JP2002065266A

JP2002065266A - 気道特異的トリプシン様酵素およびその利用法

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Publication number: JP2002065266A
Application number: JP2000257105A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Eguchi; 広志江口; Satoshi Yamamura; 聡山村; Reiko Mita; 麗子三田
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2002-03-05

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ヒト気道トリプシン様酸素（ＡＳＴ）活性を
阻害、或いはＡＳＴによるプロテアーゼ活性化受容体
（ＰＡＲ）活性化を阻害する化合物やポリペプチドのス
クリーニング方法、更に生体内及び生体より得られた細
胞や試料中のＡＳＴの測定方法の提供。又、ＡＳＴの活
性化に起因する疾患の治療薬の提供。【解決手段】ヒトもしくはマウス由来の特定のアミノ
酸配列の全部もしくは一部からなる蛋白又はヒト由来の
特定のアミノ酸配列と６６％以上のホモロジーを有する
蛋白であって、プロペプチド部分とトリプシン様蛋白部
分とがジスルフィド結合で連結されているＡＳＴ。それ
らをコードする核酸。それらに結合する抗体。かかる抗
体を用いてＡＳＴを測定する方法。更には測定対象化合
物もしくはポリペプチドのＡＳＴ阻害活性、或いはＡＳ
ＴによるＰＡＲ活性化の阻害活性を測定する方法。阻害
ポリペプチドを主薬効成分とする治療薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規に明らかにされ
た気道特異的トリプシン様酵素蛋白構造、および該酵素
のプロテアーゼ活性化受容体活性化作用に基づく、気道
特異的トリプシン様酵素活性あるいは該酵素のＰＡＲ活
性化能の検出もしくは測定系を用いた、化合物あるいは
ポリペプチド（蛋白および抗体を含む）の阻害活性検出
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒトの慢性気道炎症患者の喀痰中
からヒト気道トリプシン様酵素（以下、「気道特異的ト
リプシン様酵素」または「ＡＳＴ」（ＡｉｒｗａｙＳ
ｐｅｃｉｆｉｃＴｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅＰｒｏｔ
ｅａｓｅ）という。）が精製され（特開平７−０６７６
４０号公報、Yasuoka S. et al., Am. J. Respir. Cell
Mol. Biol., 16: p300-308, 1997）、そのアミノ酸配列
およびｃＤＮＡ配列が明らかになっている（特開平８−
８９２４６号公報、ＵＳ−５８０４４１０、ＥＰ−６９
９７６３、Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(1
9): 11895-11901, 1998）。

【０００３】この酵素のもつ活性についてはｉｎｖｉ
ｔｒｏでいくつか検討がなされている。粘液繊毛運動に
対する関与をはじめ、ヒト気管支上皮細胞株からのＩＬ
−８、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの産生増強作用
（寺尾紀子ら、１９９８年度日本呼吸器学会）を有する
ことから気道炎症の病態への関与の可能性が考えられ
る。さらに、フィブリノーゲンの分解活性およびプラス
ミノーゲンアクティベーター（プロウロキナーゼ）活性
化作用などの酵素活性（吉永純子ら、１９９８年度病態
と治療におけるプロテアーゼとインヒビター研究会（Co
nference on Proteases and Inhibitors in Pathophysi
ology and Therapeutics））を有していることから気道
粘膜面におけるフィブリン形成を介して抗炎症的に作用
したり、慢性気道疾患ではその病態を修飾している可能
性が想定され、さらに癌転移などに関与している可能性
も考えられている。

【０００４】一方、Ｇ蛋白共役型受容体の一種であるプ
ロテアーゼ活性化受容体（ＰｒｏｔｅａｓｅＡｃｔｉ
ｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＰＡＲ」ともい
う。）は、プロテアーゼによるシグナルを仲介している
受容体であり、１９９１年にヒト血小板に存在するトロ
ンビン受容体（ヒトＰＡＲ−１）がクローニングされた
（Vu U K-H et al., Cell, 64: 1057-1068, 1991）。そ
の後、マウスＰＡＲ−１（Coughlin, S. R., Unpublish
ed, Accession No. L03529, 1992）、ラットＰＡＲ−１
（Runge M. S. et al., J. Biol. Chem., 267: 16975-1
6979, 1992）、マウスＰＡＲ−２（Nystedt S. et al.,
Proc Natl Acad Sci USA, 91: 9208-9212, 1994）、ヒ
トＰＡＲ−２（Bohm S. K., Biochem. J., 314: 1009-1
016, 1996）、ラットＰＡＲ−２（Saifeddine M. et a
l., Br. J. Pharmacol., 118(3):521-530, 1996）、ヒ
トおよびマウスＰＡＲ−３（Ishihara H. et al., Natu
re,386: 502-506, 1997）、マウスＰＡＲ−４（Kahn M.
L. et al., Nature, 394:690-694, 1998）、ヒトＰＡＲ
−４（Xu W-F et al., Proc Natl Acad Sci USA,95: 66
42-6646, 1998）などがこれまでにクローニングされて
いる。ＰＡＲ−１およびＰＡＲ−２に関しては炎症反応
など様々な病態に関与しているという報告がこれまでに
多数なされている（Dery O. et al., Am. J. Physiol.,
274: C1429-C1452, 1998）。

【０００５】ＰＡＲ−２の活性化に関しては、トリプシ
ン（Nystedt S. et al., Proc NatlAcad Sci USA, 91:
9208-9212, 1994）およびトリプターゼ（Schwartz,L.B.
etal., J. Immunol., 126: 1290-1294, 1981）がＰＡ
Ｒ２を活性化することが報告されている（Molino M. et
al., J. Biol. Chem., 272: 4043-4049, 1997）。トリ
プシンもしくはＰＡＲ−２アンタゴニストペプチド（Ny
stedt S. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91: 9208-
9212, 1994）はＰＡＲ２を活性化することにより、膵臓
において膵液の分泌（Bohm S. K., Biochem. J., 314:
1009-1016, 1996）やイオンチャネルの活性化（Nguyen
T.D. et al., J. Clin. Invest., 103: 261-269, 199
9）などに関与しているという報告の他、十二指腸の運
動の調節などにも関与しているという報告がある（Kawa
bata A. et al., Br. J. Pharmacol., 128(4): 865-87
2, 1999）。トリプターゼはマストセルから放出され、
４量体としてのみ酵素活性を示し（Schwartz,L.B. et a
l., J. Biol. Chem., 256: 11939-11943, 1981）、皮膚
炎症（Steinhoff M. et al., Exp. Dermatol., 8 : 282
-294, 1999）や肺の炎症（Am. J. Physiol. Lung Cell.
Mol. Physiol., 278:L193-L201, 2000）に関与してい
ることを示唆する報告がなされている。

【０００６】しかし、トリプターゼの作用とＰＡＲ２の
活性化に関しては、まだ不明な点が多く、その他のＰＡ
Ｒ２活性化酵素に関してはまったく未解明である。さら
に気道においてＰＡＲ２を活性化する酵素として、上述
のトリプシノーゲンの気道における存在を示唆する報告
があるが、その活性や存在量に関しては全く不明であ
り、免疫組織染色により反応する蛋白の存在が示されて
いるだけである（CocksT. M. et al., Nature, 398: 15
6-160, 1999）。まして気道特異的にＰＡＲ２を活性化
する酵素が存在することに関しては全くこれまで報告が
無い。

【０００７】本発明者らは、ＡＳＴの精製方法に関して
鋭意検討した結果、活性を有するＡＳＴを喀痰中あるい
は組換え昆虫細胞から効率よく精製する方法を確立し
た。その結果、より多くのＡＳＴの取得が可能となっ
た。この取得された精製蛋白を使用し、アミノ酸配列を
決定した結果、精製されたＡＳＴの活性体の構造が、従
来報告されていたトリプシン様蛋白類似のアミノ酸構造
以外に、プロペプチドとトリプシン様蛋白部分がジスル
フィド結合により連結された構造を有する蛋白構造をも
つ活性体が存在することを初めて明らかにした。また、
この酵素が細気管支上皮細胞や気管支上皮細胞に特異的
に存在することを見出した。さらに該構造を有するＡＳ
ＴがＰＡＲを活性化する能力を有することを発見し、さ
らに研究を進めた結果、本発明に至ったのである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、活性
を有する真の構造のＡＳＴ取得である。また、上述した
蛋白構造を有するＡＳＴによるＰＡＲ活性化を阻害する
薬剤をスクリーニングする方法およびその活性を検出す
るための評価系の構築である。さらに、該構造を有する
ＡＳＴの活性を阻害する化合物またはポリペプチド（蛋
白および抗体を含む）、または該構造を有するＡＳＴの
ＰＡＲ活性化を阻害する化合物またはポリペプチドの評
価系を提供することである。また、該構造の酵素を結合
する抗体を取得し、測定系を構築することにより、炎症
性の疾患や凝固線溶系の異常、癌などの診断を行う手段
を提供することである。

【０００９】すなわち、本発明を利用することにより得
られたＡＳＴ活性を阻害する化合物もしくはポリペプチ
ド、またはＡＳＴによるＰＡＲ活性化を阻害する化合物
もしくはポリペプチドは、ＡＳＴのもつ凝固・線溶系に
おける作用、気道リモデリングへの作用、気道炎症への
作用、線維芽細胞・上皮細胞（繊毛細胞）・平滑筋細胞
・杯細胞の増殖および障害に対する作用、癌の増殖や転
移に関する作用、粘液繊毛運動に対する作用、抗ウイル
ス感染作用等の生理作用を抑制もしくは修飾し、病態に
おける改善および治療に用いることが期待できる。

【００１０】さらにＰＡＲのもつ分泌細胞に対する分泌
促進作用（杯細胞の分泌亢進作用）、上皮細胞あるいは
内皮細胞を介した血管、気道、腸管などの弛緩作用や、
平滑筋に対する収縮作用、線維芽細胞や上皮細胞などの
炎症性サイトカイン産生誘導および増強作用、線維芽細
胞・上皮細胞（繊毛細胞）・平滑筋細胞・杯細胞などの
細胞増殖および障害に対する作用、神経細胞に対する過
敏性の増強作用等の生理作用を抑制もしくは修飾し、病
態における改善および治療に用いることが期待できる。

【００１１】そして、慢性気道炎症（慢性閉塞性肺疾患
（肺気腫、びまん性汎細気管支炎、気管支拡張症を含
む）、喘息）、副鼻腔気管支症候群、線維症、神経過敏
症、凝固線溶系異常による疾患、癌、関節炎、皮膚の炎
症性の疾患のための新しい治療薬スクリーニングの評価
系、診断薬となり得るものである。

【００１２】また、該構造の酵素と結合する抗体、測定
系を用いることにより、上記疾患の新たな診断薬になり
うる。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは昆虫細胞で
ＡＳＴのｃＤＮＡ配列（特開平８−８９２４６号公報、
ＵＳ−５８０４４１０、ＥＰ−６９９７６３、およびYa
maoka K. et al., J.Biol. Chem., 273(19): 11895-119
01, 1998）に基づき、組換えバキュロウイルスベクター
を作製し、組換え蛋白を発現させた。これを実施例１に
示した精製方法により活性を有する蛋白を精製し、活性
蛋白の一次構造を決定した結果、従来報告（特開平７−
０６７６４０号公報、S.Yasuoka et al., Am. J. Respi
r. Cell Mol. Biol., 16: p300-308, 1997）されている
トリプシン類似の構造蛋白（１８７番目のイソロイシン
（Ｉｌｅ）から始まるトリプシン様蛋白部分）以外に、
１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１８６番目のアルギ
ニン（Ａｒｇ）の間のアミノ酸配列からなるプロペプチ
ドの一部の部分配列（具体的には１４５番目のアスパラ
ギン（Ａｓｎ）あるいは１６２番目のアスパラギン酸
（Ａｓｐ）からはじまるプロペプチド部分）がトリプシ
ン様蛋白部分とジスルフィド結合を介して結合している
構造からなる蛋白を含んでおり、本構造蛋白が活性体の
ＡＳＴの主成分であることを発見した。さらに、天然Ａ
ＳＴを喀痰中から精製し、同様にアミノ酸配列を決定し
た結果、やはりプロペプチドの一部の部分配列（具体的
には１７３番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）からはじまる
プロペプチド部分）が１８７番目のイソロイシン（Ｉｌ
ｅ）から始まるトリプシン様蛋白部分とジスルフィド結
合を介して結合する構造蛋白を含有し、本構造をもつＡ
ＳＴが主成分であることを発見した。

【００１４】一方、これまでヒトＡＳＴはヒトに特異的
に存在すると考えられており、ＨＡＴ（ＨｕｍａｎＡ
ｉｒｗａｙＴｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅＰｒｏｔｅａ
ｓｅ）と命名されていた。しかし、本発明者らがいくつ
かのセリンプロテアーゼのホモロジーに基づて鋭意検討
することにより作製したｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉ
ｍｅｒを用い、マウスの気道より作製したｃＤＮＡを鋳
型としＰＣＲを施行し、得られたＤＮＡフラグメントの
配列を決定した結果、直立二足歩行を行わないマウスな
どの動物においてもＨＡＴ様蛋白が存在することをはじ
めて見い出した。さらに、マウスのＨＡＴ様蛋白をコー
ドする全長ｃＤＮＡを５’−ＲＡＣＥ（ＲａｐｉｄＡ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄ
ｓ）、３’−ＲＡＣＥを施行することによって取得し
た。本発明者らは、この遺伝子発現の組織特異性をしら
べたところ、マウスにおいても気道特異的な発現が観察
された。さらにマウスＡＳＴを昆虫細胞において組換え
体として発現させ、その蛋白一次構造を決定した結果、
マウスＡＳＴもヒトＡＳＴと同様に１番目のメチオニン
（Ｍｅｔ）から１８６番目のアルギニン（Ａｒｇ）の間
のアミノ酸配列からなるプロペプチドの部分配列が１８
７番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から始まるトリプシン
様蛋白部分とジスルフィド結合を介して結合している構
造からなる酵素であることを明らかにした。

【００１５】以上に述べた動物におけるＡＳＴの存在の
発見は、動物のＡＳＴの遺伝子レベルあるいは蛋白レベ
ルの発現を評価することを可能とし、動物疾患モデルに
おいて、動物ＡＳＴの発現や活性を評価することによ
り、該病態におけるＡＳＴの関与を明確にしていくの非
常に有用である。また、アンチセンスオリゴを用いてＡ
ＳＴの発現を抑制したり、発現ベクターを導入してＡＳ
Ｔの発現を上昇させたりすることにより、病態モデル動
物におけるＡＳＴの関与を調べることができる。さらに
動物モデルにおいてＡＳＴ阻害剤あるいは阻害ポリペプ
チド（蛋白、抗体を含む）の薬効を評価するうえで重要
となる動物における種差を検討、評価するうえでも重要
な情報を提供するものである。

【００１６】つぎに、上記構造を有する組換えＡＳＴを
組換えＰＡＲ発現昆虫細胞に作用させ、カルシウム流入
を指標にＰＡＲの活性化を評価したところ、ＰＡＲ１お
よびＰＡＲ２を発現させた昆虫細胞においてカルシウム
流入を惹起し、ＡＳＴがＰＡＲを活性化することをはじ
めて見出した。

【００１７】さらに、正常ヒト気道上皮細胞および気道
上皮細胞株においてＡＳＴがＰＡＲを活性化し、カルシ
ウム流入を惹起すること、および該構造のＡＳＴがＰＡ
Ｒを介したシグナル伝達系によりＩＬ−８産生増強や細
胞増殖を引き起こすことをはじめて見出し、気道疾患に
おいてＡＳＴがＰＡＲを介したシグナル伝達系によりそ
の病態を修飾していることを明らかにした。そして、こ
れに基づいて上記構造を有する組換え蛋白の酵素活性あ
るいはＰＡＲ活性化作用に基づくスクリーニング系を構
築し、本発明を完成した。

【００１８】本発明の実施例においてはカルシウム流入
をＰＡＲ活性化のシグナル伝達の指標として用いている
が、この実施例に限らず、ＰＡＲ活性化のシグナル伝達
の指標としてすでに報告されている測定対象物を用いて
ＡＳＴによるＰＡＲのシグナル伝達系の活性化を測定す
ることが可能である。たとえば、細胞増殖アッセイや、
ＮＦｋＢ、ＡＰ−１などの転写エレメントを含む遺伝子
（ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦなど）の転写活性
や生成蛋白の測定、細胞内におけるイノシトールリン酸
の分解活性の測定、プロスタグランジンＥ２産生の測
定、トロンボキサンＡ２の測定、ｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉ
ｃＡＭＰ）の測定、ＮＯ（ＮｉｔｒｉｃＯｘｉｄｅ）
の生成を直接あるいは間接に測定する方法、Ｘｅｎｏｐ
ｕｓＯｏｃｙｔｅを用いたカルシウムのｒｅｌｅａｓ
ｅなどである。

【００１９】すなわち本発明は、プロペプチド部分がト
リプシン様蛋白部分とジスルフィド結合を介して結合す
る構造を有したＡＳＴである。

【００２０】さらに該構造を有する酵素のＰＡＲ活性化
能を指標とした阻害剤あるいは阻害ポリペプチドのスク
リーニング系である。

【００２１】さらに本発明には、かかる構造のＡＳＴを
産生する昆虫細胞等の動物細胞も含まれる。

【００２２】また、該構造を有する酵素と結合する抗体
であって、酵素免疫測定法により生体内の該酵素を検出
し得る結合性を有するモノクローナル抗体もしくはポリ
クローナル抗体、もしくは免疫組織染色において組織中
および細胞中の該酵素を検出し得る結合性を有するモノ
クローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、および該
酵素活性を阻害し得るモノクローナル抗体もしくはポリ
クローナル抗体である。

【００２３】さらに、本発明にはかかるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ細胞等の動物細胞も含ま
れる。

【００２４】本発明をさらに具体的に述べると以下のよ
うになる。（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列の全部もしく
は一部からなる蛋白であって、１番目のＭｅｔから１８
６番目のＡｒｇの間のアミノ酸配列の全部もしくは一部
からなるプロペプチド部分と、１８７番目のＩｌｅから
４１８番目のＩｌｅまでの２３２アミノ酸の配列からな
るトリプシン様蛋白部分とが１本のジスルフィド結合で
連結されている構造を有するＡＳＴ。

【００２５】（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列
と６６％以上のホモロジーを有する蛋白であって、該プ
ロペプチド部分に相当する部分と該トリプシン様蛋白部
分に相当する部分とが１本のジスルフィド結合で連結さ
れている構造を有するＡＳＴ。

【００２６】（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列
の全部もしくは一部からなる蛋白であって、１番目のＭ
ｅｔから１８５番目のＡｒｇの間のアミノ酸配列の全部
もしくは一部からなるポリペプチド部分と、１８６番目
のＩｌｅから４１７番目のＩｌｅまでの２３２アミノ酸
の配列からなるポリペプチド部分とが１本のジスルフィ
ド結合で連結されている構造を有するＡＳＴ。

【００２７】（４）上記ＡＳＴに特異的に結合する抗
体。

【００２８】（５）ヒトＡＳＴ活性を阻害するか、また
はその活性化を阻害するモノクローナル抗体。

【００２９】（６）前記抗体を用いてＡＳＴを検出また
は測定する方法。

【００３０】（７）酵素基質と測定対象化合物もしくは
ポリペプチドを混合し、これらと気道特異的トリプシン
様酵素（ＡＳＴ）もしくは該酵素発現細胞もしくは該酵
素発現組織を適切な条件下にインキュベートして該酵素
基質と反応させ、その反応生成物を測定することにより
測定対象化合物もしくはポリペプチドのＡＳＴ阻害活性
を検出する方法。また、このようにして選ばれた化合物
もしくはポリペプチド、さらにそれを主薬効成分とする
治療薬。

【００３１】（８）気道特異的トリプシン様酵素（ＡＳ
Ｔ）もしくは該酵素発現細胞もしくは該酵素発現組織
と、測定対象化合物もしくはポリペプチドと、さらにＰ
ＡＲ発現細胞とを混合し、ＰＡＲ活性化を指標として測
定対象化合物もしくはポリペプチドのＡＳＴによるＰＡ
Ｒ活性化の阻害活性を検出する方法。また、このように
して選ばれた化合物もしくはポリペプチド、さらにそれ
を主薬効成分とする治療薬。

【００３２】（９）ＡＳＴの３次元構造を決定し、基質
が結合するのに適当な３次元構造を分析し、予想反応サ
イトに結合する化合物を合成し、化合物の該酵素阻害活
性を決定する、というステップからなる該酵素阻害剤の
評価方法。

【００３３】（１０）以下のグループから選択される単
離された核酸。ａ）天然哺乳類ＡＳＴ遺伝子のコード領域ｂ）天然哺乳類ＡＳＴ遺伝子配列と少なくとも６６％の
相同性があり、かつＰＡＲを活性化する酵素をコードす
る核酸ｃ）ＰＡＲを活性化する上記のＡＳＴをコードする核酸

【００３４】（１１）哺乳類ＡＳＴ遺伝子由来のｍＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡ。

【００３５】（１２）哺乳類のＡＳＴ。

【００３６】（１３）天然哺乳類ＡＳＴ遺伝子配列と少
なくとも６６％の相同性があり、ＡＳＴにより活性化さ
れるＧ蛋白共役型受容体を活性化する酵素をコードする
核酸。

【００３７】（１４）前記核酸を用いて作製された発現
ベクター。それがトランスフェクトもしくはトランスフ
ォームされた細胞。その細胞からＡＳＴまたはその前駆
体を精製する方法および精製されたＡＳＴまたはその前
駆体。

【００３８】（１５）前記核酸の全体もしくは一部の情
報を用いて、それらの核酸に対応するＡＳＴ遺伝子の発
現量を検出する方法。

【００３９】（１６）ＡＳＴの活性化過剰もしくはアッ
プレギュレートにより特徴づけられる疾患をもつ哺乳類
に対して、測定対象の化合物もしくはポリペプチドを投
与することからなる、ＡＳＴの活性を阻害、または該酵
素の活性化を阻害する物質のスクリーニング方法または
その治療効果判定方法。また、このようにして選ばれた
化合物もしくはポリペプチド、およびそれを主薬効成分
とする治療薬。

【００４０】（１７）ＡＳＴによるＰＡＲの活性化過剰
もしくはアップレギュレートにより特徴づけられる疾患
をもつ哺乳類に対して、測定対象の化合物もしくはポリ
ペプチドを投与することからなる、ＡＳＴによるＰＡＲ
活性化を阻害する物質のスクリーニング方法またはその
治療効果判定方法。

【００４１】（１８）ＡＳＴの活性化過剰もしくはアッ
プレギュレートにより特徴づけられる疾患をもつ哺乳類
に対し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有す
る薬剤を投与することにより、ＡＳＴの活性阻害または
その活性化阻害による治療効果を判定する方法。

【００４２】（１９）前記アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを有効成分として含有する、ＡＳＴの活性化過剰も
しくはアップレギュレートにより特徴づけられる疾患の
治療薬。

【００４３】

【発明の実施の形態】配列番号１に示されるアミノ酸配
列の全部もしくは一部からなる本発明の気道特異的トリ
プシン用酵素においては、プロペプチド部分とトリプシ
ン様蛋白部分とが１７３番目のＣｙｓと２９２番目のＣ
ｙｓとのジスルフィド結合で連結されているものが好ま
しい。配列番号２に示されるアミノ酸配列の全部もしく
は一部からなる本発明の気道特異的トリプシン用酵素に
ついては、プロペプチド部分に相当する部分とトリプシ
ン様蛋白部分に相当する部分が１７２番目のＣｙｓと２
９１番目のＣｙｓとのジスルフィド結合で連結されてい
るものが好ましい。配列番号１に示されるアミノ酸配列
と６６％以上のホモロジーを有する本発明の気道特異的
トリプシン用酵素については、プロペプチド部分に相当
する部分とトリプシン様蛋白部分に相当する部分とが、
配列番号１に示されるＡＳＴのそれぞれ１７３番目のＣ
ｙｓと２９２番目のＣｙｓに相当するシステイン部分と
のジスルフィド結合で連結されているものが好ましい。

【００４４】かかるプロペプチド部分としては、そのＮ
末端アミノ酸が、１番目のＭｅｔから１７０番目のＩｌ
ｅの間のアミノ酸であるもの、４４番目のＡｓｐから１
７０番目のＩｌｅの間のアミノ酸であるもの、１４５番
目のＡｓｎから１７０番目のＩｌｅの間のアミノ酸であ
るものが好ましい。特に１４５番目のＡｓｎ、１６２番
目のＡｓｐもしくは１７０番目のＩｌｅのいずれかから
１８６番目のＡｒｇまでであるものが好ましい。

【００４５】本発明の前記ＡＳＴに特異的に結合する抗
体としては、モノクローナル抗体が好ましく、ヒトＡＳ
Ｔ活性を阻害するか、またはその活性化を阻害するもの
が特に好ましい。

【００４６】本発明の抗体を用いるＡＳＴの検出または
測定方法としては、酵素免疫測定法を用いるものが好ま
しい。

【００４７】本発明の、測定対象化合物もしくはポリペ
プチドのＡＳＴ阻害活性を検出する方法においては、Ａ
ＳＴ発現細胞もしくは組織が口腔組織、鼻腔組織、副鼻
腔組織、気道組織、もしくは肺組織由来であるか、また
はそれらの組織に存在する細胞もしくはそれらの細胞株
であるものが好ましく、特に上皮細胞、ことに線毛上皮
細胞もしくはそれらの細胞株が好ましい。

【００４８】本発明の、測定対象化合物もしくはポリペ
プチドのＡＳＴによるＰＡＲ活性化に対する阻害活性を
検出する方法においては、ＰＡＲ活性化の指標として
は、細胞内カルシウム流入、ＮＦｋＢを含有するプロモ
ーターの転写活性、ＡＰ１を含有するプロモーターの転
写活性、ＩＬ−８プロモーターの転写活性、イノシトー
ルリン酸の分解活性、プロスタグランジンＥ２産生、ト
ロンボキサンＡ２、ｃＡＭＰ、ＮＯの生成が好ましく挙
げられる。

【００４９】また、ＡＳＴ発現細胞は、該酵素発現組換
え細胞であることが好ましい。さらに、ＡＳＴ発現細胞
もしくは該酵素発現組織としては、口腔組織、鼻腔組
織、副鼻腔組織、気道組織、もしくは肺組織であるか、
またはそれらの組織に由来する細胞もしくはそれらの細
胞株が好ましい。かかる組織に由来する細胞もしくは細
胞株には、癌細胞、癌細胞株が含まれる。特に上皮細
胞、なかでも気道上皮細胞、ことに線毛上皮細胞もしく
はそれらに由来する細胞株が好ましい。

【００５０】ＰＡＲ発現細胞としては、ＰＡＲ発現組換
え昆虫細胞が例示されるが、口腔組織、鼻腔組織、副鼻
腔組織、気道組織、もしくは肺組織に存在する細胞、気
道組織に存在する細胞、特に気道上皮細胞、なかでも線
毛上皮細胞もしくはそれらに由来する細胞株が好まし
い。ほかに、ＰＡＲ発現細胞としては、杯細胞もしくは
杯細胞由来の細胞株、分泌腺細胞もしくは分泌腺細胞由
来の細胞株、漿液腺細胞もしくは漿液腺細胞由来の細胞
株が挙げられる。

【００５１】ＰＡＲの具体例としては、ＡＳＴによって
活性化されるＧ蛋白共役受容体、ヒトＰＡＲ１、ヒトＰ
ＡＲ２、ヒトＰＡＲ３、ヒトＰＡＲ４が挙げられ、なか
でもヒトＰＡＲ１、ヒトＰＡＲ２が好ましい。

【００５２】本発明の哺乳類ＡＳＴ遺伝子由来のｍＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡとしては、げっ歯類のものが例示され
る。例えば配列番号５または配列番号６で示されるＡＳ
ＴをコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。同様
に、本発明の哺乳類のＡＳＴとしては、げっ歯類のもの
が例示され、具体的には配列番号２で示されるＡＳＴが
挙げられる。

【００５３】また、本発明は天然哺乳類ＡＳＴ遺伝子配
列と少なくとも６６％の相同性があり、ＡＳＴにより活
性化されるＧ蛋白共役型受容体、例えばマウスなどの哺
乳類Ｇ蛋白共役型受容体を活性化しうる酵素をコードす
る核酸である。

【００５４】こうしたＧ蛋白共役型受容体を活性化しう
る酵素をコードする核酸のなかでも、ヒトＰＡＲ１、ヒ
トＰＡＲ２、ヒトＰＡＲ３、ヒトＰＡＲ４、あるいはそ
れらに相当する、例えばマウスなどの哺乳類ＰＡＲを活
性化しうる酵素をコードするものが好ましい。特に、ヒ
トＰＡＲ２またはそれに相当するマウスＰＡＲ２などの
哺乳類ＰＡＲを活性化しうる酵素をコードするものが好
ましい。

【００５５】本発明は、これらの核酸を用いて作製され
た発現ベクター、それがトランスフェクトもしくはトラ
ンスフォームされた細胞、その細胞からＡＳＴまたはそ
の前駆体を精製する方法、さらにはそのようにして精製
されたＡＳＴまたはその前駆体である。本発明にはこれ
らの核酸から翻訳されるＡＳＴが存在する哺乳類の体
液、細胞、または細胞株から精製されたＡＳＴまたはそ
の前駆体も含まれる。

【００５６】さらに本発明は、これらの核酸の全体もし
くは一部の情報を用いて、それらの核酸に対応するＡＳ
Ｔ遺伝子の発現量を検出する方法であるが、その検出手
法としてはノーザンハイブリダイゼーション法、遺伝子
増幅法が例示される。本発明には、こうした遺伝子増幅
法の実施に用いられる、天然哺乳類ＡＳＴ遺伝子配列の
情報、例えばそのｃＤＮＡ配列の情報に基づいて作製さ
れたセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーも
含まれる。

【００５７】本発明はさらに、これまでに述べたＡＳＴ
の発現を指示する発現ベクター、その発現ベクターがト
ランスフェクトもしくはトランスフォームされた細胞、
その細胞を培養し、培養液からＡＳＴを回収することか
らなるＡＳＴの製造方法、さらにはその製造方法によっ
て得られるＡＳＴである。

【００５８】本発明はさらに、上述のＡＳＴの活性化過
剰もしくはアップレギュレートにより特徴づけられる疾
患をもつ哺乳類に対して、測定対象の化合物もしくはポ
リペプチドを投与することからなる、ＡＳＴの活性を阻
害、または該酵素の活性化を阻害する物質のスクリーニ
ング方法またはその治療効果判定方法である。

【００５９】かかるＡＳＴの活性化過剰もしくはアップ
レギュレートにより特徴づけられる疾患としては、慢性
気道炎症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、
びまん性汎細気管支炎、気管支拡張症、喘息、副鼻腔気
管支症候群、線維症、神経過敏症、凝固線溶系異常によ
る疾患、癌、関節炎、または皮膚の炎症性の疾患が挙げ
られる。特に、呼吸器系における炎症性の疾患もしくは
口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、肺組織に
おける分泌異常、細胞外基質合成異常、細胞増殖異常、
細胞分化異常、神経系の異常、免疫系の異常、粘液線毛
輸送系の異常、または凝固線溶系異常による病態がもた
らす疾患が例示される。

【００６０】また、本発明は上述のＡＳＴによるＰＡＲ
の活性化過剰もしくはアップレギュレートにより特徴づ
けられる疾患をもつ哺乳類に対して、測定対象の化合物
もしくはポリペプチドを投与することからなる、ＡＳＴ
によるＰＡＲ活性化を阻害する物質のスクリーニング方
法またはその治療効果判定方法であるが、かかるＡＳＴ
によるＰＡＲの活性化過剰もしくはアップレギュレート
により特徴づけられる疾患の具体例としても上記したも
のと同じものが例示される。また、かかるＰＡＲとして
は、例えばマウスなどの哺乳類ＡＳＴによって活性化さ
れる哺乳類Ｇ蛋白共役型受容体、ヒトＰＡＲ１、ヒトＰ
ＡＲ２、ヒトＰＡＲ３、またはヒトＰＡＲ４に相当す
る、例えばマウスもしくはラットなどの哺乳類ＰＡＲ
１、哺乳類ＰＡＲ２、哺乳類ＰＡＲ３、または哺乳類Ｐ
ＡＲ４、なかでも哺乳類ＰＡＲ２もしくはＰＡＲ１、特
に哺乳類ＰＡＲ２についてのものが好ましい。

【００６１】また、本発明は上述した本発明の核酸の一
部を用いて作製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
であるが、本発明には上述のＡＳＴの活性化過剰もしく
はアップレギュレートにより特徴づけられる疾患をもつ
哺乳類に対し、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチド
を含有する薬剤を投与することにより、ＡＳＴの活性阻
害またはその活性化阻害による治療効果を判定する方
法、ならびにかかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを
有効成分として含有する該疾患の治療薬も含まれる。こ
のようなＡＳＴの活性化過剰もしくはアップレギュレー
トにより特徴づけられる疾患の具体例としても、上述し
たものと同じ疾患が例示される。

【００６２】本発明には、前述したＡＳＴ活性の検出方
法によって選ばれたＡＳＴ活性もしくはその活性化を阻
害する化合物あるいはポリペプチド、ＡＳＴによるＰＡ
Ｒ活性化の検出方法によって選ばれた化合物もしくはポ
リペプチド、前述の治療効果判定方法により有効性が確
認されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、さらにはそ
れらを主薬効成分とする治療剤も含まれる。これらの治
療剤の対象疾患としても、前述したのと同じ疾患が例示
される。

【００６３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものでは
ない。

【００６４】［実施例１］ＡＳＴの調製喀痰中からの活性型天然ＡＳＴの精製は、以下に述べる
組換えＡＳＴを精製した方法と同様の方法により実施し
た。組換えＨＡＴの精製に関しては、特開平８−８９２
４６号公報、ＵＳ−５８０４４１０、ＥＰ−６９９７６
３およびYamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(1
9): 11895-11901, 1998に開示されているｃＤＮＡ配列
に基づいて組換えバキュロウイルスベクターを調製し、
昆虫細胞に感染させることにより組換えＡＳＴ（ｒＡＳ
Ｔ）を産生させ、その細胞画分よりｒＡＳＴを精製し
た。すなわち、昆虫細胞（Ｔｎ−５細胞）を単層で５×
１０⁶個／ｍＬの密度まで生育させ、培地を除去した
後、細胞あたりＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏ
ｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．２〜０．５になるよう
に組換えＡＳＴ発現バキュロウイルスを含む無血清培地
を加えて感染させ、３日間培養し、ＡＳＴを発現させ
た。発現した蛋白質の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
抗ＡＳＴペプチド抗体を用いたウエスタンブロット法
（Anal. Biochem., 112, 195-203, 1981）によって行っ
た。

【００６５】遠心分離（約５００×ｇ）で上清と細胞を
分離した。４５０ｍＬに相当する細胞をＭ−ＰＥＲ（Ｍ
ａｍｍａｌｉａｎＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎＲｅａｇｅｎｔ：ＰＩＥＲＣＥ社製）１００ｍＬに
懸濁し、室温で３０分インキュベートした。さらに超音
波破砕を１５分間氷上で行い、可溶化した。得られた可
溶化物を１００００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心し、上
清を回収した。回収した上清を１リットルの５０ｍＭＡ
ｃＯＮａ（ｐＨ４）／０．０１％ＰＥＧ６０００にて室
温で２時間撹拌しながら透析したのち、４℃で１０００
０ｒｐｍで３０分間遠心を行って上清を回収した。

【００６６】次にこの試料にＢＳＡ（終濃度１００μｇ
／ｍＬ）を添加し、２リットルの５０ｍＭＴｒｉｓＨ
Ｃｌ（ｐＨ８）／０．５ＭＮａＣｌ／０．０１％ＰＥ
Ｇ６０００にて２回透析した後、４℃で１００００ｒｐ
ｍ、３０分間遠心して上清を回収した。回収した上清を
ベンザミジンセファロース６Ｂ（１０ｍＬベッドボリュ
ーム）にのせ、１００ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８）／０．５ＭＮａＣｌ／０．０１％ＰＥＧ６０
００にてカラムを洗浄した。さらに８０ｍＬの１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にてカラムを洗
浄したのち、１０ｍＭＨＣｌ（ｐＨ２）にて結合蛋白
を溶出した。溶出後、各フラクションについて吸光度
（２８０ｎｍ）を測定し、メインピークを集めた。そし
てＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）をおこなって分子量約３０ｋＤの蛋白質を検
出、確認し、これを精製ｒＡＳＴ標品として凍結保存し
た。

【００６７】［実施例２］ＡＳＴの活性測定方法トリプシン用合成基質Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−ＭＣＡ（ＭＣＡ：Ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎａ
ｍｉｄｅ）を１００μＭ、ＢＳＡを０．０１％含有する
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１．
０ｍＬにＡＳＴ含有溶液を５０μＬ加え、３７℃で１時
間インキュベートした。次いで１ｍＬの３０％酢酸を加
え、生成した７−アミノー４−メチルクマリン（ＡＭ
Ｃ）量を蛍光測定により定量し（蛍光４６０ｎｍ、励起
光３８０ｎｍ）、酵素の活性を算出した。１分間に１ｐ
ＭのＡＭＣを生成させる活性を１単位と定義する。

【００６８】［実施例３］組換えＡＳＴおよび天然ＡＳ
Ｔのアミノ酸配列の決定実施例１で得られた精製蛋白を還元および非還元条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲル中の蛋
白をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｓｕ
ｌｆｉｄｅ）膜（イモビロン−Ｐ−トランスファー膜、
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にトランスファーした後、クマ
シーブルーＲ−２５０溶液（０．１％の５０％メタノー
ル溶液）中で染色し、約３０ｋＤ付近のＡＳＴ蛋白のバ
ンドを切り出し、そのアミノ酸配列を決定した。

【００６９】その結果、昆虫細胞発現組換えＡＳＴに関
しては、還元条件下では、Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｇからはじまる
アミノ酸配列が確認された。非還元条件下では、３種類
のバンドを確認することができた。分子量の大きいもの
からそれぞれ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）とすると、銀染色
により推定された蛋白量としては（ａ）８％、（ｂ）８
７％、（ｃ）５％の含有率であった。それぞれのバンド
を切り出して決定されたアミノ酸配列は、（ａ）Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｉ−ＮとＩ−Ｌ−Ｇ−
Ｇ−Ｔ−Ｅ−Ａ−Ｅそれぞれ等モル（ｂ）Ｄ−Ｑ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｎ−Ｗ−ＬとＩ−Ｌ−Ｇ
−Ｇ−Ｔ−Ｅ−Ａ−Ｅそれぞれ等モル（ｃ）Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｅ−Ａ−Ｅからはじまるアミノ酸配列であった。以前、報告されて
いるＡＳＴは（ｃ）の構造を有する蛋白である。

【００７０】以上のことから、精製されたｒＡＳＴは、
メインバンド（８７％）が（ｂ）の構造であり、Ｄ−Ｑ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｎ−Ｗ−Ｌからはじまるプロペプチドと
Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｅ−Ａ−Ｅからはじまるトリプシ
ン様蛋白部分とがジスルフィド結合している構造物が主
体であることが明らかとなった。この構造物が活性を有
するものである。

【００７１】一方、喀痰から精製したＡＳＴに関して
は、還元条件下では、既報のＩ−Ｌ−Ｇ−Ｇから始まる
アミノ酸配列が確認された。一方、非還元条件下ではＩ
−Ｌ−Ｇ−Ｇのほかにそれぞれアミノ酸のピークを確認
することができ、その配列は、Ｉ−Ｎ−Ｅ−Ｂｌａｎｋ
−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｐと読み取れた（最初のＩに関してはメ
インピークと同一）。この配列は、プロペプチドの１７
０番目のＩから始まるヒトＡＳＴのアミノ酸配列と一致
し、組換えＡＳＴと同様に喀痰由来の天然ＡＳＴもプロ
ペプチドとジスルフィド結合している構造が主体である
ことが初めて明らかとなった。ジスルフィド結合のプロ
ペプチド（軽鎖）側のシステインは１７３番目のシステ
インであり、トリプシン様酵素部分（重鎖）は他のトリ
プシン類との構造の相同性比較より２９２番目のシステ
インに相当するシステイン部分でジスルフィド結合によ
って連結されている構造であることが判明した。

【００７２】［実施例４］各種組換えヒトＰＡＲ発現細
胞の調製（１）ＰＡＲｃＤＮＡの取得とＰＡＲｃＤＮＡ含有ト
ランスファーベクターの作製正常ヒト気道上皮細胞よりＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ
ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（アマシャムファルマシア
バイオテク社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、プライ
マーＰＡＲ１Ｆ（配列番号７）およびＰＡＲ１Ｒ（配列
番号８）によりＰＡＲ−１を、プライマーＰＡＲ２Ｆ
（配列番号９）およびＰＡＲ２Ｒ（配列番号１０）によ
りＰＡＲ−２を、プライマーＰＡＲ３Ｆ（配列番号１
１）およびＰＡＲ３Ｒ（配列番号１２）によりＰＡＲ−
３をＰＣＲ増幅した。また、ヒト前立腺由来ｃＤＮＡ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入）の１／１００量を用いて
プライマーＰＡＲ４Ｆ（配列番号１３）およびＰＡＲ４
Ｒ（配列番号１４）によりＰＡＲ−４をＰＣＲ増幅し
た。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動した結
果、ＰＡＲ−１〜４のｃＤＮＡフラグメントのバンドが
認められた。このＤＮＡフラグメントをＤＮＡ精製キッ
ト（ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＥＸII使用）を用いてゲル
から抽出、精製した。精製したＤＮＡフラグメントをＥ
ｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（ＰＡＲ４に関してはＢｇｌ I
I）で切断し、バキュロウイルストランスファーベクタ
ーｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したものとライゲ
ーション反応を行った。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９株に形質転換し、いくつかの形質転換体のコロニ
ーからプラスミドを抽出し、数クローンについてプラス
ミド精製（ＱＩＡＧＥＮ社製プラスミド抽出キット使
用）を行った。これらの精製プラスミドを用いてＡＢＩ
社製蛍光自動シーケンサーによりＤＮＡ配列を決定した
結果、これらＤＮＡフラグメントがＰＡＲをコードして
いることが明らかになった。

【００７３】（２）ＰＡＲ発現用組換えバキュロウイル
スの作製組換えバキュロウイルスの作製にはファーミジェン社製
のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＴＭ）トランスフェクション
キットを用いた。昆虫細胞Ｓｆ９を１×１０⁶細胞／ｍ
Ｌで３５ｍｍディッシュに播種し、３０分間室温にて接
着させた。一方、０．５ｍｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ
（ＴＭ）ＤＮＡと２μｇのｐＶＬ−ＰＡＲプラスミドＤ
ＮＡを混ぜ、室温に５分間静置し、その後、０．５ｍＬ
トランスフェクションバッファーＢ（２５ｍＭＨＥＰ
ＥＳ、ｐＨ７．１、１２５ｍＭＣａＣｌ₂、１４０ｍ
ＭＮａＣｌ）を加えてよく混ぜた。次に播種したＳｆ
９細胞の培地を抜き取り、０．５ｍＬのトランスフェク
ションバッファーＡ（グレース培地、１０％牛血清含
有）を加えた。ここに、トランスフェクションバッファ
ーＢとＤＮＡの溶液を少しずつ滴下していくことによ
り、コトランスフェクションを行った。２７℃でインキ
ュベーションし、４時間後に新しいグレース培地（１０
％牛血清含有）に取り換えた。５日後、組換えウイルス
を含む培養上清を回収し、培養上清１００μＬとＥＸ−
ＣＥＬＬ４０５Ｍｅｄｉｕｍ２００μＬを作成
し、Ｓｆ９細胞（１×１０⁶細胞／ｄｉｓｈ）に室温で
１時間感染させた。上清を抜き取り、１％ＳｅａＰｌａ
ｑｕｅアガロース含有グレース培地（４２℃）を２ｍＬ
滴下して加え、アガロースが固まるまで１０分間室温に
放置した。その後、２７℃で５日間培養した。５日目に
ニュートラルレッド／ＰＢＳ（０．１ｇ／Ｌ）を１ｍＬ
／ｄｉｓｈ加えた。６日目にウイルスプラークを観察
し、プラークを確認した。数個のシングルウイルスプラ
ークをアガロースごとパスツールピペットで抜き取り、
グレース培地と混ぜて、ウイルスを培地中に拡散させ
た。このシングルプラーク由来のウイルス液を単層培養
したＳｆ９細胞（２５ｃｍ²フラスコ培養）に感染させ
た。これを２７℃で５日間培養してウイルス液を回収し
た。このウイルス液を１ｍＬとって１．５ｍＬエッペン
ドルフチューブに入れ、４℃、１５０００回転／分で３
０分間遠心し、ウイルス粒子を沈殿させた。沈殿物を２
００μＬのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、０．１ｍＭＥ
ＤＴＡ）緩衝液に懸濁し、５０μＬのＬｙｓｉｓ緩衝液
（１０％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ）を加え、６０℃で
２０分間インキュベートした。さらにフェノール／クロ
ロホルム抽出およびエタノール沈殿により反応液中のウ
イルスＤＮＡを回収した。回収したウイルスＤＮＡの１
／１０を使用して、プライマーＢａｃＦ（配列番号１
５）およびＢａｃＲ（配列番号１６）によってＰＣＲ増
幅を行い、ＤＮＡ中にＰＡＲｃＤＮＡが含有されている
ことを確認した。このＰＡＲ発現用組換えバキュロウイ
ルスをＶＬ−ＰＡＲと命名した。ウイルス液は適宜希釈
してプラークアッセイを行い、タイターをチェックし
た。さらに、ウイルス液をＳｆ９細胞に感染させること
で１−５×１０⁷ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎ
ｇｕｎｉｔ）／ｍＬ程度の高濃度のウイルス液を得
た。ウイルス液は４℃および−８０℃で保存した。

【００７４】（３）組換えバキュロウイルスによるトロ
ンビンレセプターの昆虫細胞における発現上記のようにして得られたＰＡＲ発現用組換えバキュロ
ウイルス；ＶＬ−ＰＡＲを７５ｃｍ²フラスコに播種し
た１．０×１０⁷のＳｆ９細胞にＭＯＩ＝２で感染さ
せ、４０時間、２７℃で静置培養した。培養後、感染細
胞を回収し、カルシウム流入実験によってＰＡＲの機能
を有することの確認を行った。

【００７５】［実施例５］ＰＡＲ発現昆虫細胞を用いた
ＡＳＴによるカルシウム流入実験回収した感染細胞（約５×１０⁶細胞）をＨＥＰＥＳ−
Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ７．４で１回洗
浄した後、５ｍＬのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液
（１μｇ／ｍＬ、Ｆｕｒａ２−ＡＭ含有）に懸濁してＦ
ｕｒａ２−ＡＭを２７℃で３０分間負荷した。室温で８
００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収し、ＨＥＰＥＳ
−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ７．４で２回
洗浄した後、５ｍＬのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液
−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ７．４に再懸濁した。この細胞懸濁
液に５μＬの１ＭＣａＣｌ₂を加えて最終濃度１ｍＭ
ＣａＣｌ₂になるようにし、遮光して室温で５分間イ
ンキュベートした。このように調製したＦｕｒａ２−Ａ
Ｍ負荷感染細胞を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウ
ェルで分注し、さらにＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液
−Ｃａ²⁺（＋）ｐＨ７．４を８０μＬ／ウェルで分注
し、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＤｒｕｇＳｃｒｅｅ
ｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（浜松ホトニクス）で測定し
た。すなわち、［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの
蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍
光強度］（細胞内カルシウム濃度を反映）を測定した。

【００７６】ＡＳＴ（０．２〜２単位／ｍＬ）、トリプ
シン（牛の膵臓由来、０．１〜１０単位／ｍＬ）、ヒト
トロンビン（０．１〜１０単位／ｍＬ）、もしくはＳＦ
ＬＬＲＮａｍｉｄｅ（ＰＡＲ−１、２のアゴニストペプ
チド）、もしくはＳＬＩＧＲＬ（ＰＡＲ−２のアゴニス
トペプチド、１０〜１００μＭ）を添加して刺激を与
え、細胞内カルシウム濃度を経時的に測定した。その結
果、ＰＡＲ発現用組換えバキュロウイルスを感染させた
昆虫細胞に特異的にカルシウム流入が観察された。この
結果から、機能を有するＰＡＲが昆虫細胞に発現してい
ることが証明された。

【００７７】ＰＡＲ−１〜ＰＡＲ−４それぞれのＣａ²⁺
流入は以下に示す。ＰＡＲ−１は、ＡＳＴ（２単位／ｍ
Ｌ）、トリプシン（０．１〜１０単位／ｍＬ）、トロン
ビン（０．１〜１０単位／ｍＬ）、ＳＦＬＬＲＮａｍｉ
ｄｅ（１０〜１００μＭ）でＣａ²⁺流入が認められた。
ＰＡＲ−２は、ＡＳＴ（２単位／ｍＬ）、トリプシン
（０．１〜１０単位／ｍＬ）、トロンビン（１〜１０単
位／ｍＬ）、ＳＦＬＬＲＮａｍｉｄｅ（１０〜１００ｍ
Ｍ）、ＳＬＩＧＲＬ（１０〜１００μＭ）でＣａ²⁺流入
が認められた。ＰＡＲ−４は、ＡＳＴ（２単位／ｍ
Ｌ）、トリプシン（０．１〜１０単位／ｍＬ）、トロン
ビン（０．１〜１０単位／ｍＬ）でＣａ²⁺流入が認め
られた（図２参照）。

【００７８】［実施例６］気道上皮細胞を用いたＡＳＴ
によるカルシウム流入実験（１）正常ヒト気道上皮細胞をもちいたＡＳＴによるカ
ルシウム流入実験正常ヒト気道上皮細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社よ
り購入）についてのＡＳＴによるＣａ²⁺流入を検討し
た。３枚の１０ｃｍディッシュにコンフルエントになっ
た細胞を用いて行った。１０ｍＭＥＤＴＡ／Ｈｅｐｅ
ｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で１０分かけて細胞を剥がし、
室温で８００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収し、５
ｍＬのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液−Ｃａ²⁺（−）
ｐＨ７．４に再懸濁した。回収した細胞（約１．２×１
０⁶細胞）を５ｍＬのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液
（１μｇ／ｍＬ、Ｆｕｒａ２−ＡＭ含有）に懸濁してＦ
ｕｒａ２−ＡＭを３７℃で１時間負荷した。室温で８０
０ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収し、ＨＥＰＥＳ−
Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ７．４で２回洗
浄した後、１．３ｍＬのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝
液−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ７．４に再懸濁した。この細胞懸
濁液に５μＬの１ＭＣａＣｌ₂を加えて最終濃度１ｍ
ＭＣａＣｌ₂になるようにし、遮光して室温で５分間
インキュベートした。このように調製したＦｕｒａ２−
ＡＭ負荷感染細胞を９６ウェルプレートに１００μＬ／
ウェルで分注し、さらにＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝
液−Ｃａ ²⁺（＋）ｐＨ７．４を８０μＬ／ウェルで分注
して、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＤｒｕｇＳｃｒｅｅ
ｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（浜松ホトニクス）で測定し
た。すなわち［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍
光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光
強度］（細胞内カルシウム濃度を反映）を測定した。

【００７９】ＡＳＴ（２単位／ｍＬ）、牛の膵臓由来ト
リプシン（１〜１００単位／ｍＬ）、ヒトトロンビン
（１〜１００単位／ｍＬ）、ＳＦＬＬＲＮａｍｉｄｅ、
もしくはＳＬＩＧＲＬ（１０〜１００μＭ）を添加して
刺激を与え、細胞内カルシウム濃度を経時的に測定し
た。その結果、ＡＳＴ（２単位／ｍＬ）、トリプシン
（１０〜１００単位／ｍＬ）、ＳＦＬＬＲＮａｍｉｄｅ
（１００μＭ）でＣａ²⁺流入が認められた（図３参
照）。

【００８０】（２）気道上皮細胞株を用いたＡＳＴによ
るカルシウム流入実験気道上皮細胞株ＢＥＡＳ−２ＢについてのＡＳＴによる
Ｃａ²⁺流入を検討した。６枚の１０ｃｍディッシュにコ
ンフルエントになった細胞を用いて行った。１０ｍＭ
ＥＤＴＡ／Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で１０分間
かけて細胞を剥がし、室温で１５００ｒｐｍで５分間遠
心して細胞を回収し、１０ｍＬのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏ
ｄｅ緩衝液−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ７．４に再懸濁した。回
収した細胞（約１．１×１０⁷細胞）を、１１ｍＬのＨ
ＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１μｇ／ｍＬ、Ｆｕｒ
ａ２−ＡＭ含有）に懸濁してＦｕｒａ２−ＡＭを３７℃
で３０分間負荷した。室温で１５００ｒｐｍで５分間遠
心して細胞を回収し、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液
−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ７．４で２回洗浄した後、１１ｍＬ
のＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液−Ｃａ²⁺（−）ｐＨ
７．４に再懸濁した。この細胞懸濁液に１１ｍＬの１Ｍ
ＣａＣｌ₂を加えて最終濃度１ｍＭＣａＣｌ₂になる
ようにし、遮光して室温で５分間インキュベートした。
このように調製したＦｕｒａ２−ＡＭ負荷感染細胞を９
６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで分注し、さら
にＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液−Ｃａ²⁺（＋）ｐＨ
７．４を８０μＬ／ウェルで分注して、Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅＤｒｕｇＳｃｒｅｅｎｉｎｇＳｙｓｔ
ｅｍ（浜松ホトニクス）で測定した。すなわち［励起光
３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３
８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］（細胞内カルシ
ウム濃度を反映）を測定した。

【００８１】ＡＳＴ（０．２〜２単位／ｍＬ）、牛の膵
臓由来トリプシン（０．１〜１００単位／ｍＬ）、ヒト
トロンビン（０．１〜１００単位／ｍＬ）、もしくはＳ
ＦＬＬＲＮａｍｉｄｅ、ＳＬＩＧＲＬ（ＰＡＲＡｇｏ
ｎｉｓｔＰｅｐｔｉｄｅ、１０〜１００μＭ）を添加
し刺激を与えて、細胞内カルシウム濃度を経時的に測定
した。その結果、ＡＳＴ（２単位／ｍＬ）、トリプシン
（１０〜１００単位／ｍＬ）、ＳＦＬＬＲＮａｍｉｄｅ
（１００μＭ）でＣａ²⁺流入が認められた（図４参
照）。

【００８２】［実施例７］マウスＡＳＴｃＤＮＡの取
得（１）マウス気道ｃＤＮＡの取得マウス（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ）の気道を採取し、１つの気
道あたり１ｍＬのＩＳＯＧＥＮを使用し、ホモジェナイ
ズをおこなった。このホモジェネートに０．２ｍＬのク
ロロホルムを加え、ボルテックスで混和し、室温で２〜
３分間放置した。１２０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠
心し、上層を新しいチュ−ブに移した。これに０．５ｍ
Ｌのイソプロピルアルコールを加え、混合し、室温で１
０分間放置した。これを１５０００ｒｐｍ、４℃で１５
分間遠心して全ＲＮＡを沈殿させた。ペレットに７５％
エタノールを１ｍＬ加え、よく混和した後、１００００
ｒｐｍ、５分間４℃で遠沈した。ペレットを風乾し、Ｄ
Ｎａｓｅ、ＲＮａｓｅフリーの水に溶解し、−８０℃で
保存した。マウス気道由来のｔｏｔａｌＲＮＡ２．
５μｇおよびＯｌｉｇｏ（ｄＴ） _12-18を用い、Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ社製）を使用して添付のプロトコールに従い、ｃ
ＤＮＡの合成を行った。

【００８３】（２）マウス気道ｃＤＮＡからのＡＳＴ
ＰＣＲフラグメントの取得ヒトＡＳＴおよびマウスヘプシン（Ｈｅｐｓｉｎ）の塩
基配列の相同性を比較し、配列番号１７、配列番号１８
で示されるＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒおよびＲｅｖ
ｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒを作成した。このプライマーを
使用し、ＴａＫａＲａＴａｑ^TMポリメラーゼ（宝酒造
製）を用い、マウス気道由来ｃＤＮＡを鋳型として添付
のプロトコールに従いＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）反応を行った。ＰＣＲ
産物のアガロースゲル電気泳動行った結果、目的とする
４５０ｂｐ付近に増幅バンドを認めた。この増幅ＤＮＡ
フラグメントをアガロースゲルより切り出し、ＴＡクロ
ーニングベクターに挿入し、大腸菌に形質転換してクロ
ーンを得た。プラスミドを定法に従って調製し、挿入Ｄ
ＮＡフラグメントの塩基配列決定を行った。その結果、
マウスＨｅｐｓｉｎのほかに、ヒトＡＳＴと相同性を示
す遺伝子がクローニングされていることが明らかとなっ
た。

【００８４】（３）５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥに
よる全長マウスＡＳＴｃＤＮＡの取得（２）によって得られた部分塩基配列をもとに５’−Ｒ
ＡＣＥ（ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｃＤＮＡＥｎｄｓ）および３’−ＲＡＣＥ用のプラ
イマーを合成した。１ｓｔＲＡＣＥ用のプライマー配列
は配列番号１９、配列番号２０を用い、２ｎｄＲＡＣＥ
用のプライマー配列は配列番号２１、配列番号２２に示
す。この配列をもとにしてＭｏｕｓｅ１５−ｄａｙ
ＥｍｂｒｙｏＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤ
ＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔ
ｅｒ／ＮＩＨｅｍｂｒｙｏ）を用い、５’−ＲＡＣＥ
および３’−ＲＡＣＥを施行した。ＰＣＲ反応はＡｄｖ
ａｎｔａｇｅ２ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い、添付のプロトコールに従
って行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動行っ
た結果、５’−ＲＡＣＥによって約１．１ｋｂｐの増幅
フラグメントが、３’−ＲＡＣＥによって約０．６ｋｂ
ｐの増幅フラグメントが得られた。この増幅ＤＮＡフラ
グメントをアガロースゲルより切り出し、ＴＡクローニ
ングベクターに挿入し、大腸菌に形質転換してそれぞれ
数クローンを得た。これらの形質転換体よりプラスミド
を定法に従って調製し、挿入ＤＮＡフラグメントの塩基
配列を決定した。その結果、（２）によって得られた部
分塩基配列と一致したシーケンスから始まり、５’−方
向、３’−方向にヒトＡＳＴと相同性のある塩基配列が
伸張されていることが確認された。決定された完全長の
マウスＡＳＴｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列番
号２に示す。さらに実際にマウス気道において存在する
マウスＡＳＴが同様のアミノ酸配列であるか否かを確認
するため、アミノ酸をコードする遺伝子の外側を認識す
るＰＣＲプライマー配列番号２３、配列番号２４を合成
した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ２Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてマウス気道ｃＤＮＡ
のＰＣＲ反応を行い、増幅したＤＮＡフラグメントの塩
基配列決定を行った。その結果、アミノ酸配列が一致す
ることが判明し、気道由来のマウスＡＳＴｃＤＮＡ配
列番号６のクローニングに成功した。

【００８５】（４）ヒトＡＳＴとのホモロジーの比較ヒトＡＳＴとマウスＡＳＴとのアミノ酸の相同性を比較
した結果を図１に示した。相同性比較は遺伝子解析ソフ
ト（ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ；テイジンシステムテクノロ
ジー社）を用いて行った。アミノ酸配列は全体で６６％
一致していた。

【００８６】［実施例８］抗ＡＳＴポリクローナル抗体
の取得（１）抗ペプチド抗体の取得ヒトＡＳＴの１８７番目イソロイシンから２０５番目の
残基までの、Ｎ末端にシステインを有する２０残基のペ
プチド（配列番号２５）をペプチドシンセサイザー（Ａ
ｐｐｌｉｄｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ４
３１Ａ）にて化学合成した。この合成ペプチドを１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し（１０ｍｇ／ｍ
Ｌ）、１０ｍｇのマレイミド活性化ヘモシアニン（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａ社製）と２５℃で２時間インキュベートした後、
反応溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し
て透析した。ヘモシアニンに結合させたペプチドを家兎
の皮下に投与（０．５ｍｇ／１回）した。投与は２週間
おきに６回繰り返した。全血を採取し、血清を調製した
後、プロテインＡセファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）で精製して抗ＡＳＴポリクローナル抗体
（ａｎｔｉ−Ｎ１９ＰＡｂ）を得た。

【００８７】（２）抗組換えＡＳＴ抗体の取得実施例１で調製した組換えＡＳＴ（４０μｇ／１回）を
フロインドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社
製、１：１）とともに、２週間毎に家兎に皮内投与し
た。これを４回行なった後、全採血をして抗血清を得
た。この血清から常法に従い、プロテインＡセファロー
ス４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にてＩｇＧを
精製し、抗ＡＳＴポリクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｒＡ
ＳＴＰＡｂ）を得た。

【００８８】［実施例９］抗ＡＳＴモノクローナル抗体
の作製（１）組換えＡＳＴによるマウスの免疫実施例１で調製した組換えＡＳＴをフロインドのコンプ
リートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：１）ととも
に、２週間毎にＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、オス）に
腹腔内投与した（１０−２０μｇ／回／ｈｅａｄ）。こ
れを４回行なった後、５回目は細胞融合の３日前に組換
えＡＳＴ溶液５０μｇを静脈内投与した。マウスの尾静
脈より採血し、３７℃で３０分間インキュベート後、３
０００ｒｐｍで１０分間遠心して血清を回収し、血清中
の抗ＡＳＴ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。以下、
その方法を述べる。

【００８９】９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ
３９１２、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に
０．０５ＭＮａ₂ＣＯ₃緩衝液（ｐＨ１０．５）で１μ
ｇ／ｍＬに希釈した組換えＡＳＴを５０μＬ加え、４℃
で１晩反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含むＰＢＳで室温で１時間処理した。０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、検体を５０μＬ
加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、３％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで１０００倍希釈したアルカリホスファターゼと結合
させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を５０
μＬ加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、ＰＮＰＰ（ｐ−Ｎ
ｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、和光純薬）
と室温で１時間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を
測定した。

【００９０】（２）細胞融合によるハイブリドーマの作
製細胞融合の直前にマウスを殺し、脾細胞をＰＢＳ中でホ
モジナイズし、残渣をナイロンメッシュで濾過後、ＰＢ
Ｓで遠心洗浄を１回行なった。この脾細胞とマウスミエ
ローマ（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１）とを常法（Kohler,
Milstein; Nature, 256, 495-497, 1975）に従って細胞
融合した。すなわち、脾細胞５×１０⁷個とマウスミエ
ローマ細胞Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）５×１
０⁶個をＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、１５００ｒｐ
ｍで５分間遠心し、細胞ペレットにした。３５％ポリエ
チレングリコール液（ＲＰＭＩ１６４０培地５．７５
ｍＬ＋ポリエチレングリコール３．５ｍＬ＋ジメチルス
ルホキシド０．７５ｍＬ）を２分間で１ｍＬ加え、細胞
をゆるやかに浮遊させた。ＲＰＭＩ１６４０培地を２
分間で１ｍＬ加えた後、さらに２分間で２ｍＬ加えた。
次にＧＩＴ−ＨＡＴ培地（９５μＭヒポキサンチン、
０．４μＭアミノプテリン、１．６μＭチミジン、およ
び５％ＦＣＳを含むＧＩＴ培地）を２分間で４ｍＬ加え
た後、さらに２分間で８ｍＬ加えた。３７℃で３０分間
インキュベート後、各ウェルあたり約１０⁴個のマウス
腹腔浸出細胞をまきこんだ９６穴平底プレート１枚に分
注し、５％ＣＯ₂存在下３７℃で培養した。１週間後に
ＧＩＴ−ＨＴ培地（ＧＩＴ−ＨＡＴ培地よりアミノプテ
リンを除いた培地）で培地を半量交換し、さらに５％Ｃ
Ｏ₂存在下、３７℃で約１週間培養することにより各ウ
ェルあたり数個のハイブリドーマのコロニーが得られ
た。

【００９１】（３）ハイブリドーマのスクリーニング二週間後に組換えＡＳＴをコートしたプレートによるス
クリーニングを行なった。組換えＡＳＴの５０ｍＭＮ
ａ₂ＣＯ₃緩衝液溶液（１μｇ／ｍＬ、ｐＨ１０．５）を
９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＰＶＣ製）に各
ウェル当り５０μＬづつ分注し、４℃で１晩放置した。
洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェル当り２００μＬ
加えて３７℃で１時間ブロッキングした。再度洗浄後、
各ウェル当り５０μＬの培養上清を加え、室温で１時間
放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄し
た。次に、３％ＢＳＡおよび０．２％スキムミルクを含
むＰＢＳで２０００倍に希釈したやぎ抗マウスＩｇＧ−
アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔａｇｏ社）
をウェル当り５０μＬ加え、室温で１時間放置した。再
度洗浄し、０．２５ｍＭの塩化マグネシウムを含む１Ｍ
ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶解したｐ
−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩（和光純
薬）の１ｍｇ／ｍＬ溶液をウェル当り１００μＬ加え、
室温で３０分間反応させた。この４０５ｎｍにおける吸
光度を９６ウェルプレート用のＥＬＩＳＡリーダー測定
器（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤａｖｉｃｅ社Ｖｍａｘ）を
用いて調べ、組換えＡＳＴと結合するモノクローナル抗
体を分泌するハイブリドーマを選択した。

【００９２】（４）ハイブリドーマのクローニングこのように選択したハイブリドーマについて限界希釈法
によるクローニングを２回行ない、株化した。具体的に
はマウス腹腔浸出細胞をＨＴ培地中１０⁶個／ｍＬの割
合に調製したものを各ウェルに分注し、これにウェル当
り０．５個の割合でＨＴ培地に懸濁したハイブリドーマ
細胞を播き込んだ。５％ＣＯ₂のＣＯ₂インキュベーター
内で３７℃で２週間培養し、その培養上清について上記
ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、単一コロニーをピッ
クアップすることで株化を行なった。

【００９３】（５）ハイブリドーマの培養および抗体精
製以上の操作で得られた抗ＡＳＴ抗体を産生するハイブリ
ドーマ２０クローンのうち６クローンをインシュリン、
トランスフェリン、エタノールアミン、セレナイトを含
む無血清培地であるｅＲＤＦ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
社）に適応させて培養し、培養上清を回収した。培養上
清中の抗体をＰｒｏｔｅｉｎＧカラムで常法により精製
した。

【００９４】（６）ＡＳＴモノクローナル抗体のサブタ
イピング（５）の操作で得られた精製抗ＡＳＴモノクローナル抗
体６クローンに関し、ＩｓｏＳｔｒｉｐ（マウスモノク
ローナル抗体のアイソタイピングキット、ベーリンガー
社製）を用いてプロトコールに従い、サブタイピングを
行った。その結果、＃Ａ３、＃Ｂ３、＃Ｂ５の３クロー
ンがＩｇＧ１であり、＃Ａ６、＃Ｃ２がＩｇＭであるこ
とが判明した。＃Ｃ３は不明であった。

【００９５】［実施例１０］抗ＡＳＴ抗体によるウエス
タンブロッティング組換えＡＳＴもしくは天然ＡＳＴを還元条件下でＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画後、ニトロセル
ロース膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にウエスタンブロッティ
ングした。３％ＢＳＡを含むＰＢＳで室温で１晩処理
後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈し
た実施例８、９で得られた抗ＡＳＴ抗体と室温で１時間
反応させた。ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳで６回洗浄後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで２５μｇ
／ｍＬに希釈したアルカリホスファターゼと結合させた
ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社）と室温で１時間反
応させた。ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで６回洗浄後、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウ
ムクロリド）／ＢＩＣＰ（５−ブロモ−４−クロロ−
３’−インドールホスフェートｐ−トルイジン塩、Ｐ
ＩＥＲＣＥ社）で室温で１０分間反応させて発色させ
た。図５および図６に結果を示す。

【００９６】これにより、それぞれの抗ＡＳＴ抗体が組
換えＡＳＴと結合することが示された。ウエスタンブロ
ッティングの反応性は、モノクローナル抗体においては
＃Ａ３および＃Ｂ５の反応性が高く、＃Ｂ３の反応性は
非常に低かった。またポリクローナル抗体では抗Ｎ−１
９抗体（ａｎｔｉ−Ｎ１９ＰＡｂ）が反応性が高く、
抗ｒＡＳＴ抗体（ａｎｔｉ−ｒＡＳＴＰＡｂ）は反応
性が低かった。また、ａｎｔｉ−ｒＡＳＴＰＡｂはマ
ストセル由来トリプターゼおよびトリプシンとは交差反
応性を示さなかった。なお、ネガティブコントロールと
しては正常ウサギＩｇＧを使用した（図７参照）。

【００９７】［実施例１１］ＡＳＴ阻害活性の評価（１）ＡＳＴ活性の測定方法トリプシン用合成基質Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
−ＭＣＡ（ＭＣＡ：メチルクマリンアミド）を１００μ
Ｍ、ＢＳＡを０．０１％含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）１．０ｍＬに対し、ＡＳＴ
含有溶液を５０μＬ加え、３７℃で１時間インキュベー
トした。次いで１ｍＬの３０％酢酸を加えて生成した７
−アミノー４−メチルクマリン（ＡＭＣ）量を蛍光測定
により定量し（蛍光４６０ｎｍ、励起光３８０ｎｍ）、
酵素の活性を算出した。１分間に１ｐＭのＡＭＣを生成
させる活性を１単位と定義する。

【００９８】（２）抗ＡＳＴ抗体のＡＳＴ阻害活性の評
価組換えＡＳＴを２ｎｇ／ｍＬ、ＢＳＡを０．０１％含有
する５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
０．５ｍＬに対し、抗ＡＳＴ抗体含有溶液を５０μＬ加
え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ト
リプシン用合成基質Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
ＭＣＡを２００μＭ含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ８．６）０．５ｍＬを加え、３７℃で１時
間インキュベートした。次いで１ｍＬの３０％酢酸を加
え、生成したＡＭＣ量を蛍光測定により測定し（蛍光４
６０ｎｍ、励起光３８０ｎｍ）、抗ＡＳＴ抗体の酵素活
性阻害能を評価した。結果を図８に示す。実施例におい
て取得した組換えＡＳＴ（昆虫細胞−バキュロウイルス
系）を免疫して得られた抗ＡＳＴポリクローナル抗体
に、２３６μｇ／ｍＬの濃度で２７％の活性阻害効果が
認められた。

【００９９】［実施例１２］ＡＳＴ測定系の構築（１）ポリクローナル抗体によるサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ系の構築実施例２（Ｂ）で得られた抗ＡＳＴポリクローナル抗体
（ａｎｔｉ−ｒＡＳＴＰＡｂ）を用いて以下の操作を行
ない、サンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。

【０１００】Ａ．ホースラディッシュ・ペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）標識抗体の調製ａ）抗体（Ｆ（ａｂ’）₂）の調製抗体（ＩｇＧ）の２．０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液１ｍＬ
に１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μＬと、４０
μｇのペプシンを２０μＬの同緩衝液に溶解して加え、
３７℃で４時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳにて平
衡化したセファデックスＧ２５カラム（φ２ｃｍ×４５
ｃｍ）を用いて分離し、抗体（Ｆ（ａｂ’）₂）を採取
した。ｂ）抗体（Ｆ（ａｂ’）₂）のＨＲＰ標識抗体（Ｆ（ａｂ’）₂）の１ｍｇ／ｍＬ、０．０１Ｍリ
ン酸、０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶液２ｍＬ
に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）１０ｍｇ／ｍＬの濃度のジメチ
ルホルムアミド溶液５０μＬを添加し、２５℃の温度で
３０分間反応させた。次いでセファデックスＧ−２５を
充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）でゲル濾過を行ない、マレイミド化抗体と未反
応ＭＢＳとを分離した。

【０１０１】一方、ＨＲＰの１０ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）溶液２ｍＬにＳ−アセチル
メルカプト無水コハク酸の６０ｍｇ／ｍＬジメチルホル
ムアミド溶液１２０μＬを加え、２５℃で２時間反応さ
せた。次に０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を８００μＬ、０．１ＭＥＤＴＡを１６０μＬ、１Ｍ
ヒドロキシルアミン１．６ｍＬを加え、０℃で４分間反
応させた。その後、反応液をコロジオンバッグに入れ、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５ｍＭＥＤＴＡ
含有溶液を用いて４℃で３日間透析し、チオール化ＨＲ
Ｐを得た。

【０１０２】次に、マレイミド化抗体２ｍｇとチオール
化ＨＲＰ４ｍｇとを混合し、コロジオンバッグを用いて
氷冷下に４〜１０ｍｇ／ｍＬの蛋白濃度になるまで濃縮
し、１５〜２０℃で一夜放置した。その液を、ウルトロ
ゲルＡｃＡ４４（ファルマシアＬＫＢ社製）を充填した
カラムでゲル濾過し、抗ＡＳＴ（Ｆ（ａｂ’）₂）ＨＲ
Ｐ標識抗体を得た。

【０１０３】Ｂ．抗体固定化プレートの調製９６ウェルプレート（住友ベークライト社製、ＭＳ−３
７９６Ｆ／カルボプレート）をよく洗浄し、抗体の２０
μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液中に４℃で１昼夜放置した。これ
をＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の
ＰＢＳ溶液中、４℃で１昼夜放置してポストコーティン
グ処理をして抗体固定化プレートを得た。

【０１０４】Ｃ．測定系の構成Ｂ．で調製した抗ＡＳＴ抗体ＩｇＧ固定化プレートに、
精製した組換えＡＳＴ（標準物質）を０〜１６００ｎｇ
／ｍＬの範囲で含有する１％ＢＳＡ−０．１％スキムミ
ルク含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液（検体希
釈液）１００μＬを添加し、２５℃で４時間インキュベ
ートした。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有１０
ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）により洗浄し、（Ａ）で作
成した抗ＡＳＴ（Ｆ（ａｂ’）₂）ＨＲＰ標識抗体（５
００μｇ／ｍＬ）の１％ＢＳＡ含有１０ｍＭＰＢＳ
（ｐＨ７．２）１００倍希釈溶液を１００μＬずつそれ
ぞれのウェルに添加し、２５℃で２時間インキュベート
した。次に各ウェル内の溶液を吸引除去した後、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．
２）により洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチル
ベンジジン塩酸塩０．０２％、Ｈ₂Ｏ₂２．５ｍＭを含
有する０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）
を１００μＬずつ各ウェルに加え、２５℃で３０分間反
応させた後、反応停止剤として０．５Ｍ硫酸水溶液を１
００μＬずつ加え、酵素反応を停止させた。次いでこの
溶液を分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長における吸
収強度を測定し、これを標準物質濃度０〜１６００ｎｇ
／ｍＬに対応してブロットした。結果を図９に示す。

【０１０５】Ｄ．生体内成分中のＡＳＴの検出ａ）唾液中のＡＳＴの検出Ｃ．の測定系を用いてヒト唾液中のＡＳＴの測定を行っ
た。ヒトから採取した唾液を１５０００ｒｐｍで１５分
間遠心した上清を測定サンプルとした。６検体につい
て、原液のままと１％ＢＳＡ−０．１％スキムミルク含
有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液（検体希釈液）
で１６倍に希釈したものに関して測定した。３検体に関
しては測定値が低いため原液の値を採用し、他の３検体
については１６倍希釈の値を採用し、唾液中のＡＳＴ濃
度とした。測定結果を検体中のＡＳＴ活性（トリプシン
基質分解活性）とともに表１に示す。

【０１０６】

【表１】

【０１０７】ｂ）喀痰中のＡＳＴの検出喀痰を慢性気道炎症患者より採取し、９倍量の生理食塩
水にて希釈した後、ホモジェナイズし、１００００×ｇ
で１０分間遠心した上清を測定検体とした。検体を２０
倍希釈し測定を行った結果を図１０に示す。膿性痰のほ
うが粘液性痰より低い測定値を示した。

【０１０８】ここで、粘液性−粘液膿性痰は以下の患者
より採取した。

【０１０９】ＣＢ；慢性気管支炎ＳｅｃＣＢ；続発性気管支炎ＢＡ；気管支喘息ＢＥ；気管支拡張症ＤＰＢ；びまん性汎細気管支炎また、膿性痰は以下の患者より採取した。ＢＥ；気管支拡張症ＤＰＢ；びまん性汎細気管支炎

【０１１０】（２）モノクローナル抗体およびポリクロ
ーナル抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築Ａ．各抗ＡＳＴモノクローナル抗体の液相抗原反応性の
評価サブタイピングによりＩｇＧ１タイプであった＃Ａ３、
＃Ｂ３、＃Ｂ５の３種の抗ＡＳＴモノクローナル抗体に
関して、液相中の組換えＡＳＴに対する結合性の評価を
おこなった。評価方法は実施例１２の（１）Ｂ．Ｃ．に
準じて行った。９６ウェルプレートに各抗ＡＳＴモノク
ローナル抗体のＰＢＳ溶液（１および５μｇ／ｍＬ）を
ウェルあたり５０μＬ加え、４℃で一晩静置してプレー
トに抗体を固定化した。調製した抗ＡＳＴモノクローナ
ル抗体固定化プレートに、精製した組換えＡＳＴ（標準
物質）を０〜３００ｎｇ／ｍＬの範囲で含有する１％Ｂ
ＳＡ−０．１％スキムミルク含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．２）溶液（検体希釈液）１００μＬを添加し、２
５℃で４時間インキュベートした。その後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で
洗浄し、Ａ．で作成したＨＲＰ標識抗体（５００μｇ／
ｍＬ）の１％ＢＳＡ含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．
２）１００倍希釈溶液を１００μＬずつそれぞれのウェ
ルに添加し、２５℃で２時間インキュベートした。次
に、各ウェル内の溶液を吸引除去した後、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗
浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩
酸塩０．０２％、Ｈ₂Ｏ₂２．５ｍＭを含有する０．１
Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を１００μＬ
ずつ各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させた後、
０．５Ｍ硫酸水溶液を１００μＬずつ加えて酵素反応を
停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４
５０ｎｍの波長における吸収強度を測定し、これを標準
物質濃度０〜３００ｎｇ／ｍＬに対応してブロットし
た。その結果、＃Ｂ３＞＃Ｂ５＞＃Ａ３の順で液相抗原
反応性が高いことが明らかとなった。結果を図１１に示
す。

【０１１１】Ｂ．測定系の構築ａ）ビオチン化抗体の作製Ａ．の評価結果においてもっとも液相抗原反応性の高か
った＃Ｂ３抗ＡＳＴモノクローナル抗体および実施例８
で得られた抗ＡＳＴポリクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｒ
ＡＳＴＰＡｂ）を用いてＩｇＧのビオチン化を以下の
ようにおこなった。１〜３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ／ＰＢＳ
（−）溶液１ｍＬと、等量の０．２ＭＮａＨＣＯ
₃（ｐＨ８．０）を混合し、つぎに１００倍のモル濃度
のビオチン化試薬１０ｍＭを加え、３７℃で１時間イン
キュベートした。ビオチン化試薬はＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉ
ｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製＃２１３３５）をジメチル
ホルムアミドで１０ｍＭに溶解し使用した。その後、１
０分の１量の１Ｍモノエタノールアミンを加え、さらに
３７℃で１時間インキュベートした。この反応液をＰＢ
Ｓ（−）にて２．５ｍＬにメスアップし、Ｇ−２５ゲル
濾過カラムにかけ、ＰＢＳ（−）で流出させてビオチン
化ＩｇＧを回収した。さらに、終濃度３％になるように
ＢＳＡを加え、終濃度０．１％になるようにＮａＮ₃を
加えて保存した。

【０１１２】ｂ）抗体固定化プレートの調製９６ウェルプレート（住友ベークライト社製、ＭＳ−３
７９６Ｆ／カルボプレート）をよく洗浄し、抗体（＃Ｂ
３およびａｎｔｉ−ｒＡＳＴＰＡｂ）の２０μｇ／ｍ
ＬのＰＢＳ溶液を１００μＬずつ各ウェルに加え、４℃
で１昼夜放置した。これをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０で洗浄し、１％牛血清アルブミンのＰＢＳ溶液を
３８０μＬ各ウェルに加え、４℃で１昼夜放置するポス
トコーティング処理をして抗体固定化プレートを得た。
ｃ）測定系の構築

【０１１３】ｂ）で調製した抗ＡＳＴＩｇＧ固定化プ
レートに、精製した組換えＡＳＴ（標準物質）を０〜４
００ｎｇ／ｍＬの範囲で含有する１％ＢＳＡ−０．１％
スキムミルク含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液
（検体希釈液）５０μＬおよびａ）で作製したビオチン
化ＩｇＧを１０μｇ／ｍＬ含有する１％ＢＳＡ−０．１
％スキムミルク含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶
液を５０μＬ添加し、４℃で一晩静置した。つぎにプレ
ートを洗浄した後、１００μＬ／ウェルでストレプトア
ビジン標識ペルオキシダーゼ（ＴＡＧＯ社製、＃ＳＮＮ
１００４）を１万倍希釈した１％ＢＳＡ−０．１％スキ
ムミルク含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液を加
え、２５℃で１時間インキュベートした。次に各ウェル
内の溶液を吸引除去した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
含有１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、３，
３’５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩０．０２
％、Ｈ₂Ｏ₂２．５ｍＭを含有する０．１Ｍリン酸／ク
エン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を１００μＬずつ各ウェル
に加え、２５℃で１５分間反応させた後、０．５Ｍ硫酸
水溶液を１００μＬずつ加えて酵素反応を停止させた。
次いで、この溶液を分光光度計を用いて４５０ｎｍの波
長における吸収強度を測定し、これを標準物質濃度０〜
２００ｎｇ／ｍＬに対応してブロットした。結果を図１
２に示す。

【０１１４】

【発明の効果】本発明によれば、プロペプチド部分の全
体あるいは一部がトリプシン様蛋白部分とジスルフィド
結合を介して結合する構造を有するＡＳＴが提供され
る。これを用いて該構造を有する酵素のＰＡＲを活性化
することを指標とした阻害剤のスクリーニング系を構築
し、阻害剤をスクリーニングすることによって、ＡＳＴ
阻害剤および阻害ポリペプチド（阻害抗体を含む）を得
ることができる。このようにして得られたＡＳＴ阻害剤
もしくはＡＳＴのＰＡＲ活性化阻害剤を治療薬として用
いることにより、ＡＳＴのもつ直接的あるいはＰＡＲを
介することによる広義の気道炎症への作用、気道リモデ
リングへの作用、粘液繊毛運動に対する作用、凝固・線
溶系における作用、癌の増殖や転移に関する作用、抗ウ
イルス感染作用等の生理作用を抑制もしくは修飾し、発
症の予防あるいは病態における改善および治療に用いる
ことが期待できる。

【０１１５】また、本発明のマウスＡＳＴなど動物ＡＳ
Ｔの配列に基づいた、動物ＡＳＴの蛋白発現あるいは遺
伝子発現を測定あるいは制御することにより、どのよう
な病態モデル動物においてどのような時期にＡＳＴが病
態に関与しているかを判定することができる。また、本
発明を利用することにより選ばれたＡＳＴ阻害剤および
阻害ポリペプチド（阻害抗体を含む）の治療効果判定や
臨床投与量の推定をすることができる。

【０１１６】さらに、本発明のモノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、組
織での発現部位を検出することができる。また、本発明
のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用い
た酵素免疫測定系あるいは診断薬、診断キットによれ
ば、例えば唾液中、喀痰中あるいは血清中のＡＳＴ濃度
を測定することができ、ＡＳＴ関与の病態の把握、診断
に有用であることが期待される。

【０１１７】

【配列表】

【０１１８】 <110> 帝人株式会社 <120> 気道特異的トリプシン様酵素およびその利用法 <130> P33704 <160> 25 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Tyr Arg Pro Ala Arg Val Thr Ser Thr Ser Arg Phe Leu Asn 1 5 10 15 Pro Tyr Val Val Cys Phe Ile Val Val Ala Gly Val Val Ile Leu 20 25 30 Ala Val Thr Ile Ala Leu Leu Val Tyr Phe Leu Ala Phe Asp Gln 35 40 45 Lys Ser Tyr Phe Tyr Arg Ser Ser Phe Gln Leu Leu Asn Val Glu 50 55 60 Tyr Asn Ser Gln Leu Asn Ser Pro Ala Thr Gln Glu Tyr Arg Thr 65 70 75 Leu Ser Gly Arg Ile Glu Ser Leu Ile Thr Lys Thr Phe Lys Glu 80 85 90 Ser Asn Leu Arg Asn Gln Phe Ile Arg Ala His Val Ala Lys Leu 95 100 105 Arg Gln Asp Gly Ser Gly Val Arg Ala Asp Val Val Met Lys Phe 110 115 120 Gln Phe Thr Arg Asn Asn Asn Gly Ala Ser Met Lys Ser Arg Ile 125 130 135 Glu Ser Val Leu Arg Gln Met Leu Asn Asn Ser Gly Asn Leu Glu 140 145 150 Ile Asn Pro Ser Thr Glu Ile Thr Ser Leu Thr Asp Gln Ala Ala 155 160 165 Ala Asn Trp Leu Ile Asn Glu Cys Gly Ala Gly Pro Asp Leu Ile 170 175 180 Thr Leu Ser Glu Gln Arg Ile Leu Gly Gly Thr Glu Ala Glu Glu 185 190 195 Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Leu Asn Asn Ala His 200 205 210 His Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Asn Met Trp Ile Leu Thr Ala 215 220 225 Ala His Cys Phe Arg Ser Asn Ser Asn Pro Arg Asp Trp Ile Ala 230 235 240 Thr Ser Gly Ile Ser Thr Thr Phe Pro Lys Leu Arg Met Arg Val 245 250 255 Arg Asn Ile Leu Ile His Asn Asn Tyr Lys Ser Ala Thr His Glu 260 265 270 Asn Asp Ile Ala Leu Val Arg Leu Glu Asn Ser Val Thr Phe Thr 275 280 285 Lys Asp Ile His Ser Val Cys Leu Pro Ala Ala Thr Gln Asn Ile 290 295 300 Pro Pro Gly Ser Thr Ala Tyr Val Thr Gly Trp Gly Ala Gln Glu 305 310 315 Tyr Ala Gly His Thr Val Pro Glu Leu Arg Gln Gly Gln Val Arg 320 325 330 Ile Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Ala Pro His Ser Tyr Asn Gly 335 340 345 Ala Ile Leu Ser Gly Met Leu Cys Ala Gly Val Pro Gln Gly Gly 350 355 360 Val Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Gln Glu 365 370 375 Asp Ser Arg Arg Leu Trp Phe Ile Val Gly Ile Val Ser Trp Gly 380 385 390 Asp Gln Cys Gly Leu Pro Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val 395 400 405 Thr Ala Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Gln Gln Thr Gly Ile 410 415 418

【０１１９】 <210> 2 <211> 417 <212> PRN <213> Mus musculus <400> 2 Met Tyr Arg Pro Arg Pro Met Leu Ser Pro Ser Arg Phe Phe Thr 1 5 10 15 Pro Phe Ala Val Ala Phe Val Val Ile Ile Thr Val Gly Leu Leu 20 25 30 Ala Met Met Ala Gly Leu Leu Ile His Phe Leu Ala Phe Asp Lys 35 40 45 Lys Ala Tyr Phe Tyr His Ser Ser Phe Gln Ile Leu Asn Val Glu 50 55 60 Tyr Thr Glu Ala Leu Asn Ser Pro Ala Thr His Glu Tyr Arg Thr 65 70 75 Leu Ser Glu Arg Ile Glu Ala Met Ile Thr Asp Glu Phe Arg Gly 80 85 90 Ser Ser Leu Lys Ser Glu Phe Ile Arg Thr His Val Val Lys Leu 95 100 105 Arg Lys Glu Gly Thr Gly Val Val Ala Asp Val Val Met Lys Phe 110 115 120 Arg Ser Ser Lys Arg Asn Asn Arg Lys Val Met Lys Thr Arg Ile 125 130 135 Gln Ser Val Leu Arg Arg Leu Ser Ser Ser Gly Asn Leu Glu Ile 140 145 150 Ala Pro Ser Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Asp Gln Asp Thr Glu 155 160 165 Asn Val Leu Thr Gln Glu Cys Gly Ala Arg Pro Asp Leu Ile Thr 170 175 180 Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ile Gly Gly Met Gln Ala Glu Pro Gly 185 190 195 Asp Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Leu Asn Asn Val His His 200 205 210 Cys Gly Gly Ala Leu Ile Ser Asn Met Trp Val Leu Thr Ala Ala 215 220 225 His Cys Phe Lys Ser Tyr Pro Asn Pro Gln Tyr Trp Thr Ala Thr 230 235 240 Phe Gly Val Ser Thr Met Ser Pro Arg Leu Arg Val Arg Val Arg 245 250 255 Ala Ile Leu Ala His Asp Gly Tyr Ser Ser Val Thr Arg Asp Asn 260 265 270 Asp Ile Ala Val Val Gln Leu Asp Arg Ser Val Ala Phe Ser Arg 275 280 285 Asn Ile His Arg Val Cys Leu Pro Ala Ala Thr Gln Asn Ile Ile 290 295 300 Pro Gly Ser Val Ala Tyr Val Thr Gly Trp Gly Ser Leu Thr Tyr 305 310 315 Gly Gly Asn Ala Val Thr Asn Leu Arg Gln Gly Glu Val Arg Ile 320 325 330 Ile Ser Ser Glu Glu Cys Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Ser Gly Ser 335 340 345 Val Leu Pro Gly Met Leu Cys Ala Gly Met Arg Ser Gly Ala Val 350 355 360 Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Gln Glu Asp 365 370 375 Ser Arg Arg Leu Trp Phe Val Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr 380 385 390 Gln Cys Gly Leu Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Thr 395 400 405 Ala Tyr Arg Asn Trp Ile Arg Gln Gln Thr Gly Ile 410 415 417

【０１２０】 <210> 3 <211> 1500 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gagtgggaat ctcaaagcag ttgagtaggc agaaaaaaga acctcttcat 50 taaggattaa a atg tat agg cca gca cgt gta act tcg act tca 94 Met Tyr Arg Pro Ala Arg Val Thr Ser Thr Ser 1 5 10 aga ttt ctg aat cca tat gta gta tgt ttc att gtc gtc gca ggg 139 Arg Phe Leu Asn Pro Tyr Val Val Cys Phe Ile Val Val Ala Gly 15 20 25 gta gtg atc ctg gca gtc acc ata gct cta ctt gtt tac ttt tta 184 Val Val Ile Leu Ala Val Thr Ile Ala Leu Leu Val Tyr Phe Leu 30 35 40 gct ttt gat caa aaa tct tac ttt tat agg agc agt ttt caa ctc 229 Ala Phe Asp Gln Lys Ser Tyr Phe Tyr Arg Ser Ser Phe Gln Leu 45 50 55 cta aat gtt gaa tat aat agt cag tta aat tca cca gct aca cag 274 Leu Asn Val Glu Tyr Asn Ser Gln Leu Asn Ser Pro Ala Thr Gln 60 65 70 gaa tac agg act ttg agt gga aga att gaa tct ctg att act aaa 319 Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Gly Arg Ile Glu Ser Leu Ile Thr Lys 75 80 85 aca ttc aaa gaa tca aat tta aga aat cag ttc atc aga gct cat 364 Thr Phe Lys Glu Ser Asn Leu Arg Asn Gln Phe Ile Arg Ala His 90 95 100 gtt gcc aaa ctg agg caa gat ggt agt ggt gtg aga gcg gat gtt 409 Val Ala Lys Leu Arg Gln Asp Gly Ser Gly Val Arg Ala Asp Val 105 110 115 gtc atg aaa ttt caa ttc act aga aat aac aat gga gca tca atg 454 Val Met Lys Phe Gln Phe Thr Arg Asn Asn Asn Gly Ala Ser Met 120 125 130 aaa agc aga att gag tct gtt tta cga caa atg ctg aat aac tct 499 Lys Ser Arg Ile Glu Ser Val Leu Arg Gln Met Leu Asn Asn Ser 135 140 145 gga aac ctg gaa ata aac cct tca act gag ata aca tca ctt act 544 Gly Asn Leu Glu Ile Asn Pro Ser Thr Glu Ile Thr Ser Leu Thr 150 155 160 gac cag gct gca gca aat tgg ctt att aat gaa tgt ggg gcc ggt 589 Asp Gln Ala Ala Ala Asn Trp Leu Ile Asn Glu Cys Gly Ala Gly 165 170 175 cca gac cta ata aca ttg tct gag cag aga atc ctt gga ggc act 634 Pro Asp Leu Ile Thr Leu Ser Glu Gln Arg Ile Leu Gly Gly Thr 180 185 190 gag gct gag gag gga agc tgg ccg tgg caa gtc agt ctg cgg ctc 679 Glu Ala Glu Glu Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Leu 195 200 205 aat aat gcc cac cac tgt gga ggc agc ctg atc aat aac atg tgg 724 Asn Asn Ala His His Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Asn Met Trp 210 215 220 atc ctg aca gca gct cac tgc ttc aga agc aac tct aat cct cgt 769 Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Arg Ser Asn Ser Asn Pro Arg 225 230 235 gac tgg att gcc acg tct ggt att tcc aca aca ttt cct aaa cta 814 Asp Trp Ile Ala Thr Ser Gly Ile Ser Thr Thr Phe Pro Lys Leu 240 245 250 aga atg aga gta aga aat att tta att cat aac aat tat aaa tct 859 Arg Met Arg Val Arg Asn Ile Leu Ile His Asn Asn Tyr Lys Ser 255 260 265 gca act cat gaa aat gac att gca ctt gtg aga ctt gag aac agt 904 Ala Thr His Glu Asn Asp Ile Ala Leu Val Arg Leu Glu Asn Ser 270 275 280 gtc acc ttt acc aaa gat atc cat agt gtg tgt ctc cca gct gct 949 Val Thr Phe Thr Lys Asp Ile His Ser Val Cys Leu Pro Ala Ala 285 290 295 acc cag aat att cca cct ggc tct act gct tat gta aca gga tgg 994 Thr Gln Asn Ile Pro Pro Gly Ser Thr Ala Tyr Val Thr Gly Trp 300 305 310 ggc gct caa gaa tat gct ggc cac aca gtt cca gag cta agg caa 1039 Gly Ala Gln Glu Tyr Ala Gly His Thr Val Pro Glu Leu Arg Gln 315 320 325 gga cag gtc aga ata ata agt aat gat gta tgt aat gca cca cat 1084 Gly Gln Val Arg Ile Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Ala Pro His 330 335 340 agt tat aat gga gcc atc ttg tct gga atg ctg tgt gct gga gta 1129 Ser Tyr Asn Gly Ala Ile Leu Ser Gly Met Leu Cys Ala Gly Val 345 350 355 cct caa ggt gga gtg gac gca tgt cag ggt gac tct ggt ggc cca 1174 Pro Gln Gly Gly Val Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 360 365 370 cta gta caa gaa gac tca cgg cgg ctt tgg ttt att gtg ggg ata 1219 Leu Val Gln Glu Asp Ser Arg Arg Leu Trp Phe Ile Val Gly Ile 375 380 385 gta agc tgg gga gat cag tgt ggc ctg ccg gat aag cca gga gtg 1264 Val Ser Trp Gly Asp Gln Cys Gly Leu Pro Asp Lys Pro Gly Val 390 395 400 tat act cga gtg aca gcc tac ctt gac tgg att agg caa caa act 1309 Tyr Thr Arg Val Thr Ala Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Gln Gln Thr 405 410 415 ggg atc tag tgcaacaagt gcatccctgt tgcaaagtct gtatgcaggt 1358 Gly Ile 418 gtgcctgtct taaattccaa agctttacat ttcaactgaa aaagaaacta 1408 gaaatgtcct aatttaacat cttgttacat aaatatggtt taacaaacac 1458 tgtttaacct ttctttatta ttaaaggttt tctattttct cc 1500

【０１２１】 <210> 4 <211> 1462 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 cgccgggcag gtcaaagcag ctggacacac agaaacaagg acctcttcat 50 tattcaagag taaa atg tat agg cca aga cca atg cta tca ccg tca 97 Met Tyr Arg Pro Arg Pro Met Leu Ser Pro Ser 1 5 10 aga ttc ttc act ccc ttt gca gta gct ttc gtt gtc ata ata acg 142 Arg Phe Phe Thr Pro Phe Ala Val Ala Phe Val Val Ile Ile Thr 15 20 25 gta ggg ctc ctg gcc atg atg gca ggt cta ctt att cac ttt tta 187 Val Gly Leu Leu Ala Met Met Ala Gly Leu Leu Ile His Phe Leu 30 35 40 gct ttt gac aag aaa gct tac ttt tat cat agc agc ttt caa atc 232 Ala Phe Asp Lys Lys Ala Tyr Phe Tyr His Ser Ser Phe Gln Ile 45 50 55 cta aac gtt gaa tac act gag gct tta aac tca cca gct aca cac 277 Leu Asn Val Glu Tyr Thr Glu Ala Leu Asn Ser Pro Ala Thr His 60 65 70 gaa tac aga acc ttg agt gaa aga att gag gct atg att act gat 322 Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Glu Arg Ile Glu Ala Met Ile Thr Asp 75 80 85 gaa ttt cga gga tca agt cta aaa agt gag ttt atc agg aca cat 367 Glu Phe Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ser Glu Phe Ile Arg Thr His 90 95 100 gtt gtc aaa cta aga aaa gaa ggg act ggt gtg gtt gcg gat gtt 412 Val Val Lys Leu Arg Lys Glu Gly Thr Gly Val Val Ala Asp Val 105 110 115 gtc atg aaa ttt cga tct agt aaa cgt aac aac aga aag gta atg 457 Val Met Lys Phe Arg Ser Ser Lys Arg Asn Asn Arg Lys Val Met 120 125 130 aaa acc aga att caa tct gtg cta cga aga ctc agc agc tct gga 502 Lys Thr Arg Ile Gln Ser Val Leu Arg Arg Leu Ser Ser Ser Gly 135 140 145 aac ttg gaa ata gcc cct tcg aat gag ata aca tca ctc act gac 547 Asn Leu Glu Ile Ala Pro Ser Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Asp 150 155 160 cag gat aca gaa aat gtt ttg act caa gaa tgt gga gca cgt cca 592 Gln Asp Thr Glu Asn Val Leu Thr Gln Glu Cys Gly Ala Arg Pro 165 170 175 gac ctt ata aca ctg tca gaa gag aga atc att gga ggc atg caa 637 Asp Leu Ile Thr Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ile Gly Gly Met Gln 180 185 190 gct gag ccc ggt gac tgg ccc tgg caa gtc agt cta cag ctc aat 682 Ala Glu Pro Gly Asp Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Leu Asn 195 200 205 aat gtc cac cac tgt gga ggt gcc ctg atc agt aac atg tgg gtc 727 Asn Val His His Cys Gly Gly Ala Leu Ile Ser Asn Met Trp Val 210 215 220 ctg aca gca gct cat tgc ttc aaa agc tat cct aat cct caa tat 772 Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Lys Ser Tyr Pro Asn Pro Gln Tyr 225 230 235 tgg aca gcc acc ttt ggg gtt tct aca atg agc cct agg ctg aga 817 Trp Thr Ala Thr Phe Gly Val Ser Thr Met Ser Pro Arg Leu Arg 240 245 250 gtg aga gta agg gct att tta gcc cac gac ggg tac agc tcc gta 862 Val Arg Val Arg Ala Ile Leu Ala His Asp Gly Tyr Ser Ser Val 255 260 265 act cgt gac aat gac atc gca gtt gta caa ctt gac aga tct gtc 907 Thr Arg Asp Asn Asp Ile Ala Val Val Gln Leu Asp Arg Ser Val 270 275 280 gcc ttt tcc aga aat atc cat agg gta tgt ctc cca gca gca acc 952 Ala Phe Ser Arg Asn Ile His Arg Val Cys Leu Pro Ala Ala Thr 285 290 295 caa aat atc atc cct ggt tct gtc gca tat gtt aca gga tgg gga 997 Gln Asn Ile Ile Pro Gly Ser Val Ala Tyr Val Thr Gly Trp Gly 300 305 310 tct ctc aca tat gga ggc aac gca gtc aca aat cta cgg caa gga 1042 Ser Leu Thr Tyr Gly Gly Asn Ala Val Thr Asn Leu Arg Gln Gly 315 320 325 gaa gtc aga ata ata agt tca gaa gaa tgc aat acg cca gct ggt 1087 Glu Val Arg Ile Ile Ser Ser Glu Glu Cys Asn Thr Pro Ala Gly 330 335 340 tac agt gga agt gtc ttg cca gga atg ctg tgt gct gga atg cgt 1132 Tyr Ser Gly Ser Val Leu Pro Gly Met Leu Cys Ala Gly Met Arg 345 350 355 tca ggg gcc gtg gat gca tgc cag ggt gat tca ggt ggc ccg cta 1177 Ser Gly Ala Val Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 360 365 370 gta caa gaa gac tca agg cgg ctt tgg ttt gtt gtg ggc att gtg 1222 Val Gln Glu Asp Ser Arg Arg Leu Trp Phe Val Val Gly Ile Val 375 380 385 agc tgg gga tat cag tgt ggc ctc cca aat aag cca ggc gtg tat 1267 Ser Trp Gly Tyr Gln Cys Gly Leu Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr 390 395 400 act cga gtg aca gcc tac cgc aac tgg atc aga cag cag acg gga 1312 Thr Arg Val Thr Ala Tyr Arg Asn Trp Ile Arg Gln Gln Thr Gly 405 410 415 atc tag tgcaaccgag gaaaaaacgt gccatgaggt ctctgtatcc 1358 Ile 417 aagtgtgact gactcggatg ccatggcttc acatttcaac tgcaaaggag 1408 actggaaatg ccccttctga cgtcccatta cataaattgg tttaactgtt 1458 tagt 1462

【０１２２】 <210> 5 <211> 1462 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 5 cgccgggcag gucaaagcag cuggacacac agaaacaagg accucuucau uauucaagag 60 uaaaauguau aggccaagac caaugcuauc accgucaaga uucuucacuc ccuuugcagu 120 agcuuucguu gucauaauaa cgguagggcu ccuggccaug auggcagguc uacuuauuca 180 cuuuuuagcu uuugacaaga aagcuuacuu uuaucauagc agcuuucaaa uccuaaacgu 240 ugaauacacu gaggcuuuaa acucaccagc uacacacgaa uacagaaccu ugagugaaag 300 aauugaggcu augauuacug augaauuucg aggaucaagu cuaaaaagug aguuuaucag 360 gacacauguu gucaaacuaa gaaaagaagg gacuggugug guugcggaug uugucaugaa 420 auuucgaucu aguaaacgua acaacagaaa gguaaugaaa accagaauuc aaucugugcu 480 acgaagacuc agcagcucug gaaacuugga aauagccccu ucgaaugaga uaacaucacu 540 cacugaccag gauacagaaa auguuuugac ucaagaaugu ggagcacguc cagaccuuau 600 aacacuguca gaagagagaa ucauuggagg caugcaagcu gagcccggug acuggcccug 660 gcaagucagu cuacagcuca auaaugucca ccacugugga ggugcccuga ucaguaacau 720 guggguccug acagcagcuc auugcuucaa aagcuauccu aauccucaau auuggacagc 780 caccuuuggg guuucuacaa ugagcccuag gcugagagug agaguaaggg cuauuuuagc 840 ccacgacggg uacagcuccg uaacucguga caaugacauc gcaguuguac aacuugacag 900 aucugucgcc uuuuccagaa auauccauag gguaugucuc ccagcagcaa cccaaaauau 960 caucccuggu ucugucgcau auguuacagg auggggaucu cucacauaug gaggcaacgc 1020 agucacaaau cuacggcaag gagaagucag aauaauaagu ucagaagaau gcaauacgcc 1080 agcugguuac aguggaagug ucuugccagg aaugcugugu gcuggaaugc guucaggggc 1140 cguggaugca ugccagggug auucaggugg cccgcuagua caagaagacu caaggcggcu 1200 uugguuuguu gugggcauug ugagcugggg auaucagugu ggccucccaa auaagccagg 1260 cguguauacu cgagugacag ccuaccgcaa cuggaucaga cagcagacgg gaaucuagug 1320 caaccgagga aaaaacgugc caugaggucu cuguauccaa gugugacuga cucggaugcc 1380 auggcuucac auuucaacug caaaggagac uggaaaugcc ccuucugacg ucccauuaca 1440 uaaauugguu uaacuguuua gu 1462

【０１２３】 <210> 6 <211> 1462 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 cgccgggcag gtcaaagcag ctggacacac agaaacaagg acctcttcat 50 tattcaagag taaa atg tat agg cca aga cca atg cta tca ccg tca 97 Met Tyr Arg Pro Arg Pro Met Leu Ser Pro Ser 1 5 10 aga ttc ttc act ccc ttt gca gta gct ttc gtt gtc ata ata acg 142 Arg Phe Phe Thr Pro Phe Ala Val Ala Phe Val Val Ile Ile Thr 15 20 25 gta ggg ctc ctg gcc atg atg gca ggt cta ctt att cac ttt tta 187 Val Gly Leu Leu Ala Met Met Ala Gly Leu Leu Ile His Phe Leu 30 35 40 gct ttt gac aag aaa gct tac ttt tat cat agc agc ttt caa atc 232 Ala Phe Asp Lys Lys Ala Tyr Phe Tyr His Ser Ser Phe Gln Ile 45 50 55 cta aac gtt gaa tac act gag gct tta aac tca cca gct aca cac 277 Leu Asn Val Glu Tyr Thr Glu Ala Leu Asn Ser Pro Ala Thr His 60 65 70 gaa tac aga acc ttg agt gaa aga att gag gct atg att act gat 322 Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Glu Arg Ile Glu Ala Met Ile Thr Asp 75 80 85 gaa ttt cga gga tca agt cta aaa agt gag ttt atc agg aca cat 367 Glu Phe Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ser Glu Phe Ile Arg Thr His 90 95 100 gtt gtc aaa cta aga aaa gaa ggg act ggt gtg gtt gcg gat gtt 412 Val Val Lys Leu Arg Lys Glu Gly Thr Gly Val Val Ala Asp Val 105 110 115 gtc atg aaa ttt cga tct agt aaa cgt aac aac aga aag gta atg 457 Val Met Lys Phe Arg Ser Ser Lys Arg Asn Asn Arg Lys Val Met 120 125 130 aaa acc aga att caa tct gtg cta cga aga ctc agc agc tct gga 502 Lys Thr Arg Ile Gln Ser Val Leu Arg Arg Leu Ser Ser Ser Gly 135 140 145 aac ttg gaa ata gcc cct tcg aat gag ata aca tca ctc act gac 547 Asn Leu Glu Ile Ala Pro Ser Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Asp 150 155 160 cag gat aca gaa aat gtt ttg act caa gaa tgt gga gca cgt cca 592 Gln Asp Thr Glu Asn Val Leu Thr Gln Glu Cys Gly Ala Arg Pro 165 170 175 gac ctt ata aca ctg tca gaa gag aga atc att gga ggc atg caa 637 Asp Leu Ile Thr Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ile Gly Gly Met Gln 180 185 190 gct gag ccc ggt gac tgg ccc tgg caa gtc agt cta cag ctc aat 682 Ala Glu Pro Gly Asp Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Leu Asn 195 200 205 aat gtc cac cac tgt gga ggt gcc ctg atc agt aac atg tgg gtc 727 Asn Val His His Cys Gly Gly Ala Leu Ile Ser Asn Met Trp Val 210 215 220 ctg aca gca gct cat tgc ttc aaa agc tat cct aat cct caa tat 772 Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Lys Ser Tyr Pro Asn Pro Gln Tyr 225 230 235 tgg aca gcc acc ttt ggg gtt tct aca atg agc cct agg ctg aga 817 Trp Thr Ala Thr Phe Gly Val Ser Thr Met Ser Pro Arg Leu Arg 240 245 250 gtg aga gta agg gct att tta gcc cac gac ggg tac agc tcc gta 862 Val Arg Val Arg Ala Ile Leu Ala His Asp Gly Tyr Ser Ser Val 255 260 265 act cgt gac aat gac atc gca gtt gta caa ctt gac aga tct gtc 907 Thr Arg Asp Asn Asp Ile Ala Val Val Gln Leu Asp Arg Ser Val 270 275 280 gcc ttt tcc aga aat atc cat agg gta tgt ctc cca gca gca acc 952 Ala Phe Ser Arg Asn Ile His Arg Val Cys Leu Pro Ala Ala Thr 285 290 295 caa aat atc atc cct ggt tct gtc gca tat gtt aca gga tgg gga 997 Gln Asn Ile Ile Pro Gly Ser Val Ala Tyr Val Thr Gly Trp Gly 300 305 310 tct ctc aca tat gga ggc aac gca gtc aca aat cta cgg caa gga 1042 Ser Leu Thr Tyr Gly Gly Asn Ala Val Thr Asn Leu Arg Gln Gly 315 320 325 gag gtc aga ata ata agt tca gag gaa tgc aat acg cca gct ggt 1087 Glu Val Arg Ile Ile Ser Ser Glu Glu Cys Asn Thr Pro Ala Gly 330 335 340 tac agt gga agt gtc ttg cca gga atg ctg tgt gct gga atg cgt 1132 Tyr Ser Gly Ser Val Leu Pro Gly Met Leu Cys Ala Gly Met Arg 345 350 355 tca ggg gcc gtg gat gca tgc cag ggt gat tca ggt ggc ccg cta 1177 Ser Gly Ala Val Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 360 365 370 gta caa gaa gac tca agg cgg ctt tgg ttt gtt gtg ggc att gtg 1222 Val Gln Glu Asp Ser Arg Arg Leu Trp Phe Val Val Gly Ile Val 375 380 385 agc tgg gga tat cag tgt ggc ctc cca aat aag cca ggc gtg tat 1267 Ser Trp Gly Tyr Gln Cys Gly Leu Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr 390 395 400 act cga gtg aca gcc tac cgc aac tgg atc aga cag cag acg gga 1312 Thr Arg Val Thr Ala Tyr Arg Asn Trp Ile Arg Gln Gln Thr Gly 405 410 415 atc tag tgcaaccgag gaaaaaacgt gccatgaggt ctctgtatcc 1358 Ile 417 aagtgtgact gactcggatg ccatggcttc acatttcaac tgcaaaggag 1408 actggaaatg ccccttctga cgtcccatta cataaattgg tttaactgtt 1458 tagt 1462

【０１２４】<210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 aaggatccat ggggccgcgg cggctgct 28

【０１２５】<210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tgggaattcc taagttaaca gctttttg 28

【０１２６】<210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 cctttggatc caggaggatg cggagcccc 29

【０１２７】<210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ctgtggaatt cccatctgag gacctggaaa act 33

【０１２８】<210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cctttggatc catgaaagcc ctcatctttg cag 33

【０１２９】<210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 cctttgaatt cctattttgt aaggtaagca gtgga 35

【０１３０】<210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 cctttagatc tatgtggggg cgactgctcc tg 32

【０１３１】<210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cctttgaatt ctgtcactgg agcaaagagg a 31

【０１３２】<210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 tttactgttt tcgtaacagt tttg 24

【０１３３】<210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 caacaacgca cagaatctag 20

【０１３４】<210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 ctgacngcng cncaytgctt 20

【０１３５】<210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gtcrccctgr cangcrtc 18

【０１３６】<210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 acgcattcca gcacacagca 20

【０１３７】<210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 cacaaatcta cggcaaggag aggtcag 27

【０１３８】<210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 gaacttatta ttctgacctc tccttgc 27

【０１３９】<210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 ggaatgctgt gtgctggaat 20

【０１４０】<210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 ccaaaggatc caaatgtata ggccaagacc aatgctatca c 41

【０１４１】<210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 cctttgaatt cggaacgtca gaaggggcat ttccagtct 39

【０１４２】 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 25 Ile Leu Gly Gly Thr Glu Ala Glu Glu Gly Ser Trp Pro Trp Gln 1 5 10 15 Val Ser Leu Arg Cys 20

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＡＳＴとマウスＡＳＴのアミノ酸配列の相
同性を比較した図。

【図２】ＰＡＲ発現昆虫細胞を用いたＡＳＴによるカル
シウム流入を示す図。

【図３】正常ヒト気道上皮細胞を用いたＡＳＴによるカ
ルシウム流入を示す図。

【図４】気道上皮細胞株をもちいたＡＳＴによるカルシ
ウム流入を示す図。

【図５】本発明の抗ＡＳＴポリクローナル抗体の組換え
ＡＳＴに対するウエスタンブロッティングを行なった結
果を示す。

【図６】本発明の抗ＡＳＴモノクローナル抗体の組換え
ＡＳＴに対するウエスタンブロッティングを行なった結
果を示す。

【図７】本発明の抗ＡＳＴポリクローナル抗体の組換え
ＡＳＴおよびマストセルトリプターゼおよびトリプシン
に対するウエスタンブロッティングを行なった結果を示
す。

【図８】本発明の抗ＡＳＴ抗体の阻害活性を評価した結
果を示す。

【図９】本発明の抗ＡＳＴポリクローナル抗体をもちい
た測定系の組換えＡＳＴに対する標準曲線を示す。

【図１０】本発明の抗ＡＳＴポリクローナル抗体をもち
いた測定系により喀痰中のＡＳＴを測定した結果を示
す。

【図１１】本発明の抗ＡＳＴモノクローナル抗体と抗Ａ
ＳＴポリクローナル抗体の組換えＡＳＴに対する液相抗
原反応性を調べた結果を示す。

【図１２】本発明の抗ＡＳＴモノクローナル抗体と抗Ａ
ＳＴポリクローナル抗体をもちいた測定系の組換えＡＳ
Ｔに対する標準曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 11/06 ４Ｂ０６５ 11/00 17/00 ４Ｃ０５７ 11/06 19/02 ４Ｃ０８４ 17/00 25/02 ４Ｃ０８６ 19/02 27/16 ４Ｈ０４５ 25/02 35/00 27/16 43/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/76 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/76 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/573 ＡＧ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/02 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者三田麗子東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB10 BB20 BB46 BB48 BB51 CB01 CB09 DA20 FA29 FB02 FB03 GC10 4B024 AA01 AA11 BA14 BA44 BA63 CA04 DA02 EA02 EA04 GA03 GA09 GA11 GA18 GA27 HA03 4B050 CC01 CC03 DD11 EE01 FF05E FF09E LL01 LL03 LL05 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ36 QQ41 QQ61 QQ89 QR16 QR48 QR77 QR80 QS33 QS35 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91X AA93Y AA95X AC14 AC15 AC16 BA02 BA24 BB11 BC03 BC07 BD01 BD14 BD15 BD16 BD17 CA24 CA25 CA33 CA44 CA46 4C057 MM04 MM09 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA202 ZA342 ZA542 ZA592 ZA892 ZA962 ZB262 ZC202 ZC422 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA20 ZA34 ZA54 ZA59 ZA89 ZA96 ZB26 ZC20 ZC42 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA56 DA76 EA20 EA50 FA72 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示されるアミノ酸配列の全
部もしくは一部からなる蛋白であって、１番目のＭｅｔ
から１８６番目のＡｒｇの間のアミノ酸配列の全部もし
くは一部からなるプロペプチド部分と、１８７番目のＩ
ｌｅから４１８番目のＩｌｅまでの２３２アミノ酸の配
列からなるトリプシン様蛋白部分とが１本のジスルフィ
ド結合で連結されている構造を有する気道特異的トリプ
シン様酵素。
【請求項２】配列番号１に示されるアミノ酸配列と６
６％以上のホモロジーを有する蛋白であって、該プロペ
プチド部分に相当する部分と該トリプシン様蛋白部分に
相当する部分とが１本のジスルフィド結合で連結されて
いる構造を有する気道特異的トリプシン様酵素。
【請求項３】配列番号２に示されるアミノ酸配列の全
部もしくは一部からなる蛋白であって、１番目のＭｅｔ
から１８５番目のＡｒｇの間のアミノ酸配列の全部もし
くは一部からなるポリペプチド部分と、１８６番目のＩ
ｌｅから４１７番目のＩｌｅまでの２３２アミノ酸の配
列からなるポリペプチド部分とが１本のジスルフィド結
合で連結されている構造を有する気道特異的トリプシン
様酵素。
【請求項４】該プロペプチド部分と該トリプシン様蛋
白部分とが１７３番目のＣｙｓと２９２番目のＣｙｓと
のジスルフィド結合で連結されている構造を有する請求
項１記載の気道特異的トリプシン様酵素。
【請求項５】プロペプチド部分に相当する部分とトリ
プシン様蛋白部分に相当する部分とが、配列番号１に示
される気道特異的トリプシン様酵素のそれぞれ１７３番
目のＣｙｓと２９２番目のＣｙｓに相当するシステイン
残基とのジスルフィド結合で連結されている構造を有す
る請求項２記載の気道特異的トリプシン様酵素。
【請求項６】プロペプチド部分に相当する部分とトリ
プシン様蛋白部分に相当する部分が１７２番目のＣｙｓ
と２９１番目のＣｙｓとのジスルフィド結合で連結され
ている構造を有する請求項３記載の気道特異的トリプシ
ン様酵素。
【請求項７】プロペプチド部分のＮ末端アミノ酸が１
番目のＭｅｔから１７０番目のＩｌｅの間のアミノ酸で
ある請求項１または４記載の気道特異的トリプシン様酵
素。
【請求項８】プロペプチド部分のＮ末端アミノ酸が４
４番目のＡｓｐから１７０番目のＩｌｅの間のアミノ酸
である請求項１または４記載の気道特異的トリプシン様
酵素。
【請求項９】プロペプチド部分のＮ末端アミノ酸が１
４５番目のＡｓｎから１７０番目のＩｌｅの間のアミノ
酸である請求項１または４記載の気道特異的トリプシン
様酵素。
【請求項１０】プロペプチド部分が１４５番目のＡｓ
ｎ、１６２番目のＡｓｐ、１７０番目のＩｌｅのいずれ
かから１８６番目のＡｒｇまでである、請求項１または
４記載の気道特異的トリプシン様酵素。
【請求項１１】請求項１、４、７、８、９、または１
０記載の気道特異的トリプシン様酵素に特異的に結合す
る抗体。
【請求項１２】請求項２または５記載の気道特異的ト
リプシン様酵素に特異的に結合する抗体。
【請求項１３】請求項３または６記載の気道特異的ト
リプシン様酵素に特異的に結合する抗体。
【請求項１４】請求項１、４、７、８、９、または１
０記載の気道特異的トリプシン様酵素に特異的に結合す
るモノクローナル抗体。
【請求項１５】請求項２または５記載の気道特異的ト
リプシン様酵素に特異的に結合するモノクローナル抗
体。
【請求項１６】請求項３または６記載の気道特異的ト
リプシン様酵素に特異的に結合するモノクローナル抗
体。
【請求項１７】ヒト気道特異的トリプシン様酵素活性
を阻害するか、またはその活性化を阻害する請求項１４
記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】哺乳類気道特異的トリプシン様酵素活
性を阻害するか、またはその活性化を阻害する請求項１
５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】マウス気道特異的トリプシン様酵素活
性を阻害するか、またはその活性化を阻害する請求項１
６記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】請求項１１から１９のいずれかに記載
の抗体を用いて気道特異的トリプシン様酵素を検出し、
または測定する方法。
【請求項２１】請求項１１から１９のいずれかに記載
の抗体を用いる気道特異的トリプシン様酵素の酵素免疫
測定法。
【請求項２２】酵素基質と測定対象化合物もしくはポ
リペプチドを混合し、これらと請求項１、４、７、８、
９、または１０記載の気道特異的トリプシン様酵素もし
くは該酵素発現細胞もしくは該酵素発現組織を適切な条
件下にインキュベートして該酵素基質と反応させ、その
反応生成物を測定することにより測定対象化合物もしく
はポリペプチドの気道特異的トリプシン様酵素の阻害活
性を検出する方法。
【請求項２３】酵素基質と測定対象化合物もしくはポ
リペプチドを混合し、これらと請求項２または５記載の
気道特異的トリプシン様酵素もしくは該酵素発現細胞も
しくは該酵素発現組織を適切な条件下にインキュベート
して該酵素基質と反応させ、その反応生成物を測定する
ことにより測定対象化合物もしくはポリペプチドの気道
特異的トリプシン様酵素の阻害活性を検出する方法。
【請求項２４】酵素基質と測定対象化合物もしくはポ
リペプチドを混合し、これらと請求項３または６記載の
気道特異的トリプシン様酵素もしくは該酵素発現細胞も
しくは該酵素発現組織を適切な条件下にインキュベート
して該酵素基質と反応させ、その反応生成物を測定する
ことにより測定対象化合物もしくはポリペプチドの気道
特異的トリプシン様酵素の阻害活性を検出する方法。
【請求項２５】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
もしくは組織が口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道
組織、もしくは肺組織由来であるか、またはそれらの組
織に存在する細胞もしくはそれらの細胞株である請求項
２２ないし２４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２６】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
が口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、もしく
は肺組織に存在する上皮細胞もしくはそれらの細胞株で
ある請求項２２ないし２４のいずれかに記載の検出方
法。
【請求項２７】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
が口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、もしく
は肺組織に存在する線毛上皮細胞もしくはそれらの細胞
株である請求項２２ないし２４のいずれかに記載の検出
方法。
【請求項２８】請求項１、４、７、８、９、または１
０記載の気道特異的トリプシン様酵素もしくは該酵素発
現細胞もしくは該酵素発現組織と、測定対象化合物もし
くはポリペプチドと、さらにプロテアーゼ活性化受容体
発現細胞とを混合し、プロテアーゼ活性化受容体活性化
を指標として測定対象化合物もしくはポリペプチドの気
道特異的トリプシン様酵素によるプロテアーゼ活性化受
容体活性化に対する阻害活性を検出する方法。
【請求項２９】請求項２または５記載の気道特異的ト
リプシン様酵素もしくは該酵素発現細胞もしくは該酵素
発現組織と、測定対象化合物もしくはポリペプチドと、
さらにプロテアーゼ活性化受容体発現細胞とを混合し、
プロテアーゼ活性化受容体活性化を指標として測定対象
化合物もしくはポリペプチドの気道特異的トリプシン様
酵素によるプロテアーゼ活性化受容体活性化に対する阻
害活性を検出する方法。
【請求項３０】請求項３または６記載の気道特異的ト
リプシン様酵素もしくは該酵素発現細胞もしくは該酵素
発現組織と、測定対象化合物もしくはポリペプチドと、
さらにプロテアーゼ活性化受容体発現細胞とを混合し、
プロテアーゼ活性化受容体活性化を指標として測定対象
化合物もしくはポリペプチドの気道特異的トリプシン様
酵素によるプロテアーゼ活性化受容体活性化に対する阻
害活性を検出する方法。
【請求項３１】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標が細胞内カルシウム流入である請求項２８ないし３０
のいずれかに記載の検出方法。
【請求項３２】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がＮＦｋＢを含有するプロモーターの転写活性である
請求項２８ないし３０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項３３】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がＡＰ１を含有するプロモーターの転写活性である請
求項２８ないし３０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項３４】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がＩＬ−８プロモーターの転写活性である請求項２８
ないし３０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項３５】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がイノシトールリン酸の分解活性である請求項２８な
いし３０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項３６】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がプロスタグランジンＥ２産生である請求項２８ない
し３０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項３７】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がトロンボキサンＡ２である請求項２８ないし３０の
いずれかに記載の検出方法。
【請求項３８】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がｃＡＭＰである請求項２８ないし３０のいずれかに
記載の検出方法。
【請求項３９】プロテアーゼ活性化受容体活性化の指
標がＮＯの生成である請求項２８ないし３０のいずれか
に記載の検出方法。
【請求項４０】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
が該酵素発現組換え細胞である請求項２８ないし３９の
いずれかに記載の検出方法。
【請求項４１】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
もしくは該酵素発現組織が口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔
組織、気道組織、もしくは肺組織であるか、またはそれ
らの組織に由来する細胞もしくはそれらの細胞株である
請求項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４２】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
が口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、もしく
は肺組織に由来する上皮細胞もしくはそれらの細胞株で
ある請求項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方
法。
【請求項４３】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
が気道上皮細胞もしくは気道上皮細胞由来の細胞株であ
る請求項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４４】気道特異的トリプシン様酵素発現細胞
が線毛上皮細胞もしくは線毛上皮細胞由来の細胞株であ
る請求項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４５】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
プロテアーゼ活性化受容体発現組換え昆虫細胞である請
求項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４６】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、もしくは
肺組織に存在する細胞である請求項２８ないし３９のい
ずれかに記載の検出方法。
【請求項４７】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
気道組織に存在する細胞である請求項２８ないし３９の
いずれかに記載の検出方法。
【請求項４８】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
気道上皮細胞もしくは気道上皮細胞由来の細胞株である
請求項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４９】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
線毛上皮細胞もしくは線毛上皮細胞由来の細胞株である
請求項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５０】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
杯細胞もしくは杯細胞由来の細胞株である請求項２８な
いし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５１】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
分泌腺細胞もしくは分泌腺細胞由来の細胞株である請求
項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５２】プロテアーゼ活性化受容体発現細胞が
漿液腺細胞もしくは漿液腺細胞由来の細胞株である請求
項２８ないし３９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５３】プロテアーゼ活性化受容体が気道特異
的トリプシン様酵素によって活性化されるＧ蛋白共役受
容体である請求項２８ないし５２のいずれかに記載の検
出方法。
【請求項５４】プロテアーゼ活性化受容体がヒトＰＡ
Ｒ１、ヒトＰＡＲ２、ヒトＰＡＲ３、またはヒトＰＡＲ
４である請求項２８ないし５２のいずれかに記載の検出
方法。
【請求項５５】プロテアーゼ活性化受容体がヒトＰＡ
Ｒ２である請求項２８ないし５２のいずれかに記載の検
出方法。
【請求項５６】プロテアーゼ活性化受容体がヒトＰＡ
Ｒ１である請求項２８ないし５２のいずれかに記載の検
出方法。
【請求項５７】請求項１から１０のいずれかに記載の
気道特異的トリプシン様酵素の３次元構造を決定し、基
質が結合するのに適当な３次元構造を分析し、予想反応
サイトに結合する化合物を合成し、化合物の該酵素阻害
活性を決定する、というステップからなる該酵素阻害剤
の評価方法。
【請求項５８】以下のグループから選択される単離さ
れた核酸。（ａ）天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵素遺伝子の
コード領域（ｂ）天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵素遺伝子配
列と少なくとも６６％の相同性があり、かつプロテアー
ゼ活性化受容体を活性化する酵素をコードする核酸（ｃ）プロテアーゼ活性化受容体を活性化する請求項１
から１０のいずれかに記載の気道特異的トリプシン様酵
素をコードする核酸
【請求項５９】哺乳類気道特異的トリプシン様酵素遺
伝子由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ。
【請求項６０】げっ歯類の気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ。
【請求項６１】配列番号５または配列番号６で示され
る気道特異的トリプシン様酵素をコードするｍＲＮＡま
たはｃＤＮＡ。
【請求項６２】哺乳類の気道特異的トリプシン様酵
素。
【請求項６３】げっ歯類の気道特異的トリプシン様酵
素。
【請求項６４】配列番号２で示される気道特異的トリ
プシン様酵素。
【請求項６５】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
請求項１、４、７、８、９、１０のいずれかに記載の気
道特異的トリプシン様酵素により活性化されるＧ蛋白共
役型受容体を活性化する酵素をコードする核酸。
【請求項６６】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
ヒトＰＡＲ１、ヒトＰＡＲ２、ヒトＰＡＲ３、またはヒ
トＰＡＲ４を活性化する酵素をコードする核酸。
【請求項６７】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
ヒトＰＡＲ２を活性化する酵素をコードする核酸。
【請求項６８】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
請求項２または５記載の気道特異的トリプシン様酵素に
より活性化される哺乳類Ｇ蛋白共役型受容体を活性化す
る酵素をコードする核酸。
【請求項６９】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
ヒトＰＡＲ１、ヒトＰＡＲ２、ヒトＰＡＲ３、またはヒ
トＰＡＲ４に相当する哺乳類プロテアーゼ活性化受容体
を活性化する酵素をコードする核酸。
【請求項７０】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
ヒトＰＡＲ２に相当する哺乳類プロテアーゼ活性化受容
体を活性化する酵素をコードする核酸。
【請求項７１】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
請求項２または５記載の気道特異的トリプシン様酵素に
より活性化されるマウスＧ蛋白共役型受容体を活性化す
る酵素をコードする核酸。
【請求項７２】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
マウスＰＡＲ１、マウスＰＡＲ２、マウスＰＡＲ３、ま
たはマウスＰＡＲ４を活性化する酵素をコードする核
酸。
【請求項７３】天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵
素遺伝子配列と少なくとも６６％の相同性があり、かつ
マウスＰＡＲ２を活性化する酵素をコードする核酸。
【請求項７４】請求項５８ないし６１のいずれかに記
載の核酸を用いて作製された気道特異的トリプシン様酵
素の発現ベクター。
【請求項７５】請求項７４記載の発現ベクターがトラ
ンスフェクトもしくはトランスフォームされた細胞。
【請求項７６】請求項７５記載の細胞から気道特異的
トリプシン様酵素またはその前駆体を精製する方法。
【請求項７７】請求項７５記載の細胞から精製された
気道特異的トリプシン様酵素またはその前駆体。
【請求項７８】請求項５８ないし６１のいずれかに記
載の核酸から翻訳される気道特異的トリプシン様酵素が
存在する哺乳類の体液、細胞、または細胞株から精製さ
れた気道特異的トリプシン様酵素またはその前駆体。
【請求項７９】請求項５８ないし６１のいずれかに記
載の核酸の全体もしくは一部の情報を用い、それらの核
酸に対応する気道特異的トリプシン様酵素遺伝子の発現
量を検出する方法。
【請求項８０】ノーザンハイブリダイゼーション法を
用いる請求項７９記載の検出方法。
【請求項８１】遺伝子増幅法を用いる請求項７９記載
の検出方法。
【請求項８２】請求項８１記載の検出方法の実施に用
いられる、天然哺乳類気道特異的トリプシン様酵素遺伝
子配列の情報に基づいて作製されたセンスプライマーま
たはアンチセンスプライマー。
【請求項８３】請求項１、４、７、８、９、または１
０記載の気道特異的トリプシン様酵素の発現を指示する
発現ベクター。
【請求項８４】請求項８３記載の発現ベクターがトラ
ンスフェクトもしくはトランスフォームされた細胞。
【請求項８５】請求項８４記載の細胞を培養し、培養
液から気道特異的トリプシン様酵素を回収することから
なる気道特異的トリプシン様酵素の製造方法。
【請求項８６】請求項８５記載の製造方法によって得
られる気道特異的トリプシン様酵素。
【請求項８７】請求項２または５記載の気道特異的ト
リプシン様酵素の発現を指示する発現ベクター。
【請求項８８】請求項８７記載の発現ベクターがトラ
ンスフェクトもしくはトランスフォームされた細胞。
【請求項８９】請求項８８記載の細胞を培養し、培養
液から気道特異的トリプシン様酵素を回収することから
なる気道特異的トリプシン様酵素の製造方法。
【請求項９０】請求項８９記載の製造方法によって得
られる気道特異的トリプシン様酵素。
【請求項９１】請求項３または６記載の気道特異的ト
リプシン様酵素の発現を指示する発現ベクター。
【請求項９２】請求項９１記載の発現ベクターがトラ
ンスフェクトもしくはトランスフォームされた細胞。
【請求項９３】請求項９２記載の細胞を培養し、培養
液から気道特異的トリプシン様酵素を回収することから
なる気道特異的トリプシン様酵素の製造方法。
【請求項９４】請求項９３記載の製造方法によって得
られる気道特異的トリプシン様酵素。
【請求項９５】請求項１ないし１０のいずれかに記載
の気道特異的トリプシン様酵素の活性化過剰もしくはア
ップレギュレートにより特徴づけられる疾患をもつ哺乳
類に対して、測定対象の化合物もしくはポリペプチドを
投与することからなる、気道特異的トリプシン様酵素の
活性を阻害、または該酵素の活性化を阻害する物質のス
クリーニング方法またはその治療効果判定方法。
【請求項９６】気道特異的トリプシン様酵素の活性化
過剰もしくはアップレギュレートにより特徴づけられる
疾患が慢性気道炎症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、気管支拡張症、喘
息、副鼻腔気管支症候群、線維症、神経過敏症、凝固線
溶系異常による疾患、癌、関節炎、または皮膚の炎症性
の疾患である請求項９５記載のスクリーニング方法また
は治療効果判定方法。
【請求項９７】気道特異的トリプシン様酵素の活性化
過剰もしくはアップレギュレートにより特徴づけられる
疾患が呼吸器系における炎症性の疾患もしくは口腔組
織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、肺組織における
分泌異常、細胞外基質合成異常、細胞増殖異常、細胞分
化異常、神経系の異常、免疫系の異常、粘液線毛輸送系
の異常、または凝固線溶系異常による病態がもたらす疾
患である請求項９５記載のスクリーニング方法または治
療効果判定方法。
【請求項９８】請求項１ないし１０のいずれかに記載
の気道特異的トリプシン様酵素によるプロテアーゼ活性
化受容体の活性化過剰もしくはアップレギュレートによ
り特徴づけられる疾患をもつ哺乳類に対して、測定対象
の化合物もしくはポリペプチドを投与することからな
る、気道特異的トリプシン様酵素によるプロテアーゼ活
性化受容体活性化を阻害する物質のスクリーニング方法
またはその治療効果判定方法。
【請求項９９】気道特異的トリプシン様酵素によるプ
ロテアーゼ活性化受容体の活性化過剰もしくはアップレ
ギュレートにより特徴づけられる疾患が慢性気道炎症、
慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、びまん性汎
細気管支炎、気管支拡張症、喘息、副鼻腔気管支症候
群、線維症、神経過敏症、凝固線溶系異常による疾患、
癌、関節炎、または皮膚などの炎症性の疾患である請求
項９８記載のスクリーニング方法または治療効果判定方
法。
【請求項１００】気道特異的トリプシン様酵素による
プロテアーゼ活性化受容体の活性化過剰もしくはアップ
レギュレートにより特徴づけられる疾患が呼吸器系にお
ける炎症性の疾患もしくは口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔
組織、気道組織、肺組織における分泌異常、細胞外基質
合成異常、細胞増殖異常、細胞分化異常、神経系の異
常、免疫系の異常、粘液線毛輸送系の異常、または凝固
線溶系異常による病態がもたらす疾患である請求項９８
記載のスクリーニング方法または治療効果判定方法。
【請求項１０１】プロテアーゼ活性化受容体が哺乳類
気道特異的トリプシン様酵素によって活性化される哺乳
類Ｇ蛋白共役型受容体である請求項９８ないし１００の
いずれかに記載のスクリーニング方法または治療効果判
定方法。
【請求項１０２】プロテアーゼ活性化受容体がヒトＰ
ＡＲ１、ヒトＰＡＲ２、ヒトＰＡＲ３、またはヒトＰＡ
Ｒ４に相当する哺乳類ＰＡＲ１、哺乳類ＰＡＲ２、哺乳
類ＰＡＲ３、または哺乳類ＰＡＲ４である請求項９８な
いし１００のいずれかに記載のスクリーニング方法また
は治療効果判定方法。
【請求項１０３】プロテアーゼ活性化受容体がヒトＰ
ＡＲ２もしくはヒトＰＡＲ１に相当する哺乳類ＰＡＲ２
もしくはＰＡＲ１である請求項９８ないし１００のいず
れかに記載のスクリーニング方法または治療効果判定方
法。
【請求項１０４】プロテアーゼ活性化受容体がヒトＰ
ＡＲ２に相当する哺乳類ＰＡＲ２である請求項９８ない
し１００のいずれかに記載のスクリーニング方法または
治療効果判定方法。
【請求項１０５】プロテアーゼ活性化受容体がマウス
気道特異的トリプシン様酵素によって活性化されるマウ
スＧ蛋白共役型受容体である請求項９８ないし１００の
いずれかに記載のスクリーニング方法または治療効果判
定方法。
【請求項１０６】プロテアーゼ活性化受容体がマウス
ＰＡＲ１、マウスＰＡＲ２、マウスＰＡＲ３、またはマ
ウスＰＡＲ４である請求項９８ないし１００のいずれか
に記載のスクリーニング方法または治療効果判定方法。
【請求項１０７】プロテアーゼ活性化受容体がマウス
またはラットのＰＡＲ１もしくはＰＡＲ２である請求項
９８ないし１００のいずれかに記載のスクリーニング方
法または治療効果判定方法。
【請求項１０８】プロテアーゼ活性化受容体がマウス
またはラットのＰＡＲ２である請求項９８ないし１００
のいずれかに記載のスクリーニング方法または治療効果
判定方法。
【請求項１０９】請求項５８ないし６１のいずれかに
記載の核酸の一部を用いて作製されたアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド。
【請求項１１０】請求項１から１０のいずれかに記載
の気道特異的トリプシン様酵素の活性化過剰もしくはア
ップレギュレートにより特徴づけられる疾患をもつ哺乳
類に対し、請求項１０９記載のアンチセンスオリゴヌク
レオチドを含有する薬剤を投与することにより、気道特
異的トリプシン様酵素の活性阻害またはその活性化阻害
による治療効果を判定する方法。
【請求項１１１】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰もしくはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が慢性気道炎症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、気管支拡張症、喘
息、副鼻腔気管支症候群、線維症、神経過敏症、凝固線
溶系異常による疾患、癌、関節炎、または皮膚の炎症性
の疾患である請求項１１０記載の判定方法。
【請求項１１２】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰もしくはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が呼吸器系における炎症性の疾患もしくは口腔組
織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、肺組織における
分泌異常、細胞外基質合成異常、細胞増殖異常、細胞分
化異常、神経系の異常、免疫系の異常、粘液線毛輸送系
の異常、または凝固線溶系異常による病態がもたらす疾
患である請求項１１０記載の判定方法。
【請求項１１３】請求項１０９記載のアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを有効成分として含有する、請求項１
から１０のいずれかに記載の気道特異的トリプシン様酵
素の活性化過剰もしくはアップレギュレートにより特徴
づけられる疾患の治療薬。
【請求項１１４】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰もしくはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が慢性気道炎症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、気管支拡張症、喘
息、副鼻腔気管支症候群、線維症、神経過敏症、凝固線
溶系異常による疾患、癌、関節炎、または皮膚の炎症性
の疾患である請求項１１３記載の治療薬。
【請求項１１５】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰もしくはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が呼吸器系における炎症性の疾患もしくは口腔組
織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、肺組織における
分泌異常、細胞外基質合成異常、細胞増殖異常、細胞分
化異常、神経系の異常、免疫系の異常、粘液線毛輸送系
の異常、または凝固線溶系異常による病態がもたらす疾
患である請求項１１３記載の治療薬。
【請求項１１６】請求項２２記載の検出方法によって
選ばれた化合物またはポリペプチド。
【請求項１１７】請求項１１６記載の化合物またはポ
リペプチドを主薬効成分とする、気道特異的トリプシン
様酵素の活性化過剰あるいはアップレギュレートにより
特徴づけられる疾患の治療薬。
【請求項１１８】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰あるいはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が慢性気道炎症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、気管支拡張症、喘
息、副鼻腔気管支症候群、線維症、神経過敏症、凝固線
溶系異常による疾患、癌、関節炎、または皮膚の炎症性
の疾患である請求項１１７記載の治療薬。
【請求項１１９】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰あるいはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が呼吸器系における炎症性の疾患あるいは口腔組
織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、肺組織における
分泌異常、細胞外基質合成異常、細胞増殖異常、細胞分
化異常、神経系の異常、免疫系の異常、粘液線毛輸送系
の異常、または凝固線溶系異常による病態がもたらす疾
患である請求項１１７記載の治療薬。
【請求項１２０】請求項２８ないし３０のいずれかに
記載の検出方法によって選ばれた化合物もしくはポリペ
プチド。
【請求項１２１】請求項２８ないし５６のいずれかに
記載の検出方法によって選ばれた化合物またはポリペプ
チドを主薬効成分とする、気道特異的トリプシン様酵素
によるＰＡＲ活性化過剰あるいはアップレギュレートに
より特徴づけられる疾患に対する治療薬。
【請求項１２２】気道特異的トリプシン様酵素による
ＰＡＲの活性化過剰あるいはアップレギュレートにより
特徴づけられる疾患が慢性気道炎症、慢性閉塞性肺疾
患、慢性気管支炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、気
管支拡張症、喘息、副鼻腔気管支症候群、線維症、神経
過敏症、凝固線溶系異常による疾患、癌、関節炎、また
は皮膚などの炎症性の疾患である請求項１２１記載の治
療薬。
【請求項１２３】気道特異的トリプシン様酵素による
ＰＡＲの活性化過剰あるいはアップレギュレートにより
特徴づけられる疾患が呼吸器系における炎症性の疾患あ
るいは口腔組織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、肺
組織における分泌異常、細胞外基質合成異常、細胞増殖
異常、細胞分化異常、神経系の異常、免疫系の異常、粘
液線毛輸送系の異常、または凝固線溶系異常による病態
がもたらす疾患である請求項１２１記載の治療薬。
【請求項１２４】請求項１１０ないし１１２のいずれ
かに記載の治療効果判定方法により有効性が確認された
アンチセンスオリゴヌクレオチドを主薬効成分とする、
気道特異的トリプシン様酵素の活性化過剰あるいはアッ
プレギュレートにより特徴づけられる疾患の治療薬。
【請求項１２５】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰あるいはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が慢性気道炎症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、肺気腫、びまん性汎細気管支炎、気管支拡張症、喘
息、副鼻腔気管支症候群、線維症、神経過敏症、凝固線
溶系異常による疾患、癌、関節炎、または皮膚の炎症性
の疾患である請求項１２４記載の治療薬。
【請求項１２６】気道特異的トリプシン様酵素の活性
化過剰あるいはアップレギュレートにより特徴づけられ
る疾患が呼吸器系における炎症性の疾患あるいは口腔組
織、鼻腔組織、副鼻腔組織、気道組織、肺組織における
分泌異常、細胞外基質合成異常、細胞増殖異常、細胞分
化異常、神経系の異常、免疫系の異常、粘液線毛輸送系
の異常、または凝固線溶系異常による病態がもたらす疾
患である請求項１２４記載の治療薬。