JP5272114B2 - Eopa酵素の阻害方法 - Google Patents
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Description
長さ約2.2kbの前記cDNAの配列が完全に決定され、そのcDNAおよびたんぱく質の配列はGenbankへそれぞれAcc.No.AF217798およびAAF24516として寄託された。
(a)グアニジンイソチオシアニド−フェノール−クロロフォルム抽出法を用いるか、または商品名Trizol(GibcoBRL)を用いて、幾つかの動物組織から総RNAを単離し;
(b)予め充填されたオリゴーdTセルロースカラムまたはサスペンション中の樹脂を用い、総RNAからメッセンジャーRNAを精製し;
(c)変性アガロースゲル(1〜2.5%のホルムアルデヒドを含む。)中で電気泳動により、前記メッセンジャーRNAの質を分析し、エチジウムブロマイド、または“Syber Green”(Molecular Dynamics)のような他の核酸色素で染色し、フォトドキュメンテーション(photodocumentation)し、特定のプローブ(ノーザンブラット)とのハイブリッダイゼーション後分析を行い;
(d)メッセンジャーRNAを逆転写させ、それに相応する二本鎖cDNA(これはプラスミドベクター、コスミドまたはファージベクターヘクローニングされ、“インビトロ”増幅される。)を生成させ;
(e)EOPA特異的活性の検出により、または特異的抗−EOPA抗体を用いる、ハイブリダイゼーション、免疫選択により、EOPAをコードするcDNA挿入断片を同定および選択し;
(f)PCR(“ポリメラーゼ連鎖反応”)により、または細菌内でこのcDNAを含むベクターを増幅させることにより、そのcDNA挿入断片を増幅および単離させ、次いでベクターからこのcDNAを放出させる制限酵素で消化させ;
(g)または、メッセンジャーまたは総RNAおよび特異的オリゴヌクレオチド類を用いる、直接PCR増幅(RT−PCR−逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)により、選択されたcDNAを増幅させ;
(h)そのcDNAが完全に配列決定され、特異的ソフトウェアおよびデータバンクを用いる相同性分析を含め、1次および2次構造を分析し、各々の推定アミノ酸配列を決定する。
組み換えEOPAは、例えば培養物中の真核細胞、細菌、イースト、バキュロウイルスなどのような非相同的系を用いて発現され得る。細菌内での組み換えEOPAの生成は、ベクターの転写開示信号(開示メチオニンを含む。)が用いられるように、EOPAをコードするcDNAをインフレームで(in frame)発現ベクター(例えば、pProEx−HTc)内へサブクローンした後行われた。大腸菌(Escherichia coli)は、電気泳動または“熱ショック”処理を行うことによって、その構造体により形質移入または形質転換され、かつ各々の組み換えたんぱく質の発現はIPTG(イソプロピル−チオ−ガラクトシダーゼ)の添加により誘導された。発現されたたんぱく質は、アンカーたんぱく質またはポリーヒスチジン配列標識(標的たんぱく質の同定および精製プロセスを助ける。)を有する、組み変えまたは融合たんぱく質として生成された。
(a)アンカーたんぱく質またはオリゴペプチド配列標識を有する融合たんぱく質として、または組み換え分子としてEOPAが生成されるように、EOPAをコードする、単離されたcDNAをプラスミド発現ベクター内へインフレームでクローンし;
(b)組み換えまたは融合たんぱく質を生成するために、発現ベクター内にインフレームでクローンされたEOPAをコードするcDNA挿入断片を含む、前記プラスミドベクター構造体で宿主細菌(Escherichia coli菌株DH5α、BL21(DE3)など)を形質転換させ(ここで、形質転換は、これらの方法に対しそれぞれ適切なプロトコールを用い、前もって用意された細菌の熱ショック処理または電気泳動処理により行われ得る。);
(c)前記形質転換された細菌を、560〜600nm(波長)での吸光度値が約0.6になるまでに、適切な培地(通常、選沢用の適切な抗生物質を含むLB培地を用いる。)中の生育により増幅させ(その際に、標的たんぱく質の生成は、発現誘導化合物、例えばIPTG(イソプロピル−チオガラクトシダーゼ)を、最終濃度0.5〜1mMになるまで添加し、振盪機内で30〜37℃でインキュベートすることによって誘導される。);
(e)たんぱく質が融合たんぱく質として得られる場合に、ポリヒスチジン融合物に対し固定ニッケル、またはGST(グルタチオンーS−転移酵素)との融合物に対しグルタチオン−セファロース樹脂を含む、アフィニティーカラムを用い、他の可溶性細菌たんぱく質(不純物)から前記たんぱく質を分離し;次いで特異的なプロテアーゼ(例えば、トロンビン、因子X,エンテロキナーゼなど)との消化(その消化部位は、アンカーたんぱく質と選択される組み換えたんぱく質との間に導入される。)を介してアンカーたんぱく質またはポリペプチドを除去し、組み換えたんぱく質を得;
(f)ポリアクリルアミドゲル(SDS/PAGE)での電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法、および天然および合成ペプチド基質を用いて、酵素反応速度により特異活性を決定する方法により、組み換えたんぱく質の純度および質を評価することからなる。
EOPAをコードするヒト遺伝子の全配列は、公開されているデータベースに完全にアクセス可能なヒトゲノムの配列分析により決定された。EOPA遺伝子は9エキソンおよび10イントロンからなり、約40kbの長さを有する。この遺伝子は、p53遺伝子(約0.7cMにより単離される。)の位置に比較的に近接したクロモソーム17p12.9に位置し、かつ遺伝子LIS1が位置したクロモソーム17(17p13.3)と同じアーム(arm)上に位置する。EOPA遺伝子の上流領域(プロモーターを含む。)で、幾つかの転写調節因子の結合部位、例えばAP1,cMyb,SP1,nMyc,cMycなどが見られた。
ウサギEOPAをコードする遺伝子のプロモーター領域を分析して、この酵素の発現を調節する幾つかの主転写因子を同定した。得られた構造物に対し測定されたルシフェラーゼ活性に基づき、位置−725〜位置−648の領域は、グリオーマ(C6細胞株)でEOPAの発現を強く抑制する転写因子により認識される(原型がん遺伝子c−mybの生成物により認識され得る)一つ以上の部位を有する。Thiele et al.,1988参照。さらに、この研究は、ヒトEOPA遺伝子がその上流領域、即ち位置−980〜位置−310でこの遺伝子を陽性的に調節する認識部位を有しているのを示す。C6細胞株だけを用いて実施した本研究の以外に、得られた結果は、ヒトおよびウサギの両方のEOPA遺伝子は、上流領域に対し低い類似性を示すにもかかわらず、グリオーマ(ここで、酵素触媒活性測定結果、低いEOPA様ペプチダーゼ活性が観察された。)で陰性的に調節されることが分かった。一方、分析されたEOPA遺伝子のプロモーター領域の断片は、研究の対象になった細胞株、例えばC6細胞でこの遺伝子発現の活性化因子として作用する転写因子に対する認識部位を含んでいるように思われる。
免疫化のために、細菌、とりわけ大腸菌で発現された活性の組み換えEOPA、または精製された天然EOPAを用い、レット、マウスおよびウサギで多クローン性抗体を生成させた。7〜8週齢の、体重18〜22gのオスのBalb−Cマウスを、精製された天然ヒトEOPA、または触媒活性の組み換え酵素で免疫化した。4回の免疫化それぞれにおいて、水酸化アルミニウム、[Al(OH)3]上に吸収された形態の、精製されたたんぱく質2μgまたは組み換えたんぱく質3μgを毎週皮内へ注射した。最後の免疫化が終わってから1週間後、血液サンプルを収集し、血精を−20℃で保存した。適切な抗原を用い抗血精力価をELISAにより評価した。得られた血清の抗−触媒活性は、消光蛍光(quenched fluorescence)ペプチド類基質を用いてHPLCまたは蛍光分析法により評価した。抗血清は、使用する前に、混入されている任意のペプチダーゼ活性を除去するために、55℃で5分間予熱した。抗体の使用を標準化するテストの結果から、抗−EOPA抗体を組み換えEOPAと共に37℃で30分間インキュベートすると最大阻害効率に達し、かつ他の組織オリゴペプチダーゼ、例えばチメットオリゴペプチダーゼ(TOP)および神経溶解素(NL)とのインキュウベートの際はいかなる阻害活性も示さなかったため、この阻害は特異的であることが分かった。この抗体を用いると、また動物および細胞株に存在している、機能的には類似しているが相同ではない酵素類(例えば、TOPおよびNL)からEOPAの活性を識別することができた。
9〜13アミノ酸残基からなる、ブラジキニン、ニューロテンシンおよびオピオイドペプチド類のような天然ペプチド基質類を用いる反応速度分析は、我々の研究室でEOPAを発見および特性決定するのに欠くことのできないものであった。論文(Camergo et al.,1994)の抄録参照。1990年以後、我々は、この酵素の特性を標準化し、費用を単純化しかつ減少させ、もっと信頼できるEOPAの反応速度特性を明かすために、消光蛍光(quenched fluorescence)を有する天然基質に由来したペプチド基質類の開発に取り組んできた。Juliano et al.,1990参照。用いられた、消光蛍光(qf)を持つこのペプチド基質類は、ペプチドのアミノ末端にラジカルAbz(オルト−アミノ安息香酸)を、ペプチドのカルボキシル末端にEDDnp、[N−(2,4−ジニトロフェニル)エチレンジアミン]を有する。これらのペプチド類のアミノ酸残基は次のような一文字の略語として示される。
G−グリシン N−アスパラギン
A−アラニン Q−グルタミン
P−プロリン D−アスパラギン酸
V−バリン E−グルタミン酸
I−イソロイシン K−リシン
L−ロイシン R−アルギニン
S−セリン F−フェニルアラニン
T−トレオニン H−ヒスチジン
W−トリプトファン Y−チロシン
当分野に技術によれば、反応速度分析の結果から、EOPAは、還元剤ジチオトレイトール(DTT)により活性化され、またシステイニルプロテアーゼの古典的阻害薬である、5’−ジチオ−ビス−(2−ニトロ案息香酸塩)(DTNB)およびp−クロロメルクリ案息香酸塩(PCMB)のようなチオル試薬により阻害されるため、チオルにより活性化される酵素であることが知られている。Oliveira et al.,1976;Camargo et al.,1983;Hayashi et al.,1996 and 2000参照。後で、チオル−反応性基Npys(S−(3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル)で標識された酵素基質類(ダイノルフィンの誘導体類)の模倣化合物類を用いて、触媒部位に近接した、重要なシステイン残基の存在が確認された。Gomes et al.,1993;Hyayshi et al.,1996参照。このEOPAの重要なシステイン残基は部位特異的阻害薬と非可逆的に反応したため、この酵素がシステインプロテアーゼであるという仮説が実証された。
別個のレット組織および細胞でのEOPAの発現は、生化学的および免疫学的方法、また特異的触媒活性の評価/数量化、免疫組織化学、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションおよびノーダンブロット分析を意味する分子生物学的技法を用いて分析された。これらの分析を用いると、脳でのEOPAの高い発現度を検証し、皮質、海馬、小脳およびマイルネト(Meynert)の基底核の幾つかの層で主に強いハイブリダーゼーション信号を示すことができた。よって、これらの部位で特異的なメッセンジャーRNAの転写レベルがより高いということが分かった。
多能性幹細胞から“インビトロ”神経細胞の分化は、胚発生の初期段階に関与する分子メカニズムの基本研究に対するモデルとして広く受け入れられてきた。EOPAの機能および発現に関する研究には、“インビトロ”神経細胞の分化過程に対するモデルとして、マウスの胚性癌腫に由来したB19細胞株が用いられてきた。胚盤胞の中央層に由来した胚性幹細胞は、遺伝子発現の調節を研究するのに用いられてきた。これらはまた、神経細胞退行に対する治療剤として、およびパーキンソン病の治療に用いられるドーパミン作用性移植片に対し、可能性のある候補薬物である。胚性癌腫細胞は、通常、胚の組織の新生物から得られ、培養物で容易に操作される。これらは幹細胞のように行動し、エピブラスト(epiblast)の内層で見られる細胞と類似した遺伝子発現パターンを示し、また培養物で、典型的な内皮性、中胚葉性または外胚葉性細胞を作り出すことができる。Martin 1980参照。マウスの胚性癌腫に由来した全能性P19細胞(McBurney et al.,1982)は分化モデルとして、また別個の分化経路に対し非可逆的なコミットメント(commitment)に必要な因子を同定するための研究において用いられた。非分化P19細胞は高い増殖速度を特徴とし、高密度の付着細胞またはサスペンション中の細胞を持つ両方の培養物は分化過程を誘導する。この過程はまた化学的因子、たとえばレチノイン酸またはDMSOによりトリガーされ得る。例えば、10−7Mのレチノイン酸の存在下で、P19細胞は神経外胚葉細胞へ分化することが知られている。(Jones−Villeneuve et al.,1982)。
EOPAの非−たんぱく分解作用の今の観点は、それが“高次コイル”構造、例えば、Lis1およびDisclを持つ構造を通じて他のサイトゾルたんぱく質類と相互作用するということである。Lis1は、広く反復されるモチーフを有するWD−40たんぱく質部類に属し(Neer et al.,1994参照)、幾つかの細胞機能を一緒に遂行する機能性仕組みを維持する細胞内たんぱく質として作用する。Hatakeyama et al.,1999;Kitagawa et al.,1999;Sidow et al.,1999参照 。Lis1およびDisc1とEOPAとの相互作用は胚発生時に中枢神経系の形成および生体機能,例えば細胞内輸送、神経突起生成、核の運動性および神経組織の可塑性において欠くことのできないものである。相互作用異常は滑脳症およびMiller−Diecker症候群のような神経学的疾病を引き起こす。Reiner et al.,1993;Cardoso et al.,2002参照。最近、EOPAの関与を示す他の病状として報告されたのは精神***症である。精神***病患者はEOPAに結合しない、切断型または突然変異型Disc1を生成し、このような異常はこの疾病のトリガーに関連しているように思われる。Ozeki et al.,2003;Taylor et al.,2003参照。
を特徴とし、進化的スケールで、例えばアスペルギルスのように離れた生物ですら保存された配列の断片を示す、新たなたんぱく質部類を構成するように思われる。[GenBank Acc.No.AF015037](Sweeney et al.,2001;Kitagawa e cols.,2000)
オピオイドペプチド類はまた免疫調節薬であることが既に知られており(Blalock,1989)、免疫系の細胞でEOPAの存在を考えると、免疫系でこの酵素に対する役割を提案することができる。Paik et al.,1992参照。MHCIにより提示された抗原の大きさが、これらのエンドオリゴペプチダーゼと結合するのに必要とされるペプチド類の大きさ(7〜13アミノ酸残基)と一致するという、これらのデータおよび観察に基づき(Engelhard、1994)、本発明者らは、自己および非自己の選択プロセスに関与する可能性を調べることにした。MHCI抗原提示プロセスでのチメットオリゴペプチドダーゼの関与は本発明者らにより既に明らかになっていた。その理由はMHCIにより提示されるエピトップ類は7〜13アミノ酸残基を有するオリゴペプチド類であり、それらはまたこの酵素に対する競合的阻害薬であるからである。“インビトロ”で組み換えEOPAを用いた場合、EOPAとTOPとの特異性において微妙な差はあるものの、類似な結果が再現された。我々は、抗原提示細胞でオリゴペプチダーゼ阻害薬の追加後リンフォプロリフェレーション(linfoproliferation)レベルの低下は主にEOPAの阻害に起因し、それはこの酵素がMHCI抗原提示系経路に関与し得るのを示唆するということを見出した。神経組織でのMHCIの発現は感染性および退行性プロセス、および中枢神経系の可塑性に関連するため、このペプチダーゼの調節またはEOPAのシャペロン活性は、EOPAの特定の阻害薬により影響を受けるのが明らかである、これらのプロセスとの関連性を説明することができる。Piehl and Lidman,2001;Huh et al.,2000参照。
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- EOPA酵素をJA2で処理する工程を含む、EOPA酵素の活性を阻害する方法。
- 阻害剤として抗−EOPA抗体、及び、JA2のうちいずれかを用いて神経細胞の前駆体細胞を処理する工程を含む、神経細胞の分化を阻害する方法。
- 阻害剤として抗−EOPA抗体、及び、JA2のうちいずれかを用いて抗原提示細胞を処理する工程を含む、リンパ増殖の調整方法。
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