JP5272114B2 - Ｅｏｐａ酵素の阻害方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト組み換えエンドオリゴペプチダーゼＡ（ｅｎｄｏｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ａ；ｈＥＯＰＡ）、ｈＥＯＰＡをコードするポリヌクレオチド（原核生物類および、ヒトを含む真核生物類でｈＥＯＰＡを発現させる。）；ｈＥＯＰＡのたんぱく分解活性を決定するための、またはペプチド類“溶解性受容体”としてまたはシャペロンとしての活性を評価するための、合成基質類の使用；多たんぱく質（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ）複合体類の形成および他のたんぱく質との相互作用に影響を与えられる、作用物質類、競合物質類および拮抗物質類として作用できるオリゴペプチド−リガンド活性の特異的抗体および阻害薬の使用およびその製造方法に関する。本発明はまた、中枢神経系の先天性、感染性および退行性病状における診断および／または使用、および精神医学的障害、認知障害、および行動機能障害に対し、天然、組み換え、化学的修飾または遺伝子組み換え形態の、そのたんぱく質の使用にも関する。本発明はまた、神経学的病状および組織の退行変性の治療のために抗体類およびそれらの誘導体類を含む、ＥＯＰＡに対するリガンドの相互作用の阻害薬類および競合物質類の使用を提案する。

より詳しくは、本発明は中枢神経系（ＣＮＳ）で発現されるたんぱく質に関する。本発明によれば、そのたんぱく質は、ペプチド類基質に対したんぱく分解活性を呈し、それらと、オリゴペプチド類および／または細胞内たんぱく質類との相互作用を可能にするたんぱく質の構造を示し、神経細胞移動、神経突起生成、介在ニューロン性情報伝達(例えば、シナプス形成のための情報伝達)、抗原提示および生体内変化および／または生理活性ペプチドの保護(シャペロン活性)または生理活性ペプチド類の調節たんぱく質相互作用（“溶解性受容体”活性）のような重要な生理学的作用を決めることができる。

本発明の目的を達成するために、このようなたんぱく質をコードするメッセンジャーＲＮＡの１次構造、およびヒトＥＯＰＡのたんぱく質配列の１次構造を決定する特定の方法を提案する。

同様に、本発明はＥＯＰＡ遺伝子の１次構造、並びにその転写および発現を制御する調節因子の１次構造を決定する方法を提供する。

さらに、ＥＯＰＡの主な特異性は、基質加水分解(たんぱく分解活性)および活性中心でペプチド類との相互作用(シャペロンまたは“溶解性受容体”−様活性)に係り、活性複合体類の形成に影響を与え、中枢神経系の細胞性プロセスで作用することができ、活性生成物の製造を可能とするということが明らかになった。それはまた、合成または天然特異的阻害薬類の生成および／または使用(それは試験管内、生体外、または生体内で用いられる。)に関連し、ＥＯＰＡの生理学的または病理学的役割に影響を与える。

本発明の更なる目的は、ＥＯＰＡの触媒活性を阻害し、かつ組織および生物学的体液でＥＯＰＡを特異的に認識することができる特異的抗体を作製することにある。

本発明の更なる別の目的は、ＥＯＰＡをコードするポリヌクレオチド、各々の組み換えたんぱく質、またはそれに対して生成された抗体を用い、ヒトおよび動物の別個の組織、器官および体液でこのたんぱく質の分布様式を決定することにある。

他の目的として、本発明は、腫瘍組織または細胞で；全能性細胞(幹細胞)および神経細胞で、分化過程、軸索の形成過程、またはシナプス性結合の形成過程で；および（特に、神経組織および平滑筋の）退行性病理学的過程またはそれの修復過程で、このたんぱく質の発現および分泌を決定する方法を提供する。

本発明による幾つかの目的は後述する分化過程により得られ、また特性決定された。

ヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）から購入したヒト脳皮質ｃＤＮＡライブラリーから単離した。ウサギＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ配列に由来した放射活性標識プローブを用いるハイブリダイゼーションにより前記単離されたｃＤＮＡをスクリーニングした後、同定し、そのｃＤＮＡおよびそれに相応するたんぱく質をＧｅｎｂａｎｋデータバンクへそれぞれＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０１５０３７およびＡＡＢ９９９０５として寄託した。本発明者らによる文献（Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）参照。

ヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡのクローニングおよびその推定アミノ酸配列の分析
長さ約２．２ｋｂの前記ｃＤＮＡの配列が完全に決定され、そのｃＤＮＡおよびたんぱく質の配列はＧｅｎｂａｎｋへそれぞれＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ２１７７９８およびＡＡＦ２４５１６として寄託された。

哺乳動物のＥＯＰＡおよびそれに相応するたんぱく質配列をコードするメッセンジャーＲＮＡの１次構造を決定するために、
（ａ）グアニジンイソチオシアニド−フェノール−クロロフォルム抽出法を用いるか、または商品名Ｔｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、幾つかの動物組織から総ＲＮＡを単離し；
（ｂ）予め充填されたオリゴーｄＴセルロースカラムまたはサスペンション中の樹脂を用い、総ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを精製し；
（ｃ）変性アガロースゲル（１〜２．５％のホルムアルデヒドを含む。）中で電気泳動により、前記メッセンジャーＲＮＡの質を分析し、エチジウムブロマイド、または“Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ”（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のような他の核酸色素で染色し、フォトドキュメンテーション（ｐｈｏｔｏｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）し、特定のプローブ(ノーザンブラット)とのハイブリッダイゼーション後分析を行い；
（ｄ）メッセンジャーＲＮＡを逆転写させ、それに相応する二本鎖ｃＤＮＡ（これはプラスミドベクター、コスミドまたはファージベクターヘクローニングされ、“インビトロ”増幅される。）を生成させ；
（ｅ）ＥＯＰＡ特異的活性の検出により、または特異的抗−ＥＯＰＡ抗体を用いる、ハイブリダイゼーション、免疫選択により、ＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ挿入断片を同定および選択し；
（ｆ）ＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”）により、または細菌内でこのｃＤＮＡを含むベクターを増幅させることにより、そのｃＤＮＡ挿入断片を増幅および単離させ、次いでベクターからこのｃＤＮＡを放出させる制限酵素で消化させ；
（ｇ）または、メッセンジャーまたは総ＲＮＡおよび特異的オリゴヌクレオチド類を用いる、直接ＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ−逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）により、選択されたｃＤＮＡを増幅させ；
（ｈ）そのｃＤＮＡが完全に配列決定され、特異的ソフトウェアおよびデータバンクを用いる相同性分析を含め、１次および２次構造を分析し、各々の推定アミノ酸配列を決定する。

組み換えＥＯＰＡの発現
組み換えＥＯＰＡは、例えば培養物中の真核細胞、細菌、イースト、バキュロウイルスなどのような非相同的系を用いて発現され得る。細菌内での組み換えＥＯＰＡの生成は、ベクターの転写開示信号（開示メチオニンを含む。）が用いられるように、ＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡをインフレームで（ｉｎ ｆｒａｍｅ）発現ベクター(例えば、ｐＰｒｏＥｘ−ＨＴｃ)内へサブクローンした後行われた。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、電気泳動または“熱ショック”処理を行うことによって、その構造体により形質移入または形質転換され、かつ各々の組み換えたんぱく質の発現はＩＰＴＧ(イソプロピル−チオ−ガラクトシダーゼ)の添加により誘導された。発現されたたんぱく質は、アンカーたんぱく質またはポリーヒスチジン配列標識(標的たんぱく質の同定および精製プロセスを助ける。)を有する、組み変えまたは融合たんぱく質として生成された。

前記のように得られた組み換えたんぱく質は、脳に存在する天然たんぱく質で見られるものと等しい生化学的および免疫学的特徴を示した。

組み換えＥＯＰＡ(特に、細菌内での)の生成は、
（ａ）アンカーたんぱく質またはオリゴペプチド配列標識を有する融合たんぱく質として、または組み換え分子としてＥＯＰＡが生成されるように、ＥＯＰＡをコードする、単離されたｃＤＮＡをプラスミド発現ベクター内へインフレームでクローンし；
（ｂ）組み換えまたは融合たんぱく質を生成するために、発現ベクター内にインフレームでクローンされたＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡ挿入断片を含む、前記プラスミドベクター構造体で宿主細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）など）を形質転換させ（ここで、形質転換は、これらの方法に対しそれぞれ適切なプロトコールを用い、前もって用意された細菌の熱ショック処理または電気泳動処理により行われ得る。）；
（ｃ）前記形質転換された細菌を、５６０〜６００ｎｍ（波長）での吸光度値が約０．６になるまでに、適切な培地（通常、選沢用の適切な抗生物質を含むＬＢ培地を用いる。）中の生育により増幅させ(その際に、標的たんぱく質の生成は、発現誘導化合物、例えばＩＰＴＧ(イソプロピル−チオガラクトシダーゼ)を、最終濃度０．５〜１ｍＭになるまで添加し、振盪機内で３０〜３７℃でインキュベートすることによって誘導される。)；
（ｅ）たんぱく質が融合たんぱく質として得られる場合に、ポリヒスチジン融合物に対し固定ニッケル、またはＧＳＴ（グルタチオンーＳ−転移酵素）との融合物に対しグルタチオン−セファロース樹脂を含む、アフィニティーカラムを用い、他の可溶性細菌たんぱく質（不純物）から前記たんぱく質を分離し；次いで特異的なプロテアーゼ(例えば、トロンビン、因子Ｘ，エンテロキナーゼなど)との消化（その消化部位は、アンカーたんぱく質と選択される組み換えたんぱく質との間に導入される。）を介してアンカーたんぱく質またはポリペプチドを除去し、組み換えたんぱく質を得；
（ｆ）ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）での電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法、および天然および合成ペプチド基質を用いて、酵素反応速度により特異活性を決定する方法により、組み換えたんぱく質の純度および質を評価することからなる。

ヒトＥＯＰＡの遺伝子配列の決定
ＥＯＰＡをコードするヒト遺伝子の全配列は、公開されているデータベースに完全にアクセス可能なヒトゲノムの配列分析により決定された。ＥＯＰＡ遺伝子は９エキソンおよび１０イントロンからなり、約４０ｋｂの長さを有する。この遺伝子は、ｐ５３遺伝子（約０．７ｃＭにより単離される。）の位置に比較的に近接したクロモソーム１７ｐ１２．９に位置し、かつ遺伝子ＬＩＳ１が位置したクロモソーム１７（１７ｐ１３．３）と同じアーム（ａｒｍ）上に位置する。ＥＯＰＡ遺伝子の上流領域(プロモーターを含む。)で、幾つかの転写調節因子の結合部位、例えばＡＰ１，ｃＭｙｂ，ＳＰ１，ｎＭｙｃ，ｃＭｙｃなどが見られた。

ＥＯＰＡをコードする遺伝子のプロモーター領域の分析
ウサギＥＯＰＡをコードする遺伝子のプロモーター領域を分析して、この酵素の発現を調節する幾つかの主転写因子を同定した。得られた構造物に対し測定されたルシフェラーゼ活性に基づき、位置−７２５〜位置−６４８の領域は、グリオーマ(Ｃ６細胞株)でＥＯＰＡの発現を強く抑制する転写因子により認識される（原型がん遺伝子ｃ−ｍｙｂの生成物により認識され得る）一つ以上の部位を有する。Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８参照。さらに、この研究は、ヒトＥＯＰＡ遺伝子がその上流領域、即ち位置−９８０〜位置−３１０でこの遺伝子を陽性的に調節する認識部位を有しているのを示す。Ｃ６細胞株だけを用いて実施した本研究の以外に、得られた結果は、ヒトおよびウサギの両方のＥＯＰＡ遺伝子は、上流領域に対し低い類似性を示すにもかかわらず、グリオーマ（ここで、酵素触媒活性測定結果、低いＥＯＰＡ様ペプチダーゼ活性が観察された。）で陰性的に調節されることが分かった。一方、分析されたＥＯＰＡ遺伝子のプロモーター領域の断片は、研究の対象になった細胞株、例えばＣ６細胞でこの遺伝子発現の活性化因子として作用する転写因子に対する認識部位を含んでいるように思われる。

ｍｙｂ遺伝子部類は細胞の増殖および分化にかかわる遺伝子の転写を調節するがん遺伝子類として記載されている。Ｎｅｓｓ（１９９９）参照。この部類は三つの別個の遺伝子、即ちＡ−ｍｙｂ，Ｂ−ｍｙｂおよびｃ−ｍｙｂからなる。Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９参照。ｃ−ｍｙｂの良く知られている特性のうち、それが、骨髄性細胞および赤血球細胞の分化を阻害し、従って遮断された未熟細胞の連続的な分化を可能とする生存因子（ｓｕｒｖｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）であることは注目すべきである。Ｗｅｓｔｏｎ， １９９８参照。数多くのグループは、ｃ−ｍｙｂ遺伝子と、幾つかの腫瘍細胞株との関係、および神経細胞の正常的な作用との関係を提案してきた。Ｗｅｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０およびＧｏｚｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７参照。しかしながら、ｃ−ｍｙｂ遺伝子の生理学的な作用はまだ解明されていない。

抗−触媒活性を持つ抗−ＥＯＰＡ抗体の生成および類似の作用を持つたんぱく質を識別する能力
免疫化のために、細菌、とりわけ大腸菌で発現された活性の組み換えＥＯＰＡ、または精製された天然ＥＯＰＡを用い、レット、マウスおよびウサギで多クローン性抗体を生成させた。７〜８週齢の、体重１８〜２２ｇのオスのＢａｌｂ−Ｃマウスを、精製された天然ヒトＥＯＰＡ、または触媒活性の組み換え酵素で免疫化した。４回の免疫化それぞれにおいて、水酸化アルミニウム、［Ａｌ（ＯＨ）_３］上に吸収された形態の、精製されたたんぱく質２μｇまたは組み換えたんぱく質３μｇを毎週皮内へ注射した。最後の免疫化が終わってから１週間後、血液サンプルを収集し、血精を−２０℃で保存した。適切な抗原を用い抗血精力価をＥＬＩＳＡにより評価した。得られた血清の抗−触媒活性は、消光蛍光（ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ペプチド類基質を用いてＨＰＬＣまたは蛍光分析法により評価した。抗血清は、使用する前に、混入されている任意のペプチダーゼ活性を除去するために、５５℃で５分間予熱した。抗体の使用を標準化するテストの結果から、抗−ＥＯＰＡ抗体を組み換えＥＯＰＡと共に３７℃で３０分間インキュベートすると最大阻害効率に達し、かつ他の組織オリゴペプチダーゼ、例えばチメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）および神経溶解素（ＮＬ）とのインキュウベートの際はいかなる阻害活性も示さなかったため、この阻害は特異的であることが分かった。この抗体を用いると、また動物および細胞株に存在している、機能的には類似しているが相同ではない酵素類（例えば、ＴＯＰおよびＮＬ）からＥＯＰＡの活性を識別することができた。

ＥＯＰＡの生化学的特徴およびたんぱく分解特性
９〜１３アミノ酸残基からなる、ブラジキニン、ニューロテンシンおよびオピオイドペプチド類のような天然ペプチド基質類を用いる反応速度分析は、我々の研究室でＥＯＰＡを発見および特性決定するのに欠くことのできないものであった。論文（Ｃａｍｅｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の抄録参照。１９９０年以後、我々は、この酵素の特性を標準化し、費用を単純化しかつ減少させ、もっと信頼できるＥＯＰＡの反応速度特性を明かすために、消光蛍光（ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を有する天然基質に由来したペプチド基質類の開発に取り組んできた。Ｊｕｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０参照。用いられた、消光蛍光（ｑｆ）を持つこのペプチド基質類は、ペプチドのアミノ末端にラジカルＡｂｚ（オルト−アミノ安息香酸）を、ペプチドのカルボキシル末端にＥＤＤｎｐ、[Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）エチレンジアミン]を有する。これらのペプチド類のアミノ酸残基は次のような一文字の略語として示される。
Ｇ−グリシン Ｎ−アスパラギン
Ａ−アラニン Ｑ−グルタミン
Ｐ−プロリン Ｄ−アスパラギン酸
Ｖ−バリン Ｅ−グルタミン酸
Ｉ−イソロイシン Ｋ−リシン
Ｌ−ロイシン Ｒ−アルギニン
Ｓ−セリン Ｆ−フェニルアラニン
Ｔ−トレオニン Ｈ−ヒスチジン
Ｗ−トリプトファン Ｙ−チロシン

現在、ＥＯＰＡ活性を決定するために選択されるペプチドはＡｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐである。このような天然ＥＯＰＡの特性決定方法を組み換え酵素に適用し、天然ＥＯＰＡにより得られた結果を完璧に再現した。Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０００参照。この酵素分析法は、消光蛍光（これは、ＥＯＰＡ、ＴＯＰおよびＮＬのような幾つかの組織オリゴペプチダーゼの特性を決定するのに用いられる。）を持つ、幾つかのペプチド基質類をテストするのに幅広く使用されてきた。Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００１参照。

天然たんぱく質およびその組み換え形態は７〜１３アミノ酸残基のペプチド類を選択的に加水分解し、それらの等電点は５．２２〜５．５５である。ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｂｙ Ｍｅｄｅｉｒｏｓ，１９９２参照。この酵素はブラジキニンのＰｈｅ^５−Ｓｅｒ^６ボンドを特異的に加水分解し（Ｃａｍｅｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９７３）、そして神経溶解素のＡｒｇ^８−Ａｒｇ^９ボンドを特異的に加水分解し（Ｃａｍｅｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、配列中にエンケファリンを含む、幾つかのオピオイドペプチド類から［Ｍｅｔ^５］−または［Ｌｅｕ^５］−エンケファリンを放出する。（Ｃａｍａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５；１９８７）参照。よって、これらの生理活性ペプチド類が生体内変化に関与する可能性が示唆される。

ＥＯＰＡは、チオルにより活性化され、ＥＤＴＡに不感性の、約４０ｋＤａの分子量を示すエンドペプチダーゼであり、他のサイトゾルたんぱく質と結合し、より大きい分子量を持つ複合体を生成することができる。この最後の特性は、動物組織のサイトゾル、とりわけレット脳のサイトゾルに対し、分子量が知られている標準物質を用い目盛りを決めたＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ゲルろ過させることにより検証された。流出液中に存在するたんぱく質は、抗−ＥＯＰＡ抗体を用い、酵素活性、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡを測定することによってモニターされた。

ＥＯＰＡの阻害薬
当分野に技術によれば、反応速度分析の結果から、ＥＯＰＡは、還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）により活性化され、またシステイニルプロテアーゼの古典的阻害薬である、５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ案息香酸塩）（ＤＴＮＢ）およびｐ−クロロメルクリ案息香酸塩（ＰＣＭＢ）のようなチオル試薬により阻害されるため、チオルにより活性化される酵素であることが知られている。Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９７６；Ｃａｍａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６ ａｎｄ ２０００参照。後で、チオル−反応性基Ｎｐｙｓ（Ｓ−（３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）で標識された酵素基質類（ダイノルフィンの誘導体類）の模倣化合物類を用いて、触媒部位に近接した、重要なシステイン残基の存在が確認された。Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｈｙａｙｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６参照。このＥＯＰＡの重要なシステイン残基は部位特異的阻害薬と非可逆的に反応したため、この酵素がシステインプロテアーゼであるという仮説が実証された。

従って、ＥＯＰＡは、ＥＤＴＡに不感性で、チオル依存性を有するエンドオリゴペプチダーゼである。しかし、それは、金属プロテアーゼ、例えばＪＡ２を阻害するように特別に設計された化合物類により阻害され得るが（Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、Ｊｉｒａｃｅｋらにより合成されたホスフィン酸塩ペプチド阻害薬により阻害されない（１９９５）。このＪＡ２阻害薬は、ＴＯＰに特異的な阻害薬であるｃＦＰの構造を変更することによって得られたが、その後すぐに両方の化合物が約１７ｎＭの類似したＫｉをもって、ＥＯＰＡの活性を阻害するということが本発明者らによって証明された。

ＪＡ２および抗−ＥＯＰＡ抗体によるエンドオリゴペプチダーゼの阻害

*Ｓｈｒｉｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００

レット組織でのＥＯＰＡの分布
別個のレット組織および細胞でのＥＯＰＡの発現は、生化学的および免疫学的方法、また特異的触媒活性の評価／数量化、免疫組織化学、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションおよびノーダンブロット分析を意味する分子生物学的技法を用いて分析された。これらの分析を用いると、脳でのＥＯＰＡの高い発現度を検証し、皮質、海馬、小脳およびマイルネト（Ｍｅｙｎｅｒｔ）の基底核の幾つかの層で主に強いハイブリダーゼーション信号を示すことができた。よって、これらの部位で特異的なメッセンジャーＲＮＡの転写レベルがより高いということが分かった。

さらに、免疫組織化学による組織および細胞分布研究の結果から、中枢神経系、および既に知られているように［Ｌｅｕ^５］−エンケファリンが豊かな、脊椎動物の網膜の神経細胞の軸索および細胞体でオピオイドペプチド類およびそれらの前駆体類とＥＯＰＡとの共存が証明された。Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｐａｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｆｅｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０００参照。またＥＯＰＡが、他のペプチドメッセンジャー代謝酵素のように、細胞外空間へ分泌されるという証拠が存在する。

たんぱく分解活性を測る分析の対象となった組織（脳、精巣、心臓、骨髄、肝臓、肺、骨格筋、および腎臓）のうち、我々は腎臓のサイトゾルが最も低いＥＯＰＡおよび神経溶解素活性レベルを示すということに注目した。一方、チメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）はこの組織での総活性の３２％を構成し、基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐが用いられた場合に、この酵素は偏在的分布を示した。一般的に、ＥＯＰＡおよびチメットオリゴペプチダーゼの酵素活性は、脳と腎臓のサイトゾルを除いたほとんどの組織のサイトゾルで均一に分布した。

ＥＯＰＡは脳のサイトゾルで優先的に見られるが、それはこの組織で観察された総オリゴペプチダーゼ活性の６０％に達する。チメットオリゴペプチダーゼの活性はこのサイトゾルで検出されなかったが、このサイトゾルで観察された活性の２０％は神経溶解素に起因し、また２０％はこの基質を加水分解する他のサイトゾル酵素の活性に起因したものであった。

以上のように同定された特性をよりよく証明するために（本発明の目的でもある。）、前記の表は、サイトゾルのエンドオリゴペプチダーゼによる蛍光基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐの加水分解の百分率として、抗−ＥＯＰＡ抗血清の特異的活性により決定されたＥＯＰＡの分布を示している。

さらに、これは、図１にも、基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐに対するエンドオリゴペプチダーゼの活性の百分率として示されている。

図２は、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションに対するＥＯＰＡ分布研究で、用いられたプローブの作製に用いられる断片が分離されるヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡの全配列を図解する。

サイトゾルのエンドオリゴペプチダーゼによる、蛍光基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐの加水分解の百分率

*ＴＯＰおよびＮＬの酵素活性は、ＴＯＰおよびＮＬにそれぞれ特異的なホスフィン酸塩阻害薬、Ｚ−（Ｌ，Ｄ）−Ｆ−ψ−（ＰＯ_２ＣＨ_２）−（Ｌ，Ｄ）−Ａ−Ｒ−ＭおよびＰ−Ｆ−ψ−（ＰＯ_２ＣＨ_２）−Ｌ−Ｐ−ＮＨ_２によるサイトゾルペプチダーゼの阻害の百分率から推定された。Ｊｉｒａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５参照。

神経細胞および黒色腫におけるＥＯＰＡの発現
多能性幹細胞から“インビトロ”神経細胞の分化は、胚発生の初期段階に関与する分子メカニズムの基本研究に対するモデルとして広く受け入れられてきた。ＥＯＰＡの機能および発現に関する研究には、“インビトロ”神経細胞の分化過程に対するモデルとして、マウスの胚性癌腫に由来したＢ１９細胞株が用いられてきた。胚盤胞の中央層に由来した胚性幹細胞は、遺伝子発現の調節を研究するのに用いられてきた。これらはまた、神経細胞退行に対する治療剤として、およびパーキンソン病の治療に用いられるドーパミン作用性移植片に対し、可能性のある候補薬物である。胚性癌腫細胞は、通常、胚の組織の新生物から得られ、培養物で容易に操作される。これらは幹細胞のように行動し、エピブラスト（ｅｐｉｂｌａｓｔ）の内層で見られる細胞と類似した遺伝子発現パターンを示し、また培養物で、典型的な内皮性、中胚葉性または外胚葉性細胞を作り出すことができる。Ｍａｒｔｉｎ １９８０参照。マウスの胚性癌腫に由来した全能性Ｐ１９細胞（ＭｃＢｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２）は分化モデルとして、また別個の分化経路に対し非可逆的なコミットメント（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）に必要な因子を同定するための研究において用いられた。非分化Ｐ１９細胞は高い増殖速度を特徴とし、高密度の付着細胞またはサスペンション中の細胞を持つ両方の培養物は分化過程を誘導する。この過程はまた化学的因子、たとえばレチノイン酸またはＤＭＳＯによりトリガーされ得る。例えば、１０^−７Ｍのレチノイン酸の存在下で、Ｐ１９細胞は神経外胚葉細胞へ分化することが知られている。（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。

付着を防ぐためのプロトコールで、細胞凝集体はサスペンション中に５日間維持され、次のような細胞タイプを形成した：７日目に神経細胞が現れ、１０日目に星状細胞およびグリア細胞が見られた。従って、天然での変化および化学的誘導物質の濃度での変化は、Ｐ１９細胞を、平滑筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞または星状細胞を形成させる多重の分化経路へ誘導することができる。Ｅｄｗａｒｄ ａｎｄ ＭｃＢｕｒｎｅｙ，１９８３参照。本発明者らにより行われた研究で、軸索突起の形成が観察される際に、レチノイン酸で処理した後約８日目に、胚性小体および神経細胞分化細胞でＥＯＰＡメッセンジャーＲＮＡの発現が増加された。この研究の目的は、ＥＯＰＡの生理学的役割と、神経細胞の分化過程で遺伝子およびたんぱく質の調節のメカニズムを明かすことにある。

ＰＣ１２細胞株は、神経細胞の表現型へ誘導する、神経成長因子（ＮＧＦ）に可逆的に反応し、可塑物（ｐｌａｓｔｉｃ）に対する付着性が劣るレット腫瘍（移植可能なレットクロム親和性細胞腫）に由来し、成長し小さなクラスターを形成する傾向がある。Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９７６参照。標準条件下で培養物中に維持されると、これらの細胞は，生物学的および形態学的特徴において、胎児副腎のクロム親和性細胞に類似する。これらは二つの方法で分化し得る：１）グルココルチコイド類に応答してクロム親和性様細胞へ、および２）ＮＧＦまたは繊維亜細胞成長因子（ＦＧＦ）のような神経栄養性因子に応答して交感神経細胞へ。さらに、これらの細胞は幾つかの生理活性ペプチド類、例えばエンケファリン類、ダイノルフィン（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）類およびニューロテンシン類を発現する。

これらの特徴により、この細胞株は神経ペプチド類の生体内変化に関与する酵素の研究のための実験的モデルとして適している。以前、我々は、ＥＯＰＡのたんぱく分解活性はこれらの細胞のサイトゾルに存在し、この活性はｃＡＭＰの添加に応答して調整されるが、ＦＧＦ処理には応答しないということを証明した。

一方、これらの細胞をＦＧＦで処理すると、神経細胞表現型へ分化させることができ、並びに軸索の伸長が観察され得る。その後、これらの細胞に存在するＥＯＰＡは神経細胞の末端へ移動するが、これは細胞伸長部の形成、または他の細胞との接続部の形成において、この酵素の潜在的な役割を示唆する。これらの細胞においてこのたんぱく質の実際の役割を明かすための努力がなされてきた。

ＥＯＰＡの生理学的役割を研究するための新たな生物学的モデルを考案するために、神経細胞への幹細胞の分化過程を標準化した。

胚性幹細胞（ＥＳ）は、 胚盤胞の内部細胞集団に由来した未分化細胞であり、かつ多能性を有するものとして知られている。Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ， １９８１；Ｍａｒｔｉｎ，１９８１参照。多能性は、生物体内で正常の発達を回復することを可能にするＥＳ細胞の注目すべき能力であり、また生殖系を含む別個の組織を生成することを可能にする。特定条件下で培養すると、幹細胞は、数回の細胞分割が起こる間に、数多くの継代を経ても、未分化形態で維持され得る。一方、これらの細胞が導入され、“インビトロ”分化プログラムを開示することができる。例えば、サスペンション中に培養される際に、幹細胞は、胚様体（移植前胚児に類似する。）と呼ばれる分化細胞の凝集体を自発的に形成する。形態学的、免疫組織学的、および分子分析を行なった結果、幾つかの、別個の胚性細胞株は胚様体、例えば造血細胞、神経細胞、内皮細胞および筋細胞で見られる。これらの幹細胞の特性は、初期胚芽発達に対する“インビトロ”モデルとしてこれらの細胞を使用する動機付けとなり、この故に、例えば次のような重要な問題に答えるための強力なツールでもある：胚発生時に神経細胞における核移動の過程でＥＯＰＡの実際の役割は何か、およびこの過程でＥＯＰＡの触媒活性の重要性は何か、および未分化細胞および神経細胞の前駆体細胞および成熟した神経細胞でＥＯＰＡはどのような細胞内分布を有するのか。

未分化胚性幹細胞（ＵＳＰ−１細胞株）を次のような培地で培養した：１５％ウシ胎児血清、１００ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸、１０^−４Ｍのモノチオグリセロール、およびＬＩＦ（白血病阻害因子）を含むＤＭＥＭ（最終濃度１、０００ユニット／ｍｌ）。未分化幹細胞の培養物を全て、前もって照射されたマウスの繊維亜細胞（Ｎｅｏ Ｍｅｆ２）の１次培養物上で維持させた。胚様体（ここで、７５０細胞はペトリ皿上で２０μｌの培地ドロップ中に、３７℃で4日間、５％炭素ガス下に維持された。）が形成された後に、分化が行なわれる。（この期間に、細胞は胚様体と知られている細胞凝集体を形成する。）胚様体が形成された後、細胞を、前記培地を含有し、ＬＩＦを含有しない、０．１〜０．５μＭのレチノイン酸（神経細胞分化の誘導するための試薬として用いられる。）を含む、新たな皿へ移した。次いで、この培養物を４日間分化誘導物質と共に維持させた。その時点で、上記誘導物質を除去し、細胞培養物を、０．２２％ゲラチンで予め処理した新たな皿（グラススライドを含む。）へ移し、ここで細胞を、前記したような条件下で、神経細胞用の基礎培地（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｎ）（ウシ胎児血清を低濃度で含む、神経細胞培養のための特別な培地）を用い４日間さらに培養した。神経細胞用の基礎培地で細胞を維持させることによって、神経細胞の前駆体細胞および成熟した神経細胞を選択した。幹細胞の分化が終了したら、共焦点顕微鏡を用い分化された細胞を数え、かつ撮影した。

神経細胞へ分化した細胞集団は、前述したプロトコールに従い得られ、これらの神経細胞の分化および成熟プロセスでＥＯＰＡ触媒活性阻害の影響を調べるために、その神経細胞を阻害薬ＪＡ２で処理した後分析を行った。神経細胞の前駆体細胞をこの阻害薬で処理すると、軸索突起の形成が阻害され、従って細胞の異常分化が誘導された。それによって特徴付けが行われた。

胚発生時中枢神経系の形成におけるＥＯＰＡの役割
ＥＯＰＡの非−たんぱく分解作用の今の観点は、それが“高次コイル”構造、例えば、Ｌｉｓ１およびＤｉｓｃｌを持つ構造を通じて他のサイトゾルたんぱく質類と相互作用するということである。Ｌｉｓ１は、広く反復されるモチーフを有するＷＤ−４０たんぱく質部類に属し（Ｎｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４参照）、幾つかの細胞機能を一緒に遂行する機能性仕組みを維持する細胞内たんぱく質として作用する。Ｈａｔａｋｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｉｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９参照 。Ｌｉｓ１およびＤｉｓｃ１とＥＯＰＡとの相互作用は胚発生時に中枢神経系の形成および生体機能，例えば細胞内輸送、神経突起生成、核の運動性および神経組織の可塑性において欠くことのできないものである。相互作用異常は滑脳症およびＭｉｌｌｅｒ−Ｄｉｅｃｋｅｒ症候群のような神経学的疾病を引き起こす。Ｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｃａｒｄｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００２参照。最近、ＥＯＰＡの関与を示す他の病状として報告されたのは精神***症である。精神***病患者はＥＯＰＡに結合しない、切断型または突然変異型Ｄｉｓｃ１を生成し、このような異常はこの疾病のトリガーに関連しているように思われる。Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００３参照。

新生児レットまたは胚の脳薄片を用いる“インサイチュ”ハイブリダイゼーション研究で、ＥＯＰＡメッセンジャーＲＮＡの転写レベルの増加が、主に新生児の、５〜１０日齢の胚の皮質で見られた。

さらに、発明者らは別個の動物、たとえばヒト、ウサギ、マウスおよびレット（ここで、同一のたんぱく質がまたＮｕｄｅ−ＬまたはＮｕｄｅ−様またはＮｕｄｅ２と呼ばれる。）で発現されるＥＯＰＡの“高次コイル”ドメインの高度に進化された保存部（ｈｉｇｈ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を同定および証明した。Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１参照。

らせん状構造，および他のたんぱく質と相互作用できる能力は，核移動および神経細胞移動と関係があり、それは胚発生時に主に生じる細胞移動プロセスでこの構造の重大な作用を示唆する。

我々の結果から、レットから単離されたＥＯＰＡに相同のたんぱく質 （Ｎｕｄｅ２，Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ_１３３３２０）およびマウスから単離されたＥＯＰＡに相同なたんぱく質（Ｎｕｄｅ−Ｌ，Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ３２３９１８）はまた，ＥＯＰＡに対し既に用いられたペプチド基質類が用いられる場合、ＥＯＰＡ特異的阻害薬によりたんぱく分解活性を遮断することに加えて、ＥＯＰＡ様ペプチダーゼ活性を示すことが分かった。これらのたんぱく質は、高度に保存されたＮ−末端ドメインを示し、“高次コイル”構造の存在およびより多様なＣ−末端ドメイン
を特徴とし、進化的スケールで、例えばアスペルギルスのように離れた生物ですら保存された配列の断片を示す、新たなたんぱく質部類を構成するように思われる。［ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ０１５０３７］（Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｉｔａｇａｗａ ｅ ｃｏｌｓ．，２０００）

ＥＯＰＡの組織特異的発現は、レポーターたんぱく質、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を調節するウサギＥＯＰＡ遺伝子のプロモーター領域を用いる分析を通じてカエル胚で見られた。レポーター遺伝子のる転写における第一の徴候はステージ１３〜１５の胚で見られ、かつ胚がそれ以上維持されない約ステージ４０まで続くことができた。この実験で、研究された遺伝子の発現を調節する転写因子は、プロモーター領域に存在する特定の配列と相互作用し、標的たんぱく質が主に発現されるべき発達ステージおよび組織を指示するレポーターたんぱく質の発現をトリガーする。従って、これらの研究で、ＥＯＰＡは神経胚形成時に神経細胞チューブを形成する最初の段階で、並びに神経細胞の外胚葉および小脳で主に発現された。後ほど、胚の尾部を形成する、骨格筋細胞の特定の標識がまた見られた。

これらの結果はまた、白皮症のツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の胚を用いて行われた、総量“インサイチュ”ハイブリダイゼーション分析により確認された。ここで、約ステージ１９の胚の背面部位の前側―後側軸に沿って、ＥＯＰＡ相同性メッセンジャーＲＮＡの存在を確認した。このような染色部位は神経細胞組織、より正確的には、脊髄に向かって広がりかつ神経冠を含む菱脳および前脳を含むのが明らかである。さらに、ＥＯＰＡ遺伝子の同型接合性の有害な突然変異が生育不可能であることを考えて、“インビトロ”で転写された特定のメッセンジャーＲＮＡを注射することによってＥＯＰＡをツメガエルで超発現させる分析が行われた。その結果、ＥＯＰＡの過剰発現は神経系の正常の形成を妨げるのが証明された。より小さくかつ置き違えられた目、および動物の脳の深刻な奇形が観察された。それらは注射された側上での異常ラミネーションを示唆する。

抗原提示プロセスでのＥＯＰＡの役割
オピオイドペプチド類はまた免疫調節薬であることが既に知られており（Ｂｌａｌｏｃｋ，１９８９）、免疫系の細胞でＥＯＰＡの存在を考えると、免疫系でこの酵素に対する役割を提案することができる。Ｐａｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２参照。ＭＨＣＩにより提示された抗原の大きさが、これらのエンドオリゴペプチダーゼと結合するのに必要とされるペプチド類の大きさ（７〜１３アミノ酸残基）と一致するという、これらのデータおよび観察に基づき（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、１９９４）、本発明者らは、自己および非自己の選択プロセスに関与する可能性を調べることにした。ＭＨＣＩ抗原提示プロセスでのチメットオリゴペプチドダーゼの関与は本発明者らにより既に明らかになっていた。その理由はＭＨＣＩにより提示されるエピトップ類は７〜１３アミノ酸残基を有するオリゴペプチド類であり、それらはまたこの酵素に対する競合的阻害薬であるからである。“インビトロ”で組み換えＥＯＰＡを用いた場合、ＥＯＰＡとＴＯＰとの特異性において微妙な差はあるものの、類似な結果が再現された。我々は、抗原提示細胞でオリゴペプチダーゼ阻害薬の追加後リンフォプロリフェレーション（ｌｉｎｆｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）レベルの低下は主にＥＯＰＡの阻害に起因し、それはこの酵素がＭＨＣＩ抗原提示系経路に関与し得るのを示唆するということを見出した。神経組織でのＭＨＣＩの発現は感染性および退行性プロセス、および中枢神経系の可塑性に関連するため、このペプチダーゼの調節またはＥＯＰＡのシャペロン活性は、ＥＯＰＡの特定の阻害薬により影響を受けるのが明らかである、これらのプロセスとの関連性を説明することができる。Ｐｉｅｈｌ ａｎｄ Ｌｉｄｍａｎ，２００１；Ｈｕｈ ｅｔ ａｌ．，２０００参照。

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図１は、基質Ａｂｚ−ＧＦＡＰＦＲＱ−ＥＤＤｎｐに対するエンドオリゴペプチダーゼの活性を百分率として示す。 図２は、“インサイチュ”ハイブリダイゼーションに対するＥＯＰＡ分布研究で、用いられたプローブの製作に用いられる断片が分離されるヒトＥＯＰＡをコードするｃＤＮＡの全配列を図解する。

Claims (3)

1. ＥＯＰＡ酵素をＪＡ２で処理する工程を含む、ＥＯＰＡ酵素の活性を阻害する方法。
2. 阻害剤として抗−ＥＯＰＡ抗体、及び、ＪＡ２のうちいずれかを用いて神経細胞の前駆体細胞を処理する工程を含む、神経細胞の分化を阻害する方法。
3. 阻害剤として抗−ＥＯＰＡ抗体、及び、ＪＡ２のうちいずれかを用いて抗原提示細胞を処理する工程を含む、リンパ増殖の調整方法。

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