JP2002520018A - 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 - Google Patents
8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法Info
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Abstract
Description
明は、約5未満または約8より上のpIを有するペプチドの産生に関する。本発
明の好ましい実施態様は、b型ナトリウム利尿ペプチドの産生に関する。
により、ペプチドの精製工程としてイオン交換クロマトグラフィーを行うことが
望ましくなる)を有する場合に、ペプチドを発現および回収するための効率的な
方法に関する。本発明は、比較的高いpIを有するb型ナトリウム利尿ペプチド
に関して例証される。それでもなお、当業者は、本明細書で開示される方法およ
び試薬が、高いpIまたは低いpIのいずれかを有する他のペプチドの産生に対
する適応性を有することを理解する。
よる50アミノ酸未満の長さのペプチドの産生が、宿主細胞内で発現されたペプ
チドの酵素分解によりペプチドの部分的もしくは完全な損失を生じるという問題
に一般的に悩まされていることは、当該分野において周知である。この問題を克
服するために最も一般的に用いられる手段は、宿主細胞内でペプチドを不溶化す
ることである。これは、ペプチドを融合タンパク質として発現することによりも
たらされ得、その融合タンパク質ではペプチドが融合パートナーに連結されてい
る。通常、融合パートナーは、ペプチドのN末端に融合される。この融合タンパ
ク質は、細胞内で封入体を形成し、ここで、ペプチドは、タンパク質分解性酵素
による分解から保護される。
され、精製され、そして活性形態で回収されるはずである。リーダー配列からの
分離は、適切な条件下で特異的に認識されそして切断される(例えば、酸切断ま
たは酵素的切断)リーダーとペプチドとの連結部にてアミノ酸の配列を置換する
ことにより達成され得る。酵素的切断は、酵素の高い費用および限定された使用
可能期間に起因して、固定されたカラム上で使用する場合でさえも、商業的スケ
ールでの産生にはほとんど実用的ではない。
ることによって達成され得る。ここで、このジペプチドの第1のアミノ酸は、ア
ルパラギン酸である。第2のアミノ酸の選択は、ジペプチド結合が酸性条件下で
切断される速度を決定する。もちろん、所望されるペプチドが酸で切断可能な任
意の内部ジペプチド配列を含む場合、リーダーとペプチドとの連結部の切断部位
は、受容不可能な回収の損失を避けるために、内部切断よりも実質的に速い速度
で酸切断をうけなければならない。酸切断が可能なジペプチドの相対反応速度は
、以下である:
ク質構造のアンフォールディングをもたらすカオトロピズム剤を用いた処理によ
り可溶化される。次いで可溶化された融合タンパク質は切断され、所望のペプチ
ドが単離され、そして精製される。そして、このペプチドは、例えば、必要なら
ば内部のジスルフィド結合の形成をもたらすカオトロープおよび酸化の除去によ
り、生物学的に活性な立体配座へと再折り畳みをもたらす条件に供される。
おいて、134のアミノ酸前駆体タンパク質の切断によりインビボで産生される
32のアミノ酸ペプチドとして生じる。ヒトb型ナトリウム***増加性前駆体を
コードするDNA配列は、単離されている(米国特許第5,114,923号)
。b型ナトリウム利尿ペプチドは、ヒトの臨床的試行において、直接的な心臓へ
の刺激なしで心臓機能を改善すること(これは、不整脈のような有害な副作用を
もたらし得る)、および心不全の死亡率および進行の加速の増大に関連する神経
ホルモンのレベルを減少させることが示されている。従って、これは、うっ血性
心不全の患者の処置に有用である。
される他の薬物を超える特定の臨床的利点を提供するが、非ペプチド薬剤と比較
して、比較的高い費用のペプチド薬剤の産生は、臨床的実施におけるその承認に
対して障害を示し得る。結果的に、費用を最小限にするためにb型ナトリウム利
尿ペプチドを産生する高い効率的手段を提供する必要性が存在する。封入体の形
態におけるペプチドの組換え産生は、いくつかの問題を示す。b型ナトリウム利
尿ペプチドを得るための融合タンパク質の酵素的切断の使用は、必要とされる酵
素の費用が高いため、望ましくない。精製工程としてイオン交換クロマトグラィ
ーを使用することによる、比較的高いpIのb型ナトリウム利尿ペプチド(10
以上)の利用を所望する場合、イオン性カオトロープ(例えば、塩酸グアニジン
)の使用は避けるべきである。なぜならば、イオン性カオトロープは、イオン交
換クロマトグラフィーを干渉するからである。一方、最も一般的に使用される非
イオン性カオトロープである尿素は、融合タンパク質の酸切断を行う場合に疑問
がある。高温の酸性条件下で、尿素の存在は、ペプチドの分解をもたらす。
れ、その結果可溶性b型ナトリウム利尿ペプチドを生じる。この可溶性ペプチド
は、不溶性タンパク質から可溶性タンパク質を分離するための任意の公知の簡便
な方法(例えば、限外濾過、ダイアフィルトレーションまたは遠心分離による)
を用いて、不溶性のままである融合パートナーおよび他の夾雑物から分離され得
る。限外濾過および遠心分離は、商業的な観点から最適以下の工程であるので、
本発明の好ましい実施態様は、不溶性物質の可溶化、続いて非イオン性カオトロ
ープ(例えば、尿素)での処理による切断、およびイオン交換クロマトグラフィ
ーによるb型ナトリウム利尿ペプチドの単離を使用する。
の効率的な方法を提供する。本発明の方法の好ましい実施態様は、以下の工程: (a)このペプチドを、所望のペプチドが融合パートナーに対してそのN末端
で融合された融合タンパク質として組換え宿主細胞中で発現させる工程であって
、この融合パートナーは、そのC末端でAsp残基を有するアミノ酸配列を含み
、ここで、(i)融合パートナーのC末端Asp残基およびペプチドのN末端残
基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、(ii)このペプチドが、融合パ
ートナーの正味の電荷と十分異なる正味の電荷、およびペプチドがその融合パー
トナーから分離され得る融合タンパク質の酸切断により産生される任意の望まし
くないフラグメント、およびイオン交換クロマトグラフィーによる融合タンパク
質の任意の望ましくない酸切断フラグメントを有し、そして(iii)この融合
タンパク質が組換え宿主細胞内に封入体を形成する、工程; (b)この組換え宿主細胞から封入体を回収する工程; (c)融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することによ
って、このペプチドを融合パートナーから切断する工程; (d)この不溶性切断産物を、そのペプチドの一次構造を変性することなく可
溶化させる条件下で非イオン性カオトロープで処理することによって、可溶化さ
せる工程;ならびに (e)イオン交換クロマトグラフィーによりそのペプチドを単離する工程、 を包含する。
断可能な融合タンパク質を発現するのに有用なベクターがまた、本明細書中で提
供され、このベクターは、以下: (a)宿主細胞中で融合タンパク質の発現を指向し得る調節配列; (b)改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配
列の少なくとも一部をコードするDNA配列であって、ここで、リジン、アルギ
ニンおよび/またはヒスチジン残基をコードする十分な数のコドンが、融合タン
パク質のpIが6.0と8.0との間である荷電されていないかもしくは負に荷
電したアミノ酸をコードするコドンで置換されている、DNA配列; (c)改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする
DNA配列の3’末端に、直接かまたはリンカー配列を介して連結される、アス
パラギン酸をコードするコドン;および (d)8より上または5未満のpIを有し、かつそのN末端でプロリン、グリ
シン、セリン、ロイシン、アラニン、イソロイシンまたはバリン残基を有する所
望のペプチドをコードするDNA配列であって、ここでこの配列は、改変型クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするDNA配列の5’末
端から3’末端で連結される、DNA配列、 を含む。
チドを産生するために用いられる。本明細書中において、本発明はb型ナトリウ
ム利尿ペプチド(これは、比較的高いpIを有する)に関して例示されるが、所
望のペプチドが、融合パートナーの正味の電荷、および融合タンパク質の酸切断
によって産生される任意の所望でないフラグメント(すなわち、融合パートナー
および所望のペプチドの結合以外の部位での切断によって産生されたフラグメン
ト)の正味の電荷と十分に異なる正味の電荷を有し、その所望のペプチドがイオ
ン交換クロマトグラフィーによって切断混合物から単離されることを可能にする
場合に、本発明の方法はまた、低いpIを有するペプチドの産生にも適用可能で
あることが理解される。ペプチドと他の切断産物(切断混合物中におけるインタ
クトな任意の融合パートナーを含む)との間の正味の電荷の違いは、好ましくは
少なくとも約±2、より好ましくは少なくとも約±3である。従って、1つ以上
の内部酸切断部位を有する融合パートナーが選択されるならば、融合パートナー
の切断産物の各々は、イオン交換クロマトグラフィーによって所望のペプチドか
ら分離され得るように、所望のペプチドの電荷と十分に異なる、正味の電荷を有
するべきである。
択される。この目的のための適切な融合パートナーの選択は、部分的には、産生
されるペプチドの性質に依存する。好ましくは、その融合パートナーは、少なく
とも約50アミノ酸残基を含む。融合パートナーのアミノ酸残基の数に厳格な上
限は存在しないが、約100を超えないことが好ましい。なぜなら、融合パート
ナー中のより大きい数のアミノ酸残基は、一般的に、所望のペプチドのより低い
収量に転換されるからである。融合タンパク質が、封入体の形成を促進する、約
25〜約50の疎水性アミノ酸残基を含むように、融合パートナーを選択するこ
ともまた、好ましい。
N末端と結合する。
より好ましくは6.5と7.5との間のpIであるように選択される。本発明の
特に好ましい融合パートナーは、改変されたクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼのN末端部分を少なくとも含む。クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼのアミノ酸配列は、十分な数のリジン、アルギニン、および
/またはヒスチジン残基を、電荷を有さないか、または負に荷電しているアミノ
酸で置換するように改変され、その結果、融合タンパク質が6.0と8.0との
間、より好ましくは6.5と7.5との間のpIを有する。クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ配列になされ得るさらなる改変には:(a)シス
テイン、トリプトファン、およびメチオニン残基の、システイン、トリプトファ
ン、およびメチオニン以外の残基による置換;および(b)電荷のバランスを達
成するために必要とされるような、1つ以上の酸性残基または塩基性残基の疎水
性残基への置換が挙げられる。
されない酸化的な副反応(所望のペプチドを含み得る)を除去するために働く。
リジン、アルギニン、および/またはヒスチジンの疎水性残基での置換は、pI
および融合パートナーの荷電した残基の割合の両方を減少させ、そして封入体形
成を促進する疎水性を導入する。改変されたクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ配列のC末端のAsp残基は、直接的またはリンカー配列を通し
て、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ配列に連結され得る。リ
ンカー配列は、制限部位を提供するために発現ベクターに挿入されたコドンの翻
訳の結果として存在し得る。本発明の方法によって産生することが望まれるペプ
チドが、内部の酸切断部位を含むならば、融合パートナーとそのペプチドとの連
結で形成される酸切断部位は、上記に示したような内部切断部位よりも速い反応
の速度を有するものであるに違いない。例えば、ヒトb型ナトリウム利尿ペプチ
ドは、酸分解に感受性である内部Asp−Argジペプチドを含む。本発明に従
って、本発明者らは、改変されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ配列との融合物としてこのペプチドを発現した。ここで融合パートナーとb
型ナトリウム利尿ペプチドの結合は、Asp−Serジペプチドを形成する。2
つのジペプチドの酸切断の差示的な速度に起因して、本発明者らは、内部切断部
位における切断によるいくつかのペプチドの損失に関わらず、所望のペプチドの
良好な収量を得ることができた。あるいは、本発明者らは、本発明の手順を利用
して、b型ナトリウム利尿ペプチドを産生した(2−32)。この分子は、全長
32アミノ酸型と等価な生物学的活性を有し、そしてそのN末端のプロリンの存
在に起因して、融合パートナーから、付随する収量の増加を伴う、なおより効率
的な切断を生じる。
現される。組換えDNA法によるタンパク質の発現のために有用であることが公
知である任意の適切な宿主細胞が利用され得、これらには、原核生物および真核
生物宿主の細胞および細胞株が含まれる。E.coliは好ましい宿主である。
宿主細胞は、宿主におけるその発現を指向し得る調節配列、ならびに宿主細胞中
で機能的である複製起点の制御下で融合タンパク質をコードする発現ベクターを
含む。そのベクターは、組換えDNA技術において慣用的に利用される他のDN
A配列(例えば、選択マーカーをコードする配列)を含み得る。
下で発現される。宿主細胞の増殖のための条件および融合タンパク質の発現は、
種々の因子(例えば、使用される宿主細胞、プロモーター、および発現される特
定の融合タンパク質)に依存して変化する。当業者は、使用される特定の宿主/
ベクター系についての適切な条件を決定し得る。
ら回収される。これは、公知の方法、例えば、細胞を化学的または機械的に溶解
し、そして遠心分離によって封入体を分離することによって達成され得る。代表
的には、本発明者らは、細胞ペーストを数倍容量の溶解緩衝液中で希釈し、そし
て9,000〜10,000psiで、AVP Gaulinホモジナイザーに
複数回通すことによって、細胞を溶解する。次いで、この細胞溶解物は、緩衝液
中でさらに希釈され、そして遠心分離されて封入体が回収される。
に曝される。酸切断は、ペプチドの分解を引き起こす条件にペプチドを曝すこと
を避けるために、カオトロープ(chaotrope)の非存在下で行われる。
切断は、封入体を、温度を上昇させた水性酸性溶液中で懸濁することによっても
たらされ得る。好ましくは、封入体は、5%と15%との間のw/vで、より好
ましくは、5%と8%との間のw/vで、約1.7と2.2との間、より好まし
くは1.9と2.1との間のpHの酸性溶液中に懸濁される。HClが、切断を
実行するための好ましい酸であるが、他の酸(例として酢酸およびリン酸を含む
)が使用され得る。切断は、収量を最大化するために十分な温度および十分な時
間で実行される。代表的には、切断は、約75℃〜約95℃までの温度で、約2
時間〜約10時間までの時間で実行される。b型ナトリウム利尿ペプチドの産生
の際に、本発明者らは、好ましくは、封入体を水中で10%w/vまで希釈する
こと、HClでpHを2.0に調節すること、および85℃で4.5〜5.5時
間維持することによって酸切断を行った。
後、融合パートナーおよびペプチドは、非イオン性カオトロープ(好ましくは尿
素)でそれらを処理することにより可溶化され、次いでそのペプチドは、イオン
交換クロマトグラフィーによって単離されることが好ましい。この懸濁物は、カ
オトロープの添加前に、好ましくは50℃以下(例えば、40℃より下)まで冷
却される。可溶化は、固体の尿素を約3M〜約7Mの濃度まで添加し、そして4
0℃より下の温度(好ましくはおよその室温(18〜25℃))で維持すること
によって実行され得る。
、切断された融合パートナーおよびペプチドを含む溶液は、直接的にイオン交換
カラムにロードされ得る。ペプチド単離のために適切な任意の市販のイオン交換
カラムが使用され得る。b型ナトリウム利尿ペプチドについて、本発明者らは、
スルホプロピルイオン交換カラム(Pharmacia Streamline
(登録商標))を使用した。このカラムは平衡化され、そして夾雑物を溶離する
ために洗浄された。次いで、所望のペプチドが、適切な塩濃度を用いてカラムか
ら溶出される。b型ナトリウム利尿ペプチドについて、カラムからの溶出は、好
ましくはNaCl溶液の0.5〜0.6Mを用いてもたらされた。
ティブな高次構造に再フォールディングされるが、さらなる工程が、そのペプチ
ドを生物学的に活性な型に回復させるために必要であり得る(特に、そのペプチ
ドがその活性に内部のジスルフィド結合の形成を必要とする場合)。B型ナトリ
ウム利尿ペプチドは、ジスルフィド結合しなければならない2つのシステイン残
基を含む。このことは、回収されたペプチドを酸化的な条件に曝すことによって
達成され得る。酸化は、通常、そのペプチドの溶液を加熱することおよび大気下
で攪拌することによってもたらされ得る。あるいは、Cu+2、I3 -、またはFe
(CN)6 -3のような酸化剤が使用され得る。
このような工程には、例えば、HPLC(例えば、RP−HPLC)またはさら
なるイオン交換クロマトグラフィー工程)が挙げられ得る。b型ナトリウム利尿
ペプチドの場合、回収されたペプチドは、酢酸アンモニウム緩衝液pH5.0〜
5.5およびアセトニトリル溶出勾配中のRP−HPLCに供された。
する。この発現ベクターは、リジン残基、アルギニン残基、および/またはヒス
チジン残基についての十分な数のコドンが、電荷を有さないかまたは負に荷電し
ているアミノ酸についてのコドンによって置換されており、その結果、融合タン
パク質のpIは、6.0と8.0との間、好ましくは6.5と7.5との間であ
るように改変された、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CA
T)のアミノ酸配列のN末端部分を少なくともコードするDNA配列を利用する
。有利には、リジン残基、アルギニン残基、および/またはヒスチジン残基のう
ちのいくつかは、疎水性残基で置換され得る。この疎水性残基は融合パートナー
の正味の電荷を減少するだけではなく、宿主細胞中での封入体の形成を促進もす
る。所望される場合、CATのネイティブな配列中のトリプトファン残基、シス
テイン残基、および/またはメチオニン残基についての1つ以上のコドンは、所
望されない酸化的な副反応(例えば、b型ナトリウム利尿ペプチドとのジスルフ
ィド結合)を防ぐために、トリプトファン、システイン、またはメチオニン以外
の残基についてのコドンによって置換され得る(得られる融合タンパク質が必要
とされる範囲のpIを有する場合)。
8アミノ酸のネイティブなアミノ酸配列を表す。一番下の行は、本発明者らがb
型ナトリウム利尿ペプチドの産生に適切な融合タンパク質を発現するために使用
したベクターによってコードされた、改変されたCAT配列を表す。Thr(7
4位)で始まる改変された配列の5つのアミノ酸は、C末端Aspを改変された
CAT配列と一つにし、そしてAgeI部位を導入する連結配列を表す。このA
geI部位は、アミノ酸74および75についてのコドンを変異させることによ
って作製された。
節配列の制御下にあり、この調節配列は、宿主細胞において融合タンパク質の発
現を指向し得る。任意の適切なプロモーター(例えば、trpLE、phoAま
たはlacZプロモーター)が、使用され得る。好ましいプロモーターは、Wa
nner,B.L.、Escherichia coli and Salmo
nella 第2版(Neidbardt、P.C.ら編、ASM Press
,Washington,D.C.)1357〜1381頁に記載される、E.
coli phoAプロモーターである。このプロモーターは、増殖培地中でホ
スファターゼの非存在下において、融合タンパク質をコードするDNA配列の転
写を開始する。本発明者らが使用したphoAプロモーターは、ネイティブE.
coli phoA配列から変異されて、ネイティブGTGシグナルのためのA
TG翻訳開始シグナルを置換した。図2は、上の行に野生型phoAプロモータ
ーのDNA配列、および下の行にb型ナトリウム利尿ペプチドのための発現ベク
ターを生成するために本発明者らによって使用された改変されたphoAプロモ
ーターを示す。
3’末端でのAspコドンに連結される。このペプチドをコードするDNA配列
は、その5’末端で、Pro、Gly、SerまたはLeuのコドンを有する。
選択される特定のアミノ酸は、所望のペプチドの配列に一部依存する。このペプ
チドが1つ以上の内部酸切断部位を含む場合、N末端アミノ酸は、この融合パー
トナーおよびこのペプチドの接合部での切断部位が内部切断部位よりも速い速度
で切断されるように選択されなければならない。所望のペプチドのネイティブ配
列がそのN末端にPro、Gly、SerまたはLeuコドンを含まない場合、
このペプチドをコードするDNAは、5’末端で所望のアミノ酸のコドンを置換
することによって改変される。これは、このペプチドのN末端での外来アミノ酸
を生じ、続いて生物学的活性を妨害しない場合に受容可能であり得る融合パート
ナーからの切断を生じることが理解される。b型ナトリウム利尿ペプチドの場合
において、N末端アミノ酸はSerである。このアミノ酸は、融合パートナーと
の接合部で受容可能である。なぜなら、b型ナトリウム利尿ペプチドは、唯一の
内部酸切断部位であり、Asp−Serよりも非常に低速度で切断されるAsp
−Argを含むからである。
製および組み込まれ得る。
示することを意図する。E.coli W3110宿主中のプラスミドpCB1
01−1(実施例1)は、American Type Culture Co
llection,Manassas,VA(登録番号ATCC98774を有
する)で寄託されている。E.coli W3110宿主中のプラスミドpTH
76(実施例1)は、American Type Culture Coll
ection,Manassas,VA(登録番号ATCC98775を有する
)で寄託されている。E.coli W3110宿主中のプラスミドpTH53
(実施例2)は、American Type Culture Collec
tion,Manassas,VA(登録番号ATCC98776を有する)で
寄託されている。
合成およびクローニング) trpプロモーターをコードするテトラサイクリン耐性プラスミドpCB10
1−1(5μg)およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの改
変された153アミノ酸のN末端部分の3’末端に融合したb型ナトリウム利尿
ペプチドからなる融合タンパク質を、NdeIおよびAgeIを用いて消化した
。得られた消化物を、1%アガロースゲル(SeaPlaque,FMC,Ro
ckland,ME)上で電気泳動に供し、そして3.4Kbpのフラグメント
を切り出した。
リヌクレオチドキナーゼを用いる処理によって個々にリン酸化し、そして各1μ
gのオリゴヌクレオチド1099および1106と組み合わせた。次いで、この
オリゴヌクレオチドの混合物を、7分間、煮沸によって変性させ、そして室温ま
で徐々に冷却させた。この214μlの反応混合物の5μlを、T4DNAリガ
ーゼを使用して室温で一晩、上記で調製した1.5μlのpCB101−1の溶
融し切り出したフラグメントに連結した。次いで、この混合物を再溶融し、そし
てE.coli株MC1061をテトラサイクリン耐性に形質転換するために使
用した。得られた8つのコロニーを、317bpのAgI/MluIフラグメン
トを有するプラスミドについてスクリーニングした。このようなプラスミドの1
つを、pTH80(trpの制御下でb型ナトリウム***増加性に融合する改変
されたCAT配列をコードする)と命名した。
プロモーターは、PO4-の枯渇によって十分な誘導が達成されるまで、誘導され
ない状態において標的遺伝子を維持し得る利点を有する。phoAプロモーター
の制御下に融合物を配置するために、pTH80を、制限酵素NdeIおよびH
indIIIを用いて消化した。次いで、この消化物を3%アガロースゲル(N
usieve,FMC,Rockland,ME)上で電気泳動し、そしてCA
T−BNP融合物をコードする332bpのフラグメントを切り出した。このベ
クターフラグメントを、テトラサイクリン耐性プラスミドであるpTH76の、
NdeIおよびHindIIIを用いる消化によって調製した。pTH76は、
trpプロモーターがphoAプロモーターによって置換されていることを除い
て、pTH80と非常に類似している。このベクターフラグメントを、2.4μ
gのpTH76の、37℃、一晩でのNdeIおよびHindIIIを用いる消
化によって単離し、続いて、37℃で1時間、ウシ腸ホスファターゼを用いて処
理した。反応混合物の最終容量は100μlであった。連結を、1μlのベクタ
ーフラグメントと、pTH80由来の挿入フラグメントを含む3μlの溶融し切
り出したゲル切片との間で実施した。室温での一晩のインキュベーション後、こ
の混合物を使用して、W3110株を形質転換した。得られたコロニーから調製
したDNAを、固有のBstXI部位の存在についてスクリーニングした。これ
らの陽性コロニーを、DNA配列決定によって確認した。これらのうちの1つを
、pTH85と命名した。図3は、pTH85のプラスミドのダイアグラムであ
る。
して、E.coli株W3110をテトラサイクリン耐性に形質転換した。単一
コロニーを、6.25μg/mlのテトラサイクリンを含有するLブロスへ播種
した。37℃での4時間のインキュベーション後、得られた培養物を使用して、
0.1の光学密度まで、以下の培地を含む培養物に播種した: グルコース 4g カザミノ酸 5g 1M MOPSカリウム緩衝液(pH7.4) 40ml (NH4)2SO4 1.24g 1M MgSO4 2ml 水(最終容量1Lになるまで)。
くとも一相の明るい封入体を有することを観察した。細胞を回収し、そしてSD
Sサンプル緩衝液中で18分間煮沸し、そして標準Laemmli Tris−
glycine SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。b−ナトリ
ウム利尿ペプチド融合タンパク質の大量の蓄積を、非常にクーマーシー染色され
る、約12Kダルトンで移動するバンドの存在によって示す。
する遺伝子のクローニング) 酸切断は、Asp−Proペプチド結合で最も迅速に生じる。成熟b型ナトリ
ウム利尿ペプチドの第2の残基はProであるので、アミノ酸残基2〜32を含
むb型ナトリウム利尿ペプチドの短縮型バージョン[b型ナトリウム利尿ペプチ
ド(2〜32)]の発現によって、融合パートナーからのb型ナトリウム利尿ペ
プチドの切断を容易にすることが可能である。成熟b型ナトリウム利尿ペプチド
の最初のセリンコドンを欠失するAgeI/HindIII制限フラグメントの
変更した形態を、以下の2つのオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用
いて、野生型コード配列のPCRによって構築した:
マー、ヒトユビキチンのクローンに対して3’末端に融合したb型ナトリウム利
尿ペプチド配列を保有する50ngのプラスミドpTH53、および1μlのV
ENT DNAポリメラーゼ(New England Biolabs,Be
verly,MA)を、製造業者によって提供される反応緩衝液中に含むように
調製した。この反応を、以下の温度プログラムの30サイクルの間実施した:9
4℃1分間、55℃2分間、および72℃1分間。予測サイズ(167bp)を
、3%Nusieve上のアガロースゲル電気泳動によって確認した。次いで,
このPCR反応生成物を、ベクタープラスミドpTH53と共に、KpnIおよ
びHindIIIを用いる2重消化(double digestion)に供
した。次いで、このベクター消化物を、ウシ腸ホスファターゼを用いて45分間
37℃で、続いてフェノール抽出およびエタノール沈殿によってさらに処理した
。次いで、このプラスミド消化物を、30μlのTris−EDTA緩衝液中に
再懸濁した。このPCR消化物を、3%Nusieve上での電気泳動に供し、
そして108bpのフラグメントを、DE81紙を用いて、移動するバンドの妨
害によって回収した。このベクターおよびPCRで消化したフラグメントの連結
を、製造業者によって供給された緩衝液中に、0.5μlのベクターDNA、0
.1μlのPCRフラグメント、および0.5μlのT4DNAリガーゼ(Ne
w England Biolabs,Beverly,MA)を含有する20
μlの反応混合物中で実施した。この連結を室温で3時間実施し、続いて、Ca
Cl2コンピテントE.coli Bへ形質転換した。プラスミドDNAを、2
つの得られた形質転換体から調製し、そしてジデオキシDNA配列決定を使用し
て、正確なヌクレオチド配列が得られたことを決定した。このプラスミドをpU
DBNP2と命名し、そしてこれは、b型ナトリウム利尿ペプチド(2〜32)
にインフレームで融合するヒトユビキチンをコードする。
発現する発現プラスミドの構築のために、プラスミドpUDBNP2をb型ナト
リウム利尿ペプチド(2〜32)コード配列の供給源として使用したが、一方、
プラスミドpCB101−1はCAT154融合パートナーをコードし、そして
b型ナトリウム利尿ペプチド(2〜32)フラグメントのレシピエントとして使
用する。5マイクログラムのpUDBNP2および1μgのpUB101−1を
各々、製造業者(New England Biolabs,Beverly,
MA)によって供給された緩衝液中でAgeIを用いて、37℃で2時間、消化
した。消化物を、アガロースゲル電気泳動によって完了についてチェックした。
DNAを、GeneClean(Bio101,CA)を使用して消化混合物か
ら回収し、そして15μlの最終容量中に溶出した。次いで、両方のプラスミド
を、製造業者(New England Biolabs,Beverly,M
A)によって供給された緩衝液中で、1.5時間、37℃でBamHIを用いて
消化した。アガロースゲル電気泳動は、完了するまでpUDBNP2消化を示し
、それによって、部分的に消化したDNAを、GeneCleanを使用して回
収し、そして以前のようにBamHIを用いて消化した。この時点で、アガロー
スゲル電気泳動は、完了するまでpUDBNP2消化物およびpCB101−1
消化物の両方を示した。連結のためのフラグメントを、3%Nusieve上で
の電気泳動によって調製し、pUDBNP2消化物から2407bpのバンドお
よびpCB101−1消化物から1562bpのバンドを切り出した。DNAフ
ラグメントを、Genecleanを用いて回収し、そして10μlの最終容量
中で溶出した。2つのフラグメントの連結を、15℃で一晩、製造業者によって
供給された緩衝液中に1μlのT4DNAリガーゼ(New England
Biolabs,Beverly,MA)を有する混合物中で、2μlのpUD
BNP2 DNAフラグメントおよびpCB101−1由来の5μlのDNAフ
ラグメントを使用して達成した。得られた混合物を、CaCl2コンピテントE
.coli W3110へ形質転換した。得られた6つの形質転換体から調製し
たプラスミドDNAを、BglIを用いて消化し、そして正確な構造を有するプ
ラスミドを2845bpおよび890bpのフラグメントの両方の存在に基づい
て同定した。テトラサイクリン耐性領域から生じる予測される234bpバンド
は非常に小さいので可視化されない。さらに、プラスミドDNA調製物のために
使用される培養物もまた、小さなLB培養物へ播種し、そして37℃で一晩イン
キュベートした。得られた細胞を位相差顕微鏡によって可視化し、一方、他のア
リコートをSDSサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてSDSポリアクリルアミド
ゲル電気始動によって分析した。この方法で処理した6つのコロニーのうち、正
確な制限パターンを得た3つはまた、顕微鏡において明るい相の封入体の存在、
およびSDS−PAGE中で約20、500ダルトンで強力にクーマーシー染色
されたバンドの存在を示した。このプラスミドをpSP54と命名した。図4は
、pSP54のプラスミドのダイアグラムである。
102)を保有するE.coli細胞を流加様式で発酵させた。この系における
融合タンパク質の発現の誘導は、細胞に、培地からのリン酸塩を枯渇させること
によって引き起こされる。43リットルの全発酵ブロスを、発酵の終了時に収集
した。全発酵ブロスを遠心分離することによって、得られたバイオマスを1Lの
瓶に収集し、そして−70±10℃にて保存する。43リットルの発酵物からの
バイオマス収量は、湿重量4.7kgのE.coli細胞であった。凍結したバ
イオマスを室温で一晩で解凍し、そして溶解緩衝液(20mMのNaXHXPO4
、5mMのEDTA、pH6.0)を用いて、25%w/vに希釈した。直列に
冷却した熱交換機を備えたMaton−Gaulin Model 30CD(
9−10、000psi)ホモジナイザーを用いて、細胞をホモジナイズした。
細胞溶液を溶解を開始する前に2℃に冷却し、そして溶解の間は15℃未満に温
度を維持した。ホモジナイザーを通した流れを細胞溶液に逆戻りさせて、顕微鏡
試験によって測定される場合に90%を超える溶解の均質化終点を達成するため
に、平均6回ホモジナイザーを通過させる。
冷却したSorvall RC−3B遠心機を使用して実施した。E.coli
細胞溶解物を、溶解緩衝液で出発細胞重量の12.5%まで希釈し、そしてH6
000Aローターを備えたSorvall RC−3B遠心機内で、4500r
pm(5894g)にて40分間遠心分離した。上清をデカントし、そして封入
体のペレット(905g)を2〜8℃にて保存した。
2〜8℃の貯蔵機から取り出し、そして手動ホモジナイザーを用いて、脱イオン
水で1980mL(封入体100g/220mL)に再懸濁した。100g湿重
量と等価なこの懸濁物のアリコートを、さらに加工処理した。封入体調製物を、
780mLの脱イオン水で希釈して、10%湿重量の懸濁液を産生した。封入体
懸濁物のpHを、濃塩酸(約4mL)で1.99に調整した。この溶液はpH4
.5〜3.0で濃厚になるので、激しい攪拌を必要とした。
するためのコネクションを備える、温度制御されたガラス被覆反応容器内に配置
した。不活性ガスは、通気孔の開口とともに5psiで反応容器に流入される。
温度制御器を作動状態にし、そして適切な設定に調整した。反応のタイミングを
この時点で開始した。加熱を40℃まで進めさせ、この時点で通気孔を閉鎖し、
そして反応容器を5psiまで加圧させた。圧力水頭を維持するために、温度調
整の期間に時折、反応容器を開口した。この反応混合物を、15分間、所望の温
度の5℃の範囲内にした。温度を、反応期間を通して85±0.5℃に制御した
。サンプルを、b型ナトリウム利尿ペプチド放出のRP−HPLC分析のために
、規則的な間隔(1時間および30分間)に採取した。最初にガス入口弁を閉鎖
し、次いで、大気圧まで容器を開口し、そして最後にディスポーザブル注射器を
用いて、サンプリングポートから1mLのサンプルを回収することによりサンプ
リングを行った。次いで、サンプリングポートを閉鎖し、ガス入口弁を再開し、
この容器を5〜10秒間開口し、そして最終的に通気孔を閉鎖して容器を再加圧
させた。
た。この溶液を冷却の間中連続的に攪拌した。40℃未満への温度の低下を、2
0分間未満に達成した。冷却期間の終了時に、反応混合液のpHを、2NのNa
OHで2.9に調整した。この溶液のb型ナトリウム利尿ペプチド含有量を、R
P−HPLCピーク範囲によって、1.92g b型ナトリウム利尿ペプチド/
Lと測定した。この溶液を、さらなる加工処理まで−70±10℃にて保存した
。
IEC精製) b型ナトリウム利尿ペプチド(1−32)のIEC精製のために、上記のよう
に調製される4つの酸切断反応混合液を組み合わせ、そして260gの固形尿素
を1Lの酸切断反応混合液に添加して、3.5Mの尿素濃度を与えた。最終容量
は、1.3Lであった。この溶液は、0.6mgのb型ナトリウム利尿ペプチド
/mLまたは780mgのb型ナトリウム利尿ペプチドを含んだ。この溶液を、
RP−HPLCアッセイに基づいて、Whatman Express−Ion
Exchanger S(スルホキシエチルイオン交換樹脂)の充填されたカ
ラム上に、8mg hBNP/mL樹脂にてロードした。カラムを以下を用いて
連続的に洗浄した:200mLの3.5M尿素、50mM酢酸(pH3.5)、
500mLの50mM酢酸、600mLの10mMジチオトレイトール(DTT
)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.2)、そして最終的に、1Lの50
mMリン酸ナトリウム中55mMのNaCl(pH6.8)。ここで完全に還元
されたb型ナトリウム利尿ペプチドのカラムからの溶出を、1Lの50mMリン
酸ナトリウム中500mMのNaCl(pH6.8)の段階的勾配によって実施
した。150mLの溶出ピークを収集し、そしてb型ナトリウム利尿ペプチド含
有量について分析した(合計590mg)。この溶出プールをさらなる加工処理
まで−70±10℃にて保存した。
で暖めた。溶液を50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)を用いて1.4m
gのb型ナトリウム利尿ペプチド/mLに希釈した。ジスルフィド結合形成は、
穏和な攪拌を伴う35℃で6時間の空気酸化(air oxidation)に
よって達成した。反応を5M酢酸の添加によるpH5.0への酸性化によって終
了させた。酸化プールを、さらなる加工処理まで−70±10℃にて保存した。
解凍し、そして室温まで暖めた。5N水酸化アンモニウムで5.5に調整した。
この溶液(756mL中の869mgのb型ナトリウム利尿ペプチド)を、ロー
ド中で6%アセトニトリルを得るための溶媒混合液(ロード:緩衝液B 85:
15)を用いて調製用RP−HPLC(Zorbax Pro 10/150
C8)上に10.6mL/分間にてロードした。樹脂ローディングは、9.8m
g/mL樹脂であった。溶出を、以下に概説される表に従って、同じ流速で実施
した。緩衝液Aは精製水であり、緩衝液Bは40%アセトニトリルであり、緩衝
液Cは1Mの酢酸アンモニウム(pH5.5)である。
える純度の画分をプールした。RP−HPLCプールは、406mgのb型ナト
リウム利尿ペプチド(1−32)を含んだ。
け) 酸切断、IECクロマトグラフィー、およびRP−HPLC後のb型ナトリウ
ム利尿ペプチドの類似した調製物由来の主要なRP−HPLCピークを、完全N
末端アミノ酸配列決定、アミノ酸分析およびエレクトロスプレー質量分析法によ
って特徴付けした。すべての局面において、この手順によって生成されたペプチ
ドは、合成b型ナトリウム利尿ペプチド標準から区別不能であった。
トリウム利尿ペプチド(1−32)の精製) クロマトグラフィーのための酸切断混合液の可溶化に対する代替として、可溶
性b型ナトリウム利尿ペプチドは、ダイアフィルトレーションによって粗酸切断
反応混合液から単離され得る。還元されたb型ナトリウム利尿ペプチドをフィル
ターに通し、そして高分子量凝集物および不溶性物質を保持した。b型ナトリウ
ム利尿ペプチドは自由に膜を通過し、そして濾液中に見出される。
setteフィルター(Filtron、カタログ番号OS100C72)を、
製造業者の指示に従って、ダイアフィルトレーション様式に組み立てた。デバイ
スを蒸留水で洗浄し、次いで20mM酢酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウ
ム(pH4.0)で平衡化した。
HPLC ピーク面積(RT112/123、1/26/96)により決定した
場合、705mgの還元されたb型ナトリウム利尿ペプチドを含有した。この溶
液を、2L Pyrexビンに移し、そして60mLの5M塩化ナトリウムを添
加した。混合物を氷上で25分間攪拌し、次いで60mLの蒸留水および100
mLの0.2M酢酸ナトリウム(pH4.0)を添加した。氷上でさらに20分
間攪拌を続けた。次いで、混合物を、蠕動ポンプを2L/分の循環速度を維持し
ながら用いるダイアフィルトレーションデバイスを通して循環した。濾過物排出
口循環の開始時に完全に密閉した。約2分間の循環後、濾過排出口をゆっくりと
開け、そして濾過流速を平均速度53.5mL/分(25〜82mL/分の範囲
)に制御した。ダイアフィルトレーション緩衝液(20mM酢酸ナトリウム、1
50mM塩化ナトリウム、pH4.0)を、ダイアフィルトレーション溶液を維
持するために一定の容量でフィルターから取り除いた濾過物と同じ速度で2Lビ
ンに添加した。これらの設定で、膜貫通圧を、全ダイアフィルトレーション過程
を通して、10psiよりも低く維持した。合計で、5,700mLの濾過物を
収集した後、ダイアフィルトレーション溶液への希釈剤の添加を停止した。さら
なる1Lの濾過物を、ダイアフィルトレーション過程を完了する前に収集した。
ダイアフィルトレーション過程の最後に、総容積6.7Lの濾過物を収集した。
RP−HPLCによる、濾過物中のb型ナトリウム利尿ペプチドの定量は、55
0mgのb型ナトリウム利尿ペプチドすなわち78%の回収を示した。
E.coli細胞を、流加培養様式で発酵させた。この系は、trpプロモータ
ーを用い、そして融合タンパク質発現はインドールアクリル酸の添加により誘導
される。全発酵培養液(4.7リットル)を、発酵の最後に採取した。生じるバ
イオマスを1Lビン中の全発酵培養液を遠心分離することにより収集し、そして
−70±10℃で保存した。4.7リットルの発酵物から得たバイオマスは、湿
重量432gのE.coli細胞であった。凍結バイオマスを室温で一晩解凍し
、そしてクラック緩衝液(20mM NaxHxPO4、5mM EDTA、pH
6.0)を用いて25% w/vに希釈した。細胞を、AVP Gaulin
Model 30CD(9−10,000 psi)を用いて、冷蔵熱交換に従
ってホモジナイズした。細胞溶液を、破壊を開始する前に2℃冷し、そして溶解
の間、温度を15℃未満に保った。ホモジナイザーを通した流れは、顕微鏡実験
により測定されるように>90%破壊のホモジナイゼーション終点に達するまで
平均4回ホモジナイザーを通ることを可能にするために細胞溶液中に戻した。
3B遠心分離を用いて1Lのポリプロピレンボトルにおいて行なった。E.co
li細胞溶解物を12.5%開始細胞重まで溶解物緩衝液で希釈し、そして45
00rpm(5894g)でH6000Aローターを用いるSorvall R
C−3B遠心分離装置において、40分間遠心分離した。上清を静かにデカント
し、そして封入体ペレット(111.5g)を−70±10℃で保存した。
)を、−70±10℃の保存から取りだし、そして携帯型ホモジナイザーを用い
て、脱イオン水を用いて558mLに再懸濁し、10%湿重量の懸濁物を得た。
封入体上清のpHを、1Mの塩酸(約28mL)を用いて、2.0に調製した。
激しい攪拌が、溶液がpH4.5〜3.0の間で濃縮されるにつれて必要とされ
た。
は、攪拌するサンプルポートおよび不活性ガス雰囲気を提供するように接続部を
有する。不活性ガス(Ar)を、5psiで通気開口(vent open)を
用いて反応容器中に流した。温度のコントローラーを作動させ、そして適切な設
定に調節した。反応のタイミングをこの時点で開始した。加熱を40℃まで進行
させ、この時点で通気口を閉じ、そして反応容器を5psiに加圧した。この反
応容器を、このヘッドの圧力を維持するように温度を調節する期間の間、時折通
気した。反応混合物を15分以内で所望される温度の5℃以内にした。温度は、
反応期間を通して、85±1.5℃に制御した。サンプルを、b型ナトリウム利
尿ペプチド(2−32)放出の、RP−HPLC分析のために、通常の間隔(3
0分)で採取した。サンプリングを、まずガス注入口のバルブを閉じ、次いで、
雰囲気圧に容器を通気し、そして最後に、使い捨てのシリンジを用いて、サンプ
リングポートから1mLのサンプルを取り出すことにより行なった。次いで、サ
ンプリングポートを閉じ、ガス注入口を再度開き、容器を5〜10秒通気させ、
そして最後に、通気口を閉じて、容器を再加圧させた。
、冷却中連続して攪拌した。冷却期間の終了時、28mLの1Mのリン酸を、反
応混合物(最終50mM)に添加し、そして反応混合物のpHを10N NaO
Hを用いて2.8に調整した。この溶液のb型ナトリウム利尿ペプチド(2−3
2)含量を、RP−HPLCアッセイにより、0.45gの還元されたb型ナト
リウム利尿ペプチド(2−32)/L(総量223mgの還元されたb型ナトリ
ウム利尿ペプチド(2−32))として決定した。この溶液をさらなる処理まで
、−70±10℃で凍結した。
バッチイオン交換精製) b型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)を、SP−Spherodex L
Sカチオン交換樹脂とのバッチインキュベーションにより、pH調整酸切断反応
混合物から吸収した。上記の500mLの酸切断反応混合物を、温度が22℃に
達するまで、1.5時間温浴槽において解凍した。製造者の指示に従って洗浄し
たSP−Spherodex LS樹脂(50mL)を、穏やかに攪拌しながら
、ガラス容器中の解凍した反応混合物に添加した。混合物を、90分間、周囲温
度で攪拌し、そしてサンプルの上清を30分間隔で採取した。この樹脂を、5分
間の混合の最後に沈下させた。上清を静かにデカントし、そして樹脂を、3回、
250mLの50mM酢酸を用いて洗浄した。次いで、この樹脂を、カラム(2
.5×11.5cm)に詰め、そして2カラム容積(CV)の50mM酢酸(p
H3.5)を用いて、8mL/分にてさらに洗浄した。次いで、このカラムを、
4CVの50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)で洗浄した。カラム上での還
元を、カラムを4CVの10mMジチオスレイトール(DTT)、50mMリン
酸ナトリウム(pH7.2)を用いて洗浄することにより行なった。最後に、カ
ラムを、4CVの50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)で洗浄し、次いで2
00mMのNaClを含有する5CVの50mMリン酸ナトリウム(pH7.2
)で洗浄した。カラムから、今や完全に還元されたb型ナトリウム利尿ペプチド
(2−32)の溶出を、2段階で、50mMリン酸ナトリウム(pH7.2)中
、450mMおよび1M NaClで行なった。330mLの溶出プールを収集
し、そしてb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)含量を分析した(総量14
8mg、66%収量)。溶出プールは、直接ジスフィルド結合形成に用いた。
する330mLのイオン交換カラム溶出物を、2NのHClを用いて、pH6.
8にpH調整した。ジスフィルド結合形成を、アルゴン下で、11時間2〜8℃
にて11mLの15mM K3Fe(CN)6の溶液への添加により達成した。反
応を、3.4mLの5M酢酸の添加によるpH5.0への酸性化により終結した
。酸化反応物の収率は、121mgのb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)
、82%段階収量であった。酸化プールを2〜8℃で一晩保存した。
アセトニトリル(18mL)を、342mLの酸化プールに添加し、360mL
ロードを得た。pHを、10Nの水酸化アンモニウムを用いて5.5に調整した
。この溶液(51mgのb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)を含有する1
60mL)を、RP−HPLCカラム(Vydac C4 214TP1010
)上に4.5mL/分でロードした。樹脂のロードは、3mg/mLであった。
溶出を、同じ流速で、以下の概説表に従って行なった。緩衝液Aは、5%アセト
ニトリル、50mM酢酸アンモニウム(pH5.0)であり、緩衝液Bは、50
%アセトニトリルであり、50mM酢酸アンモニウム(pH5.0)である。
プールするまで3日間、2〜8℃で保存した。>95%純度の画分をプールし、
最終的に、分析用RP−HPLCにより>97%純度のプールを得、そして48
mgのb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)の収量すなわち94%の段階収
率であった。
け) 酸切断、IECクロマトグラフィー、およびRP−HPLC後の、b型ナトリ
ウム利尿ペプチド(2−32)の同様の調製物からの主なRP−HPLCピーク
を、完全なN末端アミノ酸配列分析、アミノ酸分析、およびエレクトロスプレー
質量分析により特徴付けた。3つ全てのアッセイの結果は、このプロトコルによ
り産生したペプチドがb型ナトリウム利尿ペプチド(2−32)であったことを
示した。
使用される、改変型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ
酸配列を示す。
に改変型phoAプロモーターのDNA配列を示す。
Claims (26)
- 【請求項1】 5未満または8より上のpIを有する精製ペプチドを産生す
るための方法であって、以下の工程; (a)組換え宿主細胞において、融合タンパク質として該ペプチドを発現させ
る工程であって、該融合タンパク質において、所望のペプチドが、そのC末端に
Asp残基を有するアミノ酸配列を含む融合パートナーに、該所望のペプチドの
N末端で融合され、ここで(i)該融合パートナーのC末端Asp残基および該
ペプチドのN末端残基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、(ii)該ペ
プチドが、該融合パートナーの正味の電荷とは有意に異なる正味の電荷、および
該融合パートナーの該酸切断によって産生される任意の所望でないフラグメント
であって、該ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって該融合タンパ
ク質の該融合パートナーおよび任意の所望でない酸切断フラグメントから分離さ
れることを可能にする、フラグメント、を有し、そして(iii)該融合タンパ
ク質が、該組換え宿主細胞内で封入体を形成する、工程; (b)該封入体を該組換え宿主細胞から回収する工程; (c)該融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することに
よって、該融合パートナーから該ペプチドを切断する工程; (d)不溶性切断産物を、該ペプチドの一次構造を崩壊せずに可溶化させる条
件下で、非イオン性カオトロープで処理することによって可溶化する工程;なら
びに (e)該ペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって単離する工程、
を包含する、方法。 - 【請求項2】 前記融合タンパク質が、6.0と8.0との間のpIを有す
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記融合タンパク質が、6.5と7.5との間のpIを有す
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 生物学的に活性な三次構造へと再折り畳みさせ、そして生物
学的活性に必要な任意の分子内ジスルフィド結合を形成させる条件に、前記単離
されたペプチドを供する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記所望のペプチドが、酸性条件下で切断可能な内部ジペプ
チド配列を含まない、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記ペプチドが、1つ以上の内部ジペプチド配列を含み、該
内部ジペプチド配列は、前記融合パートナーのC末端アミノ酸残基および該ペプ
チドのN末端アミノ酸残基によって形成されるジペプチドの切断速度よりも遅い
切断速度で、酸性条件下で切断可能である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 前記ペプチドが、b型ナトリウム利尿ペプチドである、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項8】 工程(d)で使用される前記非イオン性カオトロープが尿素
である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 前記ペプチドが、約3M〜約7Mの濃度の尿素で処理される
、請求項7に記載の方法。 - 【請求項10】 前記ペプチドが、その生物学的に活性なコンフォメーショ
ンにおいて、システイン残基間の少なくとも1つのジスルフィド結合を含み、そ
して工程(f)が、ジスルフィド結合の形成を生じる酸化条件下で行われる、請
求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 前記ペプチドが、b型ナトリウム利尿ペプチドである、請
求項9に記載の方法。 - 【請求項12】 5未満または8より上のpIを有する精製ペプチドを産生
するための方法であって、以下の工程; (a)組換え宿主細胞において、融合タンパク質として該ペプチドを発現させ
る工程であって、該融合タンパク質において、所望のペプチドが、そのC末端に
Asp残基を有するアミノ酸配列を含む融合パートナーに、該所望のペプチドの
N末端で融合され、ここで(i)該融合パートナーのC末端Asp残基および該
ペプチドのN末端残基が、酸性条件下で切断可能な結合を形成し、(ii)該ペ
プチドが、該融合パートナーの正味の電荷とは有意に異なる正味の電荷、および
該融合パートナーの該酸切断によって産生される任意の所望でないフラグメント
であって、該ペプチドが、イオン交換クロマトグラフィーによって該融合タンパ
ク質の該融合パートナーおよび任意の所望でない酸切断フラグメントから分離さ
れることを可能にする、フラグメント、を有し、そして(iii)該融合タンパ
ク質が、該組換え宿主細胞内で封入体を形成する、工程; (b)該封入体を該組換え宿主細胞から回収する工程; (c)該融合タンパク質をカオトロープの非存在下で酸性条件に供することに
よって、該融合パートナーから該ペプチドを切断する工程; (d)不溶性切断産物を、該切断混合物から、限外濾過、ダイアフィルトレー
ション、または遠心分離によって除去する工程;ならびに (e)該ペプチドをイオン交換クロマトグラフィーによって単離する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項13】 前記ペプチドが、工程(f)に続いて1つ以上のさらなる
精製工程に供される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】 前記ペプチドがb型ナトリウム利尿ペプチドであり、そし
て該ペプチドが、連続して、工程(f)に続く逆相HPLCクロマトグラフィー
およびさらなるイオン交換クロマトグラフィーに供される、請求項13に記載の
方法。 - 【請求項15】 融合タンパク質の宿主細胞における発現のためのベクター
であって、該融合タンパク質は、酸性条件下で切断可能であり、8より上または
5未満のpIを有する所望のペプチドを生成し、該ベクターは、以下: (a)該宿主細胞における該融合タンパク質の発現を指向し得る調節配列; (b)改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
の少なくとも一部をコードするDNA配列であって、ここでリジン、アルギニン
および/またはヒスチジン残基をコードする十分な数のコドンが、該融合タンパ
ク質のpIが6.0と8.0との間であるように荷電していないかまたは負に荷
電したアミノ酸をコードするコドンと置換された、DNA配列; (c)改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするD
NA配列の3’末端に、直接またはリンカー配列を介してのいずれかで連結され
るアスパラギン酸をコードするコドン;ならびに (d)8より上または5未満のpIを有し、そしてそのN末端で、プロリン、
グリリン、セリン、ロイシン、アラニン、イソロイシンまたはバリン残基を有す
る所望のペプチドをコードするDNA配列であって、該配列が、その5’末端で
、該改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ配列をコードするD
NA配列の3’末端に連結される、DNA配列、 を含む、ベクター。 - 【請求項16】 改変クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを
コードする前記DNA配列におけるリジン、アルギニンおよび/またはヒスチジ
ン残基をコードする1つ以上のコドンが、疎水性アミノ酸をコードするコドンと
置換されている、請求項15に記載のベクター。 - 【請求項17】 前記コードされた融合タンパク質が、6.5〜7.5のp
Iを有する、請求項15に記載のベクター。 - 【請求項18】 前記コードされたペプチドが、b型ナトリウム利尿ペプチ
ドである、請求項15に記載のベクター。 - 【請求項19】 前記調節配列が、phoAプロモーターを含む、請求項1
5に記載のベクター。 - 【請求項20】 前記コードされた改変クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼが、少なくともクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼの50N末端アミノ酸残基に対応する50残基を含む、請求項15に記載のベ
クター。 - 【請求項21】 請求項15に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項22】 請求項16に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項23】 請求項17に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項24】 請求項18に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項25】 請求項19に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項26】 請求項20に記載のベクターを含む、宿主細胞。
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