CN1170932C - 生产等电点高于8或低于5的多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产等电点高于8或低于5的多肽的方法,其中肽作为融合蛋白被表达,在该融合蛋白中肽通过一个酸裂解位点与一个融合配偶体连接。在无离液剂存在的情况下肽通过酸裂解与融合配偶体分离。该融合配偶体及其可能存在的酸裂解产物与所需的肽具有足够的净电荷差,使肽可通过离子交换层析被分离。
Description
本发明涉及用于肽生产的方法和试剂。本发明特别涉及生产等电点高于8或低于5多肽的方法。本发明的一种优选的实施例涉及b-型钠尿肽的生产。
本发明针对表达和回收一种肽的有效方法,特别是需要生产具有高等电点或低等电点的肽时,从而使离子交换层析法作为肽纯化的一个步骤成为必须的。本发明虽然以具有相对高的等电点的b-型钠尿肽为例作为说明,但是本领域的技术人员将可以应用本发明所公开的方法和试剂来生产其它具有高等电点或低等电点的肽。
本领域众所周知,在一个重组宿主细胞中,例如大肠杆菌,用表达编码肽的DNA来生产长度少于50个氨基酸的肽会遇到所表达的肽在宿主细胞内发生酶降解的问题,导致部分甚至全部的肽的破坏。解决此问题的最普通的方法是设法使肽在宿主细胞中不溶解。有效的方法是肽表达为一种融合蛋白,在该融合蛋白中肽被连接在一个融合配偶体上。通常,该融合配偶体会与肽的N-端融合。该融合蛋白在细胞内形成包含体,在包含体中,肽受到保护,免受蛋白水解酶的降解作用。
在该包含体从宿主细胞回收后,必须将该肽从前导序列中分离、纯化并以活性形式回收。从前导序列中分离可通过在前导序列和肽之间的连接处放置一种氨基酸序列来进行,可以被特异性地识别,并在合适的条件下分离,如酸分离或酶分离。由于酶的高成本以及可用的时效受限,酶分离的方法往往不可能在商业规模的生产上实现,即使在一个固定的分离柱中使用也难以实现。
可以在前导序列和肽的连接处放置一种特定的二肽,以实现酸裂解,这种二肽的第一个氨基酸是天冬氨酸。第二个氨基酸的确定将决定了在酸性条件下该二肽键裂解的速率。当然,如果所需生产的肽中有任何可被酸裂解的二肽序列,即么在该前导序列和肽接合处的裂解点的酸裂解速率必须比肽内部的裂解速率高得多,以避免产量的较大损失。可进行酸裂解的二肽的相对反应速率如下:
二肽 | 相对反应速率 |
Asp-Pro* | 10x |
Asp-X X=Gly*,Ser*,Leu*,Ile,Val | 1x |
Asp-Lys* | 0.5x |
Asp-Arg** | 0.2x |
*F.Marcus,Intl.J.Peptide and Protein Res.(1985)25:542-546
**本发明的观察
在用酶或酸裂解之前,通常用一种离液剂处理包含体中的融合蛋白,使其溶解,离液剂会引起蛋白结构的伸展。然后将该溶解了的融合蛋白裂解,所需的肽被分离并纯化,然后对该肽加以使其再折叠成一种有生物学活性的构象的条件,例如,在需要形成蛋白内的二硫键时去除离液剂和氧化。
通常所说的b-型钠尿肽或BNP在人体中以一种32-氨基酸的肽出现,这种物质在体内是通过一种134-氨基酸的前体蛋白的裂解而产生的。编码该人类b-型钠尿肽前体蛋白的DNA序列已被分离出(US Patent No5114923)。经人体临床实验证明,b-型钠尿肽可在无直接心脏刺激(这可以引起有害的副作用,如心律不齐等)的情况下改善心功能,降低某些可引起增加死亡率的神经激素水平并促使改善心力衰竭。因此,b-型钠尿肽可用于治疗充血性心力衰竭患者。
尽管b-型钠尿肽在临床上优于其它用于治疗充血性心力衰竭患者的药物,但是比起非肽类药物,生产肽类药物的相对高的成本却成为临床实践中使用该类药物的一个难以接受的阻碍。因此,需要提供一种减低成本并高效生产b-型钠尿肽的方法。以包含体形式的该肽重组体的生产存在着几个问题。使用一种融合蛋白进行酶裂解来生产b-型钠尿肽是不合适的,因为所需的酶成本太高。如果希望用离子交换层析作为一种纯化步骤生产相对高等电点的b-型钠尿肽(大于或等于10),应避免使用一种离子型离液剂,例如盐酸胍,因为离子型离液剂会干扰离子交换层析。另一方面,如果进行融合蛋白的酸裂解,用脲这种最常用的非离子型离液剂是有问题的,在高温酸性条件下,脲的存在会导致肽的降解。
本发明中,融合蛋白的酸裂解是在无离液剂情况下进行的,产生可溶解的b-型钠尿肽。该可溶解的肽可从融合配偶体及其它不溶性的杂质中分离出,可采用任何方便的已知方法将可溶解的蛋白从其它不溶的蛋白中分离,如超滤法,渗滤法或离心方法。因为从商业的角度来看,超滤法和离心方法不是最理想的分离方法,本发明的一个优选实施方案中在裂解后采用了对不溶性物质的溶解,然后用非离子型离液剂,如尿素,并用离子交换层析法分离b-型钠尿肽。
本发明提供了一种有效的生产等电点高于8或低于5的肽的方法。本发明所述方法的一个优选实施方案包括如下步骤:
(A)在一个重组宿主细胞中以一种融合蛋白的形式表达所述的肽,其中,所需的肽在其N-末端与一种融合配偶体融合,该融合配偶体在其C-末端包括具有Asp残基的氨基酸序列,其中(I)该融合配偶体的C端Asp残基和该肽的N端残基形成一个在酸性条件下可断裂的键;(II)该肽与融合配偶体、任何经酸裂解融合配偶体所产生的不需要的片段之间具有足够的净电荷差别,使该肽能够通过离子交换层析从融合配偶体和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分离出来;(III)该融合蛋白在重组宿主细胞中形成包含体;
(B)从重组宿主细胞中回收包含体;
(C)在无离液剂情况下将融合蛋白置于酸性条件,将肽与融合配偶体之间进行裂解;
(D)用一种非离子型的离液剂对不溶性的裂解产物进行溶解化处理,其条件是使其变得可溶但又不破坏肽的一级结构;
(E)用离子交换层析分离肽。
本文还提供一种表达载体,可用于表达一种在酸性条件下可裂解的融合蛋白,得到所需的等电点高于8或低于5的肽,所述的载体包括:
(A)一种在宿主细胞中能够指导融合蛋白表达的调节序列;
(B)一种编码修饰的氯霉素乙酰转移酶的至少一部分氨基酸序列的DNA序列,其中足够量的编码赖氨酸、精氨酸、和/或组氨酸残基的密码子已被替换为编码不带电荷或带负电荷氨基酸的密码子,使该融合蛋白的等电点在6.0-8.0之间。
(C)一种编码天冬氨酸的密码子,它被直接或通过一种连接子序列连接于编码修饰的氯霉素乙酰转移酶DNA序列的3′端;
(D)一种编码所需肽的DNA序列,所述肽的等电点高于8或低于5,并且其N端有脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸残基,所述序列在其5′端与编码修饰的氯霉素乙酰转移酶DNA序列的3′端相连接。
附图说明
图1是用于产生b-型钠尿肽的被用作融合配偶体的修饰的氯霉素乙酰转移酶的氨基酸序列。
图2上面一行是野生型phoA启动子的DNA序列,下面一行是修饰的phoA启动子的DNA序列。
图3是pTH85的质粒图。
图4是pSP54的质粒图。
图5是pCB101-1的质粒图。
图6是pTH76的质粒图。
图7是pTH53的质粒图。
A.本发明的生产方法
本发明的方法用于生产等电点高于8或低于5的纯化的肽。尽管本发明在此以具有较高等电点的b-型钠尿肽为例,但本发明的方法也适用生产有较低等电点的肽,只要所需的肽与融合配偶体、任何经酸裂解融合蛋白产生的不需要的片段(例如,在除了融合配偶体和所需肽的接合处裂解所产生的片段)具有足够的净电荷差,并可使所需的肽通过离子交换层析从裂解混合物中分离出。肽与其它裂解产物,包括任何在裂解混合物中完整的融合配偶体净电荷之差优选至少为±2左右,最佳至少为±3左右。这样,如果选择一种具有一个或多个酸内切位点的融合配偶体,该融合配偶体的每个裂解产物应具有与所需的可通过离子交换层析分离的肽足够的净电荷差。
选择融合配偶体还应对融合蛋白形成的包含体加以考虑。选择一种合适的融合配偶体将部分地依赖于所生产的肽的性质。优选地,融合配偶体含有至少约50个氨基酸的残基。尽管融合配偶体的氨基酸残基的数量没有上限,但最好不超过100,因为在融合配偶体中大的氨基酸残基数目一般会产生较低产量的所需肽。也可以优选这样一种融合配偶体,该融合蛋白中含有约25-50个疏水的氨基酸残基,从而促进包含体的形成。
该融合配偶体在C端具有天冬氨酸残基与肽的N端相连。
优选地,融合配偶体的选择使融合蛋白的等电点在6.0-8.0之间,更优选在6.5-7.5之间。本发明特别优选的融合配偶体含有修饰的氯霉素乙酰转移酶至少一个N端部分。将氯霉素乙酰转移酶的氨基酸序列用不带电或带负电荷的氨基酸置换足量的赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸残基而进行修饰,使该融合蛋白的等电点在6.0-8.0,更优选在6.5-7.5。对氯霉素乙酰转移酶序列可以进行的其它修饰包括:(A)用除半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸以外的其它氨基酸残基置换半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸氨基酸残基;(B)用疏水的氨基酸残基置换一种或多种酸性或碱性氨基酸残基,以达到电荷平衡。
置换半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸残基,可起到消除可能涉及所需要的肽的不需要的氧化副反应的作用。用疏水氨基酸残基替换赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸既可以减低融合配偶体带电残基的等电点和百分比,又可以引入疏水性,促进包含体的形成。修饰的氯霉素乙酰转移酶序列在C端的天冬氨酸残基可以与氯霉素乙酰转移酶序列直接连接或通过一个连接序列连接。一种连接子序列可以作为***表达载体的提供限制性位点的密码子翻译的结果。如果用本发明的方法生产所需要的肽含有一种酸内切位点,如前所述,在融合配偶体和肽的连接处所形成的酸裂解位点一定比肽的内切位点具有较高反应速率。例如,人b-型钠尿肽含有易受酸裂解影响的Asp-Arg二肽。根据本发明,我们已经表达了此肽与修饰的氯霉素乙酰转移酶序列的融合蛋白,其中在融合配偶体与b-型钠尿肽的结合处形成了Asp-Ser二肽。由于两种二肽酸解的速率不同,我们已经能够得到较高产量的所需肽,尽管酸解时由于在肽内部的裂解点上裂解有一些肽的损失。我们还运用本发明的步骤生产b-型钠尿肽(2-32)。这个分子与全长32-氨基酸形式有相同的生物学活性。由于在其N端存在脯氨酸,导致从融合配偶体产生更加有效的裂解,使得产量更加增高。
融合蛋白是在宿主细胞中使用已知的重组DNA技术表达的。可以使用任何适当的已知用作通过重组DNA方法表达蛋白的宿主细胞,包括原核的和真核的宿主细胞及细胞系。大肠杆菌是一种较优选的宿主细胞。宿主细胞含有一种在调节序列控制下编码融合蛋白的表达载体,这种调节序列能够引导在宿主细胞中的表达,以及在宿主细胞中有功能的复制起点。载体还可含有其它通常用在重组DNA技术中的DNA序列,如编码可选择的标记的序列。
在适当的条件下生长含有表达载体的宿主细胞并表达融合蛋白。宿主细胞的生长条件和融合蛋白的表达条件将会根据各种不同因素而改变,例如,所使用的宿主细胞种类、启动子和被表达的特殊融合蛋白。本领域的技术人员能够根据所使用的特殊宿主或载体***来确定适当的条件。
在融合蛋白以包含体的形式被表达之后,该包含体从宿主细胞中被回收。这可用已知的方法进行,如用化学或机械方法裂解细胞,用离心方法分离包含体。典型的方法是用几倍体积的裂解缓冲液稀释细胞浆,用AVP匀浆器以9000-10000psi压力裂解细胞。细胞的裂解物再用缓冲液稀释并离心以回收包含体。
然后将包含体在酸性条件下从所需的肽裂解融合配偶体。为避免产生引起肽降解的条件,酸裂解是在无离液剂存在的情况下进行的。可以将包含体悬浮在酸性水溶液中在提高温度的情况下实现裂解。包含体在悬浮液中优选的浓度为5-15%w/v,更优选的浓度为5-8%w/v,酸性水溶液pH为1.7-2.2,优选为1.9-2.1。进行裂解优选的酸是盐酸,然而,也可以用其它酸进行,如可用乙酸和磷酸。裂解使在足够高的温度下进行充足长的时间以提高产量。进行裂解的典型温度是约75℃-95℃,时间为约2小时-约10小时。在生产b-型钠尿肽时,进行酸裂解是通过将包含体在水中稀释至10%w/v来进行的,用盐酸调pH至2.0,在85℃保温4.5-5.5小时。
从商业的角度来看,由于超滤和沉淀不是最理想的步骤,因此在裂解后,融合配偶体和肽优选通过用一种非离子型离液剂,优选尿素,进行处理来溶解,然后用离子交换层析分离肽。在加入离液剂之前,优选将悬浮液冷却至50℃或更低的温度,比如40℃以下。可通过加入浓度约为3M-7M的固体尿素并在低于40℃的温度下,优选在室温下(18-25℃)保温进行溶解。
将pH调至3-7.5,优选在3.8-4.2之后,可将含有裂解的融合配偶体和肽的溶液直接加在离子交换柱上。任何市售的用作肽的分离的离子交换柱均可使用。对于b-型钠尿肽,本发明采用一种硫丙基离子交换柱(Pharmacia Streamline)。将柱子平衡并洗涤,洗脱污染物。然后用一种合适浓度的盐将所需的肽从柱子上洗脱。对于b-型钠尿肽,优选地,用0.5-0.6M浓度的NaCl溶液从柱子上洗脱。
许多情况下,从离子交换柱上回收的肽将重新折叠为其天然构象,然而,可能会需要有一些额外的步骤将肽恢复到有生物学活性的形式,特别是,为保持生物学活性当这种肽需要形成内部二硫键时。b-型钠尿肽含有两个必须形成二硫键的半胱氨酸残基。这可以将回收的肽进行氧化来进行。氧化反应的进行通常是将肽加热然后暴露在空气中搅拌即可。可选择地,可使用如Cu+2,I3 -或Fe(CN)6 -3作为氧化剂。
如有需要,本领域的技术人员可用一些已知技术进行进一步的纯化。这些步骤包括,高压液相层析,比如RP-HPLC,或其它离子交换层析方法。对于生产b-型钠尿肽,回收的肽用RP-HPLC纯化,用pH为5.0-5.5的乙酸铵缓冲液和乙腈进行梯度洗脱。
B.本发明的表达载体
本发明还提供了一种适于本发明生产方法的表达载体。这种表达载体利用编码氯霉素乙酰转移酶的氨基酸序列的至少一个N末端部分的DNA序列,该氯霉素乙酰转移酶已被修饰,使足量的赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸残基的密码子被不带电荷的或带负电荷的氨基酸密码子所替代,使融合蛋白的等电点在6.0-8.0,优选范围是6.5-7.5。更方便地,某些赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸残基可以被疏水残基所替代。这些疏水残基不仅减少融合配偶体的净电荷,而且促进宿主细胞内的包含体的形成。如果需要,天然氯霉素乙酰转移酶中的一个或多个密码子色氨酸、半胱氨酸和/或蛋氨酸残基可以被除了色氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸的残基密码子所替代,以防止不期望出现的氧化副反应,例如与b-型钠尿肽发生的二硫键合作用,从而提供等电点在所需范围内的融合蛋白。
在图1中,上面一排氨基酸序列代表氯霉素乙酰转移酶N端前78个氨基酸的天然氨基酸序列。下面一排代表修饰了的氯霉素乙酰转移酶序列,该序列被常用于表达一种适于生产b-型钠尿肽的融合蛋白的载体编码。从苏氨酸(位置在74)开始的5个氨基酸代表一种连接序列,连接C端Asp到修饰的氯霉素乙酰转移酶序列并引入一个AgeI位点。该AgeI位点的产生是通过氨基酸74和75密码子的突变。
在本发明的载体中,编码修饰的氯霉素乙酰转移酶的DNA序列受到调节序列的控制,该调节序列能够指导融合蛋白在宿主细胞中的表达。可以使用任何适当的启动子,例如,trpLE,phoA或lacZ启动子。优选的启动子是大肠杆菌phoA启动子(Wanner,B.L:Escherichia coli andSalmonella,2nd edition Neidhardt,P.C.et al.Eds.,ASM Press,Washington,D.C.pp-1357-1381.)这种启动子在生长培养基中无磷酸盐存在时起始编码融合蛋白的DNA序列转录。本发明所使用的phoA启动子是从天然大肠杆菌突变而得到的,以氯霉素乙酰转移酶翻译初始信号ATG代替天然GTG信号。图2上面一排是野生型phoA启动子的DNA序列,下面一排是本发明所使用的生产b-型钠尿肽表达载体的修饰的phoA启动子的DNA序列。
编码所需肽的DNA序列在5′端和融合蛋白的3′端的密码子Asp连接。编码该肽的DNA序列在其5′端有Pro,Gly,Ser或Leu的密码子。所选择的特定的氨基酸将部分依赖于所需肽的序列。如果肽内部含有一个或多个酸裂解位点,就必须选择N端的氨基酸,使融合配偶体与肽接合处的裂解位点裂解的速率大于肽内部裂解位点裂解的速率。如果所需肽的天然序列的N端不含有Pro,Gly,Ser或Leu,则编码该肽的DNA通过在所需肽的5′端放置一个密码子而被修饰。这将会导致在肽与融合配偶体裂解后,紧接着在肽的N端产生一个其它氨基酸,如果其不影响生物学活性,就可以被接受。在b-型钠尿肽的情况中,N端的氨基酸是Ser。这种氨基酸在与融合配偶体的接合处是可接受的,因为b-型钠尿肽仅含有一个内部酸裂解位点,Asp-Arg,这个位点的裂解速率大大低于Asp-Ser的裂解速率。
用众所周知的DNA重组技术可以制备本发明的表达载体并导入宿主细胞中。
下文列举的非限定的实施例是为了进一步说明本发明在本文中所述的实际操作。实施例1中在一种大肠杆菌W3110宿主中的质粒pCB101-1已提交美国典型培养物保藏中心保藏(American Type Culture Collection,Manassas,VA),保藏号是ATCC 98774。实施例1中在一种大肠杆菌W3110宿主中的质粒pTH 76已提交美国典型培养物保藏中心保藏(AmericanType Culture Collection,Manassas,VA),保藏号是ATCC 98775。实施例2中在一种大肠杆菌W3110宿主中的质粒pTH 53已提交美国典型培养物保藏中心保藏(American Type Culture Collection,Manassas,VA),保藏号是ATCC 98776。
实施例1 编码一种与b-型钠尿肽的融合蛋白的基因的合成及克隆
5微克抗四环素质粒pCB101-1,它编码trp启动子和一种b-型钠尿肽与153氨基酸修饰的氯霉素乙酰转移酶N端部分的3′端融合的融合蛋白,用NdeI和AgeI消化。所得的消化产物用1%琼脂糖凝胶(SeaPlaque,FMC,Rockland,ME)进行电泳,切下3.4Kbp片段。
合成了具有下述序列的寡核苷酸:
寡核苷酸1099
TATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGAT(SEQ ID NO:1)
寡核苷酸1100
CAGAACATGATATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTT
CTCCA(SEQ ID NO:2)
寡核苷酸1101
ATATCCCAATATCATGTTCTGGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCT
CAATCAACC(SEQ ID NO:3)
寡核苷酸1102
TATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTITTAGAAACCGTAGA
AGTTAATGTT(SEQ ID NO:4)
寡核苷酸1103
AAAGGCCGGATAAAACAGGTGAACATTAACITCTACGGTITCTAAAAAGG
CCGTAATATC(SEQ ID NO:5)
寡核苷酸1104
CAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTTGATTGAGCAACTGACTGAAATGCCT
CAAAATGTTC(SEQ ID NO:6)
寡核苷酸1105
CACCTGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCGTTCTGCTGAATGCTC
ATCCGCTGTTCA(SEQ ID NO:7)
寡核苷酸1106
CCGGTGAACAGCGGATGAGCATTCAGCAGAACGGCAAGAATGTGAAT
(SEQ ID NO:8)
用ATP和T4多核苷酸激酶将寡核苷酸1100-1105每种1微克分别磷酸化,并分别与寡核苷酸1099-1106每种1微克结合。然后将这些寡核苷酸混合物加热煮沸,保持7分钟,使其变性,逐渐冷却至室温。在214微升反应混合物中取5微升与1.5微升切下的熔化pCB101-1片段连接,该片段是用上述T4 DNA连接酶在室温过夜制备的。将该混合物重新熔化并用于转化大肠杆菌株MC1061为抗四环素型。为得到具有317bpAgeI/MluI片段的质粒,筛选了8个所得到的菌落。一种这样的质粒被称为pTH80,在trp控制下编码一个与b-型钠尿肽融合的修饰的CAT序列。
在发酵期间能够控制融合蛋白的合成是很重要的。通过排除PO4达到完全诱导之前,PhoA启动子能够保持目的基因的未诱导状态。为了使融合体被置于PhoA启动子控制之下,用NdeI和HindIII限制酶对pTH80进行消化。然后将消化产物用3%琼脂糖凝胶进行电泳(NuSieve,FMC,Rockland,ME),切下编码CAT-BNP融合的332个bp片段。该载体片段的制备是用NdeI和HindIII限制酶对抗四环素质粒pTH76进行消化。除了trp启动子被PhoA启动子替代以外,pTH76非常类似于pTH80。该载体片段的分离是用NdeI和HindIII对2.4微克的pTH76进行消化,在37℃过夜,然后在37℃加入牛小肠磷酸酶1小时。反应混合物的终体积是100微升。1微升的载体片段和3微升的含有pTH80***片段的熔化电泳凝胶切片间进行连接。在室温培育过夜后,该混合物被用于转化W3110株。筛选从产生的菌落中制备的DNA,寻找单一的BstXI位点的存在。通过DNA测序,确定3个阳性克隆。其中1个被称为pTH85,图3是pTH85的质粒图。
质粒pTH85和其它2个从其结构中阳性克隆被用于转化大肠杆菌株W3110为四环素抗性型。单个的菌落在L液体培养基中与6.25μg/ml四环素培育,在37℃培育4小时后,将得到的培养物接种至含有下述培养基,光密度为0.1的培养物中:
葡萄糖 4g
酪蛋白氨基酸 5g
1M钾MOPS缓冲液,pH7.4 40ml
(NH4)2SO4 1.24g
1M MgSO4 2ml
水加至终体积1升
在37℃温育过夜后,所有的细胞都能在相差显微镜下观察到至少具有一相明视包含体。细胞在SDS样品缓冲液中被恢复并煮沸18分钟,然后用标准Laemmli Tris-glycine SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。由在约12千道尔顿处迁移的深色考马斯染色带表明有高丰度累积的b-型钠尿肽融合蛋白存在。
实施例2 克隆编码b-型钠尿肽(2-32)融合蛋白的基因
在Asp-Pro肽键酸裂解发生速度最快。由于成熟的b-型钠尿肽的第二残基是Pro,通过表达一种截断型的(truncated version)包括有氨基酸残基2-32的b-型钠尿肽,能够促使b-型钠尿肽从融合配偶体裂解。构建了一种改变了形式的AgeI/HindIII限制性内切酶酶切片段,该片段缺少成熟b-型钠尿肽的原来的丝氨酸密码子,方法是将野生型编码序列进行PCR,用下列二种寡核苷酸作为PCR引物:
寡核苷酸754:
GTGGTGGTACCGGTGGTGACCCGAAAATGGTTCAG(SEQ ID NO:9)
寡核苷酸PR 1279:
CCTACTCTCGCATGGGGAGA(SEQ ID NO:10)
制备100μl的反应混合物,其中含有0.4mM每种dNTP,1.3μg每种引物,50ng携带b-型钠尿肽序列,并与克隆的人类遍在蛋白质3′端融合的质粒pTH53,以及1μl VENT DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)在生产商制造的反应缓冲液中。反应进行30个循环周期,以下列温度与时间进行:94℃ 1分钟,55℃ 2分钟,72℃ 1分钟。预计长度的167个bp用3%Nusieve琼脂糖凝胶电泳检验。该PCR反应产物与载体质粒pTH53用KpnI HindIII3进行二次消化。将载体消化产物再用牛小肠磷酸酶在37℃处理45分钟,然后用苯酚提取和乙醇沉淀。将质粒消化产物然后重新悬浮于30μl Tris-EDTA缓冲液中。将该PCR产物经3%Nusieve电泳,用DE81纸获取迁移带回收108bp片段。载体与PCR消化片段的连接在20μl反应混合物中进行,该反应混合物包括0.5μl载体DNA、0.1μl PCR片段、0.5μl T4连接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)溶于制造者提供的缓冲液中。连接反应在室温进行3小时,然后转化为二氯化钙感受态大肠杆菌B。质粒DNA从两个产生的转化体中制备,使用双脱氧DNA测序以确定所获得的是正确的核苷酸序列。这种质粒被命名为pUDBNP2,编码框内融合的b-型钠尿肽的人类遍在蛋白质(2-32)。
对于构建一种表达CAT154与b-型钠尿肽(2-32)基因融合的表达质粒,当质粒pCB101-1编码CAT154融合配偶体时,质粒pUDBNP2作为b-型钠尿肽(2-32)编码序列源,被用作b-型钠尿肽(2-32)片段的受体。5μg pUDBNP2和1μg pCB101-1分别在37℃与AgeI在制造者(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)提供的缓冲液中消化2小时。用琼脂糖凝胶电泳检查消化反应是否进行完全。用GeneClean(Bio101,CA)从消化反应混合物中回收DNA,并以15μl的终体积洗脱。然后将两种质粒在37℃用BamHI在制造者(New England Biolabs,Beverly,MA)提供的缓冲液中消化1.5小时。琼脂糖凝胶电泳检查表明pUDBNP2消化反应进行不完全,因此,部分消化的DNA用GeneClean回收,用BamHI按前述方法进行再次消化。此时,琼脂糖凝胶电泳检查表明pUDBNP2和pCB101-1消化反应都已进行完全。经3%Nusieve电泳,从pUDBNP2消化产物中切下2407碱基电泳带,并从pCB101-1消化产物中切下1562碱基电泳带,制备连接片段。用GeneClean回收DNA片段,以10μl的终体积洗脱。用2μl pUDBNP2 DNA片段和5μl来自pCB101-1的DNA片段的混合物在15℃与1μl T4 DNA连接酶在制造者(New England Biolabs,Beverly,MA)提供的缓冲液中反应过夜,达到两种片段的连接。所得的混合物转化为二氯化钙感受态大肠杆菌W3110。将从所产生的6种转化物中制备的质粒DNA用BglI进行消化,根据存在2845bp和890bp片段鉴别正确结构的质粒。预期来自抗四环素区的234bp带因太小而观察不到。此外,将用作质粒DNA制备的培养物也接种在小LB培养物上,并在37℃温育过夜。所产生的细胞在相差显微镜下观察到,将其它部分在SDS样品缓冲液中煮沸并用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。在6个以此方式处理的菌落中,3个给出正确限制图谱的菌落在显微镜下也显示出存在包含体及在SDS-PAGE中显示出约20500道尔顿的深色考马斯染色带。这种质粒被命名为pSP54。图4是pSP54的质粒图。
实施例3b-型钠尿肽(1-32)的生产和分离
(A)发酵和细胞裂解
包含有b-型钠尿肽(1-32)的大肠杆菌表达载体(pTH85/THE 102)以补料分批方式发酵。在此***中,去除培养基中的磷酸盐引起诱导融合蛋白的表达。在培养完成时,收获43升全发酵液体培养基。将全发酵液体培养基置于一个1升的瓶中进行离心,收集所得到的生物量,并在-70±10℃存放。从43升发酵液中产生的生物量为4.7kg湿重的大肠杆菌细胞。该冷冻的生物质在室温下经过一夜解冻,用裂解缓冲液(20mMNaxHxPO4,5mM EDTA,pH6.0)稀释到25%w/v。将该细胞用带有冷热交换器的Maton-Gaulin Model 30 CD(9-10000psi)匀浆器搅匀。在开始裂解之前,将细胞溶液冷却至2℃,并在整个裂解过程中保持温度低于15℃。通过匀浆器的液体流回细胞溶液中,使6次经过匀浆器的平均数经显微镜检查达到在匀浆终点时大于90%的标准。
(B)经分批离心回收包含体
在一个1升的聚丙烯瓶中,用带有H6000转头的Sorvall RC-3B离心机进行分批离心。用裂解缓冲液将大肠杆菌细胞裂解产物稀释至起始细胞重量的12.5%,然后用带有H6000转头的Sorvall RC-3B离心机进行40分钟离心,离心速度为4500转/分(5894g)。倾去上清液,将905g包含体沉淀物在2-8℃贮存。
(C)酸裂解反应
从上述制备的包含体制备酸裂解反应混合物。从2-8℃贮存液中取出包含体,并用手提式匀浆器重新悬浮至1980ml(100g包含体/220ml)去离子水中。相当于100克湿重的这种悬浮液液体被进一步处理。用780ml去离子水稀释该包含体制备物,得到10%湿重的悬浮物。用约4ml浓盐酸调节该包含体悬浮物的pH,至1.99。当pH调到4.5和3.0之间时,溶液会变得很浓,需要剧烈搅拌。
将上述包含体悬浮物置于一个备有搅拌器、加样口、提供惰性气体连接管的温控搪瓷反应容器中。惰性气体可以通过通气口以5psi(磅/平方英寸)的压力进入反应容器。打开温控器并调至合适的温度设置,此时记录反应开始时间。此时进行加热,至40℃,关闭通气口,使反应容器中的压力为5psi。在调节温度期间有时可以通入一些惰性气体,以保持与开始的压力一致。反应混合物在所需温度的上下5℃范围内保持15分钟。整个反应期间的温度控制在85±0.5℃。定时取样(1小时或30分钟一次),用RP-HPLC分析分离出的b-型钠尿肽。取样的操作应该是先关闭气体入口阀,使容器与大气压连通后再进行。最后用任意形式的注射器从取样口中抽取1ml样品。关闭取样口重新打开气体入口,通入气体5-10秒,最后再关闭通气口,使容器重新加压。
4.5小时后,将反应容器置于冰上冷却使反应停止。在冷却期间继续搅拌反应溶液。在少于20分钟以内将温度降至40℃以下。在冷却期间结束时,用2N NaOH将反应混合物的pH调至2.9。该溶液中的b-型钠尿肽含量用RP-HPLC峰面积测定为每升含b-型钠尿肽1.92g。将该溶液在-70±10℃冷冻保存,直到进行下一步操作。
(D)从酸裂解反应混合物中得到的b-型钠尿肽(1-32)的IEC纯化
将前述所制备的用于b-型钠尿肽IEC纯化的四种酸裂解反应混合物合并,在1升酸裂解反应混合物中加入260克固体尿素,使尿素浓度达到3.5M。终体积为1.3升。该溶液含有0.6mg b-型钠尿肽/ml或780mg b-型钠尿肽。将溶液装入一个(Whatman Express-Ion Exchanger S次硫酸乙基离子交换树脂)填充柱中,根据RP-HOLC试验,装入8mg hBNP/ml。将该柱用200ml 3.5mM尿素溶液、50mM pH3.5的乙酸、500ml 50mM乙酸、600ml 10mM二硫苏糖醇(DTT)、50mM pH7.2的磷酸钠依次洗脱,最后用1L 55mM NaCl在50mM,pH6.8的磷酸钠中的溶液洗脱。从柱上全部还原的b-型钠尿肽用1L 500mM NaCl在50mM,pH6.8的磷酸钠中的溶液分级梯度洗脱。收集150ml洗脱峰,进行b-型钠尿肽含量分析,总共590mg。将洗脱液在-70±10℃冷冻保存,直到进行下一步操作。
(E)形成二硫键
145ml离子交换柱洗脱液在4℃过夜解冻,使升温至室温。用50mM,pH6.8的磷酸钠稀释至b-型钠尿肽1.4mg/ml。二硫键的形成是在35℃时,将溶液放置空气中氧化6小时并适当搅拌来完成的。通过加入5M乙酸使反应液酸化,使达到pH5.0而终止反应。将氧化的反应液在-70±10℃冷冻保存,直到进行下一步操作。
(F)b-型钠尿肽反相HPLC纯化
将前述的两种氧化的反应液在2-8℃过夜解冻,使升温至室温。用5N氢氧化铵调pH至5.5。将该溶液(b-型钠尿肽869mg/756ml)与一种混合溶剂(Load:Buffer B 85:15)以10.6ml/min速度装入制备的RP-HPLC柱(Zobax Pro 10/150 C8),使填充物中得到6%的乙腈。装入的树脂量是9.8mg/ml。根据与下表中列出的同样的流速进行洗脱。缓冲液A是纯化的水,缓冲液B是40%乙腈,缓冲液C是1M,pH为5.5的乙酸铵。
步骤 | 体积ml | 填充物% | 缓冲液A% | 缓冲液B% | 缓冲液C% |
填充 | 890 | 85 | 15 | ||
洗脱 | 353 | 60 | 15 | 25 | |
梯度洗脱开始 | 60 | 15 | 25 | ||
梯度洗脱结束 | 441 | 35 | 40 | 25 | |
保持 | 177 | 35 | 40 | 25 |
用分析RP-HPLC分析洗脱峰部分,合并纯度大于96%的部分。合并的RP-HPLC洗脱液含有406mg b-型钠尿肽(1-32)。
(G)酸裂解反应得到的b-型钠尿肽(1-32)鉴定
通过完整的N末端氨基酸测序、氨基酸分析和电喷射质谱分析,鉴定经过酸裂解、IEC层析、RP-HPLC纯化制备的b-型钠尿肽RP-HPLC主峰,每种鉴定都证明本方法所制备的肽与合成的b-型钠尿肽标准品完全一致。
实施例4 用超滤和渗滤方法纯化酸裂解得到的b-型钠尿肽(1-32)
作为一种选择,为用于层析而溶解的酸裂解反应混合物,可溶解的b-型钠尿肽粗品可从酸裂解混合物中用渗滤方法分离出。还原的b-型钠尿肽通过滤器,收集较高分子量的部分,留下不溶的物质。b-型钠尿肽可以自由通过滤膜,在滤液中被发现。
使用一种带有标示分子量的Filtron ultrasette滤器300KD(Filtron,Cat#OS100C72),操作方法按制造商说明书。用蒸馏水洗涤该装置,然后用20mM乙酸钠,150mM氯化钠,pH4.0的溶液进行平衡。
按上述方法制备1升酸裂解反应混合物。该溶液含有705mg还原的经RP-HPLC峰面积测定的b-型钠尿肽(RT 112/123,1/26/96)。将此溶液置于一个2升的Pyrex瓶中,加入60ml 5M的氯化钠。将反应混合物在冰上搅拌25分钟,然后加入60ml蒸馏水、100ml 0.2mM pH4.0的乙酸钠。将反应混合物在冰上继续搅拌20分钟,然后用蠕动泵将该混合物循环通过渗滤装置,循环速率保持在2L/分。在循环开始时,滤液的出口完全关闭,循环进行大约2分钟后,滤液的出口慢慢打开,将滤液的流速控制在平均53.5ml/min(在25-82ml/min速度范围内)。将渗滤缓冲液:20mM乙酸钠、150mM氯化钠、pH4.0加至2升的瓶中,加入的速度与从滤器中放出滤液的速度相等,以保持渗滤溶液的体积恒定。在此装置中,整个渗滤过程中保持跨膜压小于10psi。收集完全部5700ml滤液后,停止往渗滤液中加入稀释液。在渗滤过程完成前,另收集1L滤液。在渗滤过程结束时,收集的滤液总体积为6.7L。将滤液中的b-型钠尿肽经RP-HPLC定量分析,表明回收了550mg b-型钠尿肽,回收率为78%。
实施例5 b-型钠尿肽(2-32)的制备和分离
(A)发酵和细胞裂解
包含有b-型钠尿肽(2-32)的大肠杆菌表达载体pSP54以补料分批方式发酵。该***使用trp启动子,通过加入吲哚丙烯酸诱导融合蛋白的表达。在培养完成时,收集4.7升全发酵液体培养基。将全发酵液体培养基置于一个1升的瓶中进行离心,收集所得到的生物量,并在-70±10℃存放。从4.7升发酵液中产生的生物量为432g湿重的大肠杆菌细胞。该冷冻的生物质在室温下经过一夜解冻,用断裂缓冲液(20mMNaxHxPO4,5mM EDTA,pH6.0)稀释到25%w/v。将该细胞用带有冷热交换器的AVP Gaulin Model 30 CD(9-10000psi)匀浆器搅匀。在开始断裂之前,将细胞溶液冷却至2℃,并在整个裂解过程中保持温度低于15℃。通过匀浆器的液体流回细胞溶液中,使4次经过匀浆器的平均数经显微镜测定达到在匀浆终点时断裂大于90%。
(B)经分批离心回收包含体
在一个1升的聚丙烯瓶中,用一个冷冻的带有H6000转头的SorvallRC-3B离心机进行分批离心。用裂解缓冲液将大肠杆菌细胞裂解液稀释至起始细胞重量的12.5%,然后用带有H6000转头的Sorvall RC-3B离心机进行40分钟离心,离心速度为4500转/分(5894g)。倾去上清液,将包含体沉淀物111.5g在-70±10℃贮存。
(C)酸裂解反应
从上述制备的包含体制备酸裂解反应混合物。从-70±10℃贮存液中取出包含体55.8g,并用手提式匀浆器重新悬浮至558ml去离子水中,得到10%湿重的悬浮物。用约28ml,1M盐酸调节该包含体悬浮物的pH,至2.0。当pH调到4.5和3.0之间,溶液变浓时,需要剧烈搅拌。
将上述包含体悬浮物置于一个备有搅拌器、加样口、提供惰性气体连接管的温控搪瓷反应容器中。惰性气体(Ar)可以通过通气口以5psi(磅/平方英寸)的压力进入反应容器。打开温控器并调至合适的温度设置,此时记录反应开始时间。此时进行加热,至40℃,关闭通气口,使反应容器中的压力为5psi。在调节温度期间有时可以通入一些惰性气体,以保持与开始的压力一致。反应混合物在所需温度的上下5℃范围内保持15分钟。整个反应期间的温度控制在85±1.5℃。定时取样(30分钟一次),用RP-HPLC分析分离出的b-型钠尿肽(2-32)。先关闭气体入口阀后完成取样,然后使容器与大气压连通,最后用任意形式的注射器从取样口中抽取1ml样品。关闭取样口,重新打开气体入口,通入气体5-10秒,最后再关闭通气口,使容器重新加压。
2小时后,将反应容器置于冰上冷却至20℃使反应停止。在冷却期间继续搅拌反应溶液。在冷却期间结束时,在反应混合物中加入28ml 1M磷酸(最终浓度为50mM)并用10N NaOH将反应混合物的pH调至2.8。该溶液中的b-型钠尿肽(2-32)含量用RP-HPLC峰面积测定为每升含b-型钠尿肽(2-32)0.45g。(总共223mg还原的b-型钠尿肽(2-32))。将该溶液在-70±10℃冷冻保存,直到进行下一步操作。
(D)从酸裂解反应混合物中得到的b-型钠尿肽(2-32)的分批离子交换纯化
用分批培育方法从调节了pH的酸裂解反应混合物中用SP-SpherodexLS阳离子交换树脂将b-型钠尿肽(2-32)吸附。吸取500ml上述酸裂解反应混合物置于一个热水浴中1.5小时,直至温度升至22℃。将50mlSP-Spherodex LS树脂按制造者说明书中的方法洗涤后,加入置于一玻璃容器中解冻的该反应混合物中,并进行适当搅拌。该反应混合物在室温环境下搅拌90分钟,每30分钟的间隔取上清液一次。在混合结束时停5分钟,使树脂沉降。倾去上清,用250ml,50mM乙酸洗涤树脂三次。然后将树脂装入一个柱(2.5×11.5cm)中,再用2倍柱体积(CV)的50mM乙酸洗涤树脂,该乙酸pH是3.5,洗涤速度为8ml/分。然后再用4 CV 50mMpH7.2的磷酸钠洗涤柱子。用4 CV 10mM二硫苏糖醇(DTI)、50mM pH7.2的磷酸钠洗脱,完成在柱上的还原。最后用4 CV 50mM pH7.2的磷酸钠、含有200mM氯化钠的5CV 50mM pH7.2的磷酸钠洗脱。用450mM NaCl在50mM pH7.2磷酸钠和1M NaCl在50mM pH7.2的磷酸钠的溶液两次洗涤后,完成全部还原的b-型钠尿肽(2-32)的洗脱。收集全部330ml洗脱液,进行b-型钠尿肽含量分析,总共148mg,产率为66%。将洗脱液直接用于进行下一步形成二硫键的操作。
(E)b-型钠尿肽(2-32)形成二硫键
将含有b-型钠尿肽(2-32)0.45mg/mlr离子交换柱洗脱液330ml用2N盐酸调pH至6.8。二硫键的形成是在氩气中,2-8℃时,将11ml 15mMK3Fe(CN)6加入溶液中反应11小时而完成的。通过加入3.4ml 5M乙酸使反应液酸化至pH5.0终止反应。氧化反应得到的产物是121mg b-型钠尿肽(2-32),本步骤产率是82%。将氧化反应液置于2-8℃保存过夜。
(F)b-型钠尿肽(2-32)反相HPLC纯化
将氧化反应液升温至室温,用反相HPLC方法进行进一步的纯化。在342ml氧化反应液中加入乙腈18ml,共装入360ml。用10N氢氧化铵调pH至5.5。将该溶液(b-型钠尿肽(2-32)51mg/160ml)以4.5ml/min速度装入RP-HPLC柱(Vydac C4 214TP1010)。装入的树脂量是3mg/ml。根据与下表中列出的同样的流速进行洗脱。缓冲液A是5%乙腈,50mM乙酸铵,pH5.0,缓冲液B是50%乙腈,50mM乙酸铵,pH5.0。
步骤 | 体积ml | 填充物% | 缓冲液A% | 缓冲液B% |
加样 | 160 | 100 | ||
洗脱 | 67.5 | 100 | ||
梯度洗脱开始 | 100 | |||
梯度洗脱结束 | 180 | 60 | 40 |
手工收集洗脱峰部分,在合并洗脱液前用分析RP-HPLC进行分析,并在2-8℃贮存三天。合并纯度大于95%的部分。经RP-HPLC分析,最终得到的合并液的纯度大于97%。得到48mg b-型钠尿肽(2-32),本步骤产率是94%。
(G)酸裂解反应得到的b-型钠尿肽(2-32)鉴定
通过完整的N末端氨基酸测序、氨基酸分析和电喷射质谱分析,鉴定经过酸裂解、IEC层析、RP-HPLC纯化制备的b-型钠尿肽RP-HPLC主峰,所有三种试验都证明按本程序所制备的肽是b-型钠尿肽(2-32)。
Claims (13)
1.一种生产等电点高于8或低于5的纯化的多肽的方法,包括:
(A)在一种重组宿主细胞中以一种融合蛋白的形式表达所述的肽,其中,所需的肽在其N-末端与一种融合配偶体融合,该融合配偶体在其C-末端包括具有Asp残基的氨基酸序列,其中(I)该融合配偶体的C端Asp残基和该肽的N端残基形成一个在酸性条件下可断裂的键;(II)该肽与融合配偶体、任何经酸裂解融合配偶体所产生的不需要的片段之间具有足够的净电荷差别,使该肽能够通过离子交换层析从融合配偶体和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分离出来;(III)该融合蛋白在重组宿主细胞中形成包含体;
(B)从重组宿主细胞中回收包含体;
(C)在无离液剂情况下将融合蛋白置于酸性条件,将肽与融合配偶体之间进行裂解;
(D)用一种非离子型的离液剂对不溶性的裂解产物进行溶解化处理,所使用的条件是使其变得可溶但又不破坏肽的一级结构;
(E)用离子交换层析分离肽。
2.权利要求1所述的方法,其中所述的融合蛋白的PI在6.0-8.0之间。
3.权利要求1所述的方法,其中所述的融合蛋白的PI在6.5-7.5之间。
4.权利要求1所述的方法,还包括(F)将分离的肽置于使其重新折叠成具有生物活性的三级结构,并形成生物学活性所需的分子内二硫键的条件下的步骤。
5.权利要求1所述的方法,其中所需的肽内部不含有在酸性条件下可裂解的二肽序列。
6.权利要求1所述的方法,其中所述的肽内部含有一个或多个在酸性条件下可裂解的二肽,其裂解速率低于融合配偶体的C端残基和肽的N端氨基酸残基形成的二肽的裂解速率。
7.权利要求1所述的方法,其中所述的肽是b-型钠尿肽。
8.权利要求1所述的方法,其中在步骤(D)中所使用的非离子型的离液剂是尿素。
9.权利要求7所述的方法,其中,将肽用浓度为3M至7M的尿素处理。
10.权利要求4所述的方法,其中所述的肽在其具有生物学活性的构象时含有至少一个半胱氨酸残基间的二硫键,并且步骤(F)是在导致二硫键形成的氧化条件下进行的。
11.一种生产等电点高于8或低于5的纯化的多肽的方法,包括:
(A)在一种重组宿主细胞中以一种融合蛋白的形式表达所述的肽,其中,所需的肽在其N-末端与一种融合配偶体融合,该融合配偶体在其C-末端包括具有Asp残基的氨基酸序列,其中(I)该融合配偶体的C端Asp残基和该肽的N端残基形成一个在酸性条件下可断裂的键;(II)该肽与融合配偶体、任何经酸裂解融合配偶体所产生的不需要的片段之间具有足够的净电荷差别,使该肽能够通过离子交换层析从融合配偶体和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分离出来;(III)该融合蛋白在重组宿主细胞中形成包含体;
(B)从重组宿主细胞中回收包含体;
(C)在无离液剂情况下将融合蛋白置于酸性条件,将肽与融合配偶体之间进行裂解;
(D)用超滤、渗滤或离心方法从该裂解混合物中去除不溶性的裂解产物;
(E)用离子交换层析分离肽。
12.权利要求11所述的方法,其中所述的肽在进行步骤(E)之后还进行一个或几个其它的纯化步骤。
13.权利要求12所述的方法,其中所述的肽是b-型钠尿肽,并在进行步骤(E)之后依次进行反相HPLC层析和额外的离子交换层析。
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