JP5291137B2 - 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 - Google Patents
8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5291137B2 JP5291137B2 JP2011064117A JP2011064117A JP5291137B2 JP 5291137 B2 JP5291137 B2 JP 5291137B2 JP 2011064117 A JP2011064117 A JP 2011064117A JP 2011064117 A JP2011064117 A JP 2011064117A JP 5291137 B2 JP5291137 B2 JP 5291137B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- fusion protein
- partner
- fusion
- type natriuretic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
- C07K1/122—Hydrolysis with acids different from HF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12N9/1033—Chloramphenicol O-acetyltransferase (2.3.1.28)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01028—Chloramphenicol O-acetyltransferase (2.3.1.28)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Small-Scale Networks (AREA)
Description
本発明は、ペプチドの産生に有用な方法および試薬に関する。詳細には、本発明は、約5未満または約8より上のpIを有するペプチドの産生に関する。本発明の好ましい実施態様は、b型ナトリウム利尿ペプチドの産生に関する。
本発明は、特に、産生が所望されるペプチドが高いpIまたは低いpI(これにより、ペプチドの精製工程としてイオン交換クロマトグラフィーを行うことが望ましくなる)を有する場合に、ペプチドを発現および回収するための効率的な方法に関する。本発明は、比較的高いpIを有するb型ナトリウム利尿ペプチドに関して例証される。それでもなお、当業者は、本明細書で開示される方法および試薬が、高いpIまたは低いpIのいずれかを有する他のペプチドの産生に対する適応性を有することを理解する。
本発明において、融合タンパク質の酸切断は、カオトロープの非存在下で行われ、その結果可溶性b型ナトリウム利尿ペプチドを生じる。この可溶性ペプチドは、不溶性タンパク質から可溶性タンパク質を分離するための任意の公知の簡便な方法(例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーションまたは遠心分離による)を用いて、不溶性のままである融合パートナーおよび他の夾雑物から分離され得る。限外濾過および遠心分離は、商業的な観点から最適以下の工程であるので、本発明の好ましい実施態様は、不溶性物質の可溶化、続いて非イオン性カオトロープ(例えば、尿素)での処理による切断、およびイオン交換クロマトグラフィーによるb型ナトリウム利尿ペプチドの単離を使用する。
(a)このペプチドを、所望のペプチドが融合パートナーに対してそのN末端で融合された融合タンパク質として組換え宿主細胞中で発現させる工程であって、この融合パートナーは、そのC末端でAsp残基を有するアミノ酸配列を含み、ここで、(i)融合パートナーのC末端Asp残基およびペプチドのN末端残基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、(ii)このペプチドが、融合パートナーの正味の電荷と十分異なる正味の電荷、およびペプチドがその融合パートナーから分離され得る融合タンパク質の酸切断により産生される任意の望ましくないフラグメント、およびイオン交換クロマトグラフィーによる融合タンパク質の任意の望ましくない酸切断フラグメントを有し、そして(iii)この融合タンパク質が組換え宿主細胞内に封入体を形成する、工程;
(b)この組換え宿主細胞から封入体を回収する工程;
(c)融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することによって、このペプチドを融合パートナーから切断する工程;
(d)この不溶性切断産物を、そのペプチドの一次構造を変性することなく可溶化させる条件下で非イオン性カオトロープで処理することによって、可溶化させる工程;ならびに
(e)イオン交換クロマトグラフィーによりそのペプチドを単離する工程、を包含する。
(a)宿主細胞中で融合タンパク質の発現を指向し得る調節配列;
(b)改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードするDNA配列であって、ここで、リジン、アルギニンおよび/またはヒスチジン残基をコードする十分な数のコドンが、融合タンパク質のpIが6.0と8.0との間である荷電されていないかもしくは負に荷電したアミノ酸をコードするコドンで置換されている、DNA配列;
(c)改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするDNA配列の3’末端に、直接かまたはリンカー配列を介して連結される、アスパラギン酸をコードするコドン;および (d)8より上または5未満のpIを有し、かつそのN末端でプロリン、グリシン、セリン、ロイシン、アラニン、イソロイシンまたはバリン残基を有する所望のペプチドをコードするDNA配列であって、ここでこの配列は、改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするDNA配列の5’末端から3’末端で連結される、DNA配列、を含む。
(A.本発明の産生方法)
本発明の方法は、約8より上または約5より下のpIを有する精製されたペプチドを産生するために用いられる。本明細書中において、本発明はb型ナトリウム利尿ペプチド(これは、比較的高いpIを有する)に関して例示されるが、所望のペプチドが、融合パートナーの正味の電荷、および融合タンパク質の酸切断によって産生される任意の所望でないフラグメント(すなわち、融合パートナーおよび所望のペプチドの結合以外の部位での切断によって産生されたフラグメント)の正味の電荷と十分に異なる正味の電荷を有し、その所望のペプチドがイオン交換クロマトグラフィーによって切断混合物から単離されることを可能にする場合に、本発明の方法はまた、低いpIを有するペプチドの産生にも適用可能であることが理解される。ペプチドと他の切断産物(切断混合物中におけるインタクトな任意の融合パートナーを含む)との間の正味の電荷の違いは、好ましくは少なくとも約±2、より好ましくは少なくとも約±3である。従って、1つ以上の内部酸切断部位を有する融合パートナーが選択されるならば、融合パートナーの切断産物の各々は、イオン交換クロマトグラフィーによって所望のペプチドから分離され得るように、所望のペプチドの電荷と十分に異なる、正味の電荷を有するべきである。
本発明はまた、本発明の産生方法を実行するために適切な発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、リジン残基、アルギニン残基、および/またはヒスチジン残基についての十分な数のコドンが、電荷を有さないかまたは負に荷電しているアミノ酸についてのコドンによって置換されており、その結果、融合タンパク質のpIは、6.0と8.0との間、好ましくは6.5と7.5との間であるように改変された、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のアミノ酸配列のN末端部分を少なくともコードするDNA配列を利用する。有利には、リジン残基、アルギニン残基、および/またはヒスチジン残基のうちのいくつかは、疎水性残基で置換され得る。この疎水性残基は融合パートナーの正味の電荷を減少するだけではなく、宿主細胞中での封入体の形成を促進もする。所望される場合、CATのネイティブな配列中のトリプトファン残基、システイン残基、および/またはメチオニン残基についての1つ以上のコドンは、所望されない酸化的な副反応(例えば、b型ナトリウム利尿ペプチドとのジスルフィド結合)を防ぐために、トリプトファン、システイン、またはメチオニン以外の残基についてのコドンによって置換され得る(得られる融合タンパク質が必要とされる範囲のpIを有する場合)。
(B型ナトリウム利尿ペプチドに対する融合タンパク質をコードする遺伝子の合成およびクローニング)
trpプロモーターをコードするテトラサイクリン耐性プラスミドpCB101−1(5μg)およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの改変された153アミノ酸のN末端部分の3’末端に融合したb型ナトリウム利尿ペプチドからなる融合タンパク質を、NdeIおよびAgeIを用いて消化した。得られた消化物を、1%アガロースゲル(SeaPlaque,FMC,Rockland,ME)上で電気泳動に供し、そして3.4Kbpのフラグメントを切り出した。
(b型ナトリウム利尿ペプチド(2〜32)に対する融合タンパク質をコードする遺伝子のクローニング)
酸切断は、Asp−Proペプチド結合で最も迅速に生じる。成熟b型ナトリウム利尿ペプチドの第2の残基はProであるので、アミノ酸残基2〜32を含むb型ナトリウム利尿ペプチドの短縮型バージョン[b型ナトリウム利尿ペプチド(2〜32)]の発現によって、融合パートナーからのb型ナトリウム利尿ペプチドの切断を容易にすることが可能である。成熟b型ナトリウム利尿ペプチドの最初のセリンコドンを欠失するAgeI/HindIII制限フラグメントの変更した形態を、以下の2つのオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いて、野生型コード配列のPCRによって構築した。
(b型ナトリウム利尿ペプチド(1−32)の生成および単離)
((a)発酵および細胞溶解)
b型ナトリウム利尿ペプチド(1−32)発現ベクター(pTH85/TEH102)を保有するE.coli細胞を流加様式で発酵させた。この系における融合タンパク質の発現の誘導は、細胞に、培地からのリン酸塩を枯渇させることによって引き起こされる。43リットルの全発酵ブロスを、発酵の終了時に収集した。全発酵ブロスを遠心分離することによって、得られたバイオマスを1Lの瓶に収集し、そして−70±10℃にて保存する。43リットルの発酵物からのバイオマス収量は、湿重量4.7kgのE.coli細胞であった。凍結したバイオマスを室温で一晩で解凍し、そして溶解緩衝液(20mMのNaXHXPO4、5mMのEDTA、pH6.0)を用いて、25%w/vに希釈した。直列に冷却した熱交換機を備えたMaton−Gaulin Model 30CD(9−10、000psi)ホモジナイザーを用いて、細胞をホモジナイズした。細胞溶液を溶解を開始する前に2℃に冷却し、そして溶解の間は15℃未満に温度を維持した。ホモジナイザーを通した流れを細胞溶液に逆戻りさせて、顕微鏡試験によって測定される場合に90%を超える溶解の均質化終点を達成するために、平均6回ホモジナイザーを通過させる。
バッチ遠心法を、1Lのポリプロピレン瓶内で、H6000ローターを備えた冷却したSorvall RC−3B遠心機を使用して実施した。E.coli細胞溶解物を、溶解緩衝液で出発細胞重量の12.5%まで希釈し、そしてH6000Aローターを備えたSorvall RC−3B遠心機内で、4500rpm(5894g)にて40分間遠心分離した。上清をデカントし、そして封入体のペレット(905g)を2〜8℃にて保存した。
酸切断反応混合液を、上記のように調製された封入体から調製した。封入体を2〜8℃の貯蔵機から取り出し、そして手動ホモジナイザーを用いて、脱イオン水で1980mL(封入体100g/220mL)に再懸濁した。100g湿重量と等価なこの懸濁物のアリコートを、さらに加工処理した。封入体調製物を、780mLの脱イオン水で希釈して、10%湿重量の懸濁液を産生した。封入体懸濁物のpHを、濃塩酸(約4mL)で1.99に調整した。この溶液はpH4.5〜3.0で濃厚になるので、激しい攪拌を必要とした。
b型ナトリウム利尿ペプチド(1−32)のIEC精製のために、上記のように調製される4つの酸切断反応混合液を組み合わせ、そして260gの固形尿素を1Lの酸切断反応混合液に添加して、3.5Mの尿素濃度を与えた。最終容量は、1.3Lであった。この溶液は、0.6mgのb型ナトリウム利尿ペプチド/mLまたは780mgのb型ナトリウム利尿ペプチドを含んだ。この溶液を、RP−HPLCアッセイに基づいて、Whatman Express−Ion Exchanger S(スルホキシエチルイオン交換樹脂)の充填されたカラム上に、8mg hBNP/mL樹脂にてロードした。カラムを以下を用いて連続的に洗浄した:200mLの3.5M尿素、50mM酢酸(pH3.5)、500mLの50mM酢酸、600mLの10mMジチオトレイトール(DTT)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.2)、そして最終的に、1Lの50mMリン酸ナトリウム中55mMのNaCl(pH6.8)。ここで完全に還元されたb型ナトリウム利尿ペプチドのカラムからの溶出を、1Lの50mMリン酸ナトリウム中500mMのNaCl(pH6.8)の段階的勾配によって実施した。150mLの溶出ピークを収集し、そしてb型ナトリウム利尿ペプチド含有量について分析した(合計590mg)。この溶出プールをさらなる加工処理まで−70±10℃にて保存した。
145mLのイオン交換カラム溶出物を、4℃で一晩解凍し、次いで、室温まで暖めた。溶液を50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)を用いて1.4mgのb型ナトリウム利尿ペプチド/mLに希釈した。ジスルフィド結合形成は、穏和な攪拌を伴う35℃で6時間の空気酸化(air oxidation)によって達成した。反応を5M酢酸の添加によるpH5.0への酸性化によって終了させた。酸化プールを、さらなる加工処理まで−70±10℃にて保存した。
上記のように実施された2つの酸化反応由来の酸化プールを2〜8℃にて一晩解凍し、そして室温まで暖めた。5N水酸化アンモニウムで5.5に調整した。この溶液(756mL中の869mgのb型ナトリウム利尿ペプチド)を、ロード中で6%アセトニトリルを得るための溶媒混合液(ロード:緩衝液B 85:15)を用いて調製用RP−HPLC(Zorbax Pro 10/150 C8)上に10.6mL/分間にてロードした。樹脂ローディングは、9.8mg/mL樹脂であった。溶出を、以下に概説される表に従って、同じ流速で実施した。緩衝液Aは精製水であり、緩衝液Bは40%アセトニトリルであり、緩衝液Cは1Mの酢酸アンモニウム(pH5.5)である。
酸切断、IECクロマトグラフィー、およびRP−HPLC後のb型ナトリウム利尿ペプチドの類似した調製物由来の主要なRP−HPLCピークを、完全N末端アミノ酸配列決定、アミノ酸分析およびエレクトロスプレー質量分析法によって特徴付けした。すべての局面において、この手順によって生成されたペプチドは、合成b型ナトリウム利尿ペプチド標準から区別不能であった。
(限外濾過/ダイアフィルトレーションによる酸切断反応混合液からのb型ナトリウム利尿ペプチド(1−32)の精製)
クロマトグラフィーのための酸切断混合液の可溶化に対する代替として、可溶性b型ナトリウム利尿ペプチドは、ダイアフィルトレーションによって粗酸切断反応混合液から単離され得る。還元されたb型ナトリウム利尿ペプチドをフィルターに通し、そして高分子量凝集物および不溶性物質を保持した。b型ナトリウム利尿ペプチドは自由に膜を通過し、そして濾液中に見出される。
((a)発酵および細胞溶解)
b型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)発現ベクターpSP54を保有するE.coli細胞を、流加培養様式で発酵させた。この系は、trpプロモーターを用い、そして融合タンパク質発現はインドールアクリル酸の添加により誘導される。全発酵培養液(4.7リットル)を、発酵の最後に採取した。生じるバイオマスを1Lビン中の全発酵培養液を遠心分離することにより収集し、そして−70±10℃で保存した。4.7リットルの発酵物から得たバイオマスは、湿重量432gのE.coli細胞であった。凍結バイオマスを室温で一晩解凍し、そしてクラック緩衝液(20mM NaxHxPO4、5mM EDTA、pH6.0)を用いて25% w/vに希釈した。細胞を、AVP Gaulin Model 30CD(9−10,000 psi)を用いて、冷蔵熱交換に従ってホモジナイズした。細胞溶液を、破壊を開始する前に2℃冷し、そして溶解の間、温度を15℃未満に保った。ホモジナイザーを通した流れは、顕微鏡実験により測定されるように>90%破壊のホモジナイゼーション終点に達するまで平均4回ホモジナイザーを通ることを可能にするために細胞溶液中に戻した。
バッチ遠心分離を、H6000ローターを用いる冷蔵Sorvall RC−3B遠心分離を用いて1Lのポリプロピレンボトルにおいて行なった。E.coli細胞溶解物を12.5%開始細胞重まで溶解物緩衝液で希釈し、そして4500rpm(5894g)でH6000Aローターを用いるSorvall RC−3B遠心分離装置において、40分間遠心分離した。上清を静かにデカントし、そして封入体ペレット(111.5g)を−70±10℃で保存した。
酸切断反応混合物を、上記の封入体調製物から調製した。封入体(55.8g)を、−70±10℃の保存から取りだし、そして携帯型ホモジナイザーを用いて、脱イオン水を用いて558mLに再懸濁し、10%湿重量の懸濁物を得た。封入体上清のpHを、1Mの塩酸(約28mL)を用いて、2.0に調製した。激しい攪拌が、溶液がpH4.5〜3.0の間で濃縮されるにつれて必要とされた。
b型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)を、SP−Spherodex LSカチオン交換樹脂とのバッチインキュベーションにより、pH調整酸切断反応混合物から吸収した。上記の500mLの酸切断反応混合物を、温度が22℃に達するまで、1.5時間温浴槽において解凍した。製造者の指示に従って洗浄したSP−Spherodex LS樹脂(50mL)を、穏やかに攪拌しながら、ガラス容器中の解凍した反応混合物に添加した。混合物を、90分間、周囲温度で攪拌し、そしてサンプルの上清を30分間隔で採取した。この樹脂を、5分間の混合の最後に沈下させた。上清を静かにデカントし、そして樹脂を、3回、250mLの50mM酢酸を用いて洗浄した。次いで、この樹脂を、カラム(2.5×11.5cm)に詰め、そして2カラム容積(CV)の50mM酢酸(pH3.5)を用いて、8mL/分にてさらに洗浄した。次いで、このカラムを、4CVの50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)で洗浄した。カラム上での還元を、カラムを4CVの10mMジチオスレイトール(DTT)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)を用いて洗浄することにより行なった。最後に、カラムを、4CVの50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)で洗浄し、次いで200mMのNaClを含有する5CVの50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)で洗浄した。カラムから、今や完全に還元されたb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)の溶出を、2段階で、50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)中、450mMおよび1M NaClで行なった。330mLの溶出プールを収集し、そしてb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)含量を分析した(総量148mg、66%収量)。溶出プールは、直接ジスフィルド結合形成に用いた。
1mLあたり0.45mgのb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)を含有する330mLのイオン交換カラム溶出物を、2NのHClを用いて、pH6.8にpH調整した。ジスフィルド結合形成を、アルゴン下で、11時間2〜8℃にて11mLの15mM K3Fe(CN)6の溶液への添加により達成した。反応を、3.4mLの5M酢酸の添加によるpH5.0への酸性化により終結した。酸化反応物の収率は、121mgのb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)、82%段階収量であった。酸化プールを2〜8℃で一晩保存した。
酸化プールを、室温に加温し、そしてRP−HPLCによりさらに精製した。アセトニトリル(18mL)を、342mLの酸化プールに添加し、360mLロードを得た。pHを、10Nの水酸化アンモニウムを用いて5.5に調整した。この溶液(51mgのb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)を含有する160mL)を、RP−HPLCカラム(Vydac C4 214TP1010)上に4.5mL/分でロードした。樹脂のロードは、3mg/mLであった。溶出を、同じ流速で、以下の概説表に従って行なった。緩衝液Aは、5%アセトニトリル、50mM酢酸アンモニウム(pH5.0)であり、緩衝液Bは、50%アセトニトリルであり、50mM酢酸アンモニウム(pH5.0)である。
酸切断、IECクロマトグラフィー、およびRP−HPLC後の、b型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)の同様の調製物からの主なRP−HPLCピークを、完全なN末端アミノ酸配列分析、アミノ酸分析、およびエレクトロスプレー質量分析により特徴付けた。3つ全てのアッセイの結果は、このプロトコルにより産生したペプチドがb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)であったことを示した。
Claims (22)
- 5未満または8より上のpIを有する精製ペプチドを産生するための方法であって、以下の工程;
(a)組換え宿主細胞において、融合タンパク質として5未満または8より上のpIを有する該ペプチドを発現させる工程であって、該融合タンパク質において、該ペプチドが、そのC末端にAsp残基を有するアミノ酸配列を含む融合パートナーに、該ペプチドのN末端で融合され、ここにおいて、(i)該融合パートナーのC末端Asp残基および該ペプチドのN末端残基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、(ii)該ペプチドが、所望のペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって切断混合物から分離されることを可能にするように、該融合パートナーの正味の電荷および該融合タンパク質の該酸切断によって産生される任意の所望でないフラグメントの正味の電荷の両方とは異なる正味の電荷を有し、そして(iii)該融合タンパク質が、該組換え宿主細胞内で封入体を形成する、工程;
(b)該封入体を該組換え宿主細胞から回収する工程;
(c)該融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することによって、融合パートナーのC末端Asp残基と所望のペプチドのN末端残基との間を切断することにより所望のペプチドが融合パートナーから切断される、工程;
(d)該ペプチドの一次構造を崩壊せずに可溶化させるように、不溶性切断産物を3M〜7Mの尿素で処理することによって可溶化する工程;ならびに
(e)該ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって単離する工程、を包含する、方法。 - 前記融合パートナーが、前記融合タンパク質が6.0と8.0との間のpIを有するような電荷を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記融合パートナーが、前記融合タンパク質が6.5と7.5との間のpIを有するような電荷を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記単離されたペプチドをpH6.8の50mMのリン酸ナトリウムで希釈し、前記単離されたペプチドを35℃で6時間空気酸化することによって生物学的に活性なペプチドを製造する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記所望のペプチドが、酸性条件下で切断可能な内部ジペプチド配列を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記ペプチドが、1つ以上の内部ジペプチド配列を含み、該内部ジペプチド配列は、前記融合パートナーのC末端アミノ酸残基および該ペプチドのN末端アミノ酸残基によって形成されるジペプチドの切断速度よりも遅い切断速度で、酸性条件下で切断可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記ペプチドが、b型ナトリウム利尿ペプチドである、請求項1に記載の方法。
- b型ナトリウム利尿ペプチドがヒトb型ナトリウム利尿ペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 工程(d)で使用される尿素濃度が3.5Mである、請求項1に記載の方法。
- 前記ペプチドが、b型ナトリウム利尿ペプチドである、請求項9に記載の方法。
- 5未満または8より上のpIを有する精製ペプチドを産生するための方法であって、以下の工程;
(a)組換え宿主細胞において、融合タンパク質として該ペプチドを発現させる工程であって、該融合タンパク質において、所望のペプチドが、そのC末端にAsp残基を有するアミノ酸配列を含む融合パートナーに、該所望のペプチドのN末端で融合され、ここで(i)該融合パートナーのC末端Asp残基および該ペプチドのN末端残基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、(ii)該ペプチドが、所望のペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって切断混合物から分離されることを可能にするように、該融合パートナーの正味の電荷および該融合タンパク質の該酸切断によって産生される任意の所望でないフラグメントの正味の電荷の両方とは異なる正味の電荷を有し、そして(iii)該融合タンパク質が、該組換え宿主細胞内で封入体を形成する、工程;
(b)該封入体を該組換え宿主細胞から回収する工程;
(c)該融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することによって、融合パートナーのC末端Asp残基と所望のペプチドのN末端残基との間を切断することにより所望のペプチドが融合パートナーから切断される、工程;
(d)不溶性切断産物を、該切断混合物から、限外濾過、ダイアフィルトレーション、または遠心分離によって除去する工程;ならびに
(e)該ペプチドをイオン交換クロマトグラフィーによって単離する工程、を包含する、方法。 - 前記ペプチドが、工程(e)に続いて1つ以上のさらなる精製工程に供される、請求項11に記載の方法。
- 前記ペプチドがb型ナトリウム利尿ペプチドであり、そして該ペプチドが、連続して、工程(e)に続く逆相HPLCクロマトグラフィーおよびさらなるイオン交換クロマトグラフィーに供される、請求項12に記載の方法。
- 融合タンパク質の宿主細胞における発現のためのベクターであって、該融合タンパク質は、カオトロープの非存在下、酸性条件下で切断可能であり、8より上または5未満のpIを有する所望のペプチドを生成し、該ベクターは、以下:
(a)該融合タンパク質のpIが6.0と8.0との間であるように荷電した融合タンパク質パートナーをコードするDNA配列;
(b)前記(a)の融合タンパク質パートナーをコードするDNA配列の3’末端に連結される、アスパラギン酸をコードするコドン;
(c)8より上または5未満のpIを有し、そしてそのN末端で、プロリン、グリシン、セリン、ロイシン、アラニン、イソロイシンまたはバリン残基を有する所望のペプチドをコードするDNA配列であって、前記(b)のアスパラギン酸をコードするコドンの3’末端にその5’末端で連結される、DNA配列;
(d)融合タンパク質パートナーをコードするDNA配列に操作可能に連結し、宿主細胞における該融合タンパク質の発現を指向し得る調節配列、を含み、
ここにおいて、コードされた所望のペプチドが、カオトロープの非存在下、酸性条件下で供される場合、前記(b)のコードされたアスパラギン酸残基と前記(c)のコードされたN末端残基との間の結合を切断することにより、コードされた融合パートナーから切断可能である、ベクター。 - 融合タンパク質パートナーが配列番号12のクロラムフェニコールトランスフェラーゼである、請求項14に記載のベクター。
- コードされた融合タンパク質パートナーが、前記融合タンパク質が6.5と7.5の間のpIを有するような荷電を有する、請求項14に記載のベクター。
- 前記コードされたペプチドが、b型ナトリウム利尿ペプチドである、請求項14に記載のベクター。
- 前記調節配列が、phoAプロモーターを含む、請求項14に記載のベクター。
- 前記融合タンパク質パートナーが、配列番号11の50個のN末端アミノ酸残基に対応する少なくとも50個の残基を含む、請求項14に記載のベクター。
- 請求項14〜19のいずれか1項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 前記組換え宿主細胞が原核生物である、請求項1または11に記載の方法。
- 前記原核生物がE.coliである、請求項21に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9242398P | 1998-07-10 | 1998-07-10 | |
US60/092,423 | 1998-07-10 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000559232A Division JP4741076B2 (ja) | 1998-07-10 | 1999-07-08 | 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011172575A JP2011172575A (ja) | 2011-09-08 |
JP5291137B2 true JP5291137B2 (ja) | 2013-09-18 |
Family
ID=22233139
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000559232A Expired - Lifetime JP4741076B2 (ja) | 1998-07-10 | 1999-07-08 | 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 |
JP2011064117A Expired - Lifetime JP5291137B2 (ja) | 1998-07-10 | 2011-03-23 | 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000559232A Expired - Lifetime JP4741076B2 (ja) | 1998-07-10 | 1999-07-08 | 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6303340B1 (ja) |
EP (3) | EP2305815B1 (ja) |
JP (2) | JP4741076B2 (ja) |
CN (2) | CN1242062C (ja) |
AT (2) | ATE529515T1 (ja) |
AU (1) | AU4859599A (ja) |
CA (1) | CA2334160C (ja) |
CY (2) | CY1106110T1 (ja) |
DE (1) | DE69930938T2 (ja) |
DK (2) | DK1095141T3 (ja) |
ES (2) | ES2374829T3 (ja) |
HK (2) | HK1036637A1 (ja) |
PT (2) | PT1095141E (ja) |
WO (1) | WO2000003011A2 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1196094A (zh) * | 1995-09-07 | 1998-10-14 | 诺沃挪第克公司 | 除垢剂酶活性的噬菌体显示 |
AU2002314111A1 (en) | 2001-06-15 | 2003-01-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the recombinant production of peptidic antiviral fusion inhibitors, and acetylation of gb41 fragments |
CN100427506C (zh) | 2001-07-26 | 2008-10-22 | 高级蛋白质技术公司 | 从融合多肽制备感兴趣的多肽的方法 |
WO2006041945A2 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | Novetide, Ltd. | A counterion exchange process for peptides |
JP2008054673A (ja) * | 2006-08-03 | 2008-03-13 | Hokkaido Univ | 組み換え蛋白質の製造方法 |
US8951185B2 (en) | 2007-10-26 | 2015-02-10 | Ams Research Corporation | Surgical articles and methods for treating pelvic conditions |
US20090035815A1 (en) * | 2007-06-29 | 2009-02-05 | Laxmi Srinivas Rao | Synthetic Gene for Enhanced Expression in E. Coli |
US8609621B2 (en) | 2010-11-15 | 2013-12-17 | E I Du Pont De Nemours And Company | Acid-cleavable linkers exhibiting altered rates of acid hydrolysis |
CN107266554A (zh) * | 2012-03-19 | 2017-10-20 | 麦德林制药私人有限公司 | 制备重组血管扩张肽的方法、表达构建体、宿主细胞及重组融合多肽 |
US20150099860A1 (en) * | 2013-10-08 | 2015-04-09 | Proteins Easy Corp | Methods for separating and purifying endogenous, exogenous and recombinant proteins/peptides from plants and animals using aqueous-free, anhydrous strategies |
CN106928316B (zh) * | 2015-12-31 | 2020-11-20 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种纯化氧化含二硫键多肽的方法 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8314362D0 (en) * | 1983-05-24 | 1983-06-29 | Celltech Ltd | Polypeptide and protein products |
DK175535B1 (da) * | 1987-03-04 | 2004-11-29 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid |
US5114923A (en) * | 1988-05-31 | 1992-05-19 | California Biotechnology Inc. | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
EP0428615A4 (en) * | 1988-08-11 | 1991-11-13 | California Biotechnology, Inc. | Method for stabilizing heterologous protein expression and vectors for use therein |
US5595887A (en) * | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
US5202239A (en) * | 1990-08-07 | 1993-04-13 | Scios Nova Inc. | Expression of recombinant polypeptides with improved purification |
AU664030B2 (en) * | 1991-02-27 | 1995-11-02 | Micromet Ag | Serine-rich peptide linkers |
ATE253639T1 (de) * | 1991-08-19 | 2003-11-15 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Verfahren zur herstellung von peptiden |
JP3531947B2 (ja) * | 1991-08-19 | 2004-05-31 | 第一サントリーファーマ株式会社 | ペプチドの製造方法 |
US5589364A (en) | 1994-07-29 | 1996-12-31 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Recombinant production of biologically active peptides and proteins |
JP3995279B2 (ja) * | 1994-09-07 | 2007-10-24 | アスビオファーマ株式会社 | 蛋白の製造方法 |
CA2198966C (en) * | 1996-03-04 | 2011-06-21 | Yuji Suzuki | Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme |
US5851802A (en) * | 1996-03-22 | 1998-12-22 | Xoma Corporation | Methods for recombinant microbial production of fusion proteins and BPI-derived peptides |
-
1999
- 1999-07-08 PT PT99932242T patent/PT1095141E/pt unknown
- 1999-07-08 EP EP10013050.9A patent/EP2305815B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 AT AT06008034T patent/ATE529515T1/de active
- 1999-07-08 EP EP99932242A patent/EP1095141B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 AT AT99932242T patent/ATE323765T1/de active
- 1999-07-08 DK DK99932242T patent/DK1095141T3/da active
- 1999-07-08 DK DK06008034.8T patent/DK1714972T3/da active
- 1999-07-08 CA CA2334160A patent/CA2334160C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 AU AU48595/99A patent/AU4859599A/en not_active Abandoned
- 1999-07-08 ES ES06008034T patent/ES2374829T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 ES ES99932242T patent/ES2263278T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 DE DE69930938T patent/DE69930938T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 WO PCT/US1999/015147 patent/WO2000003011A2/en active IP Right Grant
- 1999-07-08 EP EP06008034A patent/EP1714972B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 CN CNB2003101233443A patent/CN1242062C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 JP JP2000559232A patent/JP4741076B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 PT PT06008034T patent/PT1714972E/pt unknown
- 1999-07-08 US US09/349,644 patent/US6303340B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-08 CN CNB998099465A patent/CN1170932C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-29 HK HK01107531A patent/HK1036637A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-06-30 CY CY20061100896T patent/CY1106110T1/el unknown
-
2007
- 2007-04-25 HK HK07104389.4A patent/HK1097280A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-03-23 JP JP2011064117A patent/JP5291137B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2011-12-16 CY CY20111101251T patent/CY1112195T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2305815B1 (en) | 2014-11-05 |
CY1106110T1 (el) | 2011-06-08 |
DK1714972T3 (da) | 2012-01-23 |
CN1521261A (zh) | 2004-08-18 |
ES2263278T3 (es) | 2006-12-01 |
EP1714972B1 (en) | 2011-10-19 |
JP2002520018A (ja) | 2002-07-09 |
DK1095141T3 (da) | 2006-07-31 |
ATE529515T1 (de) | 2011-11-15 |
DE69930938T2 (de) | 2007-01-11 |
AU4859599A (en) | 2000-02-01 |
EP1714972A2 (en) | 2006-10-25 |
CA2334160C (en) | 2016-09-27 |
HK1036637A1 (en) | 2002-01-11 |
DE69930938D1 (de) | 2006-05-24 |
WO2000003011A3 (en) | 2000-06-15 |
ES2374829T3 (es) | 2012-02-22 |
CN1242062C (zh) | 2006-02-15 |
JP2011172575A (ja) | 2011-09-08 |
EP2305815A1 (en) | 2011-04-06 |
CA2334160A1 (en) | 2000-01-20 |
WO2000003011A2 (en) | 2000-01-20 |
PT1095141E (pt) | 2006-07-31 |
CN1170932C (zh) | 2004-10-13 |
HK1097280A1 (en) | 2007-06-22 |
CN1313896A (zh) | 2001-09-19 |
EP1714972A3 (en) | 2008-05-28 |
CY1112195T1 (el) | 2015-12-09 |
ATE323765T1 (de) | 2006-05-15 |
PT1714972E (pt) | 2011-12-26 |
EP1095141B1 (en) | 2006-04-19 |
US6303340B1 (en) | 2001-10-16 |
EP1095141A2 (en) | 2001-05-02 |
JP4741076B2 (ja) | 2011-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5291137B2 (ja) | 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 | |
JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
EP0542863B1 (en) | Expression of recombinant polypeptides with improved purification | |
IE921250A1 (en) | Hybrid polypeptide | |
AU607973B2 (en) | Process for production of physiologically active peptide containing cysteine residue | |
JP2002504494A (ja) | マウス及びヒトエンドスタチンの生産方法 | |
US20220372074A1 (en) | Production and Purification Method for Polypeptide | |
KR20140135959A (ko) | 온-컬럼 효소적 절단 | |
MX2013001536A (es) | Construccion de expresion procariotica. | |
JP2001008697A (ja) | E.コリでの非融合タンパク質の調製方法 | |
EP1001980A1 (en) | Recombinant expression of insulin c-peptide | |
PL194141B1 (pl) | Plazmidowy wektor ekspresyjny, plazmidy pPTAI, pHIS, pLMT8.5 sposób ekstrahowania zrekombinowanego białka, sposoby wytwarzania zrekombinowanej ludzkiej insuliny lub peptydu-C proinsuliny lub proinsuliny | |
KR20030074832A (ko) | 하나 이상의 관심있는 폴리펩티드의 분비 형태의 생산 및유사한 개량의 과정에서 과분비될 수 있는 펩티드의 용도 | |
JP4088584B2 (ja) | 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。 | |
HU216335B (hu) | Eljárás peptidek előállítására | |
CA2198966C (en) | Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme | |
JP3995279B2 (ja) | 蛋白の製造方法 | |
JP2001506489A (ja) | 組換えタンパク質の製造方法 | |
MX2014009979A (es) | Metodo para la reduccion del desplazamiento de los marcos de lectura 1->3. | |
Rao et al. | Expression, purification, and characterisation of nesiritide using an E. coli expression system | |
KR100202958B1 (ko) | 인슐린 융합단백질로부터 인슐린을 생산하는데 있어서 효소적 절단을 가능케하는 인슐린 융합단백질 유전자를 가진 발현벡터 및 이를 이용한 사람 인슐린의 제조방법 | |
KR100473443B1 (ko) | 단백질의 생산방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120216 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130108 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130405 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130410 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130422 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130514 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130606 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5291137 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |