DE3853678T2

DE3853678T2 - Verfahren zum nachweis des karzinogenen menschlichen papillomavirus.

Info

Publication number: DE3853678T2
Application number: DE3853678T
Authority: DE
Inventors: Brian Morris; Brian Nightingale
Original assignee: University of Sydney
Current assignee: POLARTECHNICS Ltd SYDNEY NEUSUEDWALES AU
Priority date: 1987-02-26
Filing date: 1988-02-24
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2008-02-25
Also published as: EP0357611B1; EP0357611A4; JP2000189200A; AU611135B2; US5783412A; US6218104B1; JP2001197894A; JPH02502334A; DE3853678D1; WO1988006634A1; EP0357611A1; AU1393888A; JP3096704B2; ATE121794T1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für den spezifischen Nachweis der DNA von Papillomaviren in klinischen Proben. Der Test ist insbesondere darauf gerichtet, in der kürzestmöglichen Zeit zu unterscheiden, ob Zellen aus der anogenitalen Region Typen von Papillomaviren enthalten, die mit Krebs assoziiert sind, oder ob sie Typen von Papillomaviren enthalten, die im allgemeinen mit gutartigen Läsionen assoziiert sind. Derartige Unterscheidungen sind von großer Bedeutung bei der Diagnose bei Patienten und nachfolgenden Untersuchungen.

Hintergrund

Der Krebs der Cervix ist der häufigste Krebs bei Frauen (ca. 25% aller weiblichen Krebserkrankungen). Darüber hinaus nimmt die Häufigkeit bei jüngeren Frauen zu. In der Tat zeigen etwa 2% der routinemäßigen Cervikalabstriche eine unnormale Zytologie als Anzeichen einer Epidemie. Eine derartige Epidemie tritt in vielen westlichen und Entwicklungsländern häufig auf. Sexuelle Aktivitäten scheinen ein wichtiger prädisponierender Faktor bei der Epidemiologie der Karzinogenese und der präcancerösen Läsionen zu sein. Ein geringes Alter beim Geschlechtsverkehr und eine Vielzahl von sexuellen Partnern sind statistisch mit einem größeren Risiko der Malignität verknüpft (Harris et al., Br. J. Cancer 42: 359-63, 1980). Die Partner sind häufig Männer mit Peniswarzen ("Hochrisiko-Männer"), und ein sehr hoher Anteil (mehr als 90%) von cervikalem Karzinomgewebe enthält nachweisbare DNA-Sequenzen für bekannte Varietäten des menschlichen Papillomavirus (HPV). Dies stützt eine wachsende Anzahl von Indizien, die darauf hinweisen, dar bestimmte HPV-Typen als sexuell übertragener Faktor eine Rolle bei der Entwicklung von squamösen Zellkrebsen der Cervix spielen (zur Hausen et al., Progr. Med. Virol. 30: 170-86, 1984; zur Hausen et al., Progr. Med. Virol. 32: 15-21, 1985; zur Hausen, Cancer 59: 1692-6; Campion et al., Lancet i: 943-6, 1985). Das Auftreten von Cervikalkrebs und präcancerösen Läsionen wird bei jüngeren Frauen immer häufiger. Ohne Behandlung kann dies tödlich sein, wobei die Sterberate etwa 100 pro 1 Million Frauen pro Jahr in westlichen Ländern beträgt. Bei der Entdeckung in einer frühen Phase steht jedoch glücklicherweise eine wirksame Behandlung zur Verfügung, die die tödlichen Konsequenzen vermeidet.
Die sofortige Behandlung und anschließende Nachkontrolle von jungen Frauen mit unnormalen zytologischen Abstrichen, die noch einen Kinderwunsch haben, birgt viele Probleme. Dies wird durch die Ungewißheit über die Deutung von Abstrichen mit Merkmalen einer Papillomavirusinfektion ("Koilocyten") und einer Dysplasie verstärkt. Darüber hinaus hat die gegenwärtige zytologische Testmethode für die Überprüfung auf Cervikalkrebs, der Pap-Abstrich, eine falsch-negative Quote von etwa 20%. Signifikante Anzahlen von dysplastischen Läsionen bilden sich spontan zurück, andere schreiten nicht fort, und nur einige wenige entwickeln sich schnell. Somit kann sich aus einer undefinierten Wolke von morphologischen Abnormalitäten gelegentlich Krebs entwickeln. Gegenwärtig gibt es keinen eindeutigen Weg, um vorherzusagen, ob sich ein Krebs entwikkeln wird, wenn ein Pap-Abstrich unnormal ist. Die klinische Untersuchung von vielen dieser Patientinnen ergab keine warzenartigen Läsionen (Condylomata accuminata) der äußeren Genitalien oder sogar an der Cervix selbst. Es ist vielmehr das schwierige Verfahren der Kolposkopie nach dem Auftragen von 3% Essigsäure erforderlich, was die Anwesenheit von flachen ("nicht-condylomatösen") Warzen (die für das bloße Auge nicht erkennbar sind) zeigt. Dies sind die verdächtigen, prämalignen Läsionen. Die histopathologische Progression der Warzen zu Karzinomen in situ und die Malignität schlechthin sind gut beschrieben worden (z.B. Dyson et al., J. Clin. Path. 37: 126-31, 1984). Ein zunehmendes Problem ist das Auftreten von invasivem Krebs innerhalb von drei Jahren eines negativen Pap-Abstrichs (Berkowitz et al., Gynecol. Oncol. 8: 311, 1979; Holman et al., Med J. Aust. 2: 597, 1981). Während das Auftreten der Replikation von Papillomaviren in cervikalen Condylomen durch den Nachweis von Viruspartikeln oder dem gruppenspezifischen Antigen bestätigt werden kann, wurden jedoch keine Partikel oder Antigene in dem Gewebe von squamösen Zellkarzinomen gefunden.
Im Gegensatz zu der Unsicherheit und Kontroverse, die die Interpretation von auf der Morphologie basierenden Tests umgibt, können die neuen Methoden der Molekularbiologie eingesetzt werden, um solche Probleme zu umgehen und objektivere Informationen zu liefern. Durch die Verwendung der Methoden der Nucleinsäure-Hybridisierung kann die virale DNA direkt und zu einem früheren Zeitpunkt der Infektion identifiziert werden. In der Tat wurden mit diesem Ansatz HPV-Typen sowohl in gutartigen als auch in prämalignen Läsionen gefunden. Gegenwärtig sind etwa 50 Typen des Papillomavirus bei menschlichen Infekten gefunden worden. Unterschiedliche Typen infizieren unterschiedliche Epitelgebiete. Die besonderen HPV-Typen, die häufig den Genitaltrakt infizieren, schliefen diejenigen mit den Nummern 6, 11, 16 und 18 und verschiedene seltenere Typen (31, 33, 35, 39, 43 und 44) ein. HPV6 (de Villiers et al., J. Virol. 40: 932-5, 1981) und HPV11 (Gissmann et al., J. Virol. 44: 393-400, 1982; Gissmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 560-3, 1983; Dartmann et al., Virology 151: 124-30, 1986) sind mit gutartigen Condylomata accuminata assoziiert worden, den klassischen Läsionen des Anal- und Genitaltraktes (Gissmann et al., J. Invest Dermatol. 83: 26s-8s, 1984). Demgegenüber werden HPV16 (Dürst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3812-5, 1983) und HPV18 (Boshart et al., EMBO J. 3: 1151-7, 1984; Cole und Danos, J. Mol. Biol. 193: 599-608, 1987) häufiger in dysplastischen flachen Läsionen der Vulva und der Cervix und in squamösen Karzinomen von Cervix und Penis gefunden (Crum et al., Cancer 49: 468-71, 1982; Campion et al., Lancet i: 943-6, 1985).
Somit können die HPV-Typen, die das anogenitale Gebiet infizieren, folgenden zwei Kategorien zugeordnet werden:
1. "Geringes Risiko": HPV6 und HPV11, wobei die Type 6 die häufigste von allen anogenitalen Typen ist.
2. "Hohes Risiko": HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV43 und HPV44.
Die Häufigkeit des Auftretens der Typen mit höherem Risiko ist in abnehmender Reihenfolge. Somit ist innerhalb der Kategorie mit hohem Risiko HPV16 am häufigsten (45-60%), HPV18 ist das nächst häufigste (20-30%) und die anderen sind seltener, wobei die letzten 4 lediglich vor kurzem entdeckt und im Jahre 1986 beschrieben wurden (Gesamthäufigkeit für die selteneren Typen etwa 15%). Andere seltene Typen werden vermutlich in Zukunft noch entdeckt werden.
Für die Rolle von HPV bei cervikalem Krebs sprechen die folgenden Erkenntnisse:
(I) Die DNA von Hochrisiko-HPV wurde in etwa 90% der cervikalen Adenokarzinome und squamösen Zellkarzinome gefunden (Zachow et al., Nature 300: 771-3, 1982; Gissmann et al., 1984, ibid.).
(II) Die DNA von Hochrisiko-HPV wurde in Metastasen gefunden, die von cervikalen Tumoren herrührten (Lancaster et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 154: 115-9, 1986).
(III) Anstatt in Zellen in der gewöhnlichen episomalen Form aufzutreten, wurde die DNA von Hochrisiko-HPV integriert in die menschliche Genom-DNA gefunden (Schwartz et al., Nature 314: 111-4, 1985; Lehn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5540-4, 1985; Kreider et al., Nature 317 639-41, 1985; Matsukura et al., J. Virol. 58: 979-82, 1986; Schneider-Gadicke und Schwartz, EMBO J. 5: 2285-92, 1986; Di Luca et al., J. Gen. Virol. 67: 583-9, 1986). Es wurde vorgeschlagen, daß eine derartige Integrierung für die maligne Konversion der Zellen erforderlich ist, unterstützt von Nachweisen der Integration auch in Präkarzinom-Gewebe (Shirasawa et al., J. Gen. Virol. 67: 2011-5, 1986).
(IV) Das Integrationsmuster unterbricht oder deletiert gewöhnlich spezifische Regionen der HPV16- oder 18-DNA, läßt jedoch stets die offenen Leseraster (ORF) von E6 und E7 intakt (Pater und Pater, Virology 145: 313-8, 1985), die mit der Expression fortfahren, mindestens in Zellinien, die von Cervikalkarzinomen abgeleitet sind (Smotkin und Wettstein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4680-4, 1986; Androphy et al., EMBO J. 6: 989-92, 1987; Baker et al., J. Virol. 61: 962-71, 1987; Takebe et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 143: 837-44, 1987).
(V) Ein Spleißdonor existiert in dem E6 ORF von HPV16 und 18 (nicht jedoch von HPV6 und 11), der zu der Generierung eines ORF führen kann, welcher bei der Translation einem epidermalen Wachstumsfaktor ähnelt (zur Hausen, Lancet 489-91, 1986).
(VI) Die Integration in cervikale Zellinien (HeLa, CaSki, SiHa, SW756, etc.) erfolgt häufig in der Nähe von Proto-Oncogenen (Dürst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1070-4, 1987; Popescu et al., Cytogenet. Cell Genet. 44: 58-62, 1987; Popescu et al., J. Virol. 51: 1682-5, 1987; Shirasawa et al., J. Gen. Virol. 68: 583-91, 1987).
(VII) Eine derartige Integration ist mit einer gesteigerten Expression von c-myc und c-ras mRNA assoziiert (Dürst et al., 1987, ibid. ; Shirasawa et al., 1987, ibid.). Dies stützt den Vorschlag, daß die cis-Aktivierung von zellulären Oncogenen durch HPV mit der malignen Transformation der Cervikalzellen assoziiert sein kann.
(VIII) Menschliche Fibroblasten und Keratinocyten können durch Transfektion mit HPV16 transformiert werden (Pirisi et al., J. Virol. 61: 1061-6, 1987), ebenso wie NIH 3T3-Zellen (Tsunokawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2200-3, 1986; Ysumoto et al., J. Virol. 57: 572-7, 1986).
(IX) Die Integration kann für zellulär eingreifende Faktoren kodierende Gene unterbrechen; dies kann den normalen Verteidigungsmechanismus der Zellen zerstören, der das unkontrollierte Wachstum und die Transkription des Virus unterdrückt (zur Hausen, Lancet 489-91, 1986).
Während Peniswarzen bei Männern nur sehr selten zu einem Krebs des Penis führen, ist Krebs wahrscheinlicher, wenn die Übertragung auf die Cervix erfolgt. Etwa bei einem Drittel der Patientinnen, die eine histologisch bestätigte HPV-Infektion der Cervix haben, kann erwartet werden, daß sie cervikale intraepitheliale Neoplasien (CIN) innerhalb eines Jahres entwickeln (Nash et al., Obstet. Gynecol. 69: 160-2, 1987). Die Verzögerungszeit zwischen der Infektion und dem Krebs beträgt jedoch häufig 10 bis 30 Jahre. Somit trägt die jeweilige Umgebung der Cervix, zusammen mit anderen Faktoren wie Rauchen (Trevathan et al., J. Am. Med. Ass. 250: 499-504, 1983) zu dem Ausbruch des Krebses bei. Die Schädigung der DNA durch den letzteren zusammen mit der Wirkung von HPV unter Verursachung der zellulären Proliferation kann den Ausbruch der Malignität erklären. Die Behandlung von Frauen mit präcancerösen Läsionen schließt die chirurgische Extirpation des befallenen Gebietes ein. Weiterhin wird von vielen angenommen, daß die Behandlung auch ihre infizierten männlichen Partner einschließen sollte, um die Reinfektion und die Infektion von anderen Frauen durch den Mann zu verhindern.
Da die gegenwärtig für die routinemäßige Untersuchung von Cervikalzellen verwendeten zytologischen Tests (Pap-Abstrich) subjektiv ausgewertet werden und die Identifizierung der speziellen HPV-Type in einer Läsion nicht gestatten, sind wir der Auffassung, daß der spezifischere Ansatz der DNA-DNA- Hybridisierung für den direkten viralen Nachweis in Zukunft routinemäßig verwendet werden wird, um die Zytologie bei der primären Überwachung zu ergänzen oder sogar zu ersetzen.
Bei der klinischen Überprüfung der Patienten ist es wichtig, zwischen solchen Läsionen zu unterscheiden, die die Potentiell karzinogenen (Hochrisiko-) Typen enthalten, und denen, die mit den eher gutartigen (Niedrigrisiko-) Typen assoziiert sind.
Die Auswertung von Patientenproben bezüglich HPV-Infektion ist durch Methoden der Filterhybridisierung erleichtet worden. Derartige Methoden sind verwendet worden, um HPV-DNA in cervikalen Abstrichen nachzuweisen, welche parallel zu Proben für die routinemäßige Zytologie gewonnen wurden (Wagner et al., Obstet. Gynecol. 64: 767-72, 1984; Wickenden et al., Lancet i: 65-7, 1984; Schneider et al., Science 216: 1065-70, 1982). Im Januar 1985 wurde an der Universität von Sydney von Dr. Morris ein Projekt begonnen, um einen direkten Test für die anogenitalen HPV-Typen zu entwickeln, mit besonderer Blickrichtung auf die Abschätzung, ob die Infektion durch einen der Hochrisiko-HPV-Typen oder durch einen der Niedrigrisiko-Typen erfolgt war. Die erste Veröffentlichung, die eine vorläufige Version des Tests beschreibt und die rekombinante virale DNA einschließt, ist von B.R. Henderson, C.H. Thompson, B.R. Rose, Y.E. Cossart und B.J. Morris, "Detection of specific types of human papillomavirus in cervical scrapes, anal scrapes, and anogenital biopsies by DNA hybridization", Journal of Medical Virology 12: 381-93, 1987. Diese Veröffentlichung wurde Anfang 1986 eingereicht. Seitdem ist die Empfindlichkeit der Tests mit rekombinanter DNA um das 100-fache gesteigert worden, und es werden ständig weitere Verbesserungen erreicht. Bis heute sind über 5000 klinische Proben getestet worden. Diese stammen hauptsächlich von S.T.D.-Kliniken in Sydney. Bis jetzt haben die Daten die Durchführbarkeit und Anwendbarkeit des direkten viralen Nachweises für die Bestimmung der Anwesenheit und der Natur von einer HPV-Infektion in Cervikalabstrichen und anderen anogenitalen Proben unter Beweis gestellt. Unsere neueren Veröffentlichungen über diesen Ansatz schliefen die folgenden ein: B.R. Rose, C.H. Thompson, A.M. McDonald, B.R. Henderson, Y.E. Cossart & B.J. Morris, "Cell biology of cultures of anogenital warts", British Journal of Dermatology 116: 311-22, 1987; B.J. Parker, Y.E. Cossart, C.H. Thompson, B.R. Rose & B.R. Henderson, "The clinical management and laboratory assessment of anal warts", Medical Journal of Australia 147: 59-63, 1987; P.M. Katelaris, Y.E. Cossart, B.R. Rose, B. Nightingale, E. Sorich, C.H. Thompson, P.B. Dallas & B.J. Morris, "Human papillomavirus: The untreated male reservoir", Journal of Urology, im Druck, 1988. Zahlreiche weitere Arbeiten müssen noch publiziert werden.
Bezüglich der Hauptstrang-DNA-Sequenzen der häufigsten anogenitalen HPV-Typen wird auf die folgenden Publikationen verwiesen:
Die Sequenz von HPV6b ist veröffentlicht in Schwarz et al., EMBO J. 2: 2361-8, 1983.
Die Sequenz von HPVII ist veröffentlicht in Dartmann et al., Virology 151: 124-30, 1986.
Die Sequenz von HPV16 ist veröffentlicht in Seedorf et al., Virology 145: 181-5, 1985.
Die Sequenz von HPV18 ist veröffentlicht in Matlashewski et al., J. Gen. Virol. 67: 1909-16, 1986.
Die Sequenz von HPV33 ist veröffentlicht in Cole und Streeck, J. Virol. 58: 991-5, 1986.

Prinzip des Nachweises von spezifischer viraler DNA durch Hybridisierung

DNA ist doppelsträngig. Jeder DNA-Strang ist ein komplementäres "Spiegelbild" des anderen. Die DNA-Stränge werden durch Wasserstoffbrücken zusammengehalten. Unsere Methoden für den Nachweis von viraler DNA basieren auf der Fähigkeit der Einzelsequenz der Nucleotide im DNA-Strang, mit einer zu dieser kompleinentären Sequenz zu binden ("Hybridisieren"). Somit ist es mit einer DNA-Sequenz für die gesamte oder einen Einzelteil eines Typs eines Papillomavirus möglich, diese als "Zielsonde" zu verwenden, um das Virus in einer Probe von Cervikalzellen von einer Patientin nachzuweisen. Die als Probe zu verwendende DNA ist entweder mit einem radioaktiven Isotop oder einem nicht-radioaktiven Marker markiert, so daß sie später nachgewiesen werden kann. Um die Empfindlichkeit des Tests zu vergrößern, haben wir eine Methode zur Vermehrung der HPV-DNA-Sequenzen in der Probe entwickelt.

Hintergrund der verwendeten Methode zur Vermehrung der viralen DNA

Um die Empfindlichkeit der Nachweismethode zu vergrößern, haben wir ein Verfahren verwendet, das ursprünglich für die Diagnose von genetischen Erkrankungen beschrieben wurde. Es ist als "Polymerase-Kettenreaktion" (PCR) bekannt. Es wird verwendet, um enzymatisch eine spezifische DNA-Sequenz zu vermehren, bevor sie mit einer synthetischen Oligonucleotidprobe hybridisiert wird. Ein typischer Vermehrungsfaktor beträgt etwa 250.000 Kopien, beginnend mit einer Kopie von viraler DNA. Eine derartige Methode steigert nicht nur die Empfindlichkeit, sondern sie erfüllt auch Anforderungen bezüglich der Spezifizität, Geschwindigkeit, Einfachheit und Anwendbarkeit auf nicht-radioaktive Nachweisverfahren, die von einer flexibleren Testmethode erwartet werden. Sie kann auch mit einer Kit-Anordnung durchgeführt und automatisiert werden; wir haben beides erreicht. Die PCR-Methode wird in Veröffentlichungen beschrieben, die mit pränatalen Diagnosetests für spezifische genetische Anomalien befaßt sind (Sakii et al., Science 230: 1350-4, 1985; Sakii et al., Nature 324: 163-6, 1986; Scharf et al., Science 233: 1076-8, 1986). Die PCR-Methode ist Gegenstand der folgenden Schutzrechte: Australische Patentanmeldung AU-A-55322/86, Cetus Corp., "Verfahren zur Vermehrung von Nucleinsäuresequenzen", US-Prioritätsdatum 28.03.85; australische Patentanmeldung AU-A-55323/86, "Vermehrung und Nachweis von Target-Nucleinsäuren durch Hybridisierungssonden", US-Prioritätsdatum 28.03.85.
Kurz gesagt wird ein kleiner, einzelner Bereich der HPV-DNA- Sequenz, etwa 100 bis 200 bp lang, mittels der PCR-Methode vermehrt. In den Beispielen wurde eine Region in der E6-Region ausgewählt. Es kann jedoch jede andere Region der viralen DNA ausgewählt werden. Der PCR-Schritt erfordert zwei etwa 20-mere Oligonucleotid-Primer, die die zu vermehrende Region flankieren. Ein Primer ist komplementär zu dem (+)-Strang einer Region der DNA, und der andere ist komplementär zu dem (-)-Strang. Das Anheften des Primers an den (+)-Strang der denaturierten, viralen DNA der Probe, gefolgt von einer Verlängerung mit z.B. dem Klenow-Fragment von Escherichia coli-DNA-Polymerase oder anderen Enzymen, die eine ähnliche Reaktion ausführen, und Deoxynucleotid-triphosphaten führt zu der Synthese eines (-)-Strangfragmentes, das eine "Target"-Sequenz enthält, die zwischen den Hybridisierungsorten des Primers angeordnet ist. Gleichzeitig tritt eine ähnliche Reaktion mit dem anderen Primer auf, wobei ein neuer (+)-Strang erzeugt wird. Das Prinzip der Methode ist in dem folgenden Diagramm gezeigt. Klenow DNA polymerase Primer Targetsonde
Da diese neu synthetisierten DNA-Stränge selbst Template für die PCR-Primer darstellen, führen wiederholte Zyklen der Denaturierung, Primer-Annealing und Extension zu der exponentiellen Ansammlung der etwa 100-200 bp großen Region, die von den Primern definiert wird. Anschließend wird die spezifische DNA bestimmt. Hierfür sind verschiedene Mittel möglich. Die Menge der gebildeten DNA kann ausreichend sein, um nach der Elektrophorese an einem Gel und Anfärben direkt sichtbar zu werden.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Nachweis der karzinogenen, menschlichen Papillomaviren HPV16, HPV33 oder HPV18 mit den Schritten:
(a) Anwendung der Methode der Polymerase-Kettenreaktion auf eine Probe menschlicher Cervixgewebezellen zur Vermehrung der Menge einer ausgewählten Nucleotidsequenz, die innerhalb der E6-Region angeordnet und charakteristisch für vorhandene Karzinogene HPV16, HPV33 oder HPV18 ist, mit den Stufen:
(I) Erwärmen zur Dissoziation der DNA-Stränge,
(II) Zugabe von Oligonucleotid-Primern, die jedes Ende der Nucleotidsequenzen definieren,
(III) Abkühlen, damit sich die Primer an die dissoziierten DNA-Stränge hybridisieren,
(IV) Zugabe einer DNA-Polymerase,
(V) Bildung von zu jedem Strang der Nucleotidsequenz komplementärer DNA bei der abgesenkten Temperatur,
(VI) Erwärmen auf die Dissoziationstemperatur, und Wiederholen der Stufen (III) bis (VI), ggf. unter Weglassung der Stufe (IV), wenn eine wärmestabile DNA-Polymerase verwendet wird, und
(b) Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der genannten Nucleotidsequenz von HPV16, HPV33 oder HPV18 in der amplifizierten Probe.
Die Erfindung betrifft auch die verwendeten spezifischen Oligonucleotid-Primer sowie spezifisch markierte Oligonucleotidsonden, wie im folgenden beschrieben.
Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden lediglich beispielhaft erläutert.

Beispiele

Zusammenfassung der verwendeten typischen Methode(n)

1. Abstriche oder Warzengewebe werden mittels üblicher Methoden in der Klinik gewonnen, und, falls erforderlich, bis zu 3 Tage gelagert, bevor sie zur Analyse in das Laboratorium gebracht werden.
2. Zellen werden lysiert, und ihre DNA wird denaturiert.
3. Virale DNA wird durch Polymerase-Kettenreaktion vermehrt.
4. Virale DNA wird direkt nachgewiesen, z.B. durch Elektrophorese und Anfärben (Endpunkt des Versuchs), oder
4.a Proben (mehrfache) werden auf eine beladene Nylonmembran gebracht, und zwar unter Verwendung eines Dotverteilers, zusammen mit geeigneten Standards und Kontrollmitteln.
5. Der Filter wird prähybridisiert.
6. Der Filter wird mit markierten, gemischten viralen DNA-Sonden hybridisiert, wobei ein Gemisch Sonden für die Hochrisiko- (potentiell karzinogen) und die anderen Sonden für die Niedrigrisiko-HPVs enthält.
7. Die Filter werden unter Bedingungen der gebotenen Gründlichkeit gewaschen, wobei lediglich nah verwandte Sequenzen zurückbleiben (durch Wasserstoffbindung der jeweils komplementären DNA-Stränge).
8. Autoradiographie. (Schwarze Belichtungsflecken auf dem Röntgenfilm, wo eine Probe aufgetragen war, zeigen, daß sie einen HPV-Virus der zu ermittelnden Kategorie enthält), oder
8.a Durchführung einer nicht radioaktiven Nachweismethode. (Ein gefärbter Fleck oder gegebenenfalls ein anderes Signal zeigen, daß ein HPV-Virus der zu testenden Art enthalten ist).

Beispiele für Oligonucleotide, die in dem beschriebenen Test funktionieren

Primer

Für jede HPV-Type oder -Kategorie werden zwei synthetische Oligonucleotide synthetisiert, die als Primer in dem Extensions- und Vermehrungsschritt der PCR verwendet werden. Diese Oligonucleotide entsprechen einer DNA, die eine spezifische "Ziel"- bzw. "Target"-Sequenz von Interesse flankiert, wobei dies eine DNA-Sequenz in dem viralen Genom ist, die für HPV eindeutig ist und von einer HPV-Type oder -Kategorie "Hochrisiko" gegenüber "Niedrigrisiko" zur anderen differiert. Wir haben gefunden, daß die unten beschriebenen Oligonucleotide geeignet sind; es können jedoch auch andere geeignete Sequenzen für die spezifischen, angegebenen viralen Typen oder für andere Typen von Papillomaviren gewählt werden.

Niedrigrisiko-HPVs

Für HPV6 und HPV11 wurde eine geeignete Targetsequenz innerhalb des E6-offenen Leserasters des viralen Genoms ausgewählt. Geeignete DNA-Sequenzen zur Verwendung als Primer, die diese Targetsequenz flankieren, sind die folgenden (wobei die Positionszahl sich auf die Nucleotidsequenz des viralen Genoms bezieht) und die gleichen für jede dieser HPVs: Primer POSITION
Diese Primer haben komplementäre Sequenzen auf dem HPV6 und HPV11. Sie unterscheiden sich von den Sequenzen in den Genomen von HPV16, HPV18 und HPV33, für die getrennte Primer, die eine ausgewählte DNA-Targetsequenz flankieren, synthetisiert werden, zusammen mit als Sonden geeigneten Oligonucleotiden, und zwar unter Verwendung des gleichen Prinzips wie oben bzw. unten für HPV6 und HPV11 erläutert.

Hochrisiko-HPVs

Für HPV16 und HPV33 sind geeignete, eine Targetsequenz flankierende Sequenzen wie folgt: Primer POSITON:
Für HPV18 geeignete, eine gewählte Targetsequenz flankierende Sequenzen sind wie folgt: Primer Position
Es ist zweckmäßig, Primer für sämtliche HPV-Typen jeder Probe hinzuzufügen. Die Probe kann anschließend aufgeteilt und für jede Kategorie von HPV-Typen (Hochrisiko gegen Niedrigrisiko) getestet werden.

Target-Oligonucleotide zur Verwendung als Sonden Niedrigrisiko-HPVs

Eine Oligonucleotid-(Target)-Sequenz zur Verwendung als Sonde wird synthetisiert. Diese entspricht einer Region zwischen den zwei Primern und ist identisch für jeden der vialen Typen HPV6 und HPV11, unterscheidet sich jedoch selbstverständlich von jeglicher anderer viralen oder anderen DNA-Sequenz. Diese Sequenzen sind wie folgt: Target oligonucleotid POSITION:
Für den Nachweis von HPV16 und HPV33 wird die folgende Oligonucleotid-(Target)-Sequenz zur Verwendung als Sonde synthetisiert: Target oligonucleotid POSITION
Für die spezifische Bestimmung von HPV18 oder innerhalb der Kategorie der Hochrisiko-HPVs wird die folgende Oligonucleotid-(Target)-Sequenz zur Verwendung als Sonde synthetisiert: Target oligonucleotid POSITION
Die exakte Anordnung sämtlicher dieser Sequenzen kann durch Untersuchung der publizierten Sequenzen der viralen Genome erkannt werden. Es ist zu betonen, daß das gleiche Prinzip, nämlich die Synthese von Oligonucleotiden, die mit gegenüberliegenden Strängen der DNA, welche eine spezifische Targetsequenz in HPV(s) hybridisiert, auch auf andere Sätze von Sequenzen innerhalb der Sequenzen der in den oben genannten Veröffentlichungen beschriebenen HPVs und in Sequenzen von anderen HPVs, wenn diese publiziert werden, angewandt werden kann.

Markierung von Targetoligonucleotiden

Radioaktive Markierung

5'-Endmarkierung der ca. 30-mere mit (gamma³²P)dATP unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Berkner und Folk, J. Biol. Chem. 252: 3176-80, 1977). Ein Kit kann von Dupont (New England Nuclear) bezogen werden, der in diesem Schritt eingesetzt werden kann.
I. Mischen:
DNA mit 5'-terminalen Phosphaten 1-50 pmol
10x Austauschen des Reaktionspuffers* 5 ul
5 mM ADP 3 ul (gamma³²P)dATP (Sp. Act. 3000 Ci/mmol) 100 pmol (i.e. 30 ul einer 10 mCi/ml-Lösung)
destilliertes Wasser auf 50 ul
T4 Polynucleotidkinase 1 ul (20 Einheiten)
* 10x Austauschen des Reaktionspuffers:
0,5 M Imidazol.Cl (pH 6,6)
0,1 M MgCl&sub2;
50 mM Dithiothreitol
1 mM Spermidin
1 mM EDTA
II. Inkubieren bei 37ºC für 30 Minuten.
III.Zugabe von 2 ul 0,5 M EDTA.
IV. Einmal Extrahieren mit Phenol/Chloroform.

Nicht-radioaktives Markieren

Verschiedene Methoden werden für das nicht-radioaktive Markieren von Oligonucleotiden zur Verwendung als Hybridisierungsprobe entwickelt. Diese sind für den Gebrauch in einem HPV- Nachweiskit geeignet, da sie allgemein eine akzeptabel lange Lebensdauer haben und Gefahren der sowie das Erfordernis einer Erlaubnis für den Einsatz von Radioaktivität vermeiden. Wir haben nicht-radioaktive Oligonucleotide verwendet, die mittels einer solchen neuen Methode (durchgeführt von BRESA, Adelaide) hergestellt wurden, bei der alkalische Phosphatase direkt an das Targetoligonucleotid gekoppelt wird. Mit alkalischer Phosphatase markierte Oligonucleotide einer jeden spezifizierten Sequenz werde bei Bedarf von BRESA hergestellt und sind dort erhältlich.

Reagentien

Sammelpuffer = phosphatgepuffertes Kochsalz (PBS) = 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na&sub2;HPO&sub4;.12H&sub2;O, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;.
Lysepuffer = 50 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,5% SDS, 10 mM EDTA.
Enzympulver = Proteinase K (Konzentration nach Zugabe von 10 ml Lysepuffer = 50 ug/ml).
Deproteinisierungsreagenz 1 = Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1, v/v).
Deproteinisierungsreagenz 2 = Chloroform/Isoamylalkohol (24:1, v/v).
Extraktionslösung = 3 M Natriumacetat.
PCR-Puffer (bei Verwendung von normalem Klenow) = 50 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;.
PCR-Puffer (bei Verwendung von hitzestabiler DNA-Polymerase) = 50 mM Tris.HCl, pH 8,8 (bei 25ºC), 10 mM Ammoniumsulfat, 10 mM MgCl&sub2;.
PCR-Reagenzpuffer =
10x PCR-Puffer 10 ul
dNTPs 16 u1 (4 ul von jeweils 50 mM Vorrat)
Dimethylsulfoxid 10 ul
Primer 1 ul von jeweils 500 ng/ul Vorrat (= 4 ul gesamt)
DNA (Zellen oder DNA) x ul dH&sub2;O Auffüllen auf 100 ul
DNA-Polymerase-Lösung = 1 U/ul DNA-Polymerase (Klenow-Fragment).
Prähybridisierungslösung = 6x SSC, 25x Denhardts Lösung, 0,5% Natriumdodecylsulfat.
Hybridisierungslösung = 6x SSC, 1x Denhardts Lösung, 0,5% SDS, mit 100 ng/ml mit alkalischer Phosphatase gekoppelter Oligonucleotidsonde.
Waschlösung 1 = 6x SSC, 0,1% SDS.
Waschlösung 2 = 6x SSC.
Waschlösung 3 = 1 M NaCl, 0,1 M Tris.HCl, pH 9,5, 5 mM MgCl&sub2;.
Färbungsreagenzlösung = 0,33 mg/ml Nitroblau-tetrazollium (NBT), 0,17 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat (BCIP), 0,33% v/v Dimethylformamid in 0,1 M Tris.HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl&sub2;.
TE = 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA.
SSC = Standard-Kochsalzcitrat (1x SSC = 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Trinatriumcitrat, pH 7,0).
Denhardts Lösung = 5 g Ficoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g Rinderserumalbumin, aufgefüllt auf 500 ml mit destilliertem Wasser.
SDS = Natriumdodecylsulfat.

Protokoll für cervikale oder andere anogenitale Abstriche

Probengewinnung von den Patientinnen

1. Gewinnung des Abstrichs von der Patientin unter Verwendung eines Spekulums (d.h. wie für einen Pap-Abstrich) oder vorzugsweise durch cervikovaginale Lavage im Falle des cervikalen Screenings.
2. Überführen des Tupfers mit dem Abstrich in das Sammelglas. (Das Glas enthält sterilen Sammelpuffer.)
3. Das Abstrichgewebe kann 2 bis 3 Tage bei 4ºC oder bei -20ºC für die Lagerung über einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden.

Probenvorbereitung

1. Man nimmt das Sammelröhrchen und schüttet zurückbleibende Zellen vom Spekulum in den Sammelpuffer in dem Röhrchen. Die Suspension wird in ein Eppendorf-Röhrchen gegossen.
2. Man mikrozentrifugiert 15 sec. Man gießt das PBS vom Pellet ab. Man resuspendiert die Zellen in 500 ul frischem Sammelpuffer durch kurzes Vortexing. Man mikrozentrifugiert erneut.
3. Der Schritt 2. wird zweimal wiederholt.
4. Die Zahl der Zellen wird unter Verwendung eines Hämatozytometers bestimmt.

Verfahren für die Polymerase-Kettenreaktion (normaler Klenow)

1. Man fügt ein Volumen der Zellsuspension, die etwa 10.000 Zellen enthält, in 35 ul destilliertes Wasser in ein Eppendorf-Röhrchen.
2. Man setzt das Röhrchen in ein auf 95-98ºC erhitztes Wasserbad.
3. Nach 10 min entfernt man das Röhrchen und mikrozentrifugiert kurz zur Entfernung von Kondensation.
4. Man fügt augenblicklich 65 ul PCR-Reagenzpuffer hinzu.
5. Man setzt das Röhrchen in ein zweites, auf 37ºC erwärmtes Wasserbad.
6. Nach 2 min setzt man 1 ul DNA-Polymeraselösung hinzu; man läßt die Reaktion 2 min bei 37ºC fortschreiten.
7. Man setzt das Röhrchen für 2 min in das Wasserbad mit 95-98ºC zurück und mikrozentrifugiert kurz.
8. Die Schritte 5. bis 7. werden 25 mal wiederholt.

Verfahren für die Polymerase-Kettenreaktion (thermophile Polymerase aus Thermus aquaticus)

Stattdessen wird eine DNA-Polymerase verwendet, die bis 95ºC resistent ist. Die Verwendung dieses Enzyms erleichtert in gewissem Ausmaß den Test und, was besonders wichtig ist, verringert die Kosten auf etwa 20%. Wir haben das von New England Biolabs vertriebene Enzym verwendet, das von einem Stamm aus heilen Quellen in Rotorua, Neuseeland, gereinigt werden kann. Das Protokoll ist wie oben, mit der Ausnahme von 93ºC für 5 min, wobei man 50 ul flüssiges Paraffin zum Verhindern des Verdampfens zusetzt, und anschließend 4 U Polymerase hinzufügt sowie im 50ºC-Bad 30 sec, im 63ºC-Bad 90 sec und im 93ºC-Bad 30 sec inkubiert. Dieser Zyklus wird z.B. 50 mal wiederholt.

Bestimmung von mittels des PCR-Verfahrens gebildeter viraler DNA

Von diesem Punkt an können eine Anzahl von Verfahren verwendet werden. Es werden hier einige der von uns verwendeten beschrieben.

A. Polyacrylamid-Gelelektrophorese für das direkte Sichtbarmachen von PCR-Produkten

1. Man gießt ein 12% nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel aus.
2. Wenn sich das Gel abgesetzt hat, wird die Hälfte einer jeden PCR-Mischung (50 ul) aufgetragen und die Elektrophorese erfolgt 2 h bei 15 V/cm. Man fügt 0,5 ug eines pBR322/HpaII-Verdaus als Molekulargewichtsmarker bei.
3. Nach der Elektrophorese taucht man das Gel in Ethidiumbromid-Lösung (50 ug/ml in destilliertem Wasser) und läßt 30 min einfärben.
4. Für HPV16 oder HPV33 positive Proben zeigen sich als diskrete Bande von etwa 200 bp. Für HPV6 oder HPV11 positive Proben zeigen sich als diskrete Bande von etwa 120 bp. Für HPV6/11 und HPV16/33 positive Proben zeigen sich als diskrete Banden von 200 bp und 120 bp.
oder

B. Alkalische Phosphatase-Oligonucleotidsonde auf Dotblot

1. Auftragen von Proben auf die Membran.
I) Man setzt 25 ul einer Probe in ein Eppendorf-Röhrchen. Man fügt 25 ul 1,0 M Natriumhydroxidlösung, gefolgt von 12,5 ul destilliertem Wasser, hinzu.
II) Man setzt das Röhrchen 3 min in ein 95-98ºC Wasserbad.
III)Man überträgt das gesamte Gemisch auf eine Nylonmembran unter Verwendung eines Hybridot-Verteilers.
IV) Man spült mit 2x SSC.
V) Man lädt die Membran trocknen.
2. Sondierung der Membran mit einer mit alkalischer Phosphatase verknüpften Oligonucleotidsonde.
I) Prähybridisierung - Man setzt die Membran in einen mitgelieferten Plastikbeutel und fügt 10 ml der Prähybridisierungslösung hinzu. Man verschließt den Beutel und inkubiert 30 min unter Bewegung bei 30ºC.
II) Hybridisierung - Man entleert den Inhalt des Beutels und ersetzt ihn mit 10 ml der Hybridisierungslösung. Man verschließt den Kunststoffbeutel und inkubiert 40 min unter Bewegung bei 30ºC.
III)Waschen - Man entfernt die Membran aus dem Beutel und setzt sie in ein Gefäß, daß 500 ml der Waschlösung 1, vorerwärmt auf 37ºC, enthält. Man rührt 10 min bei dieser Temperatur. Man ersetzt die Lösung mit 500 ml der Waschlösung 2 und rührt weitere 10 min bei 37ºC. Man ersetzt die Lösung erneut, diesmal mit 200 ml Waschlösung 3, und rührt 5 min bei Umgebungstemperatur. Man wiederholt den Waschlösung 3-Schritt 5 weitere Male.
IV) Farbentwicklung - Man setzt die Membran in ein flaches Gefäß, das 25 ml der Farbreagenzlösung enthält. Man lädt die Farbe sich über mehrere Stunden oder über Nacht bei Umgebungstemperatur entwickeln.
oder

C. Radioaktive Oligonucleotidsonde auf Dotblot

I) Prähybridisierung. Die Membran wird mindestens 1 h bei 30ºC prähybridisiert. Hierfür können verschiedene Methoden verwendet werden.
(a) Man verwendet einen speziell entworfenen Perspex-Block, der in der Werkstatt des Labors konstruiert wurde. Der Block wird aufrecht in ein 30ºC-Wasserbad gestellt, wobei sich die Membran, eingetaucht in die folgende Lösung, im Inneren befindet.
(b) Eine andere Methode besteht darin, dar zwei Bögen eines Whatman-Typ 542-Papiers auf eine Abmessung geringfügig größer als die der Membran geschnitten werden. Als nächstes setzt man die Membran auf einen Bogen und netzt die Membran mit 2 ml der Prähybridisierungslösung an. Dann setzt man einen weiteren Whatman-Bogen auf und setzt das resultierende "Sandwich" in einen Kunststoffbeutel mit dem Rest der Prähybridisierungslösung.
Prähybridisierungsgemisch (10 ml Gesamtvolumen):
10% (G/V) entfettetes Milchpulver (z.B. Diploma ) 0,5 ml
20x SSC (3M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat) 2,5 ml
20% (G/V) SDS (Natriumdodecylsulfat) 0,5 ml
10 mg/ml Träger-DNA (z.B. aus Heringssperma) 2,0 ml
Steriles destilliertes Wasser 4,5 ml.
II) Hybridisierung. Man gießt das Prähybridisierungsgemisch ab und ersetzt es mit dem Hybridisierungsgemisch, das das gleiche ist, mit der Ausnahme, daß radioaktiv markierte virale DNA (1 mg/ml Hybridisierungsgemisch) zugesetzt ist. Man läßt die Hybridisierung über Nacht bei 30ºC in dem Perspex-Block oder dem Plastikbeutel fortlaufen.
III)Waschen der Membranen. Die Membranfilter werden unter Bedingungen einer großen Gründlichkeit gewaschen. Dies dient zur Entfernung jeglicher radioaktiver DNA-Sonden mit Ausnahme von derjenigen, die spezifisch angeheftet ist, und zwar durch Wasserstoffbindung an identische virale DNA-Sequenzen, die in einer Probe vorhanden sein können.
IV) Autoradiographie.
1. Die Membran wird mit Filterpapier geblottet, wobei man jedoch nicht trocknet, und wird noch im feuchten Zustand auf eine Bahn von 3 MM Whatman-Papier mit Klebestreifen befestigt sowie mit einer Haftfolie bedeckt.
2. Das Ganze wird auf einen geeigneten Röntgenfilm aufgebracht (z.B. Kodak XR-5), und zwar in einer Dunkelkammer, und in einer Autoradiographiekassette mit 2 Verstärkungsschirmen (DuPont) verschlossen.
3. Man läßt die Autoradiographie bei -80ºC 2,5 bis 12 h fortschreiten.
4. Dunkle Flecken auf dem Autoradiogramm zeigen die Anwesenheit der HPV-Type an.

Protokoll für Warzen und Biopsien

Vorbereitung des Reagens.

Man bereitet den Lysepuffer vor, indem man 1 ml destilliertes Wasser zu Lysepufferpulver gibt und dieses mit dem Enzympulver in einem Reaktionsgefäß mischt.

Probenvorbereitung.

1. Man spült das Gewebe dreimal in 500 ul Sammelpuffer (wie oben für Abstriche).
2. Man schneidet das Gewebe in ca. 1 mm große Stücke.
3. Man fügt zu dem Gewebe 700 ul der Lysepuffer/Enzymlösung hinzu.
4. Man lädt bei 37ºC stehen, bis das Gewebe vollständig verdaut erscheint, oder über Nacht bei 37ºC.
5. Man fügt 350 ul des Deproteinisierungsreagens 1 und 350 ul des Deproteinisierungsreagens 2 hinzu. Man mischt heftig.
6. Man mikrozentrifugiert 15 sec und überführt die obere Schicht in ein frisches Röhrchen (die untere Phase wird verworfen).
7. Man wiederholt die Schritte 5 und 6 dreimal.
8. Man fügt 700 ul des Deproteinisierungsreagens 2 hinzu, mischt und mikrozentrifugiert 15 sec.
9. Man überführt die obere Schicht in ein frisches Röhrchen und fügt 100 ul der Extraktionslösung hinzu. Man fügt sofort 1,4 ml eiskaltes, absolutes Ethanol hinzu. Man lädt bei -20ºC 1 Stunde oder bei -80ºC 15 min stehen.
10. Man mikrozentrifugiert 10 min und gießt anschließend vorsichtig das Ethanol ab. Man läßt das Pellet (=DNA) 15 min trocknen.
11. Man resuspendiert die DNA in 50 ml TE und bestimmt, falls möglich, die DNA-Konzentration bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers (1 O.D.260-Einheit = 50 ug/ml).

Verfahren für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1. Man fügt ein Volumen der DNA-Lösung, die etwa 1 ug DNA enthält, auf 100 ul des PCR-Reaktionsgemisches in ein Eppendorf-Röhrchen.
2. Man setzt das Röhrchen in ein auf 95-98ºC erhitztes Wasserbad.
3. Nach 10 min mikrozentrifugiert man das Röhrchen kurz (etwa 5 sec) zur Entfernung von Kondensation.
4. Man setzt das Röhrchen in ein auf 37ºC vorerwärmtes Wasserbad.
5. Nach 2 min fügt man 1 ul der DNA-Polymerase hinzu und setzt die Inkubation 2 min bei 37ºC fort.
6. Man setzt das Röhrchen für 2 min zurück in das 95-98ºC Wasserbad.
7. Man wiederholt die Schritte 4-6 fünfundzwanzigmal.

Nachweis von in dem PCR-Verfahren gebildeter viraler DNA

Wie oben für die Abstrichprotokolle.

Standards und Kontrollen

Standards: Reine virale DNA von HPV6, HPV11, HPV16, HPV18 und HPV33 oder Oligonucleotide, die mindestens der hybridisierenden Targetregion jeder HPV entsprechen, werden zu der Membran in Mengen von 125, 12,5, 1,25 und 0,125 pg für vollständige HPV oder entsprechend weniger für Oligonucleotide gegeben.
Kontrollen:
I.) Vorhaut-DNA von Neugeborenen (entdeckt das unwahrscheinliche Auftreten irgendeiner nicht-spezifischen Hybridisierung an menschlicher Haut-DNA) in Mengen von 10 ng, 50 ng, 100 ng und 2 ug wird auf jede Membran aufgebracht.
II.) Positive Kontrolle: DNA von mit HPV6/11 und HPV16/18/33 infizierten Proben.
III.) Alu-Wiederholungssequenz-DNA (zur Hybridisierung an die Alu-Probe) in Mengen von 10 pg, 50 pg, 100 pg und 2 ng wird auf jede Membran aufgebracht (wahlweise).

Automation

Wir haben einen funktionierenden Prototyp einer Maschine zur automatischen Durchführung der PCR-Reaktion entworfen und konstruiert.

Gesamtzeit für das Testergebnis

(nach dem Erhalt der Proben im Labor): Mehrere Stunden bis 2 Tage.

Mit dem Test erhaltene Ergebnisse

Die Ergebnisse haben die Wichtigkeit des direkten HPV-Nachweises bei der Untersuchung bei Patienten gezeigt. Es zeigte sich zum Beispiel, daß viele Patientinnen mit einer normalen Zytologie der Cervixzellen mit den karzinogenen Varianten von HPV infiziert waren. Dies spiegelt die Tatsache wieder, daß unser Test die Infektion zu einem früheren Zeitpunkt entdecken kann, vielleicht sogar bevor das Virus Gelegenheit hat, eine morphologische Veränderung in der Zelle zu verursachen. Weiterhin sind die mit den potentiell karzinogenen Varianten der HPV assoziierten Läsionen oft äußerst flach und weniger auffällig als die großen Condylome, die von den gutartigeren Varianten verursacht werden, und können daher nicht so leicht in der Klinik erkannt werden.

Spezifische Versuche, die Beispiele für das Verfahren im Einsatz betreffen

In den Abbildungen werden Zeichnungen anstelle von Fotografien wiedergegeben, da das Fotokopierverfahren eine schlechte Auflösung ergibt.
A. PCR-Amplifikation von reiner HPV16-viraler DNA unter Verwendung von normalem Klenow. 1ng HPV16/pBR322 wurde 20 Umläufen gemäß den folgenden Bedingungen unterworfen: 95ºC für 2 min (Strangdissoziation), anschließend 37ºC für 2 min (Annealing), anschließend 1 U Klenow-Enzym zugesetzt und 37ºC-Inkubation für 2 min. Die Hälfte (50ul) des erhaltenen Gemisches wurde an einem 2% Agarosegel elektrophoresiert, und das Ergebnis ist in Fig. 1 gezeigt. Menge = 2,5 x 100 ng = 250ng. Vermehrte Region = 1/40 der gesamten HPV16-Sequenz. Gesamtamplifikation = 250 x 40 = 10.000 x (d. h. die Effizienz der Reaktion war 60 % für jeden Zyklus).

B. PCR-Amplifikation von Warzenbiopsie-DNA mit HPV16/33-Tests.

Die DNA von Analwarzen Gap289 wurde Phenol/Chloroform-extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. 1ug DNA wurde anschließend 23 Amplifikationsrunden unterworfen (jeweils: 95ºC für 2 min, anschließend 37ºC für 2 min, 1 U Klenow zugesetzt und 37ºC für 2 min). 40% (50ul) wurde an einem 2% Agarosegel elektrophoresiert. Mit Ethidiumbromid gefärbte DNA ist in Fig. 2 gezeigt. Die PCR-Probe und die Standards wurden auf eine Membran gespottet, und die Hybridisierung wurde über Nacht mit einer ³²P-markierten HPV16/33-Target-Oligonucleotidsonde durchgeführt. Die Waschbedingungen waren 22ºC für 5 min, und anschließend 38ºC für 10 min in 5 x SSPE/0,1% SDS. Die Ergebnisse der Autoradiographie sind in Fig. 3 gezeigt. Es ist zu beachten, daß sich die Mengen auf verwendete rekombinante virale DNA beziehen, von der nur ein Bruchteil die amplifizierte Sequenz wiedergibt, innerhalb der sich die Targethybridisierungsregion befindet.
C. PCR-Amplifikation von reiner HPV16-rekombinanter viraler DNA unter Verwendung von normalem Klenow. 1ng HPV16/pBR322, 10mM Tris.HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 500 ng jeweils von den HPV16/33-Primern, 4 ul jeweils von dNTP (50 mM Vorrat). 23 Runden gemäß: 98ºC für 2 min, anschließend 37ºC für 2 min, Zusetzen von Klenow, anschließend 37ºC für 2 min. Elektrophorese an 2% Agarosegel. Das Ethidiumbromid-gefärbte Gel ist in Fig. 4 gezeigt. Die Bahnen 1 und 3 sind DNA-Größenmarker, d.h. pBR322, geschnitten mit HpaII bzw. SPP-1. Eine Einzel-DNA-Bande der erwarteten Größe (etwa 200 Basenpaare) kann in Spur 2 gesehen werden. Um dies zu beweisen, wurde anschließend an diesem Gel ein Southern-Blotting durchgeführt unter Verwendung der Hybridisierungsbedingungen: 5 x SSPE, 2% SDS, 0,5 ml BLOTTO, 0,5 ml von 10 mg/ml Lachssperma-DNA, 5,5 ml destilliertes Wasser. Die Prähybridisierung erfolgte 1 h bei 30ºC, und die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 30ºC in der obigen Lösung mit etwa 1 ng/ml endmarkierter Target- HPV16/33-Oligonucleotidsonde. Gewaschen wurde 10 min bei 38ºC in 1 x SSPE, 0,1% SDS. Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt; es zeigt massive Hybridisierung an einer Bande bei der erwarteten Position in Spur 2 (d. h. in der gleichen Position wie die Bande der gefärbten DNA in Fig. 4, Spur 2).
D. Biopsien von Analwarzen. Patientenproben: Gap119, Gap278, Km, Gap289, 11912C. Die Bedingungen waren wie oben unter C beschrieben. Fig. 6 ist ein Autoradiogramm nach der radioaktiven Sondierung: Km und Gap289 waren +ve, d. h. enthielten HPV16.
E. Southern-Blot von Biopsien +ve für HPV16. Dieses Experiment zeigt, dar die HPV16/33-Oligosonde an die richtigen Restriktionsfragmente in nicht-amplifizierten Biopsien und reiner viraler DNA hybridisiert, und daß es auch keine Kreuzhybridisierung mit anderen HPV-Typen gibt.
Spur 1 - 8 ug Gap289, geschnitten mit BamHI/PstI.
Spur 2 - frei.
Spur 3 - 100 ng HPV33, geschnitten mit Bg/II/PstI.
Spur 4 - 100 ng HPV16, geschnitten mit BamHT/PstI.
Spur 5 - 100 ng HPV18, geschnitten mit EcoRI/XbaI.
Spur 6 - 100 ng HPV11, geschnitten mit BamHI/PstI.
Spur 7 - 100 ng HPV6, geschnitten mit EcoRT/PstI.
Das Autoradiogramm (diagrammatisch wiedergegeben in Fig. 7) zeigt die Hybridisierung von radioaktiven HPV16/33-Oligosonden an HPV16 in Spur 4 und an HPV33 in Spur 3. Keine Hybridisierung erfolgte an HPV6, 11 und 18 in den Spuren 7, 6 bzw. 5, was zeigte, daß die Sonde spezifisch für HVPs16 und 33 ist. Die Hybridisierung in der Spur 1 zeigt, daß die Probe Gap289 HPV16 enthält.
F. Cervikalabstriche - HPV16/33-PCR-Amplifikation. Dies zeigt, daß die Technik spezifische HPV in Abstrichproben nachweisen kann. Abstriche: Pt und Mo. Etwa 10.000 Zellen wurde in 35ul Wasser suspendiert, auf 98ºC 10 min erwärmt, mit 65ul PCR-Gemisch versetzt, und man befolgte das normale Protokoll mit 30 Amplifikationsrunden unter Verwendung von normalem Klenow. Die Proben wurden auf Membranen gedottet und mit radioaktiven Oligosonden sondiert. Ergebnis (Fig. 8): Pt-Abstrich war +ve mit der HPV16/33-Sonde; Mo war -ve.
G. Southern-Blot des Abstrichs. Dies diente zur Bestätigung, daß der Pt-Abstrich eine tatsächliche Amplifikation erfahren hatte (d. h. ist ein Beweis für die Richtigkeit des Ergebnisses in H.). Das verwendete Gel war 1,5% Agarose. In Fig. 7 bedeuten:
Spur 1 - 25ul Pt PCR, verdaut mit Bg/I/BamHI im PCR-Puffer.
Spur 2 - 40ng HPV33-Insert.
Spur 3 - 40ng HPV16-Insert.
Spur 4 - 0,5ug pBR322, verdaut mit HpaII.
Spur 5 - Bakteriophage lambda, verdaut mit HindIII.
Fig. 9 zeigt das resultierende, gefärbte Gel. Fig. 10 zeigt das Ergebnis des radioaktiven Targetoligosondierens. Fig. 11 zeigt das Ergebnis des alkalischen Phosphatase-Targetoligosondierens. Eine dunkle Hybridisierungsbande kann an der richtigen Position in der Spur 1 für die PCR-Produkte aus der Patientenprobe gesehen werden, und die Banden in den Spuren 2 und 3 entsprechen der Position des gesamten Virus. Dies bestätigt die Anwesenheit von HPV16 in dem Cervikalabstrich.
Die folgenden Beispiele (H-J) zeigen zusätzliche positive Ergebnisse mit der auf verschiedene Biopsien und Abstriche angewendeten Methode.
H. Verschiedene Abstriche und Biopsien von Anogenitalwarzen - HPV6/11 PCR. In den Fig. 12 und 13 zeigen:
Spur 1 - 0,4ug pBR322, geschnitten mit HpaII.
Spur 2 - 0,9ug F9885-Warzen-DNA, nur HPV6/11-Oligos.
Spur 3 - 1ug Ow-Warzen-DNA, HPV6/11 und HPV16/33-Oligos.
Spur 4 - 3ul Zellen von F11912 Cervikalabstrichen, nur HPV6/11-Oligos.
Spur 5 - 3ul Zellen von F11912-Vaginalabstrich, nur HPV6/11-Oligos.
Spur 6 - 5ul Zellen vonF11912 Rektalabstrich, nur HPV6/11-Oligos.
30 Runden wurden unter normalen Protokollbedingungen durchgeführt. 50ul jedes PCR-Gemisches wurden auf ein 12% nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel gesetzt. Das eingefärbte Gel ist in Fig. 12 gezeigt. (Die Bande bei etwa 34 pb ist ein mit dem HPV6/11-Primern assoziiertes Artefakt.) Diese Membran wurde 1 Stunde lang bei 20V/100 mA elektrogeblottet und mit der radioaktiven HPV6/11-Oligosonde sondiert. Das Ergebnis der zweistündigen Belichtung auf Röntgenfilm ist in Fig. 13 gezeigt. Banden in den Spuren 4 und 5 zeigen an, daß die cervikalen und vaginalen, nicht jedoch die rektalen Zellen von dieser Patientin mit HPV6/11 infiziert waren.
I. Warzen - HPV6/11 PCR. Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt:
Spur 1 - pBR322, geschnitten mit HpaII.
Spur 2 - 750ng F8408 Labialwarzen.
Spur 3 - 1ug Gap252 Analwarzen.
Spur 4 - 860 ng Tr Analwarzen.
Spur 5 - 750 ng Bi Analwarzen.
(Bedingungen: 25 Runden, nur HPV6/11-Primer; 50 ul eines jeden PCR-Gemisches lief auf dem Gel.)
J. Cervikalwarzen - HPV6/11- und HPV16/33-Primer. 50 ul Ansatz auf 12% Polyacrylamidgel; die Ergebnisse sind in Fig. 15 gezeigt:
Spur 1 - pBR322, geschnitten mit HpaII.
Spur 2 - ca. 500 ng Hn-Biopsie.
Spur 3 - ca. 500 ng Hs-Biopsie.
Spur 4 - ca. 500 ng Ls-Biopsie.
K. Cervikalabstriche - HPV6/11 und HPV16/33. Dieses Ergebnis zeigt, daß Primer für verschiedene HPVs zusammen in dem gleichen Reaktionsgemisch verwendet werden können, um Amplifikationsprodukte zu ergeben, die für jeden HPV-Typ einzigartig sind. Die Ergebnisse sind in Fig. 16 gezeigt.
Spur 1 - pBR322, geschnitten mit HpaII.
Spur 2 - 1 ng HPV6/pAT153 und 1 ng HPV16/pBR322; HPV6/11- und HPV16/33-Primer.
Spur 3 - 3 ul Zellen eines CSC019-Abstrichs, HPV6/11- und HPV16/33-Primer.
Spur 4 - 3 ul Zellen eines CSC328-Abstrichs, HPV6/11,-Primer.
Spur 5 - 3 ul Zellen eines Pt-Abstrichs, HPV6/11-Primer.
(Bedigungen: 25 Runden, normale Protokollbedingungen.) In Spur 2 der Fig. 16 kann man das 200 bp HPV16/33-Amplifizierungsprodukt (schwach) und das 120 bp HPV6/11-Produkt (dunkler) erkennen. Die Spuren 3-5 waren negativ (es sind nur Primerbanden zu erkennen), d. h. sie enthielten nicht HPV6/11.
L. Abstriche und Biopsien - HPV16/33 PCR. Dieses Experiment ist ein Vergleich der radioaktiven und nicht-radioaktiven Sondierung für den Nachweis von HPVs mittels der PCR-Methode. In Fig. 12 zeigen:
Spur 1 - pBR322, geschnitten mit HpaII.
Spur 2 - frei.
Spur 3 - HPV6/pAT153 und HPV16/pBR322 PCR aus I.
Spur 4 - 15 ul Km PCR.
Spur 5 - 15 ul Gap289 PCR.
Spur 6 - 15 ul Pt-Abstrich PCR.
Gel (12% Polyacrylamid) wurde laufengelassen und gefärbt (Fig. 17), und anschließend elektrogeblottet und mit alkalischer Phosphatasesonde (Fig. 18) und der radioaktiven HPV16/33-Oligosonde (Fig. 19) sondiert. In Fig. 17 kann die ca. 200 bp-Bande, die ein Anzeichen für HPV16/33 ist, in den Spuren 6, 5, 4 und 3 und die 120 bp HPV6/11-Bande kann in der Spur 3 gesehen werden. In Fig. 18 kann ein einzelnes Hybridisierungsband an die ca. 200 bp HPV16/33-Amplifizierungsprodukte in jeder der Spuren 6-3 gesehen werden. Die Fig. 19 zeigt das Ergebnis einer 1,5 h Belichtung des Röntgenfilms: man erkennt die Hybridisierung an die etwa 200 bp HPV16/33-Amplifikationsprodukte. Fig. 20 ist ein Dotblot, sondiert mit einer radioaktiven Targetoligosonde (rechts: Diagramm der Positionen der Proben auf dem Dotblot; links: Ergebnis der Hybridisierung).
M. Hitzestabile Polymerase - HPV6 PCR. 1 ng HPV6/pAT153, 2 Einheiten von Thermus aquaticus-DNA-Polymerase wurden anfänglich zugesetzt und jeweils nach 10 Runden für 40 Runden. Die verwendeten Bedingungen waren genauso wie in dem New England Biolabs-Protokoll angegeben. Das Ergebnis (Fig. 21) zeigt, daß die hitzestabile Polymerase auch in der Lage ist, die gewünschten Amplifikationsprodukte zu bilden. In dieser Fig. zeigen:
Spur 1 - pBR322/HpaII.
Spur 2 - 40 ul HPV6/pAT153 PCR.
N. Hitzestabile Polymerase - HPV16 und Biopsie. Nach der Amplifikation sollte HPV16/pBR322, geschnitten mit HinfI, zwei Fragmente von 52 bp und 142 bp ergeben. 5 ng HPV33/plink und 1 ug Gap289 wurden 40 Runden mit einer hitzestabilen Polymerase unterworfen (Spuren 4 und 5 in Figur 22). Die Bedingungen waren: 50 mM Tris.HCl, pH 8,8 bei 25ºC, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 ul DSMO, 500 ng des jeweiligen HPV16/33-Primers, 4 ul des jeweiligen dNTP (50 mM Vorrat) und 50 ul flüssiges Paraffin. 4 U DNA-Polymerase wurden zu Beginn zugesetzt. Die Inkubation erfolgte in dem 93ºC-Inkubator für 30 sec und anschließend bei 50ºC für 30 sec sowie dann bei 43ºC für 45 sec. In der Figur 22 zeigen:
Spur 1 - pBR322/HpaII.
Spur 2 - HPV16/pBR322, geschnitten mit HinfI. (20 ul PCR + 2 ul 10x HinfI-Puffer + 1 ul Enzym + 6ul dH&sub2;O)
Spur 3 - 20 ul HPV16/pBR322 PCR
Spur 4 - 20 ul HPV33/plink PCR.
Spur 5 - 20 ul Gap 289.
O. Verdünnte Biopsie, 100 PCR-Runden unter Verwendung einer hitzestabilen Polymerase. Warzenbiopsie-Gap289 (1 ug/ul) wurde auf 1:10³, 1:10&sup6; und 1:10&sup9; verdünnt, und 100 Amplifikationsrunden wurden ausgeführt, unter Verwendung von 1 ul einer jeden Verdünnung und anfänglich 4 U der hitzestabilen DNA- Polymerase, und anschließend wurden zusätzliche 2 U nach 50 Runden zugesetzt. Andere Biopsien und Abstriche wurden lediglich 50 Runden unterworfen. Die Bedingungen waren wie im Beipiel P. Das Ergebnis zeigt die außerordentliche Empfindlichkeit des Tests; die besten Ergebnisse mit dieser exzessiven Anzahl von Runden der Amplifikation wurden mit den am meisten verdünnten Beispielen erhalten. Die Fig. 23 zeigt das mit Ethidiumbromid gefärbte DNA-Gel. Das Gel wurde elektrogeblottet und mit radioaktiv markierten HPV6/11-(Figur 24) und HPV16/33-(Figur 25) Targetoligosonden sondiert. Das Ergebnis zeigt die extreme Spezifizität des Tests. In Figur 15(b) sieht man, daß nur in Spur 5 und 6, wo die HPV6/11-Primer verwendet wurden, eine Hybridisierung an eine 120 bp-Bande stattfand von der Größe des HPV6/11 Amplifikationsproduktes. Absolut keine Hybridisierung wurde in den Spuren gesehen, wo die Proben nur unter Verwendung von HPV16/33-Primern amplifiziert wurden. In Figur 15(c) kann man eine Hybridisierung an die etwa 200 bp-Bande der HPV16/33-Amplifikationsprodukte für die Biopsien (Spuren 2-4) und den Analabstrich (Spur 5) erkennen. In den Figuren 23, 24 und 25 sind die Spuren wie folgt:
Spur 1 - pBR322, geschnitten mit HpaII.
Spur 2 - Gap289 (1:10³) PCR (nur HPV16/33-Primer)
Spur 3 - Gap289 (1:10&sup6;) PCR (nur HPV16/33-Primer)
Spur 4 - Gap289 (1:10&sup9;) PCR (nur HPV16/33-Primer)
Spur 5 - Analabstrich Gap402 PCR (HPV6/11- und HPV16/33-Primer)
Spur 6 - Bs-Warzen PCR (HPV6/11- und HPV16/33-Primer).
Spur 7 - Cervikalabstrich 11912 (nur HPV16/33-Primer).
Spur 8 - Vaginalabstrich 11912 (nur HPV16/33-Primer).
P. Hybridisierung einer Targetoligosonde an nicht-amplifizierte HPV16, HPV33 und Biopsien. Übliche restriktionierte HPVs und Biopsien wurden auf einem Gel laufengelassen und angefärbt (Figur 26) sowie anschließend mit einer HPV16/33- Targetoligosonde sondiert. Das Ergebnis ist in Figur 27 gezeigt, wo die Hybridisierung in jedem Falle (Spuren 2-5) und zu dem korrekten Restriktionsfragment im Falle der rekombinanten viralen DNA erkannt werden kann. Sechs Tage Belichtung auf Röntgenfilm waren für diese nicht verstärkte DNA erforderlich. In den Figuren 26 und 27 zeigen:
Spur 1 - Bakteriophage lambda, geschnitten mit HindIII/EcoRI.
Spur 2 - 5 ug Bs-Warzen-DNA, BgIII/BamHI.
Spur 3 - 5 ug Gap289, BglII/BamHI.
Spur 4 - HPV16/pBR322, BamHI.
Spur 5 - HPV33/plink, BglII.
Spur 6 - SPP-1.
Q. Dotblots, die die Hybridisierung von HPV16/33-alkalischen Phosphatase-Oligosonden an HPV16 zeigen, sind in Figur 28 gezeigt.
R. HPV18 PCR. 30 Runden mit normaler Klenow-DNA-Polymerase. Das Ergebnis ist in Figur 29 gezeigt, wo die Spuren bedeuten:
Spur 1 - HPV16-Insert PCR-Produkte, HPV16/33-Primer.
Spur 2 - HPV18-Insert PCR-Produkte, HPV18-Primer wurden verwendet.
Die HPV18 PCR-Produkte von ca. 100 bp können in Spur 2 gesehen werden. In Spur 1 sind die HPV16 PCR-Produkte von ca. 200 bp sichtbar.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des karzinogenen menschlichen Papillomavirus HPV16, HPV33 bzw. HPV18, dadurch gekennzeichnet, daß man:

(a) bei einer Probe menschlicher Zervixgewebezellen die Menge einer sich in der E6-Region befindlichen, für karzinogenes HPV16 sowie HPV33 bzw. HPV18 typischen, ausgewählten Nukleotidsequenz mittels Polymerasekettenreaktionstechnik amplifiziert, wobei die folgenden Schritte durchlaufen werden:

(i) Erwärmen des Ansatzes, um die DNA-Stränge zu dissoziieren,

(ii) Zufügen von Oligonukleotid-Primern, die jedes Ende dieser Nukleotidsequenz definieren,

(iii) Abkühlen des Ansatzes, so daß die Primer die dissoziierten DNA-Stränge sich reassoziieren lassen,

(iv) Zufügen einer DNA-Polymerase,

(v) bei Abkühlungstemperatur Bildung von DNA, die zu jedem Strang dieser Nukleotidsequenz komplementär ist, und

(vi) Erwärmen auf Dissoziationstemperatur, sowie Wiederholung der Schritte (iii) bis (vi), gegebenenfalls unter Auslassung von Schritt (iv) bei Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase; und

(b) das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein dieser Nukleotidsequenz von HPV16 sowie HPV33 bzw. HPV18 in der amplifizierten Probe nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem die ausgewählte Nukleotidsequenz definierenden Primer-Paar

handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Polymerase um eine bei der Dissoziationstemperatur stabile Polymerase handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Polymerase um eine thermophile Polymerase von Thermus aquaticus handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein dieser Nukleotidsequenz dadurch nachweist, daß man die Bestandteile der amplifizierten Probe auf einem Gel trennt und das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein einer DNA mit der gleichen Anzahl Nukleotide wie diese Nukleotidsequenz nachweist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis des Vorhandenseins bzw. Nichtvorhandenseins dieser Nukleotidsequenz eine markierte Oligonukleotid-Hybridisierungsprobe, die einer Region dieser Nukleotidsequenz entspricht, zufügt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Oligonukleotidprobe

handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidprobe mit einem ³²P-enthaltenden radioaktiven Marker oder mit einem alkalische Phosphatase enthaltenden Enzymmarker markiert wird.

9. Primerzusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 1, die

umfaßt.

10. Markierte Oligonukleotidprobe zur Verwendung bei einem Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich beim Oligonukleotid

handelt.