JP5289792B2 - 焦点検出装置とそれを用いた蛍光観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、焦点検出装置とそれを用いた蛍光観察装置に関し、特に、生細胞を高コントラストで蛍光観察する顕微鏡や光学装置において、観察対象となる観察標本の搭載されたガラス面と観察標本の界面位置を高い精度で検出することができる装置に関する。

生物研究分野では、蛍光観察法を利用して細胞内部の機能、構造解析が行われている。しかしながら、通常の蛍光観察では照明光が観察対象物全体に照射されるため、観察したい位置以外（ピントの合っていない位置）の蛍光情報も同時に取得される。そのため、コントラストが低下してしまい、例えば１分子といった微小単位の観察を行うことができなかった。

近年、光の全反射時に発生するエバネッセント光を照明光として利用し、数十から数百ｎｍといった微小領域のみを照明する技術が確立したことで、通常の蛍光観察の問題点である上記コントラストの低下を防止し、１分子レベルの微小単位の蛍光観察が可能となってきている。

エバネッセント光は、屈折率の異なる境界面に、ある一定値以下の角度で照明光を入射させたときに、その照明光を全反射させることによって発生する光である。また、エバネッセント光は、上記境界面に対して照明光とは反対側に、波長より小さい寸法の領域に局在する、自由空間を伝播しない特性をもつ。

生物研究では、生細胞内での経時変化を見るためにしばしばタイムラプスと言われる手法がとられている。この手法は、例えば１日、２日といった期間内で連続または一定間隔で観察像を取得することで細胞内部の機能を解析することを目的としている。

この手法においては、長期間におよぶ観察が必要となるが、観察装置である顕微鏡は金属とガラスの集合体であり、例えば実験を行う部屋の内部温度が僅かに変化しただけでも顕微鏡が変形し、ピント位置がずれるという問題が発生する。特に、数十から数百ｎｍといった微小領域を観察するエバネッセント光を利用した蛍光観察では、大きな問題となっている。

特許文献1では、焦点検出専用のエバネッセント光を利用することで、そのエバネッセント場に存在する細胞の一部を高精度で位置検出する手段が開示されている。

図１１に示すように、焦点検出用のレーザ光９０をカバーガラス９１と試料溶液９６中の観察試料９２との界面９１ａで全反射するように入射し、カバーガラス表面にエバネッセント光を浸み出させる。このエバネッセント光の存在する領域つまりエバネッセント場に位置する観察標本９２は前記エバネッセント光により散乱光９３を生じる。その散乱光９３を対物レンズ９４で集光し、受光素子９５で検出してその受光強度の最も大きな位置を合焦位置とする。この位置情報から対物レンズ９４の焦点位置を制御している。試料を蛍光観察するための光源はさらに別にあり、焦点検出用のレーザ光９０は赤外光を用いる事で細胞に与えるダメージを少なくする事ができる。
特開２００３−２７０５２４号公報

ところが特許文献１に記載の発明では、細胞による散乱光強度を検出しているため、合焦精度、位置が細胞の数や状態によって振られることや、フォーカス調整時の散乱光強度変化が微小であり検出精度が劣化することが予想される。

また焦点を合わせるために用いている基準点が散乱光を発生する試料の一部であるため、生細胞などを観察標本としている場合、基準点とした散乱光を発生する観察標本の一部が動くことが予想され、焦点調整が定まらないことになる。例えば、焦点調整に用いていた細胞の一部が上方向に移動し、実際に観察していた部位が動かなかった時、観察している部位はピントボケになってしまう。

本発明は、エバネッセント光を利用した高コントラストの蛍光観察において、試料である細胞の状態等に影響なく高合焦精度を実現することを目的とする。

本発明の焦点検出装置は、観察標本を観察するための対物レンズと、前記観察標本の屈折率とは異なる屈折率をもつ透明部材と、前記観察標本を励起するために所定の波長を有する光源と、前記光源からの照明光を、前記観察標本と前記透明部材との境界面で全反射するように前記対物レンズの外周部分を通して出射する照明光学系と、前記境界面で全反射した反射光を前記対物レンズを介して検出する検出器と、前記光源からの照明光が前記境界面で全反射したときに生じるエバネッセント光により前記観察標本の蛍光観察を行う観察光学系と、前記観察光学系の光軸に対して設けられ、前記光源からの照明光により前記境界面で全反射した反射光を前記検出器の検出面に集光させる結像光学系と、前記検出器が検出する前記境界面で全反射した反射光の集光位置に基づいて、前記対物レンズと前記観察標本とを相対移動させ、前記対物レンズの焦点調整を行う制御部と、を備えたことを特徴とする。

本発明によれば、試料である細胞の状態等に影響なく高合焦精度を実現することができる。

図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図である。なお、第１の実施の形態及び以降の実施の形態では、蛍光観察装置として倒立型の落射蛍光顕微鏡を用いて、本発明の実施の形態を説明する。
図１において、１は顕微鏡本体であり、この顕微鏡本体１は、一般的な倒立型の落射蛍光顕微鏡と同様に、照明部２、ダイクロイックミラー３、対物レンズ４、ハーフミラー５、光学フィルタ６および光ディテクタとしての撮像素子（ＣＣＤカメラなど）７を有しており、それらが、それぞれの光軸を一致させて配置されている。

照明部２は、後述する標本（生細胞）１２を励起する所定波長のレーザ光を発する照射光源８と、集光レンズ９を、それぞれの光軸が一致するように配置している。また、照射光源８からのレーザ光が集光レンズ９、ダイクロイックミラー３を介して対物レンズ４の後ろ側焦点位置に集光されるように調整されている。

ダイクロイックミラー３は、照射光源８からの所定波長の照明光１１１の波長の光を反射するとともに、後述する照明光１１１よりも波長の長い蛍光１１２の波長を透過するように設定されている。対物レンズ４は、ＮＡ（対物レンズの開口数）＞ｎ（観察標本の屈折率）の条件を満たした高い開口数を有する油浸対物レンズからなる。

対物レンズ４の上方に標本１２が配置されている。標本１２は、顕微鏡本体１の図示しないステージに載置されたカバーガラス１３上に密着される。このカバーガラス１３は生細胞である標本１２の生体活動に必要な水溶液で満たされている。この標本１２は、カバーガラス１３の屈折率とほぼ同じ屈折率をもつオイル１５を介して対物レンズ４の焦点位置に位置されている。

ダイクロイックミラー３で反射された照射光源８のレーザ光は、照明光（励起光）１１１として、対物レンズ４の外周部分を通る小さい光束径で対物レンズ４に入射し、カバーガラス１３で全反射する入射角度に調整されており、カバーガラス１３で全反射したときに標本１２側にエバネッセント光１７を生成する。エバネッセント光１７は、その照明光の波長より短い距離でカバーガラス１３の標本１２側に局在する。照明光１１１はカバーガラス１３で全反射した後、対物レンズ４の中心軸に対して照明光１１１と軸対称な対物レンズ４の後ろ側焦点位置で集光し、戻り光１１３としてダイクロイックミラー３で反射して顕微鏡本体１の内面で遮光される。

一方、エバネッセント光１７により励起される標本１２から発する微弱な蛍光１１２（破線で表記）は、ダイクロイックミラー３を透過し、光学フィルタ６を介してハーフミラー５に入射する。ハーフミラー５は、観察光軸に対して挿脱可能になっている。ハーフミラー５が光軸に挿入された時には、蛍光１１２が分割され、一方の分割蛍光は接眼レンズ１６を介して観察可能になり、他方の分割蛍光は撮像素子７に入射する。一方、ハーフミラー５が光軸から抜かれた時には、蛍光１１２がすべて撮像素子７に導かれる。

光学フィルタ６は、ダイクロイックミラー３などとともに観察光学系を構成するもので、特定の波長の光を選択的に通すことができるようになっている。ここでは、照明光１１１の波長の光を遮断し、照明光１１１よりも波長が長い蛍光１１２の光を通過させるものが用いられる。

標本１２からの蛍光１１２は、光学フィルタ６を通過し、接眼レンズ１６による蛍光像として観察されるとともに、撮像レンズ１８を介して撮像素子７により撮像される。

制御部１０は、位置制御部１４を使って対物レンズ４を光軸方向に動かすことにより対物レンズ４の焦点位置を光軸方向に動かす。これにより、蛍光１１２の複数の蛍光像を撮像素子７で取得し、そのコントラストの差を求める。

このコントラストの差から、観察標本１２と対物レンズ４の焦点位置が重なるように位置制御部１４を制御して対物レンズ４を上下に動かす。
なお、蛍光像によるピント検出は、コントラスト差に限らず、像の強度分布などからも求めることができる。

以上の構成により、数十ナノメートル〜数百ナノメートルという非常に薄いエバネッセント光１７の領域に存在する標本１２の一部分から発する蛍光１１２の像を使った、焦点検出と焦点合わせが可能となる。
エバネッセントと組み合わせた高精度の焦点検出の効果が得られる。すなわち、蛍光１１２は上記の数十ナノメートル〜数百ナノメートルのエバネッセント光１７の領域でしか発光しないため、数十ナノメートル〜数百ナノメートルという精度で焦点検出ができる。

また生物研究における生細胞内での経時変化を見るためのタイムラプスでは、長期間におよぶ観察が必要となるが、観察装置である顕微鏡は金属とガラスの集合体であり、例えば実験を行う部屋の内部温度が僅かに変化しただけでも顕微鏡が熱変形し、ピント位置がずれるという問題が発生しており、特に、数十から数百ｎｍといった微小領域を観察するエバネッセント光を利用した蛍光観察では、大きな問題となっている。しかし本実施の形態によれば、観察している蛍光１１２の像を使って焦点検出を行うため、顕微鏡などが熱変形をおこしても、長時間にわたり焦点を合わせたまま観察を続けることができる。また、観察に使用するレーザの波長より多い波長のレーザを別途用意して使用すれば、蛍光の退色も防止できる。

なお、第１の実施の形態及び以降の実施の形態においては、蛍光観察装置として、倒立型の落射蛍光顕微鏡を用いて説明しているが、これに限らず、蛍光を用いて合焦を実現できる構成であれば、どのような装置にも適用可能である。

（第２の実施の形態）
図２は、本発明の第２の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図である。図２において、図１と同じ部分には同じ符号を付している。
第２の実施の形態では、第１の実施の形態における装置に、新たに焦点検出装置系である集光レンズ３０と検出器３１を観察光学系の光軸に対して追加している。
図２において、第１の実施の形態では戻り光１１３を遮光していたが、本実施の形態では、戻り光１１３を遮光せずに、集光レンズ３０にて検出器３１の検出ポイント３７の後方に集光している。

上記構成ではカバーガラス１３と標本１２の密着面が対物レンズ４の焦点位置に一致した状態の構成を示しており、カバーガラス１３の位置３３（点線）は、対物レンズ４の焦点位置よりも下方向にカバーガラスが動いた状態を示している。カバーガラス１３が位置３３に動いたときに、照明光１１１の戻り光１１３は戻り光１２３の位置に動く。具体的には、図２に示すように、照明光１１１の反射面が下方向に動いたので、戻り光１２３の光路は、戻り光１１３より光軸側の光路に移動し、集光レンズ３０による集光位置が検出ポイント３７から検出ポイント３８に移動する。
カバーガラス面１３が対物レンズ４の焦点位置よりも上方向に動いた場合を考慮すると、照明光１１１の戻り光は検出ポイント３７に対して検出ポイント３８とは反対側の図示しない光路を通ることになる。
従って、まず、ピントがあった状態における集光レンズ３０による集光位置である検出器３１の検出ポイント３７の位置を記憶しておく。そして、集光位置が、検出ポイント３７からずれたときに、ピントがずれているということなので、対物レンズ４を動かして、集光位置をピントが合った状態である検出ポイント３７の位置に戻す。

上記のように、検出器３１に対する戻り光の集光位置を検出して、集光位置を合焦時の検出ポイントに一致させることで、対物レンズ４の合焦位置を求めることが可能となる。これにより第１の実施形態と同様に、顕微鏡などが熱変形をおこしても、長時間にわたり焦点を合わせたまま観察を続けることができる。

また検出器３１に集光される戻り光の検出ポイントの位置により、カバーガラス１３と標本１２の密着面が、焦点位置に対して光軸方向の上方向か下方向かどちらにあるのかが分かるため、焦点調整時の調整方向を短時間で判断できる。

本実施の形態において、カバーガラス１３と標本１２の密着面と異なる位置（ここではカバーガラス面３３と標本の密着面）に対物レンズ４の焦点を合わせたいとき、戻り光の検出ポイント３８を焦点一致ポイントとしてオフセットしても良い。なお照明光１１１を対物レンズ４の瞳位置で集光させていれば、エバネッセント光３６は変わらない。
これにより、上記の効果に加え、カバーガラス１３と標本１２の密着面と異なる位置に対物レンズ４の焦点をオフセットして合わせたままで、焦点位置を検出する事ができる。

更に、照明光１１１はカバーガラス面１３への入射角度によって、エバネッセント光１７の浸み出し深さを変化させる事ができるが、エバネッセント光１７の浸み出し深さを変化させた後の検出ポイントを焦点一致ポイントとしてオフセットしても良い。
これにより、上記の効果に加え、エバネッセント光１７の浸み出し深さを変化させても焦点位置を検出する事ができる。

また、カバーガラス面１３が移動しない短時間の間に、照明光１１１のカバーガラス面１３への入射角度を変化させ、その戻り光の検出ポイントの変化量を読み取るようにしても良い。
これにより、エバネッセント光１７の浸み出し深さの変化量を求める事ができる。

図３に示すように、図２に示す検出器３１である面センサ、ラインセンサなどの代わりに、ピンホール３９と光検出器４０を組み合わせた集光ポイント検出器４１に置き換えても良い。この場合には、集光位置を検出するために集光ポイント検出器４１を移動して光検出器４０で集光ポイントを検出する。
これにより、上記の効果に加え、高価な検出器３１をより安価な検出器に置き換えることができる。

また、焦点検出に用いていた照明光１１１を焦点検出用の専用光とし、照明用の光源を別に配置しても良い。
これにより、上記の効果に加え、焦点検出用の光源の波長を、生体である標本１２にダメージを与えにくい赤外光などに変更することができる。

（第３の実施の形態）
図４は、本発明の第３の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図である。図４において、図１と同じ部分には同じ符号を付している。
図４に示すように、本実施の形態では、新たに焦点検出光源系である焦点検出用レンズ５０と、焦点検出装置系である焦点検出用レンズ５３と、２分割検出器５４とを観察光学系の光軸に対して追加している。

本実施の形態では、戻り光１１３は、挿脱可能な遮光板５２で、遮光と透過を選択できるように構成される。
焦点検出用レンズ５０が照明光路内に挿入されると、遮光板５２は焦点検出戻り光１３２の光路から抜かれて、焦点検出戻り光１３２は２分割検出器５４に到達する。一方、焦点検出用レンズ５０が照明光路内から抜かれると、遮光板５２は戻り光１１３の光路に挿入されて、戻り光１１３は遮光される。

焦点検出用レンズ５０は、集光レンズ９の焦点と共益な位置に挿脱可能な状態で配置される。焦点検出用レンズ５０が照明光路内に挿入されると、照明光１１１は焦点検出光１３１となる。焦点検出光１３１として対物レンズ４に入射されるレーザ光は、カバーガラス１３と標本１２の密着面で焦点を結ぶと同時に反射され、対物レンズ４の中心軸に対して焦点検出光１３１と軸対称な焦点検出戻り光１３２となる。焦点検出戻り光１３２はダイクロイックミラー３で反射される。

ダイクロイックミラー３で反射された焦点検出戻り光１３２は、焦点検出光軸と光軸を一致した焦点検出用レンズ５３にて集光され、焦点検出光軸と軸を一致した２分割検出器５４の中心の分割部で焦点を結ぶ。このときの２分割検出器５４の集光面５５では、２分割検出器５４の両検出素子にまたがった小さな集光光が観察される。

２分割検出器５４の分割面は、光軸と平行であり、かつ焦点検出光１３１と焦点検出戻り光１３２の軸を含む面に対して垂直な状態で構成される。ここで、図５に示すようにカバーガラス１３と標本１２の密着面が下方向に動いたとき、焦点検出光１３１として対物レンズ４に入射されるレーザ光は、カバーガラス１３と標本１２の境界面で焦点を結ばずに反射して焦点検出戻り光１３３となる。焦点検出戻り光１３３は２分割検出器５４の中心より偏った位置に集光しない状態のまま到達する。したがって２分割検出器５４の集光面５５では、２分割検出器５４の片側素子に偏った大きなボケ光５６が観察される。逆に、図６のようにカバーガラス１３と標本の密着面が上方向に動いたときは、２分割検出器５４の上記とは反対の素子に偏った大きなボケ光５７が観察される。
そこで、２分割検出器５４の集光面５５にて両検出素子にまたがった小さな集光光が観察できるように対物レンズを光軸方向に調整することで焦点調整を行うことができる。

上記のように、本実施の形態により、照明光１１１を定期的に焦点検出光１３１に切り替えながら対物レンズ４の焦点位置を検出することができる。これにより、第１の実施の形態と同様に、顕微鏡などが熱変形をおこしても、長時間にわたり焦点を合わせたまま観察を続けることができる。また照明光を焦点検出光に流用するため、全体的な構成が単純となり安価に構成できる。また焦点検出光を必要な時だけ照明光に切り替えられるため、生細胞などの標本に与えるダメージが少なくなる。また焦点検出においても、２分割検出器５４の集光面のどちらに焦点検出戻り光１３２が到達しているかで、カバーガラス１３が焦点面の上方向にあるのか下方向にあるのか判断できるため、カバーガラス１３の移動方向をこれだけで判断する事ができる。

（第４の実施の形態）
図７は、本発明の第４の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図である。図７において、図１と同じ部分には同じ符号を付している。
図７に示すように、本実施の形態では、新たに焦点検出光源系である焦点検出光源６０と、コリメートレンズ６１と、遮光板６２と、半透過ミラー６３と、焦点検出用ダイクロイックミラー６９と、焦点検出装置系である焦点検出用レンズ６４と、波長カット板７０と、２分割検出器６５とを観察光学系の光軸に対して追加している。

図７において、照明系と観察系は、第１の実施の形態に係る構成と同じである。ダイクロイックミラー３は、照射光源８からの所定波長の照明光１１１の波長の光を反射するとともに、照明光１１１の励起により標本１２から発せられる波長の長い微弱な蛍光の波長を透過し、蛍光の波長よりさらに波長の長い焦点検出で用いる焦点検出光１４１も透過するように設定されている。

照明系には、カバーガラス１３で全反射した戻り光１１３が、観察光学系に漏れ出さないようになり、遮光板７１が、ダイクロイックミラー３より標本側に配置される。

焦点検出系では、生細胞にダメージを与えにくい赤外域の所定波長のレーザ光を発する焦点検出光源６０、及びコリメートレンズ６１を、それぞれの光軸を一致するように配置している。焦点検出光源６０からのレーザ光を、コリメートレンズ６１、半透過ミラー６３、焦点検出光ダイクロイックミラー６９、ダイクロイックミラー３を介して対物レンズ４の焦点位置で集光させるように各々が調整されている。

半透過ミラー６３は、焦点検出光源６０からの所定波長のレーザ光を半透過するとともに、残りの半分の光量を反射するように設定されている。
焦点検出光ダイクロイックミラー６９は、蛍光の波長を透過すると共に、蛍光より波長の長い焦点検出光１４１を反射するように設定されている。

焦点検出光源６０からのレーザ光は、コリメートレンズ６１の瞳位置に配置された遮光板６２でその半分を遮光された焦点検出光１４１として対物レンズ４に入射され、カバーガラス１３と標本１２の密着面で焦点を結ぶと共に反射されて対物レンズ４の中心軸に対して焦点検出光１４１と軸対称な焦点検出戻り光１４２となる。
遮光板６２は、焦点検出光の断面から見て半円形に遮光するように、円板状のガラス板の半円部分を遮光し、残りを透過させている。

カバーガラス１３と標本１２の密着面で反射した焦点検出戻り光１４２は、ダイクロイックミラー３を透過し、焦点検出用ダイクロイックミラー６９で反射し、半透過ミラー６３でその半分の光量が反射して遮光板６２で遮光され、残り半分の光量が透過する。半透過ミラー６３を透過した焦点検出戻り光１４２は、焦点検出光軸と光軸を一致した焦点検出用レンズ６４にて集光され、波長カット板７０にて焦点検出光源６０の波長のみを透過し、焦点検出光軸と軸を一致した２分割検出器６５の中心の分割部で焦点を結ぶ。このときの２分割検出器６５の集光面６６では、２分割検出器６５の両検出素子にまたがった小さな集光光が観察される。
２分割検出器６５の分割面は、光軸と平行でかつ焦点検出光１４１と焦点検出戻り光１４２の分割ラインを含む面と同じ面で構成される。

これにより、カバーガラス１３と標本１２の密着面に対物レンズ４の焦点が合った状態を検出できる。

図８はカバーガラス１３が下方向に動いたとき、焦点検出光１４１として対物レンズ４に入射されるレーザ光は、カバーガラス１３と標本１２の密着面で焦点を結ばずに反射して対物レンズ４を透過してもコリメータ光ではない焦点検出戻り光１４３となる。焦点検出戻り光１４３は２分割検出器６５まで導かれ、２分割検出器６５の中心より偏った位置に集光しない状態のまま到達する。したがって２分割検出器６５の集光面６６では、２分割検出器６５の片側素子に偏った大きなボケ光６７が観察される。逆に図９のようにカバーガラス１３が上方向に動いたときは、カバーガラス１３が下方向に動いたときの２分割検出器６５の検出素子とは反対の素子に偏った大きなボケ光６８が観察される。

以上より焦点検出器の集光面にて両検出素子にまたがった小さな集光光が観察できるように対物レンズを光軸方向に調整する事で焦点調整を行う。

本実施の形態によれば、蛍光像を観察しながら常に対物レンズの焦点位置を検出することができる。また照明光１１１と焦点検出光１４１の光源が異なるため、焦点検出光１４１に赤外光などを用い、生細胞などの標本に与えるダメージを少なくする事ができる。また焦点検出においても、２分割検出器６５の集光面のどちらに焦点検出戻り光１４２が到達しているかで、カバーガラス１３が焦点面の上方向にあるのか下方向にあるのか判断できるため、焦点調整時にカバーガラス１３の移動方向をこれだけで判断する事ができる。さらに、照明光１１１のカバーガラス１３への入射角を変えてエバネッセント光１７の浸み出し深さを変えても、焦点検出はまったく別の光源でおこなっているため焦点検出に影響が出ない。また第１の実施の形態と同様に、顕微鏡などが熱変形をおこしても、長時間にわたり焦点を合わせたまま観察を続けることができる。さらに２分割検出器６５における焦点一致の位置をオフセットすることで、対物レンズ４の焦点位置がカバーガラス１３と標本１２の密着面から離れていても像を観察しながら焦点検出が行える。

（第５の実施の形態）
図１０は、本発明の第５の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図である。図１０において、図１と同じ部分には同じ符号を付している。

図１０において、１は顕微鏡本体で、この顕微鏡本体１は、一般的な倒立型の落射蛍光顕微鏡と同様に、照明光源８４、対物レンズ４、ダイクロイックミラー３、光学フィルタ６、ハーフミラー５、および光ディテクタとしての撮像素子７、焦点検出光源８７、焦点検出装置８９を有しており、それぞれの光軸を一致させて配置されている。照明光源８４による照明光は、標本１２を励起する所定波長の光のみを透過する励起フィルタ８５を通って標本１２を照射する。対物レンズ４は、ＮＡ（対物レンズの開口数）＞ｎ（観察標本の屈折率）の条件を満たした高い開口数を有する油浸対物レンズからなる。

対物レンズ４の上方に標本１２が配置されている。標本１２は、顕微鏡本体１の図示しないステージに載置されたカバーガラス１３上に密着される。このカバーガラス１３は生細胞である標本１２の生体活動に必要な水溶液で満たされている。この標本１２は、カバーガラス１３の屈折率とほぼ同じ屈折率をもつオイル１５を介して対物レンズ４の焦点位置に位置されている。

照明光８８の励起により、標本１２から発せられる微弱な蛍光１１２は、対物レンズ４及びダイクロイックミラー３を透過し、光学フィルタ６を介してハーフミラー５に入射される。ハーフミラー５は、観察光軸に対して挿脱ができるようになっており、光軸に挿入された時には、蛍光１１２を分割し、一方の分割蛍光が接眼レンズ１６を介して観察可能であり、他方の分割蛍光が撮像素子７に入射する。一方、ハーフミラー５が光軸から抜かれた時には、蛍光１１２がすべて撮像素子７に導かれる。光学フィルタ６は、ダイクロイックミラー３などとともに観察光学系を構成するものであって、特定の波長の光を選択的に通すことができる。ここでは、光学フィルタ６として、照明光８８の波長の光と焦点検出光１５１の波長の光を遮断し、照明光８８よりも波長が長い蛍光１１２の光を通過させるものが用いられる。標本１２からの蛍光１１２は、光学フィルタ６を通過し、蛍光像として観察されるとともに、撮像素子７により撮像される。

焦点検出系は、生細胞である標本にダメージを与えにくい赤外域の所定波長のレーザ光を発する焦点検出光源８７、集光レンズ８６を、それぞれの光軸が一致するように配置しており、焦点検出光源８７からのレーザ光を集光レンズ８６及びダイクロイックミラー３を介して対物レンズ４の後ろ側焦点位置に集光させるように調整されている。

ダイクロイックミラー３は、励起光８８よりも波長の長い蛍光の波長を透過し、焦点検出光源８７からの赤外域の所定波長の焦点検出光１５１を反射するとともに、励起光８８を通さないように設定されている。
ダイクロイックミラー３で反射された焦点検出光源８７のレーザ光は、焦点検出光１５１として対物レンズ４を介して標本１２に照射される。

焦点検出光１５１は、対物レンズ４の外周部分を通る小さい光束径で、カバーガラス１３と標本１２の密着面で全反射する入射角度に調整されており、カバーガラス１３と標本１２の密着面で全反射したときに標本１２側にエバネッセント光１７を生成する。エバネッセント光１７は、その焦点検出光１５１の波長より短い距離でカバーガラス１３の標本１２側に局在する。焦点検出光１５１はカバーガラス１３で全反射した後、対物レンズ４の中心軸に対して焦点検出光１５１と軸対称な対物レンズ４の後ろ側焦点位置で集光され、焦点検出戻り光１５２としてダイクロイックミラー３で反射して顕微鏡本体１の内面で遮光される。

エバネッセント光１７が標本１２に当たるとその散乱光１６１が発生する。散乱光１６１はダイクロイックミラー３で反射し、焦点検出装置８９にはいる。
焦点検出装置８９は、集光レンズ８０、ピンホール８１、フィルタ８２、検出器８３で構成され、各々が顕微鏡本体１の光軸と一致している。散乱光１６１は集光レンズ８０で検出器８３に集光される。集光レンズ８０の瞳位置にはピンホール８１が配置され、焦点を合わせたい視野中心の散乱光１１４以外の不要な光線を大幅にカットする。ピンホール８１と検出器８３の間には、赤外域の所定波長である散乱光１６１の波長のみを透過しそれ以外の照明光８８などの波長を除去するフィルタ８２が構成される。

制御部１０では、位置調整部１４を使って対物レンズ４を光軸方向に動かし、これにより対物レンズ４の焦点位置を光軸方向に動かすことで、散乱光１６１の複数の像を検出器８３で取得し、その信号の強度差などを求める。この信号の強度差から、信号強度が最大になる状態が標本１２と対物レンズ４の焦点位置が重なる状態であるとして位置制御部１４を制御して対物レンズ４を信号強度が最大になる位置まで光軸方向に動かす。

本実施の形態によれば、数十ナノメートル〜数百ナノメートルという非常に薄いエバネッセント光１７の領域に存在する標本１２の一部分から発する散乱光１６１の像を使った、焦点検出と焦点合わせが可能となる。
散乱光１６１は、上記のように、数十ナノメートル〜数百ナノメートルのエバネッセント光１７の領域でしか発光しないため、数十ナノメートル〜数百ナノメートルという精度の焦点検出が効果として得られる。

また生物研究における生細胞内での経時変化を見るためのタイムラプスでは、長期間におよぶ観察が必要となるが、観察装置である顕微鏡は金属とガラスの集合体であり、例えば実験を行う部屋の内部温度が僅かに変化しただけでも顕微鏡が熱変形し、ピント位置がずれるという問題が発生しており、特に、数十から数百ｎｍといった微小領域を観察するエバネッセント光を利用した蛍光観察では、大きな問題となっている。しかしこの実施の形態では、観察している標本の散乱光を使って焦点検出を行うため、顕微鏡などが熱変形をおこしても、長時間にわたり焦点を合わせたまま観察を続けることができる。また焦点を合わせたい部分の像のみをピンホール８１で選択するため、焦点とは関係ない像を除去し、焦点検出の精度を上げることができる。

本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。例えば、上記の各実施の形態では、焦点検出方法を個別に述べたが、適宜組み合わせることができることはもちろんである。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。

また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。

本発明の第１の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態の変形例にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図。 本発明の第３の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図。 本発明の第３の実施の形態において、カバーガラスと標本の密着面が下方向に動いたときの焦点検出戻り光の検出位置を示す図。 本発明の第３の実施の形態において、カバーガラスと標本の密着面が上方向に動いたときの焦点検出戻り光の検出位置を示す図。 本発明の第４の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図。 本発明の第４の実施の形態において、カバーガラスと標本の密着面が下方向に動いたときの焦点検出戻り光の検出位置を示す図。 本発明の第４の実施の形態において、カバーガラスと標本の密着面が上方向に動いたときの焦点検出戻り光の検出位置を示す図。 本発明の第５の実施の形態にかかる蛍光観察装置の概略構成を示す図。 従来技術の概略構成を示す図。

符号の説明

１…顕微鏡本体
２…照明部
３…ダイクロイックミラー
４…対物レンズ
５…ハーフミラー
６…光学フィルタ
７…撮像素子
８…照射光源
９…集光レンズ
１０…制御部
１２…標本
１３…カバーガラス
１４…位置制御部
１５…オイル
１６…接眼レンズ
１７…エバネッセント光
１８…撮像レンズ
３０…集光レンズ
３１…検出器
３２…カバーガラス面
３６…エバネッセント光
３９…ピンホール
４０…光検出器
４１…集光ポイント検出器
５０…焦点検出用レンズ
５２…遮光板
５３…焦点検出用レンズ
５４…２分割検出器
５５…集光面
６０…焦点検出光源
６１…コリメートレンズ
６２…遮光板
６３…半透過ミラー
６４…焦点検出用レンズ
６５…分割検出器
６６…集光面
６７…ボケ光
６９…焦点検出用ダイクロイックミラー
８０…集光レンズ
８１…ピンホール
８２…フィルタ
８３…検出器
８４…照明光源
８５…励起フィルタ
８６…集光レンズ
８７…焦点検出光源
８９…焦点検出装置

Claims (6)

1. 観察標本を観察するための対物レンズと、
   前記観察標本の屈折率とは異なる屈折率をもつ透明部材と、
   前記観察標本を励起するために所定の波長を有する光源と、
   前記光源からの照明光を、前記観察標本と前記透明部材との境界面で全反射するように前記対物レンズの外周部分を通して出射する照明光学系と、
   前記境界面で全反射した反射光を前記対物レンズを介して検出する検出器と、
   前記光源からの照明光が前記境界面で全反射したときに生じるエバネッセント光により前記観察標本の蛍光観察を行う観察光学系と、
   前記観察光学系の光軸に対して設けられ、前記光源からの照明光により前記境界面で全反射した反射光を前記検出器の検出面に集光させる結像光学系と、
   前記検出器が検出する前記境界面で全反射した反射光の集光位置に基づいて、前記対物レンズと前記観察標本とを相対移動させ、前記対物レンズの焦点調整を行う制御部と、
   を備えたことを特徴とする焦点検出装置。
2. 前記照明光学系は、前記光源からの照明光を前記対物レンズの瞳位置で集光させる焦点検出用レンズを有することを特徴とする請求項１記載の焦点検出装置。
3. 前記制御部は、前記境界面を合焦位置とした時の検出位置を、前記境界面とは異なる位置を合焦位置とした時の集光位置に変更することで、合焦位置を前記境界面からオフセットさせることを特徴とする請求項２記載の焦点検出装置。
4. 前記結像光学系の光路内に挿脱可能で、前記反射光を遮光する遮光部材をさらに有し、
   前記焦点検出用レンズは前記照明光学系の光路内に挿脱可能で、前記焦点検出用レンズを光路内に挿入するとともに、前記遮光部材を光路から外すことで行われる前記焦点検出と、前記焦点検出用レンズを光路内から外すとともに前記遮光部材を光路に挿入して前記観察標本にエバネッセント光を照射させる蛍光観察とを切換え可能であることを特徴とする請求項２記載の焦点検出装置。
5. 前記照明光学系は、前記境界面に対する前記照明光の入射角度を変化可能であることを特徴とする請求項１乃至４記載の焦点検出装置。
6. 前記照明光学系は、前記光源から出射された前記照明光及び前記境界面から全反射した反射光を反射するダイクロイックミラーを有することを特徴とする請求項１乃至５記載の焦点検出装置。

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