JP5058403B2 - Ｃｋ−ｍｂ活性測定法およびｃｋ−ｍｂ活性測定試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はミトコンドリアクレアチンキナーゼ（ｍＣＫ）の活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体を用いたクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の測定法および測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）は遺伝子を異にする３つの蛋白が存在する。細胞質に由来する２種類の蛋白（局在により筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ型））ともう一つはミトコンドリアに由来する蛋白である。細胞質由来のＣＫアイソザイムはＭ型とＢ型との組み合わせによりなる２量体で構成され、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの３種類に分類される。ミトコンドリアＣＫ（ｍＣＫ）は、偏在型のユビキタス（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）Ｍｉａ−ＣＫとサルコメリック（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ）Ｍｉｂ−ＣＫのアイソフォームが組織特異的に合成される。
【０００３】
また、ｍＣＫは８量体で極めて安定的に存在するが、クレアチン、ＭｇＡＤＰおよび硝酸塩の遷移状態類似物質複合体の存在下では、数分のうちに２量体に加速的に解離する。また、血液中では時間と共に徐々に２量体になると言われている（Ｋａｒｉｎ Ｆｒｉｔｚ−Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３８１，３４１−３４５，１９９６）。
【０００４】
これらアイソザイムの電気泳動の移動度は陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｍＣＫ（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしまう。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリンが結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免疫向流法などによりザイモグラムから確認することができる。
【０００５】
臨床検査においてはＣＫ、ＣＫアイソザイムの定量が広く行われている。中でもＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量はＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法などにより行われている。ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定できる反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動法は操作が煩雑で熟練を要する上に、結果を出すまでにデンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要があり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により迅速簡便に測定ができる利点があるが特異性に欠ける欠点を有していた。
【０００６】
しかし現状では、急性心筋梗塞の早期診断が求められる為、迅速簡便に測定ができる免疫阻害法が広く使用されている。この方法は、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する特異抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体ということもある）を用いてＭサブユニットを失活させ、残存するＢサブユニット活性を測定するものである。この方法だと、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣＫ（２量体＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−ＢＢは、血中にほとんど存在しないため無視できるし、ＣＫ−ＢＢが逸脱する疾患も少ない。しかし、ｍＣＫは健常者の血清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれており（豊田陽子 他：生物物理化学，４１，２４４，１９９７、星野忠 他：小児を対象としたＣＫアイソザイム分画の年齢別推移に関する検討．生物物理化学，４２補冊２，２１，１９９８）、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性腫瘍などでｍＣＫの逸脱が起こり結果の判定を混乱させる。 最近では、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死などでもｍＣＫの逸脱が起こることが報告されている（星野忠 他：臨床病理，４６，総会号，５７，１９９８、金光房江 他：臨床病理，４６，総会号，５６，１９９８）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来の免疫阻害法は、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ‐ＭＢを測定するものであり、簡便で迅速に測定できるが、この方法だとｍＣＫも同時に測定してしまい、正確なＣＫ−ＭＢの測定は期待できない。しかし、ｍＣＫを阻害する抗体および抗ＣＫ‐Ｍ阻害抗体を添加することにより、ｍＣＫの影響を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定が可能となる。そこで本発明の目的は、免疫阻害法によるＣＫ‐ＭＢ測定法において、ｍＣＫの影響を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、たとえば哺乳動物をｍＣＫで免疫して得られた抗血清や、免疫した各種動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞との細胞融合により作製したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、前記目的を達成せしめる抗体を得て本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）免疫阻害法によりクレアチンキナーゼ（ＣＫ）ＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の酵素活性を測定する方法であって、ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体およびクレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体を用いて検体を処理し、ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性およびｍＣＫの酵素活性を阻害する処理がなされた検体中に残存するクレアチンキナーゼＢ（ＣＫ−Ｂ）サブユニットの酵素活性を測定し、測定されたＣＫ−Ｂサブユニットの酵素活性からＣＫ−ＭＢの酵素活性を求めることを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（２）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない（１）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定方法、
（３）ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を一つの工程中で同時に作用させることを特徴とする（１）または（２）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（４）ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を別々の工程で作用させることを特徴とする（１）または（２）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（５）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする（１）〜（４）の何れか１項に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（６）（１）記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法に用いるＣＫ−ＭＢ活性測定試薬であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
（７）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない（６）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
（８）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする（６）または（７）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害抗体（抗ｍＣＫ阻害抗体とよぶこともある）は、ｍＣＫ蛋白質を特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、後述する本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法に使用できるが、このＣＫアイソザイムの分別定量法において実質的にｍＣＫ以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍＣＫを阻害できれる抗体であればよく、ｍＣＫを６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上阻害する抗体であり得る。ｍＣＫは多くの場合、試料中に５〜２０Ｕ／Ｌ含まれており、８０％以上のｍＣＫ阻害能を有すれば臨床上問題なく使用可能である。ｍＣＫ阻害能の低い抗体であっても、複数の抗体を組み合わせて使用する、またはｍＣＫを阻害しうる化合物と共に使用することにより、実質的に８０％以上の阻害効果を得ることができるので、本発明の範囲に含まれる。また、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００１１】
具体的には例えば、本発明の抗体は、ヒトｍＣＫを特異的に認識して阻害しうるモノクローナル抗体であって、マウス由来かつイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスのｍＣＫＩ−５７８と命名された抗体であり、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により平成１２年４月１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体である。ｍＣＫＩ−５７８は、試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に８０％以上阻害することができる。また、ｍＣＫＩ−５７８は、少なくともサルコメラｍＣＫを９０％以上阻害する。本発明の抗体は、この具体例に限定されるものではなく、ヒトｍＣＫを特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害しうる抗体であればよい。また、本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体は、ｍＣＫ酵素活性を阻害する目的で使用する時、単独で用いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００１２】
本発明の抗体の由来である動物種はマウスに限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスである。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されるものではなく、ＩｇＭなどでもよい。
【００１３】
本発明の抗体は、従来公知の免疫学的手法を用いて、例えば抗原としてｍＣＫを用い、好ましくはアジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動物の血清などから得ることができる。モノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融合することにより、具体的には以下に記載する方法で作製することができる。
【００１４】
抗原としては、目的とする特異性によっても異なるが、ｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を阻害する抗体を得る場合には、ヒトまたは哺乳類のｍＣＫが用いられるが、特異性を高めるためには種特異的な抗原を用いることが好ましい。ヒトｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を特異的に阻害する抗体を得る場合には、抗原として好ましくはヒトｍＣＫを用いる。当該抗原は、ｍＣＫを心筋組織や血液などから精製することにより調製できるし、また遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
【００１５】
感作抗原としては、精製したｍＣＫ蛋白質、またはそのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法により発現させたｍＣＫ蛋白質やその部分ペプチドをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解、あるいは懸濁したものが用いられる。抗原液は通常抗原物質を５０〜５００μｇ／ｍＬ程度含む濃度に調製すればよい。また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に架橋して用いることが好ましい。当該抗原で免疫感作する動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【００１６】
このとき、被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投与することが好ましい。ここで用いられるアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）。百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使用する組合せが特に好ましい。
【００１７】
免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無などにより、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。当該抗原溶液をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多くして、腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
【００１８】
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒトなど由来のものが使用される。例えばマウスミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３などの株化骨髄腫細胞が例示される。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、好ましくは免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３やＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４などを用いることが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞の維持は、凍結保存するか、またはウマ、ウサギもしくはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養することにより行われる。また細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。
【００１９】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１，０００〜６，０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄しＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート中に播種して培養を続ける。
【００２０】
融合操作後の細胞は選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換することによって開始し、さらに２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウエルを確認する。
【００２１】
生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取して抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応させれば、該上清中に産生されている抗体を検出することができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗体の検出および抗体価の測定を行うことができる。このように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な抗体を産生しているハイブリドーマを得る。
【００２２】
さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈して培養することにより目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ クローンを単離することができる。得られた抗体産生ハイブリドーマ クローンは、約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）あるいはグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍結させて−７０〜−１９６℃で保存すると、約半年〜半永久的に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温槽中で急速に融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ましい。
【００２３】
ハイブリドーマが産生する抗体の免疫グロブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより知ることができる。
【００２４】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選択して用いる。例えば、該ハイブリドーマを移植したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数ｍｇ／ｍＬの高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。細胞培養によるモノクローナル抗体の取得は、抗体産生量はインビボより低いが、マウス腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。
【００２５】
抗体をハイブリドーマを移植したマウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約１０６個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。
【００２６】
一方、細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法などの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくすることが望ましい。または、ハイブリドーマを常法により無血清培地に馴化し、無血清培地を用いて培養すれば、抗体精製が容易になるので、より好ましい。
【００２７】
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などを応用することで、容易に達成される。
【００２８】
さらに、モノクローナル抗体が、マウスＩｇＧである場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合単体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製することが可能であり、簡便である。
【００２９】
かくして得られた本発明のモノクローナル抗体は試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害できる。従って、本抗体を用いることにより、試料中のｍＣＫを選択的に排除することができ、ＣＫ−Ｍサブユニットを選択的に排除せしめる抗体と共に使用することで、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムであるＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢおよびｍＣＫを分別定量することが可能となる。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体で処理することにより、ｍＣＫを排除することを特徴とするクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定量法を提供する。本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体は、単独で用いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００３０】
ＣＫアイソザイム測定法の基本原理は、免疫阻害法によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法を利用する。一般に、例えばこの方法によるＣＫ−ＭＢの活性測定は次のようにして行われている。すなわち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活性阻害抗体を使用し、試料中のＣＫ−ＭＭおよびＭＢ中のＭサブユニット活性（ＭＢは約半分の活性が阻害される）を阻害したのち、残存するＢサブユニット活性を２倍することによりＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−ＭＢ活性の測定は、下述の反応式（化１）の左行反応によって生成するＡＴＰを、さらにヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）からなる共役反応によりＮＡＤＰＨを生成させ、ＮＡＤＰＨの量的変化を定量することにより行う（化２）。
【００３１】
【化１】
【００３２】
【化２】
【００３３】
従来法では、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体のみを用いてＣＫ−ＭＢの測定を行っていたため、ｍＣＫも同時に測定され正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定が期待できなかったが、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法において、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットおよびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処理することにより選択的に排除する処理をした後、残存するＣＫ活性を測定すれば、実用上十分に正確なＣＫ−ＭＢ測定を簡便迅速に実施できる。
【００３４】
上記本発明のＣＫ−ＭＢ測定法では、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体および本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体とを同一の工程中、例えば測定用酵素液中、で作用させてもよいし、別々の工程で、例えば本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を基質液に添加し、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体は測定用酵素液中で、作用させてもよい。
活性測定を目的とするアイソザイムがＣＫ−ＭＢの場合は、好ましくは同時に、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体および本発明で得た抗ｍＣＫ阻害抗体で試料を処理して測定を行うのが簡便でよい
【００３５】
さらに本発明は、抗ｍＣＫ阻害抗体で試料を処理することによりｍＣＫの酵素活性を選択的に排除することを特徴とするｍＣＫ測定法を提供する。すなわち、本発明のｍＣＫ測定法においては、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とを行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性のみを求めることができる。この時、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とは、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体などを含んでいる測定用試薬を使用して行ってもよいし、含んでいない測定用試薬を使用して行ってもよい。２つの測定において使用する測定用試薬が抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体の含有に関して同条件であれば問題はない。
【００３６】
例えば、試料中の全ＣＫ活性を測定し、測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定を行い、得られた２つの測定値の差によりｍＣＫ活性を求めることができる。この時、試料をまず抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いて処理しＣＫ−ＭＭ活性とＣＫ−ＭＢの約半分の活性とを阻害したのちに一旦測定を行って、１／２ＣＫ−ＭＢ＋ｍＣＫ酵素活性を測定し（測定値Ａ）、測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定を行い、１／２ＣＫ−ＭＢ酵素活性（測定値Ｂ）を測定することにより、ｍＣＫ活性のみならずＣＫ−ＭＢ活性を同一試料を用いて同時に簡便迅速に測定できる。すなわち、ＣＫ−ＭＢ活性は測定値Ｂを２倍することにより求めることができるし、ｍＣＫ活性は測定値Ａと測定値Ｂとの差により求めることができる。
【００３７】
また例えば、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とを別々に行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることもできる。すなわち、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性を例えば全ＣＫ活性測定試薬（キットＡ）を用いて測定し、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性を別に調製した抗ｍＣＫ阻害抗体をキットＡに添加したキットＢを用いて測定を行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることができる。この時、キットＡとして抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を添加したＣＫ−ＭＢ活性測定試薬を使用すれば、ｍＣＫ活性のみならず、ＣＫ−ＭＢ活性をも求めることができる。
【００３８】
さらに、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法において、抗ｍＣＫ阻害抗体を用いて試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定を行い（測定値Ｃ）、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ｍＣＫ阻害抗体とを用いてｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、および１／２ＣＫ−ＭＢ以外のＣＫ活性の測定を行い（測定値Ｄ）、測定値Ｃと測定値Ｄの２倍の値との差により、ＣＫ−ＭＭ活性を求めることができる。
【００３９】
本発明の方法により測定される試料は特に制限はないが、通常臨床検査の分野で行われているＣＫアイソザイムが測定されている方法や試料に適用しうる。
【００４０】
また本発明は、本発明のＣＫアイソザイム測定法、ＣＫ−ＭＢ測定法、ｍＣＫ測定法に必要な試薬をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム活性測定用試薬を提供する。本発明のＣＫアイソザイム活性測定用試薬は、本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体を試薬中に含むかまたは単品として構成してなる。ここでいう試薬には、全ＣＫ活性測定試薬や、急性心筋梗塞の生化学的診断に用いられているＣＫ−ＭＢ測定用試薬を、その一部として利用できるがこれに限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
（１）免疫原（抗原）の調製
ヒトｍＣＫはヒト心筋組織を用い、Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｏｂｅｒｔｓら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５５巻、２８７０〜２８７７項、１９８０、およびＡｎｎ Ｍｅｒｚ Ｇｒａｃｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５８巻、１５３４６〜１５３５４項、１９８３に記載されている方法により精製した。４００ｇのヒト心筋より約１０ｍｇの精製ヒトｍＣＫが得られた。これを使用するまで凍結保存した。
【００４２】
（２）被免疫動物
５〜８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
【００４３】
（３）免疫方法
上記（１）で調製した精製ヒトｍＣＫを抗原として用い、１００μｇ／０．５ｍＬとなる様にＰＢＳで調製し、同量（０．５ｍＬ）のフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ社製）を混合して乳化した。この乳化状の抗原を、５週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に１匹あたり２００μＬ投与した。さらに２週間毎に、Ｒｉｂｉアジュバントにて１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原をマウス当たり２０μｇずつ４回投与した。さらに１ヶ月の後Ｒｉｂｉアジュバントで１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに２週間後、抗原である精製ヒトｍＣＫをＰＢＳで１００μｇ／ｍＬに調製し、マウス尾静脈より注射して最終免疫した。
【００４４】
（４） 抗体価測定（抗体価アッセイ）
抗体価の測定に当たっては、定期的にマウス眼底網膜より少量の全血を採取し、血清を分離した後使用直前まで凍結保存した。免疫開始時より、ヒトｍＣＫに対する抗体価をｍＣＫ酵素活性阻害抗体法により調べた。
【００４５】
すなわち、各マウスの抗血清をＰＢＳで１０〜１，０００倍希釈して調製した抗体液２５μＬと２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭ アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ ＨＫ、２Ｕ／ｍＬ グルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとして抗血清の代わりに非免疫マウス血清を添加し、陰性コントロールとした。
【００４６】
得られた吸光度から、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体が血液中に産生されていればｍＣＫの酵素活性が阻害され基質反応が抑制されて吸光度の変化量が低くなるため、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体の存在を特定することができた。
【００４７】
（５） 反応特異性の検討
得られた抗ｍＣＫ酵素活性阻害ポリクローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを至適濃度に加えた酵素液をそれぞれ調製し、上記（４）と同様の方法により各ＣＫアイソザイムに対する酵素活性阻害を確認した。
【００４８】
（６）細胞融合
最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄した後、細胞数を算定し、７．０×１０８個の脾細胞を得た。
【００４９】
細胞融合は、８−アザグアニン（２−ａｍｉｎｏ−６−ｏｘｙ−８ａｚａｐｕｒｉｎｅ） 耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫培養細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞株として用いた。
【００５０】
Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）１０％を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（２０μｇ／ｍＬ，８−アザグアニン含有）で継代培養した。細胞融合の３日前より８−アザグアニンを含有しない１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定し、７×１０７個の生細胞を得た。
【００５１】
ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、ポリエチレングリコール−４０００が５０（Ｗ／Ｖ）％濃度となるように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞との比が１０：１となるように混合し、ケーラーおよびミルシュタイン共著：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻，４９５−４９７，１９７５）およびヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６巻，５１１−５１９，１９７６年）の方法に準じて細胞融合を行った。
【００５２】
その後、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液に、１×１０−４Ｍ のヒポキサンチン、４×１０−７Ｍのアミノプテリンおよび１．６×１０−５Ｍ のチミジン（ＨＡＴ）を含有するＨＡＴ選択培地に、脾細胞が２．０×１０６個／ｍＬとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を５０μＬずつ、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ２無菌培養器において温度３７℃、湿度９５％、８％のＣＯ２ 雰囲気で培養を行なった。培養開始後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択培地を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約１０日〜２週間後に、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを下記に記載したスクリーニング方法によって選別した。
【００５３】
（７）スクリーニング
上記ハイブリドーマの培養上清を用いて、ｍＣＫ酵素活性阻害による方法により実施した。
【００５４】
すなわち、２５μＬのハイブリドーマ培養上清と２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭ アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ ＨＫ、２Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養液のみを添加し、陰性コントロールとした。
【００５５】
得られた吸光度から、ｍＣＫの酵素活性を阻害する抗体が存在した場合には基質反応が抑制されるため吸光度の変化量が低くなるので、ｍＣＫに対する阻害抗体を産生しているハイブリドーマを特定することができた。
【００５６】
得られた抗ヒトｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを用い、上記と同様の方法により各酵素に対する酵素活性阻害を確認した。
上記（７）のスクリーニング方法により、ハイブリドーマの増殖が認められた９６穴マイクロタイタープレートの２４９６穴についてスクリーニングを実施し、１０穴についてｍＣＫ酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの存在が認められた。
【００５７】
（８）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の樹立（クローニング）
上記（７）のスクリーニングにより得られた１０穴中のハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。その結果、上記１０穴中のハイブリドーマの内、安定にｍＣＫ酵素活性阻害を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を１クロ−ン選択した。このハイブリドーマを樹立株とし、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００５８】
（９）マウスイムノグロブリンサブクラスの同定
上記、クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマ クローン（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３）の産生するモノクローナル抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）社製 モノアブタイピングキット（ＭＯＮＯＡｂ ｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ）を使用して同定した。その結果ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３が産生するモノクローナル抗体（ ｍＣＫＩ−５７８）はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ１，κ）であることが判明した。
【００５９】
（１０） ｍＣＫＩ−５７８のヒトＣＫアイソザイムに対する特異性
得られた抗体ｍＣＫＩ−５７８の、ヒトＣＫアイソザイムに対する特異性を確認するため、ヒトｍＣＫ、ヒトＣＫ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒトＣＫ−ＭＢを用い、上記（７）と同様の方法により各アイソザイムに対する酵素活性阻害を確認した。
その結果を表１に示した。ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫの酵素活性を約９０％阻害したが、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣＫ−ＭＢの酵素活性は阻害しなかった。従って、ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫのみを特異的に認識し、ｍＣＫ酵素活性を選択的に阻害する抗体であることが確認された。一方、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３と同様に作製された別のハイブリドーマ クローンから産生されたＣＫ−１７７３はいずれのＣＫアイソザイムも阻害しなかった。
【００６０】
【表１】
モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の特異性
【００６１】
（１１）ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害活性
ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害能を上記（７）と同様の方法で検討したところ、図１に示すように約９８％の阻害が認められた。
【００６２】
【実施例２】
実施例１で得られたｍＣＫＩ−５７８を用いたＣＫ−ＭＢ測定
ヒト健常人検体またはヒトｍＣＫ陽性検体１００μｌに生理食塩水、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）、抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）または２つの抗体を混合したものを各々１０μｌ加えて電気泳動を行った。電気泳動はポルＥフィルムシステム（アガロース電気泳動）を使用し、４０分間泳動した。泳動後、ＣＫ発色試薬〔１００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’−五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２０ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍｌヘキソキナーゼ、２Ｕ／ｍｌグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸、１ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、３Ｕ／ｍｌのダイアフォラーゼ、ＰＨ６．６〕を泳動したゲルに染み込ませて３７℃で３０分間インキュベートした。５％酢酸水溶液で反応を停止し、精製水で洗浄後、ゲルを乾燥させてコピーした。抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体だけではｍＣＫを阻害できないため、ｍＣＫもＣＫ−ＭＢとして測定されてしまうが、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）を併用して使用することによりＣＫ−ＭＢが特異的に測定されることが示唆された。
【００６３】
【実施例３】
ｍＣＫＩ−５７８を用いた筋肉疾患患者検体のＣＫ−ＭＢ測定
測定用酵素液（１４０ｍＭイミダゾール、２．８ｍＭ ＥＤＴＡ、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８ｍＭアデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、７ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、１４μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、４２ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、４．２Ｕ／ｍｌ ヘキソキナーゼ、２．１Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ、ｐＨ６．６）に抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）１．０Ｕ／ｍｌ添加したもの（対照法）とさらに１Ｕ／ｍｌの抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）を添加したもの（本発明）を調製した。ＣＫ活性が３００Ｕ／Ｌ以上の筋肉疾患検体１５例について、血清２０μｌに、本発明の抗体を添加していない上記測定用酵素液を２５０μｌ加えて３７℃で恒温とした後、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ａ）。さらに、これに基質液として１５０ｍＭクレアチンリン酸二ナトリウム１００μｌを添加し２〜３分後より吸光度変化を測定した（Ｂ）。ＣＫ−ＭＢ活性は以下の計算式（数１）により算出した。次に、同一検体について、本発明の抗体を添加した測定用酵素液を用いて同様に操作し、ＣＫ活性を測定した。
【００６４】
【数１】
２※： ＣＫ−Ｂ活性をＣＫ−ＭＢ活性に変換するファクター
【００６５】
この結果、筋肉疾患患者検体は従来行われていた対照法では急性心筋梗塞患者検体でないにもかかわらず１０検体が２５Ｕ／Ｌ以上の活性を示した。しかしながら、本発明においてはすべての検体が２５Ｕ／Ｌ以下となった（表２）。
【００６６】
【表２】
【００６７】
以上の結果より、本発明はＣＫ−ＭＢの非特異反応を減少させることにより急性心筋梗塞に対する早期マーカーとして従来よりも感度が高くなることが期待される。
【００６８】
【発明の効果】
本発明の抗ヒトｍＣＫ阻害モノクローナル抗体を用いたＣＫアイソザイム分別定量法により、従来の測定方法では不可能であった、ＣＫ−ＭＢ、ｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢの選択的かつ正確な定量が可能となった。特にＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーであり、本発明のＣＫ−ＭＢ測定法により急性心筋梗塞の重篤度や病態の把握が確度高く迅速に行えるので、急性心筋梗塞における早期診断のみならずその治療のモニターなどの臨床検査上、本発明は大きな意義を持つ。
また、ｍＣＫは肝疾患、悪性腫瘍、ロタウイルス腸炎などで増加することが知られており、本発明はこれら疾患の診断に有用である。
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の、サルコメラｍＣＫに対する阻害能を示す図面である。
【発明の属する技術分野】
本発明はミトコンドリアクレアチンキナーゼ（ｍＣＫ）の活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体を用いたクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の測定法および測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）は遺伝子を異にする３つの蛋白が存在する。細胞質に由来する２種類の蛋白（局在により筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ型））ともう一つはミトコンドリアに由来する蛋白である。細胞質由来のＣＫアイソザイムはＭ型とＢ型との組み合わせによりなる２量体で構成され、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの３種類に分類される。ミトコンドリアＣＫ（ｍＣＫ）は、偏在型のユビキタス（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）Ｍｉａ−ＣＫとサルコメリック（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ）Ｍｉｂ−ＣＫのアイソフォームが組織特異的に合成される。
【０００３】
また、ｍＣＫは８量体で極めて安定的に存在するが、クレアチン、ＭｇＡＤＰおよび硝酸塩の遷移状態類似物質複合体の存在下では、数分のうちに２量体に加速的に解離する。また、血液中では時間と共に徐々に２量体になると言われている（Ｋａｒｉｎ Ｆｒｉｔｚ−Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３８１，３４１−３４５，１９９６）。
【０００４】
これらアイソザイムの電気泳動の移動度は陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｍＣＫ（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしまう。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリンが結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免疫向流法などによりザイモグラムから確認することができる。
【０００５】
臨床検査においてはＣＫ、ＣＫアイソザイムの定量が広く行われている。中でもＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量はＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法などにより行われている。ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定できる反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動法は操作が煩雑で熟練を要する上に、結果を出すまでにデンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要があり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により迅速簡便に測定ができる利点があるが特異性に欠ける欠点を有していた。
【０００６】
しかし現状では、急性心筋梗塞の早期診断が求められる為、迅速簡便に測定ができる免疫阻害法が広く使用されている。この方法は、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する特異抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体ということもある）を用いてＭサブユニットを失活させ、残存するＢサブユニット活性を測定するものである。この方法だと、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣＫ（２量体＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−ＢＢは、血中にほとんど存在しないため無視できるし、ＣＫ−ＢＢが逸脱する疾患も少ない。しかし、ｍＣＫは健常者の血清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれており（豊田陽子 他：生物物理化学，４１，２４４，１９９７、星野忠 他：小児を対象としたＣＫアイソザイム分画の年齢別推移に関する検討．生物物理化学，４２補冊２，２１，１９９８）、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性腫瘍などでｍＣＫの逸脱が起こり結果の判定を混乱させる。 最近では、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死などでもｍＣＫの逸脱が起こることが報告されている（星野忠 他：臨床病理，４６，総会号，５７，１９９８、金光房江 他：臨床病理，４６，総会号，５６，１９９８）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来の免疫阻害法は、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ‐ＭＢを測定するものであり、簡便で迅速に測定できるが、この方法だとｍＣＫも同時に測定してしまい、正確なＣＫ−ＭＢの測定は期待できない。しかし、ｍＣＫを阻害する抗体および抗ＣＫ‐Ｍ阻害抗体を添加することにより、ｍＣＫの影響を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定が可能となる。そこで本発明の目的は、免疫阻害法によるＣＫ‐ＭＢ測定法において、ｍＣＫの影響を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、たとえば哺乳動物をｍＣＫで免疫して得られた抗血清や、免疫した各種動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞との細胞融合により作製したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、前記目的を達成せしめる抗体を得て本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）免疫阻害法によりクレアチンキナーゼ（ＣＫ）ＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の酵素活性を測定する方法であって、ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体およびクレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体を用いて検体を処理し、ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性およびｍＣＫの酵素活性を阻害する処理がなされた検体中に残存するクレアチンキナーゼＢ（ＣＫ−Ｂ）サブユニットの酵素活性を測定し、測定されたＣＫ−Ｂサブユニットの酵素活性からＣＫ−ＭＢの酵素活性を求めることを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（２）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない（１）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定方法、
（３）ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を一つの工程中で同時に作用させることを特徴とする（１）または（２）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（４）ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を別々の工程で作用させることを特徴とする（１）または（２）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（５）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする（１）〜（４）の何れか１項に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（６）（１）記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法に用いるＣＫ−ＭＢ活性測定試薬であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
（７）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない（６）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
（８）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする（６）または（７）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害抗体（抗ｍＣＫ阻害抗体とよぶこともある）は、ｍＣＫ蛋白質を特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、後述する本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法に使用できるが、このＣＫアイソザイムの分別定量法において実質的にｍＣＫ以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍＣＫを阻害できれる抗体であればよく、ｍＣＫを６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上阻害する抗体であり得る。ｍＣＫは多くの場合、試料中に５〜２０Ｕ／Ｌ含まれており、８０％以上のｍＣＫ阻害能を有すれば臨床上問題なく使用可能である。ｍＣＫ阻害能の低い抗体であっても、複数の抗体を組み合わせて使用する、またはｍＣＫを阻害しうる化合物と共に使用することにより、実質的に８０％以上の阻害効果を得ることができるので、本発明の範囲に含まれる。また、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００１１】
具体的には例えば、本発明の抗体は、ヒトｍＣＫを特異的に認識して阻害しうるモノクローナル抗体であって、マウス由来かつイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスのｍＣＫＩ−５７８と命名された抗体であり、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により平成１２年４月１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体である。ｍＣＫＩ−５７８は、試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に８０％以上阻害することができる。また、ｍＣＫＩ−５７８は、少なくともサルコメラｍＣＫを９０％以上阻害する。本発明の抗体は、この具体例に限定されるものではなく、ヒトｍＣＫを特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害しうる抗体であればよい。また、本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体は、ｍＣＫ酵素活性を阻害する目的で使用する時、単独で用いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００１２】
本発明の抗体の由来である動物種はマウスに限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスである。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されるものではなく、ＩｇＭなどでもよい。
【００１３】
本発明の抗体は、従来公知の免疫学的手法を用いて、例えば抗原としてｍＣＫを用い、好ましくはアジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動物の血清などから得ることができる。モノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融合することにより、具体的には以下に記載する方法で作製することができる。
【００１４】
抗原としては、目的とする特異性によっても異なるが、ｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を阻害する抗体を得る場合には、ヒトまたは哺乳類のｍＣＫが用いられるが、特異性を高めるためには種特異的な抗原を用いることが好ましい。ヒトｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を特異的に阻害する抗体を得る場合には、抗原として好ましくはヒトｍＣＫを用いる。当該抗原は、ｍＣＫを心筋組織や血液などから精製することにより調製できるし、また遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
【００１５】
感作抗原としては、精製したｍＣＫ蛋白質、またはそのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法により発現させたｍＣＫ蛋白質やその部分ペプチドをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解、あるいは懸濁したものが用いられる。抗原液は通常抗原物質を５０〜５００μｇ／ｍＬ程度含む濃度に調製すればよい。また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に架橋して用いることが好ましい。当該抗原で免疫感作する動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【００１６】
このとき、被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投与することが好ましい。ここで用いられるアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）。百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使用する組合せが特に好ましい。
【００１７】
免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無などにより、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。当該抗原溶液をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多くして、腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
【００１８】
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒトなど由来のものが使用される。例えばマウスミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３などの株化骨髄腫細胞が例示される。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、好ましくは免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３やＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４などを用いることが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞の維持は、凍結保存するか、またはウマ、ウサギもしくはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養することにより行われる。また細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。
【００１９】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１，０００〜６，０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄しＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート中に播種して培養を続ける。
【００２０】
融合操作後の細胞は選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換することによって開始し、さらに２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウエルを確認する。
【００２１】
生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取して抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応させれば、該上清中に産生されている抗体を検出することができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗体の検出および抗体価の測定を行うことができる。このように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な抗体を産生しているハイブリドーマを得る。
【００２２】
さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈して培養することにより目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ クローンを単離することができる。得られた抗体産生ハイブリドーマ クローンは、約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）あるいはグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍結させて−７０〜−１９６℃で保存すると、約半年〜半永久的に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温槽中で急速に融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ましい。
【００２３】
ハイブリドーマが産生する抗体の免疫グロブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより知ることができる。
【００２４】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選択して用いる。例えば、該ハイブリドーマを移植したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数ｍｇ／ｍＬの高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。細胞培養によるモノクローナル抗体の取得は、抗体産生量はインビボより低いが、マウス腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。
【００２５】
抗体をハイブリドーマを移植したマウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約１０６個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。
【００２６】
一方、細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法などの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくすることが望ましい。または、ハイブリドーマを常法により無血清培地に馴化し、無血清培地を用いて培養すれば、抗体精製が容易になるので、より好ましい。
【００２７】
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などを応用することで、容易に達成される。
【００２８】
さらに、モノクローナル抗体が、マウスＩｇＧである場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合単体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製することが可能であり、簡便である。
【００２９】
かくして得られた本発明のモノクローナル抗体は試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害できる。従って、本抗体を用いることにより、試料中のｍＣＫを選択的に排除することができ、ＣＫ−Ｍサブユニットを選択的に排除せしめる抗体と共に使用することで、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムであるＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢおよびｍＣＫを分別定量することが可能となる。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体で処理することにより、ｍＣＫを排除することを特徴とするクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定量法を提供する。本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体は、単独で用いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００３０】
ＣＫアイソザイム測定法の基本原理は、免疫阻害法によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法を利用する。一般に、例えばこの方法によるＣＫ−ＭＢの活性測定は次のようにして行われている。すなわち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活性阻害抗体を使用し、試料中のＣＫ−ＭＭおよびＭＢ中のＭサブユニット活性（ＭＢは約半分の活性が阻害される）を阻害したのち、残存するＢサブユニット活性を２倍することによりＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−ＭＢ活性の測定は、下述の反応式（化１）の左行反応によって生成するＡＴＰを、さらにヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）からなる共役反応によりＮＡＤＰＨを生成させ、ＮＡＤＰＨの量的変化を定量することにより行う（化２）。
【００３１】
【化１】
【化２】
従来法では、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体のみを用いてＣＫ−ＭＢの測定を行っていたため、ｍＣＫも同時に測定され正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定が期待できなかったが、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法において、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットおよびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処理することにより選択的に排除する処理をした後、残存するＣＫ活性を測定すれば、実用上十分に正確なＣＫ−ＭＢ測定を簡便迅速に実施できる。
【００３４】
上記本発明のＣＫ−ＭＢ測定法では、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体および本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体とを同一の工程中、例えば測定用酵素液中、で作用させてもよいし、別々の工程で、例えば本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を基質液に添加し、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体は測定用酵素液中で、作用させてもよい。
活性測定を目的とするアイソザイムがＣＫ−ＭＢの場合は、好ましくは同時に、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体および本発明で得た抗ｍＣＫ阻害抗体で試料を処理して測定を行うのが簡便でよい
【００３５】
さらに本発明は、抗ｍＣＫ阻害抗体で試料を処理することによりｍＣＫの酵素活性を選択的に排除することを特徴とするｍＣＫ測定法を提供する。すなわち、本発明のｍＣＫ測定法においては、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とを行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性のみを求めることができる。この時、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とは、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体などを含んでいる測定用試薬を使用して行ってもよいし、含んでいない測定用試薬を使用して行ってもよい。２つの測定において使用する測定用試薬が抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体の含有に関して同条件であれば問題はない。
【００３６】
例えば、試料中の全ＣＫ活性を測定し、測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定を行い、得られた２つの測定値の差によりｍＣＫ活性を求めることができる。この時、試料をまず抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いて処理しＣＫ−ＭＭ活性とＣＫ−ＭＢの約半分の活性とを阻害したのちに一旦測定を行って、１／２ＣＫ−ＭＢ＋ｍＣＫ酵素活性を測定し（測定値Ａ）、測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定を行い、１／２ＣＫ−ＭＢ酵素活性（測定値Ｂ）を測定することにより、ｍＣＫ活性のみならずＣＫ−ＭＢ活性を同一試料を用いて同時に簡便迅速に測定できる。すなわち、ＣＫ−ＭＢ活性は測定値Ｂを２倍することにより求めることができるし、ｍＣＫ活性は測定値Ａと測定値Ｂとの差により求めることができる。
【００３７】
また例えば、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とを別々に行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることもできる。すなわち、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性を例えば全ＣＫ活性測定試薬（キットＡ）を用いて測定し、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性を別に調製した抗ｍＣＫ阻害抗体をキットＡに添加したキットＢを用いて測定を行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることができる。この時、キットＡとして抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を添加したＣＫ−ＭＢ活性測定試薬を使用すれば、ｍＣＫ活性のみならず、ＣＫ−ＭＢ活性をも求めることができる。
【００３８】
さらに、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法において、抗ｍＣＫ阻害抗体を用いて試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定を行い（測定値Ｃ）、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ｍＣＫ阻害抗体とを用いてｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、および１／２ＣＫ−ＭＢ以外のＣＫ活性の測定を行い（測定値Ｄ）、測定値Ｃと測定値Ｄの２倍の値との差により、ＣＫ−ＭＭ活性を求めることができる。
【００３９】
本発明の方法により測定される試料は特に制限はないが、通常臨床検査の分野で行われているＣＫアイソザイムが測定されている方法や試料に適用しうる。
【００４０】
また本発明は、本発明のＣＫアイソザイム測定法、ＣＫ−ＭＢ測定法、ｍＣＫ測定法に必要な試薬をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム活性測定用試薬を提供する。本発明のＣＫアイソザイム活性測定用試薬は、本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体を試薬中に含むかまたは単品として構成してなる。ここでいう試薬には、全ＣＫ活性測定試薬や、急性心筋梗塞の生化学的診断に用いられているＣＫ−ＭＢ測定用試薬を、その一部として利用できるがこれに限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
（１）免疫原（抗原）の調製
ヒトｍＣＫはヒト心筋組織を用い、Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｏｂｅｒｔｓら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５５巻、２８７０〜２８７７項、１９８０、およびＡｎｎ Ｍｅｒｚ Ｇｒａｃｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５８巻、１５３４６〜１５３５４項、１９８３に記載されている方法により精製した。４００ｇのヒト心筋より約１０ｍｇの精製ヒトｍＣＫが得られた。これを使用するまで凍結保存した。
【００４２】
（２）被免疫動物
５〜８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
【００４３】
（３）免疫方法
上記（１）で調製した精製ヒトｍＣＫを抗原として用い、１００μｇ／０．５ｍＬとなる様にＰＢＳで調製し、同量（０．５ｍＬ）のフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ社製）を混合して乳化した。この乳化状の抗原を、５週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に１匹あたり２００μＬ投与した。さらに２週間毎に、Ｒｉｂｉアジュバントにて１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原をマウス当たり２０μｇずつ４回投与した。さらに１ヶ月の後Ｒｉｂｉアジュバントで１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに２週間後、抗原である精製ヒトｍＣＫをＰＢＳで１００μｇ／ｍＬに調製し、マウス尾静脈より注射して最終免疫した。
【００４４】
（４） 抗体価測定（抗体価アッセイ）
抗体価の測定に当たっては、定期的にマウス眼底網膜より少量の全血を採取し、血清を分離した後使用直前まで凍結保存した。免疫開始時より、ヒトｍＣＫに対する抗体価をｍＣＫ酵素活性阻害抗体法により調べた。
【００４５】
すなわち、各マウスの抗血清をＰＢＳで１０〜１，０００倍希釈して調製した抗体液２５μＬと２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭ アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ ＨＫ、２Ｕ／ｍＬ グルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとして抗血清の代わりに非免疫マウス血清を添加し、陰性コントロールとした。
【００４６】
得られた吸光度から、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体が血液中に産生されていればｍＣＫの酵素活性が阻害され基質反応が抑制されて吸光度の変化量が低くなるため、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体の存在を特定することができた。
【００４７】
（５） 反応特異性の検討
得られた抗ｍＣＫ酵素活性阻害ポリクローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを至適濃度に加えた酵素液をそれぞれ調製し、上記（４）と同様の方法により各ＣＫアイソザイムに対する酵素活性阻害を確認した。
【００４８】
（６）細胞融合
最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄した後、細胞数を算定し、７．０×１０８個の脾細胞を得た。
【００４９】
細胞融合は、８−アザグアニン（２−ａｍｉｎｏ−６−ｏｘｙ−８ａｚａｐｕｒｉｎｅ） 耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫培養細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞株として用いた。
【００５０】
Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）１０％を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（２０μｇ／ｍＬ，８−アザグアニン含有）で継代培養した。細胞融合の３日前より８−アザグアニンを含有しない１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定し、７×１０７個の生細胞を得た。
【００５１】
ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、ポリエチレングリコール−４０００が５０（Ｗ／Ｖ）％濃度となるように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞との比が１０：１となるように混合し、ケーラーおよびミルシュタイン共著：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻，４９５−４９７，１９７５）およびヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６巻，５１１−５１９，１９７６年）の方法に準じて細胞融合を行った。
【００５２】
その後、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液に、１×１０−４Ｍ のヒポキサンチン、４×１０−７Ｍのアミノプテリンおよび１．６×１０−５Ｍ のチミジン（ＨＡＴ）を含有するＨＡＴ選択培地に、脾細胞が２．０×１０６個／ｍＬとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を５０μＬずつ、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ２無菌培養器において温度３７℃、湿度９５％、８％のＣＯ２ 雰囲気で培養を行なった。培養開始後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択培地を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約１０日〜２週間後に、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを下記に記載したスクリーニング方法によって選別した。
【００５３】
（７）スクリーニング
上記ハイブリドーマの培養上清を用いて、ｍＣＫ酵素活性阻害による方法により実施した。
【００５４】
すなわち、２５μＬのハイブリドーマ培養上清と２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭ アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ ＨＫ、２Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養液のみを添加し、陰性コントロールとした。
【００５５】
得られた吸光度から、ｍＣＫの酵素活性を阻害する抗体が存在した場合には基質反応が抑制されるため吸光度の変化量が低くなるので、ｍＣＫに対する阻害抗体を産生しているハイブリドーマを特定することができた。
【００５６】
得られた抗ヒトｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを用い、上記と同様の方法により各酵素に対する酵素活性阻害を確認した。
上記（７）のスクリーニング方法により、ハイブリドーマの増殖が認められた９６穴マイクロタイタープレートの２４９６穴についてスクリーニングを実施し、１０穴についてｍＣＫ酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの存在が認められた。
【００５７】
（８）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の樹立（クローニング）
上記（７）のスクリーニングにより得られた１０穴中のハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。その結果、上記１０穴中のハイブリドーマの内、安定にｍＣＫ酵素活性阻害を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を１クロ−ン選択した。このハイブリドーマを樹立株とし、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００５８】
（９）マウスイムノグロブリンサブクラスの同定
上記、クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマ クローン（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３）の産生するモノクローナル抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）社製 モノアブタイピングキット（ＭＯＮＯＡｂ ｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ）を使用して同定した。その結果ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３が産生するモノクローナル抗体（ ｍＣＫＩ−５７８）はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ１，κ）であることが判明した。
【００５９】
（１０） ｍＣＫＩ−５７８のヒトＣＫアイソザイムに対する特異性
得られた抗体ｍＣＫＩ−５７８の、ヒトＣＫアイソザイムに対する特異性を確認するため、ヒトｍＣＫ、ヒトＣＫ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒトＣＫ−ＭＢを用い、上記（７）と同様の方法により各アイソザイムに対する酵素活性阻害を確認した。
その結果を表１に示した。ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫの酵素活性を約９０％阻害したが、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣＫ−ＭＢの酵素活性は阻害しなかった。従って、ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫのみを特異的に認識し、ｍＣＫ酵素活性を選択的に阻害する抗体であることが確認された。一方、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３と同様に作製された別のハイブリドーマ クローンから産生されたＣＫ−１７７３はいずれのＣＫアイソザイムも阻害しなかった。
【００６０】
【表１】
モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の特異性
（１１）ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害活性
ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害能を上記（７）と同様の方法で検討したところ、図１に示すように約９８％の阻害が認められた。
【００６２】
【実施例２】
実施例１で得られたｍＣＫＩ−５７８を用いたＣＫ−ＭＢ測定
ヒト健常人検体またはヒトｍＣＫ陽性検体１００μｌに生理食塩水、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）、抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）または２つの抗体を混合したものを各々１０μｌ加えて電気泳動を行った。電気泳動はポルＥフィルムシステム（アガロース電気泳動）を使用し、４０分間泳動した。泳動後、ＣＫ発色試薬〔１００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’−五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２０ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍｌヘキソキナーゼ、２Ｕ／ｍｌグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸、１ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、３Ｕ／ｍｌのダイアフォラーゼ、ＰＨ６．６〕を泳動したゲルに染み込ませて３７℃で３０分間インキュベートした。５％酢酸水溶液で反応を停止し、精製水で洗浄後、ゲルを乾燥させてコピーした。抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体だけではｍＣＫを阻害できないため、ｍＣＫもＣＫ−ＭＢとして測定されてしまうが、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）を併用して使用することによりＣＫ−ＭＢが特異的に測定されることが示唆された。
【００６３】
【実施例３】
ｍＣＫＩ−５７８を用いた筋肉疾患患者検体のＣＫ−ＭＢ測定
測定用酵素液（１４０ｍＭイミダゾール、２．８ｍＭ ＥＤＴＡ、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８ｍＭアデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、７ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、１４μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、４２ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、４．２Ｕ／ｍｌ ヘキソキナーゼ、２．１Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ、ｐＨ６．６）に抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）１．０Ｕ／ｍｌ添加したもの（対照法）とさらに１Ｕ／ｍｌの抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）を添加したもの（本発明）を調製した。ＣＫ活性が３００Ｕ／Ｌ以上の筋肉疾患検体１５例について、血清２０μｌに、本発明の抗体を添加していない上記測定用酵素液を２５０μｌ加えて３７℃で恒温とした後、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ａ）。さらに、これに基質液として１５０ｍＭクレアチンリン酸二ナトリウム１００μｌを添加し２〜３分後より吸光度変化を測定した（Ｂ）。ＣＫ−ＭＢ活性は以下の計算式（数１）により算出した。次に、同一検体について、本発明の抗体を添加した測定用酵素液を用いて同様に操作し、ＣＫ活性を測定した。
【００６４】
【数１】
【００６５】
この結果、筋肉疾患患者検体は従来行われていた対照法では急性心筋梗塞患者検体でないにもかかわらず１０検体が２５Ｕ／Ｌ以上の活性を示した。しかしながら、本発明においてはすべての検体が２５Ｕ／Ｌ以下となった（表２）。
【００６６】
【表２】
以上の結果より、本発明はＣＫ−ＭＢの非特異反応を減少させることにより急性心筋梗塞に対する早期マーカーとして従来よりも感度が高くなることが期待される。
【００６８】
【発明の効果】
本発明の抗ヒトｍＣＫ阻害モノクローナル抗体を用いたＣＫアイソザイム分別定量法により、従来の測定方法では不可能であった、ＣＫ−ＭＢ、ｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢの選択的かつ正確な定量が可能となった。特にＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーであり、本発明のＣＫ−ＭＢ測定法により急性心筋梗塞の重篤度や病態の把握が確度高く迅速に行えるので、急性心筋梗塞における早期診断のみならずその治療のモニターなどの臨床検査上、本発明は大きな意義を持つ。
また、ｍＣＫは肝疾患、悪性腫瘍、ロタウイルス腸炎などで増加することが知られており、本発明はこれら疾患の診断に有用である。
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の、サルコメラｍＣＫに対する阻害能を示す図面である。
Claims (8)
- 免疫阻害法によりクレアチンキナーゼ（ＣＫ）ＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の酵素活性を測定する方法であって、ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体およびクレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体を用いて検体を処理し、ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性およびｍＣＫの酵素活性を阻害する処理がなされた検体中に残存するクレアチンキナーゼＢ（ＣＫ−Ｂ）サブユニットの酵素活性を測定し、測定されたＣＫ−Ｂサブユニットの酵素活性からＣＫ−ＭＢの酵素活性を求めることを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定法。
- 前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない請求項１に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
- ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を一つの工程中で同時に作用させることを特徴とする請求項１または２に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
- ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を別々の工程で作用させることを特徴とする請求項１または２に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
- 前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法。
- 請求項１記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法に用いるＣＫ−ＭＢ活性測定試薬であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
- 前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない請求項６に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
- 前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６または請求項７に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬。
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