JP3995458B2 - 全反射蛍光顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全反射照明による蛍光観察を可能にした全反射蛍光顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっているが、これら細胞の機能解析の中で、特に、細胞膜の機能を観察するために、細胞膜およびその近傍からの全反射蛍光画像を取得する全反射蛍光顕微鏡が注目されるようになっている。
【０００３】
このような全反射蛍光顕微鏡には、ガラス表面近傍の試料のみを局所的に照明する全反射照明が用いられている。この全反射照明は、ガラスと試料の境界面で試料側に数百ｎｍ程度しみだすエバネッセント光を利用したもので、バックグラウンド・ノイズ(散乱光など)が極めて低いため、蛍光色素１分子の蛍光観察が可能となっている。
【０００４】
ところで、このような全反射照明による蛍光観察では、ガラスの屈折率などによってガラス表面から試料側にしみ出すエバネッセント光のしみだし深さが異なり、また、このしみだし深さは、標本の、どの程度の深さまで観察したいかということであり、検鏡者の目的によっても異なる。
【０００５】
そこで、従来、標本の条件や、観察したい深さによって、ガラスから試料への照明光の入射角を可変するようなことが考えられている。
【０００６】
特開平９−１５９９２２号公報は、このような考えを採用したもので、光源からの光を対物レンズ側に反射するミラーを移動させて、照明光を光軸よりシフトさせることによりガラスから試料への入射角を連続的に変化させ、落射蛍光照明と全反射照明の切換えを行うようにしている。
【０００７】
また、一般に、照明光を反射するミラーの移動、つまりガラスから試料への入射角の調整は、微調整が必要であることからマイクロメータなどが用いられていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開平９−１５９９２２号公報のものでは、例えば、全反射照明で蛍光観察をする際に、ガラスから試料への入射角の調整時に落射蛍光照明に切換えてしまうことがあり、この場合、改めて、ミラーを全反射照明の位置まで移動させる必要があるが、この間、ガラス表面の試料には、強度の強い落射照明が励起光として照射されるため、試料全体が退色してしまうおそれがある。
【０００９】
また、落射蛍光照明から全反射照明の範囲でミラーを移動させるのに、マイクロメータ等を使用すると、マイクロメータは、回転操作部の一回転当たりの移動量が小さいため、落射照明から全反射照明の切換えの際は、回転回数が多くなり、切換えまでに、手間がかかり、蛍光観察の操作性が著しく低下する。また、このことは、試料に照明励起光を当てたまま落射蛍光照明から全反射照明に切換えようとすると、この切換えの間にも試料全体を退色させてしまうおそれがある。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、全反射照明および近全反射照明による安定した蛍光観察を実現できるとともに、操作性の向上を図ることができる全反射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、光源と照明光学系と対物レンズを介して、試料に照射される照明光の入射角を変化させる前記照明光学系に含まれる移動部と、前記移動部を移動させることで全反射照明および近全反射照明の切換えを可能にした全反射蛍光顕微鏡において、
前記移動部を微小移動させる微動機構と、前記微動機構を操作する操作部と、前記移動部の移動範囲を規制する規制手段を設け、
前記移動範囲は、前記照明光の前記対物レンズを介して前記試料への入射角が全反射照明および近全反射照明が得られる範囲であることを特徴としている。
【００１２】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記照明光学系は、光ファイバを有し、前記移動部は、前記光ファイバの出射端を、光軸に対して垂直方向に移動可能に設けられ、前記規制手段は、前記操作部の操作による前記光ファイバの出射端の光軸に対して垂直方向の移動範囲を前記全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制することを特徴としている。
【００１３】
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記照明光学系は、反射部材を有し、前記移動部は前記移動部材を、前記反射部材への照明光の入射光路、または反射光路の光軸方向に沿って移動させ、前記規制手段は、前記入射光路、または反射光路の光軸方向に沿った移動範囲を前記全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制することを特徴としている。
【００１４】
請求項４記載の発明は、請求項１または３記載の発明において、前記照明光学系の光路に前記照明光を拡散させる光学素子を挿脱可能に設けたことを特徴としている。
【００１５】
この結果、本発明によれば、照明光の対物レンズを介して試料への入射角を常に全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制するようにできるので、落射蛍光照明による強い光で試料全体が退色してしまうのを防止でき、全反射照明および近全反射照明による安定した蛍光観察を得ることができる。また、常に、全反射照明および近全反射照明の範囲で対物レンズから試料への照明光の入射角を調整できるので、操作性の向上を図ることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１７】
まず、本発明に関する全反射蛍光観察の概要を図１を用いて説明する。この場合、試料２の下方に配置された対物レンズ７により観察を行う倒立型顕微鏡の例を示している。
【００１８】
試料２は、その下側にカバーガラス３が配置され、このカバーガラス３の下方にオイル５を介して対物レンズ７が設けられている。
【００１９】
対物レンズ７の光軸８上には、２個以上の蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂを保持した回転可能なミラーユニットターレット９が配置され、ミラーユニットターレット９の回転軸１４を中心の回転操作により全反射照明または落射蛍光照明に対応する蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂを選択的に光軸８上に切換えるようにしている。図面では、全反射照明に対応する蛍光ミラーユニット１０ａが光軸８上に切換えられている。蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂの入射光路には、高反射ミラー２４が配置されている。この高反射ミラー２４は、ミラー保持部２２に接着等で固定されている。ミラー保持部２２には、アリ部２２ａが設けられている。このアリ部２２ａは、落射投光管１７に設けられたアリ溝部２０に紙面垂直方向に移動可能に保持されており、操作ツマミ２３を出し入れすることにより、高反射ミラー２４を紙面垂直方向に移動させることができるようになっている。この場合、図示のように落射投光管１７の光軸１９上にあるときは、レーザ光源４１からの光を蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂ側に反射する。
【００２０】
一方、レーザ光源４１からのレーザ光は、光ファイバ入射部４０から導入された後、光ファイバ出射部３８から出射される。この光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａは、ファイバ投光管２８のコリメートレンズ２９で平行光２１ｂに変換され、高反射ミラー２４で反射されたのち、集光レンズ１８で集光され、蛍光ミラーユニット１０ａに導かれる。蛍光ミラーユニット１０ａには、ダイクロイックミラー１１ａと吸収フィルタ１２ａが設けられており、集光レンズ１８で集光された光は、ダイクロイックミラー１１ａで反射され、対物レンズ７の後側焦点位置６に焦点を結び、対物レンズ７の先端からの出射光は、カバーガラス３から試料２へ入射する。ここで、対物レンズ７の先端から出射され、カバーガラス（高屈折率側）３から試料（低屈折率側）２への入射する入射光の入射角度を臨界角より大きくなるように、光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａの光軸３１を、ファイバ投光管２８の光軸３０に対して垂直方向にシフトさせれば、試料（低屈折率側）２に、カバーガラス３との境界面から数百ｎｍ程度の範囲でしみ出すエバネッセント光４を発生させることができる。
【００２１】
エバネッセント光４が発生しているカバーガラス３の表面近傍に存在する試料２中の蛍光物質は、励起光であるエバネッセント光４により励起され蛍光を発し、対物レンズ７、ダイクロイックミラー１１ａを通過し、吸収フィルタ１２ａで、蛍光以外の波長域である不利益な光が除去されたのち、観察結像系１５に導かれ、高感度カメラ（ＣＣＤ等）１６に結像され、試料２中の蛍光物質を観察することができる。
【００２２】
一方、通常の落射蛍光照明の場合は、図２に示すように、高反射ミラー２４を落射投光管１７の光軸１９から外し、蛍光ミラーユニット１０ａを落射蛍光照明用の蛍光ミラーユニット１０ｂに切換える。この場合、蛍光ミラーユニット１０ｂは、ダイクロイックミラー１１ｂ、吸収フィルタ１２ｂおよび励起フィルタ１３ｂを有し、水銀ランプハウス２５の水銀バーナー２６からの光線のうち、励起光のみが励起フィルタ１３ｂを透過され、ダイクロイックミラー１１ｂにより反射され、対物レンズ７の先端からの出射光は、カバーガラス３から試料２へ入射する。そして、試料２中の蛍光物質からの蛍光は、ダイクロイックミラー１１ｂを透過し、吸収フィルタ１２ｂで、蛍光以外の波長域である不利益な光が除去されたのち、観察結像系１５に導かれ、高感度カメラ（ＣＣＤ等）１６に結像され、試料２中の蛍光物質を観察することができる。
【００２３】
次に、具体的な実施の形態について説明する。
【００２４】
(第１の実施の形態)
図３（ａ）（ｂ）（ｃ）は、本発明の第１の実施の形態が適用された全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示している。なお、図３は、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００２５】
この場合、落射投光管１７は、倒立顕微鏡本体（図示せず）に固定されている。この落射投光管１７は、ファイバ投光管２８との連結部１７ａ、水銀バーナー２６を保持する水銀ランプハウス２５との連結部１７ｂを有している。ファイバ投光管２８の光軸３０は、落射投光管１７の光軸１９と直交するように、水銀ランプハウス２５の光軸２７は、落射投光管の光軸１９と一致するように、それぞれ連結されている。
【００２６】
落射投光管１７内部には、高反射ミラー２４がファイバ投光管２８の平行光２１ｂを落射投光管１７の光軸１９上に反射させるように、ミラー保持部２２に接着等で固定されている。ミラー保持部２２には、アリ部２２ａが設けられている。このアリ部２２ａは、落射投光管１７に設けられたアリ溝部２０に紙面垂直方向に移動可能に保持されており、落射投光管１７の外部から操作ツマミ２３を紙面垂直方向に出し入れすることにより、高反射ミラー２４を紙面垂直方向に移動させることができるようになっている。また、ミラー保持部２２は、水銀ランプハウス２５側の側面に、遮光部２２ｂが設けられている。
【００２７】
ファイバ投光管２８は、コリメートレンズ２９、ファイバ導入部３２より構成されている。このファイバ投光管２８の落射投光管１７側と反対側端部には、ファイバ導入部３２が連結されている。
【００２８】
一方、レーザ光源４１からの出射光は、光ファイバ入射部４０から、光ファイバ３９に入射され、光ファイバ出射部３８から出射光２１ａが出射される。光ファイバ出射部３８は、移動部３７にビス等（図示せず）で固定されている。移動部３７の外側面部３７ａは、ファイバ導入部３２の内側面部３２ａ１と嵌合されており、紙面左右方向５４に移動可能となっている。
【００２９】
ここで、ファイバ導入部３２には、移動部３７の紙面左右方向５４と平行に中心線３６を持ったネジ穴３２ａと嵌合穴３２ｂが空いており、ネジ穴３２ａには、ネジ部を持つフタ筒３３が係合され、嵌合穴３２ｂには、アダプタ３５が嵌合されている。
【００３０】
そして、フタ筒３３とアダプタ３５の間には、弾性体である圧縮コイルばね３４が自然長よりも、短い状態で、挟まれており、アダプタ３５は、移動部３７の外側面部３７ａに当接するようになっている。一方、移動部３７の外側面部３７ａの反対側には、斜面当接部３７ｂが設けられている。
【００３１】
ファイバ導入部３２には、マイクロメータ保持部４２がネジ等（図示せず）で固定されている。このマイクロメータ保持部４２には、マイクロメータ本体４４がネジ等（図示せず）で保持されている。
【００３２】
マイクロメータ本体４４は、回転部４４ａに、ツマミ４６がネジ等（図示せず）で係合されている。また、ファイバ導入部３２には、ネジ穴３２ａと、嵌合穴３２ｂの中心線と直交する中心線を持つ筒穴３２ｃが設けられており、この筒穴３２ｃに嵌合されるとともに、斜面当接部３７ｂとマイクロメータ本体４４の回転部４４ａの先端部４４ｂに挟まれた状態で、カプセルアダプタ４３が配置されている。
【００３３】
これにより、マイクロメータ本体４４のツマミ４６を回転操作し、回転部４４ａの先端部４４ｂのカプセルアダプタ４３により移動部３７の斜面当接部３７ｂを押圧し、移動部３７を圧縮コイルばね３４の押圧力に抗して移動させることで、対物レンズ７先端から出射され、カバーガラス（高屈折率側）３から試料（低屈折率側）２へ入射する入射光の入射角度を調整できるように、光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａの光軸３１を、ファイバ投光管２８の光軸３０より（図では左側に）シフトできるようにしている。
【００３４】
マイクロメータ本体４４の固定部４４ｃには、規制手段として同図(ｃ)に示すように開口部４５ａとコの字型の切り欠き部４５ｃを持った切り欠きストッパ４５の開口部４５ａが嵌合されている。そして、コの字型の切り欠き部４５ｃの間隔を調整するビス４７が設けられている。
【００３５】
次に、このように構成された第１の実施の形態の作用について説明する。
【００３６】
この場合、アダプタ３５は、圧縮コイルばね３４により、移動部３７の外側面部３７ａを押した状態になっており、一方、マイクロメータ本体４４のツマミ４６を回転操作することで、先端部４４ｂを紙面上下方向５５に移動させることができ、カプセルアダプタ４３を介して、移動部３７を紙面左右方向５４に移動させることができる。これにより、光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａの光軸３１をファイバ投光管２８の光軸３０に対して平行な状態で、且つファイバ投光管２８の光軸３０に対して垂直方向に調整できることになる。
【００３７】
また、同時に、対物レンズ７の先端から出射され、カバーガラス３から試料２への入射光角度も調整することができるようになるが、ここで、カバーガラス３から試料２への入射角度を臨界角よりやや大きな状態になるように、ツマミ４６を回転操作して移動部３７の位置調整を行い、その位置で、切り欠きストッパ４５の側面部４５ｄをマイクロメータ本体４４の回転部４４ａの当接部４４ａａに当て付け、さらに切り欠きストッパ４５の切り欠き部４５ｃの間隔をビス４７で締め付け、開口部４５ａによりマイクロメータ本体４４の固定部４４ｃを挟み込むことで、切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４に対して位置決め固定する。
【００３８】
従って、これ以降は、移動部３７は、切り欠きストッパ４５の規制により、光ファイバ出射部３８をファイバ投光管２８の光軸３０側に移動させることができなくなり、カバーガラス３から試料２への入射角度が臨界角より大きい、全反射照明の範囲でのみの移動に規制される。
【００３９】
一方、水銀ランプハウス２５からの光線（図示せず）は、ミラー保持部２２の遮光部２２ｂで遮光されているが、操作ツマミ２３を紙面垂直方向の手前側に引き出し、ミラー保持部２２を光路から外すことで、水銀バーナー２６からの光線（図示せず）を落射投光管１７に導くことができる。この際は、ミラーユニットターレット９を回転軸１４を中心に回転させることで、励起フィルタ１３ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂおよび吸収フィルタ１２ｂを備えた蛍光ミラーユニット１０ｂを光軸上に配置することで、通常の落射蛍光照明観察をすることができる。
【００４０】
従って、このような第１の実施の形態によれば、マイクロメータ本体に固定された切り欠きストッパ４５により、カバーガラス３から試料２への入射角度を調整する際に、この入射角度を臨界角より大きくなる範囲内に規制されるため、全反射照明のみで蛍光観察を行うことができる。このため、落射蛍光照明による強い光で試料全体が退色してしまうのを防止でき、全反射照明による安定した蛍光観察を得ることができる。また、常に、全反射照明の範囲でカバーガラス３から試料２への入射角度を調整できるので、操作性の向上を図ることができる。さらに、全反射照明と落射蛍光照明の切換えは、高反射ミラー２４の出し入れで迅速に行えるため、試料に照明光を当てたまま、落射蛍光照明から全反射照明へ切換える際に（または、その逆）、試料が退色する原因も回避することができる。
【００４１】
なお、この第１の実施の形態では、倒立顕微鏡について説明したが、正立顕微鏡に適用した場合も同様の効果が得られる。
【００４２】
（第１の実施例の変形例）
次に、第１の実施例の変形例を説明する。図４（ａ）（ｂ）は、第１の実施例の変形例を説明するもので、図３と同一部分には同符号を付している。
【００４３】
この場合、ファイバ投光管２８には、コリメートレンズ２９の後側（落射投光管１７側）にスライド開口部２８ａが設けられ、このスライド開口部２８ａには、開口４８ａと開口４８ｂを持つスライダー４８が紙面左右方向５４に移動可能設けられている。このスライダー４８は、開口４８ａに、拡散板４９がリングネジ（図示せず）により固定されている。
【００４４】
一方、高反射ミラー２４のミラー保持部２２は、落射投光管１７の固定部５０にネジ等（図示せず）で直接固定されている。
【００４５】
このような構成とすると、上述した第１の実施の形態で述べたように全反射照明に設定されている状態で、スライダー４８の開口４８ｂをファイバ投光管２８の光軸３０に配置させると、この状態のままに維持されるが、スライダー４８を移動させて、拡散板４９を有する開口４８ａを光軸３０に配置させるると平行光２１ｂが拡散され、落射蛍光照明に切換えられる。
【００４６】
このようにすれば、上述した第１の実施の形態と同様の効果が選られるのに加えて、水銀ランプハウス２５を使わずに、全反射照明と落射蛍光照明の切換えを実現することができる。
【００４７】
なお、第１の実施の形態の変形例において、ファイバ投光管２８を落射投光管１７と同軸に備えるようにすれば、高反射ミラー２４を省略することも可能で、さらに安価な構造にすることができる。
【００４８】
(第２の実施の形態)
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。図５は、第１の実施例の変形例を説明するもので、図３と同一部分には同符号を付している。
【００４９】
この場合、高反射ミラー２４のミラー保持部２２には、アリ部５１が設けられ、このアリ部５１は、落射投光管１７に設けられたアリ溝部５２に紙面左右方向５４に移動可能となるように保持されている。
【００５０】
この場合、ミラー保持部２２は、常時、圧縮コイルばね３４によりアダプタ３５を介してアリ部５１の当接部５１ａが押された状態になっている。一方、落射投光管１７のアダプタ３５の配置位置と反対側側面には、マイクロメータ保持部５３が設けられ、このマイクロメータ保持部５３にマイクロメータ本体４４が設けられている。この場合、マイクロメータ本体４４は、ツマミ４６の回転により回転される回転部４４ａの先端部４４ｂをアリ部５１の当接部５１ｂに当接させている。
【００５１】
この状態で、マイクロメータ本体４４のツマミ４６を回転することで、アリ部５１によりミラー保持部２２を高反射ミラー２４の反射光路に沿って移動し、高反射ミラー２４での平行光２１ｂの反射位置を調整できるようになっている。
【００５２】
これにより、平行光２１ｂの高反射ミラー２４での反射光２１ｃを光軸１９からシフトさせることができ、対物レンズ７から出射され、カバーガラス３から試料２への入射光角度を調整することができる。
【００５３】
ここでも、カバーガラス３から試料２への入射角度を臨界角よりやや大きくした状態になるように、ツマミ４６を回転操作してミラー保持部２２の位置調整を行い、その位置で、切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４の回転部４４ａに当て付け、切り欠きストッパ４５を締付けることで、マイクロメータ本体４４に対して位置決め固定する。
【００５４】
これにより、これ以降は、ミラー保持部２２は、切り欠きストッパ４５の規制により高反射ミラー２４からの反射光２１ｃを光軸１９側に移動させることができなくなり、カバーガラス３から試料２への入射角度が臨界角より大きい、全反射照明の範囲でのみの移動に規制される。
【００５５】
この場合、第１の実施の形態の変形例と同様に、スライダー４８を設け、拡散板４９を持つ開口４８ａを光軸３０に配置させることで、平行光２１ｂを拡散させることで、レーザ光源４１を利用した落射蛍光照明を得るようにすることもできる。
【００５６】
この第２の実施の形態では、ミラー保持部２２を高反射ミラー２４の反射光路に沿って移動させるようにしたが、高反射ミラー２４の入射光路に沿って移動させるようにしても同様な効果を得ることができる。
【００５７】
なお、上述した実施の形態では、マイクロメータ本体４４と、このマイクロメータ本体４４の回転部４４ａの移動を規制する切り欠きストッパ４５を用いたが、これらを用いない代わりに、ファイバ投光管２８の光軸３０の中心より左右どちらかにシフトしたスリット孔を備えた遮光板を光ファイバ出射部３８の手前に配置し、光ファイバ出射部３８から出射される出射光の光軸をファイバ投光管２８の光軸３０側に移動させても、遮光板により、出射光の光軸中心側の光を遮断するようにすれば、落射照明への切換えは阻止され、全反射照明の範囲でのみの移動に規制するようにできる。この場合、全反射照明とレーザ光源４１を利用した落射蛍光照明との切換えは、第１の実施の形態で述べたと同様に高反射ミラー２４を光路中から挿脱するよう移動させることで行うことができる。
【００５８】
次に、全反射照明を実現する方法について説明する。カバーガラス３から試料２への照明光の入射角が臨界角を超えた時の確認方法は、鏡筒（図示せず）に付いている接眼レンズ（図示せず）をＣＴ（センタリングテレスコープ）（図示せず）に変えて、このＣＴを用いて対物レンズ７の後側焦点位置６近傍のレンズ群（図示せず）を見る。照明光が対物レンズ７のレンズ群（図示せず）を透過する光でレンズ群の自家蛍光が起り、特に集光されている後側焦点位置６近傍のレンズ群で輝点が観察できる。
【００５９】
カバーガラス３から試料２への入射角が臨界角より小さい場合には、対物レンズ７の後側焦点位置６に照明光の入射角側の輝点が１つしか確認されないが、臨界角より大きい場合には対物レンズ７の後側焦点位置６の外周の内側近傍に光軸を中心に対称に輝点が２つ観察される。２つ目の輝点は、カバーガラス３と試料２との境界面で全反射した照明光が対物レンズ７の先端から再び対物レンズ７内に戻るためである。
【００６０】
カバーガラス３から試料２への照明光の入射角が臨界角より小さい状態から大きい状態に変化させいくと、最初１つの輝点が対物レンズの光軸の中心側から次第に外周方向に移動し、入射角が臨界角を超えると対物レンズの光軸中心を対称として２つ目の輝点が現れ、この２つ目の輝点が現れた時に切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４に固定する。
【００６１】
次に、近全反射照明の定義と第１の実施の形態に適用した場合の作用、及び効果を第１実施例をもとに説明する。構成は、第１の実施の形態と同様なため省略する。また、作用、効果についても第１の実施の形態と同じ部分は省略し、異なる分部についてのみ説明する。
【００６２】
まず、はじめに近全反射照明について、以下のように定義する。全反射照明では、カバーガラス３と試料２の境界面で低屈折率媒質側である試料２側に、エバネッセント光４が数百ｎｍ程度の範囲で発生しているが、カバーガラス３から試料２への入射角を臨界角をわずかに小さくすると、カバーガラス３から試料２への屈折光が、カバーガラス３から試料２の境界面上近傍に沿って出射される。この照明法では、試料２のうちカバーガラス３近傍の数μｍの範囲を照明することができる。これは、暗視野照明の一種であり、本発明では、この照明方法を近全反射照明と呼ぶこととする。
【００６３】
次に、近全反射照明の作用について説明する。ここではレーザ光源４１による近全反射照明についてのみ記載し、水銀バーナー２６を光源とした落射蛍光照明についての記載は省略する。まず、第１の実施の形態と同様に、マイクロメータ４４のツマミ４６を回転操作し、カバーガラス３から試料２への入射角が臨界角よりも大きくなっている全反射照明にする。次に、カバーガラス３から試料２への入射角が小さくなる方向にマイクロメータ本体４４のツマミ４６を徐々に回転操作し、前述の近全反射照明となる照明光に調整する。
【００６４】
この状態で、第１の実施の形態と同様に、切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４に対して位置決め固定することで、近全反射照明と全反射照明の範囲のみに光ファイバ出射部３８の移動を規制する。
【００６５】
次に、効果について説明する。近全反射照明の場合でも照明範囲は、カバーガラス３上面近傍の数μｍ範囲の試料２のみであり、第１実施例と同様に試料２全体の退色を防ぐことができる他、照明光を光軸から遠ざかる方向に移動させて全反射照明へ迅速に変えることが可能である。
【００６６】
上述した効果以外にも、全反射照明により発生したエバネッセント光４では観察不可能であった領域や、発生する蛍光が微弱すぎて観察できなかった試料２の観察が可能となる。さらに、水銀バーナー２６を光源とした落射蛍光照明では試料２全体から蛍光が発するのに対して、近全反射照明では、照明範囲をカバーガラス３近傍の数μｍの範囲に限定できるため、不要な蛍光を除去でき、バックグラウンドノイズの少ない観察が可能となる。
【００６７】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００６８】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００６９】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、全反射照明および近全反射照明による安定した蛍光観察を実現できるとともに、操作性の向上を図ることができる全反射蛍光顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に関する全反射蛍光顕微鏡の概要を説明する概略構成図。
【図２】本発明に関する全反射蛍光顕微鏡の通常の蛍光落射照明時を説明する概略構成図。
【図３】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第１の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。
【図５】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
２…試料
３…カバーガラス
４…エバネッセント光
５…オイル
６…後側焦点位置
７…対物レンズ
８…光軸
９…ミラーユニットターレット
１０ａ．１０ｂ…蛍光ミラーユニット
１１ａ、１１ｂ…ダイクロイックミラー
１２ａ、１２ｂ…吸収フィルタ
１３ｂ…励起フィルタ
１４…回転軸
１５…観察結像系
１６…高感度カメラ
１７…落射投光管
１７ａ…連結部
１７ｂ…連結部
１８…集光レンズ
１９…光軸
２０…アリ溝部
２１ａ…出射光
２１ｂ…平行光
２１ｃ…反射光
２２…ミラー保持部
２２ａ…アリ部
２２ｂ…遮光部
２３…操作ツマミ
２４…高反射ミラー
２５…水銀ランプハウス
２６…水銀バーナー
２７…光軸
２８…ファイバ投光管
２８ａ…スライド開口部
２９…コリメートレンズ
３０、３１…光軸
３２…ファイバ導入部
３２ａ１…内側面部
３２ａ…ネジ穴
３２ｂ…嵌合穴
３２ｃ…筒穴
３３…フタ筒
３４…圧縮コイルばね
３５…アダプタ
３６…中心線
３７…移動部
３７ａ…外側面部
３７ｂ…斜面当接部
３８…光ファイバ出射部
３９…光ファイバ
４０…光ファイバ入射部
４１…レーザ光源
４２…マイクロメータ保持部
４３…カプセルアダプタ
４４…マイクロメータ本体
４４ａ…回転部
４４ｂ…先端部
４４ｃ…固定部
４４ａａ…当接部
４５…切り欠きストッパ
４５ａ…開口部
４５ｃ…切り欠き部
４５ｄ…側面部
４６…ツマミ
４７…ビス
４８…スライダー
４８ａ、４８ｂ…開口
４９…拡散板
５０…固定部
５１…アリ部
５１ａ、５１ｂ…当接部
５２…アリ溝部
５３…マイクロメータ保持部
５４…紙面左右方向
５５…紙面上下方向
【発明の属する技術分野】
本発明は、全反射照明による蛍光観察を可能にした全反射蛍光顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっているが、これら細胞の機能解析の中で、特に、細胞膜の機能を観察するために、細胞膜およびその近傍からの全反射蛍光画像を取得する全反射蛍光顕微鏡が注目されるようになっている。
【０００３】
このような全反射蛍光顕微鏡には、ガラス表面近傍の試料のみを局所的に照明する全反射照明が用いられている。この全反射照明は、ガラスと試料の境界面で試料側に数百ｎｍ程度しみだすエバネッセント光を利用したもので、バックグラウンド・ノイズ(散乱光など)が極めて低いため、蛍光色素１分子の蛍光観察が可能となっている。
【０００４】
ところで、このような全反射照明による蛍光観察では、ガラスの屈折率などによってガラス表面から試料側にしみ出すエバネッセント光のしみだし深さが異なり、また、このしみだし深さは、標本の、どの程度の深さまで観察したいかということであり、検鏡者の目的によっても異なる。
【０００５】
そこで、従来、標本の条件や、観察したい深さによって、ガラスから試料への照明光の入射角を可変するようなことが考えられている。
【０００６】
特開平９−１５９９２２号公報は、このような考えを採用したもので、光源からの光を対物レンズ側に反射するミラーを移動させて、照明光を光軸よりシフトさせることによりガラスから試料への入射角を連続的に変化させ、落射蛍光照明と全反射照明の切換えを行うようにしている。
【０００７】
また、一般に、照明光を反射するミラーの移動、つまりガラスから試料への入射角の調整は、微調整が必要であることからマイクロメータなどが用いられていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開平９−１５９９２２号公報のものでは、例えば、全反射照明で蛍光観察をする際に、ガラスから試料への入射角の調整時に落射蛍光照明に切換えてしまうことがあり、この場合、改めて、ミラーを全反射照明の位置まで移動させる必要があるが、この間、ガラス表面の試料には、強度の強い落射照明が励起光として照射されるため、試料全体が退色してしまうおそれがある。
【０００９】
また、落射蛍光照明から全反射照明の範囲でミラーを移動させるのに、マイクロメータ等を使用すると、マイクロメータは、回転操作部の一回転当たりの移動量が小さいため、落射照明から全反射照明の切換えの際は、回転回数が多くなり、切換えまでに、手間がかかり、蛍光観察の操作性が著しく低下する。また、このことは、試料に照明励起光を当てたまま落射蛍光照明から全反射照明に切換えようとすると、この切換えの間にも試料全体を退色させてしまうおそれがある。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、全反射照明および近全反射照明による安定した蛍光観察を実現できるとともに、操作性の向上を図ることができる全反射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、光源と照明光学系と対物レンズを介して、試料に照射される照明光の入射角を変化させる前記照明光学系に含まれる移動部と、前記移動部を移動させることで全反射照明および近全反射照明の切換えを可能にした全反射蛍光顕微鏡において、
前記移動部を微小移動させる微動機構と、前記微動機構を操作する操作部と、前記移動部の移動範囲を規制する規制手段を設け、
前記移動範囲は、前記照明光の前記対物レンズを介して前記試料への入射角が全反射照明および近全反射照明が得られる範囲であることを特徴としている。
【００１２】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記照明光学系は、光ファイバを有し、前記移動部は、前記光ファイバの出射端を、光軸に対して垂直方向に移動可能に設けられ、前記規制手段は、前記操作部の操作による前記光ファイバの出射端の光軸に対して垂直方向の移動範囲を前記全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制することを特徴としている。
【００１３】
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記照明光学系は、反射部材を有し、前記移動部は前記移動部材を、前記反射部材への照明光の入射光路、または反射光路の光軸方向に沿って移動させ、前記規制手段は、前記入射光路、または反射光路の光軸方向に沿った移動範囲を前記全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制することを特徴としている。
【００１４】
請求項４記載の発明は、請求項１または３記載の発明において、前記照明光学系の光路に前記照明光を拡散させる光学素子を挿脱可能に設けたことを特徴としている。
【００１５】
この結果、本発明によれば、照明光の対物レンズを介して試料への入射角を常に全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制するようにできるので、落射蛍光照明による強い光で試料全体が退色してしまうのを防止でき、全反射照明および近全反射照明による安定した蛍光観察を得ることができる。また、常に、全反射照明および近全反射照明の範囲で対物レンズから試料への照明光の入射角を調整できるので、操作性の向上を図ることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１７】
まず、本発明に関する全反射蛍光観察の概要を図１を用いて説明する。この場合、試料２の下方に配置された対物レンズ７により観察を行う倒立型顕微鏡の例を示している。
【００１８】
試料２は、その下側にカバーガラス３が配置され、このカバーガラス３の下方にオイル５を介して対物レンズ７が設けられている。
【００１９】
対物レンズ７の光軸８上には、２個以上の蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂを保持した回転可能なミラーユニットターレット９が配置され、ミラーユニットターレット９の回転軸１４を中心の回転操作により全反射照明または落射蛍光照明に対応する蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂを選択的に光軸８上に切換えるようにしている。図面では、全反射照明に対応する蛍光ミラーユニット１０ａが光軸８上に切換えられている。蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂの入射光路には、高反射ミラー２４が配置されている。この高反射ミラー２４は、ミラー保持部２２に接着等で固定されている。ミラー保持部２２には、アリ部２２ａが設けられている。このアリ部２２ａは、落射投光管１７に設けられたアリ溝部２０に紙面垂直方向に移動可能に保持されており、操作ツマミ２３を出し入れすることにより、高反射ミラー２４を紙面垂直方向に移動させることができるようになっている。この場合、図示のように落射投光管１７の光軸１９上にあるときは、レーザ光源４１からの光を蛍光ミラーユニット１０ａ、１０ｂ側に反射する。
【００２０】
一方、レーザ光源４１からのレーザ光は、光ファイバ入射部４０から導入された後、光ファイバ出射部３８から出射される。この光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａは、ファイバ投光管２８のコリメートレンズ２９で平行光２１ｂに変換され、高反射ミラー２４で反射されたのち、集光レンズ１８で集光され、蛍光ミラーユニット１０ａに導かれる。蛍光ミラーユニット１０ａには、ダイクロイックミラー１１ａと吸収フィルタ１２ａが設けられており、集光レンズ１８で集光された光は、ダイクロイックミラー１１ａで反射され、対物レンズ７の後側焦点位置６に焦点を結び、対物レンズ７の先端からの出射光は、カバーガラス３から試料２へ入射する。ここで、対物レンズ７の先端から出射され、カバーガラス（高屈折率側）３から試料（低屈折率側）２への入射する入射光の入射角度を臨界角より大きくなるように、光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａの光軸３１を、ファイバ投光管２８の光軸３０に対して垂直方向にシフトさせれば、試料（低屈折率側）２に、カバーガラス３との境界面から数百ｎｍ程度の範囲でしみ出すエバネッセント光４を発生させることができる。
【００２１】
エバネッセント光４が発生しているカバーガラス３の表面近傍に存在する試料２中の蛍光物質は、励起光であるエバネッセント光４により励起され蛍光を発し、対物レンズ７、ダイクロイックミラー１１ａを通過し、吸収フィルタ１２ａで、蛍光以外の波長域である不利益な光が除去されたのち、観察結像系１５に導かれ、高感度カメラ（ＣＣＤ等）１６に結像され、試料２中の蛍光物質を観察することができる。
【００２２】
一方、通常の落射蛍光照明の場合は、図２に示すように、高反射ミラー２４を落射投光管１７の光軸１９から外し、蛍光ミラーユニット１０ａを落射蛍光照明用の蛍光ミラーユニット１０ｂに切換える。この場合、蛍光ミラーユニット１０ｂは、ダイクロイックミラー１１ｂ、吸収フィルタ１２ｂおよび励起フィルタ１３ｂを有し、水銀ランプハウス２５の水銀バーナー２６からの光線のうち、励起光のみが励起フィルタ１３ｂを透過され、ダイクロイックミラー１１ｂにより反射され、対物レンズ７の先端からの出射光は、カバーガラス３から試料２へ入射する。そして、試料２中の蛍光物質からの蛍光は、ダイクロイックミラー１１ｂを透過し、吸収フィルタ１２ｂで、蛍光以外の波長域である不利益な光が除去されたのち、観察結像系１５に導かれ、高感度カメラ（ＣＣＤ等）１６に結像され、試料２中の蛍光物質を観察することができる。
【００２３】
次に、具体的な実施の形態について説明する。
【００２４】
(第１の実施の形態)
図３（ａ）（ｂ）（ｃ）は、本発明の第１の実施の形態が適用された全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示している。なお、図３は、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００２５】
この場合、落射投光管１７は、倒立顕微鏡本体（図示せず）に固定されている。この落射投光管１７は、ファイバ投光管２８との連結部１７ａ、水銀バーナー２６を保持する水銀ランプハウス２５との連結部１７ｂを有している。ファイバ投光管２８の光軸３０は、落射投光管１７の光軸１９と直交するように、水銀ランプハウス２５の光軸２７は、落射投光管の光軸１９と一致するように、それぞれ連結されている。
【００２６】
落射投光管１７内部には、高反射ミラー２４がファイバ投光管２８の平行光２１ｂを落射投光管１７の光軸１９上に反射させるように、ミラー保持部２２に接着等で固定されている。ミラー保持部２２には、アリ部２２ａが設けられている。このアリ部２２ａは、落射投光管１７に設けられたアリ溝部２０に紙面垂直方向に移動可能に保持されており、落射投光管１７の外部から操作ツマミ２３を紙面垂直方向に出し入れすることにより、高反射ミラー２４を紙面垂直方向に移動させることができるようになっている。また、ミラー保持部２２は、水銀ランプハウス２５側の側面に、遮光部２２ｂが設けられている。
【００２７】
ファイバ投光管２８は、コリメートレンズ２９、ファイバ導入部３２より構成されている。このファイバ投光管２８の落射投光管１７側と反対側端部には、ファイバ導入部３２が連結されている。
【００２８】
一方、レーザ光源４１からの出射光は、光ファイバ入射部４０から、光ファイバ３９に入射され、光ファイバ出射部３８から出射光２１ａが出射される。光ファイバ出射部３８は、移動部３７にビス等（図示せず）で固定されている。移動部３７の外側面部３７ａは、ファイバ導入部３２の内側面部３２ａ１と嵌合されており、紙面左右方向５４に移動可能となっている。
【００２９】
ここで、ファイバ導入部３２には、移動部３７の紙面左右方向５４と平行に中心線３６を持ったネジ穴３２ａと嵌合穴３２ｂが空いており、ネジ穴３２ａには、ネジ部を持つフタ筒３３が係合され、嵌合穴３２ｂには、アダプタ３５が嵌合されている。
【００３０】
そして、フタ筒３３とアダプタ３５の間には、弾性体である圧縮コイルばね３４が自然長よりも、短い状態で、挟まれており、アダプタ３５は、移動部３７の外側面部３７ａに当接するようになっている。一方、移動部３７の外側面部３７ａの反対側には、斜面当接部３７ｂが設けられている。
【００３１】
ファイバ導入部３２には、マイクロメータ保持部４２がネジ等（図示せず）で固定されている。このマイクロメータ保持部４２には、マイクロメータ本体４４がネジ等（図示せず）で保持されている。
【００３２】
マイクロメータ本体４４は、回転部４４ａに、ツマミ４６がネジ等（図示せず）で係合されている。また、ファイバ導入部３２には、ネジ穴３２ａと、嵌合穴３２ｂの中心線と直交する中心線を持つ筒穴３２ｃが設けられており、この筒穴３２ｃに嵌合されるとともに、斜面当接部３７ｂとマイクロメータ本体４４の回転部４４ａの先端部４４ｂに挟まれた状態で、カプセルアダプタ４３が配置されている。
【００３３】
これにより、マイクロメータ本体４４のツマミ４６を回転操作し、回転部４４ａの先端部４４ｂのカプセルアダプタ４３により移動部３７の斜面当接部３７ｂを押圧し、移動部３７を圧縮コイルばね３４の押圧力に抗して移動させることで、対物レンズ７先端から出射され、カバーガラス（高屈折率側）３から試料（低屈折率側）２へ入射する入射光の入射角度を調整できるように、光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａの光軸３１を、ファイバ投光管２８の光軸３０より（図では左側に）シフトできるようにしている。
【００３４】
マイクロメータ本体４４の固定部４４ｃには、規制手段として同図(ｃ)に示すように開口部４５ａとコの字型の切り欠き部４５ｃを持った切り欠きストッパ４５の開口部４５ａが嵌合されている。そして、コの字型の切り欠き部４５ｃの間隔を調整するビス４７が設けられている。
【００３５】
次に、このように構成された第１の実施の形態の作用について説明する。
【００３６】
この場合、アダプタ３５は、圧縮コイルばね３４により、移動部３７の外側面部３７ａを押した状態になっており、一方、マイクロメータ本体４４のツマミ４６を回転操作することで、先端部４４ｂを紙面上下方向５５に移動させることができ、カプセルアダプタ４３を介して、移動部３７を紙面左右方向５４に移動させることができる。これにより、光ファイバ出射部３８からの出射光２１ａの光軸３１をファイバ投光管２８の光軸３０に対して平行な状態で、且つファイバ投光管２８の光軸３０に対して垂直方向に調整できることになる。
【００３７】
また、同時に、対物レンズ７の先端から出射され、カバーガラス３から試料２への入射光角度も調整することができるようになるが、ここで、カバーガラス３から試料２への入射角度を臨界角よりやや大きな状態になるように、ツマミ４６を回転操作して移動部３７の位置調整を行い、その位置で、切り欠きストッパ４５の側面部４５ｄをマイクロメータ本体４４の回転部４４ａの当接部４４ａａに当て付け、さらに切り欠きストッパ４５の切り欠き部４５ｃの間隔をビス４７で締め付け、開口部４５ａによりマイクロメータ本体４４の固定部４４ｃを挟み込むことで、切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４に対して位置決め固定する。
【００３８】
従って、これ以降は、移動部３７は、切り欠きストッパ４５の規制により、光ファイバ出射部３８をファイバ投光管２８の光軸３０側に移動させることができなくなり、カバーガラス３から試料２への入射角度が臨界角より大きい、全反射照明の範囲でのみの移動に規制される。
【００３９】
一方、水銀ランプハウス２５からの光線（図示せず）は、ミラー保持部２２の遮光部２２ｂで遮光されているが、操作ツマミ２３を紙面垂直方向の手前側に引き出し、ミラー保持部２２を光路から外すことで、水銀バーナー２６からの光線（図示せず）を落射投光管１７に導くことができる。この際は、ミラーユニットターレット９を回転軸１４を中心に回転させることで、励起フィルタ１３ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂおよび吸収フィルタ１２ｂを備えた蛍光ミラーユニット１０ｂを光軸上に配置することで、通常の落射蛍光照明観察をすることができる。
【００４０】
従って、このような第１の実施の形態によれば、マイクロメータ本体に固定された切り欠きストッパ４５により、カバーガラス３から試料２への入射角度を調整する際に、この入射角度を臨界角より大きくなる範囲内に規制されるため、全反射照明のみで蛍光観察を行うことができる。このため、落射蛍光照明による強い光で試料全体が退色してしまうのを防止でき、全反射照明による安定した蛍光観察を得ることができる。また、常に、全反射照明の範囲でカバーガラス３から試料２への入射角度を調整できるので、操作性の向上を図ることができる。さらに、全反射照明と落射蛍光照明の切換えは、高反射ミラー２４の出し入れで迅速に行えるため、試料に照明光を当てたまま、落射蛍光照明から全反射照明へ切換える際に（または、その逆）、試料が退色する原因も回避することができる。
【００４１】
なお、この第１の実施の形態では、倒立顕微鏡について説明したが、正立顕微鏡に適用した場合も同様の効果が得られる。
【００４２】
（第１の実施例の変形例）
次に、第１の実施例の変形例を説明する。図４（ａ）（ｂ）は、第１の実施例の変形例を説明するもので、図３と同一部分には同符号を付している。
【００４３】
この場合、ファイバ投光管２８には、コリメートレンズ２９の後側（落射投光管１７側）にスライド開口部２８ａが設けられ、このスライド開口部２８ａには、開口４８ａと開口４８ｂを持つスライダー４８が紙面左右方向５４に移動可能設けられている。このスライダー４８は、開口４８ａに、拡散板４９がリングネジ（図示せず）により固定されている。
【００４４】
一方、高反射ミラー２４のミラー保持部２２は、落射投光管１７の固定部５０にネジ等（図示せず）で直接固定されている。
【００４５】
このような構成とすると、上述した第１の実施の形態で述べたように全反射照明に設定されている状態で、スライダー４８の開口４８ｂをファイバ投光管２８の光軸３０に配置させると、この状態のままに維持されるが、スライダー４８を移動させて、拡散板４９を有する開口４８ａを光軸３０に配置させるると平行光２１ｂが拡散され、落射蛍光照明に切換えられる。
【００４６】
このようにすれば、上述した第１の実施の形態と同様の効果が選られるのに加えて、水銀ランプハウス２５を使わずに、全反射照明と落射蛍光照明の切換えを実現することができる。
【００４７】
なお、第１の実施の形態の変形例において、ファイバ投光管２８を落射投光管１７と同軸に備えるようにすれば、高反射ミラー２４を省略することも可能で、さらに安価な構造にすることができる。
【００４８】
(第２の実施の形態)
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。図５は、第１の実施例の変形例を説明するもので、図３と同一部分には同符号を付している。
【００４９】
この場合、高反射ミラー２４のミラー保持部２２には、アリ部５１が設けられ、このアリ部５１は、落射投光管１７に設けられたアリ溝部５２に紙面左右方向５４に移動可能となるように保持されている。
【００５０】
この場合、ミラー保持部２２は、常時、圧縮コイルばね３４によりアダプタ３５を介してアリ部５１の当接部５１ａが押された状態になっている。一方、落射投光管１７のアダプタ３５の配置位置と反対側側面には、マイクロメータ保持部５３が設けられ、このマイクロメータ保持部５３にマイクロメータ本体４４が設けられている。この場合、マイクロメータ本体４４は、ツマミ４６の回転により回転される回転部４４ａの先端部４４ｂをアリ部５１の当接部５１ｂに当接させている。
【００５１】
この状態で、マイクロメータ本体４４のツマミ４６を回転することで、アリ部５１によりミラー保持部２２を高反射ミラー２４の反射光路に沿って移動し、高反射ミラー２４での平行光２１ｂの反射位置を調整できるようになっている。
【００５２】
これにより、平行光２１ｂの高反射ミラー２４での反射光２１ｃを光軸１９からシフトさせることができ、対物レンズ７から出射され、カバーガラス３から試料２への入射光角度を調整することができる。
【００５３】
ここでも、カバーガラス３から試料２への入射角度を臨界角よりやや大きくした状態になるように、ツマミ４６を回転操作してミラー保持部２２の位置調整を行い、その位置で、切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４の回転部４４ａに当て付け、切り欠きストッパ４５を締付けることで、マイクロメータ本体４４に対して位置決め固定する。
【００５４】
これにより、これ以降は、ミラー保持部２２は、切り欠きストッパ４５の規制により高反射ミラー２４からの反射光２１ｃを光軸１９側に移動させることができなくなり、カバーガラス３から試料２への入射角度が臨界角より大きい、全反射照明の範囲でのみの移動に規制される。
【００５５】
この場合、第１の実施の形態の変形例と同様に、スライダー４８を設け、拡散板４９を持つ開口４８ａを光軸３０に配置させることで、平行光２１ｂを拡散させることで、レーザ光源４１を利用した落射蛍光照明を得るようにすることもできる。
【００５６】
この第２の実施の形態では、ミラー保持部２２を高反射ミラー２４の反射光路に沿って移動させるようにしたが、高反射ミラー２４の入射光路に沿って移動させるようにしても同様な効果を得ることができる。
【００５７】
なお、上述した実施の形態では、マイクロメータ本体４４と、このマイクロメータ本体４４の回転部４４ａの移動を規制する切り欠きストッパ４５を用いたが、これらを用いない代わりに、ファイバ投光管２８の光軸３０の中心より左右どちらかにシフトしたスリット孔を備えた遮光板を光ファイバ出射部３８の手前に配置し、光ファイバ出射部３８から出射される出射光の光軸をファイバ投光管２８の光軸３０側に移動させても、遮光板により、出射光の光軸中心側の光を遮断するようにすれば、落射照明への切換えは阻止され、全反射照明の範囲でのみの移動に規制するようにできる。この場合、全反射照明とレーザ光源４１を利用した落射蛍光照明との切換えは、第１の実施の形態で述べたと同様に高反射ミラー２４を光路中から挿脱するよう移動させることで行うことができる。
【００５８】
次に、全反射照明を実現する方法について説明する。カバーガラス３から試料２への照明光の入射角が臨界角を超えた時の確認方法は、鏡筒（図示せず）に付いている接眼レンズ（図示せず）をＣＴ（センタリングテレスコープ）（図示せず）に変えて、このＣＴを用いて対物レンズ７の後側焦点位置６近傍のレンズ群（図示せず）を見る。照明光が対物レンズ７のレンズ群（図示せず）を透過する光でレンズ群の自家蛍光が起り、特に集光されている後側焦点位置６近傍のレンズ群で輝点が観察できる。
【００５９】
カバーガラス３から試料２への入射角が臨界角より小さい場合には、対物レンズ７の後側焦点位置６に照明光の入射角側の輝点が１つしか確認されないが、臨界角より大きい場合には対物レンズ７の後側焦点位置６の外周の内側近傍に光軸を中心に対称に輝点が２つ観察される。２つ目の輝点は、カバーガラス３と試料２との境界面で全反射した照明光が対物レンズ７の先端から再び対物レンズ７内に戻るためである。
【００６０】
カバーガラス３から試料２への照明光の入射角が臨界角より小さい状態から大きい状態に変化させいくと、最初１つの輝点が対物レンズの光軸の中心側から次第に外周方向に移動し、入射角が臨界角を超えると対物レンズの光軸中心を対称として２つ目の輝点が現れ、この２つ目の輝点が現れた時に切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４に固定する。
【００６１】
次に、近全反射照明の定義と第１の実施の形態に適用した場合の作用、及び効果を第１実施例をもとに説明する。構成は、第１の実施の形態と同様なため省略する。また、作用、効果についても第１の実施の形態と同じ部分は省略し、異なる分部についてのみ説明する。
【００６２】
まず、はじめに近全反射照明について、以下のように定義する。全反射照明では、カバーガラス３と試料２の境界面で低屈折率媒質側である試料２側に、エバネッセント光４が数百ｎｍ程度の範囲で発生しているが、カバーガラス３から試料２への入射角を臨界角をわずかに小さくすると、カバーガラス３から試料２への屈折光が、カバーガラス３から試料２の境界面上近傍に沿って出射される。この照明法では、試料２のうちカバーガラス３近傍の数μｍの範囲を照明することができる。これは、暗視野照明の一種であり、本発明では、この照明方法を近全反射照明と呼ぶこととする。
【００６３】
次に、近全反射照明の作用について説明する。ここではレーザ光源４１による近全反射照明についてのみ記載し、水銀バーナー２６を光源とした落射蛍光照明についての記載は省略する。まず、第１の実施の形態と同様に、マイクロメータ４４のツマミ４６を回転操作し、カバーガラス３から試料２への入射角が臨界角よりも大きくなっている全反射照明にする。次に、カバーガラス３から試料２への入射角が小さくなる方向にマイクロメータ本体４４のツマミ４６を徐々に回転操作し、前述の近全反射照明となる照明光に調整する。
【００６４】
この状態で、第１の実施の形態と同様に、切り欠きストッパ４５をマイクロメータ本体４４に対して位置決め固定することで、近全反射照明と全反射照明の範囲のみに光ファイバ出射部３８の移動を規制する。
【００６５】
次に、効果について説明する。近全反射照明の場合でも照明範囲は、カバーガラス３上面近傍の数μｍ範囲の試料２のみであり、第１実施例と同様に試料２全体の退色を防ぐことができる他、照明光を光軸から遠ざかる方向に移動させて全反射照明へ迅速に変えることが可能である。
【００６６】
上述した効果以外にも、全反射照明により発生したエバネッセント光４では観察不可能であった領域や、発生する蛍光が微弱すぎて観察できなかった試料２の観察が可能となる。さらに、水銀バーナー２６を光源とした落射蛍光照明では試料２全体から蛍光が発するのに対して、近全反射照明では、照明範囲をカバーガラス３近傍の数μｍの範囲に限定できるため、不要な蛍光を除去でき、バックグラウンドノイズの少ない観察が可能となる。
【００６７】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００６８】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００６９】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、全反射照明および近全反射照明による安定した蛍光観察を実現できるとともに、操作性の向上を図ることができる全反射蛍光顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に関する全反射蛍光顕微鏡の概要を説明する概略構成図。
【図２】本発明に関する全反射蛍光顕微鏡の通常の蛍光落射照明時を説明する概略構成図。
【図３】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第１の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。
【図５】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
２…試料
３…カバーガラス
４…エバネッセント光
５…オイル
６…後側焦点位置
７…対物レンズ
８…光軸
９…ミラーユニットターレット
１０ａ．１０ｂ…蛍光ミラーユニット
１１ａ、１１ｂ…ダイクロイックミラー
１２ａ、１２ｂ…吸収フィルタ
１３ｂ…励起フィルタ
１４…回転軸
１５…観察結像系
１６…高感度カメラ
１７…落射投光管
１７ａ…連結部
１７ｂ…連結部
１８…集光レンズ
１９…光軸
２０…アリ溝部
２１ａ…出射光
２１ｂ…平行光
２１ｃ…反射光
２２…ミラー保持部
２２ａ…アリ部
２２ｂ…遮光部
２３…操作ツマミ
２４…高反射ミラー
２５…水銀ランプハウス
２６…水銀バーナー
２７…光軸
２８…ファイバ投光管
２８ａ…スライド開口部
２９…コリメートレンズ
３０、３１…光軸
３２…ファイバ導入部
３２ａ１…内側面部
３２ａ…ネジ穴
３２ｂ…嵌合穴
３２ｃ…筒穴
３３…フタ筒
３４…圧縮コイルばね
３５…アダプタ
３６…中心線
３７…移動部
３７ａ…外側面部
３７ｂ…斜面当接部
３８…光ファイバ出射部
３９…光ファイバ
４０…光ファイバ入射部
４１…レーザ光源
４２…マイクロメータ保持部
４３…カプセルアダプタ
４４…マイクロメータ本体
４４ａ…回転部
４４ｂ…先端部
４４ｃ…固定部
４４ａａ…当接部
４５…切り欠きストッパ
４５ａ…開口部
４５ｃ…切り欠き部
４５ｄ…側面部
４６…ツマミ
４７…ビス
４８…スライダー
４８ａ、４８ｂ…開口
４９…拡散板
５０…固定部
５１…アリ部
５１ａ、５１ｂ…当接部
５２…アリ溝部
５３…マイクロメータ保持部
５４…紙面左右方向
５５…紙面上下方向
Claims (4)
- 光源と照明光学系と対物レンズを介して、試料に照射される照明光の入射角を変化させる前記照明光学系に含まれる移動部と、前記移動部を移動させることで全反射照明および近全反射照明の切換えを可能にした全反射蛍光顕微鏡において、
前記移動部を微小移動させる微動機構と、前記微動機構を操作する操作部と、前記移動部の移動範囲を規制する規制手段を設け、
前記移動範囲は、前記照明光の前記対物レンズを介して前記試料への入射角が全反射照明および近全反射照明が得られる範囲であることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。 - 前記照明光学系は、光ファイバを有し、前記移動部は、前記光ファイバの出射端を、光軸に対して垂直方向に移動可能に設けられ、
前記規制手段は、前記操作部の操作による前記光ファイバの出射端の光軸に対して垂直方向の移動範囲を前記全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光顕微鏡。 - 前記照明光学系は、反射部材を有し、前記移動部は前記移動部材を、前記反射部材への照明光の入射光路、または反射光路の光軸方向に沿って移動させ、
前記規制手段は、前記入射光路、または反射光路の光軸方向に沿った移動範囲を前記全反射照明および近全反射照明が得られる範囲に規制することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光顕微鏡。 - 前記照明光学系の光路に前記照明光を拡散させる光学素子を挿脱可能に設けたことを特徴とする請求項１または３記載の全反射蛍光顕微鏡。
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