JP5204132B2 - ヒトパピローマウイルスｍＲＮＡを検出するための方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、ヒト被験者を、子宮頸癌を発症する危険性を評価するためにスクリーニングするインビトロ方法に関する。

［発明の背景］
子宮頸癌は、世界中で最も一般的な悪性疾患の１つであり、女性の間では罹病および死亡の主要な原因の１つである（Ｐａｒｋｉｎ ＤＭ、Ｐｉｓａｎｉ Ｐ、Ｆｅｒｌａｙ Ｊ（１９９３）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、５４：５９４〜６０６；Ｐｉｓａｎｉ Ｐ、Ｐａｒｋｉｎ ＤＭ、Ｆｅｒｌａｙ Ｊ（１９９３）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、５５：８９１〜９０３）。１５，７００人の新規の侵襲性子宮頸癌患者が１９９６年に米国では予測されたが、世界中での年間発生数は、世界保健機構により、４５万人であると推定されている（１９９０）。年間発生率は世界の地域によって異なり、西アジアにおける１０万人あたり７．６人から、南部アフリカにおける１０万人あたり４６．８人までの範囲に及ぶ（Ｐａｒｋｉｎ等、１９９３、同上）。

子宮頸癌の現在の概念は、子宮頸癌は、多くの場合には１０年〜２５年の期間にわたって発達する多段階の疾患であるということである。子宮頸部の侵襲性扁平上皮癌は、基底膜の貫通、および間質または上皮粘膜固有層を侵襲することによって表される。子宮頸癌の臨床経過はかなりの変動を示す。予後は、臨床的段階、リンパ節の関与、原発性腫瘍の大きさ、組織学の型、侵襲の深度、およびリンパ管内蔓延に関連づけられている（Ｄｅｌｇａｄｏ Ｇ等（１９９０）、Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ、３８：３５２〜３５７）。腫瘍の特徴があまり好ましくない患者の中には、比較的良好な結果を有する患者がいる一方で、初期段階に限定された疾患の致死的結果を受ける患者がいる。このことは、危険性に適合した治療を施すために、新たに診断された子宮頸癌を更に特徴づけるための更なるマーカーが明らかに必要であることを示している（Ｉｋｅｎｂｅｒｇ Ｈ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５９：３２２〜６、１９９４）。

子宮頸癌の疫学は、宗教、結婚および性の行動様式と強い関連を示している。約１００例の患者対照研究により、ＨＰＶと子宮頸部腫瘍形成との関係が調べられ、ほぼすべてに明確な関連が見出されている（ＩＡＲＣモノグラフ、１９９５）。この関連は強く、一貫しており、かつ限られた数のウイルス型に対して特異的である（Ｍｕｎｏｚ Ｎ、Ｂｏｓｃｈ ＦＸ（１９９２）、ＨＰＶおよび子宮頸部腫瘍形成：患者対照研究およびコホート研究の概説、ＩＡＲＣ Ｓｃｉ Ｐｕｂｌ、２５１〜２６１）。非常に有益な研究の中で、ＨＰＶ１６のＤＮＡとの強い関連が、侵襲性癌および高悪性度のＣＩＮ病変について顕著な一貫性で観察されており、これにより、この関連が偶然、偏りまたは混同により説明され得るという可能性が排除されている（ＩＡＲＣモノグラフ、１９９５）。間接的な証拠により、癌細胞において検出されるＨＰＶのＤＮＡが、発癌のより初期におけるＨＰＶ感染の役割に対する良好なマーカーであることが示唆された。用量反応相関が、増大するウイルス負荷量と子宮頸癌の危険性との間で報告されている（ＭｕｎｏｚおよびＢｏｓｃｈ、１９９２、同上）。いくつかのより大規模な一連の試験において、最高で１００％の腫瘍がＨＰＶ陽性であったが、ウイルス陰性の子宮頸癌の存在についてはまだ議論の余地がある（Ｍｅｉｊｅｒ ＣＪ等（１９９２）、細胞学に関連したポリメラーゼ連鎖反応による子宮頸切屑標本におけるヒトパピローマウイルスの検出：子宮頸癌スクリーニングのための考えられる意義、ＩＡＲＣ Ｓｃｉ Ｐｕｂｌ、２７１〜２８１；Ｄａｓ ＢＣ等（１９９３）、Ｃａｎｃｅｒ、７２：１４７〜１５３）。

扁平上皮細胞の子宮頸癌において最も頻繁に見出されるＨＰＶの型は、ＨＰＶ１６（４１％〜８６％）およびＨＰＶ１８（２％〜２２％）である。更に、ＨＰＶの３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５４型、５６型、５８型、５９型、６１型、６６型および６８型もまた見出されている（ＩＡＲＣモノグラフ、１９９５）。バルセロナで開催されたＨＰＶ２０００国際会議において、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および４５型は危険性が高いとして定義され、その一方で、ＨＰＶの３３型、３５型、３９型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型は中間の危険性であるとして定義された（Ｋｅｅｒｔｉ Ｖ．Ｓｈａｈ、７１頁）。これら１３種の高危険性ＨＰＶおよび中間危険性ＨＰＶはまとめて癌関連ＨＰＶ型と呼ばれることが多い。

多数の研究により、子宮頸部のスクリーニングにおけるＨＰＶ検査の潜在的な役割が調査されている（Ｃｕｚｉｃｋ等、子宮頸部スクリーニングプログラムの範囲でのヒトパピローマウイルス検査の役割に関する体系的概説、Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ａｓｓｅｓｓ、３：１４、１９９９）。

Ｒｅｉｄ等（Ｒｅｉｄ Ｒ等（１９９１）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１６４：１４６１〜１４６９）は、スクリーニングに関連してＨＰＶ検査に対する役割を最初に明らかにした。この研究は、性感染症診療所および婦人科専門医からの、危険性が高い女性に対して行われ、高感度（低ストリンジェンシー）のサザンブロットハイブリダイゼーションがＨＰＶ検出のために使用された。合計で１０１２名の女性が登録され、頸管造影法もまた、細胞学の可能な補助的手段として考慮された。２３例のＣＩＮ ＩＩ／ＩＩＩ病変が全体で見出されたが、１２例のみが細胞学によって検出されただけであった（５２％の感度、９２％の特異性）。ＨＰＶ検査により、１６例の高悪性度の病変が見出された。

Ｂａｕｅｒ等（Ｂａｕｅｒ ＨＭ等（１９９１）、ＪＡＭＡ、２６５：４７２〜４７７）は、日常的な塗抹標本に参加した若い女性（大学生）における、ＭＹ０９／１１プライマー（Ｍａｎｏｓ Ｍ等（１９９０）、Ｌａｎｃｅｔ、３３５：７３４）を使用したＰＣＲに基づく初期の研究を報告している。彼らは、４６７名の女性において陽性率が４６％であることを見出したが、これはドットブロットアッセイの場合（１１％）よりもはるかに高いものであった。

ＧＰ５／６プライマー（Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｒｕｌｅ ＡＪ等（１９９０）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２８：２７３９〜２７４３）によるＰＣＲを用いた研究において、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｌｅ等（Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｒｕｌｅ ＡＪ等（１９９１）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、４８：４０４〜４０８）は、細胞学によって評価されるような子宮頸部腫瘍形成とのＨＰＶ陽性の相関が非常に強いことを示した。細胞学で陰性となった高齢の女性（３５歳〜５５歳）では、ＨＰＶ陽性率はわずかに３．５％であったが、１６型、１８型、３１型および３３型のみを考慮した場合、ＨＰＶ陽性率は１．５％に減少した。一方、転移していない元の位置にある組織学的癌を有する女性は全員がＨＰＶ陽性であり、９０％が上記の４つの型の１つを有していた。細胞学的異常がそれほど重篤でない女性は、明らかな傾向を示す段階的な様式で、より低いＨＰＶ陽性率を有していた。

Ｒｏｄａ Ｈｏｕｓｍａｎ等（Ｒｏｄａ Ｈｏｕｓｍａｎ ＡＭ等（１９９４）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、５６：８０２〜８０６）は、塗抹標本での異常を有する更なる１３７３名の女性を調べることによって、これらの観察結果を拡張させた。この研究ではまた、塗抹標本での結果の重篤度が増大することに伴う陽性率の増大が確認された。彼らはまた、ＨＰＶ異種性のレベルが、低悪性度の塗抹標本に対して２２種の型から、高悪性度の塗抹標本に対して１０種の「危険性が高い」型に減少したことを認めた。この論文では、細胞学的に陰性の女性が全く含まれず、また、細胞学的疾患が組織学的に確認されていなかった。

Ｃｕｚｉｃｋ等（Ｃｕｚｉｃｋ Ｊ等（１９９２）、Ｌａｎｃｅｔ、３４０：１１２〜１１３；Ｃｕｚｉｃｋ Ｊ等（１９９４）、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、６９：１６７〜１７１）は、ＨＰＶ検査が、ランダムスクリーニング時に検出された細胞学的異常の分類のために有用な情報をもたらすことを最初に報告した。膣鏡診のために紹介された１３３名の女性の研究において、陽性予測値が４２％であることが見出され、これは、中程度の核異型に対する陽性予測値と類似していた。この結果は、ＨＰＶ１６に対して最も顕著であった。この場合、ＨＰＶ１６について陽性である４２名の女性のうちの３９名が、高悪性度のＣＩＮを有していることが生検で見出された。この研究では、ウイルス負荷量を評価することの重要性が指摘されたが、危険性が高い型の高いレベルが陽性として見なされるだけであった。

Ｃｏｘ等（Ｃｏｘ ＪＴ等（１９９５）、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１７２：９４６〜９５４）は、塗抹標本で境界線上の女性を分類するためにＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）システム（ＤＩＧＥＮＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）を使用してＨＰＶを検査するための役割を明らかにした。この検査は、大学紹介サービスからの２１７名のそのような女性に対して実施され、９３％の感度が、再度の細胞学について７３％と比較されるが、ＣＩＮ ＩＩ／ＩＩＩについて見出された。高いウイルス負荷は、偽陽性を減少させることによって、性能を更に改善することが見出された。５ＲＬＵが切捨て値として採用されたとき、約２４％のＰＰＶが、感度の喪失を伴うことなく見出された。

Ｃｕｚｉｃｋ等（Ｃｕｚｉｃｋ Ｊ等（１９９５）、Ｌａｎｃｅｔ、３４５：１５３３〜１５３６）は、家族計画診療所での日常的なスクリーニングに参加した１９８５名の女性における、一次スクリーニングに関連するＨＰＶ検査の評価を行なった。４つの一般的なＨＰＶ型に対する型特異的なＰＣＲを使用した感度（７５％）は、細胞学の感度（４６％）を超え、そして陽性ＨＰＶ検査に対するＰＰＶ（４２％）は、中程度の核異型の場合（４３％）と類似していた。

国際公開公報第９１／０８３１２号には、ＨＰＶ感染者の予後を決定するための方法が記載される。この方法は、サンプル中のＥ６および／またはＥ７のＨＰＶ遺伝子のすべてまたは一部分の転写物を検出することによってＨＰＶ活性のレベルを測定すること、そして、活性と、子宮頸部での重篤な腫瘍形成または癌腫に進行する危険性との間における以前に確立された関係を用いて、ＨＰＶ活性の測定値を比較することを含む。

国際公開公報第９９／２９８９０号には、遺伝子発現レベルの測定および分析に基づいてＨＰＶ感染を評価するための方法が記載される。具体的には、国際公開公報第９９／２９８９０号は、２つ以上のＨＰＶ遺伝子（例えば、ＨＰＶのＥ６、Ｅ７、Ｌ１およびＥ２）の発現レベルを測定し、その後、患者においてＨＰＶに基づく疾患の病期を示すためにこれらの遺伝子の組合わせの発現比率を比較することに基づく方法を記載する。

本発明者らは、ＨＰＶのＬ１ｍＲＮＡ転写物およびＥ６ｍＲＮＡ転写物の発現を陽性／陰性で単に明らかにすることに基づくだけであり、これら２つの転写物の発現レベルの正確な定量的測定、またはこれら２つの転写物の発現レベルの相違を明らかにすることを全く必要としない、ＨＰＶ関連疾患の臨床的に有用な評価を行うことが可能であることを明らかにしている。この方法は技術的に簡便であり、また、好ましい実施形態では、中〜高処理能の形式での自動化が容易である。更に、本発明の方法を使用して得られる結果に基づいて、本発明者らは、ＨＰＶ遺伝子の発現パターンにおける疾患に関連した分子変化に関係づけられ、かつＣＩＮ分類とは無関係である、子宮頸癌を発症する危険性に基づく患者分類のための新規な方式を規定している。

従って、第１の態様において、本発明は、子宮頸癌を発症する危険性を評価するためにヒト被験者をスクリーニングするインビトロ方法であって、ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子およびＥ６遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写物の発現についてスクリーニングすることを含み、Ｌ１ｍＲＮＡおよび／または全長のＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性である被験者が、子宮頸癌を発症する危険性を有するとして評価される方法を提供する。

本発明の方法における陽性のスクリーニング結果は、子宮頸部の細胞におけるＬ１ｍＲＮＡおよび／またはＥ６ｍＲＮＡの発現が陽性であることによって示される。これらのｍＲＮＡのいずれか一方または両方のｍＲＮＡの発現が陽性であることは、被験者が子宮頸癌を発症する「危険性を有する」ということを示すものとして理解される。発癌性のＥ６およびＥ７は細胞周期調節タンパク質に結合し、細胞増殖のためのスイッチとして作用するので、Ｅ６ｍＲＮＡを発現する女性は、細胞変化を生じさせる危険性が高い。Ｅ６ｍＲＮＡの明らかな発現は、子宮頸部における細胞変化を直接的に示すものである。Ｌ１ｍＲＮＡの発現はまた、Ｅ６ｍＲＮＡの発現を伴って、またはＥ６ｍＲＮＡの発現を伴うことなく、活性なＨＰＶの存在を示している。

子宮頸スクリーニングのより広範な状況では、Ｌ１ｍＲＮＡおよび／またはＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性であるとして同定された女性を、更なる調査のために、例えば、細胞学（細胞診）を使用する調査のために選択することができる。従って、１つのレベルで、本発明の方法は、更なる調査のために選択することができるＨＰＶ陽性被験者を同定するために、女性集団を予備スクリーニングする簡便な技術的手段を提供することができる。

特定の実施形態において、本発明の方法は、Ｌ１ｍＲＮＡおよびＥ６ｍＲＮＡの発現を陽性／陰性で評価することに基づいて、被験者を、子宮頸癌の発症について４つの異なる危険性クラスに分類するために使用することができる。

従って、更なる態様において、本発明は、 子宮頸癌を発症する危険性を評価するためにヒト被験者をスクリーニングするインビトロ方法であって、ＨＰＶのＬ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物およびＨＰＶのＥ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現について被験者をスクリーニングすること、そして、下記の分類に従って、Ｌ１ｍＲＮＡおよび／またはＥ６ｍＲＮＡの発現に基づく子宮頸癌の発症について４つの危険性カテゴリーの１つに被験者を分類することを含む方法を提供する：

危険性カテゴリー１：ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型または６８型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性であるが、Ｌ１ｍＲＮＡの発現について陰性である被験者。ＨＰＶの１６型、１８型、３１型または３３型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性である人は、例えば、これらの型について陰性であるが、ＨＰＶの３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型または６８型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現については陽性である人と比較した場合、より危険性が高いとして評価される。

危険性カテゴリー２：ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型または６８型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性であり、Ｌ１ｍＲＮＡの発現について陽性である被験者。ＨＰＶの１６型、１８型、３１型または３３型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性である人は、例えば、これらの型について陰性であるが、ＨＰＶの３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型または６８型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現については陽性である人と比較した場合、より危険性が高いとして評価される。

危険性カテゴリー３：癌関連ＨＰＶ型に由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陰性（例えば、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型および６８型に由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陰性）であるが、Ｌ１ｍＲＮＡの発現について陽性である被験者。

危険性カテゴリー４：Ｌ１ｍＲＮＡの発現について陰性であり、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陰性である被験者。

好ましい実施形態において、陽性の発現は、１ｍｌあたり（またはサンプルの総容量あたり）５０コピーを超える転写物が存在することによって示され、陰性の発現は、１ｍｌあたり（またはサンプルの総容量あたり）１コピー未満の転写物が存在することによって示される。

上記の分類は、子宮頸癌を発症する危険性に関連する分子的事象に基づいており、被験者のＣＩＮ状態には無関係である。従って、この分類方法は、子宮頸癌を発症する潜在的危険性を有する女性を同定するための、女性の日常的なスクリーニングにおける細胞学の使用に対する代替法を提供することができる。この方法はまた、細胞学の補助的手段として、例えば、細胞学に基づいてなされる危険性評価を確認するための確認検査として使用することができる。

ＨＰＶの１６型、１８型、３１型または３３型の１つに由来する、危険性が高いＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性であるが、Ｌ１の発現について陰性である女性は、重度の細胞変化および細胞異常を生じさせる危険性レベルが最も高い。これは、Ｌ１ｍＲＮＡの発現に対する陰性の結果は、組み込まれたＨＰＶ、従って、Ｅ６およびＥ７の発現が高く、かつ一定している蓋然性がより高いことを直接的に示しているという事実のためである。ヒトゲノムにおけるウイルスの組み込みはまた、細胞の安定性に対して直接的な影響を及ぼす。ＨＰＶの組み込みはまた、細胞変化を復帰させる可能性を低下させる。

ＨＰＶの１６型、１８型、３１型または３３型の１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性であり、Ｌ１ｍＲＮＡの発現について陽性である女性は、「危険性が高い」ＨＰＶ発現を有しており、ＨＰＶが組み込まれていることが依然として考えられる。しかしながら、これらの女性の危険性は、Ｌ１について陰性であり、Ｅ６について陽性である女性ほど高く分類されない。なぜなら、これらの女性はＨＰＶが組み込まれていないと考えることが妥当であるからである。

ＨＰＶの１６型、１８型、３１型または３３型に由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陰性であるが、別のＨＰＶ型（例えば、３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型および６８型）に由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性である女性は、依然として、「危険性を有する」と見なされる。従って、これらの女性は、Ｌ１ｍＲＮＡの発現について陽性または陰性であるかどうかに依存して、（上記で定義されたような）危険性カテゴリー１または２に位置づけることができる。

Ｌ１ｍＲＮＡについて陽性であるが、Ｅ６ｍＲＮＡについて陰性である女性は、中程度の危険性を有するとして評価される。危険性が高いＨＰＶ型がサンプル中に存在することがあり、Ｌ１の発現は溶解活性を示す。様々なＨＰＶ型が組み込まれて存在し得ることもあるが、ウイルスを伴うことは希でしかない。しかしながら、溶解活性を検出することにより、細胞がまもなく何らかの変化を生じさせ得ることが示されることがある。

子宮頸スクリーニングのより広範な状況において、本発明の方法は、子宮頸癌を発症する危険性に従って女性を分類するために使用することができ、従って、処置および／または更なるスクリーニングに関する判定のための基礎を提供する。例えば、危険性カテゴリー１の女性、具体的には、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型または３３型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの陽性発現を示す女性は、「即座の措置」（これは、生検および組織学（組織診）を含む、円錐切除術または膣鏡検査を意味する）を必要とするとして同定され得る。

上記で定義されたように、危険性カテゴリー２の女性は、即時の注意（これは、膣鏡検査単独、または生検および組織学を含む膣鏡検査を意味する）を必要とするとして評価され得る。

上記で定義されたように、危険性カテゴリー３の女性は、即座の再検査（これは、即時に、または比較的短い間隔（例えば、６ヶ月）の後に、ＨＰＶの発現について更なる検査のために再び呼び出されることを意味する）を必要とするとして評価され得る。

上記で定義されたように、危険性カテゴリー４の女性は、後日、ＨＰＶの発現について再検査されるためにスクリーニングプログラムに戻され得る。

更なる実施形態において、本発明は、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムの存在についてヒト被験者をスクリーニングするインビトロ方法であって、ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子およびＥ６遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写物の発現について被験者をスクリーニングすることを含み、Ｌ１ｍＲＮＡの発現について陰性であるが、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陽性である被験者が、組み込まれたＨＰＶを保有するとして評価される方法を提供する。

用語「組み込まれたＨＰＶ」は、ヒトゲノムに組み込まれているＨＰＶゲノムを示す。

用語「改変されたエピソームＨＰＶゲノム」は、エピソームとしてヒト被験者の細胞内に保持されているＨＰＶゲノム（すなわち、ヒトゲノムに組み込まれていないＨＰＶゲノム）であって、対応する野生型のＨＰＶゲノムと比較したとき改変を有し、そのような改変により、Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子の転写物の構成的発現または持続的発現が生じているＨＰＶゲノムを意味することが理解される。「改変」は、典型的には、Ｅ６／Ｅ７の発現の調節に影響を及ぼす、欠失、エピソームの多量体化または鎖状体化、エピソームの再配列などである。

上記のように、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムの存在は、子宮頸の細胞におけるＥ６ｍＲＮＡの発現に対する陽性の結果とともに、Ｌ１ｍＲＮＡの発現に対する陰性の結果によって示される。従って、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムの存在をこのアッセイで予測することができる能力は、Ｌ１ｍＲＮＡの発現に対する陰性の結果を評価する能力に決定的に依存する。これには、最大の感度を有し、その上、偽陰性の結果が最小限である検出技術が必要である。好ましい実施形態において、これは、Ｌ１ｍＲＮＡの存在の有無についてスクリーニングするために高感度増幅技術およびリアルタイム検出技術を使用することによって達成される。最も好ましい技術は、Ｌｅｏｎｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、第２６巻、２１５０〜２１５５に記載されるような、分子ビーコンプローブを使用するリアルタイムＮＡＳＢＡ増幅である。この技術の感度により、偽陰性の結果の発生が最小限に抑えられ、「陰性のＬ１発現」の結果をより大きな信頼性で評価することができる。

更なる実施形態において、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムの存在についてヒト被験者をスクリーニングする方法は、Ｅ６ｍＲＮＡだけの発現についてスクリーニングすることに基づくことができる。従って、本発明は、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムの存在についてヒト被験者をスクリーニングするインビトロ方法であって、ヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写物の発現について被験者をスクリーニングすることを含み、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陽性である被験者が、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムを保有するとして評価される、方法を提供する。

更に、Ｅ６ｍＲＮＡだけの発現を「オン／オフ」で決定することに基づいて、子宮頸癌の発症に対する２つの危険性カテゴリーの１つに人を分類することができる。従って、本発明は、子宮頸癌を発症する危険性を評価するためにヒト被験者をスクリーニングするインビトロ方法であって、ＨＰＶのＥ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現について被験者をスクリーニングすること、および、Ｅ６ｍＲＮＡの発現に基づいて子宮頸癌の発症について２つの危険性カテゴリーの１つに被験者を分類することを含み、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陽性である個体が、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムを保有するとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について「危険性が高い」として分類され、これに対して、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陰性である個体が、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムを保有しないとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について「検出できるほどの危険性がない」として分類される、方法を提供する。

被験者は、子宮頸部の細胞におけるＥ６ｍＲＮＡの発現を「オン／オフ」で決定することに基づいて、子宮頸癌の発症に対する２つの危険性カテゴリーの１つに分類される。Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陽性である人は、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムを保有するとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について「危険性が高い」として分類され、これに対して、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陰性である人は、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムを保有しないとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について「検出できるほどの危険性がない」として分類される。

子宮頸スクリーニングに関連して、子宮頸癌の発症について「危険性が高い」または「検出できるほどの危険性がない」の２つの群に被験者を分類することにより、処置および／または更なるスクリーニングに関する判定のための根拠が提供される。例えば、危険性が高いというカテゴリーの被験者は、即座の更なる分析（例えば、組織学的膣鏡検査による分析）を必要とするとして評価され得る一方で、検出できるほどの危険性がないというカテゴリーの被験者は、３年または５年の間隔でスクリーニングプログラムに差し戻され得る。これらの方法は、ＨＰＶに感染していることが判明している被験者、例えば、ＨＰＶのＤＮＡについて陽性であると検査された被験者、あるいは、細胞学またはパプ塗抹標本によって子宮頸部の異常が以前に現れたことがある被験者において癌を発症する危険性を評価するために特に有用である。Ｅ６ｍＲＮＡ発現に基づいて「検出できるほどの危険性がない」というカテゴリーに位置づけられた被験者には、ＨＰＶのＤＮＡが存在することがあり、しかし、Ｅ６発現に対する陰性の結果は、ＨＰＶが検査時の癌遺伝子の活性には無関係であることを示している。

Ｅ６ｍＲＮＡの発現に対する陽性の結果によって示されるような、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムの存在は、それ自体が、被験者が子宮頸部における異常な細胞変化を有することを示している。従って、本発明はまた、子宮頸部における異常な細胞変化を有するヒト被験者を同定するインビトロ方法であって、ＨＰＶのＥ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現について被験者をスクリーニングすることを含み、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陽性である個体が、子宮頸部における異常な細胞変化を有するとして同定される、方法に関する。

用語「子宮頸部における異常な細胞変化」は、低悪性度の子宮頸部病変または低度の扁平上皮内病変よりも重篤な疾患に特徴的である細胞変化を包含し、また、高悪性度のＣＩＮ（形質転換細胞の腫瘍性拡大として定義される）、ＣＩＮ（子宮頸部上皮内腫瘍）ＩＩＩ、または高度の扁平上皮内腫瘍（ＨＳＩＬ）と同等の重篤度またはこれらよりも大きい重篤度の疾患に特徴的な細胞変化を含み、これらには、多倍数性ＤＮＡプロフィールを伴う病変、ならびに増大した平均ＤＮＡインデックス値、高率のＤＮＡ異数性、および２．５ｃの超過率（Ｅｘｃｅｅｄｉｎｇ Ｒａｔｅｓ）を有する「悪性」のＣＩＮ病変が含まれる（Ｈａｎｓｅｌａａｒ等、１９９２、Ａｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ．、４：３１５〜３２４；Ｒｉｈｅｔ等、１９９６、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ、４９：８９２〜８９６；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ等、１９９７、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０４：６２３〜６２５）。

子宮頸部上皮内腫瘍（これは「ＣＩＮ」と略される）は、子宮頸部形成異常とも呼ばれるが、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる子宮頸部疾患である。ＣＩＮは、その重篤度に依存して、Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩとして分類される。ＣＩＮは、実際の癌ではなく、前癌性の異常であると考えられている。その最も軽い形態であるＣＩＮ Ｉは、まれに癌に進行し得るが、通常ひとりでに消失する。より重篤な形態であるＣＩＮ ＩＩおよびＣＩＮ ＩＩＩは、非常に多くの場合、同じ状態を持続するか、または時間とともに悪化する。これらは癌になり得るが、適切に処置された場合、癌になることはほとんどない。

ＨＰＶは、子宮頸癌の発症をもたらし得る子宮頸における細胞変化を発生させる際の原因因子として同定されている。これらの細胞変化は、ＨＰＶウイルスゲノムに由来するＥ６／Ｅ７タンパク質の構成的発現または持続的発現に関連づけられている。従って、Ｅ６ｍＲＮＡの発現が検出され得る被験者、特に、一定の期間にわたって評価されたとき、持続したＥ６発現を示す被験者は、子宮頸部における細胞変化を既に現していると結論づけることが可能である。これらの変化は、子宮頸のほんの少数の細胞のみにおいて起こっている場合があり、従来の細胞学により検出することができない場合がある。それにもかかわらず、Ｅ６ｍＲＮＡの高感度、特異的かつ正確な検出方法の使用により、従来の細胞学的スクリーニングを使用して可能であったよりもはるかに早期の段階で、子宮頸部における細胞変化を既に示しているそのような被験者を同定することが可能である。これにより、子宮頸癌の発症を予防することを目的とする処置を用いたより早期の治療が可能になる。

ヒトゲノム内へのＨＰＶの組み込みの結果として、または改変されたエピソームＨＰＶゲノムにおける「改変」の結果として、ウイルスのＥ６／Ｅ７癌遺伝子転写の正常な制御が失われている（Ｄｕｒｓｔ等、１９８５、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、６６（Ｐｔ７）：１５１５〜１５２２；ＰａｔｅｒおよびＰａｔｅｒ、１９８５ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４５：３１３〜３１８；Ｓｃｈｗａｒｚ等、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：１１１〜１１４；Ｐａｒｋ等、１９９７、同上）。対照的に、前悪性状態の病変およびＨＰＶ感染の正常な上皮において、パピローマウイルスは、「改変されていない」エピソーム形態が優勢であり、従って、癌遺伝子（Ｅ６／Ｅ７）の転写が存在しないことがあるか、または効率的にダウンレギュレーションされていることがある（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、７１（Ｐｔ７）：１４７３〜１４７９；Ｆａｌｃｉｎｅｌｌｉ等、１９９３、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ、４０：２６１〜２６５）。１６型ヒトパピローマウイルスＤＮＡのヒトゲノムへの組み込みは、より不安定な細胞活性／ゲノムをもたらし、Ｅ６ｍＲＮＡおよびＥ７ｍＲＮＡの安定性を増大させることが観察されている（ＪｅｏｎおよびＬａｍｂｅｒｔ、１９９５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９２：１６５４〜１６５８）。従って、子宮頸癌において典型的に見出されるが、ＣＩＮ病変ではまれに見出されるだけであるＨＰＶの組み込み（Ｃａｒｍｏｄｙ等、１９９６、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ、１０：１０７〜１１６）は、子宮頸の発癌現象における重要な事象であると考えられる。

本発明の方法では、子宮頸部におけるＥ６／Ｅ７のウイルスｍＲＮＡ発現が、ＤＮＡの代わりに検出される。子宮頸細胞におけるＥ６／Ｅ７のウイルス発現は、ＨＰＶウイルスが存在することを単に示すことよりもはるかに正確な癌発症の危険性評価である。更に、ＨＰＶの癌遺伝子転写物の検出は、発癌現象におけるウイルス癌遺伝子の直接的な関与をより高感度に示すものであり得る（Ｒｏｓｅ等、１９９４、Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ、５２：２１２〜２１７；Ｒｏｓｅ等、１９９５、Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ、５６：２３９〜２４４）。増幅および検出によるＥ６／Ｅ７転写物の検出は、危険性が高いＨＰＶ型に感染しているＡＳＣＵＳ患者およびＣＩＮ Ｉ患者では特に、ＣＩＮの発症およびＣＩＮの子宮頸癌への進行に関する危険性評価のための有用な診断手段である（Ｓｏｔｌａｒ等、１９９８、Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ、６９：１１４〜１２１；Ｓｅｌｉｎｋａ等、１９９８、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ、７８：９〜１８）。

ＨＰＶ−１６／１８のＥ６／Ｅ７転写物の発現はＨＰＶのＤＮＡの物理的状態と一様に相関している（Ｐａｒｋ等、１９９７、Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ、第６５巻（１）、１２１〜９）。大部分の子宮頸癌細胞では、特定のヒトパピローマウイルスのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子が、宿主細胞の染色体に組み込まれたウイルス配列から転写されている（ｖｏｎ Ｋｌｅｂｅｎ Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ等、１９９１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第８８巻（４）、１４１１〜５）。ウイルスの負荷量および組み込みが広範囲の一連のＣＩＮ病変において評価されている（Ｐｉｅｔｓａｒｏ等、２００２、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、第４０巻（３）、８８６〜９１）。１つのサンプルのみがエピソームＨＰＶ１６のＤＮＡをもっぱら含み、この病変は自然に退縮した。３７個の侵襲性子宮頸癌のサンプルのうち、１７サンプルが、Ｅ１／Ｅ２遺伝子全体に及ぶＰＣＲを使用することによって、完全に組み込まれたＨＰＶ１６のゲノムを含有するとして以前に同定されたが、このことは１６例でｒｌｉＰＣＲにより確認された。しかしながら、１例は、優勢である組み込まれた形態に加えて、低レベルのエピソームのデオキシリボ核酸を示した。以前の分析においてエピソームの形態を示した残りの２０個の癌腫サンプルのうち、１４個は、組み込まれた形態を含有することが、ｒｌｉＰＣＲを使用して見出され、４個は多量体型（改変された）エピソーム形態を含有していた。従って、合計で３７個の癌腫のうちの３１個（８４％）が、組み込まれたＨＰＶ１６のゲノムを示し、その一方で、組み込みの非存在は検出することができなかった（Ｋａｌａｎｔａｒｉ等、２００１、Ｄｉａｇｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ、第１０巻（１）４６〜５４）。

子宮頸癌細胞が、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶのＤＮＡを伴わずに存在するということは事実上観察されていない（Ｋａｌａｎｔａｒｉ等、２００１；Ｐｉｅｔｓａｒｏ等、２００２、同上）。更に、Ｅ６およびＥ７は、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶのＤＮＡから転写され得るだけであることが示されている（ｖｏｎ Ｋｌｅｂｅｎ Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ等、１９９１、同上）。従って、本発明者らは、Ｅ６／Ｅ７の発現を検出することにより、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶおよび高い癌遺伝子活性の直接的な徴候が提供されると推測し、そして、臨床的状況では、Ｅ６（Ｅ６／Ｅ７）の発現を検出することが、単独で、子宮頸癌を発症する「危険性が高い」被験者を同定するために十分であると結論している。すなわち、Ｅ６／Ｅ７のｍＲＮＡ発現を子宮頸部サンプルで検出することができる場合、これは、子宮頸部における細胞異常を直接的に示しており、持続的なＨＰＶ癌遺伝子活性により子宮頸癌を発症する危険性が非常に高い。従って、ヒト被験者においてＥ６／Ｅ７のｍＲＮＡが検出されることは、その被験者は、子宮頸癌を発症する危険性が非常に大きく、更なるスクリーニング、例えば、膣鏡検査によるスクリーニングを即座に受けなければならないことを示している。

ＨＰＶのＥ６／Ｅ７のｍＲＮＡ発現が検出されない場合、それでもなお、被験者はＨＰＶの感染を有することがある。しかしながら、組み込みおよび癌遺伝子活性がないことにより、それは自然に退縮することがある（Ｐｉｅｔｓａｒｏ等（２００２、同上）によって観察されたように）。

臨床的状況において、Ｅ６ｍＲＮＡだけの発現についてスクリーニングすることに依る方法の性能は、Ｅ６ｍＲＮＡの発現に対する陰性の結果を確実に評価する能力に決定的に依存する。これにはまた、再度ではあるが、最大の感度を有し、その上、偽陰性の結果が最小限である検出技術が必要である。好ましい実施形態において、これは、Ｅ６ｍＲＮＡの存在の有無についてスクリーニングするために高感度増幅技術およびリアルタイム検出技術を使用することによって達成される。最も好ましい技術が、Ｌｅｏｎｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、第２６巻、２１５０〜２１５５によって記載されるような、分子ビーコンプローブを使用するリアルタイムＮＡＳＢＡ増幅である。この技術の感度により、偽陰性の結果の発生が最小限に抑えられ、「陰性のＥ６発現」の結果をより大きな信頼性で評価することができる。アッセイが臨床的なスクリーニングプログラムの状況に関連して使用されることになる場合、このことは極めて重要である。

Ｅ６ｍＲＮＡだけを検出することに基づく方法では、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ４５を少なくとも検出することが好ましく、好ましい実施形態において、このアッセイでは、これらのＨＰＶ型のみを検出することができる。ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型に由来するＤＮＡが、８７％を超える子宮頸癌サンプルで検出されている（Ｋａｒｌｓｅｎ等、１９９６、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３４：２０９５〜２１００）。他の研究では、Ｅ６およびＥ７の発現が悪性状態への転換および悪性状態の維持のために必要であると考えられるので、Ｅ６およびＥ７がほぼ常に子宮頸癌において保持されていることが示されている（Ｃｈｏｏ等、１９８７、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ、２１：１０１〜１０７；Ｄｕｒｓｔ等、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、８５：１０５〜１１２）。非損傷ゲノムまたはＬ１遺伝子配列の検出に基づくＨＰＶ検出システムとは対照的に、Ｅ６／Ｅ７領域から発現されるＨＰＶｍＲＮＡを検出することにより、子宮頸癌を発症する危険性に直接に関連づけられる患者の９０％以上を検出することができる。

診療所において、Ｅ６ｍＲＮＡの検出に基づく方法は、スクリーニング後、すなわち、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １またはコンジロームの診断を以前に受けた個体を更に分析する際の使用のために好ましい。この方法は、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ １またはコンジロームの診断を以前に受けた個体群の中から、子宮頸癌を発症する危険性が高い個体を選択するために使用することができる。ＡＳＣＵＳ、コンジロームおよびＣＩＮ Ｉは、異なる細胞学者および異なる細胞学部門の間では再現性が非常に低いため、ほとんど同じような診断として定義されることがある。Ｏｓｔｏｒ（Ｉｎｔ Ｊ．Ｇｙｎ Ｐａｔｈ．、１２：１８６〜１９２、１９９３）は、ＣＩＮ １の症例の約１％のみが子宮頸癌に進行し得ることを見出した。従って、子宮頸癌を発症する実質的な危険性を有する、ＡＳＣＵＳ、コンジロームまたはＣＩＮ Ｉを患う個体のサブセットを同定する効率的な方法が真に求められている。ＨＰＶの１６型、１８型、３１型または３３型の１つが、Ｋａｒｌｓｅｎ等（１９９６）による子宮頸癌症例研究の８７％で検出された。ＨＰＶ４５を含めることにより、子宮頸癌サンプルのほぼ９０％がこれらの５つのＨＰＶ型に関係づけられることが見出されている。従って、Ｏｓｔｏｒ（Ｉｎｔ Ｊ．Ｇｙｎ Ｐａｔｈ．、１２：１８６〜１９２、１９９３）によって提供されたデータから計算された場合、９９．９％以上が検出され、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ Ｉまたはコンジロームに関する症例が本発明者らのＨＰＶ−Ｐｒｏｏｆｅｒキットによって見逃されている。

本発明の方法において、ｍＲＮＡの「陽性の発現」は、バックグラウンドを超える発現を意味することが理解される。ｍＲＮＡの発現レベルの正確な定量的決定のために、またはＬ１ｍＲＮＡおよびＥ６ｍＲＮＡの相対的な発現レベルの正確な決定のために絶対的に要求されるものはない。

特定の実施形態において、本発明の方法は、ｍＲＮＡの発現レベルを定量的に決定することを含むことができる。好ましい実施形態において、「陽性の発現」と「陰性の発現」との明確な区別を提供するために、「陽性の発現」の決定は、（サンプル１ｍｌあたり、またはサンプル総容量あたり）５０コピーを超える関連ｍＲＮＡが存在することを必要とし得る。これに対して、「陰性の発現」の決定は、（サンプル１ｍｌあたり、またはサンプル総容量あたり）１コピー未満の関連ｍＲＮＡが存在することを必要とし得る。

本発明の方法は、好ましくは、癌関連ＨＰＶ型（より好ましくは、「危険性が高い」癌関連ＨＰＶ）に由来するＥ６ｍＲＮＡを特異的に検出することができる技術を使用してＥ６ｍＲＮＡについてスクリーニングすることを含む。最も好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型、そしてまた、好ましくは４５型に由来するＥ６ｍＲＮＡを検出することができる技術を使用してＥ６ｍＲＮＡについてスクリーニングすることを含む。最も好ましくは、本発明の方法では、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型、そしてまた、好ましくは４５型に由来するＥ６ｍＲＮＡの発現が特異的に検出され、最も好ましくは、５つの型のすべてに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現が特異的に検出される。しかしながら、１６型、１８型、３１型、３３型および４５型とは異なる型（例えば、３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型および６８型）に由来するＥ６の発現について陽性である女性は、依然として、子宮頸癌を発症する「危険性を有する」ことがある。従って、本発明の方法は、１つ以上のこれらのＨＰＶ型に由来するＥ６ｍＲＮＡの発現についてスクリーニングすることを含むことができ、最も好ましくは、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型および４５型に由来するＥ６ｍＲＮＡについてスクリーニングすることに加えて、そのようなスクリーニングを含むことができる。特定のＨＰＶ型が顕著な地理学的／集団的分布を示す。従って、例えば、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型および４５型についてスクリーニングすることに加えて、検査している集団的／地理学的領域において優勢であることが知られているＨＰＶ型に対して特異的なプライマーを含むことが適切であり得る。

不確かさを回避するため、別途言及されない限り、本明細書中で使用される用語「Ｅ６ｍＲＮＡ」は、天然に存在するスプライスバリアントを含む、Ｅ６オープンリーディングフレームのすべてまたは一部分を含有する天然に存在するｍＲＮＡ転写物のすべてを包含し、従って、Ｅ７オープンリーディングフレーム（および更なるオープンリーディングフレーム）のすべてまたは一部分を更に含有する転写物を包含する。用語「Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ」、用語「Ｅ６／Ｅ７転写物」などは、用語「Ｅ６ｍＲＮＡ」、用語「Ｅ６転写物」と交換可能に使用することができ、そしてまた、天然に存在するスプライスバリアントを含む、Ｅ６オープンリーディングフレームのすべてまたは一部分を含有する天然に存在するｍＲＮＡ転写物、およびＥ７オープンリーディングフレームのすべてまたは一部分を含有する転写物を包含する。用語「癌遺伝子発現」もまた、別途言及されない限り、天然に存在するスプライスバリアントを含む、Ｅ６オープンリーディングフレームのすべてまたは一部分を含有する天然に存在するｍＲＮＡ転写物、およびＥ７オープンリーディングフレームのすべてまたは一部分を含有する転写物を示す。

４つのＥ６／Ｅ７ｍＲＮＡ種がＨＰＶ１６感染細胞においてこれまでに記載されている。すなわち、１つのスプライシングされていないＥ６転写物、そして、Ｅ６^＊Ｉ、Ｅ６^＊ＩＩおよびＥ６^＊ＩＩＩとして示される３つのスプライシングされた転写物である（Ｓｍｏｔｋｉｎ Ｄ等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９８９（３月）、６３（３）：１４４１〜７；Ｓｍｏｔｋｉｎ Ｄ、Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ ＦＯ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８６（７月）、８３（１３）：４６８０〜４；Ｄｏｏｒｂａｒ Ｊ．等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０（９月）、１７８（１）：２５４〜６２；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ ＭＴ等、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、１９９０（５月）、７１（Ｐｔ５）：１２４３〜６；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＭＡ等、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、１９９０（７月）、７１（Ｐｔ７）：１４７３〜９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｍａｕｎｏｕｒｙ Ｓ等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１９８７（１０月）、６１（１０）：３２９５〜８；Ｓｈｅｒｍａｎ Ｌ等、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１９９２（２月）、５０（３）：３５６〜６４）。４つの転写物はすべてが、Ｅ６ ＯＲＦの２番目のＡＴＧのすぐ上流に位置する単一のプロモーター（ｐ９７）から転写される。

１つの実施形態において、本発明の方法は、Ｅ７オープンリーディングフレームのすべてまたは一部分を含有するＥ６転写物に対するスクリーニングすることを含むことができる。これは、例えば、Ｅ７のコード領域に対して特異的なプライマーまたはプローブを使用して達成することができる。

更なる実施形態において、本発明の方法は、「全長」のＥ６転写物の存在についてスクリーニングすることを含むことができる。ＨＰＶ１６の場合、用語「全長のＥ６転写物」は、Ｅ６ ＯＲＦにおけるヌクレオチド（ｎｔ）９７からｎｔ８８０まで（ｎｔ９７およびｎｔ８８０を含む）の領域のすべてを含有する転写物を示す。ヌクレオチドの位置は標準的なＨＰＶの命名法に従って番号付けされる（ＨＶ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍａｉｌ Ｓｔｏｐ Ｋ７１０、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、ＮＭ８７５４５、米国）からインターネットを介して、または紙形態で利用可能な、Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ Ｏｎｌｉｎｅを参照のこと）。全長の転写物の特異的な検出は、例えば、全長のＥ６転写物にだけ存在し、スプライスバリアントには存在しない領域に対して特異的なプライマーまたはプローブを使用して達成することができる。異なるＨＰＶ型は異なるパターンのＥ６／Ｅ７ｍＲＮＡ発現を示す。Ｅ６／Ｅ７転写物を検出するためのプローブまたはプライマーの設計を助けるために使用することができる様々なＨＰＶ型（ＨＰＶの１６型および３１型を含む）に対する転写物地図を、（上記のように）Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍを介して公式に利用することができる。

様々なＨＰＶ型に由来するＥ６ｍＲＮＡの様々な領域をＮＡＳＢＡまたはＰＣＲによって増幅する際に使用される好適なＥ６オリゴヌクレオチドプライマーが本明細書中に記載される。

好ましい実施形態において、Ｌ１ｍＲＮＡの発現についてスクリーニングすることを含む方法は、実質的にすべての知られているＨＰＶ型に由来するか、または少なくとも主要な癌関連ＨＰＶ型（例えば、好ましくは、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型のすべて）に由来するＬ１ｍＲＮＡを検出することができる技術を使用してＬ１ｍＲＮＡ発現についてスクリーニングすることを含むことができる。ＨＰＶの６型、１１型、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型および５１型に由来するＬ１ｍＲＮＡを子宮頸サンプルにおいて検出することができるＬ１プライマーおよびプローブが本明細書中に記載される。

Ｌ１転写物の検出は、ＨＰＶの溶解活性の存在を意味するＨＰＶの「毒性」を検出することであると言うことができる。Ｅ６／Ｅ７転写物の検出は、ＨＰＶの「病原性」を検出することであると言うことができる。なぜならば、これらのｍＲＮＡの発現は、癌腫を発症する危険性に関連する分子事象を示すからである。

４５８９名の女性の研究では、Ｅ６ｍＲＮＡおよびＬ１ｍＲＮＡの発現についてスクリーニングすることに基づく方法を使用して、ＣＩＮ ＩＩＩ病変または癌の症例を、１症例を除くすべてで検出することができた（添付の実施例を参照のこと）。

更なる実施形態において、本発明の上記の方法は、ＨＰＶのＬ１転写物および／またはＥ６転写物の発現についてスクリーニングすることに加えて、ヒトｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写物の発現についてスクリーニングすることを含むことができる。

ｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}ｍＲＮＡの発現に対する陽性の結果は、子宮頸癌を発症する危険性を更に示すものとして理解される。

ｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}、および関連するファミリーのメンバーは、網膜芽細胞腫遺伝子産物（ＲＢ）のリン酸化および増殖抑制活性を調節するために機能し得る。この裏付けで、選択された癌細胞株におけるｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}タンパク質の発現と正常なＲＢの存在との間には逆比例の関係が存在することが見出されている。例えば、ｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}タンパク質は、ＲＢが変異しているか、または欠失しているか、または不活性化されているときに検出可能であり、正常なＲＢを含む細胞株では、著しく減少しているか、または存在しない。Ｋｈｅｉｆ等（Ｋｈｅｉｆ ＳＮ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：４３５０〜４３５４、１９９６）は、ｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}タンパク質が、変異型ＲＢ、またはＥ７により機能的に不活性化されている野生型ＲＢのいずれかを含有するヒト子宮頸癌細胞で発現していることを見出した。彼らはまた、ＲＢの不活性化が、ｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}およびＲＢを伴うフィードバックループを裏付けるｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}のアップレギュレーションと相関することを示している。Ｍｉｌｄｅ−Ｌａｎｇｏｓｃｈ等（Ｍｉｌｄｅ−Ｌａｎｇｏｓｃｈ Ｋ等（２００１）、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ、４３９：５５〜６１）は、著しい相関が、ｐ１６の強い発現とＨＰＶの１６／１８の感染との間に、そして、ｐ１６の強い発現とＨＰＶの１６／１８のＥ６／Ｅ７癌遺伝子発現との間に存在することを見出した。Ｋｌａｅｓ等（Ｋｌａｅｓ Ｒ等（２００１）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、９２：２７６〜２８４）は、１５２例の高悪性度の形成異常の子宮頸部病変（ＣＩＮ ＩＩから侵襲性癌まで）のうちの１５０個でｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}遺伝子産物の強い過剰発現を観察し、これに対して、正常な子宮頸部上皮または炎症性病変または化生性病変はｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}特異的モノクローナル抗体Ｅ６Ｈ４で染色されなかった。ＬＲ−ＨＰＶ型に関連する、ＣＩＮ Ｉと評価された病変はすべてが反応性を全く示さなかったか、または限局的もしくは散発性の反応性を示しただけであり、これに対して、ＨＲ−ＨＰＶ型に関連する、ＣＩＮ Ｉと評価された病変は、２つを除くすべてがｐ１６^{ｉｎｋ４ａ}について強い広汎性の染色を示した。

開示されるスクリーニング方法は、検査中の被験者から採取された子宮頸細胞を含有する臨床サンプルまたは生検物から単離された核酸の調製物に対して行うことができる。核酸の供給源として使用することができる好適なサンプルには、子宮頸部拭き取り検体、子宮頸部生検物、子宮頸部かき取り検体、皮膚生検物／いぼ、そしてパラフィン包埋組織、およびホルマリン固定細胞またはメタノール固定細胞が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。

開示される方法を使用してスクリーニングされる核酸の調製物は、ｍＲＮＡを含まなければならないが、精製されたポリＡ＋ｍＲＮＡの調製物である必要はない。トータルＲＮＡの調製物、またはＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方を含有するトータル核酸の粗調製物、または粗細胞溶解物さえもまた、ＮＡＳＢＡ反応のための出発材料として好適である。本質的には、ｍＲＮＡを含む核酸の調製物を単離するためにこの分野で知られている任意の技術を、検査サンプルから核酸を単離するために使用することができる。好ましい技術は、米国特許第５，２３４，８０９号および欧州特許ＥＰ−Ｂ−０３８９，０６３に記載される「Ｂｏｏｍ」単離法である。この方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する核酸調製物を単離するために使用することができ、カオトロピック剤であるグアニジンチオシアナート（ＧｕＳＣＮ）の存在下での二酸化ケイ素粒子の核酸結合性に基づいている。

本発明の方法は、子宮頸部の細胞におけるＨＰＶゲノムの活性な転写物を評価することに基づいている。本発明の方法は、ｍＲＮＡ発現を検出するために使用される精確な技術に関して限定されない。特定のｍＲＮＡ配列を検出するための多くの技術がこの分野では知られており、これらを本発明に従って使用することができる。例えば、特定のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション、増幅または配列決定技術によって検出することができる。

増幅技術（最も好ましくは、例えば、ＮＡＳＢＡ、転写介在増幅、ＲＮＡ技術のシグナル介在増幅、等温液相増幅などの等温増幅）によってｍＲＮＡ発現を検出することが最も好ましい。これらの方法はすべてがこの分野では広く知られている。より好ましくは、ｍＲＮＡ発現は、増幅生成物のリアルタイム検出との組合せでの等温増幅によって検出される。最も好ましい組み合わせは、Ｌｅｏｎｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、第２６巻、２１５０〜２１５５、に記載されるような、分子ビーコン技術を使用する増幅生成物のリアルタイム検出と一緒にされたＮＡＳＢＡによる増幅である。

ＮＡＳＢＡ技術を使用して検査サンプルにおけるＨＰＶを検出するための方法は、一般には、下記の工程を含む：（ａ）好適なプライマー対、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を加水分解するリボヌクレアーゼ、上記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ、ならびにリボヌクレオシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む反応媒体を組み立てる（調製する）工程；（ｂ）ＮＡＳＢＡ増幅反応を可能にする反応条件のもと、反応媒体を、ＨＰＶを含有すると思われる検査サンプルから単離された核酸調製物とインキュベーションする工程；（ｃ）ＮＡＳＢＡ増幅反応の任意のＨＰＶ特異的な生成物を検出し、かつ／または定量的に測定する工程。

ＮＡＳＢＡ反応の特異的な生成物（すなわち、標的ＲＮＡのセンスコピーおよび／またはアンチセンスコピー）の検出は多数の異なる方法で行なうことができる。１つの方法において、ＮＡＳＢＡの生成物は、ＮＡＳＢＡ生成物に特異的にアニーリングすることができるＨＰＶ特異的なハイブリダイゼーションプローブの使用によって検出することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、顕示用の標識（例えば、蛍光性化合物、発光性化合物、放射性化合物または化学発光性化合物あるいは酵素標識あるいは当業者に知られている任意の他のタイプの標識）に結合させることができる。標識の精確な性質は重要ではないが、外部の手段（それ自体によるか、または１つ以上の更なる物質（例えば、酵素に対する基質）との組合せによるかのいずれか）によって検出可能なシグナルを生じさせることができなければならない。

好ましい検出方法は、いわゆる「リアルタイムＮＡＳＢＡ」であり、これは、反応の経過にわたってＮＡＳＢＡ反応の生成物の形成を連続的にモニターすることができる。好ましい実施形態において、これは、この分野では知られているように、また本明細書中に記載されるように、ＮＡＳＢＡ生成物にアニーリングすることができるＨＰＶ特異的配列、ステム二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列、および１対の蛍光剤／消光剤部分を含む「分子ビーコン」プローブを使用して達成することができる。分子ビーコンプローブが増幅前の反応混合液に加えられる場合、リアルタイムでＮＡＳＢＡ生成物の形成をモニターすることが可能であり得る（Ｌｅｏｎｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、第２６巻、２１５０〜２１５５）。リアルタイムＮＡＳＢＡ検出を行なうための様々な試薬キットおよび計測器械が市販されている（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ ＴｅｋｎｉｋａからＮｕｃｌｉＳｅｎｓ（商標） ＥａｓｙＱシステム）。

更なる方法において、分子ビーコン技術は、別個のハイブリダイゼーションプローブを必要とすることなく、ＮＡＳＢＡ反応のリアルタイムでのモニタリングを可能にするプライマー２オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。

なお更なる方法において、ＮＡＳＢＡ反応の生成物は、プライマー２オリゴヌクレオチドの５’末端においてヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする一般的な標識された検出プローブを使用してモニターすることができる。これは、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによって供給される「ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ（商標）」検出システムに対応する。このシステムでは、標的ＨＰＶｍＲＮＡから得られたＮＡＳＢＡ生成物に対する特異性が、磁性マイクロビーズなどの固体支持体に結合した本明細書中に記載されるようなプローブオリゴヌクレオチドを含むＨＰＶ特異的な捕捉プローブを使用することによって付与され得る。最も好ましくは、一般的な標識された検出プローブは、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによって供給されるＥＣＬ（商標）検出プローブである。ＮＡＳＢＡ単位複製配列（ＮＡＳＢＡアンプリコン）は、プライマー２上の相補的配列を介して、ＨＰＶ特異的な捕捉プローブおよび一般的なＥＣＬプローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、ビーズ／アンプリコン／ＥＣＬプローブの複合体を自動ＥＣＬリーダー（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａにより供給されるＮｕｃｌｉＳｅｎｓ（商標）リーダー）の磁石電極において捕捉することができる。その後、電圧パルスにより、ＥＣＬ（商標）反応は開始させられる。

ＨＰＶｍＲＮＡの検出はまた、例えば、頭部および頸部の癌腫、口腔および舌の癌腫、皮膚の癌腫、肛門および膣の癌腫を含む、子宮頸癌以外の癌において臨床的関連性を有する。ＨＰＶｍＲＮＡの検出はまた、身体の下部部分におけるリンパ節中の微小転移巣の診断において非常に有用であり得る。従って、本発明ではまた、ＨＰＶのＬ１転写物およびＥ６転写物の発現についてスクリーニングすることに基づいた、上記に示された癌に対する罹病性についてのスクリーニングが考えられる。

本発明の更なる態様によれば、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６遺伝子の転写物の検出に使用するためのキットが提供され、このキットは、少なくともＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型、および好ましくはＨＰＶ４５に由来するＬ１転写物の領域の増幅に使用するのに適した少なくとも１つのプライマー対と、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型、および好ましくはＨＰＶ４５に由来するＥ６転写物の領域の増幅を可能にする１つ以上のプライマー対とを含む。

「プライマー対」は、任意の知られている核酸技術を使用してＬ１ｍＲＮＡまたはＥ６ｍＲＮＡの特定の領域を増幅するために組み合わせて使用することができるプライマーの対を意味することが理解される。好ましい実施形態において、キットに含まれるプライマー対は、ＮＡＳＢＡ増幅または類似する等温増幅技術において使用するために適している。

キットに含まれる各プライマー対を構成する個々のプライマーは、別々に供給され得るか（例えば、各プライマーの別個の容器で）、または、より好ましくは、１つの容器において混合されて供給され得る。２つ以上のプライマー対の組み合わせを、キット内の１つの容器において混合済みとして供給することができる。２つ以上の増幅反応が「多重化」されることになる場合（これは、１つの反応容器で同時に行なわれることを意味する）、１つの容器で２つ以上のプライマー対を供給することが好都合である場合がある。

Ｅ６転写物の領域を増幅において使用するのに適したプライマー対は、少なくとも主要な癌関連ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、および３３型、そしてまた、好ましくはＨＰＶ４５に由来するＥ６ｍＲＮＡ領域の増幅を可能にしなければならない。これを達成することができる異なる方法がいくつかある。

１つの実施形態において、キットは、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型、そしてまた、好ましくは４５型のそれぞれについて特異的な別個のプライマー対を含有することができる。これらのプライマー対は別個の容器でキット内に供給され得るか、または、例えば、増幅反応の多重化を可能にするために、２つ以上のプライマー対の混合物として１つの容器で供給され得る。

更なる実施形態において、キットは、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型、そしてまた、好ましくはＨＰＶ４５に由来するＥ６遺伝子の領域を増幅することができ、従って１回の増幅反応で４つ（好ましくは５つ）の型すべての増幅を可能にする単一のプライマー対を含有することができる。これは、例えば、１対の縮重プライマーの使用によって、または様々なＨＰＶ型の間で高度に保存されているＥ６ｍＲＮＡの領域を選択することによって達成することができる。

Ｅ６プライマー対はＥ６ｍＲＮＡの任意の領域に対応し得るし、また、Ｅ６のオープンリーディングフレームおよび／またはＥ７のオープンリーディングフレームのすべてまたは一部分の増幅を可能にし得る。

キットは更に、１６型、１８型、３１型および３３型、そしてまた、好ましくはＨＰＶ４５とは異なるＨＰＶ型に由来するＥ６ｍＲＮＡを増幅する際に使用されるのに適したプライマー対を含むことができる。例えば、キットは、特定の地理学的領域または集団において特有であるＨＰＶ型を検出するためのＥ６プライマーを追加することができる。

Ｌ１転写物の領域を増幅する際に使用されるのに適したプライマー対は、少なくとも、主要な癌関連ＨＰＶ型である１６型、１８型、３１型および３３型、および、好ましくはＨＰＶ４５に由来するＬ１ｍＲＮＡの特定領域を増幅することができなければならず、また、実質的にすべての知られているＨＰＶ型に由来するＬ１ｍＲＮＡの特定領域を増幅する際の使用のために適していなければならない。そのようなプライマーの使用により、１回の増幅反応で多数のＨＰＶ型に由来するＬ１ｍＲＮＡの活性な転写について試験することが可能である。

高度に保存されているＬ１転写物の領域を選択することによって多数のＨＰＶ型に由来するＬ１転写物を検出することができるプライマーを設計することが可能である。

更なる方法において、多数のＨＰＶ型に対する特異性を、縮重オリゴヌクレオチドプライマーの使用によって、または、好ましくは様々なＨＰＶ遺伝子型の間での配列変化部位に対応する小さな配列変化を示すポリヌクレオチドの複雑な混合物の使用によって達成することができる。そのような縮重プライマーまたは混合物を使用することの理由となる理論的根拠は、混合物が、それぞれのＨＰＶ型を検出することができる少なくとも１つのプライマー対を含有し得るということである。

なお更なる方法において、多数のＨＰＶ型に対する特異性を、好ましくは様々なＨＰＶ遺伝子型の間での配列変化部位において１つ以上のイノシンヌクレオチドをプライマーに取り込むことによって達成することができる。

Ｅ６プライマー対およびＬ１プライマー対は別個の容器でキット内に供給され得るか、またはＬ１プライマー対が、１つの容器において、１つ以上のＥ６プライマー対との混合物として供給され得る。

キットは更に、キット内に含まれるプライマー対を使用して行われた増幅反応の生成物を検出する際に使用されるのに適した１つ以上のプローブを含むことができる。プローブは別個の試薬としてキット内に供給され得る。あるいは、プローブは１つ以上のプライマー対との混合物として供給され得る。

キットに含まれるプライマーおよびプローブは、好ましくは一本鎖ＤＮＡ分子である。相補的な核酸分子との塩基対を形成する能力を保持する非天然型合成ポリヌクレオチドもまた使用することができ、これには、修飾塩基を取り込む合成オリゴヌクレオチド、および個々のヌクレオシド間の連結がホスホジエステル結合以外の結合を含む合成オリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオチド合成のための標準的な装置およびプロトコルを使用する化学合成などによって、この分野で広く知られている技術に従って製造することができる。

プライマーおよびプローブは、典型的には、長さが１００塩基以下である単離された一本鎖ポリヌクレオチドであり、より典型的には、長さが５５塩基未満である単離された一本鎖ポリヌクレオチドである。不確かさを避けるために、用語「プライマー」および用語「プローブ」は、天然に存在する全長のＨＰＶゲノムを含まないことがそれにより示される。

ＨＶＰ特異的配列を取り込む、いくつかの一般的なタイプのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブをキットに含めることができる。典型的には、そのようなプライマーおよびプローブは非ＨＰＶ配列を更に含むことができ、例えば、増幅反応のために要求される配列、または増幅反応の生成物の検出を容易にする配列を含むことができる。

第１のタイプのプライマーはプライマー１オリゴヌクレオチド（これはまた、ＮＡＳＢＡ Ｐ１プライマーとして本明細書中では示される）であり、これは、長さが一般には約５０塩基であるオリゴヌクレオチドで、標的ｍＲＮＡの領域に対して相補的である平均して約２０塩基を３’端に含有する。ＮＡＳＢＡ Ｐ１プライマーとして使用される好適なオリゴヌクレオチドが表１に「Ｐ１／ＰＣＲ」として示される。Ｐ１プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｘ_１−ＳＥＱの一般的な構造（この場合、ＳＥＱはＨＰＶ特異的配列を表し、Ｘ_１は特異的なＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを含む配列である）を有する。バクテリオファージのプロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６のプロモーターは、適切なＲＮＡポリメラーゼの結合にだけ依存する高レベルの転写という利点をもたらすので、本発明のオリゴヌクレオチドにおける使用のために好ましい。好ましい実施形態において、配列「Ｘ_１」は配列ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧまたは配列ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧを含むことができる。これらの配列は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対する転写開始部位を含むＴ７プロモーターを含有する。

表１に「Ｐ１／ＰＣＲ」として示されるプライマーにおけるＨＰＶ特異的配列はまた、標準的なＰＣＲプライマーにおける使用のために適合させることができる。これらの配列がＮＡＳＢＡ Ｐ１プライマーの基礎として使用されるとき、これらの配列は、上記で定義されたように、Ｘ_１−ＳＥＱの一般的な構造を有する。プロモーター配列Ｘ_１は、ＮＡＳＢＡ Ｐ１プライマーでは必須である。しかしながら、同じ配列が標準的なＰＣＲプライマーの基礎として使用されるときには、Ｘ_１を含むことは必ずしも必要ない。

第２のタイプのプライマーはＮＡＳＢＡプライマー２オリゴヌクレオチド（これはまた、ＮＡＳＢＡ Ｐ２プライマーとして本明細書中では示される）であり、これは、一般には、標的ｍＲＮＡの領域に対して実質的に同一である約２０塩基の配列を含む。表１に「Ｐ２／ＰＣＲ」として示されるオリゴヌクレオチド配列は、ＮＡＳＢＡ Ｐ２プライマーおよび標準的なＰＣＲプライマーの両方での使用のために好適である。

ＮＡＳＢＡ Ｐ２プライマーとしての使用のために意図されたオリゴヌクレオチドは、特定の、しかし非限定的な実施形態において、標的ｍＲＮＡに対して関連性がなく、しかし、一般的な検出プローブに対してハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列を５’端に更に含むことができる。検出プローブは、好ましくは、例えば、蛍光標識、発光性標識または酵素標識で標識することができる。ある実施形態において、検出プローブは、ＥＣＬ（商標）技術を使用する検出を可能にする標識で標識される。だが、本発明はこの特定の検出方法に決して限定されないことが理解される。好ましい実施形態において、プライマー２オリゴヌクレオチドの５’端は配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＧを含むことができる。この配列は、下記の構造：Ｒｕ（ｂｐｙ）_３ ^２＋−ＧＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＧ−３’を有する、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａから市販されている一般的なＥＣＬ（商標）プローブにハイブリダイゼーションすることができる。

異なる実施形態において、プライマー２オリゴヌクレオチドは、ＮＡＳＢＡ反応のリアルタイムでのモニターを可能にするために「分子ビーコン」技術を取り込むことができる。この技術は、この分野では知られており、例えば、国際公開公報第９５／１３３９９号によって、また、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０３〜３０８、１９９６に記載される。

標的特異的なプローブオリゴヌクレオチドもまたキット内に含めることができる。プローブオリゴヌクレオチドは、一般には、標的ｍＲＮＡの領域またはその相補体に対して実質的に同一である約２０塩基〜２５塩基の配列を含む。プローブとしての使用のために好適である例示的なＨＰＶ特異的オリゴヌクレオチド配列が表１に「ＰＯ」として示される。プローブオリゴヌクレオチドは、ＮＡＳＢＡ反応またはＰＣＲ反応の生成物を検出するための標的特異的なハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。これに関連して、プローブオリゴヌクレオチドは、捕捉プローブ（下記参照）を形成させるために、常磁性ビーズなどの固体支持体に結合させることができる。好ましい実施形態において、プローブオリゴヌクレオチドの５’端をビオチンで標識することができる。ビオチン標識の付加は、プローブをビオチン／ストレプトアビジン連結またはビオチン／アビジン連結により固体支持体に結合させることを容易にする。

増幅産物のリアルタイムでの検出を可能にする標的特異的なプローブは「分子ビーコン」技術を取り込むことができる。この技術は、この分野では知られており、例えば、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０３〜３０８、１９９６によって記載され、また、国際公開公報第９５／１３３９９号に記載される。分子ビーコンプローブとしての使用のために好適である例示的なＨＰＶ特異的オリゴヌクレオチド配列が表１に「ＭＢ」として示される。

本明細書中で使用される用語「分子ビーコンプローブ」は、下記の構造を有する分子を意味することが理解される：
Ｘ_２−ａｒｍ_１−標的−ａｒｍ_２−Ｘ_３
（式中、「標的」は標的特異的なヌクレオチド配列を表し、「Ｘ_２」および「Ｘ_３」は蛍光性成分、および、蛍光性成分と消光剤成分との２つが非常に近くで一緒に保たれたときに蛍光性成分からの蛍光を実質的または完全に消光することができる消光剤成分を表し、「ａｒｍ_１」および「ａｒｍ_２」はステム二重鎖を形成することができる相補的な配列を表す）。

「ａｒｍ_１」配列および「ａｒｍ_２」配列の好ましい組合せは下記の通りであるが、これらは、本発明に対する限定ではなく、むしろ例示であることが意図される：
ｃｇｃａｔｇ−ＳＥＱ−ｃａｔｇｃｇ
ｃｃａｇｃｔ−ＳＥＱ−ａｇｃｔｇｇ
ｃａｃｇｃ−ＳＥＱ−ｇｃｇｔｇ
ｃｇａｔｃｇ−ＳＥＱ−ｃｇａｔｃｇ
ｃｃｇｔｃｇ−ＳＥＱ−ｃｇａｃｇｇ
ｃｇｇａｃｃ−ＳＥＱ−ｇｇｔｃｃｇ
ｃｃｇａａｇｇ−ＳＥＱ−ｃｃｔｔｃｇｇ
ｃａｃｇｔｃｇ−ＳＥＱ−ｃｇａｃｇｔｇ
ｃｇｃａｇｃ−ＳＥＱ−ｇｃｔｇｃｇ
ｃｃａａｇｃ−ＳＥＱ−ｇｃｔｔｇｇ
ｃｃａａｇｃｇ−ＳＥＱ−ｃｇｃｔｔｇｇ
ｃｃｃａｇｃ−ＳＥＱ−ｇｃｔｇｇｇ
ｃｃａａａｇｃ−ＳＥＱ−ｇｃｔｔｔｇｇ
ｃｃｔｇｃ−ＳＥＱ−ｇｃａｇｇ
ｃｃａｃｃｃ−ＳＥＱ−ｇｇｇｔｇｇ
ｃｃａａｇｃｃ−ＳＥＱ−ｇｇｃｔｔｇｇ
ｃｃａｇｃｇ−ＳＥＱ−ｃｇｃｔｇｇ
ｃｇｃａｔｇ−ＳＥＱ−ｃａｔｇｃｇ

分子ビーコン技術の使用により、増幅反応、例えば、ＮＡＳＢＡ増幅（Ｌｅｏｎｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．、１９９８、第２６巻、２１５０頁〜２１５５頁を参照のこと）のリアルタイムでのモニタリングが可能になる。分子ビーコンプローブは、一般には、ステム二重鎖構造を互いに形成するためにハイブリダイゼーションすることができる、ＨＰＶ特異的配列に隣接する相補的な配列（これらは、本明細書中ではａｒｍ_１およびａｒｍ_２の表示によって表される）を含む。ａｒｍ_１およびａｒｍ_２の正確な配列は、プローブが標的ＨＰＶ配列に結合しないとき、これらの配列がステム二重鎖を形成することができなければならないという条件を除いて、本発明にとって重要ではない。

分子ビーコンプローブはまた、本明細書中ではＸ_２およびＸ_３の表示によって表される蛍光性成分および消光剤成分を含む。当業者によって理解されるように、蛍光剤成分および消光剤成分は、これらの２つの成分が非常に近くに存在するとき、例えば、プローブが標的配列の非存在下でヘアピンの「閉じた」立体配座にあるとき、消光剤成分が蛍光性成分からの蛍光を実質的または完全に消光することができるように選択される。標的配列に結合したとき、蛍光性成分および消光剤成分は、蛍光性成分の蛍光がもはや消光されないように離れて保たれる。

本発明に従って使用され得る消光剤／蛍光性成分の好適な対の多くの例がこの分野では知られている（国際公開公報第９５／１３３９９号、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（同上）を参照のこと）。多くの異なる色での広範囲の蛍光団を使用することができ、これらには、例えば、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、フルオレセイン、ＦＡＭおよびテキサスレッドが含まれる（Ｔｙａｇｉ、ＢｒａｔｕおよびＫｒａｍｅｒ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：４９〜５３を参照のこと）。異なる色の蛍光団で標識されたプローブの使用は、１つの反応容器における２つ以上の異なるプローブの「多重」検出を可能にする。好ましい消光剤は４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）であり、これは、広範囲の蛍光団に対する「普遍的（ユニバーサル）」な消光剤として役立つ非蛍光性発色団である。蛍光剤成分および消光剤成分は、いずれかの配向で、すなわち、５’端またはその近くにおける蛍光剤および３’端またはその近くにおける消光剤、あるいはその逆のいずれかで、プローブに共有結合的に結合させることができる。分子ビーコンプローブを合成するための様々なプロトコルがこの分野では知られている。合成に関する詳細なプロトコルが、Ｓａｎｊａｙ Ｔｙａｇｉ等（分子遺伝学部、公衆衛生研究所、４５５ Ｆｉｒｓｔ Ａｖｅｎｕｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ １００１６、米国）による「分子ビーコン：均一溶液において核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ」と題する論文に示されている（これは、（ｗｗｗ．ｐｈｒｉ．ｎｙｕ．ｅｄｕまたはｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎｓ．ｏｒｇにおける）ＰＨＲＩウエブサイトを介してオンラインで入手可能である）。

ＮＡＳＢＡ Ｐ１プライマーおよびＮＡＳＢＡ Ｐ２プライマーの好適な組合せを、ＮＡＳＢＡ増幅反応を行わせるために使用することができる。ＮＡＳＢＡ増幅反応を行わせるために、プライマー１オリゴヌクレオチドおよびプライマー２オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの標的領域から二本鎖ＤＮＡの合成を開始させることができなければならない。これが生じるためには、プライマー１オリゴヌクレオチドおよびプライマー２オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の領域に対してそれぞれ相補的である標的特異的な配列を含まなければならない。

ＮＡＳＢＡ増幅反応サイクルの最初の段階（いわゆる「非サイクル」段階）において、プライマー１オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ内の相補的な配列にアニーリングし、その３’端がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）の作用によって伸張させられ、第一鎖ｃＤＮＡ合成を形成する。得られるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖が、その後、例えば、ＲＮａｓｅＨの作用によって消化され、一本鎖のＤＮＡが残る。プライマー２オリゴヌクレオチドが、この一本鎖ＤＮＡの３’端に向かって相補的な配列にアニーリングし、その３’端が（逆転写酵素の作用によって）伸張され、二本鎖ＤＮＡを形成する。その後、ＲＮＡポリメラーゼは、今度は二本鎖ＤＮＡ内の転写活性なプロモーター配列から多数のＲＮＡコピーを転写することができる。このＲＮＡ転写物は、元の標的ｍＲＮＡに対してアンチセンスではあるが、ＮＡＳＢＡ反応を更に行うためのテンプレートとして作用することができる。この場合、プライマー２がＲＮＡにアニーリングし、第一鎖ｃＤＮＡ鎖の合成を開始させ、そしてプライマー１が第二ｃＤＮＡ鎖の合成を開始させる。ＮＡＳＢＡ反応の一般的な原理はこの分野では広く知られている（Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５０：９１〜９２を参照のこと）。

本明細書中に記載される標的特異的なプローブオリゴヌクレオチドはまた、磁石マイクロビーズなどの固体支持体に結合させて、ＮＡＳＢＡ増幅反応の生成物（一本鎖ＲＮＡ）を固定化するための「捕捉プローブ」として使用することができる。本明細書中に記載される標的特異的な「分子ビーコン」プローブは、ＮＡＳＢＡ反応のリアルタイムでのモニタリングのために使用することができる。

本発明によるキットはまた、既知のＨＰＶ型に由来するＥ６ｍＲＮＡおよび／またはＬ１ｍＲＮＡを含有する陽性コントロールを含むことができる。好適なコントロールには、例えば、既知のＨＰＶ型が感染している細胞株（例えば、ＨｅＬａ、ＣａＳｋｉ）から調製された核酸抽出物が含まれる。

キットは更に、内部標準用の増幅プライマー、例えば、ヒトＵ１Ａ ＲＮＡについて特異的なプライマー、を含有することができる。

ＮＡＳＢＡ増幅において使用される好適なプライマー（および場合によりプローブ）を含有するキットは更に、ＮＡＳＢＡ反応のために要求される酵素の混合物、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を加水分解するリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨ）、およびＲＮＡポリメラーゼの酵素混合物を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼは、試薬キットに供給されるＮＡＳＢＡ Ｐ１プライマーの５’末端領域に存在するプロモーター領域を認識するものでなければならない。キットはまた、ＲＮＡ合成およびＤＮＡ合成のために要求されるリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含有するＮＡＳＢＡ緩衝液の供給源を含むことができる。標準的なＮＡＳＢＡ反応緩衝液の組成は当業者には広く知られている（Ｌｅｏｎｅ等（同上）もまた参照のこと）。

ＨＰＶのＬ１ｍＲＮＡおよびＥ６ｍＲＮＡをＮＡＳＢＡによって検出する際に使用される好適な好ましいプライマーが下記の表に示される。しかしながら、これらは単なる例示であり、本発明の範囲がこれらの特定の分子に限定されることは意図されない。

下記の表において、ＮＡＳＢＡ Ｐ２プライマー（ｐ２）は配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＧを５’端に含み、ＮＡＳＢＡ Ｐ１プライマー（ｐ１）は配列ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧを５’端に含む。プローブとして使用される好適なオリゴヌクレオチドは「ｐｏ」によって識別される。Ｐ２プライマーは、一般には、プラス鎖に由来するＨＰＶ配列を含有し、これに対して、ｐ１プライマーは、一般には、マイナス鎖に由来するＨＰＶ配列を含有する。ｎｔは、関連するＨＰＶゲノム配列におけるヌクレオチド位置を示す。

同じ接頭辞を有するＰ１プライマーおよびＰ２プライマーの対（例えば、ＨＡｅ６７０１ｐ１およびＨＡｅ６７０１ｐ２）は、組合せで使用されることが意図される。しかしながら、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型および４５型について下記に要約されるように、他の組合せもまた使用することができる。

ＨＰＶ１６のＥ６ｍＲＮＡを増幅するための好適なプライマー対は下記の通りである：
HAe6701p2またはHAe6702p2（両者とも、ｎｔ１１６）およびHAe6701p1またはHAe6702p1（両者とも、ｎｔ３６８）。
HAe6701p2またはHAe6702p2（両者とも、ｎｔ１１６）およびHPV16p1（ｎｔ２５８）。H16e6702Ap2（ｎｔ１４２）、H16e6702Bp2（ｎｔ１８２）、H16e6702Cp2（ｎｔ１８５）またはH16e6702Dp2（ｎｔ１８８）およびHAe6701p1またはHAe6702p1（両者とも、ｎｔ３６８）。
HAe6701p2またはHAe6702p2（両者とも、ｎｔ１１６）およびHAe6702Ap1（ｎｔ２０８）、HAe6702Bp1（ｎｔ１９１）、HAe6702Cp1（ｎｔ１８６）またはHAe6702Dp1（１８５）。これらの組合せは、すべてのＥ６スプライス変化体を増幅するために好適である。
HAe6703p2またはHAe6704p2（両者とも、ｎｔ６５６）およびHAe6703p1またはHAe6704p1（両者とも、ｎｔ７４１）。これらの組合せは、（少なくともｎｔ７４１までの）Ｅ７コード領域を含有する転写物のすべてを増幅するために好適である。

下記のプライマー対は、ＨＰＶ１８のＥ６ｍＲＮＡを増幅するために好ましい：
H18e6701p2（ｎｔ７０２）またはH18e6702p2（ｎｔ６９８）およびH18e6701p1またはH18e6702p1（両者とも、ｎｔ８６９）。
H18e6703p2（ｎｔ６５１）およびH18e6703p1（ｎｔ８１７）。
H18e6704p2（ｎｔ１７９）およびH18e6704p1（ｎｔ３７９）。

下記のプライマー対は、ＨＰＶ３１のＥ６ｍＲＮＡを増幅するために好ましい：
H31e6701p2またはH31e6702p2（両者とも、ｎｔ１６４）およびH31e6701p1またはH31e6702p1（両者とも、ｎｔ４２３）。
H31e6703p2（ｎｔ６１７）、H31e6704p2（ｎｔ６１９）またはH31e6705p2（ｎｔ６１７）およびH31e6703p1（ｎｔ７６６）、H31e6704p1（７６６）またはH31e6705p1（ｎｔ８０９）。

下記のプライマー対は、ＨＰＶ３３のＥ６ｍＲＮＡを増幅するために好ましい：
H33e6701p2（ｎｔ６１８）またはH33e6703p2（ｎｔ６２０）およびH33e6701p1（ｎｔ７６３）またはH33e6703p1（ｎｔ８０７）。
H33e6702p2（ｎｔ４３１）およびH33e6702p1（ｎｔ６１８）。

下記のプライマー対は、ＨＰＶ４５を増幅するために好ましい：
HPV45p2（ｎｔ４３０）およびHPV45p1（ｎｔ５２７）。

ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型について好ましいＰＣＲプライマー対はＮＡＳＢＡプライマー対と類似する。

配列番号１４９および配列番号１５０（Ｏｎｃ２Ａ２／Ｏｎｃ２Ａ１−ＰＣＲおよびＯｎｃ２Ａ１／Ｏｎｃ２Ａ２−ＰＣＲのプライマー）におけるＨＰＶ特異的配列は、ＨＰＶ１６型のゲノム配列の６５９６位〜６６１５位のフラグメント（配列番号１４９；Ｏｎｃ２Ａ２／Ｏｎｃ２Ａ１−ＰＣＲ）および６７２９位〜６７４７位のフラグメント（配列番号１５０；Ｏｎｃ２Ａ１／Ｏｎｃ２Ａ２−ＰＣＲ）と同一である。

ＨＰＶ特異的配列の配列番号１５２および配列番号１５３（Ｏｎｃ２Ｂ２／Ｏｎｃ２Ｂ１−ＰＣＲおよびＯｎｃ２Ｂ１／Ｏｎｃ２Ｂ２−ＰＣＲ）は、それぞれ、数個の縮重塩基を含む上記配列の変化体である。本明細書中に提供される縮重オリゴヌクレオチド分子の配列の代表例では、標準的なＩＵＢ記号が混合塩基部位について使用される：Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｖ＝Ｇ、Ａ、Ｃ；Ｂ＝Ｇ、Ｔ、Ｃ；Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｄ＝Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ；Ｓ＝Ｇ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ；Ｍ＝Ａ、Ｃ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｒ＝Ａ、Ｇ。

配列の３’端に向かってヌクレオチド「ＳＲＨ」の任意の２つが下記のようにイノシン（Ｉ）で置換されるＨＰＶ特異的配列の配列番号１５２（Ｏｎｃ２Ｂ２／Ｏｎｃ２Ｂ１−ＰＣＲ）および配列番号１５３（Ｏｎｃ２Ｂ１／Ｏｎｃ２Ｂ２−ＰＣＲ）の変化体を使用することもまた可能である：
5' AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3'
5' AATGGCATTTGTTGGSIIAA 3'
5' AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3'

ＨＰＶ特異的配列の配列番号１５６〜配列番号１６３（これらは、Ｏｎｃ２Ｃ２、Ｏｎｃ２Ｄ２、Ｏｎｃ２Ｅ２、Ｏｎｃ２Ｆ２、Ｏｎｃ２Ｇ２、Ｏｎｃ２Ｈ２、Ｏｎｃ２Ｉ２、Ｏｎｃ２Ｊ２、Ｏｎｃ２Ｃ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｄ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｅ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｆ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｇ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｈ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｉ１−ＰＣＲおよびＯｎｃ２Ｊ１−ＰＣＲのプライマーに存在する）は、ＨＰＶ特異的配列の配列番号１５２（Ｏｎｃ２Ｂ２／Ｏｎｃ２Ｂ１−ＰＣＲ）に基づく変化体であり、これに対して、ＨＰＶ特異的配列の配列番号１６４〜配列番号１６９（これらは、Ｏｎｃ２Ｋ１、Ｏｎｃ２Ｌ１、Ｏｎｃ２Ｍ１、Ｏｎｃ２Ｎ１、Ｏｎｃ２Ｏ１、Ｏｎｃ２Ｐ１、Ｏｎｃ２Ｋ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｌ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｍ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｎ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｏ２−ＰＣＲおよびＯｎｃ２Ｐ２−ＰＣＲに存在する）は、ＨＰＶ特異的配列の配列番号１５３（Ｏｎｃ２Ｂ１／Ｏｎｃ２Ｂ２−ＰＣＲ）に基づく変化体である。これらの変化体は、縮重塩基と、そしてまたイノシン（Ｉ）残基とを含む。このような配列変化により、これらの変化体配列を取り込むオリゴヌクレオチドが多数のＨＰＶ型に結合することが可能になる。イノシン塩基はハイブリダイゼーションを妨害せず、従って、多数のＨＰＶ型に結合することができる「コンセンサス」プライマーを構築するために、様々なＨＰＶ型の間で変化している部位において含むことができる。

Ｏｎｃ２Ａ２、Ｏｎｃ２Ｂ２、Ｏｎｃ２Ｃ２、Ｏｎｃ２Ｄ２、Ｏｎｃ２Ｅ２、Ｏｎｃ２Ｆ２、Ｏｎｃ２Ｇ２、Ｏｎｃ２Ｈ２、Ｏｎｃ２Ｉ２およびＯｎｃ２Ｊ２のプライマーの任意の１つまたは複数を、ＨＰＶのＬ１ｍＲＮＡをＮＡＳＢＡ増幅するために、Ｏｎｃ２Ａ１、Ｏｎｃ２Ｂ１、Ｏｎｃ２Ｋ１、Ｏｎｃ２Ｌ１、Ｏｎｃ２Ｍ１、Ｏｎｃ２Ｎ１、Ｏｎｃ２Ｏ１およびＯｎｃ２Ｐ１のプライマーの任意の１つまたは複数との組合せで使用することができる。

Ｏｎｃ２Ａ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｂ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｃ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｄ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｅ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｆ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｇ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｈ１−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｉ１−ＰＣＲおよびＯｎｃ２Ｊ１−ＰＣＲのプライマーの任意の１つまたは複数を、ＨＰＶのＬ１ｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するために、Ｏｎｃ２Ａ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｂ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｋ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｌ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｍ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｎ２−ＰＣＲ、Ｏｎｃ２Ｏ２−ＰＣＲおよびＯｎｃ２Ｐ２−ＰＣＲのプライマーの任意の１つまたは複数との組合せで使用することができる。

本発明は、下記の実験例および図面を参照して更に理解される。

実施例１ ＮＡＳＢＡに基づく核酸増幅およびリアルタイム検出によるＨＰＶｍＲＮＡの検出

臨床サンプルの採取および調製
パプ塗抹標本およびＨＰＶサンプルがオスロ（ノルウェー）での子宮頸部スクリーニングプログラムで５９７０名の女性から集められた。ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出のために意図されたサンプルは下記のように処理された。

子宮頸部サンプルを、細胞採取用ブラシ（Ｒｏｖｅｓｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ、オランダ）を使用して、子宮頸部スクリーニングプログラムに参加した各女性から採取した。その後、細胞採取用ブラシは９ｍｌの溶解緩衝液（５Ｍグアニジンチオシアナート）に漬けられた。ＲＮＡは５Ｍグアニジンチオシアナート中において−７０℃で最も良く保護されるので、サンプルの全体積の１ｍｌのみが各抽出操作のために使用された。溶解緩衝液中のサンプルは、−２０℃で１週間まで保存され、その後は、ＤＮＡ／ＲＮＡの単離が行われるまで−７０℃で保存された。

ＲＮＡおよびＤＮＡは、溶解緩衝液における９ｍｌの全サンプルから１ｍｌを使用して、１回目の抽出において５３００名の女性から自動処理により単離された。ＲＮＡおよびＤＮＡは、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標）抽出器を自動抽出用プロトコルに従って使用して、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｂ．Ｖ．、Ｂｏｓｅｌｉｎｄ １５、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ８４、５２８０ ＡＢ Ｂａｘｔｅｌ、オランダ；現在、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、６９２８０ Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）から得られる「Ｂｏｏｍｓ」単離法に従って抽出された。

細胞株
ＨｅＬａ細胞株（ＨＰＶ１８）、ＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ１６）およびＣａＳｋｉ細胞株（ＨＰＶ１６）から得られたＤＮＡおよびＲＮＡが、ＰＣＲ反応およびＮＡＳＢＡ反応のための陽性対照として使用された。これらの細胞株はまた、感度実験（実施例２）におけるサンプル材料として使用された。ＳｉＨａ細胞は、細胞あたり１−２コピーの組み込まれたＨＰＶ１６を有し、一方、ＣａＳｋｉ細胞は、組み込まれた状態およびエピソーム状態の両方で、６０−６００コピーのＨＰＶ１６を有する。ＨｅＬａ細胞は、細胞あたり約１０−５０コピーのＨＰＶ１８を有する。

ＰＣＲによるＨＰＶの検出および型決定
子宮頸部切屑物に由来する単離されたＤＮＡを、コンセンサスなＧＰ５＋／６＋のプライマーを使用するＰＣＲに供した（欧州特許ＥＰ−Ｂ−０５１７７０４）。ＰＣＲは、７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、２０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（商標）、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１Ｕの組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、３μｌのＤＮＡサンプル、ならびに、各５０ｐｍｏｌのＧＰ５＋プライマーおよびＧＰ６＋プライマーを含有する５０μｌの反応体積において行われた。９４℃での２分間の熱変性工程の後、ＰＣＲプロセッサー（Ｐｒｉｍｕｓ９６、ＨＰＬブロック、ＭＷＧ、ドイツ）による４０サイクルの増幅が続いた。各サイクルには、１分の変性工程、４０℃で２分間のプライマーアニーリング工程、および７２℃で１．５分間の鎖伸張工程が含まれた。最後の伸張工程が、増幅されたＤＮＡの完全な伸張を確実にするために４分伸ばされた。

ＧＰ５＋／６＋陽性サンプルは、下記のように、ＨＰＶの１６型、３１型および３３型のＰＣＲプロトコルに供された：
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３：ＰＣＲが、７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５Ｕの組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、３μｌのＤＮＡサンプル、および２５ｐｍｏｌの各プライマーを含有する５０μｌにおいて行われた。９４℃での２分間の熱変性工程の後、ＰＣＲプロセッサー（Ｐｒｉｍｕｓ９６、ＨＰＬブロック、ＭＷＧ、ドイツ）による３５サイクルの増幅が続いた。各サイクルには、３０秒間の変性工程、５７℃で３０秒間のプライマーアニーリング工程、および７２℃で１分間の鎖伸張工程が含まれた。最後の伸張工程が、増幅されたＤＮＡの完全な伸張を確実にするために１０分伸ばされた。ＨＰＶ３３に対するプロトコルは、５２℃でのプライマーアニーリング工程を有した。ＨＰＶ１８のプロトコル：プライマーが、ＨＰＶ１８型を同定するために設計された。ＰＣＲが、７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、２０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５Ｕの組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、３μｌのＤＮＡサンプル、および２５ｐｍｏｌの各プライマーを含有する５０μｌにおいて行われた。９４℃での２分間の熱変性工程の後、ＰＣＲプロセッサー（Ｐｒｉｍｕｓ９６、ＨＰＬブロック、ＭＷＧ、ドイツ）における３５サイクルの増幅が続いた。各サイクルには、３０秒間の変性工程、５７℃で３０秒間のプライマーアニーリング工程、および７２℃で１分間の鎖伸張工程が含まれた。最後の伸張工程が、増幅されたＤＮＡの完全な伸張を確実にするために１０分伸ばされた。

ヒトβ−グロビン遺伝子に対するプライマーセットがＤＮＡ品質のコントロールとして使用された（操作手順、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ）。ＰＣＲが、７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１Ｕの組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、３μｌのＤＮＡサンプル、および２５ｐｍｏｌの各プライマーを含有する５０μｌにおいて行われた。９４℃での２分間の熱変性工程の後、ＰＣＲプロセッサー（Ｐｒｉｍｕｓ９６、ＨＰＬブロック、ＭＷＧ、ドイツ）による３５サイクルの増幅が続いた。各サイクルには、９４℃で１分間の変性工程、５５℃で１分半のプライマーアニーリング工程、および７２℃で２分間の鎖伸張工程が含まれた。最後の伸張工程が、増幅されたＤＮＡの完全な伸張を確実にするために４分伸ばされた。ＨｅＬａが、ＨＰＶ１８に対する陽性コントロールとして使用され、一方、ＳｉＨａまたはＣａＳｋｉが、ＨＰＶ１６に対する陽性コントロールとして使用された。水が陰性コントロールとして使用された。

ＰＣＲ生成物の可視化がＤＮＡ５００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）においてそのマニュアルに従って行われた。ＤＮＡチップでは、最適な検出範囲が０．５〜５０ｎｇ／ｍｌであるマイクロスケールでのゲル電気泳動が使用される。結果は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を使用して解釈された。

下記の表により、患者サンプルにおけるＨＰＶのＰＣＲのために使用されたプライマーが確認され、ＨＰＶの３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５８型およびＨＰＶ６／１１について有用な更なるＰＣＲプライマーが示される。

ＮＡＳＢＡによるＲＮＡ増幅
混入を避けるための注意事項：
１．核酸の放出、単離および増幅／検出を別個の研究室領域で行う。
２．核酸の放出、単離および増幅／検出のための試薬を、核酸の放出、単離および増幅／検出がそれぞれ行われることになる研究室領域において保存し、調製する。
３．チューブおよびバイアルはすべて、使用していないときには閉じたままにしておく。
４．１つの研究室領域で使用されたピペットおよび他の装置は他の領域で使用してはならない。
５．それぞれのピペッティング動作について新しいピペットまたはピペットチップを使用する。
６．核酸を含有する可能性がある流体についてはエアロゾル防止チップとともにピペットを使用する。溶液のピペッティングは、常に、この動作のためだけに開閉される隔離されたチューブから、またはこの動作のためだけに開閉される隔離されたチューブに行わなければならない。他のチューブおよびバイアルはすべて、閉じられたままにされ、取り扱われているものから分離されていなければならない。
７．標的ＲＮＡを含有する可能性がある臨床材料、または増幅物に関して処理するときには使い捨て手袋を使用する。可能であれば、試験手順における各ピペッティング工程の後で、特に、混入の可能性のある材料と接触した後では手袋を交換する。
８．使用済みの使い捨て物を容器に集める。それぞれの試験操作の後、容器を閉じて片づける。
９．各試験操作の後、少なくとも１時間、核酸の単離または増幅／検出のときに使用されたチューブラックを洗剤（例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｅｘｔｒａｎ ＭＡ０１アルカリ）に浸漬する。

下記の手順が、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによって供給されるＮｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ベーシックキットからの試薬を使用して行われた。

ｎ＝１０のサンプルに対する手順：
１．酵素溶液の調製。
５５μｌの酵素希釈液（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ベーシックキットから；これはソルビトールを水溶液中に含有する）を３つの凍結乾燥された酵素球体（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ベーシックキットから；これは、ＡＭＶ−ＲＴ、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＢＳＡを含有する）のそれぞれに加える。この酵素溶液を室温で少なくとも２０分間放置する。酵素溶液を１つのチューブにまとめ、指でチューブをはじくことによって十分に混合し、軽く遠心沈殿して、１時間以内に使用する。酵素混合物における最終濃度は、３７５ｍＭのソルビトール、２．５μｇのＢＳＡ、０．０８ＵのＲＮａｓｅＨ、３２ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよび６．４ＵのＡＭＶ逆転写酵素である。

２．試薬球体／ＫＣｌ溶液の調製。
１０サンプルについて：８０μｌの試薬球体希釈液（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ベーシックキットから；これはＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、４５％ＤＭＳＯを含有する）を凍結乾燥された試薬球体（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ベーシックキットから；これは、ヌクレオチド、ジチオスレイトールおよびＭｇＣｌ_２を含有する）に加え、直ちに十分にボルテックスする。これを３つの試薬球体に関して行い、溶液を１つのチューブで混合する。

３μｌのＮＡＳＢＡ水（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ベーシックキットから）を、再構成された試薬球体溶液に加え、十分に混合する。

５６μｌのＫＣｌストック溶液（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ベーシックキットから）を加え、十分に混合する。このＫＣｌ／水混合液の使用により、最終的なＫＣｌ濃度が７０ｍＭであるＮＡＳＢＡ反応物が得られる。試薬／ＫＣｌ溶液における最終濃度は、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、１．５ｍＭのＧＴＰ、そして０．５ｍＭのＩＴＰ、０．５ｍＭのジチオスレイトール、７０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ_２、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）である。

３．標的特異的プライマーおよび分子ビーコンプローブを含有するプライマー／プローブ溶液の調製。
それぞれの標的反応について、９１μｌの試薬球体／ＫＣｌ溶液（工程２で調製されたもの）を新しいチューブに移す。２５μｌのプライマー／分子ビーコンプローブ溶液を加える（反応あたり、それぞれが約０．１μＭ〜０．５μＭのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、そして約１５ｐｍｏｌ〜７０ｐｍｏｌの分子ビーコンプローブの最終濃度にする）。ボルテックスによって十分に混合する。遠心はしない。

１０個未満の標的ＲＮＡ増幅が行われている場合、適量の試薬球体溶液、ＫＣｌ／水溶液およびプライマーが使用されるために下記の表を参照する。プライマー溶液は調製後３０以内に使用しなければならない。

４．サンプルの添加。
それぞれの標的ＲＮＡ反応について： ９６ウエルマイクロタイタープレートにおいて、１０μｌのプライマー／プローブ溶液（工程３で調製されたもの）を１０個のウエルのそれぞれにピペットで入れる。５μｌの核酸抽出物を各ウエルに加える。マイクロタイタープレートを６５℃±１℃で４分間インキュベーションする。４１±０．５℃に４分かけて冷却する。その後、各ウエルに５μｌの酵素溶液を加える。直ちに、マイクロタイタープレートを蛍光検出装置（例えば、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標） ＥａｓｙＱ Ａｎａｌｙｚｅｒ）に入れ、増幅を開始する。

臨床研究からの結果
表１０には、細胞学結果に関連づけられる、リアルタイムＮＡＳＢＡでのＨＰＶ陽性事例（Ｌ１および／またはＥ６の発現）およびＰＣＲでのＨＰＶ陽性事例の分布が示される。ＰＣＲ増幅は、Ｋａｒｌｓｅｎ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４：２０９５〜２１００、１９９６に記載されるように行われた。予想された組織学に対する数字は、ＣＩＮ ＩＩＩ病変に関する類似した研究から得られた平均結果（Ｃｌａｖｅｌ等、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、８４：１６１６〜１６２３、２００１）に基づく。数例の代表的な事例から得られた結果が表１１に示される。

実施例２ コントロール細胞株に対するリアルタイムＮＡＳＢＡの感度
子宮頸癌細胞株であるＣａＳｋｉ、ＳｉＨａおよびＨｅＬａを、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ／ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘから得られるＢｏｏｍ抽出方法を使用する核酸の自動処理抽出の前（並行１および並行３）、または核酸抽出の後（並行２）のいずれかで、溶解緩衝液で希釈した。リアルタイムＮＡＳＢＡが、上記に記載されたプロトコルに従って、テキサスレッド（１６、Ｌ１および１８）またはＦＡＭ（Ｕ１Ａ、３３および３１）で標識された分子ビーコンプローブを使用して行われた。

従って、リアルタイムＮＡＳＢＡを使用して１個未満の細胞においてＨＰＶのＥ６ｍＲＮＡを検出することが可能である。

リアルタイムＮＡＳＢＡを、多重アッセイとして、また単一反応として、その両方で調べた。下記の感度研究から得られた結果は、ＣａＳｋｉ細胞株、ＳｉＨａ細胞株およびＨｅＬａ細胞株の並行操作に、そしてＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型についての合成ＤＮＡオリゴに対する３つの並行操作に基づいている。検出限界の定義は、並行したサンプルの両方が陽性であるということである。括弧内の数字（ｘ）は、示された細胞量が何回かの操作でもまた検出されたことを示す。感度は、２つの並行操作でＨＰＶを検出するために必要な細胞量として定義される。ＨＰＶ型はＰＣＲから決定され、特異性は、ＰＣＲと比較されるＮＡＳＢＡに基づいている。

感度
ＰＣＲ：Ｇｐ５＋／６＋を使用するＨＰＶのコンセンサスＰＣＲでは、１０^４個までのＳｉＨａ細胞およびＨｅＬａ細胞が、そして１０^３個までのＣａＳｋｉ細胞が検出された。しかしながら、型特異的なＰＣＲプライマーセットはより高感度であり、ＨＰＶ１６の型特異的ＰＣＲプライマーセットについては１０^３（１０^２）個のＳｉＨａ細胞および０．１個のＣａＳｋｉ細胞が検出され、一方、ＨＰＶ１８の型特異的ＰＣＲプライマーセットでは、１０^２個のＨｅＬａ細胞が検出された。

リアルタイムＮＡＳＢＡ：Ｕ１Ａについて特異的なプライマーを用いたリアルタイムＮＡＳＢＡでは、１０（１）個のＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞、そして１個のＨｅＬａ細胞が反応混合物において検出された。ＨＰＶ１６特異的プライマーの場合、より低い検出限界が（１０）（１０^２、１）個のＳｉＨａ細胞および１０（１）個のＣａＳｋｉ細胞であり、ＨＰＶ１８型特異的プライマーの場合、検出限界が１（０．１）個のＨｅＬａ細胞であった。ユニバーサルＬ１プライマーでは、１０個のＣａＳｋｉ細胞が検出された。ＨｅＬａ細胞およびＳｉＨａ細胞は、ユニバーサルＬ１プライマーを用いて検出されなかった。

Ｕ１Ａ特異的プライマーを用いたリアルタイム多重ＮＡＳＢＡは、１０（１）個のＳｉＨａ細胞および１０（１）個のＣａＳｋｉ細胞についてより低い検出限界を有したＨＰＶ１６特異的プライマーと組み合わされたとき、１０^２（１０）個のＳｉＨａ細胞および１０（１）個のＣａＳｋｉ細胞のより低い検出限界を有した。Ｌ１特異的プライマーでは、ＨＰＶ３３特異的プライマーとの組合せで、１０^３（１０^２）個のＣａＳｋｉ細胞が検出された。競合するＨＰＶ３３サンプルは反応中に存在しなかった。ＨＰＶ１８特異的プライマーの場合、ＨＰＶ３１特異的プライマーと組み合わされたとき、より低い検出限界が１（０．１）個のＨｅＬａ細胞であった。競合するＨＰＶ３１サンプルは反応中に存在しなかった。ＨＰＶ３１特異的プライマーおよびＨＰＶ３３特異的プライマーの感度は、これらのＨＰＶ型を保有する細胞株がないために試験されなかった。それらは、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３を含有するサンプルに対して試験された。しかし、細胞量、ならびにこれらの細胞におけるＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３のコピー数は不明であり、おそらくはサンプル毎に異なっていた。

リアルタイムＮＡＳＢＡが、１９９９年〜２００１年の期間にＣＩＮの治療のためにＯｓｔｆｏｌｄ中央病院に入院した女性から得られたサンプルに対して行われた（実施例３参照）。ＦＡＭまたはテキサスレッドで標識された分子ビーコンプローブが、上に記載された核酸抽出プロトコルおよびＮＡＳＢＡプロトコルと一緒に使用された。結果が、図１Ａおよび図１Ｂ（ＨＰＶ１６−患者サンプル２０５）に、図２Ａおよび図２Ｂ（ＨＰＶ１８−患者サンプル１４６）に、図３Ａおよび図３Ｂ（ＨＰＶ３１−患者サンプル２３６）に、図４Ａおよび図４Ｂ（ＨＰＶ３３−患者サンプル２１８）に、そして図５Ａおよび図５Ｂ（ＨＰＶ４５−患者サンプル３４３）に示される。それぞれの場合において、「Ａ」図は単一反応であり、一方、「Ｂ」は多重アッセイである。

特異性：リアルタイムＮＡＳＢＡの交差反応性。
リアルタイムＮＡＳＢＡプライマーの組合せが、ＮＡＳＢＡを使用してＨＰＶ型間の交差反応性について調べるために、ＨＰＶ６／１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５８またはＨＰＶ ＸについてＰＣＲにより陽性であった、オスロ研究から得られた４９０個の子宮頸部サンプルに対して試験された。すべてのサンプルが、ＨＰＶの３９型（２）、５２型（１）および５８型（２）を除いて、コンセンサスＰＣＲと、それぞれのＨＰＶ型について型特異的なＰＣＲとによって型決定された。これらのサンプルは、ＰｒｅＴｅｃｋ ＨＰＶ−Ｐｒｏｏｆｅｒに対して試験するために加えられている。ＨＰＶ Ｘは、Ｇｐ５＋／６＋でのコンセンサスＰＣＲについて陽性であるが、ＨＰＶ６／１１、１６、１８，３１、３３、３５、４５および５１については型特異的ＰＣＲによって陰性である。結果が表１７に示される。交差反応性は示されなかった。表１７からの選択された数の事例の配列確認が表１８に示される。

ＰＣＲ：合計で７７３個の子宮頸部サンプルが、ＰＣＲおよびＰｒｅＴｅｃｋ ＨＰＶ−Ｐｒｏｏｆｅｒ（リアルタイム多重ＮＡＳＢＡ）を用いて試験され、合計で２４．６％（１９０／７７３）のサンプルが、Ｇｐ５＋／６＋でのコンセンサスＰＣＲにより陽性であった。７４．１％（８３／１１２）がＨＰＶ１６であると型決定され、１３％（１５／１１２）がＨＰＶ１８であると型決定され、１７％（１９／１１２）がＨＰＶ３１であると型決定され、１２％（１３／１１２）がＨＰＶ３３であると型決定された。これらには、多重ＨＰＶ感染が含まれていた。合計で１０３個のサンプルが単一ＨＰＶ感染または多重ＨＰＶ感染を有し、９１．３％（９４／１０３）が単一のＨＰＶ感染を有するだけであった。二重のＨＰＶ感染がサンプルの８．７％（９／１０３）に存在していた。サンプルはすべて、最初に、コンセンサスなＧｐ５＋／６＋のＰＣＲプライマーにより試験された。コンセンサスなＧｐ５＋／６＋からのＨＰＶ ＰＣＲ陰性サンプルは、その後、インタクトなＤＮＡを確認するために、β−グロビンのコントロールプライマーにより試験された。ＨＰＶ ＰＣＲ陽性サンプルはこのＤＮＡコントロールに供されなかった。この研究におけるＨＰＶ陰性サンプルはすべてが、β−グロビンのコントロールＰＣＲプライマーにより陽性であった。Ｇｐ５＋／６＋でのＰＣＲにより陽性であるＤＮＡサンプルのみがＨＰＶ型特異的ＰＣＲに供された。注目されるＨＰＶ型は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３であった。

リアルタイム多重ＮＡＳＢＡ：リアルタイムＮＡＳＢＡ反応の場合、Ｕ１Ａ遺伝子産物に対するプライマーおよびプローブが、インタクトなＲＮＡに対する性能コントロールとして使用された。Ｕ１Ａについて陰性であるサンプルは棄却された。多重ＨＰＶ感染を示すサンプルを含めて、合計で１４．２％（１１０／７７３）のサンプルが、ＨＰＶ型特異的ＮＡＳＢＡプライマーの少なくとも１つにより陽性であった。これらのサンプルから、５４．５％（６０／１１０）がＨＰＶ１６のＮＡＳＢＡプライマーにより陽性であり、１３．６％（１５／１１０）がＨＰＶ１８プライマーにより陽性であり、２１．８％（２４／１１０）がＨＰＶ３１プライマーにより陽性であり、１３．６％（１５／１１０）がＨＰＶ３３プライマーにより陽性であった。合計で４５個のサンプルがＬ１コンセンサスプライマーにより陽性であり、通常はＨＰＶ１６のＥ６／Ｅ７癌遺伝子発現と一緒であった（８２．２％（３７／４５））。コンセンサスなＬ１が、それぞれ、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３のいずれかと一緒に、２．２％（１／４５）で検出された。Ｌ１はまた、８．９％（４／４５）の事例において単独で検出されたが、それらはすべてが、Ｇｐ５＋／６＋のプライマーによりＰＣＲ陽性であった。合計で１０８個のサンプルが単一ＨＰＶ感染または多重ＨＰＶ感染を有し、９８．１％（１０６／１０８）が単一ＨＰＶ感染を有しただけであった。二重のｍＲＮＡ発現がサンプルの１．９％（２／１０８）に存在していた。

ＰＣＲと比較されるリアルタイム多重ＮＡＳＢＡ：合計で８７個のサンプルが、ＨＰＶ１６のＰＣＲまたはＰｒｅＴｅｃｔ ＨＰＶ−ＰｒｏｏｆｅｒによりＨＰＶ１６のＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示した。６４．４％（５６／８７）が、ＰＣＲおよびリアルタイムＮＡＳＢＡの両方によりＨＰＶ１６について陽性であることが明らかにされた。３９．１％（３４／８７）がＰＣＲにより陽性であるにすぎず、３．４％（３／８７）がリアルタイムＮＡＳＢＡにより陽性であるにすぎなかった。ＨＰＶ１８の場合、合計で２０個のサンプルが、ＰＣＲまたはリアルタイムＮＡＳＢＡのいずれかによりＨＰＶ１８のＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示した。これらの２０個のサンプルから、５０％（１０／２０）が両方の試験により陽性であり、３５％（７／２０）がＰＣＲにより陽性であるにすぎず、１５％（３／２０）がリアルタイムＮＡＳＢＡにより陽性であるにすぎなかった。合計で２７個のサンプルが、ＰＣＲまたはリアルタイムＮＡＳＢＡのいずれかによりＨＰＶ３１のＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示した。これらの２７個のサンプルのうち、５９．３％（１６／２７）が両方の試験により陽性であり、１１．１％（３／２７）がＰＣＲ試験により陽性であるにすぎず、１８．５％（５／２７）がリアルタイムＮＡＳＢＡ試験により陽性であるにすぎなかった。ＨＰＶ３３の場合、合計で１８個のサンプルが、ＰＣＲまたはＰｒｅＴｅｃｔ ＨＰＶ−ＰｒｏｏｆｅｒのいずれかによりＨＰＶのＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示し、５５．６％（１０／１８）のサンプルが両方の試験により陽性であると試験された。１６．７％（３／１８）がＰＣＲにより陽性であるにすぎず、２２．２％（４／１８）がリアルタイムＮＡＳＢＡにより陽性であるにすぎなかった。

考察
リアルタイムＮＡＳＢＡの感度は、一般に、ＰＣＲの感度よりも良好であった。すべてのマーカーに対するリアルタイムＮＡＳＢＡの感度は１個〜１０^２個の細胞の間であった。これは、１０^２〜１０^４の感度範囲を有するＰＣＲ反応の場合よりもかなり良好である。予想されるように、特異的なプライマーおよびプローブの感度は、ユニバーサルプライマーおよびプローブの感度よりも良好であった。リアルタイムＮＡＳＢＡは、リアルタイム多重ＮＡＳＢＡとまさに同程度の感度、またはそれよりも高感度であった。

Ｕ１Ａ（ヒトのハウスキーピング遺伝子）に指向するリアルタイムＮＡＳＢＡ用のプライマーおよび分子ビーコンプローブが、サンプル材料中のＲＮＡがインタクトであることを確保するためにリアルタイムＮＡＳＢＡ反応におけるサンプル材料の性能コントロールとして使用された。この反応からの陽性シグナルが、リアルタイムＮＡＳＢＡ反応の有効性評価のために必要であった。

Ｌ１（ＨＰＶの主要キャプシドタンパク質）に関するユニバーサルリアルタイムＮＡＳＢＡの感度は、Ｌ１に同様に対するユニバーサルＧｐ５＋／６＋でのＰＣＲの場合よりもはるかに良好であり、１０^３（１０^２）個のＣａＳｋｉ細胞と比較して、１０細胞の感度を有した。これらの２つのプライマーセット（ＰＣＲおよびＮＡＳＢＡ）は、異なるＨＰＶ型の保存されたＬ１遺伝子の同じ領域にその標的を有する。感度の違いは、通常、細胞あたり１コピーの各遺伝子が存在し、一方で、ｍＲＮＡのコピー数は数百であり得るという事実のためであると考えられる。リアルタイムＮＡＳＢＡ用のＬ１プライマーでは、Ｇｐ５＋／６＋のＰＣＲプライマーにより検出されるようなＳｉＨａ細胞またはＨｅＬａ細胞が検出されなかった。このことは、Ｌ１の発現がこれらの細胞株では存在しないことを示している。Ｇｐ５＋／６＋のＰＣＲプライマーでは、１０^４個のＳｉＨａ細胞またはＨｅＬａ細胞が検出された。各細胞におけるＨＰＶコピー体の量を考慮すると、ＣａＳｋｉ細胞が、ＳｉＨａおよびＨｅＬａから得られる細胞量の１／１０で検出されたことが理解される。これは、ＣａＳｋｉ細胞は、組み込みおよびエピソームの両方で、細胞あたり６０コピー〜６００コピーのＨＰＶを有し、一方、ＳｉＨａ細胞は、細胞あたり１コピー〜２コピーのＨＰＶを組み込まれて有し、ＨｅＬａ細胞は、細胞あたり１０コピー〜５０コピーのＨＰＶを組み込まれて有するからである。Ｌ１プライマーセットでは、ＨＰＶの組み込み形態およびエピソーム形態の両方を有するＣａＳｋｉ細胞のみが検出され、ＨＰＶの組み込み形態のみを有するＳｉＨａ細胞またはＨｅＬａ細胞は検出されなかった。このことは、Ｌ１遺伝子はＨＰＶ感染のエピソーム状態で発現するだけであることを示していると考えられ、従って、Ｌ１は、ＨＰＶ感染の組み込みおよび持続に対する有益なマーカーであり得る。

ＨＰＶ型特異的なＮＡＳＢＡプライマーは、Ｅ２遺伝子産物が存在しないために癌細胞において多量に発現する全長のＥ６／Ｅ７転写物に指向している。リアルタイムＮＡＳＢＡ用の１６型特異的なプライマーにより、１０^３（１０^２）個のＳｉＨａ細胞を検出したＨＰＶ１６のＰＣＲプライマーと比較した場合、１０（１）個のＳｉＨａ細胞および１０（１）個のＣａＳｋｉ細胞が検出された。このことに対する説明は、各細胞株におけるＨＰＶコピー体の量が異なることであると考えられる。ＣａＳｋｉ細胞はＨＰＶの組み込み形態およびエピソーム形態の両方を有し、一方、ＳｉＨａ細胞はＨＰＶの組み込み形態のみを有する。これは、Ｅ６／Ｅ７遺伝子からのｍＲＮＡの発現が大きいためであると考えられる。ＣａＳＫｉ細胞を検出する場合、ＮＡＳＢＡ用のＨＰＶ１６プライマーに対する検出限界は、ＨＰＶ１６のＰＣＲプライマーについて０．１個のＣａＳｋｉ細胞と比較して、１０（１）個のＣａＳｋｉ細胞であった。このことは奇妙ではあるが、ＣａＳｋｉ細胞は６０コピー〜６００コピーのＨＰＶ１６ ＤＮＡを含有し、その結果、６コピー〜６０コピーのＨＰＶ１６ ＤＮＡを有する０．１個のＣａＳｋｉ細胞を検出することが可能であるという説明が考えられる。リアルタイムＮＡＳＢＡの感度が、ＰＣＲと比較して、より低いことは、ＣａＳｋｉ細胞におけるＥ６／Ｅ７の発現が中程度／低いことを示し得る。不安定なｍＲＮＡの分解もまた１つの説明であると考えられる。ＣａＳｋｉ細胞におけるＨＰＶコピー体の量は、ＳｉＨａ細胞における量よりもおよそ６０倍〜６００倍であり得る。このことは、ＣａＳｋｉ細胞の検出の方がより高感度であることによって示される。

型特異的なＨＰＶ１８用ＰＣＲプライマーにより、１０^２個のＨｅＬａ細胞が検出された。これは、ＨＰＶのコンセンサスなＧｐ５＋／６＋のプライマーよりも１００倍良好な大きさであり、特異的なプライマーは、一般に、コンセンサスなプライマーよりも高感度であることを述べている。型特異的なＨＰＶ１８用ＮＡＳＢＡプライマーの感度は１（０．１）個のＨｅＬａ細胞であり、このことは、ＨｅＬａ細胞におけるＥ６／Ｅ７の発現が大きいことを示している。

Ｕ１Ａ用ＮＡＳＢＡプライマーの感度は１０個のＳｉＨａまたはＣａＳｋｉであった。Ｕ１Ａプライマーセットに対する標的は、どのヒト細胞でも発現しているヒトハウスキーピング遺伝子である。

ＰＣＲおよびＮＡＳＢＡの感度は、プライマーセット毎に、そしてサンプル材料毎に変化し、一般に、コンセンサスなプライマーセットにおける塩基対ミスマッチのために、型特異的なプライマーの方がコンセンサスなプライマーよりも高感度である。ＰＣＲ反応におけるプライマーに対するアニーリング温度は最適化することができ、これにより、プライマーについて最適な反応条件が得られる。ＰＣＲにおけるアニーリング温度とは対照的に、ＮＡＳＢＡプライマーに対するアニーリング温度は４１℃で固定されなければならない。このように温度柔軟性がないことにより、ＮＡＳＢＡプライマーは、感度および特異性がＰＣＲプライマーよりも低くなり得る。

ＰＣＲは二本鎖ＤＮＡを増幅し、標的は、通常、細胞あたり１コピーとして存在し、このため、ＰＣＲはサンプル材料中の細胞数の影響を受けやすい。ＮＡＳＢＡ反応に対する標的はＲＮＡであり、ｍＲＮＡは、遺伝子の発現に依存して、細胞あたり複数コピーとして存在し得る。非常に発現している遺伝子を選ぶことによって、ｍＲＮＡコピー数が細胞あたり数百になることがあり、従って、検出がより容易になり得る。

ｄｓＤＮＡは細胞内では比較的安定であり、長期間にわたってインタクト（無傷）のままである。ｄｓＤＮＡとは対照的に、ｍＲＮＡは一般にあまり安定ではなく、ｍＲＮＡの分解が、細胞に依存して迅速である。溶解緩衝液ではＤＮａｓｅ活性またはＲＮａｓｅ活性が全く検出されず、従って、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡはともに安定であるはずである。自己触媒的な活性により、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が分解されることがある。子宮頸部から得られたＤＮＡ／ＲＮＡは、溶解緩衝液に保存されたとき、１５℃〜３０℃で２４時間、２℃〜８℃で７日間、または長期間の保存については−７０℃でインタクトのままであるはずである。

リアルタイムＮＡＳＢＡ反応における１つの制限が分子ビーコンプローブの濃度である。生成物の量は分子ビーコンプローブの濃度を超え、従って、その量が検出されない。これは、分子ビーコンプローブ濃度が大きいことにより、反応混合物がより複雑になり、増幅反応が阻害されるからである。ヌクレオチドもまた、ＰＣＲ反応およびＮＡＳＢＡ反応の両方で、増幅生成物の最終的な量に対する制限になることがある。増幅生成物の最終的な濃度は、生成物の量および反応混合物の複雑性のために、それ自体、更なる増幅を阻害し得る。分子ビーコンの存在下でのＮＡＳＢＡ反応のとき、プローブは、テンプレートにハイブリダイゼーションすることによって増幅と競合し得る。そのため、テンプレートがその次のＲＮＡ合成のために利用できなくなる。このように、逆転写工程および更にはＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成のための基質としてのＲＮＡが減少する。この競合は、分子ビーコンの量が低い場合には著しくなく、また、分子ビーコンの量が大きい場合には、この阻害は、投入ＲＮＡのコピー数がより大きいことにより克服され得る。

投入ＲＮＡの量と時間対陽性シグナルとの間における線形の関係が、種々のＨＰＶ細胞株の１０倍連続希釈物で調べられた。陽性シグナルが投入ＲＮＡの量および時間に依存することが明瞭に示された。多重反応では、陽性シグナルを示すために、単一反応よりも多くの時間が必要であった。これは、多重反応容器でのより複雑な混合物における競合のためであると考えられ、そしてまた、多重反応では、プライマーおよびプローブの濃度が異なり、かつ低くなるという事実のためであると考えられる。標的ＲＮＡの量と時間対陽性シグナルとの間における関係により、内部ＲＮＡ標準をそれぞれの反応溶液で用いたリアルタイム多重定量的増幅反応が本発明者らにもたらされた。

リアルタイムＮＡＳＢＡ：単一対多重。リアルタイムＮＡＳＢＡは、一般に、リアルタイム多重ＮＡＳＢＡよりも高感度であった。これは、多重反応におけるプライマーとプローブとの間での競合のために予想される通りであった。プライマーおよび分子ビーコンプローブの最終濃度が多重反応では最適化され、その結果、プライマーおよびプローブのセットの少なくとも１つについては、濃度が単一反応での場合よりも低かった。このことから、プライマーの濃度がより低い場合、反応は感度が小さくなり、または、少なくとも、反応が迅速に生じなくなるということになる。増幅反応の指数関数状態に達するために、より長い時間がかかり、従って、生成物を検出するために、より長い時間がかかる。プライマーの濃度は、ＮＡＳＢＡ反応における生成物の最終的な濃度に対する制限にはならない。これは、プライマーから生じた二本鎖ＤＮＡが、引き続き、ＲＮＡポリメラーゼに対するテンプレートとしてループにおいて何度も作用するからである。多重リアルタイムＮＡＳＢＡの感度は、単一リアルタイムＮＡＳＢＡと比較した場合、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８については同じであったが、Ｌ１に対する感度は、単一反応における１０（１）の検出限界から、多重反応における１０^３（１０^２）個のＣａＳｋｉ細胞に劇的に低下した。Ｕ１Ａ用のＮＡＳＢＡプライマーの場合、感度は１０（１）個のＳｉＨａ細胞から１０^２（１０）個のＳｉＨａ細胞に低下し、一方、検出限界は、ＣａＳｋｉ細胞については依然として同じままであった。検出限界のこの低下は、多重反応におけるプライマーおよび分子ビーコンプローブのより複雑な競合のためであり得る。プライマーおよび分子ビーコンプローブの最終的な濃度は最良でないことがあり、そして、多重反応における種々のプライマーおよび分子ビーコンプローブが互いに妨害することがある。Ｕ１Ａ用のＮＡＳＢＡプライマーでは、１個のＨｅＬａ細胞が検出された。同じ検出レベルがすべての細胞株において予想され得るが、ＨｅＬａ細胞の感度はＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞の検出レベルの１／１０であった。これらの細胞株は癌細胞であり、Ｕ１Ａの発現が異なるように細胞に対して異なる影響を有し得る。違いはまた、細胞を集めているときの計数誤差のために、各反応における細胞の量が異なるためであり得る。

リアルタイムＮＡＳＢＡは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３の間での交差反応性、あるいは、ＨＰＶ６／１１、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８またはＨＰＶ Ｘとの交差反応性を示さなかった。

ＰＣＲ反応の特異性はリアルタイムＮＡＳＢＡ反応の特異性よりも良好であり得る。これは、ＮＡＳＢＡ反応が４１℃での等温反応であり、プライマーのアニーリング温度を変化させることが全くできないからである。プライマーは、基本的には、ＰＣＲプライマーの場合と同じ様式で設計される。ＰＣＲ反応では、ＮＡＳＢＡ反応とは対照的に、アニーリング温度を変化させることができ、従って、２つのプライマーについて最適であるアニーリング温度を選ぶことができる。これにより、プライマーのアニーリングがより特異的になる。ＰＣＲの結果は、ゲル電気泳動を用いて可視化された。しかし、リアルタイムＮＡＳＢＡ反応における分子ビーコンプローブは、ＰＣＲと比較した場合、更なるパラメーターであり、従って、より良好な特異性を全体的なＮＡＳＢＡ反応にもたらし得る。ＤＮＡ配列上の２つの異なる領域をプライマーアニーリングのために見出すこともまた、より容易である。これは、ＰＣＲ生成物の長さの柔軟度が、２５０ｂｐ未満が望ましいＮＡＳＢＡ生成物に対する場合よりもはるかに大きいからである。異なるＨＰＶ型の間で保存されていない特徴的な領域を選ぶことが、ＮＡＳＢＡ反応の特異性のためには重要である。数個の塩基対ミスマッチは標的の増幅またはハイブリダイゼーションを依然としてもたらし得る。

ユニバーサルなＬ１用ＮＡＳＢＡプライマーにより、ＳｉＨａまたはＨｅＬａ（ともに組み込み型）ではなく、ＣａＳｋｉ細胞（組み込み状態またはエピソーム状態）が検出されることは、組み込まれたＨＰＶがＬ１の発現を何ら示さず、一方、エピソーム状態にあるＨＰＶがＬ１の発現を有し得ることを示し得る。

まとめると、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型および３３型について、これらのＨＰＶ型の発癌性Ｅ６／Ｅ７発現を正確に同定することができる確認アッセイが開発された。このアッセイではまた、主要キャプシドタンパク質Ｌ１の発現を同定することができる。

実施例３ １９０名の患者における更なる臨床研究
患者／臨床サンプル
１９９９年〜２００１年の期間にＣＩＮの処置のためにＯｓｔｆｏｌｄ中央病院に入院した１９０名の女性から得られた生検試料。この研究に含まれる１９０名の女性の平均年齢は３７．４歳であった（２２歳〜７４歳の範囲）。生検試料は採取後直ちに−８０℃で凍結された。

サンプルの細胞学的検査
日常的な細胞学報告が、細胞学的知見を記録するために使用された。スライド標本を再評価することは試みられなかった。スライド標本のそれぞれが、入院、膣鏡検査および生検のための根拠であるＣＩＮ ＩＩ〜ＩＩＩの状態（すなわち、高悪性度の形成異常またはＨＳＩＬ）を示していた。

サンプルの組織学的検査
生検試料（この場合、生検試料１と呼ばれる）が、高悪性度の細胞学報告の後で採取された。高悪性度の病変（ＣＩＮ ＩＩまたはＩＩＩ）が確認された場合、その患者は、再度、今回は膣鏡誘導による円錐切除術のために入院させられた。円錐切除術の前に、しかし、局所麻酔が施された後、第２の生検試料（生検試料２）が、全体的な所見から判断して、形成異常が局在化している可能性が最も大きい部領域から採取された。この生検試料（２×２ｍｍ）は−８０℃の冷凍庫で２分以内に凍結された。

生検試料２は、凍結されるときに２つに分けられ、半分がＤＮＡ／ＲＮＡ抽出のために使用された。残る半分は、組織病理学的検査のために、１０％緩衝化ホルムアルデヒドで固定され、処理された。いくつかの病変部は、関連する表面上皮を示すために、パラフィンブロックに正しく配向させられず、再配向または連続切片化しなければならなかった。従って、正確に同じ組織が抽出および組織病理学的評価のために使用されたことを保証することができない。円錐試料は、最終的には、その場の病理学者によって評価されたが、病理学者は、すべての場合に形成異常の存在を確認することができた。円錐試料は、最初の生検試料の場合と必ずしも同じ悪性度ではなく、多くの場合、生検試料２の場合と同じではなかった。

核酸の抽出
核酸は、既に記載したように自動化Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ抽出器を使用して単離された（Ｂｏｏｍ等、１９９０）。それぞれの生検試料は２つに分けられ、１つは組織学的検査のためであり、残る半分はＲＮＡ分析のためである。ＲＮＡ分析のための材料は、ドライアイス（−８０℃）上で保たれながら、より小さく分割され、１ｍｌの溶解緩衝液（上記）に入れられ、その後、使い捨て乳棒を使用して２０秒間のホモジネート化が行われた。１００ｍｌのサンプルが溶解緩衝液で更に１０倍希釈され、その後、１００ｍｌがＤＮＡ／ＲＮＡのために抽出された。抽出されたＤＮＡ／ＲＮＡは約４０ｍｌの溶出緩衝液（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）により溶出され、−７０℃で保存された。

この研究で使用されたすべての分子ビーコンプローブでは、蛍光団ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）が構造の５’端で用いられる。これは、ユニバーサルな消光剤４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）に３’端で結合した可変的なステム−ループ配列に結合された。これらのプローブはＥｕｒｏｇｅｎｅｔｅｃ（ベルギー）によって作製された。反応で使用されたＭＢの最終濃度は２．５ｍＭであった。リアルタイムＮＡＳＢＡの場合、使用者により規定されるＲＮＡ増幅アッセイの開発のために意図されたＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ベーシックキット（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｃｋｎｉｋａ、オランダ）が使用された。ＮＡＳＢＡ増幅は２０μｌの体積で行われた。プライマーセットおよびプローブは、危険性の高いＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３に対する全長のＥ６／Ｅ７ｍＲＮＡに指向した。性能コントロールとして、核酸の分解による偽陰性の結果を避けるために、本発明者らは、ヒトＵ１核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）特異的なＡタンパク質（Ｕ１Ａ ｍＲＮＡ）に指向するプライマーセットおよびプローブを使用した（Ｎｅｌｉｓｓｅｎ等、１９９１）。すべてのサンプルは別の装置において二連で処理された（蛍光および吸光度を測定するためのマイクロプレートリーダー、Ｂｉｏ−ｔｅｋ ＦＬ−６００ＦＡ、ＭＷＧ製）。ＣａＳｋｉ／ＳｉＨａ細胞またはＨｅＬａ細胞から単離されたｍＲＮＡが、ＨＰＶ１６転写物およびＨＰＶ１８転写物に対する陽性コントロールとしてそれぞれ役立った。陰性コントロール（これは、７反応毎に含められた）は、ｍＲＮＡを除くすべての試薬を含有する反応液からなった。

ＨＰＶのＤＮＡ分析；ポリメラーゼ連鎖反応
ＮＡＳＢＡ反応で使用されたのと同じ抽出物および量がＰＣＲのために使用された。Ｌ１コンセンサスプライマーのＧｐ５＋／６＋が、ＨＰＶのＤＮＡを含有するすべてのサンプルを検出するために使用された。ＰＣＲ増幅は、上に記載されるように行われた。最初のＤＮＡ変性が９４℃で２分間行われ、その後、４０サイクルのＰＣＲが行われた：９４℃で１分間の変性、４０℃で２分間のアニーリング、７２℃で１．５分間の伸張、その後、７２℃で４分間の最後の伸張。ＨＰＶの型決定が、上に記載されるように、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３（ＨＰＶ６／１１、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８）に対するＰＣＲ用の型特異的プライマーを使用することによって行われた。

結果
最初に、１９０名の患者は、生検が、ＣＩＮ Ｉ、ＣＩＮ ＩＩまたはＣＩＮ ＩＩＩの診断が細胞学によってなされた後に行われた。高悪性度の病変が組織学的検査によって確認され、１５０サンプルがＣＩＮ ＩＩＩとして診断された（７８．９％）。円錐切除術の前に採取された生検試料２がＲＮＡ分析のために使用された。しかしながら、この生検試料の組織学的検査では、最初の１５０サンプルのうちの５３個のみがＣＩＮ ＩＩＩとして診断されただけであった［５４個は診断を与えず、２４個がＣＩＮ ＩＩとして診断され、１８個がＣＩＮ Ｉとして診断され、４個がＨＰＶ／コンジロームとして診断された］。ＣＩＮ ＩＩサンプルの数は１６個（８．４％）から３０個（１５．８％）に増大した［組織学Ｉにより、２４個がＣＩＮ ＩＩＩとして診断され、４個がＣＩＮ ＩＩとして診断され、１個が癌腫として診断され、１個がＣＩＮ Ｉとして診断された。組織学Ｉに由来する１２例のＣＩＮ ＩＩには、組織学ＩＩではより低い診断が与えられた］。ＣＩＮ Ｉの程度は６サンプル（３．２％）から３２サンプル（１６．８％）に増大した。２つの扁平上皮癌が、組織学ＩＩでは、ＣＩＮ ＩＩＩとして診断され、腺癌がＣＩＮ ＩＩとして診断された。７１サンプル（３８．４％）において、高悪性度の病変が検出されなかった。

ＨＰＶの発癌性ＲＮＡが１９０名の患者のうちの６９名（３６％）で検出された。組織学ＩＩにおいてＣＩＮ ＩＩＩとして診断された５３サンプル（２８％）のうち、４０例（７６％）が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１またはＨＰＶ３３の発癌性発現を示していることが見出された。更に、本発明者らは、発癌性の発現を、ＣＩＮ ＩＩの３０例のうちの９例（３０％）で、ＣＩＮ Ｉの３２例のうちの４例（１３％）で、細胞異常を示していない７１例のうちの１４例（２０％）で、そしてＨＰＶ／コンジロームとして診断された４サンプルのうちの２個（５０％）で見出した。

ＨＰＶ１６のＲＮＡが１９０名の患者のうちの４２名で見出され、ＨＰＶ１８が７名（３．７％）で見出され、ＨＰＶ３１が１５名（７．９％）で見出され、ＨＰＶ３３が８名（４．２％）で見出された。１名の患者は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８による混合感染を有し、１名が、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ３１による混合感染を有していた。

主要キャプシドタンパク質をコードするＬ１遺伝子に指向するコンセンサスなＧｐ５＋／Ｇｐ６＋のプライマーを使用したとき、ＰＣＲにより、ＨＰＶが１９０個の子宮頸部生検試料のうちの８１個（４３％）で検出された。２回目の組織学的検査で診断が下された１１９例（１１５例がＣＩＮとして診断され、４例がＨＰＶ／コンジロームとして診断された）のうち、６３例がＨＰＶのＤＮＡを含有することが見出された。検出された更に１８例は組織学的診断を何ら与えなかった。８１例のうちの２０例はＮＡＳＢＡによって検出されなかった。これらのうちの７例には、ＣＩＮ ＩＩＩの診断が与えられ、２例はＣＩＮ ＩＩとして診断され、４例はＣＩＮ Ｉとして診断され、７例には、診断が与えられなかった。

型特異的なＰＣＲにより、ＨＰＶを含有する８５例が検出された。６６例がＨＰＶ１６を有し、１０例がＨＰＶ１８を有し、１４例がＨＰＶ３１を有し、７例がＨＰＶ３３を有していた。１２例が多重感染を有していた。３例が、ＨＰＶ１６＋ＨＰＶ１８による感染を有し、４例が、ＨＰＶ１６＋ＨＰＶ３３による感染を有し、５例が、ＨＰＶ１６＋ＨＰＶ３１による感染を有していた。２０例には診断がなかった。

実施例４
細胞学および組織学と比較されるＰｒｅＴｅｃｔ ＨＰＶ−ＰｒｏｏｆｅｒおよびＰＣＲによって検出されるＨＰＶ
正常なサンプルおよびＡＳＣＵＳサンプル（境界部塗抹標本を含む）が細胞学によって決定された。すべてのサンプルが、コンセンサスＰＣＲおよびＰｒｅＴｅｃｔ ＨＰＶ−Ｐｒｏｏｆｅｒを用いて調べられた。しかし、コンセンサス陽性サンプルのみがＰＣＲによって型決定された。ＣＩＮ３サンプルおよび癌サンプルが組織学によって決定され、サンプルのすべてが３つの方法のすべてで調べられた。結果が図６に示される。細胞学または組織学と比較されるリアルタイム多重ＮＡＳＢＡとＰＣＲとの間における一致が下記の表１９に示される。

実施例５
本発明は、ＨＰＶのＥ６遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写物を検出するためのキットを提供する。このキットは、下記のプライマー対の１つ以上、２つ以上、そして好ましくはすべてと、付随する同定プローブとを含む。
HPV 16:HPV16.txt 7905 b.p

HPV16P2:
p2:116 (20) GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAA
16 p1 (no7)
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG ATT CCC ATC TCT ATA TAC TA (51baser)

HPV16PO2:
po:230 (20) TATGACTTTGCTTTTCGGGA
H16e6702po

HPV 18:HPV18.txt 7857 b.p

HPV18P2:
p2:698 (22) GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAAACGATGAAATAGATGGAG
H18e6702p2
HPV18P4:
p1:817 (20) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTCGTCTGCTGAGCTTTCT
H18e6703p1 (Multiplex)

HPV18PO2:
po:752 (21) GAACCACAACGTCACACAATG
H18e6702po


HPV 31:HPV31.txt 7912 b.p

HPV31P3:
p2:617 (20) GATGCAAGGTCGCATATGAGACTGACCTCCACTGTTATGA
H31e6703p2
p1:766 (20) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTATCTACTTGTGTGCTCTGT
H31e6703p1

HPV31PO4:
po:686 (26) GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA
H31e6704po


HPV 33:HPV33.txt 7909 b.p

HPV33P1:
p2:618 (22) GATGCAAGGTCGCATATGAGTATCCTGAACCAACTGACCTAT
H33e6701p2
p1:763 (19) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGACACATAAACGAACTG
H33e6701p1

HPV33PO3:
po:699 (23) GGACAAGCACAACCAGCCACAGC
H33e6703po

上に示されたプローブの代替として、キットは、下記の分子ビーコンプローブの１つ以上を場合により含むことができる：
分子ビーコンプローブ：
H16e6702mb2-FAM ccagctTATGACTTTGCTTTTCGGGAagctgg
H18e6702mb1-TxR cgcatgGAACCACAACGTCACACAATGcatgcg
H31e6704mb2-FAM ccgtcgGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAcgacgg
H33e6703mb1-FAM ccaagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgcttgg

好ましくは、本発明のキットはまた、下記のプライマー対およびプローブを含む：
HPV45: HPV45.txt 7858 bp (X74479)

HPV45P1:
p2:430 (21): GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAA
H45e6701p2
p1:527 (22): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA
H45e6701p1

HPV45PO1:
po:500 (20): GTACCGAGGGCAGTGTAATA
H45e6701po

上記のＨＰＶ４５プローブは下記のＨＰＶ分子ビーコンプローブによって置き換えることができる：
H45e6701mb1 cgatcgGTACCGAGGGCAGTGTAATAcgatcg

更に、キットは、キットを使用する地理学的領域に依存して、下記のプライマー対の１つ以上と、付随する同定プローブとを含むことができる：
HPV52: HPV52.txt 7942 bp (X74481)

HPV52P1:
p2:144 (22): GATGCAAGGTCGCATATGAGTTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT
H52e6701p2
p1:358 (18): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCCTCTCTTCTAATGTTT
H52e6701p1

HPV52PO1:
Po:296 (20): GTGCCTACGCTTTTTATCTA
H52e6701po


HPV58 HPV58.txt 7824 bp (D90400)

HPV58P2:
p2:173 (18): GATGCAAGGTCGCATATGAGTCTGTGCATGAAATCGAA
H58e6702p2
p1:291 (18): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAGCACACTTTACATACTG
H58e6702p1

HPV58PO2:
po:218 (22): TTGCAGCGATCTGAGGTATATG
H58e6702po

HPV51 HPV51.txt 7808 bp (M62877)

HPV51PA/P:
p2:655 (23): GATGCAAGGTCGCATATGAG AGA GGA GGA GGA TGA AGT AGA TA
H51e6702p2
p1:807 (20): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG GCC CAT TAA CAT CTG CTGTA H51e6701p1

HPV51POA:
po:771 (24): TGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACA
H51e67o2po

上に示されたプローブは、下記の分子ビーコンプローブによってキットにおいて置き換えることができる：
H52e6701mb1 cgatcgGTGCCTACGCTTTTTATCTAcgatcg
H58e6702mb1 ccgtcgTTGCAGCGATCTGAGGTATATGcgacgg
H51e6702mb1 cgatcgTGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACAcgatcg

図１Ａは、患者サンプルに対してＨＰＶ１６用のＦＡＭ分子ビーコンを使用する単一反応リアルタイムＮＡＳＢＡアッセイの結果を示し、一方、図１Ｂは、図１ＡのＦＡＭ分子ビーコンと、ＵＩＡのためのテキサスレッド標識された分子ビーコンとを使用する多重化リアルタイムＮＡＳＢＡアッセイを示す。 図２Ａは、患者サンプルに対してＨＰＶ１８用のＦＡＭ分子ビーコンを用いた単一反応リアルタイムＮＡＳＢＡを示し、一方、図２Ｂは、ＨＰＢ１８用のテキサスレッド標識分子ビーコンと、ＨＰＶ３３用のＦＡＭ標識ビーコンとを用いた多重化形態を示す。 図３Ａは、ＨＰＶ３１のＦＡＭ標識分子ビーコンを用いた単一反応リアルタイムＮＡＳＢＡを示し、一方、図３Ｂは、ＨＰＶ４５のテキサスレッド標識分子ビーコンを含む多重化形態を示す。 図４Ａは、ＨＰＶ３３のＦＡＭ標識分子ビーコンを用いた単一反応リアルタイムＮＡＳＢＡを示し、一方、図４Ｂは、テキサスレッドで標識されたＨＰＶ１８分子ビーコンを含む多重化形態を示す。 図５Ａは、ＨＰＶ４５のＦＡＭ標識分子ビーコンを用いた単一反応リアルタイムＮＡＳＢＡを示し、一方、図５Ｂは、ＨＰＶ４５のテキサスレッド標識分子ビーコンと、ＦＡＭで標識されたＨＰＶ３１分子ビーコンとを含む多重化形態を示す。 ＰｒｅＴｅｃｔ ＨＰＶ−ＰｒｏｏｆｅｒおよびＰＣＲによって検出されるＨＰＶを、細胞学または組織学と比較して示す。

Claims (11)

1. 子宮頸癌を発症する危険性を評価するためにヒト被験者をスクリーニングするインビトロ方法であって、ＨＰＶのＥ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現について被験者をスクリーニングすること、および、Ｅ６ｍＲＮＡの発現に基づいて子宮頸癌の発症について２つの危険性カテゴリーの１つに被験者を分類することを含み、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陽性である個体が、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムを保有するとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について危険性が高いとして分類され、これに対して、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陰性である個体が、組み込まれたＨＰＶまたは改変されたエピソームＨＰＶゲノムを保有しないとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について検出できるほどの危険性がないとして分類される、方法。
2. 子宮頸部における異常な細胞変化を有するヒト被験者を同定するインビトロ方法であって、ＨＰＶのＥ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現について被験者をスクリーニングすることを含み、Ｅ６ｍＲＮＡの発現について陽性である個体が、子宮頸部における異常な細胞変化を有するとして同定される、方法。
3. ヒト被験者が、子宮頸部の細胞においてヒトパピローマウイルスＤＮＡが感染しているとして以前に確認された被験者である、請求項１または２に記載の方法。
4. ヒト被験者が、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ１病変またはコンジロームの診断を以前に受けた被験者である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型または４５型の少なくとも１つに由来するＥ６ｍＲＮＡの発現について陽性である個体が、組み込まれたＨＰＶを保有するとして評価される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 少なくとも１つの癌関連ＨＰＶ型に由来するＥ６ｍＲＮＡを検出することができる技術を使用してＥ６ｍＲＮＡの発現についてスクリーニングすることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型、および４５型に由来するＥ６ｍＲＮＡを検出することができる技術を使用してＥ６ｍＲＮＡの発現についてスクリーニングすることを含む、請求項６に記載の方法。
8. Ｅ６ｍＲＮＡの発現についてのスクリーニングが、ｍＲＮＡの領域を増幅するための増幅反応を増幅反応の生成物のリアルタイム検出とともに使用して行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ｅ６ｍＲＮＡの発現についてのスクリーニングが、リアルタイムＮＡＳＢＡを使用して行われる、請求項８に記載の方法。
10. 少なくとも１つの癌関連ＨＰＶ型が、ＨＰＶの１６型である、請求項６に記載の方法。
11. 少なくとも１つの癌関連ＨＰＶ型が、ＨＰＶの１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型および６８型から選択される、請求項６に記載の方法。