JP2010145950A - 液浸対物レンズ及びこの液浸対物レンズを有する顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】光ピンセットの性能を高めることができる液浸対物レンズとこれを有する顕微鏡を提供すること。
【解決手段】ＮＡが水の屈折率よりも高い液浸対物レンズ６において、ｎａ０≧１．３の条件を満たすｎａ０以上のＮＡの光線にのみ作用し、λ０≦８００ｎｍの条件を満たすλ０以下の波長の光線のみを透過するダイクロイック膜７を設けた光学部材を備える液浸対物レンズ６。
【選択図】図１

Description

本発明は、光ピンセット用途に適した液浸対物レンズ及びこの液浸対物レンズを有する顕微鏡に関する。

光の照射により媒質中の微粒子を捕捉し操作する光による微粒子操作方法は、一般に光ピンセットや光トラップと呼ばれ、光源に主としてレーザを用いることから、レーザツイーザやレーザトラッピングなどとも呼ばれている。光ピンセットでは、光源からのレーザ光（トラップ光）を集光光学系、例えば顕微鏡の対物レンズにより集光し、この集光光束を媒質中の微粒子に照射することにより、微粒子に発生する光の放射圧を利用して微粒子を捕捉・保持したり移動させたりする。光ピンセットは、生体細胞や微生物などを非接触でかつ非破壊で捕捉し操作する方法として様々な分野で利用されている（例えば、特許文献１を参照）。

光ピンセットは、近年顕微鏡を用いた生体研究分野で広く用いられている。細胞の特定部位、例えばバネ構造などに微粒子を特異的に付着させて光ピンセットでその微粒子を捕捉し引っ張って、バネ定数を測定して細胞内で発生する力を計測したり、細胞内の特定粒子を移動させたり、複数細胞の中から特定の細胞を選別したりすることが行われている。

このような生体研究分野では、対物レンズにより集光される光ピンセットのトラップ光が細胞にダメージを与えるのを防ぐため、細胞にほとんど吸収されない赤外光をトラップ光として使用することが多く、特に高出力のＹＡＧレーザ（波長１０６４ｎｍ）などが使われている。また、捕捉微粒子や生体サンプルの観察は、透過照明による明視野観察だけでなく、非常に小さい場合が多い捕捉微粒子をコントラスト良く観察するために、蛍光による観察を行うことも多く、顕微鏡の観察系の照明光（透過照明光や蛍光観察を行うための励起光）・観察光（透過光や蛍光）の波長は可視域であることが多い。

また、このような生体研究分野の光ピンセットでは、一般にトラップ光を集光する対物レンズの開口数（以下ＮＡと呼ぶ）は高い方が微粒子を捕捉する捕捉力も大きい。また捕捉する微粒子は水中の蛍光微粒子であることが多いため、捕捉した微粒子を観察する手段として明視野観察の他に落射蛍光観察が用いられることが多く、できるだけ明るい蛍光像を得るという観察者側のニーズからも、対物レンズのＮＡは高い方が望ましい。その結果、光ピンセットには水浸対物レンズや油浸対物レンズなどの液浸系対物レンズが使われることが多い。

さらに、特に蛍光微粒子が小さい場合や、サンプルのカバーガラスと水（培養液）の界面近傍での微粒子の様子をＳ／Ｎよく観察したい場合には、全反射蛍光観察（ＴＩＲＦ）を用いて捕捉した微粒子を観察することが多い。その場合観察用照明光である励起光は利便性の観点から対物レンズを通してサンプルへ入射させる対物照明方式が用いられることが多いが、サンプルのカバーガラスと水の界面で全反射を起こす角度で入射させる必要があるため使用する対物レンズのＮＡは少なくとも１．３３（水の屈折率）より高い必要があり、実際には少なくともＮＡ１．４以上の油浸対物レンズが用いられることが多い。
特開２００２−３０３８００号公報

ＮＡが水の屈折率よりも高い液浸対物レンズを用いた場合、トラップ光のうちＮＡが水の屈折率よりも高い光はサンプルのカバーガラスと水の界面で全反射を起こし、前記界面近傍にエバネッセント場という定在場が生じる。一般にトラップ光は蛍光観察用励起光よりも高パワーで使用することが多いため、通常の蛍光観察やＴＩＲＦのみで生じるエバネッセント場よりもはるかに強いエバネッセント場が界面に生じることになる。

このエバネッセント場は、トラップ光による捕捉微粒子が界面近傍に存在する場合に、微粒子に対して引っ張り力を生じる。その結果本来のトラップ力以外の外力が微粒子に働くことになり、バネ定数の測定や微粒子の操作などに悪影響を及ぼすという問題がある。

このような問題を避けるために、トラップ光の導入光路に絞りを設け、対物レンズへ入射するトラップ光のＮＡを制限するという方法がある。しかしこの方法では、トラップ光の導入光路に対物レンズの後側焦点面と共役な面を設けてそこに絞りを設置する必要があり、その結果装置が大きく複雑になるという問題がある。また安定的にトラップを行うためには、対物レンズに入射するトラップ光の強度分布は対物レンズの光軸中心に関して対称性が良いことが必要であり、多くのリレー系を介して対物レンズの瞳から離れた共役面で光束を絞る場合には絞りの中心出しなどの微調整が欠かせないという問題がある。

本発明は上記課題を解決するために考案されたものであり、光ピンセットの性能を高めることができる液浸対物レンズを提供することを目的とし、さらに、この液浸対物レンズを有する顕微鏡を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明に係る液浸対物レンズは、ＮＡが水の屈折率よりも高い液浸対物レンズにおいて、以下の条件を満たすｎａ０以上のＮＡの光線にのみ作用し、以下の条件を満たすλ０以下の波長の光線のみを透過するダイクロイック膜を設けた光学部材を備えることを特徴とする。
ｎａ０≧１．３
λ０≦８００ｎｍ

また、本発明に係る顕微鏡は、前記液浸対物レンズを有することを特徴とする。

本発明によれば、光ピンセットの性能を高めることができる。

以下、本願の実施形態に係る液浸対物レンズ及びこの液浸対物レンズを有する顕微鏡について図面を参照して説明する。

図１は、本実施形態の液浸対物レンズを有する顕微鏡の構成を概略的に示す図である。

図２は、本実施形態の液浸対物レンズを使用した光ピンセットの原理を説明する図である。

図３は、本実施形態の液浸対物レンズに備えるダイクロイック膜を設けた光学部材を示す図である。

まず、本実施形態の液浸対物レンズ６を有する顕微鏡の構成について説明する。

図１に示すように、本実施形態の液浸対物レンズ６を有する顕微鏡は光ピンセットによる微粒子操作が可能な装置を備えた透過型光学顕微鏡である。なお、顕微鏡の形態は特に限定されず、落射照明蛍光顕微鏡、全反射照明蛍光顕微鏡などであってもよい。本実施形態の液浸対物レンズ６を有する顕微鏡は、トラップ光を供給するための光源１を備えている。光源１は例えば高出力のＹＡＧレーザであり、波長１０６４ｎｍの赤外レーザ光を供給する。

光源１から供給された光は、例えば光ファイバのようなライトガイド２に入射し、その内部を伝播した後に射出端から射出される。ライトガイド２の射出端からの発散光は、コレクタレンズ３を介してほぼ平行光束となり、ダイクロイックミラー４に入射する。ここで、コレクタレンズ３は、駆動部５の作用により、光軸ＡＸに沿って移動可能に構成されている。また、ダイクロイックミラー４は、光源１からの光を波長選択的に反射する特性を有する。

光源１からのトラップ光は、ダイクロイックミラー４で反射された後、水の屈折率１．３３よりも高いＮＡを有し球面収差が良好に補正された液浸対物レンズ６へ向かう。ここで、本実施形態の液浸対物レンズ６には、液浸対物レンズ６の後側焦点面近傍にダイクロイック膜７が設けられている。ダイクロイック膜７は図２に示すように平行平面板８に蒸着されているが、図１では平行平面板８の図示を省略している。このダイクロイック膜７の特性とトラップ光への作用については後に詳述するが、ダイクロイック膜７によってトラップ光の光束は絞られ、ＮＡが制限されることになる。

トラップ光は、液浸対物レンズ６によって、その前側焦点位置の近傍に集光され、その集光位置の近傍に位置決めされた媒質Ｂ中の微粒子Ｓに照射される。微粒子Ｓを含む媒質Ｂは、例えばシャーレやスライドガラスなどの不図示のホルダとその上部を覆う不図示のカバーガラスによって保持された水（培養液）である。なお、液浸対物レンズ６とカバーガラスとの間は、不図示のイマージョンオイル（屈折率１．５１）などの浸液で満たしてある。

また、本実施形態の液浸対物レンズ６を有する顕微鏡は、捕捉微粒子や生体サンプルを観察するための透過照明光源１１を備えている。透過照明光源１１は、例えばハロゲンランプであり、可視光を供給する。透過照明光源１１からの照明光は、図１に点線で示すように、照明光学系１２を介して媒質Ｂ及びその中の微粒子Ｓを照明する。照明された微粒子Ｓからの観察光（媒質Ｂを透過した可視光）は、微粒子Ｓとダイクロイック膜７の間でトラップ光よりも径の大きな光束として図１に実線で示すように、液浸対物レンズ６を介してほぼ平行光束となり、ダイクロイック膜７を透過して（ダイクロイック膜７の観察光への作用については後に詳述する）、ダイクロイックミラー４に入射する。ここで、ダイクロイックミラー４は、透過照明光源１１からの光を波長選択的に透過する特性を有する。

透過照明光源１１からの照明光で照明された微粒子Ｓからの観察光は、ダイクロイックミラー４を透過した後、第２対物レンズ１３を介して所定の像面１４に微粒子Ｓの像を形成する。像面１４に形成された微粒子Ｓの像は、例えば像面１４に対して位置決めされたＣＣＤカメラなどの撮像手段１５や接眼レンズ１６を介して、肉眼１７により観察される。このようにして、観察系を構成する透過照明光源１１、照明光学系１２、液浸対物レンズ６、第２対物レンズ１３、撮像手段１５、及び／又は接眼レンズ１６により、観察者は微粒子Ｓを観察することができる。なお、捕捉微粒子Ｓ以外の媒質Ｂ中の生体サンプルの観察についても同様である。

次に、本実施形態の液浸対物レンズ６を使用した光ピンセットの原理を説明する。

図２には、図１の液浸対物レンズ６と微粒子Ｓとが拡大して示されている。なお、図２においては浸液、カバーガラスだけでなく、媒質Ｂも図示を省略している。図２に示すように、トラップ光のほぼ平行光束Ｌ１は、平行平面板８の上面に蒸着されているダイクロイック膜７によって絞られた後、液浸対物レンズ６に入射し、液浸対物レンズ６によって、その光軸ＡＸ上の点Ｐに集光する。こうして、液浸対物レンズ６を介して生成された集光光束（例えば円錐状又は円錐筒状の集光光束）Ｌ１１が、集光点Ｐの近傍に存在する微粒子Ｓに照射される。なお、図２では、光ピンセットの原理の理解を助けるために、微粒子Ｓを実際よりも非常に大きく図示している。

微粒子Ｓに照射された集光光束Ｌ１１は、微粒子Ｓの表面で反射されたり、微粒子Ｓの内部で屈折したりして、その進行方向が変化する。その結果、集光光束Ｌ１１の運動量が変化し、その運動量の変化に応じた放射圧が発生し、図２中において太い実線の矢印で示すような力Ｆが微粒子Ｓに作用する。

ここで、微粒子Ｓが周囲の媒質（図２では不図示）Ｂの屈折率よりも大きい屈折率を有し且つ光吸収のない球形状の微粒子である場合には、集光光束Ｌ１１の運動量変化の解析から、放射圧は光強度の高い方に作用し、力Ｆとして微粒子Ｓを集光点Ｐに向かって引き寄せるような捕捉力が作用することが知られている。したがって、本実施形態の液浸対物レンズ６を使用した光ピンセットでは、この捕捉力Ｆを利用して、微粒子Ｓを捕捉し操作する。また、媒質Ｂ中の微粒子Ｓを捕捉し操作する際に、観察系を用いて微粒子Ｓの様子を観察する。

なお、上述した本実施形態の液浸対物レンズ６を有する顕微鏡のように、トラップ光の波長と観察光の波長とが実質的に異なる場合、液浸対物レンズ６の軸上色収差に起因して、トラップ光の集光点Ｐの位置と、観察系における液浸対物レンズ６の合焦位置とが光軸ＡＸ方向にずれ、微粒子Ｓの像の良好な観察が困難になるという問題があるが、本実施形態の液浸対物レンズ６を有する顕微鏡では、駆動部５の作用により光軸ＡＸに沿ってコレクタレンズ３を移動することによって、トラップ光の集光点Ｐの位置を光軸ＡＸに沿って移動することができる。この構成により、上記問題を解決することができる。

また、上述のように、本実施形態の液浸対物レンズ６は、透過型光学顕微鏡に用いられるとは限らず、落射照明蛍光顕微鏡、全反射照明蛍光顕微鏡などにも使用できるものであり、液浸対物レンズ６の最大ＮＡは水の屈折率１．３３よりも高く、例えば最大ＮＡ１．４５である。なお、液浸対物レンズ６を有する顕微鏡が蛍光顕微鏡である場合は、上記構成の透過型光学顕微鏡に、蛍光観察のための内部に複数のフィルタキューブを有するフィルタターレット、落射照明光源、落射照明シャッタ、透過照明シャッタなどの部材が追加となる。

次に、本実施形態の液浸対物レンズ６に設けたダイクロイック膜７について説明する。

例えば最大ＮＡ１．４５の液浸対物レンズ６に、次に述べる特性を有するダイクロイック膜７が設けられていない場合は、上述のようにトラップ光のうちＮＡが水の屈折率よりも高い光はサンプルのカバーガラスと水（媒質Ｂ）の界面で全反射を起こし、前記界面近傍にエバネッセント場を発生させ、結果として光ピンセットの性能に悪影響を及ぼしてしまう。この問題を解決するために、本実施形態の液浸対物レンズ６には、液浸対物レンズ６の後側焦点面近傍に、平行平面板８に蒸着されたダイクロイック膜７が設けられている。

図３は、図１、２の上方から光軸方向にダイクロイック膜７を見た図である。図３に示すように、ダイクロイック膜７は、中空ドーナツ形状であり、以下の条件式（１）を満たすｎａ０以上のＮＡの光線にのみ作用し、以下の条件式（２）を満たすλ０以下の波長の光線のみを透過する特性を有する。
（１） ｎａ０≧１．３
（２） λ０≦８００ｎｍ

ダイクロイック膜７が蒸着されている平行平面板８の上面に達する光線のＮＡ、即ち、液浸対物レンズ６の反対側から（図２において上方から）平行平面板８の上面に達する光線（例えば上述のトラップ光や落射照明・全反射照明蛍光観察用の励起光の光線）、又は液浸対物レンズ６側から（図２において下方から）平行平面板８の上面に達する光線（例えば上述の透過光や蛍光の光線）のＮＡは、図３において、光軸ＡＸに一致する原点を共有し互いに直交するＸ軸とＹ軸によって形成されるＸＹ平面（平行平面板８の上面）上の１点と原点との距離に対応させることができる。

ダイクロイック膜７は、内周部分に達する光線のＮＡがｎａ０になるように、また外周部分（或いは外径に余裕をもたせて形成した場合はこれより内側の周部分）に達する光線のＮＡが液浸対物レンズ６の最大ＮＡ（例えば１．４５）以上となるように、輪帯状に形成されているため、ＮＡがｎａ０以上の光線にのみ作用する。また、ダイクロイック膜７の透過波長域はλ０以下である。これらｎａ０（ダイクロイック膜７が作用する光線のＮＡの下限値）、λ０（ダイクロイック膜７を透過する光線の波長の上限値）は、それぞれ上記条件式（１）、（２）を満たす任意の値に設定することができる。例えばｎａ０＝１．３、λ０＝８００ｎｍである。

本実施形態の液浸対物レンズ６によれば、上述のトラップ光、例えば波長が１０６４ｎｍでλ０（例えば８００ｎｍ）より長いＹＡＧレーザ光は、ＮＡがｎａ０（例えば１．３）を超える成分がダイクロイック膜７に反射されるため、サンプルのカバーガラスと水（媒質Ｂ）の界面には、ＮＡが水の屈折率よりも高いトラップ光成分によるエバネッセント場は発生せず、その結果捕捉された微粒子Ｓに余計な外力が働いて測定や捕捉作業に悪影響を及ぼすという問題がない。また、ダイクロイック膜７の中空部分を通るＮＡがｎａ０よりも小さいトラップ光の成分は、何ら妨げられることなく微粒子Ｓに照射される。

また、捕捉微粒子や生体サンプルを観察するための可視透過照明光、蛍光観察を行うための可視励起光、サンプルからの蛍光は、波長がλ０より短いため、ダイクロイック膜７は中空部分を通る光線と共にその外側の高ＮＡの光線も透過する。よってダイクロイック膜７を設けた状態でも、通常の液浸対物レンズと同様の観察を行うことができる。

さらに、本実施形態では、対物照明方式の全反射蛍光観察（ＴＩＲＦ）を行う場合でも、水の屈折率１．３３よりも高いＮＡの可視励起光は上記特性を有するダイクロイック膜７を透過するので、何ら問題なくＴＩＲＦを行うことができる。

以上のように、本実施形態の液浸対物レンズ及びこの液浸対物レンズを有する顕微鏡によれば、装置の大型化・複雑化を招くことなく、トラップ光によるエバネッセント場の発生を防ぎ、光ピンセットの性能を高めることができる。

なお、上述の実施形態は例に過ぎず、上述の構成に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。

例えば、平行平面板８の中央は、ダイクロイック膜７の中空部分に合わせて中空にしてもよい。

また、ダイクロイック膜７は、液浸対物レンズ６の後側焦点面近傍の少なくとも一箇所に設けることができる。或いは、ダイクロイック膜７を液浸対物レンズ６ではなく、その後側焦点面と共役な面に設けてもよい。

本実施形態の液浸対物レンズを有する顕微鏡の構成を概略的に示す図である。 本実施形態の液浸対物レンズを使用した光ピンセットの原理を説明する図である。 本実施形態の液浸対物レンズに備えるダイクロイック膜を設けた光学部材を示す図である。

符号の説明

１ 光源
２ ライトガイド
３ コレクタレンズ
４ ダイクロイックミラー
５ 駆動部
６ 液浸対物レンズ
７ ダイクロイック膜
８ 平行平面板
１１ 透過照明光源
１２ 照明光学系
１３ 第２対物レンズ
１４ 像面
１５ 撮像手段
１６ 接眼レンズ
ＡＸ 光軸
Ｂ 媒質
Ｓ 微粒子
Ｐ 集光点
Ｆ 捕捉力

Claims (4)

1. ＮＡが水の屈折率よりも高い液浸対物レンズにおいて、
   以下の条件を満たすｎａ０以上のＮＡの光線にのみ作用し、以下の条件を満たすλ０以下の波長の光線のみを透過するダイクロイック膜を設けた光学部材を備えることを特徴とする液浸対物レンズ。
   ｎａ０≧１．３
   λ０≦８００ｎｍ
2. 前記ダイクロイック膜を設けた光学部材は、前記液浸対物レンズの後側焦点面又はその近傍に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の液浸対物レンズ。
3. 前記ダイクロイック膜を設けた光学部材は、平行平面板であることを特徴とする請求項１又は２に記載の液浸対物レンズ。
4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の液浸対物レンズを有することを特徴とする顕微鏡。

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