CN102596922A - 有效的缀合物和亲水性连接体 - Google Patents

有效的缀合物和亲水性连接体 Download PDF

Info

Publication number
CN102596922A
CN102596922A CN2009801623736A CN200980162373A CN102596922A CN 102596922 A CN102596922 A CN 102596922A CN 2009801623736 A CN2009801623736 A CN 2009801623736A CN 200980162373 A CN200980162373 A CN 200980162373A CN 102596922 A CN102596922 A CN 102596922A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
antibody
maytansinoid
conjugate
representes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801623736A
Other languages
English (en)
Inventor
R·辛
S·D·威尔豪姆
R·V·J·查理
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunogen Inc
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of CN102596922A publication Critical patent/CN102596922A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

用于将药物与细胞结合剂结合的连接体通过并入聚乙二醇间隔物而被修饰为亲水性连接体。所述细胞结合剂-药物缀合物在各种癌细胞类型中的效价或效能意外地增加若干倍，所述癌细胞类型包括在细胞表面表达低数量抗原的癌细胞或对治疗有抗性的癌细胞。本发明还提供了一种用于制备美登木素生物碱的方法，所述美登木素生物碱带有硫醚部分和允许将所述美登木素生物碱在基本上单个步骤中连接至细胞结合剂的反应性基团。

Description

有效的缀合物和亲水性连接体
本申请是2009年4月30日提交的美国正式申请第12/433,668号的部分继续申请，所述美国正式申请要求2008年4月30日提交的美国临时申请第61/049,289号的优先权。先前申请(申请第12/433,668号和第61/049,289号)的全部公开内容均被认为是所附继续申请的公开内容的一部分并且在此均以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及新的连接体，所述新的连接体以连接体有助于增加药物活性的方式将药物(例如细胞毒剂)连接至细胞结合剂(例如抗体)。具体来讲，本发明涉及新型的亲水性连接体的用途，其中此类连接体在多种癌细胞类型中使细胞结合剂-药物缀合物的效价或效能增强若干倍，所述癌细胞类型包括在细胞表面表达低数量抗原的癌细胞或对治疗有抗性的癌症。本发明还涉及用于制备美登木素生物碱的方法，所述美登木素生物碱带有硫醚部分和允许将所述美登木素生物碱连接至细胞结合剂的反应性基团。
发明背景
细胞毒性药物的抗体缀合物正在被开发为靶标特异性治疗剂。针对各种癌细胞表面抗原的抗体已与抑制各种主要细胞靶标的不同细胞毒剂缀合，所述细胞靶标如微管(美登木素生物碱、阿里他汀类(auristatins)、紫杉烷：美国专利第5,208,020号；第5,416,064号；第6,333,410号；第6,441,163号；第6,340,701号；第6,372,738号；第6,436,931号；第6,596,757号；第7,276.497号)、DNA(加利车霉素、阿霉素、CC-1065类似物；美国专利第5,475,092号；第5,585,499号；第5,846,545号；第6,534,660号；第6,756,397号；第6,630,579号)。与这些细胞毒性药物中的一些的抗体缀合物正在临床中积极地研究用于癌症治疗(Richart，A.D.和Tolcher，A.W.，2007，NatureClinical Practice，4，245-255)。
抗体-细胞毒剂缀合物通常通过对抗体上的反应性部分(如赖氨酸氨基或半胱氨酸基团(通过还原天然二硫键产生或通过使用分子生物学方法将其它非天然半胱氨酸残基构造到抗体上产生))的初始修饰来制备。因此，首先用异双功能连接体试剂(如前述的那些，示例为SPDB、SMCC和SIAB(美国专利第6,913,758号和美国专利公布第20050169933号))修饰抗体以并入具有反应性基团(如混合的吡啶基二硫、马来酰亚胺或卤代乙酰胺)的连接体。在抗体中并入的反应性连接体基团随后与含有反应性部分(如硫羟基)的细胞毒剂缀合。另一种缀合途径是通过含有硫羟反应性基团(如卤代乙酰胺或马来酰亚胺)的细胞毒剂衍生物与细胞结合剂上的硫羟基的反应。通过还原天然二硫残基(R.Singh等人，Anal.Biochem.，2002，304，147-156)，或还原并入的二硫部分(经由SPDP、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)，随后用二硫苏糖醇还原(D.G.Gilliland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1980，77，4539-4543)，或通过并入其它非天然半胱氨酸残基(J.B.Stimmel等人，J.Biol.Chem.，2000，275，30445-30450)，将硫羟基团并入细胞结合剂(如抗体)，或通过与2-亚氨基四氢噻吩(R.Jue等人，Biochemistry，1978，17，5399-5406)或3-巯基丙亚胺酸甲酯(T.P.King等人，Biochemistry，1978，17，1499-1506)反应并入硫羟基。
为了在癌细胞内递送活性细胞毒剂，具有二硫键或硫醚键的抗体-细胞毒剂缀合物在细胞内(大概在溶酶体中)裂解(H.K.Erickson等人，2006，Cancer Research，66，4626-4433)。除了杀灭靶细胞之外，具有可还原二硫键的抗体-细胞毒剂缀合物还杀灭在体外抗原阴性和抗原阳性细胞混合种群中和体内异种移植模型中的邻近的抗原阴性细胞，这显示靶细胞释放的细胞毒剂提高对具有异源抗原表达的肿瘤中的邻近非抗原表达细胞功效中的作用(Y.V.Kovtun等人，CancerResearch，2006，66，3214-3221)。
虽然抗体-细胞毒性药物缀合物显示体外细胞杀灭活性和体内抗肿瘤活性，但是其效价在许多情况下降低，特别是当在靶癌细胞上的抗原表达低时，或当靶细胞对治疗有抗性时。这在临床情形中是很常见的情况，导致在患者中产生低至中度抗肿瘤活性。试图克服抗性的可能方法是合成带有亲水性或疏脂性功能的新药(参见G.Szokacs等人，Nature Reviews，5；219-235，2006)。然而，这种方法是繁杂的且必须合成若干类似物，并且药物结构的修饰经常引起生物活性的损失。因此需要一种不同的方法。
本领域所述的用于制备细胞结合剂和药物经由不可裂解的连接体的细胞毒性缀合物的方法需要两个反应步骤(美国专利5,208,020和美国公布第2005/0169933号)。首先，用与细胞结合剂的反应性基团(如赖氨酸残基上的氨基或半胱氨酸残基上的巯基)反应的双功能交联剂修饰细胞结合剂(如抗体)以形成共价化学键。修饰细胞结合剂之后，纯化产物以从未反应的交联剂分离所需的修饰的细胞结合剂。在第两步骤(称为缀合步骤)中，将反应性药物衍生物(如含有硫羟的美登木素生物碱)加入修饰的细胞结合剂以与修饰的细胞结合剂反应。这个反应之后，需要再纯化以从最终缀合物除去任何未反应的药物种类和其它副产物。所述多重反应和纯化步骤导致最终缀合物的低产率并且当考虑大规模地实现这些步骤时可能是昂贵和繁杂的。这些方法的其它缺点是当未反应的交联剂保持与未连接药物的细胞结合剂连接时引入的缀合物异质性。未反应的交联剂随后可能进行其它副反应(如水解和分子内或分子间反应)。因此，需要可以在基本上一个反应步骤中经由不可裂解的键共价连接至细胞结合剂(如抗体)的功能化的反应性药物衍生物(如美登木素生物碱)。
发明概述
本发明通过设计以连接体有助于增加药物活性的方式将药物连接至细胞结合剂的新的连接体来解决抗性问题。因此，本发明改善药物与细胞结合剂连接的方式，以致连接体设计提供对广谱的肿瘤(特别是在低抗原表达或抗药性肿瘤中)有活性的缀合物。
本发明基于以下新发现：当传统的连接体(例如描述于美国专利公布第20050169933号中的SMCC、SIAB等)通过并入聚乙二醇[PEGn，(-CH2CH2O)n]间隔物而被修饰为亲水性连接体时，细胞结合剂-药物缀合物在多种癌细胞类型中的效价或效能意外地增加若干倍，所述癌细胞类型包括在细胞表面表达低数量抗原的癌细胞。
此外，与前述的缀合物相比，这些含有PEG的缀合物对于对治疗有抗性的细胞系出乎意料地更有效。
此外，在抗体缀合物的情况下，亲水性连接体的并入允许每个抗体分子缀合最多15个药物分子，产率高并且没有聚集或沉淀。具有每个抗体分子连接最多15分子药物的亲水性连接体的这些缀合物高亲合力地与靶抗原(类似于未修饰的抗体)结合。
本发明还公开了对细胞结合剂的氨基或硫羟基有反应性的新型的美登木素生物碱，以致与细胞结合剂的硫醚连接的美登木素生物碱缀合物可以在基本上一个反应步骤中制备，而不用进行细胞结合剂的先前化学修饰。
本发明公开了用于合成带有硫醚部分和反应性基团的新型的美登木素生物碱衍生物的方法。这些新型的美登木素生物碱可用于在基本上一个反应步骤中制备与细胞结合剂的硫醚连接的缀合物。还公开了使用这些新型的反应性美登木素生物碱制备细胞结合剂缀合物的方法。
因此，本发明提供式(1)化合物或式(1’)的特定化合物：
Z-X，-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D  (1)
D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xi-Z  (1’)
其中：
Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l是0或1；
p是0或1；以及
n是1至2000的整数。
本发明的另一个方面是式(2)的细胞结合剂药物缀合物或式(2’)的特定化合物：
CB-[XK-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m  (2)
[D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-X1]m-CB  (2’)
其中，CB表示细胞结合剂；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l是0或1；
p是0或1；
m是2至15的整数；以及
n是1至2000的整数。
本发明的另一个方面是式(3)化合物或式(3’)的特定化合物：
Z-X，-(-CH2-CH2O-)n-Y-D (3)
D-Y-(-CH2-CH2O-)n-Xi-Z (3’)
其中：
Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、非芳族杂环基或芳族杂环基团；
l是0或1；以及
n是1至14的整数。
本发明的另一个方面是式(4)的细胞结合剂药物缀合物或式(4’)的特定化合物：
CB-(Xi-(-CH2-CH2O-)n-Y-D)m   (4)
[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-X，]m-CB  (4’)
其中，CB表示细胞结合剂；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l是0或1；以及
m是3至8的整数；以及
n是1至14的整数。
本发明的再一个方面是用于治疗对用所述方法的治疗敏感的癌症的方法，所述方法包括对有需要的患者肠胃外施用有效剂量的包含式(2)或(4)的缀合物的组合物。
在本发明的又一个方面中，提供了具有带有反应性基团且由式(5)所示的硫醚部分的新型的美登木素生物碱：
D’-Y’-V-Q-W-Z’ (5)
其中：
D’表示带有巯基的美登木素生物碱，如N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)；
Y’表示硫醚键
V是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Q表示任选的芳族或杂环部分；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；以及
Z’表示胺或巯基反应性基团。
带有硫醚部分的反应性美登木素生物碱衍生物由带有巯基的美登木素生物碱(如DM1和DM4)和异双功能交联剂制备。反应由以下化学方程式表示：
D’+V-V-Q-W-Z’→D’-Y’-V-Q-W-Z’
其中：
D’表示带有巯基的美登木素生物碱，如N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)；
V是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Q表示任选的芳族或杂环部分；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Z’是胺或巯基反应性基团；
Y″表示巯基反应性部分；
以及
Y’表示介于带有巯基的美登木素生物碱和交联剂之间的硫醚键。
本发明还公开了用于制备经由不可裂解的键连接的美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性缀合物(式10)的方法，所述方法包括使细胞结合剂与式Z’-W-Q-V-Y’-D’化合物反应以提供式CB-(Z″-W-Q-V-Y’-D’)m的细胞结合剂缀合物，
其中，
Z’表示胺或巯基反应性基团；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Q表示任选的芳族或杂环部分；
V是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Y’表示硫醚键；
D’表示带有巯基的美登木素生物碱，如N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)；
CB表示细胞结合剂；
Z″表示酰胺键；以及
m是2至8的整数。
所述细胞结合剂美登木素生物碱缀合物可进一步纯化。
附图简述
图1示出本发明的代表性的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的结构示意图(mAb＝单克隆抗体)。
图2示出本发明的代表性的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的结构示意图。
图3示出本发明的代表性的含有PEG的二硫连接的化合物的结构示意图。
图4示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的合成方案。
图5示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的合成方案。
图6示出本发明的含有PEG的二硫连接的化合物的合成方案：a.)用于与细胞结合剂一步缀合的含有PEG的二硫连接的化合物的合成；和b.)异双功能的含有PEG的二硫连接的交联化合物的合成。
图7示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图8示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。
图9示出本发明的含有PEG的硫醚连接的(硫代乙酰氨基连接的)缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图10示出本发明的含有PEG的硫醚连接的(硫代乙酰氨基连接的)缀合物的缀合过程(两步缀合)。
图11示出本发明的含有PEG的二硫连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图12示出本发明的含有PEG的二硫连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。
图13示出本发明的含有PEG的巯基反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方案。
图14示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图15示出本发明的含有PEG的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。
图16示出本发明的含有PEG的巯基反应性硫代乙酰氨基连接的化合物的合成方案；a.)用于一步缀合的含有PEG的巯基反应性硫代乙酰胺连接的化合物的合成；和b.)用于两步缀合的异双功能的含有PEG的巯基反应***联化合物的合成。
图17示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图18示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。
图19示出本发明的含有PEG的巯基反应性硫醚连接的化合物的合成方案：a.)用于一步缀合的含有PEG的巯基反应性硫代乙酰氨基连接的化合物的合成；和b.)用于两步缀合的同双功能的含有PEG的巯基反应***联化合物的合成。
图20示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(一步缀合)。
图21示出本发明的含有PEG的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(两步缀合)。
图22示出去糖基化HuAb-PEG4MaI-DM1缀合物(10.7DM1/Ab，平均值)的质谱图(MS)。
图23示出HuAb-PEG4MaI-DM1缀合物(10.7DM1/Ab，平均值)的尺寸排阻层析法(SEC)。
图24示出HuAb-PEG4Mal-DM1缀合物(10.7美登木素生物碱/抗体)的FACS结合类似于与未修饰的抗体的结合。
图25示出抗EpCAM抗体-美登木素生物碱缀合物对抗多药物性COLO205-MDR细胞的细胞毒性。
图26示出抗CanAg抗体-美登木素生物碱缀合物对抗多药物性COLO205-MDR细胞的细胞毒性。
图27示出抗CD56抗体-美登木素生物碱缀合物对Molp-8多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性。
图28示出抗EpCAM抗体-美登木素生物碱缀合物对HCT15细胞的细胞毒性。
图29示出抗EpCAM抗体-美登木素生物碱缀合物对COLO205mdr细胞的细胞毒性。
图30示出抗EpCAM抗体美登木素生物碱缀合物对HCT15异种移植的体内抗肿瘤活性。
图31示出抗EpCAM抗体美登木素生物碱缀合物对COLO205mdr异种移植的体内抗肿瘤活性。
图32示出抗EpCAM抗体美登木素生物碱缀合物对COLO205异种移植的体内抗肿瘤活性。
图33示出抗CanAg抗体美登木素生物碱缀合物对COLO205mdr异种移植的体内抗肿瘤活性。
图34示出具有最多17个D/A的抗CanAg抗体(huC242)-PEG24-Mal-DM1缀合物的结合。
图35示出具有4至17个D/A的抗CanAg抗体(huC242)-PEG24-MaI-DM1缀合物对COLO 205细胞的体外效价。
图36示出具有4至17个D/A的抗CanAg抗体(huC242)-PEG24-MaI-DM1缀合物对抗多药物性(pgp+)COLO205-MDR细胞的体外效价。
图37示出抗EGFR抗体-美登木素生物碱缀合物对UO-31细胞的细胞毒性。
图38示出抗体-PEG4-Mal-DM1的血浆药代动力学。
图39示出本发明的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的结构示意图(mAb＝抗体，m＝2-8)。
图40示出本发明的硫代乙酰氨基连接的缀合物的结构示意图(mAb＝抗体，m＝2-8)。
图41示出用本发明的化合物制备的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(mAb＝抗体，m＝2-8)。
图42示出用本发明的化合物制备的硫代乙酰氨基连接的缀合物的缀合过程(mAb＝抗体，m＝2-8)。
图43示出本发明的胺反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方案。
图44示出制备在马来酰亚胺和NHS酯之间含有直链烃的胺反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方案。
图45示出用本发明的化合物制备的去糖基化mAb-SMCC-DM1缀合物(3.42DM1/mAb，平均值)的质谱图(MS)。
图46示出在马来酰亚胺和NHS酯之间含有环烷基的胺反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的两步制备法的合成方案。
图47示出在马来酰亚胺和NHS酯之间含有环烷基的胺反应性不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的两步制备法的合成方案。
图48示出制备本发明的硫代乙酰氨基连接的化合物的合成方案。
图49示出本发明的硫代乙酰氨基连接的化合物的两步制备法的合成方案。
图50示出本发明的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的结构(mAb＝抗体，m＝2-8)。
图51示出用本发明的化合物制备的硫代琥珀酰亚胺基连接的缀合物的缀合过程(mAb＝抗体，m＝2-8)。
图52示出制备本发明的巯基反应性硫代琥珀酰亚胺基连接的化合物的合成方案。
图53示出具有3.8或D/A的抗CanAg(huC242)-Mal-(CH2)6-Mal-DM1缀合物与抗原阳性COL205细胞结合。
图54示出具有3.8D/A的抗CanAg抗体(huC242)-Mal-(CH2)6-Mal-DM 1缀合物对抗原阳性COLO205细胞有效但比对抗原阴性Namalwa细胞的有效性低。
发明详述
本发明公开了以下新发现：通过聚乙二醇或聚环氧乙烷连接体((-CH2CH2O)n)与药物(例如细胞毒剂)连接的细胞结合剂(如抗体)的缀合物显示对靶癌细胞的细胞毒性比基于与具有典型的脂肪族连接体和类似药物负载的传统细胞结合剂药物缀合物比较所预期的大若干倍。重要的是，本发明所述的缀合物对抗多药物性(mdr)癌细胞(其对用细胞毒性药物的治疗敏感性差)是非常有力或有效的。癌症治疗造成解决用不同化学治疗剂进行多轮治疗之后经常遇到的抗药性机制的障碍。在癌细胞中观察到的一种称为抗多药物性的此类机制是由ATP结合盒(ABC)转运蛋白的药物输出增加所引起(C.Drumond，B.I.Sikic，J Clin.Oncology，1999，17，1061-1070，G，Szokacs等，Nature Reviews，5；219-234，2006)。解决这些抗药性机制的治疗(如通过癌细胞干扰或解决药物的这种流出)将是非常有用的。将细胞结合剂和细胞毒性药物的PEG连接的缀合物对于抗多药物性癌细胞的细胞毒性进行评估以检测PEG连接体是否赋予针对这些抗性细胞的任何优势。在针对mdr细胞的这些分析中，与衍生自常规的连接体的非常低效的缀合物相比，细胞结合剂和细胞毒性药物的PEG连接的缀合物显示对mdr细胞出乎意料地有效的细胞杀灭。此外，本发明的缀合物还在用抗多药物性肿瘤细胞建立的动物模型中显示显著更高的抗肿瘤活性。
使用亲水性聚乙二醇或聚环氧乙烷连接体(PEG或PEO；(-CH2CH2O)n)还允许每个细胞结合剂分子并入相对大量的药物，在大于治疗使用所希望的1mg/ml浓度下具有大于90％的高蛋白单体水平。此外，具有一定范围的细胞毒性药物负载(每个细胞结合剂连接的从较小值2到较大数(例如15个药物))的细胞结合剂的聚乙二醇(PEG)连接的缀合物对靶癌细胞显示的细胞毒性比基于缀合物增加的药物负载而在药物递送的化学计量增加所预期的大大增加。在本发明中描述了细胞结合剂和具有PEG间隔物的药物的缀合物，与具有类似药物负载的传统制备的缀合物相比，其显示对靶癌细胞的细胞毒性的超化学计量增加到多达260-650倍的效价增强(参见，例如图29)。
因此，在本发明的一个方面中，描述了带有具有聚乙二醇间隔物(-CH2CH2O)n和能够与细胞结合剂反应的反应性基团的连接体的药物。
在这方面中具体考虑的是式(1)的修饰的化合物或式(1’)的特定化合物：
Z-X，-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D  (i)
D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xi-Z   (1’)
其中：
Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l是0或1；
p是0或1；以及
n是1至2000的整数。
优选地，将Y连接至药物的共价键是硫醚键或酰胺键。
优选地，n是1至100的整数。更优选地，n是1至14的整数。在最优选的方面中，n是1至4的整数。
在本发明的第二方面中，描述了具有聚乙二醇连接体(-CH2CH2O)n的细胞结合剂和药物的新型的缀合物。这些缀合物比具有传统连接体和等同药物负载的缀合物对癌细胞更有效。
在一个优选方面中具体考虑的是细胞结合剂与式(2)的药物的缀合物或式(2’)的特定化合物：
CB-[X，-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m  (2)
[D-Yp-(-CH2-CH2O-)n-X！]m-CB   (T)
其中：
CB表示细胞结合剂；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l是0或1；
p是0或1；以及
m是2至15的整数；以及
n是1至2000的整数。
优选地，所述共价键是硫醚键或酰胺键。
优选地，m是3至8的整数。
优选地，n是1至100的整数。更优选地，n是1至14的整数。在最优选的方面中，n是1至4的整数。
本发明还基于以下新发现：在抗体缀合物的情况下，其中抗体经由二硫键连接至细胞毒性药物，在免疫缀合物效价或效能的增强中，在连接的药物数目和聚乙二醇间隔物长度之间有重要的相关性。这种连接体设计的其它益处是抗体-药物缀合物的希望的高单体比例和极少的聚集。因此，在一个方面中，本发明基于以下重要发现：当用于二硫连接的缀合物的聚乙二醇间隔物由2和8个之间的乙烯氧基团组成并且连接的药物数目在3至8范围内时，其给予抗体-药物缀合物最高的生物学效价或效能并且还给予希望的高单体含量。
在一个优选方面中，描述了经由二硫基(-S-S-)连接的细胞毒性药物，其具有带有能够与细胞结合剂反应的官能团的短聚乙二醇间隔物((CH2CH2O)n＝1-14)。
在这方面中具体考虑的是式(3)的修饰的细胞毒性化合物或式(3’)的特定化合物：
Z-XH-CH2-CH2O-)n-Y-D     (3)
D-Y-(-CH2-CH2O-)n-X，-Z  (3’)
其中：
Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、非芳族杂环基或芳族杂环基团；
l是0或1；以及
n是1至14的整数。
优选地，n是2至8的整数。
在另一个优选方面中，描述了经由二硫基(-S-S-)连接的细胞结合剂和药物的缀合物，其具有带有窄范围的3-8个药物负载的聚乙二醇间隔物((CH2CH2O)n＝1-14)，其显示对癌细胞相对高效力的生物学活性并且具有高缀合产率和高单体比以及极少的蛋白质聚集的希望的生化性质。
在这方面中具体考虑的是式(4)的细胞结合剂药物缀合物或式(4’)的特定化合物：
CB-(XK-^H2-CH2O-V-Y-D)1n     (4)
[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-X，]m-CB  (4’)
其中：
CB表示细胞结合剂；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l是0或1；
m是3至8的整数；以及
n是1至14的整数。
优选地，m是3至6的整数。
此外，优选地，n是2至8的整数。
在本发明中，药物是亲脂性分子，当其与细胞结合剂(如抗体)缀合时经常由于蛋白质聚集或沉淀而引起产率的损失。增加每个细胞结合剂的药物的数目通常导致更严重的蛋白质聚集和沉淀，并且进而导致差的单体百分率和低的产率。与具有常规的连接体的典型缀合物性质相比，PEG连接体引起细胞结合剂与药物的缀合物在可用于治疗应用的1mg/ml或更高的高浓度下的单体百分率(＞90％单体)和产率(＞70％)的希望的改善。此外，这些缀合物在40℃下延期储存是稳定的。
在本发明中，公开了具有带有反应性基团的硫醚部分的新型的美登木素生物碱，如由式(5)表示的那些化合物：
D’-Y’-V-Q-W-Z’(5)
其中：
V是优选具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选地是具有1-5个碳原子的直链烷基，并且更优选地，V是一碳烷基(CH2)；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有2-8个碳原子，更优选地，W是环己基；
D’表示带有巯基的美登木素生物碱，并且更优选地，其选自DM1、DM3和DM4；
Y’表示硫醚键；
Q表示任选的芳族或杂环部分，并且优选Q不存在；
Z’表示选自(但不限于)以下的胺反应性基团或硫羟反应性基团：N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysulfosuccinimide ester)、对硝基苯酯或邻硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；马来酰亚胺或卤代乙酰胺，更优选地，Z是N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺。
在另一个实施方案中，带有硫醚部分的反应性美登木素生物碱衍生物由带有巯基的美登木素生物碱(如DM1和DM4)和异双功能交联剂制备。反应顺序由式(6)所示：
D’+γ″-V-Q-W-Z’→D’-Y’-V-Q-W-Z’ (6)
其中：
V是优选具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选是具有1-5个碳原子的直链烷基，并且更优选地，V是一碳烷基(CH2)；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有2-8个碳原子，更优选地，W是环己基；
Y″表示选自马来酰亚胺或卤代乙酰胺的硫羟反应性基团，优选是马来酰亚胺；
D’表示带有巯基的美登木素生物碱，并且更优选地，其选自DM1、DM3和DM4；
Y’表示硫醚键；
Q表示任选的芳族或杂环部分，并且优选Q不存在；
Z’表示选自但不限于以下的胺反应性基团或硫羟反应性基团：N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯酯或邻硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；马来酰亚胺或卤代乙酰胺，更优选地，Z是N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺。
Y’表示硫醚键。
本发明还提供一种用于制备经由不可裂解的键连接的美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性缀合物的方法，所述方法包括使细胞结合剂与式Z’-W-Q-V-Y’-D’化合物反应以提供式CB-(Z″-W-Q-V-Y’-D’)m的细胞结合剂缀合物，
其中：
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有2-8个碳原子，更优选地，W是环己基；
Q表示任选的芳族或杂环部分，并且优选Q不存在；
V是优选具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选是具有1-5个碳原子的直链烷基，并且更优选地，V是一碳烷基(CH2)；
Y’表示硫醚键；
D’表示带有巯基的美登木素生物碱，并且更优选地，其选自DM1、DM3和DM4；
CB表示选自以下的细胞结合剂：抗体、单链抗体、抗体片段、肽、生长因子、激素、维生素或锚蛋白重复蛋白(DARPins)，所述细胞结合剂优选是抗体或抗体片段或Darpin；
Z’表示选自但不限于以下的胺反应性基团或硫羟反应性基团：N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯酯或邻硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；马来酰亚胺或卤代乙酰胺，更优选地，Z是N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺；
Z″表示硫醚键或酰胺键；
所述方法可通过使细胞结合剂(如抗体)在缓冲水溶液(任选含有最多20％有机溶剂)中的溶液与在有机溶剂或有机溶剂和缓冲水溶液或水的混合物中的式Z’-W-Q-V-Y’-D’化合物混合并使反应进行5
min至72小时来进行。
所述缀合物可通过色谱法、渗析法、切向流过滤法或这些的组合进一步纯化
在所有方面中，“脂肪族基团”定义为烷基、烯基或炔基。烷基是可为直链或支链的脂肪族烃基，优选在链或环中具有1至20个碳原子，优选具有3至10个碳原子。更优选的烷基在链中具有1至12个碳原子。“支链”表示连接至直链烷基链的一个或多个低级烷基(如甲基、乙基或丙基)。示例性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、环戊基和环己基。
烯基是含有碳-碳双键的脂肪族烃基并且其可以是直链或支链的，优选在链中具有2至15个碳原子。更优选的烯基在链中具有2至12个碳原子；并且更优选在链中具有约2至4个碳原子。示例性烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基。
炔基是含有碳-碳三键的脂肪族烃基并且其可以是直链或支链的，优选在链中具有2至15个碳原子。更优选的炔基在链中具有2至12个碳原子；并且更优选在链中具有2至4个碳原子。示例性炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸炔基。
如本文所用，术语“芳基”表示由具有6至14个碳原子(优选具有6至10个碳原子)的芳族单环或多环烃环***组成的取代或未取代的芳基。示例性芳基包括苯基和萘基。取代基包括(但不限于)烷基、卤素、硝基、氨基、羟基和烷氧基。
卤素包括氟、氯、溴和碘原子。氟和氯原子是优选的。
如本文所用，术语“杂环基团”是指饱和的、部分不饱和的或不饱和的、非芳香族稳定的3至14元(优选5至10元)单、双或多环，其中环的至少一元是杂原子，或具有至少一个杂原子的芳香族(优选5至10元)单、二或多环。通常杂原子包括(但不限于)氧、氮、硫、硒和磷原子。优选的杂原子是氧、氮和硫。
优选的杂环基团包括(但不限于)吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢吡喃基、二噁烷基、二氧戊环基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢噻喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基、二氢硫代吡喃基、氮杂环庚烷基、吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、***基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基和异噁唑基、吡啶基-N-氧化物以及与苯基缩合所得的稠合***。
由X和Y表示的脂族基、芳基和杂环基团还可具有带电荷的取代基。带电荷的取代基可以是选自(但不限于)羧酸根、磺酸根和磷酸根的带负电荷的取代基，或选自叔氨基或季氨基的带正电的取代基。
如本文所用，表达“连接至细胞结合剂”是指经由合适的连接基团或其前体与细胞结合剂连接的包含至少一种药物衍生物的缀合物分子。优选的连接基团是硫羟键或二硫键或其前体。
如本文所用，给定基团的“前体”是指可通过任何去保护、化学修饰或偶联反应产生该基团的任何基团。例如，前体可以是适当保护的官能团，示例为硫酯或硫醚为硫羟的前体。
如本文所用，术语“反应性官能团”是指胺、硫羟或羟基反应性官能团。换言之，反应性官能团可与存在于细胞结合剂上的胺、巯基(硫羟)或羟基反应。例如，对于胺反应性官能团，所述官能团可以是反应性羧酸酯(包括N-琥珀酰亚胺基酯、N-磺基琥珀酰亚胺基酯、N-苯邻二甲酰亚胺基酯、N-磺基苯邻二甲酰亚胺基酯、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基酯、2，4-二硝基苯基酯、3-磺基-4-硝基苯基酯、3-羧基-4-硝基苯基酯、四氟苯基酯)、反应性磺酸衍生物或反应性硫酯以得到酰胺键；对于硫羟反应性官能团，所述官能团可以是马来酰亚胺、卤代乙酰胺或乙烯基砜以得到硫醚键；以及，对于羟基反应性官能团，所述官能团可以是反应性羧酸酯以得到酯键。
A.具有亲水性连接体的修饰的药物和修饰的细胞结合剂
连接体是能够以稳定的共价方式将药物(如美登木素生物碱)连接至细胞结合剂的任何化学部分。在药物或细胞结合剂保持活性的条件下，连接体可易于进行酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解，或对它们基本上有抗性。图1、2和3示例性地提供本发明的缀合物的结构示意图。
在药物和细胞结合剂之间形成连接体的包含亲水性PEG链的合适的交联剂在本领域是熟知的或可商购的(例如来自QuantaBiodesign，Powell，Ohio)。也可使用本领域技术人员已知的标准合成化学技术由本身可商购的PEG来合成合适的含有PEG的交联剂。通过本文所述的方法，药物可与双功能的含有PEG的交联剂反应以得到式(1)的化合物Z-Xi-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D。例如，含有硫羟的美登木素生物碱药物可与具有PEG间隔物的双马来酰亚胺交联剂反应以得到经由硫醚键与PEG间隔物结合的美登木素生物碱药物(参见例如图13)。随后这个具有PEG间隔物和末端马来酰亚胺基团的修饰的美登木素生物碱可与细胞结合剂反应(例如如图14所示)以提供本发明的式(2)的细胞结合剂-药物缀合物。
或者，细胞结合剂可首先在带有胺反应性基团(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的双功能的含有PEG的交联剂的一端进行反应，以得到通过酰胺键与连接体共价结合的修饰的细胞结合剂(参见例如图15)。在下一步中，美登木素生物碱与PEG间隔物的另一端上的马来酰亚胺取代基进行反应，以得到本发明的细胞结合剂-药物缀合物。
图16和17通过举例示出PEG交联剂的合成及其通过硫代乙酰胺键与美登木素生物碱的反应。随后将马来酰亚胺取代基并入PEG以使经由硫醚键与细胞结合剂的反应能够进行。或者，如图18所示，首先通过硫醚键将细胞结合剂连接至PEG交联剂。随后使修饰的细胞结合剂与美登木素生物碱药物反应以得到缀合物。同双功能PEG交联剂的合成示于例如在图19中，其中PEG间隔物的两端均含有碘代乙酰胺基部分，碘代乙酰胺基部分能够使细胞毒性药物和细胞结合剂经由硫醚键连接以得到含有亲水性PEG间隔物的缀合物。提供本发明的缀合物的缀合过程示于例如在图20和21中。
本领域技术人员将认识到可容易地通过本文所述的方法合成带有各种反应性基团的其它含有PEG的交联剂。例如，带有羟基的药物(如19-去甲基美登木素生物碱(美国专利第4,361,650号))可在碱(如碳酸钾)存在下与碘代乙酰基PEG连接体(图5)反应以经由醚键连接美登木素生物碱。类似地，含有胺的美登木素生物碱(如美国专利第7,301,019号所述合成)可在碱(如吡啶或三乙胺)存在下与碘代乙酰基PEG(在图5中示出)反应以提供经由胺键连接至PEG的美登木素生物碱。为了经由酰胺键将药物连接至PEG，可使羧基PEG(在图5中示出)在缩合剂(如二环己基碳二亚胺)存在下与含有胺的美登木素生物碱反应以提供酰胺结合的PEG-美登木素生物碱。为了经由氨基甲酸酯键将药物连接至PEG间隔物，首先使PEG与双光气反应以提供PEG氯甲酸酯，其随后可在碱(如三乙胺)存在下与含有胺的美登木素生物碱反应以得到氨基甲酸酯连接的PEG-美登木素生物碱。
合适的连接体的实例包括具有用于与细胞结合剂反应的N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分以及用于与药物反应的基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基部分的连接体。PEG间隔物可通过本文所述的方法并入本领域已知的任何交联剂。可与PEG间隔物合并的包含基于马来酰亚胺基部分的交联剂包括(但不限于)N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其是SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(对-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含基于卤代乙酰基部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。
在本发明的方法中还可使用不含硫原子的其它交联剂。此类连接体可衍生自基于二羧酸的部分。合适的基于二羧酸的部分包括(但不限于)以下通式所示的α，ω-二羧酸：
HOOC-A’p-E’q-(CH2CH2O)nG’r-COOH
其中A’是具有2至20个碳原子的任选的直链或支链烷基、烯基或炔基，E’是具有3至10个碳原子的任选的环烷基或环烯基，G’是带有6至10个碳原子的任选取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且其中p、q和r各为0或1，条件是p、q和r不同时为零，n是1至2000的整数。
本文中公开的许多连接体详细描述于美国专利公布第20050169933号。
在本发明的另一个方面中，通过使双功能交联剂与细胞结合剂反应来修饰细胞结合剂，从而产生连接体分子与细胞结合剂的共价连接。如本文所用，“双功能交联剂”是将细胞结合剂共价连接至药物(如本文所述的药物)的任何化学部分。在本发明的优选方面中，连接部分的一部分由药物提供。在这方面，药物包含用于将细胞结合剂连接至药物的较大连接体分子的一部分的连接部分。例如，为了形成美登木素生物碱DM1，在美登素的C-3羟基的侧链被修饰为具有游离的巯基(SH)。美登素的这种硫羟化形式可与修饰的细胞结合剂反应以形成缀合物。因此，最终连接体是由两个部分组装，其中之一是由交联剂提供，而另一个是由DM1的侧链提供。
在本发明的另一个方面中，药物通过二硫键连接至细胞结合剂。连接体分子包含可与细胞结合剂反应的反应性化学基团。用于与细胞结合剂反应的优选反应性化学基团是N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。此外连接体分子包含反应性化学基团，优选是可与药物反应形式二硫键的二硫代吡啶基。特别优选的连接体分子包括例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见，例如Carlsson等人，Biochem.J.173：723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见，例如美国专利第4,563,304号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(参见，例如CAS登记号341498-08-6)和其它反应***联剂(如描述于美国专利第6,913,748号中的那些)，所述美国专利以引用方式整体并入本文。
或者，如在美国专利第6,441,163B1号中公开的，可首先修饰药物以引入适于与细胞结合剂反应的反应性酯。这些含有活化的连接体部分的药物与细胞结合剂的反应提供另一种制造细胞结合剂药物缀合物的方法。为了连接siRNA’s，可通过常用于修饰寡核苷酸的方法将siRNAs连接至本发明的交联剂(参见，例如美国专利公布20050107325和20070213292)。因此3’-亚磷酰胺形式或5’-亚磷酰胺形式的siRNA与带有羟基官能团的交联剂的一端反应以在siRNA和交联剂之间得到酯键。类似地，siRNA亚磷酰胺与带有末端氨基的交联剂的反应使交联剂与siRNA通过胺连接。
B.细胞结合剂
本发明中使用的细胞结合剂是与癌细胞上的靶抗原特异性结合的蛋白质(例如免疫球蛋白蛋白质和非免疫球蛋白蛋白质)。这些细胞结合剂包括以下：
-抗体，包括：
-表面重塑抗体(美国专利第5,639,641号)；
-人源化或完全人抗体(人源化或完全人抗体选自(但不限于)huMy9-6、huB4、huC242、huN901、DS6、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、帕妥珠单抗和利妥昔单抗(参见，例如美国专利第5,639,641号、第5,665,357号和第7,342,110号；美国临时专利申请第60/424,332号、国际专利申请WO02/16,401、美国专利公布第20060045877号、美国专利公布第20060127407号、美国专利公布第20050118183号；Pedersen等人，(1994)J MoI.Biol.235，959-973；Roguska等人，(1994)Proceedings ofthe National Academy of Sciences，第91卷，969-973；Colomer等人，Cancer Invest.，19：49-56(2001)；Heider等人，Eur.J.Cancer，31A：2385-2391(1995)；Welt等人，J Clin.Oncol，12：1193-1203(1994)和Maloney等人，Blood，90：2188-2195(1997))；以及
-抗体的表位结合片段，如sFv、Fab、Fab’和F(ab’)2(Parham，JImmunol.131：2895-2902(1983)；Spring等人，J Immunol.113：470-478(1974)；Nisonoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89：230-244(1960))。
其它细胞结合剂包括其它细胞结合蛋白和多肽，其示例为但不限于：
-锚蛋白重复蛋白(DARPins；Zahnd等人，J Biol.Chem.，281，46，35167-35175，(2006)；Binz，H.K.，Amstutz，P.&Pluckthun，A.(2005)Nature Biotechnology，23，1257-1268)或锚蛋白样重复蛋白或合成肽，其描述于例如美国专利公布第20070238667号；美国专利第7,101,675号；WO/2007/147213和WO/2007/062466中)；
-干扰素(例如α、β、γ)
-淋巴因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6)；
-激素(如胰岛素、TRH(促甲状腺素释放激素)、MSH(促黑素细胞激素)、甾体激素(如雄激素和***))；以及
-生长因子和集落-刺激因子如EGF、TGF-α、IGF-I、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess，Immunology Today 5：155-158(1984))。
细胞结合剂是抗体时，其与是多肽并且可能是跨膜分子(例如受体)或配体(如生长因子)的抗原结合。示例性抗原包括分子(如肾素)；生长激素(包括人生长激素和牛生长激素)；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；凝血因子(如因子vmc、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子(von Willebrands factor))；抗凝血因子，如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物(如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA))；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(对通常T细胞表达和分泌活化的调节)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-I-α)；血清白蛋白(如人血清白蛋白)；苗勒抑制物质(Muellerian-inhibitingsubstance)；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；鼠***相关肽；微生物蛋白质(如β内酰胺酶)；DNase；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子(如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6))，或神经生长因子(如NGF-β)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(如aFGF和bFGF)；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、***结合蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLR1、间皮素、cripto、αvβ6、整联蛋白、VEGF、VEGFR、运铁蛋白受体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5；CD蛋白，如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152；***；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)(例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF)；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如HIV包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD1 Ia、CD1 Ib、CD1 Ic、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如HER2、HER3或HER4受体；以及任何以上列出的多肽的片段、抗体拟似物Adnectins(US申请20070082365)，或公开于美国公布第20080171040号或美国公布第20080305044号的结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体，所述美国公布以引用方式整体并入本文。
此外，与骨髓细胞结合的GM-CSF可用作来自急性骨髓性白血病的患病细胞的细胞结合剂。与活化的T细胞结合的IL-2可用于预防移植体移植排斥，用于治疗和预防移植物抗寄主疾病以及用于治疗急性T细胞白血病。与黑素细胞结合的MSH可用于治疗黑素瘤。叶酸可用于靶向在卵巢肿瘤和其它肿瘤上表达的叶酸受体。表皮生长因子可用于靶向鳞状细胞癌(如肺及头和颈鳞状细胞癌)。促生长素抑制素可用于靶向成神经细胞瘤和其它肿瘤类型。
可分别用***(或***类似物)或雄激素(或雄激素类似物)作为细胞结合剂成功地靶向乳腺癌和睾丸癌。
本发明包括的用于抗体的优选抗原包括CD蛋白，如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138和CD152；ErbB受体家族的成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如LFA-I、Macl、pi50.95、VLA-4、ICAM-I、VCAM、EpCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚类(例如抗CD1 Ia、抗CD18或抗CD1 Ib抗体)；生长因子，如VEGF；组织因子(TF)；TGF-β；α干扰素(α-IFN)；白细胞介素，如IL-8；IgE；血型抗原Apo2、死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白质C等。本文中最优选的靶标是IGF-IR、CanAg、EphA2、MUCl、MUCl 6、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、EpCAM、CRIPTO(在大部分人乳腺癌细胞中高水平产生的蛋白质)、darpins、αv/β3整联蛋白、αv/β5整联蛋白、αv/β6整联蛋白、TGF-β、CD1 Ia、CD18、Apo2和C242或公开于美国公布第20080171040号或美国公布第20080305044号的与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体，所述美国公布以引用方式整体并入本文。
本发明包括的用于抗体的优选抗原还包括CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD27、CD34、CD37、CD38、CD46、CD56、CD70和CD138；ErbB受体家族的成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子如LFA-I、Macl、p150.95、VLA-4、ICAM-I、VCAM、EpCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚类(例如抗CD1Ia、抗CD18或抗CD1Ib抗体)；生长因子，如VEGF；组织因子(TF)；TGF-β；α干扰素(α-IFN)；白细胞介素，如IL-8；IgE；血型抗原Apo2、死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白质C等。本文中最优选的靶标是IGF-IR、CanAg、EGF-R、EGF-RvIII、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD138、CA6、Her2/neu、CRIPTO(在大部分人乳腺癌细胞中高水平产生的蛋白质)、αv/β3整联蛋白、αv/β5整联蛋白、TGF-β、CD1 Ia、CD18、Apo2、EpCAM和C242。
单克隆抗体技术允许以单克隆抗体形式生产特异性细胞结合剂。本领域特别熟知的是用于制造通过用研究中的抗原(如完整靶细胞、从靶细胞分离的抗原、全病毒、减毒全病毒和病毒蛋白质(如病毒外壳蛋白))免疫小鼠、大鼠、仓鼠或任何其它哺乳动物生产单克隆抗体的技术。也可使用敏化人细胞。另一种制造单克隆抗体的方法是使用sFv(单链可变区)，特别是人sFv的噬菌体库(参见，例如Griffiths等人，美国专利第5,885,793号；McCafferty等人，WO 92/01047；Liming等人，WO 99/06587)。
适当的细胞结合剂的选择是取决于要靶向的特定细胞群体的选择事项，但一般来讲，单克隆抗体和其表位结合片段是优选的(如果有适当的可用)。
例如，单克隆抗体My9是鼠IgG2a抗体，其对急性骨髓性白血病(AML)细胞上发现的CD33抗原有特异性(Roy等人，Blood 77：2404-2412(1991))并且可用于治疗AML患者。类似地，单克隆抗体抗B4是鼠IgGi，其与B细胞上的CD19抗原结合(Nadler等人，JImmunol.131：244-250(1983))，并且如果靶细胞是B细胞或在诸如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴母细胞白血病中表达该抗原的患病细胞，则可以使用所述抗体。抗体N901是鼠单克隆IgGi抗体，其与在小细胞肺癌细胞和其它神经内分泌起源的肿瘤细胞上发现的CD56结合(Roy等人，J Nat.Cancer Inst.88：1136-1145(1996))；huC242是与CanAg抗原结合的抗体；曲妥珠单抗是与HER2/neu结合的抗体；以及抗EGF受体抗体与EGF受体结合。
C.药物
在本发明中使用的药物是能够连接至细胞结合剂的细胞毒性药物。合适的药物的实例包括美登木素生物碱、DNA结合药物(如CC-1065和其类似物)、加利车霉素、阿霉素及其类似物、长春花生物碱、念珠藻环肽(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、阿里他汀(auristatin)及其类似物、tubulysin、埃博霉素(epothilones)、紫杉烷和siRNA。
优选的美登木素生物碱是描述于美国专利第5,208,020号；第5,416,064号；第6,333,410号；第6,441,163号；第6,716,821号；第RE39,151号和第7,276,497号的那些。优选的CC-1065类似物是描述于美国专利第5,475,092号；第5,595,499号；第5,846,545号；第6,534,660号；第6,586,618号；第6,756,397号和第7,049,316号的那些。优选的阿霉素及其类似物是描述于美国专利第6,630,579号的那些。优选的紫杉烷是描述于美国专利第6,340,701号；第6,372,738号；第6.436,931号；第6,596,757号；第6,706,708号；第7,008,942号；第7,217,819号和第7,276,499号的那些。加利车霉素描述于美国专利第5,714,586号和第5739,116号。
长春花生物碱化合物、多拉司他汀化合物和念珠藻环肽化合物在WO01/24763中详细描述。阿里他汀包括阿里他汀E、阿里他汀EB(AEB)、阿里他汀EFP(AEFP)、单甲基阿里他汀E(MMAE)并且描述于美国专利第5,635,483号、Int.J.Oncol.15：367-72(1999)；Molecular Cancer Therapeutics，第3卷，第8期，921-932页(2004)；美国申请第11/134826号，美国专利公布第20060074008号、第2006022925号。Tubulysin化合物描述于美国专利公布第20050249740号。念珠藻环肽化合物描述于美国专利第6,680,311号和第6,747,021号。埃博霉素描述于美国专利第6,956,036号和第6,989,450号。
siRNA在以下编号的美国专利公布中详细描述：20070275465、20070213292、20070185050、20070161595、20070054279、20060287260、20060035254、20060008822、20050288244、20050176667。
类似物和衍生物
细胞毒剂领域的技术人员将容易理解本文中描述的每一种细胞毒剂可以以所得化合物仍然保持起始化合物的特异性和/或活性的方式进行修饰。本领域技术人员还将理解许多这些化合物可用来代替本文所述的细胞毒剂。因此，本发明的细胞毒剂包括本文所述的化合物的类似物和衍生物。
细胞结合剂可通过前述的方法(美国专利第6,013,748号；第6,441,1631号和第6,716,821号；美国专利公布第20050169933号和WO2006/034488 A2)与细胞毒性药物缀合。
D.治疗用途
本发明的细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)还可与化学治疗剂组合使用。此类化学治疗剂描述于美国专利第7,303,749号。
本发明的细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)可以体外、体内和/或离体施用，以治疗患者和/或调节选择的细胞群体的生长，所述细胞群体包括例如，肺癌、血癌、血浆癌、乳腺癌、结肠癌、***癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和淋巴器官癌；自身免疫疾病，如***性红斑狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化；移植排斥，如肾移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病；病毒感染，如CMV感染、HIV感染和AIDS；以及寄生虫感染，如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病等。优选地，体外、体内和/或离体施用本发明的免疫缀合物和化学治疗剂以治疗患者的癌症和/或调节癌细胞的生长，所述癌细胞包括例如，血癌、血浆癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、***癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和淋巴器官癌；更优选的是肺癌、结肠癌、***癌(colon prostrate)、血浆癌、血癌或结肠癌。在最优选的方面中，所述癌症是多发性骨髓瘤。
“调节选择的细胞群体的生长”包括：抑制选择的细胞群体(例如多发性骨髓瘤细胞群体，如MOLP-8细胞、OPM2细胞、H929细胞等)的增殖防止***产生更多细胞；例如与未经治疗的细胞相比降低细胞***的增长速度；杀灭选择的细胞群体；和/或防止选择的细胞群体(如癌细胞)转移。选择的细胞群体的生长可以体外、体内或离体调节。
在本发明的方法中，可以体外、体内或离体施用细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)。细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)可以与合适的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂(其是众所周知的)一起使用并且可以由本领域技术人员按照临床表现根据确定。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)pH值约6.5的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，其可含有约1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v NaCl)，以及(3)5％(w/v)葡萄糖。
本文所述的化合物和组合物可以适当的形式施用，优选肠胃外施用，更优选静脉注射施用。对于肠胃外施用，所述化合物或组合物可以是含水或无水无菌溶液、混悬液或乳浊液。丙二醇、植物油和可注射的有机酯(如油酸乙酯)可以用作溶剂或媒介物。所述组合物还可以含有佐剂、乳化剂或分散剂。
所述组合物还可以是可溶解或分散在无菌水或任何其它可注射的无菌介质的无菌固体组合物形式。
本文所述的细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)的“治疗有效量”是指用于调节选择的细胞群体的生长和/或治疗患者疾病的给药方案，并且根据多种因素选择，这些因素包括患者的年龄、体重、性别、饮食和医疗条件、疾病的严重程度、施用途径和药理学考虑因素(如使用的特定化合物的活性、效能、药代动力学和毒理学曲线)。“治疗有效量”还可以通过参考标准医学书(如Physicians DeskReference 2004)确定。患者优选是动物，更优选是哺乳动物，最优选是人。患者可以是男性或女性，并且可以是婴儿、儿童或成人。
细胞结合剂药物缀合物(例如免疫缀合物)的合适的给药方案的实例如下。可以每天施用缀合物持续约5天，或者每天单次静脉注射(i.v.)进行约5天，或者持续输液约5天。
或者，可每周一次施用缀合物持续6周或更长。作为另一种选择，可每两周或三周施用一次缀合物。单次剂量在约50至约400mL生理盐水中给予，其中可向生理盐水中添加约5至约10mL人血清白蛋白。持续输液以每24小时期间在约250至约500mL生理盐水中给予，其中可向生理盐水中添加约25至约50mL人血清白蛋白。剂量将是约10pg至约1000mg/kg每人，静脉注射(约100ng至约100mg/kg的范围)。
在治疗之后的约一至约四周，患者可以接受第二疗程。关于施用途径、赋形剂、稀释剂、剂量和时间的具体临床方案可由本领域技术人员按照临床表现根据来确定。
所述化合物和缀合物(例如免疫缀合物)还可以用于制造对治疗或减轻病症(如以细胞的异常生长为特征的病症(例如癌症))的严重程度有用的药物。
本发明还提供药物试剂盒，其包含一个或多个装有本发明的药物化合物和/或组合物一种或多种成分(包括一种或多种免疫缀合物和一种或多种化学治疗剂)。此类试剂盒还可包括(例如)其它化合物和/或组合物，用于施用化合物和/或组合物的装置和由管制药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的书面说明书。
癌症治疗及其剂量、施用途径和推荐的用法在本领域是已知的并且已描述于文献(如Physician’s Desk Reference(PDR))中。PDR公开了在各种癌症治疗中使用的药剂的剂量。治疗有效的这些上述化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定癌症、疾病的程度和本领域医师熟知的其它因素并且可以由医师决定。例如，2006版的Physician’s Desk Reference公开了泰索帝(Taxotere，参见2947页)是微管蛋白解聚的抑制剂；阿霉素(参见786页)、盐酸阿霉素脂质体(Doxil，参见3302页)和奥沙利铂(参见2908页)是DNA相互作用剂，伊立替康(Irinotecal，参见2602页)是拓扑异构酶I抑制剂，爱必妥(Erbitux，参见937页)和特罗凯(Tarceva，参见2470页)与表皮生长因子受体相互作用。PDR的内容以引用方式整体明确地并入本文。本领域技术人员可以使用一种或多种以下参数查阅PDR以确定可以根据本发明的教导使用的化学治疗剂和缀合物的给药方案和剂量。这些参数包括：
1.综合索引
a)通过制造商
b)产品(通过公司名称或商标药物名称)
c)分类索引(例如“抗组胺剂”、“DNA烷化剂”、紫杉烷等)
d)总索引/化学索引(无商标的普通药物的名称)
2.药物的彩色图像
3.产品信息，与FDA标签一致
a)化学信息
b)功能/作用
c)适应症和禁忌症
d)试验研究、副作用、警告
上述参考文献、专利申请和专利每一篇的内容(非限制性地包括说明书、权利要求书和摘要以及其任何图、表或附图)均以全文引用方式整体明确地并入本文。
E.具有带有反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱的合成
具有带有反应性基团的不可裂解的硫醚部分的新型的美登木素生物碱是式(5)D’-Y’-V-Q-W-Z’的化合物。用于与细胞结合剂反应的化学基团Z’包括但不限于N-琥珀酰亚胺基酯、N-磺基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯酯、四氟磺基苯基和硝基苯酯。在本文中描述了制备这些化合物的方法。带有巯基的美登木素生物碱经由不可裂解的硫醚键与带有反应性基团的异双功能交联剂共价连接并且在与细胞结合剂缀合之前分离。
不可裂解的连接体是能够以稳定、共价方式将细胞毒性药物连接至细胞结合剂的任何化学部分。不可裂解的连接体实质上对酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解有抗性。不可裂解的连接体的实例包括具有用于与美登木素生物碱反应的N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分和基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分的连接体。包含基于马来酰亚胺基的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其是SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(对-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含基于卤代乙酰基的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。
可在本发明中用以制造带有可共价连接至细胞结合剂的硫醚部分的反应性美登木素生物碱衍生物的美登木素生物碱在本领域是熟知的并且可根据已知方法从天然来源分离或根据已知方法合成制备。
具有带有反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱的合成可参考图1-4所述，其中制备了带有反应性基团的带有硫醚的美登木素生物碱。
本发明的代表性化合物由含有硫羟的美登木素生物碱制备：DM1，称为N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素，由结构式(1)表示；和DM4，称为N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素，由以下所示的结构式(2)表示：
Figure BPA00001547435100411
具有带有反应性基团的硫醚部分的新型的美登木素生物碱通过以下最新描述的方法制备。
描述了式(5)：D’-Y’-V-Q-W-Z’(5)的具有带有反应性基团的硫羟部分的新型的美登木素生物碱的合成，包括以下步骤：
a.)将式V-V-Q-W-Z’的异双功能连接体共价连接至带有硫羟的美登木素生物碱D’；其中Y″是硫羟反应性基团(如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)；V是优选具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有1-5个碳原子。W是优选具有1-10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选含有1-5个碳原子。Q表示任选的芳族或杂环部分；并且Z’是胺反应性基团，诸如但不限于N-琥珀酰亚胺基酯、N-磺基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯酯、四氟磺基苯基或硝基苯酯。反应包括顺序(6)：
D’+V-V-Q-W-Z’→D’-Y’-V-Q-W-Z’(6)
b.)可使用相对带有硫羟的美登木素生物碱D’(如DM1和DM4)化学计量的或过当量的异双功能交联剂V-V-Q-W-Z’。反应进行到完成并且可通过如HPLC和TLC的分析方法监测。反应还可用相对异双功能连接体V-V-Q-W-Z’过量的带有硫羟的美登木素生物碱D’进行。
c.)反应可在合适的有机溶剂或缓冲水溶液和有机溶剂的混合物中进行，以使带有硫羟的美登木素生物碱D’和异双功能连接体V-V-Q-W-Z’完全溶解。合适的有机溶剂的实例包括四氢呋喃(THF)、1，2-二甲氧乙烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、甲醇和乙醇。当在有机溶剂和缓冲水溶液的混合物中进行反应时，必须控制pH值以促进带有巯基的美登木素生物碱与马来酰亚胺或卤代乙酰胺Y″的反应，而使胺反应性基团Z的可能的水解最小化。这个反应的合适的pH值范围是pH值为3-10，优选的pH值是5-9，并且最优选的pH值是6-8。
d.)还可使用合适的有机碱和纯有机溶剂(如上所述的那些)在带有硫羟的美登木素生物碱D’和硫羟反应性基团Y″之间形成硫醚。有机碱(如N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)、三乙胺和4-甲基吗啉)可用于形成式(5)D’-Y’-V-Q-W-Z’的带有反应性基团的希望的硫醚反应性美登木素生物碱。
e.)反应完成之后，可分离式(5)D’-Y’-V-Q-W-Z’的化合物。用于纯化具有带有胺反应性基团Z’(例如N-琥珀酰亚胺基酯)的硫醚部分的美登木素生物碱的合适的技术包括硅胶色谱法、正相或反相制备型高效液相色谱法(HPLC)、制备型薄层色谱法(TLC)和结晶。
f,)式(5)D’-Y’-V-Q-W-Z’的分离的产物的纯度和鉴别可由包括HPLC、质谱(MS)、LC/MS、1H NMR和13C NMR的分析方法来确定。
F.具有硫醚部分的美登木素生物碱衍生物的制备
本文中描述了含有对制备含有不可裂解的、带有反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱有用的硫醚部分的新型的美登木素生物碱衍生物。公开了这些衍生物从DM1(1)和DM4(2)的制备并且由式(10)表示：
D’-Y’-V-Q-W-COOH (10)
其中，
V是优选具有1-10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有1-5个碳原子。
W是具有1-10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；更优选具有1-5个碳原子。
D’表示带有巯基的美登木素生物碱(DM1或DM4)；
Y’表示硫醚键；以及
Q表示任选的芳族或杂环部分。
描述了式(10)的具有带有羧酸的硫醚部分的新型的美登木素生物碱衍生物的合成，包括以下步骤：
a.)将式V-V-Q-W-COOH的羧酸连接体共价连接至带有硫羟的美登木素生物碱，D’；其中Y″是硫羟反应性基团(如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)；Q表示任选的芳族或杂环部分。反应顺序由式(11)表示：
D’+Y″-V-Q-W-COOH→D’-Y’-V-Q-W-COOH (11)
其中：
V和W如上定义
D’如上定义；
Y″如上定义；
Y’是在带有巯基的美登木素生物碱和羧酸COOH之间的硫醚键；以及
Q表示任选的芳族或杂环部分。
b.)可以使用相对带有硫羟的美登木素生物碱D’(如DM1和DM4)化学计量的或过当量的式Y″-V-Q-W-COOH的羧酸连接体。反应进行到完成并且可通过如HPLC和TLC的分析方法监测。反应还可以用相对式Y″-V-Q-W-COOH的羧酸连接体过量的带有硫羟的美登木素生物碱D’进行。
c.)反应可以在合适的有机溶剂或缓冲水溶液和有机溶剂的混合物中进行，以使带有硫羟的美登木素生物碱D’和式Y″-V-Q-W-COOH的羧酸连接体完全溶解。合适的有机溶剂的实例包括四氢呋喃(THF)、1，2-二甲氧乙烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、甲醇或乙醇。当在有机溶剂和缓冲水溶液的混合物反应中进行时，必须控制pH值以促进巯基与马来酰亚胺或卤代乙酰胺Y″的反应。这个反应的合适的pH值范围是pH值为3-10，优选的pH值是5-9，并且最优选的pH值是6-8。
d.)当使用合适的有机碱和纯有机溶剂(如上所述的那些)时，在带有硫羟的美登木素生物碱D’和硫羟反应性基团Y″之间也会形成硫醚。有机碱(如N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)、三乙胺和4-甲基吗啉)可用于形成所需的带有羧酸的含有硫醚的美登木素生物碱。
e.)反应完成之后，可分离式(10)D’-Y’-V-Q-W-COOH的化合物。用于纯化具有带有羧酸的硫醚部分的美登木素生物碱的合适的技术包括硅胶色谱法、正相或反相制备型高效液相色谱法(HPLC)、制备型薄层色谱法(TLC)或结晶。
f.)式(10)D’-Y’V-Q-W-COOH的分离的产物的纯度和鉴别可由包括HPLC、质谱(MS)、LC/MS、1H NMR和13C NMR的分析方法来确定。
式(11)D’-Y’-V-Q-W-COOH的含有带有末端羧酸的硫醚部分的新型的美登木素生物碱衍生物可用于制备式(5)D’-Y’-V-Q-W-Z’的化合物。式(11)D’-Y’-V-Q-W-COOH的美登木素生物碱衍生物可进一步衍生化以得到胺反应性基团Z。优选的胺反应性基团Z’是活化酯(诸如但不限于N-琥珀酰亚胺基酯、N-磺基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯酯、四氟磺基苯基或硝基苯酯)。由式(11)的化合物制备式(5)的化合物的方法按照以下反应顺序：
D’-Y’-V-Q-W-COOH+X  →D-Y’-V-Q-W-Z’
其中X是N-羟基琥珀酰亚胺，以得到胺反应性的活化酯Z’。
式(5)D’-Y’-V-Q-W-Z’的美登木素生物碱可通过本文所述的已知方法由式(11)D’-Y’-V-Q-W-COOH的新型的美登木素生物碱衍生物制备。
a.)式(11)D’-Y’-V-Q-W-COOH的美登木素生物碱可在1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDCHCl)存在下在干燥有机溶剂(如二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二噁烷、二***)中与稍过量的N-羟基琥珀酰亚胺(X)反应。所述反应可使用除了EDCHCl以外的缩合剂。
b.)可使用标准化学技术(如TLC或HPLC)来监测反应的完成。
c.)反应完成之后，带有反应性N-羟基琥珀酰亚胺基酯的美登木素生物碱衍生物可通过硅胶色谱法或HPLC或结晶来纯化。
d.)式(5)D’-Y’-V-Q-W-Z’的分离的产物的纯度和鉴别可由包括HPLC、质谱(MS)、LC/MS、1H NMR和13C NMR的分析方法来确定。
G.与具有带有反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱的抗体缀合物的制备
描述了使用式(8)CB-(Z″-W-Q-V-Y’-D’)m的具有带有反应性基团的硫醚部分的分离的反应性美登木素生物碱衍生物制备不可裂解的硫醚连接的美登木素生物碱与细胞结合剂缀合物的方法(图39和40)，其包括以下步骤：
a.)将本发明的式(5)D’-Y’-W-Q-V-Z’的带有硫醚部分的纯化的胺反应性美登木素生物碱经由在细胞结合剂的赖氨酸残基和连接至具有硫醚键的美登木素生物碱的胺反应性基团之间形成的共价酰胺键共价连接至细胞结合剂CB(抗体)。
b.)取决于抗体的性质，可在0.5-10mg/mL抗体的浓度进行缀合反应。
b.)在与抗体缀合之前，可在纯有机溶剂中制备带有硫醚部分的胺反应性不可裂解的美登木素生物碱的储备溶液。用于制备储备溶液的合适的有机溶剂包括甲醇、乙醇、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲亚砜(DMSO)
c.)由于美登木素生物碱的疏水性，可能需要在缓冲水溶液和有机溶剂的混合物中进行与抗体的缀合以保证在缀合期间美登木素生物碱保持在溶液中。取决于在这些条件下的试剂的溶解度和抗体的性质，在缓冲水溶液中的有机溶剂的优选的量在0-30％(v/v)范围内。缀合可在pH值为3-10下进行，优选的pH值是5-9，且最优选的pH值是6-8。用于缀合反应的缓冲液是具有在这个pH值范围附近的pKa值的缓冲液，如磷酸盐和HEPES缓冲液。
c.)在缀合反应中可使用相对抗体5-50倍过量的带有硫醚部分的胺反应性美登木素生物碱，以得到每个抗体分子连接希望的数目的美登木素生物碱分子的缀合物。优选地，最终缀合物每个抗体连接2-8个美登木素生物碱是希望的范围。如抗体浓度、试剂的溶解度和pH值的条件可影响需要的美登木素生物碱试剂的过量倍数以及最终缀合物中每摩尔抗体连接的美登木素生物碱分子的数目。
d.)式(8)CB-(Z″-V-Q-W-Y’-D’)m的不可裂解的缀合物的纯化通过切向流过滤法、渗析法或色谱法(凝胶过滤法、离子交换色谱法(inexchange chromatography)、疏水作用层析法)或其组合进行。
实施例
不受任何特定方面束缚，描述用于与细胞结合剂缀合的具有不同反应性连接体的聚乙二醇((CH2CH2O)n)连接的药物的合成方法。这些缀合方法包括通过在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应性基团反应的经由聚乙二醇((CH2CH2O)n)连接体连接的抗体与药物(如美登木素生物碱)的一步缀合。
此外，描述了合成用于与抗体缀合的具有不同反应性连接体的含有二硫基的聚乙二醇((CH2CH2θ)n)连接的药物的方法。这些缀合方法包括通过在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应性基团反应的用具有聚乙二醇((CH2CH2O)n)连接体的二硫基连接的抗体与药物(如美登木素生物碱)的一步缀合。
以下实施例仅是说明性的，并非旨在限制本发明。
实施例I
通过含有传统的脂肪族碳间隔物的二硫连接体使抗体以每个抗 体分子与若干美登木素生物碱分子连接进行缀合：
在将抗体与若干美登木素生物碱DM4或DM1分子缀合的两步法中，首先用可商购的含有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺基团(NHS基团)和硫羟反应性2-吡啶基二硫代基团(-SSPy基团)的异双功能连接体(SPDB)修饰人源化抗体，以将若干连接体分子并入抗体分子(如W.C.Widdison等人，J Med.Chem.，2006，49，4392-4408所述)。将反应性连接体并入抗体分子之后，在第二反应步骤中，将具有反应性硫羟基的美登木素生物碱DM4或DM1加入连接体修饰的抗体中以通过二硫键使美登木素生物碱与抗体缀合。在特定的实例中，在室温下使用10-15倍摩尔过量的可商购的具有-(CH2)-n烷基的异双功能连接体(如SPDB、SPP、SPDP)在pH值为6.5-8的缓冲水溶液中修饰5-10mg/ml浓度的人源化抗体0.25-3小时，并随后通过凝胶过滤(使用例如Sephadex G25色谱法)纯化，以高产率(通常80-90％的产率)获得每个抗体分子具有平均8-12个连接体基团修饰的抗体。将过量1，4-二硫苏糖醇(DTT)试剂加入小份的连接体修饰的抗体样品时，根据2-硫代吡啶酮在343nm的吸光度(ε343nm＝8080M-1cm-1)，通过测量2-硫代吡啶酮的释放来评估连接的基团。在测量抗体上连接的反应性基团之后，使2.5mg/ml浓度的连接体修饰的抗体在6.5的pH值下与过量的美登木素生物碱DM4(对反应性连接体1.7倍摩尔过量的DM4硫羟)缀合。然而，在抗体-美登木素生物碱缀合反应期间观察到沉淀，并且通过凝胶过滤纯化抗体-美登木素生物碱缀合物后获得低产率的抗体-美登木素生物碱缀合物(～38-60％产率)。根据在252nm和280nm的吸光度测量并且使用美登木素生物碱和抗体在252nm和280nm的消光系数，确定每个抗体分子连接的美登木素生物碱的数目。除了在～1-1.5mg/ml的沉淀和抗体-美登木素生物碱缀合物的低产率之外，每个抗体分子并入的美登木素生物碱的数目显著低于(每个抗体分子平均～5.2-5.5个美登木素生物碱分子)基于并入每个抗体分子的最初反应性连接体基团的更大的平均数目(每个抗体分子～8-12个反应性连接体基团)所预期的，这说明带有更多美登木素生物碱的抗体缀合物被沉淀。在另一个实例中，首先用SPDB异双功能连接体修饰人源化抗体以使每个抗体分子并入11个吡啶基二硫代基团，其在与1.7倍摩尔过量的DM4美登木素生物碱硫羟进行第二反应后在反应混合物中显示出明显的沉淀，这导致抗体美登木素生物碱缀合物＜30％的非常差的收率。对于抗体-美登木素生物碱缀合物浓度为1mg/ml或更高时，使用可商购的具有脂肪族间隔物的异双功能连接体(如SPDB或SPDP)通常很难以高缀合产率在每个抗体上并入大于4或5个美登木素生物碱分子。观察到的该沉淀和具有SPDB或SPDP衍生的连接体的抗体-美登木素生物碱缀合物的低产率在抗体最初的SPDB或SPDP连接体修饰后(与美登木素生物碱缀合之前)未被发现，这说明抗体-美登木素生物碱缀合物的聚集和沉淀大概由连接的疏水性分子引起。
实施例II
通过含有亲水性聚环氧乙烷间隔物(PEG n 或(-CH 2 -CH 2 -O) n＝1-14 ) 的二硫连接体使抗体以每个抗体分子与若干美登木素生物碱分子连 接进行缀合：
为了研究亲水性间隔物(如聚环氧乙烷(PEGn或(-CH2-CH2-O)n＝1-14))是否能够防止具有大数目美登木素生物碱分子(平均每个抗体分子＞4个)的抗体美登木素生物碱缀合物的聚集和沉淀，制备了若干种新的异双功能和单功能美登木素生物碱衍生物，其可通过直接修饰或两步反应与抗体缀合，所述两步反应包括在赖氨酸残基对抗体初始衍生化，随后进行美登木素生物碱的反应(参见，例如图3、6、11和12)。
15-(2-吡啶基二硫代)-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸的合成
在10mL圆底烧瓶中于5.0mL 1，2-二甲氧乙烷中制备2，2’-二吡啶二硫(aldrithiol-2，1.17g，5.31mmol)的溶液。向反应烧瓶中添加溶于1.0mL 1，2-二甲氧乙烷的3-(2-硫代四甘醇)丙酸(QuantaBiodesign，490mg，1.73mmol)溶液。反应在搅拌下进行3.5小时，通过二氧化硅色谱法(silica chromatography)用在二氯甲烷中的5％甲醇洗脱来纯化产物。真空除去溶剂以得到432mg(产率64％)所需的产物。
PySS-PEG4-NHS[15-(2-吡啶基二硫代)-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯]的合成
向10mL圆底烧瓶中装入15-(2-吡啶基二硫代)-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸(431mg，1.10mmol)、5.0mL二氯甲烷和搅拌棒。向反应容器中加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg，0.31mmol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(6.8mg，0.036mmol)，使反应在室温搅拌下进行2小时。通过二氧化硅色谱法用在二氯甲烷中的7％1，2-二甲氧基乙烷洗脱来纯化产物。真空除去溶剂以得到206mg所需的产物(产率38％)。MS：m/z：实测值：511.1(M+Na)+，计算值：511.2。
15-(DM4-二硫代)-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸的合成
在0.75mL 1，2-二甲氧基乙烷中制备N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4，18.6mg，0.0239mmol)和15-(2-吡啶基二硫代)-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸(14.0mg，0.0358mmol)的溶液。将4-甲基吗啉(6.0mg，0.0597mmol)加入反应容器，使反应在室温搅拌下进行24小时。反应完成后，将粗反应混合物真空干燥并且不经进一步纯化即可使用(图6)。
15-(DM4-二硫代)-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DM4-SPEG4-NHS)的合成
将粗15-(DM4-二硫代)-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸溶于2.0mL二氯甲烷，并与N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg，0.31mmol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(6.8mg，0.036mmol)混合。将溶液搅拌2.5小时，通过二氧化硅色谱法用在二氯甲烷中的4％甲醇洗脱来纯化产物。真空除去溶剂以得到15.0mg所需的产物(产率54％)。MS：m/z：实测值：1179.3(M+Na)+，计算值：1179.4(图6)。
使用含有亲水性聚环氧乙烷间隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n＝1-14)的二硫连接体使抗体以每个抗体分子与大数目的美登木素生物碱分子连接进行两步缀合：
当具有亲水性间隔物(如聚环氧乙烷(PEGn或(-CH2-CH2-O)n＝1-14))的新异双功能试剂用于修饰抗体，随后与DM4硫羟缀合时，得到新的观察结果。具有亲水性PEGn间隔物的抗体-美登木素生物碱缀合物的缀合混合物没有显示任何沉淀，并始终给出具有非常高的单体部分(＞90％)的高缀合产率(＞70％)。例如，在30℃下用相对抗体浓度若干倍摩尔过量的PySS-PEG4-NHS试剂在pH值为8的缓冲液中修饰浓度为8mg/ml的人源化抗体1小时，随后通过凝胶过滤纯化。每个抗体分子连接的二硫代吡啶基评估为～4-16个，该评估通过等分试样的2-硫代吡啶酮的释放试验进行，其中使用过量的二硫苏糖醇，将基于1.4倍摩尔过量的DM4美登木素生物碱硫羟加入每个二硫代吡啶基-PEGn-连接体修饰的抗体溶液中，在pH值为6.5下用于缀合步骤(在25℃下过夜)，随后通过凝胶过滤纯化缀合物(图12)。对带有不同初始连接体并入物的不同缀合混合物来说，最终每个抗体并入的美登木素生物碱的数值范围为每个抗体分子平均3至9个美登木素生物碱，没有观察到沉淀，产率＞70％及非常高的单体(＞90％单体，基于使用20％异丙醇或0.4M高氯酸纳的尺寸排阻TSK-GEL G3000 HPLC)。通过HiSep混合模式色谱法(HiSep柱，Supelco)，确定最终缀合物中未缀合的药物少于0.6％，这表示美登木素生物碱与抗体共价连接。在另一个实例中，在25℃下，用相对抗体浓度若干倍摩尔过量的PySS-PEG4-NHS试剂在pH值为6.5的缓冲液中修饰浓度为8mg/ml的人源化抗体1.5小时，随后通过凝胶过滤纯化。抗体样品上的带有二硫代吡啶基-PEGn的连接体基团评估为每个抗体分子6-18个，其随后在pH 6.5、25℃下与1.3-1.7倍摩尔过量的DM4美登木素生物碱硫羟反应过夜，随后通过凝胶过滤纯化。没有观察到沉淀，～1-2mg/ml的最终抗体-美登木素生物碱缀合物样品显示高的单体部分(＞90％)，这表示没有聚集，以及每个抗体～3.1至7.1的大数目的共价连接的美登木素生物碱分子，而且很少未缀合的美登木素生物碱(＜1.7％未缀合美登木素生物碱，通过HiSep色谱法评估)。在4℃下储存后直至分析的最长时间(1.5个月)，每个抗体高药物负载的缀合物是稳定的。
使用含有亲水性聚环氧乙烷间隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n＝1-14)的二硫连接体使抗体以每个抗体分子与大数目的美登木素生物碱分子连接进行一步缀合：
在一步缀合方法中，通过在30℃下用10-20倍摩尔过量的DM4-SPEG4-NHS试剂在pH值为8的缓冲液中缀合浓度为4mg/ml的人源化抗体2小时，产生具有含有亲水性聚环氧乙烷间隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n＝1-14)的二硫连接体的抗体-美登木素生物碱缀合物，随后通过凝胶过滤纯化以得到浓度为1.4mg/ml的每个抗体分子缀合6.6个美登木素生物碱(82％单体)的抗体-美登木素生物碱缀合物(图11)。因此，两步法和一步法都用于获得具有含有亲水聚环氧乙烷间隔物(PEGn或(-CH2-CH2-O)n＝M4)的二硫连接体的每个抗体分子连接大数目的美登木素生物碱。
实施例III
通过含有亲水性聚环氧乙烷间隔物(PEG n 或(-CH 2 -CH 2 -OU)的 硫醚连接体使抗体以每个抗体分子与若干美登木素生物碱分子连接 进行缀合：
为了直接修饰抗体的赖氨酸残基，在一步法中最初使用具有传统的脂肪族连接体(如衍生自SPP的烷基连接体)的美登木素生物碱的N-羟基琥珀酰亚胺酯(描述于W.C.Widdison等人，J.Med.Chem.，2006，49，4392-4408)来缀合抗体。尝试在30℃下用8倍摩尔过量的DM1-SPP-NHS试剂作为测试试剂在pH值为8的缓冲液中缀合5mg/ml的人源化抗体2小时(随后凝胶过滤并渗析)，这导致明显的沉淀和聚集，以致最终缀合物仅有61％的单体，每个抗体连接约3.3个美登木素生物碱。相比之下，在相似条件下使用DM1-Mal-PEG4-NHS试剂得到1.1mg/ml的缀合物，其中每个抗体连接5.4个美登木素生物碱分子，在最终缀合物中没有沉淀(图7或9)。类似地，DM1-Mal-PEG2-NHS试剂用于获得每个抗体分子经由硫醚键连接的大数目的缀合的美登木素生物碱。在另一个实例中，在30℃下用10和20倍摩尔过量的DM1-Mal-PEG4-NHS试剂在pH值为8的缓冲液中缀合4mg/ml的鼠IgG抗体2小时，随后凝胶过滤以得到浓度为～1mg/ml的抗体-美登木素生物碱缀合物(其中每个抗体分子4.1和7.8个共价缀合的美登木素生物碱分子(98％单体))以及不能检出的水平的未缀合药物(HiSep HPLC分析)。在另一个实例中，用过量DM1-Mal-PEG4-NHS试剂缀合人源化抗体以得到每个抗体平均连接10.7个美登木素生物碱分子(990％单体；1.1mg/ml浓度)。PEG4连接的硫醚缀合物还可使用图8和图10中列出的两步缀合过程由抗体制备。因此，通过使用亲水性连接体(如PEGn或(-CH2-CH2-O)n)，每个抗体分子可并入大数目的美登木素生物碱分子(参见例如图1、2、4、5、7、8、9、10、13、14、15、16、17、18、19、20和21)。
DM1-Mal-PEG2-NHS的合成
在0.70mL THF中制备N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1，13.4mg，0.0182mmol)的溶液，并且添加在1.5mL的磷酸钾缓冲水溶液(50mM，pH 6)和THF的2∶1(v/v)混合物中的琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-二甘醇]酯(NHS-PEG2-马来酰亚胺，Quanta Biodesign，11.6mg，0.0273mmol)。反应在室温搅拌下进行1小时，TLC分析显示反应完成。通过二氧化硅色谱法用在二氯甲烷中的8％乙醇洗脱来纯化粗反应混合物；真空除去溶剂以得到6.0mg(产率28％)所需的产物。MS：m/z实测值：1185.3(M+Na)+，计算值：1184.4(图4)。
DM1-Mal-PEG4-NHS的合成
在0.50mL THF中制备N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1，28.1mg，0.0381mmol)的溶液，并且添加在1.5mL的磷酸钾缓冲水溶液(50mM，pH 6)和THF的2∶1(v/v)混合物中的琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺，Quanta Biodesign，39.1mg，0.0762mmol)。反应在室温搅拌下进行1小时，TLC分析显示反应完成。通过二氧化硅色谱法用在二氯甲烷中的6％乙醇洗脱来纯化粗反应混合物；真空除去溶剂以得到9.6mg(产率20％)所需的产物。MS：m/z实测值：1273.5(M+Na)+，计算值：1273.5(图4)。
实施例IV
带有高美登木素生物碱抗体种类的质谱分析：
为了分析具有亲水PEG连接体的带有高美登木素生物碱抗体种类，选择每个抗体平均10.7个DM1的带有非常高的美登木素生物碱的Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物。将所述缀合物去糖基化，随后通过ESI-TOF MS分析(图22)。质谱显示标有不同数目连接的美登木素生物碱的抗体的各种种类，所述美登木素生物碱的范围为每个抗体4-15个药物，最多的是每个抗体约8-9个药物。该分布是正态的，这表明对于带有高药物种类没有失去选择性，这与最终缀合物的高溶解度是一致的。每个抗体平均10.7个DM1的带有高美登木素生物碱的Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物的尺寸排阻层析HPLC显示出人意料地高(＞99％)含量的单体(图23)。
实施例V
带有高美登木素生物碱的抗体种类的FACS结合类似于未修饰 的抗体的FACS结合：
通过流式细胞术比较若干抗体的带有高美登木素生物碱的缀合物与未修饰的抗体对不同靶点(如EpCAM、CanAg和CD56)的结合。简单地说，将抗原阳性细胞与缀合物或未修饰的抗体在4℃下温育，随后与二抗-FITC缀合物在4℃下温育，用甲醛(在PBS中的1％)固定并通过流式细胞术分析。对于评价的所有缀合物，在缀合物的结合和未修饰抗体的结合之间没有观察到显著差异。一个实例在图24中示出，其中带有10.7个美登木素生物碱的Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物以与未修饰的抗体相似的高亲合力与抗原阳性细胞结合。
实施例VI
具有含有聚环氧乙烷间隔物(PEG n 或(-CH 2 -CH 2 -O) n )的硫醚和 二硫连接体的抗体的美登木素生物碱缀合物的体外细胞毒性评价：
通常在癌细胞与缀合物一起持续温育4-5天之后，使用WST-8细胞生存力试验来评价具有含有PEGn间隔物的硫醚和二硫连接体的抗体-美登木素生物碱缀合物的细胞毒性影响。在96孔板中的含有胎牛血清的常规生长培养基中，使抗原表达癌细胞(每个孔～1000-5000个细胞)与各种浓庋的抗体-美登木素生物碱缀合物温育约5天。随后添加WST-8试剂，～2-5小时之后在450nm下测量板的吸光度。将存活分数对缀合物浓度作图以确定缀合物的IC50值(50％细胞杀灭浓度)。
图25示出对于PEG4连接的硫醚缀合物(Ab-PEG4-Mal-DM1)，具有增加的药物负载的抗EpCAM Ab-美登木素生物碱缀合物的效价增加，这也显示，对于EpCAM抗原阳性COL O 205-抗多药物性细胞(COL O 205-MDR细胞)，与每个抗体约4个美登木素生物碱的相似药物负载的硫醚连接的SMCC-DM1和二硫连接的SPDB-DM4缀合物相比具有较高的效价。硫醚连接的抗EpCAM Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物在4.1和7.8个美登木素生物碱负载下的效价是新的，并且可能非常有望用于治疗应用。
图26示出抗CanAg Ab-美登木素生物碱缀合物对CanAg抗原阳性COL O 205-MDR细胞的细胞毒性活性。与具有类似美登木素生物碱负载的硫醚连接的Ab-SMCC-DM1缀合物相比，硫醚连接的Ab-PEG4-Mal-DM1和Ab-PEG2-Mal-DM1缀合物再次显示出较高的效价。
图27示出具有含有PEG的硫醚和二硫连接体的抗CD56抗体-美登木素生物碱缀合物对CD56表达Molp-8多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性活性。与带有3.8个药物的缀合物(IC50＝1.9nM)相比，每个抗体7.7个药物的硫醚连接的PEG4缀合物(Ab-PEG4Mal-DM1)在细胞毒性效价方面显示出乎意料地增加至100倍(IC50值为0.019nM)。
图28示出对于EpCAM阳性抗多药物性HCT15细胞，与每个抗体约4个美登木素生物碱的相似药物负载的传统硫醚连接的SMCC-DM1相比，带有PEG4连接的硫醚缀合物的抗EpCAM Ab-美登木素生物碱缀合物(Ab-PEG4-Mal-DM1)的效价增加。硫醚连接的抗EpCAM Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物的高效价是新发现，并且可能非常有望用于治疗应用。图29示出对于EpCAM阳性抗多药物性COLO 205细胞，与每个抗体约4个美登木素生物碱的相似药物负载的传统硫醚连接的SMCC-DM1相比，带有PEG4连接的硫醚缀合物的抗EpCAM Ab-美登木素生物碱缀合物(Ab-PEG4-Mal-DM1)的效价增加。硫醚连接的抗EpCAM Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物的效价增加是新发现，并且可能非常有望用于治疗应用。图37示出对于EGFR阳性UO-31人肾癌细胞，与具有3.7个美登木素生物碱/Ab的非亲水性SMCC-DM1缀合物相比，具有亲水性硫醚连接的PEG4连接体的抗EGFR Ab-美登木素生物碱缀合物(Ab-PEG4-Mal-DM1)的细胞毒性的效价增加。PEG4-Mal-DM1的效价大于具有传统连接体的SMCC-DM1缀合物的约10倍。
实施例VII
体内药代动力学：
含有亲水性PEG4连接体并带有6.7个D/A(美登木素生物碱/抗体)的人源化抗CD56抗体(Ab)-PEG4-Mal-DM1缀合物的血浆药代动力学与含有传统的脂肪族碳链连接体并带有4个D/A的Ab-SMCC-DM1缀合物的血浆药代动力学相比较(图38A)。对CD1小鼠静脉注射(单次大剂量)5mg/kg缀合物(基于抗体的剂量；每组3个小鼠)。在若干时间点收集血浆样本直到4周为止。使用ELISA分析血浆样本的抗体浓度和缀合物浓度。对于抗体ELISA，将血浆样本加入含有涂覆、固定的山羊抗人IgG(H+L)抗体的微量滴定板，洗涤，并且使用辣根过氧化酶缀合的山羊抗人IgG(Fcγ)抗体检测。对于缀合物浓度，将血浆样本加入含有涂覆、固定的山羊抗人IgG(H+L)抗体，洗涤，并且使用生物素化的抗美登素抗体和碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素检测。抗体浓度和缀合物浓度的ELISA结果都显示带有高6.7DM1/Ab负载的具有亲水性PEG4连接体的Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物在4周的研究期间能很好地保留在血浆中。
图38A示出具有高美登木素生物碱负载(6.7DM1/Ab)的使用PEG4连接体的抗体-美登木素生物碱缀合物的体内药代动力学与带有4DM1/Ab的标准连接体缀合物的体内药代动力学相比较。即使具有高美登木素生物碱负载，具有6.7美登木素生物碱/Ab的PEG4连接的硫醚缀合物(Ab-PEG4-Mal-DM1)仍具有比标准缀合物长的半衰期。在另一个实施例中，在CD-1小鼠中以10-12mg/kg静脉注射(i.v.)剂量，将具有3H标记的DM1(在3.3美登木素生物碱/Ab)的人源化C242 Ab-PEG4-Mal-3H-DM1缀合物的血浆药代动力学与未缀合的抗体以及含有传统的脂肪族碳链连接体并带有类似的4.2D/A负载的Ab-SMCC-3H-DM1缀合物进行比较(图38B)。如通过抗体浓度(ELISA；图38B)和缀合物浓度(3H标记计算)所测量的，在4周期间，与具有类似美登木素生物碱负载的传统的SMCC连接体缀合物相比，Ab-PEG4-Mal-3H-DM1缀合物显示更高的血浆浓度。PEG4-Mal连接的缀合物的半衰期是16天，与之相比，SMCC连接的缀合物的半衰期是12.6天，因此PEG4-Mal连接的缀合物比SMCC缀合物大大改善(图38B)。重要的是，在CD-I小鼠中，在10mg/kg静脉注射(i.v.)剂量的具有3.3D/A的Ab-PEG4-Mal-DM1缀合物的曲线下的面积(AUC)(AUC＝38790h.μg/mL)与在类似12mg/kg静脉注射(i.v.)剂量的未缀合抗体的AUC(AUC＝38798h.μg/mL)相似，但比在10mg/kg静脉注射(i.v.)剂量的具有4.2D/A的Ab-SMCC-DM1缀合物的AUC(AUC＝25910h.μg/mL)好得多(图38B)。
实施例VIII
抗EpCAM-美登木素生物碱缀合物、muB38.1-MCC-DM1和 muB38.1-PEG4-mal-DM1缀合物对抗结肠癌(HCT15)异种移植的体 内抗肿瘤活性的比较
muB38.1-MCC-DM1和muB38.1-PEG4-mal-DM1缀合物的抗肿瘤作用在人结肠癌的异种移植模型(HCT15)中评价，HCT15显示过表达P糖蛋白并且对多种药物有抗性。在SCID小鼠的右肩下的区域皮下注射HCT15细胞(每个动物1x107细胞)。当肿瘤体积达到大约140mm3大小时(肿瘤细胞接种后9天)，将小鼠按肿瘤体积随机化并分成三组(每组5个动物)，将每组用单次静脉注射(i.v.)大剂量的muB38.1-MCC-DM1(20mg缀合物蛋白质/kg)、muB38.1-PEG4-mal-DM1(抗体剂量20mg/kg)或磷酸盐缓冲盐水(媒介物对照)治疗。通过每周两次测量肿瘤大小监测肿瘤生长。肿瘤大小用以下公式计算：长×宽×高×1/2。
肿瘤体积的平均变化在例如图30中示出。在PBS对照组中，接种细胞后20天后，肿瘤达到600mm3的肿瘤体积。用muB38.1-MCC-DM1的治疗导致肿瘤生长延迟15天。用muB38.1-PEG4-mal-DM1的治疗显示更强的抗肿瘤作用，五个动物中的两个肿瘤完全退化，持续44天并且三个动物肿瘤生长延迟32天。
因此，在这个人结肠癌异种移植模型中，本发明的缀合物muB38.1-PEG4-mal-DM1显然比muB38.1-MCC-DM1更有效。
实施例IX
抗EpCAM-美登木素生物碱缀合物(muB38.1-MCC-DM1和 muB38.1-PEG4-mal-DM1)对抗结肠癌(COLO205-MDR)的异种移 植的体内抗肿瘤活性的比较
muB38.1-MCC-DM1和muB38.1-PEG4-mal-DM1缀合物的抗肿瘤作用在人结肠癌的异种移植模型(COLO205-MDR)中进行评价，COLO205-MDR被工程改造以过表达P糖蛋白。在SCID小鼠右肩下的区域皮下注射COLO 205-MDR细胞(每个动物1x107个细胞)。当肿瘤体积达到大约170mm3大小时(肿瘤细胞接种后8天)，随机将小鼠分成三组(每组6个动物)，将每组用单次静脉注射(i.v.)大剂量的muB38.1-MCC-DM1(20mg缀合物蛋白质/kg)、muB38.1-PEG4-mal-DM1(抗体剂量20mg/kg)或磷酸盐缓冲盐水(媒介物对照)治疗。通过每周两次测量肿瘤大小监测肿瘤生长。肿瘤大小用以下公式计算：长×宽×高×1/4。
肿瘤体积的平均变化在例如图31中示出。在PBS对照组中，肿瘤在38天内生长至约1000mm3。用muB38.1-MCC-DM1治疗导致肿瘤生长延迟14天。用muB38.1-PEG4-mal-DM1的治疗具有显著的抗肿瘤作用，在所有6个动物中导致完全的肿瘤退化(图31)。
还对COLO 205异种移植进行了类似试验。此外用B38.1-PEG4-mal-DM1的治疗是更有效的，导致完全的肿瘤退化，而标准SMCC缀合物仅显示中度的肿瘤生长延迟(图32)。
用人源化抗CanAg抗体的缀合物获得类似的结果(图33)。
因此，在这个人结肠癌异种移植模型中，本发明的缀合物muB38.1-PEG4-mal-DM1显然比缀合物muB38.1-MCC-DM1(用前述的连接体制备)更有效。
实施例X
PEG长度的评价：
用PEG4、PEG8、PEG12、PEG24连接体和并入每个抗体的各种数目的DMx制备了若干Ab-PEGn-Mal-DMx缀合物。图34证明具有很高的17.1D/A负载的Ab-PEG24-Mal-DM1缀合物显示与未修饰的抗体类似的与抗原表达癌细胞的结合(通过流式细胞术以相对平均荧光RMF单位测量的结合)。同样，通过细胞结合流式细胞术，带有4至8个D/A的Ab-PEG8-Mal-DM1缀合物和Ab-PEG12-Mal-DM1缀合物显示与未修饰的抗体类似的结合。用PEG4、PEG8、PEG12、PEG24连接体制备的Ab-PEGn-Mal-DMx缀合物在细胞毒性方面对抗原阳性细胞是有效的。图35证明在温育5天后具有4至17个D/A的抗CanAg抗体(huC242)-PEGn-Mal-DM 1缀合物杀灭CanAg抗原阳性COLO205细胞，其有效的IC50为约0.1-0.5nM。表达pgp的抗多药物性COLO205-MDR细胞由带有4至17个D/A的huC242-PEGn-Mal-DM1缀合物以约0.05至0.5nM的IC50的有效方式杀灭(图36)。具有高的17.1个D/A的PEG24-Mal-DM1缀合物在细胞毒性方面比具有4个D/A的PEG24-Mal-DM1缀合物更有效(图34、36)。
实施例XI
带有含有胺反应性基团的不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基部分的 美登木素生物碱与抗体的缀合
使用一步法用带有不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基的美登木素生物碱的N-羟基琥珀酰亚胺酯缀合抗体(图41)。在与抗体缀合之前，用异双功能的带有马来酰亚胺的交联剂修饰带有巯基的美登木素生物碱并分离(图43)，以得到不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基连接的抗体美登木素生物碱缀合物(图39)。反应用SMCC试剂(其在马来酰亚胺和NHS酯之间含有烃环)进行，可以使用类似方法使带有巯基的美登木素生物碱与在马来酰亚胺和NHS酯之间含有直链烃的异双功能连接体反应(图44)。
DM1-SMCC的合成
将N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1，67.9mg，0.092mmol)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC，32.1mg，0.096mmol，1.05当量)和THF(4mL)装入圆底烧瓶。搅拌溶液并将试剂溶于溶剂以得到透明无色溶液。随后添加pH值为6的磷酸盐缓冲液(4mL，100mM磷酸钾，2mMEDTA)。将反应烧瓶配备隔垫和搅拌棒并在室温下剧烈搅拌下进行反应。根据反相HPLC显示反应在30分钟内完成。反应完成之后，将反应物体积在真空中减少以得到白色固体/残留物。通过硅胶色谱法，用在二氯甲烷中的3％甲醇的混合物洗脱来分离产物。将含有产物的馏分合并并真空浓缩至干燥以得到63mg(产率63.9％)呈白色固体的DM1-SMCC。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+(m/z1094.4)和m+Cl-(m/z 1106.2)主要分子离子(图43)。
抗体与DM1-SMCC的一步缀合
在DMA(10.7mg/mL)中制备DM1-SMCC试剂的10mM储备液(w/v)。将储备溶液在EtOH中稀释并在280nm对EtOH和DMA试剂空白测量吸光度。通过使用在280nm的5700M-1消光系数(其为DM1在该波长的消光系数)计算储备DM1-SMCC试剂的浓度。因为没有测定DM1-SMCC的实际消光系数，所以这仅是浓度的估算。
使用7倍摩尔过量的DM1-SMCC试剂与5mg/mL的抗体缀合。最初用若干过量的DM1-SMCC滴定抗体以测定希望的DM1∶Ab比例，对于人抗体通常这个范围是6-10倍摩尔过量。反应在室温下在具有DMA(5％v/v)的pH值为7.5的缓冲液中进行90分钟。随后使反应混合物在4℃下保持12-36小时。随后通过在pH值为5.5的柠檬酸盐缓冲液中平衡的NAP-5(Sephadex G25)柱纯化缀合物，过滤并对pH值为5.5的柠檬酸盐缓冲液渗析以除去任何未反应的游离药物。渗析之后，缀合物每摩尔抗体连接3.1个DM1分子并且在缀合物中没有可检测的游离药物存在(图39，m＝3.1)。通过测定缀合物在252和280nm的吸光度并使用DM1和抗体在这两个波长的已知消光系数来测量最终缀合物中的每个Ab抗体分子的DM1分子的数目(平均值)。
对缀合物进行SEC HPLC以显示缀合之后是96.8％的单体。
还通过尺寸排阻LC/MS分析最终缀合物。经由本发明所述的方法制备的缀合物显示仅含有预期峰分布的去糖基化缀合物的希望的MS波谱(图45)。
DM4-SMCC的合成
将N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4，22.0mg，0.0282mmol)和琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC，24.2mg，0.0723mmol，2.50当量)和玻璃蒸馏的THF(1mL)装入圆底烧瓶。搅拌溶液并将试剂溶于溶剂以得到透明无色的溶液。随后添加pH值为6的磷酸盐缓冲液(1mL，100mM磷酸钾，2mM EDTA)。将反应烧瓶配备隔垫和搅拌棒并在室温下剧烈搅拌下进行反应。根据反相HPLC显示反应在7小时之后完成。反应完成之后，将产物萃取到乙酸乙酯(3×25mL)中，用盐水(5mL)洗涤并真空干燥。通过硅胶色谱法，用在二氯甲烷中的3％乙醇的混合物洗脱来分离产物。将含有产物的馏分合并并真空浓缩以得到19.74(产率62.8％)mg DM4-SMCC。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+(m/z 1136.4)和m+Cl-(m/z 1148.4)主要分子离子。
抗体与DM4-SMCC的一步缀合
将在pH为8.0的缓冲水溶液(100mM磷酸钠)中的人源化抗体的溶液(2.5mg/mL)与在二甲亚砜(DMSO)中的10倍摩尔过量的DM4-SMCC一起温育以得到20％的最终DMSO浓度。缀合在室温下进行一小时。通过流经在pH值为5.5的缓冲液(10mM组氨酸，130mM甘氨酸，5％(w/v)蔗糖，pH 5.5)中平衡的Sephadex G25凝胶过滤柱来纯化缀合物。通过测定缀合物在252和280nm的吸光度并使用DM4和抗体在这两个波长的已知消光系数来测量最终缀合物中的每个抗体分子连接的DM4分子的数目(平均)。
纯化之后，缀合物每分子抗体连接3.7个DM4分子。对最终缀合物进行SEC分析以显示在最终缀合物上存在＞95％的单体而＞5％的游离药物种类。缀合物的渗析可能使存在的不希望的游离药物种类减少。
实施例XII
带有含有胺反应性基团的不可裂解的硫代乙酰氨基部分的美登 木素生物碱与抗体的缀合
使带有巯基的美登木素生物碱DM1与溴乙酸反应以得到硫代乙酰氨基连接的羧酸衍生物。用N-羟基琥珀酰亚胺进行酯化得到胺反应性不可裂解的硫代乙酰氨基连接的美登木素生物碱(图48)。分离的化合物与抗体(图42)的一步缀合得到不可裂解的抗体美登木素生物碱缀合物(图40)。
或者，用异双功能的带有卤代乙酰胺的交联剂修饰带有巯基的美登木素生物碱DM4以得到带有硫代乙酰氨基部分的胺反应性美登木素生物碱(图49)。分离的化合物与抗体的一步缀合(图42)得到不可裂解的硫代乙酰氨基连接的抗体美登木素生物碱缀合物(图40)。
DM1-SBA的合成
将N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1，183.4mg，0.248mmol)和无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF，3mL)装入圆底烧瓶。搅拌反应溶液并依次添加溴乙酸(37.9mg，0.273mmol，1.1当量)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU，75.6mg，0.497mmol)。将烧瓶配备隔垫和搅拌棒并使反应在室温下剧烈搅拌下进行1小时。反应完成之后使反应物体积在真空中减少到粗油状物。将粗产物溶于最小量体积的二氯甲烷并且通过硅胶色谱法分离产物，用5％乙醇、0.5％乙酸和94.5％二氯甲烷的混合物洗脱。将含有产物的馏分合并且在真空中使体积减少以得到158.8mg(产率80.4％)硫代乙酰氨基连接的DM1羧酸衍生物，HPLC纯度为94.6％。
将上述反应的产物(158.8mg，0.199mmol)和二氯甲烷(15mL)装入圆底烧瓶。随后添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，25.2mg，0.219mmol，1.1当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC，57.2mg，0.298mmol)。反应在室温搅拌下进行直到完成。反应完成之后(～45min)，将反应混合物用乙酸乙酯(20mL)稀释，转移到分液漏斗中，用pH值为6的磷酸盐缓冲液(15mL，100mM磷酸钾，2mM EDTA)和盐水(7mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并真空浓缩，以得到粗灰白色固体。通过硅胶色谱法用在乙酸乙酯中的10％1，2-二甲氧乙烷的混合物洗脱来分离产物。将含有产物的馏分合并且真空浓缩以得到34.5mg(产率19.4％)DM1-SBA，反相HPLC纯度为96.0％。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+(m/z 915.2)和m+Cl-(m/z 927.0)主要分子离子。
抗体与DM1-SBA的一步缀合
在DMA中制备DM1-SBA试剂的10.8mM储备液(w/v)。使用10.2倍摩尔过量的DM1-SBA试剂与2.5mg/mL的抗体缀合。在室温下使反应在具有DMA(10％v/v)的pH值为7.5的缓冲液(100mM磷酸钾)中进行90分钟。随后经S300凝胶过滤(Sephadex S300)柱用pH值为6.5的缓冲液(10mM磷酸钾，140mM氯化钠)洗脱来纯化缀合物。纯化之后，缀合物具有每摩尔抗体连接3.7个DM1分子和～0.18％游离药物(图40，m＝3.7)。
对缀合物进行SEC HPLC以显示缀合之后是99.6％的单体。
N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯的合成(还可商购获得)
将2-溴乙酸(2.79g，20.08mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(2.54g，22.12mmol)和二氯甲烷(30mL)装入100mL圆底烧瓶。在冰浴中搅拌溶液并添加N，N-二环己基碳二亚胺(DCC，4.46g，22.14mmol)。使反应在冰浴中搅拌一小时并在室温下再搅拌一小时。
将反应混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并真空浓缩以得到粗白色固体。将固体溶于热二氯甲烷(30mL)并用己烷(25mL)再结晶。通过过滤收集固体，用己烷冲洗并真空干燥以得到3.99g(产率84％)呈白色固体的N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯。1H NMR(CDCl3)d 2.864(s，4H)和4.100(s，2H)ppm。
DM4-SBA的合成
将N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4，71.9mg，0.092mmol)和无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF，2.5mL)装入圆底烧瓶。将反应置于氩气氛下并依次添加N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA，23.9mg，0.101mmol，1.1当量)和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU，14.7mg，0.097mmol，1.05当量)。将烧瓶配备隔垫和搅拌棒并使反应在室温下剧烈搅拌下进行直到完成。通过制备型氰基HPLC，以单次注射，用在己烷中的15-65％乙酸乙酯的梯度液洗脱30分钟，随后用增加至65-95％的乙酸乙酯洗脱10分钟来分离产物。在这些条件下，DM4-SBA在22-24分钟之间洗脱。收集产物并真空浓缩以得到50.1mg(产率55.2％)所需的DM4-SBA(纯度95％)产物。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+(m/z 957.4)和m+Cl-(m/z 969.2)主要分子离子。
实施例XIII
带有羧基部分的不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基连接的美登木素 生物碱衍生物的制备。
可修饰带有巯基的美登木素生物碱(如DM1和DM4)以得到不可裂解的带有硫代琥珀酰亚胺基的羧酸衍生物(图45、46和48)。这些衍生物可用于制备本文所述的胺反应性不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基连接的美登木素生物碱。图45、46和48示出N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯的形成，然而对本领域技术人员很明显的是，可形成若干其它活化的酯，这些酯包括(但不限于)N-磺基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯酚酯、四氟磺基苯酚和硝基酚酯。可以用同双功能马来酰亚胺试剂修饰带有巯基的美登木素生物碱(如DM1和DM4)以得到如图50所示的带有马来酰亚胺基团的美登木素生物碱。
DM1-MCC的制备
向10mL圆底烧瓶中装入DM1(44.6mg，0.0571mmol)、1，2-二甲氧乙烷(2.5mL)并配备搅拌棒。将在1，2-二甲氧乙烷(0.5mL)中的N-[4-(羧基环己基甲基)]马来酰亚胺(Toronto Research Chemicals，Inc.，MCC，20.3mg，0.08430mmol)的溶液加入反应烧瓶，随后添加pH值为7.5的缓冲液(2.5mL，50mM磷酸钾，2mM EDTA)。向反应溶液中加入几滴饱和碳酸氢钠水溶液以保持反应pH值。反应在室温下进行并且2小时之后完成。将反应物体积在真空中减半，酸化至pH值为3并且将产物萃取到乙酸乙酯(3×10mL)中。将萃取液合并，用盐水(5mL)洗涤并真空浓缩以得到粗产物。通过硅胶色谱法，用二氯甲烷和乙醇的93∶7混合物洗脱来分离产物。将含有产物的馏分合并且浓缩以得到46.5mg(产率83.5％)呈白色固体的DM1-MCC(纯度99.3％)。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+主要分子离子(m/z 997.3)。
DM4-SMCC的制备
将DM4(24.3mg，0.0311mmol)、N-[A-(羧基环己基甲基)]马来酰亚胺(MCC，Toronto Research Chemicals，Inc，.8.1mg，0.0342mmol)和1，2-二甲氧乙烷(1mL)装入3mL玻璃小瓶。搅拌溶液并向反应物中添加pH值为7.5的缓冲液(1mL，50mM磷酸钾，2mMEDTA)。反应在室温下进行并在两小时内完成。将反应物体积在真空中减半，酸化至pH值为3并且将产物萃取到乙酸乙酯(3×10mL)中。将萃取液合并，用盐水(5mL)洗涤并真空浓缩以得到粗产物。通过硅胶色谱法，用二氯甲烷和乙醇的9∶1混合物洗脱来分离产物。将含有产物的馏分合并且浓缩以得到14.8mg(产率46.9％)呈白色固体的DM4-MCC(纯度96.7％)。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+主要分子离子(m/z 1039.5)。
实施例XIV
带有硫羟反应性部分的不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基连接的美 登木素生物碱衍生物的制备。
将含有不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基基团的带有马来酰亚胺的美登木素生物碱缀合至含有硫羟的抗体(图51)。含有不可裂解的硫代琥珀酰亚胺基的带有马来酰亚胺的美登木素生物碱通过将含有硫羟的美登木素生物碱偶联至双-马来酰亚胺交联剂来制备(图52)。本文中进行的反应用Mal-(CH2)6-Mal试剂进行，然而对本领域技术人员显而易见的是，带有巯基的美登木素生物碱可被偶联至在马来酰亚胺部分之间含有不同间隔物单元的双-马来酰亚胺试剂。
DM1-MaI-(CJLyMaI的制备
在反应小瓶中制备双(马来酰亚胺)己酸酯(17.9mg，0.0648mmol，3当量)在THF(0.75mL)中的溶液。搅拌溶液并添加在THF(0.75mL)中的DM1(15.9mg，0.0216mmol)。随后添加N，N-二异丙基乙胺(3.3mg，0.0259mmol，1.2当量)并且在室温搅拌下进行反应。反应完成之后，在真空中减少反应物体积以得到粗油状物。将粗产物再溶于最小量体积的CH2Cl2并在20cm×20cm 1000微米玻璃板上通过制备薄层色谱法，用在CH2Cl2中的7％甲醇洗脱来纯化。从板上刮下含有产物的带，用在CH2Cl2中的20％MeOH萃取，通过烧结玻璃漏斗过滤并真空浓缩以得到10mg(产率45.9％)DM1-Mal-(CH，)3-Mal(纯度95.8％)。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+(m/z 1036.4)和m+Cl-(m/z 1048.3)主要分子离子。
DM4-Mal-(CH 2 ) 6 -Mal的制备
将双(马来酰亚胺)己酸酯(25.0mg，0.090mmol，3当量)和THF(1mL)装入圆底烧瓶。一旦完全溶解，将N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4，23.5mg，0.030mmol)在THF(1mL)中的溶液加入反应烧瓶。随后将pH值为6的磷酸盐缓冲液(2mL，100mM磷酸钾，2mM EDTA)加入反应烧瓶。将反应烧瓶配备搅拌棒和隔垫并在室温搅拌下进行反应。反应完成之后(～8hr)，将反应物体积在真空中减少到干燥。将粗产物再溶于最小量体积的乙腈并通过半制备型C18HPLC分离产物。将含有产物的馏分合并且真空浓缩以得到10.6mg  (产率33.3％)DM4-Mal-(CH2)6-Mal(纯度99.9％)。分离的产物的质谱分析给出预期的m+Na+(m/z 1078.4)和m+Cl-(m/z 1090.3)主要分子离子。
huC242-Mal-(CH 2 ) 6 -Mal-DM1的制备
在30℃下用9当量的SPDB修饰在含有5％二甲基乙酰胺的150mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中的huC242(8mg/mL)1小时，随后使用50mM磷酸盐，50mM NaCl，pH 7.5缓冲液通过NAP5尺寸柱(sizing column)洗脱。在30℃下向回收的修饰的抗体添加2μL 1M二硫苏糖醇。10min之后在NAP1O柱上用50mM磷酸盐，50mMNaCl，pH 6.5缓冲液洗脱来纯化反应物。将在二甲基甲酰胺中的DM1-mal-(CH2)6-mal(1.7摩尔当量)加入含有所需产物的馏分以得到10％v/v二甲基甲酰胺/缓冲液。1小时之后在NAP 25柱上用10mM柠檬酸盐，135mM NaCl，pH 5.5缓冲液洗脱来纯化粗缀合物。使用前述的结合分析，分析显示huC242-Mal-(CH2)6-Mal-DM 1与抗原阳性COLO205细胞的结合与裸huC242抗体结合程度相同(图53)。分析显示huC242-Mal-(CH2)6-Mal-DM1缀合物对抗原阳性COLO205细胞的细胞毒性比抗原阴性Namalwa细胞更高(图54)。

Claims (33)

1.一种式(1)或(T)的化合物：
Z-X，-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D  (1)
D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xi-Z   (V)
其中：
Z表示可与细胞结合剂形成酰胺键或硫醚键的反应性官能团；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l为0或1；
p为0或1；以及
n为1至2000的整数。
2.一种式(2)或(2’)的细胞结合剂细胞毒性药物缀合物：
CB-[X，-(-CH2-CH2-O)n-Yp-D]m  (2)
[D-Yp-C-CH2-CH2-O-V-XJ1n-CB (T)
其中：
CB表示细胞结合剂；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由选自由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键和腙键组成的组的共价键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l为0或1；
p为0或1；以及
m为2至15的整数；以及
n为1至2000的整数。
3.一种式(3)或(3’)化合物：
Z-XK-CH2-CH2O-V-Y-D     (3)
D-Y-(-CH2-CH2O-)n-Xi-Z  (3’)
其中：
Z表示可与细胞结合剂形成酰胺或硫醚键的反应性官能团；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、非芳族杂环基或芳族杂环基团；
l为0或1；以及
n为1至14的整数。
4.一种式(4)或(4’)的细胞结合剂细胞毒性药物缀合物：
Figure FPA00001547435000031
[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-X，]m-CB  (4’)
其中：
CB表示细胞结合剂；
D表示药物；
X表示经由硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键与所述细胞结合剂连接的脂族基、芳基或杂环基团；
Y表示经由二硫键与所述药物连接的脂族基、芳基或杂环基团；
l为0或1；以及
m为3至8的整数；以及
n为1至14的整数。
5.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗体、单链抗体、优先与靶细胞结合的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、与靶细胞特异性结合的片段、抗体模拟物adnectins、DARPins、淋巴因子、细胞因子、激素、生长因子、酶或营养转运分子。
6.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是表面重塑单克隆抗体、表面重塑单链单克隆抗体或优先与靶细胞结合的表面重塑单克隆抗体片段。
7.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是人源化单克隆抗体、人源化单链单克隆抗体或优先与靶细胞结合的人源化单克隆抗体片段。
8.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述抗体是嵌合抗体、嵌合抗体片段、结构域抗体或其结构域抗体片段。
9.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述抗体是MY9、抗B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、CD105、CD138、EphA受体、EphB受体、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、间皮素、cripto、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白或C242。
10.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述抗体是选自My9-6、B4、C242、N901、DS6、EphA2受体、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗或利妥昔单抗的人源化抗体、人抗体或表面重塑抗体。
11.根据权利要求2或4所述的缀合物，其中所述细胞结合剂与选自以下的靶细胞结合：肿瘤细胞；病毒感染的细胞、微生物感染的细胞、寄生虫感染的细胞、自身免疫细胞、活化细胞、骨髓细胞、活化T-细胞、B细胞或黑素细胞；表达IGF-IR、CanAg、EGFR、MUC1、MUC16、VEGF、TF、MY9、抗B4，EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD11a、CD18、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD79、CD105、CD138、EphA受体、FphB受体、EGFRvIII、HER2/neu、HER3、间皮素、cripto、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白、Apo2和C242抗原的一种或多种的细胞；或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体和叶酸受体的细胞。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述肿瘤细胞选自乳腺癌细胞、***癌细胞、卵巢癌细胞、结肠直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状细胞癌细胞、小细胞肺癌细胞和睾丸癌细胞。
13.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求2或4所述的药物-细胞结合剂缀合物、其药学上可接受的盐或溶剂化物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.一种用于治疗对用所述方法的治疗敏感的疾病的方法，所述方法包括对有需要的患者肠胃外施用有效剂量的根据权利要求2或4所述的缀合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥、移植物抗宿主疾病、病毒感染和寄生虫感染。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤选自肺癌、血癌、血浆癌、乳腺癌、结肠癌、***癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌和淋巴器官癌的一种或多种。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤表达以下的一种或多种：IGF-IR、FOLR1、CanAg、EGFR、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF、TF、MY9、抗B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD11a、CD18、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD79、CD105、CD138、EphA、EphB、EGFRvIII、HER2/neu，HER3、间皮素、cripto、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白、Apo2和C242抗原。
18.一种具有带有由式(5)所示的反应性基团的硫醚部分的美登木素生物碱：
D’-Y’-V-Q-W-Z’ (5)
其中：
D’表示带有巯基的美登木素生物碱；
V是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Y’表示硫醚键；
Q表示任选的芳族或杂环部分；以及
Z’表示胺或巯基反应性基团。
19.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其中所述带有巯基的美登木素生物碱是N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
20.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其由以下结构式表示：
Figure FPA00001547435000061
21.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其由以下结构式表示：
Figure FPA00001547435000071
22.根据权利要求18所述的美登木素生物碱，其由以下结构式7a或7b表示：
Figure FPA00001547435000072
23.一种用于制备根据权利要求18所述的美登木素生物碱的方法，其包括使含有硫羟的美登木素生物碱与异双功能交联剂反应，所述反应由以下化学方程式表示：
D’+Y″.V-Q-W-Z’→D’-Y’-V-Q-W-Z’ (6)
其中：
D’表示带有巯基的美登木素生物碱；
V是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Q表示任选的芳族或杂环部分；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Z’是胺或巯基反应性基团；
Y″表示巯基反应性部分；
以及
Y’表示介于所述带有巯基的美登木素生物碱和所述交联剂之间的硫醚键。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述带有巯基的美登木素生物碱是N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
25.根据权利要求23所述的方法，其中Y″是马来酰亚胺或卤代乙酰胺。
26.一种用于制备经由不可裂解的键连接的美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性缀合物的方法，所述方法包括使细胞结合剂与式Z’-W-Q-V-Y’-D’化合物反应以提供式CB-(Z″-W-Q-V-Y’-D’)m的细胞结合剂缀合物，
其中，
Z’表示胺或巯基反应性基团；
W是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Q表示任选的芳族或杂环部分；
V是具有1至10个碳原子的任选的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
Y’表示硫醚键；
D’表示带有巯基的美登木素生物碱；
CB表示细胞结合剂；
Z″表示硫醚键或酰胺键；以及
m是2至8的整数。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述带有巯基的美登木素生物碱是N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
28.根据权利要求26所述的方法，其中CB是抗体、单链抗体或抗体的抗原结合片段。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中式CB-(Z″-W-Q-V-Y’-D’)m的所述细胞结合剂缀合物是纯化的。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂和式Z’-W-Q-V-Y’-D’的所述化合物通过使所述细胞结合剂在任选含有最多20％有机溶剂的缓冲水溶液中的溶液与式Z’-W-Q-V-Y’-D’的化合物在有机溶剂或有机溶剂和缓冲水溶液或水的混合物中的溶液混合并使反应进行5分钟至72小时来反应。
31.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过色谱法、渗析法、切向流过滤法或所述方法的组合来纯化。
32.一种由以下结构式表示的化合物：
33.一种由以下结构式表示的化合物：
Figure FPA00001547435000101
CN2009801623736A 2009-10-06 2009-10-06 有效的缀合物和亲水性连接体 Pending CN102596922A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2009/059620 WO2010126551A1 (en) 2009-04-30 2009-10-06 Potent conjugates and hydrophilic linkers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102596922A true CN102596922A (zh) 2012-07-18

Family

ID=46467238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801623736A Pending CN102596922A (zh) 2009-10-06 2009-10-06 有效的缀合物和亲水性连接体

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP2486023A4 (zh)
JP (1) JP2013506709A (zh)
KR (1) KR20120080611A (zh)
CN (1) CN102596922A (zh)
IL (1) IL219020A0 (zh)
IN (1) IN2012DN02780A (zh)
WO (1) WO2010126551A1 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103044677A (zh) * 2012-12-28 2013-04-17 上海景宇生物科技有限公司 一种异端基遥爪聚乙二醇及其制备方法
CN103083652A (zh) * 2013-02-06 2013-05-08 中国科学院过程工程研究所 一种以异型双功能试剂为连接桥的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
CN103254311A (zh) * 2013-05-09 2013-08-21 齐鲁制药有限公司 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法
CN103483357A (zh) * 2013-10-12 2014-01-01 齐鲁制药有限公司 一种抗体-美登素偶联物的中间体新晶型及其制备方法
CN105188763A (zh) * 2013-03-13 2015-12-23 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物和相应的抗体
CN105435241A (zh) * 2015-12-10 2016-03-30 浙江大学 一种iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用
CN105530942A (zh) * 2013-08-26 2016-04-27 瑞泽恩制药公司 包含大环内酯类非对映异构体的药物组合物、其制备方法和治疗用途
CN112543770A (zh) * 2018-06-26 2021-03-23 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2604668T3 (es) 2009-02-05 2017-03-08 Immunogen, Inc. Nuevos derivados de benzodiacepina
MY173839A (en) 2010-03-12 2020-02-24 Debiopharm Int Sa Cd37-binding molecules and immunoconjugates thereof
US20120121615A1 (en) * 2010-11-17 2012-05-17 Flygare John A Alaninyl maytansinol antibody conjugates
WO2012086857A1 (ko) * 2010-12-21 2012-06-28 (주)파낙스이엠 광역학 진단 또는 치료를 위한 결합체 및 이의 제조방법
SG10202007640VA (en) 2011-02-15 2020-09-29 Immunogen Inc Cytotoxic benzodiazepine derivatives
JP6018622B2 (ja) 2011-04-01 2016-11-02 イミュノジェン， インコーポレイテッド Ｃｄ３７結合性分子及びその免疫複合体
US9233171B2 (en) * 2011-11-21 2016-01-12 Immunogen, Inc. Method of treatment of tumors that are resistant to EGFR antibody therapies by EGFR antibody cytotoxic agent conjugate
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
US9415118B2 (en) * 2013-03-13 2016-08-16 Novartis Ag Antibody drug conjugates
MY183572A (en) 2013-03-15 2021-02-26 Regeneron Pharma Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
MX2016001541A (es) * 2013-08-02 2016-08-18 Sanofi Sa Uso de anticuerpo inmunoconjugado anti-muc1 maitansinoide para el tratamiento de tumores solidos.
NZ717668A (en) 2013-10-15 2024-03-22 Seagen Inc Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
AU2015210578B2 (en) * 2014-01-29 2020-04-16 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Ligand-cytotoxic drug conjugate, preparation method therefor, and uses thereof
GB201402009D0 (en) * 2014-02-06 2014-03-26 Oncomatryx Biopharma S L Antibody-drug conjugates and immunotoxins
WO2015153401A1 (en) * 2014-04-04 2015-10-08 Merck Sharp & Dohme Corp Phosphate based linkers for intracellular delivery of drug conjugates
EP3180360A1 (en) * 2014-08-12 2017-06-21 Novartis AG Anti-cdh6 antibody drug conjugates
CA2978857C (en) 2015-03-19 2021-04-20 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Novel hydrophilic linkers and ligand-drug conjugates thereof
US20180031583A1 (en) * 2015-04-17 2018-02-01 Northwestern University Phosphatidylethanolamine-specific probes
JP6979877B2 (ja) 2015-06-08 2021-12-15 デビオファーム インターナショナル， エス． アー． 抗ｃｄ３７イムノコンジュゲートおよび抗ｃｄ２０抗体の組み合わせ
KR20240055894A (ko) 2015-07-21 2024-04-29 이뮤노젠 아이엔씨 세포독성 벤조다이아제핀 유도체의 제조 방법
US11104740B2 (en) 2015-08-28 2021-08-31 Debiopharm International, S.A. Antibodies and assays for detection of CD37
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
AU2016363013B2 (en) 2015-12-04 2022-03-10 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
WO2017132173A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
CA3017527A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Seattle Genetics, Inc. Process for the preparation of pegylated drug-linkers and intermediates thereof
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
GB201615725D0 (en) 2016-09-15 2016-11-02 Polytherics Ltd Novel cytotoxic agents and conjugates thereof
WO2018058001A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
WO2018083633A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-cd37 immunoconjugate therapy
JP2020512312A (ja) 2017-03-24 2020-04-23 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド グルクロニド薬物−リンカーの調製のためのプロセスおよびその中間体
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
US10646585B2 (en) 2017-09-15 2020-05-12 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and ligand-drug conjugates thereof
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
AU2018359515A1 (en) * 2017-11-01 2020-06-18 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Integrin ligands and uses thereof
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1956722A (zh) * 2003-05-20 2007-05-02 伊缪诺金公司 含有新的美登素类的改进的细胞毒剂
US20080171865A1 (en) * 2003-10-10 2008-07-17 Immunogen, Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates and methods of making said conjugates

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6680311B1 (en) 1996-08-30 2004-01-20 Eli Lilly And Company Cryptophycin compounds
FR2763066B1 (fr) 1997-05-08 2001-01-05 Agency Ind Science Techn Nouveau compose d'ester aromatique et materiau optique non lineaire de second ordre qui en est produit
EP1005569A2 (en) 1997-08-01 2000-06-07 MorphoSys AG Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2388063C (en) 1999-11-24 2010-06-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
WO2001049698A1 (en) 1999-12-29 2001-07-12 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US6956036B1 (en) 2000-03-17 2005-10-18 Alcon, Inc. 6-hydroxy-indazole derivatives for treating glaucoma
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6747021B2 (en) 2000-10-02 2004-06-08 Eli Lilly And Company Cryptophycin compound
AU2002213248A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 The University Of Mississipi Synthesis of epothilones and relates analogs
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6560782B2 (en) 2001-06-11 2003-05-13 Playtex Products, Inc. Antimicrobial glove and method of making same
US20060159838A1 (en) 2005-01-14 2006-07-20 Cabot Corporation Controlling ink migration during the formation of printable electronic features
US6716821B2 (en) * 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
AU2003253048A1 (en) 2002-07-09 2004-01-23 Morphochem Aktiengellschaft Fur Kombinatorische Chemie Tubulysin conjugates
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
NZ539395A (en) 2002-11-07 2009-01-31 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US7595306B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Method of treating neurodegenerative disease
DK3604537T3 (da) 2003-06-13 2022-02-28 Alnylam Europe Ag Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme
JP4584987B2 (ja) 2004-04-30 2010-11-24 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド Ｃ５修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチド
CA2572151A1 (en) 2004-06-30 2006-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
EP1828215A2 (en) 2004-07-21 2007-09-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
JP4193771B2 (ja) 2004-07-27 2008-12-10 セイコーエプソン株式会社 階調電圧発生回路及び駆動回路
US7632932B2 (en) 2004-08-04 2009-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
US20060045877A1 (en) 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
TR201808537T4 (tr) * 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
EP1817341A2 (en) 2004-11-29 2007-08-15 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
KR101281501B1 (ko) 2004-12-09 2013-07-15 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항인테그린 면역 컨쥬게이트, 방법 및 용도
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
JP5102772B2 (ja) 2005-11-29 2012-12-19 ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー デミボディ：二量体化活性化治療剤
EP1996612A4 (en) 2006-03-03 2010-10-20 Univ Kingston COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
RS53168B (en) * 2006-05-30 2014-06-30 Genentech Inc. Antibodies and Immunoconjugates and Their Use
WO2007147213A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
AU2008276128B2 (en) * 2007-07-16 2013-10-10 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
CN104258413A (zh) * 2008-04-30 2015-01-07 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1956722A (zh) * 2003-05-20 2007-05-02 伊缪诺金公司 含有新的美登素类的改进的细胞毒剂
US20080171865A1 (en) * 2003-10-10 2008-07-17 Immunogen, Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates and methods of making said conjugates

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103044677A (zh) * 2012-12-28 2013-04-17 上海景宇生物科技有限公司 一种异端基遥爪聚乙二醇及其制备方法
CN103083652A (zh) * 2013-02-06 2013-05-08 中国科学院过程工程研究所 一种以异型双功能试剂为连接桥的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
CN105188763A (zh) * 2013-03-13 2015-12-23 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物和相应的抗体
CN105188763B (zh) * 2013-03-13 2019-02-19 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物和相应的抗体
CN103254311A (zh) * 2013-05-09 2013-08-21 齐鲁制药有限公司 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法
CN103254311B (zh) * 2013-05-09 2015-05-13 齐鲁制药有限公司 一种制备抗体-美登素类生物碱药物偶联物的方法
CN105530942A (zh) * 2013-08-26 2016-04-27 瑞泽恩制药公司 包含大环内酯类非对映异构体的药物组合物、其制备方法和治疗用途
CN105530942B (zh) * 2013-08-26 2019-10-11 瑞泽恩制药公司 一种包含大环内酯类非对映体的药物组合物、其制备方法和用途
CN103483357A (zh) * 2013-10-12 2014-01-01 齐鲁制药有限公司 一种抗体-美登素偶联物的中间体新晶型及其制备方法
CN103483357B (zh) * 2013-10-12 2015-11-18 齐鲁制药有限公司 一种抗体-美登素偶联物的中间体新晶型及其制备方法
CN105435241A (zh) * 2015-12-10 2016-03-30 浙江大学 一种iRGD-抗癌药物偶联物及其制备方法和应用
CN112543770A (zh) * 2018-06-26 2021-03-23 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010126551A1 (en) 2010-11-04
EP2486023A4 (en) 2014-05-07
JP2013506709A (ja) 2013-02-28
KR20120080611A (ko) 2012-07-17
EP2486023A1 (en) 2012-08-15
IN2012DN02780A (zh) 2015-09-18
IL219020A0 (en) 2012-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102596922A (zh) 有效的缀合物和亲水性连接体
CN102083461B (zh) 有效的偶联物和亲水性连接体
KR101343676B1 (ko) 메이탠시노이드 화합물
JP6021963B2 (ja) クロスリンカーおよびそれらの使用
AU2006236489B2 (en) Elimination of heterogeneous or mixed cell population in tumors
JP2013506709A5 (zh)
UA116524C2 (uk) Спосіб одержання кон'югата антитіло-майтансиноїд
CN101087611A (zh) 用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所述偶联物和制备所述偶联物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: Immunogen Inc.

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: Immunogen Inc.

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120718