EA006975B1 - Способ обнаружения мрнк вируса папилломы человека - Google Patents

Способ обнаружения мрнк вируса папилломы человека Download PDF

Info

Publication number
EA006975B1
EA006975B1 EA200400919A EA200400919A EA006975B1 EA 006975 B1 EA006975 B1 EA 006975B1 EA 200400919 A EA200400919 A EA 200400919A EA 200400919 A EA200400919 A EA 200400919A EA 006975 B1 EA006975 B1 EA 006975B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nru
mrna
expression
primers
screening
Prior art date
Application number
EA200400919A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400919A1 (ru
Inventor
Франк Карльсен
Original Assignee
Норчип А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26246916&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA006975(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0200239A external-priority patent/GB0200239D0/en
Priority claimed from GB0214124A external-priority patent/GB0214124D0/en
Application filed by Норчип А/С filed Critical Норчип А/С
Publication of EA200400919A1 publication Critical patent/EA200400919A1/ru
Publication of EA006975B1 publication Critical patent/EA006975B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Предоставлен способ in vitro для скрининга женщин для оценки у них риска развития карциномы шейки матки, включающий скрининг субъекта на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена E6 и необязательно L1 вируса папилломы человека, при этом субъектов, положительных по экспрессии мРНК L1 и/или E6, считают подверженными риску развития карциномы шейки матки. Также предоставляют наборы для осуществления таких способов.

Description

Настоящее изобретение относится к способам ίη νίίτο скрининга людей для определения у них риска развития карциномы шейки матки.
Предпосылки изобретения
Карцинома шейки матки представляет собой одно из наиболее распространенных злокачественных заболеваний во всем мире и одну из главных причин заболеваемости и смертности женщин (Раткш ЭМ, Р1каш Р, Рет1ау 1 (1993) Ιηί. 1. Сапсег 54: 594-606; Р1каш Р, Раткш ЭМ, Рет1ау 1 (1993) Ιηί. 1. Сапсег 55: 891903). В 1996 г. в Соединенных Штатах прогнозировано 15700 новых случаев инвазивного рака шейки матки, а Всемирная Организация Здравоохранения оценивает частоту встречаемости заболевания во всем мире как 450000 в год (1990). Ежегодная частота встречаемости заболевания различается в разных частях света, составляя от 7,6 на 100000 в западной Азии до 46,8 на 100000 в южной Африке (Раткш еί а1., 1993 там же).
Современное понимание карциномы шейки матки таково, что она представляет собой многостадийное заболевание, часто развивающееся в течение периода 10-25 лет. Инвазивная плоскоклеточная карцинома шейки матки представлена проникновением через базальную мембрану и прорастанием в строму или в собственную мембрану эпителия. Клиническое течение карциномы шейки матки обнаруживает значительную изменчивость. Прогноз относится к клинической стадии, вовлечению лимфатических узлов, первичной опухолевой массе, гистологическому типу, глубине проникновения и лимфатическому проникновению (Эе1дабо С, еί а1., (1990) Супесо1 Опсо1 38: 352-357). У некоторых пациенток с менее благоприятными характеристиками опухоли наблюдают относительно благоприятный исход, в то время как у других наблюдают летальный исход при изначально ограниченном заболевании. Это показывает очевидную необходимость дополнительных маркеров для дальнейшей характеристики вновь диагностированных карцином шейки матки, чтобы обеспечить соответствующую риску терапию (1кепЬетд Н, еС а1., Ιώ. 1. Сапсег 59: 322-6, 1994).
Эпидемиологические исследования карциномы шейки матки показали сильную ассоциацию с религиозными, матримониальными и сексуальными параметрами. Почти в 100 исследованных случаях изучали связь между НРУ и неоплазией шейки матки и почти во всех обнаружили положительные ассоциации (1АВС топодгарбк, 1995). Ассоциация является сильной, устойчивой и специфичной для ограниченного числа типов вируса (Мипох Ν, Воксб ЕХ (1992) НРУ апб сетса1 пеор1аба: ге\зе\\' о£ саке-соп(го1 апб собой к(иб1ек. 1АВС 8с1 РиЬ1 251-261). В наиболее информативных исследованиях с поразительным постоянством для инвазивной злокачественной опухоли и выраженных очагов повреждения ί,ΊΝ наблюдали сильные ассоциации с ДНК НРУ 16, исключая возможность того, что данную ассоциацию можно объяснить случайностью, отклонением или смешиванием (1АКС топодгарбк, 1995). Косвенное доказательство позволяло предположить, что ДНК НРУ, обнаруженная в опухолевых клетках, представляет собой хороший маркер роли инфекции НРУ на ранних стадиях канцерогенеза. Между увеличением вирусной нагрузки и риском карциномы шейки матки показана зависимость доза-эффект (Мипох апб Воксб, 1992 там же). В некоторых больших сериях до 100% опухолей являлись положительными на наличие НРУ, однако, можно еще обсуждать существование карцином шейки матки без наличия вируса (Меует С1, еί а1., (1992) Эе(ес(юп о£ битап рарШопипашк ш сетса1 ксгарек Ьу (Не ро1утегаке сбаш геасбоп ш ге1а(1оп (о су(о1оду: рокк1Ь1е трбсабопк £от сетса1 сапсег кстеепшд. 1АК.С 8с1 РиЬ1 271-281; Эак ВС, е( а1., (1993) Сапсег 72: 147-153).
Наиболее часто встречающиеся типы НРУ, найденные в плоскоклеточных карциномах шейки матки, представляют собой НРУ 16 (41-86%) и 18 (2-22%). Кроме того, также обнаружены НРУ 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 66 и 68 (1АВС, топодгарбк, 1995). На Международной конференции в Барселоне НРУ2000 НРУ 16, 18, 31 и 45 определили как НРУ высокого риска, тогда как НРУ 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, 61, 68 определили как НРУ промежуточного риска (Кеей1 У. 8НаН. Р71). 13 НРУ высокого риска и НРУ промежуточного риска вместе часто обозначают как ассоциированные с раком типы НРУ.
В ряде исследований анализировали потенциальную роль тестирования НРУ в скрининге шейки матки (см. Сих1ск е( а1. А кук(етабс ге\ае\\· о£ (бе го1е о£ Нитап рарШопкиагик (екбпд \νί(1ι6ι а сетса1 кстеепшд ргодгатте. Неа1(б Тесбпо1 Аккекк 3:14, 1999).
Ве1б е( а1. (Ке1б В, е( а1., (1991) Ат 1 ОЬк(е( Супесо1 164: 1461-1469) первыми показали роль тестирования НРУ в контексте скрининга. Данное исследование проводили в группе женщин с высоким риском, из клиник для передающихся половым путем заболеваний и специалистов-гинекологов, а для выявления НРУ применяли чувствительную (с низкой жесткостью) блот-гибридизацию по Саузерну. Всего в список вошли 1012 женщин, а цервикографию рассматривали также как возможное дополнение к цитологическому обследованию. Всего обнаружили двадцать три повреждения ί,ΊΝ ΙΙ/ΙΙΙ, но только 12 выявили посредством цитологического обследования (чувствительность 52%, специфичность 92%). 16 выраженных очагов повреждения выявили посредством тестирования НРУ.
Ваиег е( а1. (Ваиег НМ, е( а1., (1991) 1АМА 265: 472-477) опубликовали основанное на ПЦР исследование на ранних стадиях, с применением праймеров МУ09/11 (Мапок М, е( а1., (1990) Ьапсе( 335: 734) среди молодых женщин, проходящих процедуру стандартного мазка (студентки колледжа). Среди 467
- 1 006975 женщин авторы обнаружили долю с положительными результатами в размере 46%, что гораздо выше, чем для анализа дот-блот (11%).
В исследовании с применением ПЦР с праймерами 6Р5/6 (Уап Ьеп Вги1е Ай, ей а1., (1990) й С1ш ΜίетоЫой 28: 2739-2743) уап беп Вги1е ей а1. (Уап Пеп Вги1е Ай, ей а1., (1991) 1пй. й. Сапсег 48: 404-408) показали очень сильную корреляцию наличия НРУ с неоплазией шейки матки, определенной посредством цитологического обследования. У более старших женщин (в возрасте 35-55 лет) с отрицательными результатами цитологического обследования процент наличия НРУ составлял всего 3,5%, и данная величина уменьшалась до 1,5%, если рассматривали только типы 16, 18, 31 и 33, в то время как все женщины с гистологической карциномой ш 81йи, оказались НРУ-положительными, а у 90% обнаружили один из четырех указанных выше типов. Женщины с менее серьезными цитологическими аномалиями обладают меньшими долями носительства НРУ градуальным путем, демонстрируя четкую тенденцию.
Коба Ноиктап ей а1. (Коба Ноиктап АМ, ей а1., (1994) 1пй й Сапсег 56: 802-806) расширили данные исследования посредством наблюдения еще за 1373 женщинами с аномальными мазками. Данное исследование также подтвердило возрастание положительной доли с увеличением тяжести результатов мазка. Авторы также обнаружили, что уровень гетерогенности НРУ уменьшался с 22 типов для мазков с невыраженными изменениями до десяти типов повышенного риска для мазков с выраженными изменениями. В данную статью не включали женщин с отрицательными цитологическими результатами, а также цитологическое заболевание не подтверждали гистологически.
Стиск ей а1. (Стиск й, ей а1., (1992) Ьапсей 340: 112-113; Стиск й ей а1., (1994) Вг й Сапсег 69: 167-171) первыми сообщили, что тестирование НРУ предоставляет полезную информацию для сортировки цитологических аномалий, обнаруженных в ходе случайного скрининга. В исследовании 133 женщин, направленных на кольпоскопию, авторы обнаружили степень положительного предсказания в размере 42%, сходную с соответствующей величиной для умеренного дискариоза. Наиболее убедительными данные результаты являлись для НРУ 16, где при биопсии обнаружили, что 39 из 42 женщин с носительством НРУ 16 обладают выраженной ί.ΊΝ. Данное исследование указывает на важность определения вирусной нагрузки и принимает за положительные только высокие уровни типов высокого риска.
Сох ей а1. (Сох ЙТ, ей а1., (1995) Ат й ОЬкйей 6упесо1 172: 946-954) показали значение тестирования НРУ с применением системы НуЬтйб Сарйиге™ (ΌΙ6ΕΝΕ Сотротаййоп, байййеткЬигд, ΜΌ, И8А) для установления очередности медицинской помощи женщинам с пограничными результатами мазков. Данный тест проводили для 217 таких женщин из справочной службы колледжей, и для ί,ΊΝΙΙ/ΙΙΙ обнаружили чувствительность в размере 93% по сравнению с 73% для повторного цитологического обследования. Показали, что высокая вирусная нагрузка дополнительно улучшает эффективность посредством уменьшения ложноположительных результатов. Когда в качестве уровня отсечения принимали 5 КЬИ, обнаруживали РРУ приблизительно в размере 24% без потери чувствительности.
Снхюк ей а1. (ίτιζίΐ; й, ей а1., (1995) Ьапсей 345: 1533-1536) оценили тестирование НРУ в контексте первичного скрининга среди 1985 женщин, проходящих стандартный скрининг в клинике планирования семьи. Чувствительность с применением типоспецифичной ПЦР для четырех наиболее распространенных типов НРУ (75%) превышала чувствительность цитологического обследования (46%), а РРУ для положительного теста на НРУ (42%) являлось сходным со значением для умеренного дискариоза (43%).
В \УО 91/08312 описаны способы определения прогноза для инфицированных НРУ индивидов, которые включают измерение уровня активности НРУ посредством определения в образце транскриптов полноразмерных генов НРУ Е6 и/или Е7 или их частей и сравнение измерений активности НРУ с предварительно установленной взаимосвязью между активностью и риском развития до тяжелой дисплазии шейки матки или карциномы.
В \УО 99/29890 описаны способы определения инфекции НРУ, основанные на измерении и анализе уровней экспрессии генов. В частности, в \УО 99/29890 описаны способы, которые основаны на измерении уровней экспрессии двух или более генов НРУ (например, НРУ Е6, Е7, Ь1 и Е2) и последующем сравнении отношения экспрессии сочетаний данных генов для указания на стадию вызванного НРУ заболевания у пациентки.
Авторы настоящего изобретения определили, что возможно получить клинически применимое определение заболевания, ассоциированного с НРУ, основанное только на простом положительном/отрицательном определении экспрессии транскриптов мРНК Ь1 и Е6 НРУ, без необходимости точных количественных измерений уровней экспрессии или определения различий уровней экспрессии двух транскриптов. Данный способ технически прост и в предпочтительном осуществлении подлежит автоматизации в формате от средней до высокой производительности. Кроме того, на основании результатов, полученных с применением способа по изобретению, авторы изобретения определили новую схему классификации пациенток на основании риска развития карциномы шейки матки, которая связана с соответствующими заболеванию молекулярными изменениями в характере экспрессии генов НРУ и не зависит от классификации Сй№
Следовательно, в первом аспекте, изобретение относится к способу ш уййто скрининга людей, для определения риска развития у них карциномы шейки матки, который включает скрининг на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Ь1 и гена Ε6 вируса папилломы человека, где субъектов с наличием
- 2 006975 экспрессии полноразмерной мРНК Ь1 и/или Е6 считают подверженными риску развития карциномы шейки матки.
Признаком положительных результатов скрининга в способе по изобретению служит выраженная экспрессия мРНК Ь1 и/или мРНК Е6 в клетках шейки матки. Наличие экспрессии либо одной из данных мРНК, либо обеих мРНК принимают за показатель того, что субъект подвержен риску развития карциномы шейки матки. Женщины, у которых экспрессируется мРНК Е6, подвержены высокому риску развития клеточных изменений, так как онкогенные Е6 и Е7 связываются с регулирующими клеточный цикл белками и действуют как переключатель пролиферации клеток. Отчетливая экспрессия мРНК Е6 представляет прямое указание на изменения клеток шейки матки. Экспрессия мРНК Ь1 в присутствии или в отсутствие экспрессии мРНК Е6 также указывает на присутствие активного НРУ.
В более широком контексте скрининга шейки матки, женщин, идентифицированных как положительных на наличие экспрессии мРНК Ь1 и/или мРНК Е6, можно выбрать для дальнейшего исследования, например, с применением цитологического обследования. Так, на первом уровне способ по настоящему изобретению может относиться к технически простым способам предварительного скрининга популяции женщин для идентификации НРУ-положительных субъектов, которых можно выбирать для дальнейшего исследования.
В конкретном осуществлении способ по изобретению можно применять для классификации субъектов по четырем различным классам риска развития карциномы шейки матки на основании положительной/отрицательной оценки экспрессии мРНК Ь1 и Е6.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу ίη νίίτο скрининга людей для оценки риска развития у них карциномы шейки матки, который включает скрининг субъектов на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Ь1 НРУ и транскриптов мРНК гена Е6 НРУ, и классификацию субъектов в одну из четырех категорий риска развития карциномы шейки матки на основании экспрессии мРНК Ь1 и/или Е6 согласно следующей классификации:
Категория риска 1: субъекты с отсутствием экспрессии мРНК Ь1, но с наличием экспрессии мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 или 68. Таких индивидов с наличием экспрессии мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 16, 18, 31 или 33 считают подверженными более высокому риску, например, по сравнению с индивидами с отсутствием данных типов, но с наличием экспрессии мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 или 68.
Категория риска 2: субъекты, с наличием экспрессии мРНК Ь1 и с наличием экспрессии мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 или 68. Индивидов с наличием экспрессии мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 16, 18, 31 или 33 считают подверженными более высокому риску, например, по сравнению с индивидами с отсутствием данных типов, но с наличием экспрессии мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 или 68.
Категория риска 3: субъекты, с наличием экспрессии мРНК Ь1, но с отсутствием экспрессии мРНК Е6 ассоциированных с раком типов НРУ (например, с отсутствием экспрессии мРНК Е6 НРУ типов 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 и 68).
Категория риска 4: субъекты с отсутствием экспрессии мРНК Ь1 и с отсутствием экспрессии мРНК Е6.
В предпочтительном осуществлении наличие экспрессии определяют по присутствию более чем 50 копий транскрипта на мл (или общий объем образца), а отсутствие экспрессии определяют при наличии менее чем 1 копии транскрипта на мл (или общий объем образца).
Приведенная выше классификация основана на молекулярных событиях, значимых для риска развития карциномы шейки матки и независимых от статуса ΟΙΝ субъектов. Таким образом, данный способ классификации может предоставить альтернативу применения цитологического обследования в стандартном скрининге женщин для идентификации подверженных потенциальному риску развития карциномы шейки матки. Способ также можно применять как дополнение к цитологическому обследованию, например, как подтверждающий тест для подтверждения оценки риска, полученной на основании цитологического обследования.
Женщины с наличием экспрессии, связанных с высоким риском мРНК Е6 НРУ одного из типов 16, 18, 31 или 33, но с отсутствием экспрессии Ь1, подвержены наивысшему уровню риска развития серьезных изменений клеток и клеточных аномалий. Это является следствием того факта, что отрицательный результат экспрессии мРНК Ь1 непосредственно указывает на интегрированный НРУ и, следовательно, на более высокую вероятность высокой и постоянной экспрессии Е6 и Е7. Интеграция вируса в геном человека также напрямую влияет на стабильность клеток. Интеграция НРУ также уменьшает возможность регрессии клеточных изменений.
У женщин с наличием экспрессии мРНК Е6 НРУ одного из типов 16, 18, 31 или 33 и с наличием экспрессии мРНК Ь1 присутствует экспрессия НРУ высокого риска и все еще сохраняется возможность того, что НРУ интегрирован. Однако риск у таких женщин не классифицируют как такой высокий,
- 3 006975 как у женщин с отсутствием Ь1 и с присутствием Е6, так как существует приемлемая вероятность того, что у них нет интегрированного НРУ.
Женщин с отсутствием экспрессии мРНК Е6 НРУ типов 16, 18, 31 или 33, но с наличием экспрессии мРНК Е6 других типов НРУ, например, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 и 68, все еще рассматривают как с риском и, следовательно, их можно поместить в категории риска 1 или 2 (как определено выше), в зависимости от того, присутствует или отсутствует у них экспрессия мРНК Ь1.
Женщин с наличием экспрессии мРНК Ь1, но с отсутствием мРНК Е6 считают подверженными умеренному риску. В образце могут присутствовать типы НРУ высокого риска, а экспрессия Ь1 свидетельствует о литической активности. Могут присутствовать также интегрированные типы НРУ, но только тех вирусов, которые являются редкими. Однако определение литической активности может указывать на то, что в клетках вскоре могут произойти некоторые изменения.
В более широком контексте скрининга шейки матки способ по изобретению можно применять для классификации женщин по риску развития карциномы шейки матки и, таким образом, предоставлять основание для решений относительно лечения и/или дополнительного скрининга. В качестве примера женщин из категории риска 1, особенно тех, для которых показано наличие экспрессии мРНК Е6 НРУ по меньшей мере одного из типов 16, 18, 31 или 33, можно идентифицировать как требующих немедленного вмешательства, что означает конизацию или кольпоскопию, включая биопсию или гистологическое обследование.
Женщин из категории риска 2, как определено выше, можно считать требующими немедленного внимания, что означает только кольпоскопию или кольпоскопию, включающую биопсию и гистологическое обследование.
Женщин из категории риска 3, как определено выше, можно считать требующими немедленного повторного тестирования, что означает повторный вызов для дополнительного теста экспрессии НРУ, немедленно или после относительно короткого интервала, например шести месяцев.
Женщин из категории риска 4, как определено выше, можно снова включить в программу скрининга для повторного тестирования экспрессии НРУ.
В дополнительном осуществлении изобретение относится к способу ίη νίίτο скрининга людей на присутствие интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ, который включает скрининг субъектов на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Ь1 и гена Е6 вируса папилломы человека, где субъектов с отсутствием экспрессии мРНК Ь1, но с наличием экспрессии мРНК Е6 считают несущими интегрированный НРУ.
Термин интегрированный НРУ относится к геному НРУ, интегрированному в геном человека.
Термин модифицированный эписомальный геном НРУ принимают для обозначения генома НРУ, который сохраняется в клетке человека в виде эписомы, то есть не интегрирует в геном человека и который по сравнению с эквивалентным геномом НРУ дикого типа несет модификацию, приводящую к конститутивной или постоянной экспрессии транскриптов генов Е6 и/или Е7. Модификация в основном означает делецию, мультимеризацию или конкатемеризацию эписомы, перестройку эписомы и т. д., влияющие на регуляцию экспрессии Е6/Е7.
Как указано выше, присутствие интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ, показывают отрицательным результатом экспрессии мРНК Ь1, совместно с положительным результатом экспрессии мРНК Е6 в клетках шейки матки. Следовательно, возможность прогнозировать присутствие интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ в данном анализе серьезно зависит от возможности оценки отрицательного результата экспрессии мРНК Ь1. Это требует способа детекции с максимальной чувствительностью, кроме того дающего минимальные ложноотрицательные результаты. В предпочтительном осуществлении для отбора на присутствие или отсутствие мРНК Ь1 этого добиваются посредством применения чувствительного способа амплификации и детекции в реальном времени. Наиболее предпочтительным способом является амплификация ΝΆ8ΒΆ в реальном времени с применением зондов в виде молекулярных беконов, как описано у Ьеопе с1 а1., Νιιοίοίο Άοίάδ Векеагсй., 1998, Уо1 26, 2150-2155. Благодаря чувствительности данного способа появление ложноотрицательных результатов сведено к минимуму, а результат отсутствие экспрессии Ь1 можно принимать с большей уверенностью.
В дополнительном осуществлении способ скрининга людей на присутствие интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ может основываться на скрининге на наличие экспрессии только мРНК Е6. Таким образом, изобретение относится к способу ίη νίίτο скрининга людей на присутствие интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ, включающего скрининг субъекта на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Е6 вируса папилломы человека, где субъектов с наличием экспрессии мРНК Е6 считают несущими интегрированный НРУ или модифицированный эписомальный геном НРУ.
Кроме того, индивидов можно распределять в одну из двух категорий риска развития карциномы шейки матки, основываясь на определении есть/нет экспрессии только мРНК Е6. Следовательно, изобретение относится к способу ίη νίίτο скрининга людей для оценки риска развития у них карциномы шейки матки, который включает скрининг субъекта на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Е6
- 4 006975
НРУ и распределение субъекта в одну из двух категорий риска развития карциномы шейки матки на основании экспрессии мРНК Е6, где индивидов, с наличием экспрессии мРНК Е6, считают несущими интегрированный НРУ или модифицированный эписомальный геном НРУ и, следовательно, классифицируют как группу высокого риска развития карциномы шейки матки, тогда как индивидов с отсутствием экспрессии мРНК Е6 считают не несущими интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ и, следовательно, классифицируют как группу невыявляемого риска развития карциномы шейки матки.
Индивидов распределяют в одну из двух категорий риска развития карциномы шейки матки, основываясь на определении есть/нет экспрессии мРНК Е6 в клетках шейки матки. Индивидов с наличием экспрессии мРНК Е6 считают несущими интегрированный НРУ или модифицированный эписомальный геном НРУ и, следовательно, классифицируют как группу высокого риска развития карциномы шейки матки, тогда как индивидов с отсутствием экспрессии мРНК Е6 считают не несущими интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ и, следовательно, классифицируют как группу невыявляемого риска развития карциномы шейки матки.
В контексте скрининга шейки матки классификация субъектов на две группы с высоким риском или невыявляемым риском развития карциномы шейки матки предоставляет основание для решений относительно лечения и/или дополнительного скрининга. Например, субъектов из категории высокого риска можно считать требующими незамедлительного дальнейшего анализа, например, посредством гистологической кольпоскопии, тогда как субъектов из категории невыявляемого риска можно направлять обратно в программу скрининга с трех- или пятилетними интервалами. Данные способы особенно пригодны для оценки риска развития карциномы у субъектов, для которых известно, что они инфицированы НРУ, например, пациенток, положительно тестирующихся на ДНК НРУ или субъектов, для которых ранее выявляли аномалии шейки матки по результатам цитологического обследования или теста по Папаниколау. У субъектов, распределенных в категорию невыявляемого риска на основании экспрессии мРНК Е6, может присутствовать ДНК НРУ, однако, отрицательный результат экспрессии Е6 показывает, что на момент тестирования НРУ не связан с онкогенной активностью.
Присутствие интегрированного НРУ или модифицированного эписомального генома НРУ, показанное по положительному результату экспрессии мРНК Е6, само по себе указывает на наличие у субъекта аномальных клеточных изменений в шейке матки. Следовательно, изобретение также относится к способу ίη νίίτο идентификации людей с аномальными клеточными изменениями в шейке матки, который включает скрининг субъекта на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Е6 НРУ, где индивидов, с наличием экспрессии мРНК Е6, идентифицируют как индивидов с аномальными клеточными изменениями в шейке матки.
Термин аномальные клеточные изменения в шейке матки включает клеточные изменения, которые являются характеристикой более тяжелого заболевания, чем невыраженные повреждения в шейке матки или плоскоклеточные интраэпителиальные повреждения с низкой степенью злокачественности, включает клеточные изменения, характерные для заболеваний равной или большей тяжести, чем выраженная СГЫ (определяемая как неопластическая экспансия трансформированных клеток), СГЫ (интраэпителиальная неоплазия шейки матки) III или плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия с высокой степенью злокачественности (Н81Ь), включающая повреждения с полиплоидным профилем ДНК и злокачественные повреждения СГЫ с повышенным средним значением индекса ДНК, высоким процентом анеуплоидии ДНК и коэффициентами превышения в 2,5 раза (Напзе1ааг с1 а1., 1992, Апа1 Се11 РаШоС 4:315-324; КП1е1 еί а1., 1996, I. С11п Ра11ю1 49:892-896 и МеОегтой еί а1., 1997, Вг. I. 0Ьз1е1 6упаеео1. 104:623-625).
Интраэпителиальная неоплазия шейки матки (сокращенно СГЫ), называемая также дисплазией шейки матки, представляет собой состояние шейки матки, вызываемое вирусом папилломы человека. СГЫ классифицируют как I, II или III в зависимости от тяжести. Данное состояние считают предраковой аномалией, однако, не раком как таковым. Наиболее мягкая форма, ί,ΊΝ I, обычно исчезает самопроизвольно, хотя в редких случаях может прогрессировать до рака. Две более тяжелые формы, ί,ΊΝ II и ΟΝ III, чаще всего с течением времени не изменяются или ухудшаются. Они могут становиться раком, однако, при адекватном лечении этого почти никогда не происходит.
НРУ идентифицировали как причину развития клеточных изменений в шейке матки, которые могут приводить к развитию карциномы шейки матки. Данные клеточные изменения ассоциированы с конститутивной или постоянной экспрессией белков Е6/Е7 из генома вируса НРУ. Таким образом, можно заключить, что у субъектов, у которых можно обнаружить экспрессию мРНК Е6, особенно у тех субъектов, у которых обнаруживают постоянную экспрессию Е6 при оценке в течение периода времени, уже проявляются клеточные изменения в шейке матки. Данные изменения могут происходить только в очень немногих клетках шейки матки, и их невозможно выявить посредством обычного цитологического обследования. Тем не менее, с применением чувствительных, специфичных и точных методов детекции мРНК Е6 возможно идентифицировать тех субъектов, у которых уже происходят клеточные изменения в шейке матки, на более ранней стадии, чем это возможно с применением обычного цитологического скрининга.
- 5 006975
Это может позволить более ранние терапевтические вмешательства с целью предотвратить развитие карциномы шейки матки.
В результате интеграции НРУ в геном человека или в результате модификации в модифицированном эписомальном геноме НРУ утрачен нормальный контроль транскрипции вирусного онкогена Е6/Е7 (1)игк1 е! а1., 1985, 1 беи У1го1, 66 (Р! 7): 1515-1522; Ра1ег аиб Ра1ег, 1985 Упо1оду 145:313-318; Бс11\\'агх е! а1., 1985, Ыа1иге 314: 111-114; Рагк е! а1., 1997, там же). Напротив, в предзлокачественных повреждениях и инфицированном НРУ нормальном эпителии преобладают вирусы папилломы в немодифицированных эписомальных формах, следовательно, транскрипция онкогена (Е6/Е7) может отсутствовать или подвергаться эффективной регуляции в сторону снижения Цойикои е! а1., 1990, 1 Сей У1го1, 71 (Р! 7): 1473-1479; Еа1сшеШ е! а1., 1993, 1 Меб У1го1, 40: 261-265). Показано, что интеграция ДНК вируса папилломы человека типа 16 в геном человека приводит к более нестабильной клеточной активности/геному и увеличенной стабильности мРНК Е6 и Е7 (1еои аиб ЬатЬей, 1995, Ргос №111 Асаб Бс1 ИБА 92: 1654-1658) . Таким образом, оказалось, что интеграция НРУ, обычно выявляемая в злокачественных опухолях шейки матки, но только нечасто выявляемая в очагах повреждения ΟΙΝ (Сагтобу е! а1., 1996, Мо1 Се11 РгоЬек, 10: 107-116), представляет собой важное событие в канцерогенезе шейки матки.
Способы по настоящему изобретению обнаруживают экспрессию вирусной мРНК Е6/Е7 в шейке матки вместо ДНК. Экспрессия вирусных Е6/Е7 в клетках шейки матки представляет собой гораздо более точное определение риска развития рака, чем простое выявление присутствия вируса. Более того, обнаружение транскриптов онкогенов НРУ может представлять собой более чувствительный индикатор прямого участия вирусных онкогенов в канцерогенезе (Воке е! а1., 1994, Суиесо1 Оисо1, 52: 212-217; Воке е! а1., 1995, Суиесо1 Оисо1, 56: 239-244). Обнаружение транскриптов Е6/Е7 посредством амплификации и детекции представляет собой пригодный для определений рисков в отношении развития ΟΙΝ и ее дальнейшего развития в опухоль шейки матки диагностический инструмент, особенно у пациенток, инфицированных НРУ типов высокого риска с АБСИБ и ΟΙΝ I (Бо!1аг е! а1., 1998, Суиесо1 Оисо1, 69: 114-121; Бейика е! а1., 1998, ЬаЬ 1иуек!, 78: 9-18).
Экспрессия транскриптов Е6/Е7 НРУ-16/18 является равнокоррелированной с физическим статусом ДНК НРУ (Рагк е! а1., 1997, Супесо1 Оисо1, Уо1: 65(1), 121-9). В большинстве клеток карциномы шейки матки гены Е6 и Е7 специфичных вирусов папилломы человека транскрибируются с вирусных последовательностей, интегрированных в хромосомы клетки-хозяина (уои К1еЬеи ЭоеЬегЦх е! а1., 1991, Ргос Ν!1 Асаб Бс1 ИБА. Уо1: 88(4), 1411-5). В большой серии повреждений ΟΙΝ определяли вирусную нагрузку и интеграцию вируса (Р1е!каго е! а1., 2002, 1 С1ш МюгоЬю1, Уо1: 40(3), 886-91). Только один образец содержал исключительно эписомальную ДНК НРУ16, а данный очаг повреждения спонтанно регрессировал. Семнадцать из 37 образцов инвазивной карциномы шейки матки, посредством ПЦР, охватывающей полный ген Е1/Е2, предварительно идентифицировали как содержащие полностью интегрированный геном НРУ16, а в 16 случаях данный факт подтвердили посредством г11РСВ. Однако в одном случае обнаружили низкий уровень эписомальной дезоксирибонуклеиновой кислоты в добавление к доминирующей интегрированной форме. Из оставшихся 20 образцов карциномы, для которых наличие эписомальных форм показали при предыдущем анализе, в 14 обнаружили наличие интегрированных форм с применением г11РСВ, а четыре содержали мультимерные (модифицированные) эписомальные формы. Таким образом, в итоге, в 31 из 37 карцином (84%) выявили интегрированный геном НРУ16, в то время как обнаружить отсутствие интеграции не удалось. (Ка1аи1аг1 е! а1., 2001, Э|ади Мо1 Ра!йо1, Уо1: 10(1), 46-54).
Фактически нет наблюдений, что существуют клетки карциномы шейки матки без интегрированного НРУ или модифицированной эписомальной ДНК НРУ (Ка1аи!аг1 е! а1., 2001; Р1е!каго е! а1., 2002, там же) . В дальнейшем показали, что Е6 и Е7 могут транскрибироваться только с интегрированной или модифицированной эписомальной ДНК НРУ (уои К1еЬеи ЭоеЬегЦх е! а1., 1991, там же). Таким образом, авторы настоящего изобретения предполагают, что обнаружение экспрессии Е6/Е7 обеспечивает непосредственное выявление интегрированного НРУ или модифицированного эписомального НРУ и высокой онкогенной активности, и заключают, что в клиническом контексте обнаружения только экспрессии Е6 (Е6/Е7) достаточно для выявления субъектов с высоким риском развития карциномы шейки матки. Иными словами, если в образце из шейки матки можно обнаружить экспрессию мРНК Е6/Е7, это напрямую указывает на клеточные аномалии в шейке матки, и существует очень высокий риск развития рака шейки матки, обусловленный постоянной активностью онкогена НРУ. Таким образом, обнаружение у человека мРНК Е6/Е7 означает, что у данного субъекта очень высоко риск развития карциномы шейки матки, и он подлежит безотлагательному дальнейшему скринингу, например, посредством кольпоскопии.
Если экспрессии мРНК Е6/Е7 не обнаруживают, у субъекта, тем не менее, может присутствовать инфекция НРУ. Однако из-за отсутствия интеграции и активности онкогена инфекция может спонтанно регрессировать (как наблюдали Р1е!каго е! а1., 2002, там же).
В клиническом контексте эффективность способов, зависящих от скрининга на наличие экспрессии только мРНК Е6, серьезно зависит от возможности с уверенностью принимать отрицательный результат экспрессии мРНК Е6. Это снова требует способа детекции, обладающего максимальной чувствительностью, кроме того, дающего минимальные ложноотрицательные результаты. В предпочтительном осуще
- 6 006975 ствлении этого достигают применением чувствительного способа амплификации и детекции в реальном времени, чтобы вести отбор по присутствию или отсутствию мРНК Е6. Наиболее предпочтительным способом является амплификация ΝΛ8ΒΛ в реальном времени с применением зондов в виде молекулярных беконов, как описано у Ьеоие с1 а1., Νυοίοίο Аайк Векеатсй., 1998, Уо1 26, 2150-2155. Благодаря чувствительности данного способа появление ложноотрицательных результатов сведено к минимуму, а результат отсутствие экспрессии Е6 можно принимать с большей уверенностью. Это необычайно важно, если анализы необходимо использовать в контексте клинической программы скрининга.
В способах, основанных на определении одной мРНК Е6, является предпочтительным выявлять, по меньшей мере, НРУ типов 16, 18, 31, 33 и 45, а в предпочтительном осуществлении анализ может определять только данные типы НРУ. ДНК НРУ типов 16, 18, 31 и 33 обнаруживали более чем в 87% образцов карциномы шейки матки (Каткеп е1 а1., 1996, 1 С1ш М1стоЫо1, 34:2095-2100). В других исследованиях показали, что Е6 и Е7 почти неизменно сохраняются при раке шейки матки, так что их экспрессия, вероятно, необходима для перехода к злокачественному состоянию и его поддержания (СЕоо е1 а1., 1987, 1 Мей У1го1 21:101-107; Эитк! е1 а1., 1995, Сапсег Сеие1 СуЮдепек 85:105-112). В отличие от систем обнаружения НРУ, основанных на определении неповрежденного генома или последовательности гена Ь1, обнаружение мРНК НРУ, экспрессированной с области Е6/Е7, может выявить более чем 90% пациенток, непосредственно связанных с риском развития карциномы шейки матки.
В клинике, способы, основанные на обнаружении мРНК Е6, предпочтительнее для применения после скрининга, то есть для дальнейшего анализа индивидов с предварительным диагнозом А8СИ8, ί,ΊΝ I или кондилома. Способ можно применять для отбора индивидов с высоким риском развития карциномы шейки матки среди группы индивидов с предварительным диагнозом А8СИ8, ΟΝ I или кондилома. А8СИ8, кондилому и ί,ΊΝ I можно определить как более или менее одинаковый диагноз из-за очень низкой воспроизводимости между разными цитологами и разными цитологическими отделениями. ОЧог (1п1 1. Суп Ра111. 12:186-192, 1993) обнаружил, что приблизительно только 1% случаев ΕΊΝ I могут прогрессировать до карциномы шейки матки. Таким образом, существует реальная необходимость в эффективном способе идентификации подгруппы индивидов с А8СИ8, кондиломой или ΤΊΝ I, со значительным риском развития карциномы шейки матки. В исследовании Каткеп е1 а1., 1996 в 87% случаев карциномы шейки матки обнаружили НРУ одного из типов 16, 18, 31 или 33. При включении сюда НРУ 45 для приблизительно 90% образцов карциномы шейки матки обнаружена связь с данными пятью типами НРУ.
Следовательно, рассчитывая по данным, предоставленным ОЧог (Би 1. Суп Ра111. 12:186-192. 1993), более чем 99,9% пропущенных случаев А8СИ8, ΟΊΝ I и кондиломы, выявляют с применением набора авторов настоящего изобретения НРУ-РгооГег.
В способе по изобретению наличие экспрессии мРНК принимают для обозначения экспрессии выше фонового уровня. Не существует абсолютной необходимости точного количественного определения уровня экспрессии мРНК или для точного определения относительных уровней экспрессии мРНК Ь1 и Е6.
В некоторых осуществлениях способы по изобретению могут включать количественное определение уровней экспрессии мРНК. В предпочтительном осуществлении для обеспечения четкого разделения между наличием экспрессии и отсутствием экспрессии, определение наличия экспрессии может требовать присутствия более чем 50 копий соответствующей мРНК (на мл образца или на общий объем образца), в то время как определение отсутствия экспрессии может требовать присутствия менее чем 1 копии соответствующей мРНК (на мл образца или на общий объем образца).
Способы по изобретению предпочтительно включают скрининг мРНК Е6 с применением способа, обеспечивающего специфичное определение мРНК, ассоциированных с раком типов НРУ, более предпочтительно ассоциированных с раком типов НРУ с «высоким риском». В наиболее предпочтительном осуществлении способы включают скрининг мРНК Е6 с применением способа, обеспечивающего определение мРНК Е6 НРУ типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также 45. Наиболее предпочтительно, чтобы способ специфично обнаруживал экспрессию мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 16, 18, 31, 33 и предпочтительно также 45, а наиболее предпочтительно - все пять типов. Однако женщины с наличием экспрессии Е6 типов, отличных от 16, 18, 31, 33 и 45, например, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 все еще могут обладать риском развития карциномы шейки матки. Таким образом, способ может включать скрининг на наличие экспрессии мРНК Е6 одного или более данных типов НРУ, наиболее предпочтительно в дополнение к скринингу мРНК Е6 НРУ типов 16, 18, 31, 33 и 45. Отдельные типы НРУ проявляют заметное географическое/популяционное распределение. Следовательно, целесообразным может представлять собой включение праймеров, специфичных для типа НРУ, для которого известно преобладание в тестируемой популяции/географической области, например, в дополнение к скринингу НРУ типов 16, 18, 31, 33 и 45.
Во избежание неопределенности, если не указано иначе, термин мРНК Е6, как применяют здесь, включает все природные транскрипты мРНК, содержащие целую открытую рамку считывания Е6 или ее часть, включающие природные варианты сплайсинга, и, следовательно, включает транскрипты, дополнительно содержащие целую открытую рамку считывания Е7 или ее часть (и более того, дополнительные открытые рамки считывания). Термины мРНК Е6/Е7, транскрипты Е6/Е7 и т.д. применяются как
- 7 006975 взаимозаменяемые с терминами мРНК Е6, транскрипты Е6, а также включают природные транскрипты мРНК, содержащие целую открытую рамку считывания Е6 или ее часть, включающую природные варианты сплайсинга, и транскрипты, содержащие целую открытую рамку считывания Е7 или ее часть. Термин экспрессия онкогена, если не указано иначе, также относится к природным транскриптам мРНК, содержащим целую открытую рамку считывания Е6 или ее часть, включающим природные варианты сплайсинга, и транскрипты, содержащие целую открытую рамку считывания Е7 или ее часть.
В клетках, инфицированных НРУ 16, к настоящему времени описали четыре вида мРНК Е6/Е7, то есть не подвергающийся сплайсингу транскрипт Е6 и три образованные в результате сплайсинга транскрипта, названные Е6*1, Е6*11 и Е6*111 (8то1кш Ό, е! а1., 1 νίτοί. 1989 Маг 63 (3): 1441-7; 8то1кш Ό \Уе(181еш ΕΘ. Ргос Νι!1 Асаб 8с1 И8А. 1986 1и1 83 (13): 4680-4; ЭоогЬат 1. е! а1., νίΐΌΐοβν. 1990 8ер 178 (1): 25462; Сотпейззеп МТ, е! а1. 1 Сей Уйо1. 1990 Мау 71(Р! 5): 1243-6; 1ойпзоп МА, е! а1. 1 Сей Упо1. 1990 1и1 71(Р! 7): 1473-9; ЗсйпеИет-Маипошу 8, е! а1. 1 Упо1. 1987 Ос! 61(10): 3295-8; 8йегшап Ь, е! а1. Ιη!. 1 Сапсег. 1992 ЕеЬ 50 (3): 356-64). Все четыре транскрипта транскрибируются с одного промотора (р97), расположенного непосредственно «выше» второго АТС ОКЕ Е6.
В одном осуществлении способы могут включать скрининг транскриптов Е6, содержащих целую открытую рамку считывания Е7 или ее часть. Этого можно достичь, например, с применением праймеров или зондов, специфичных для кодирующей области Е7.
В дополнительном осуществлении способы могут включать скрининг на присутствие полноразмерных транскриптов Е6. В случае Η₽ν 16 термин полноразмерные транскрипты Е6 относится к транскриптам, содержащим всю область от нуклеотида (п!) 97 до п! 880 в ОКЕ Е6, включая п! 97 и 880. Положения нуклеотидов пронумерованы согласно стандартной номенклатуре Η₽ν (см. Нитап РарШотау1гиз Сотрепбшт ОпЫпе, доступный в интернет или в бумажном виде из базы данных Ην, Май 8!ор К710, Ьоз А1атоз Ма!юпа1 ЬаЬота!огу, Ьоз А1атоз, ПМ 87545, И8А). Специфичного обнаружения полноразмерных транскриптов можно добиться, например, с применением праймеров или зондов, специфичных для области, присутствующей только в полноразмерных транскриптах Е6, но не в вариантах сплайсинга. Различные типы НРУ проявляют различный характер экспрессии мРНК Е6/Е7. Карты транскрипции для различных типов НРУ, включающих типы 16 и 31, которые можно использовать для облегчения разработки зондов или праймеров для обнаружения транскриптов Е6/Е7, находятся в открытом доступе в Нитап РарШотау1гиз Сотрепбшт (см. выше).
Здесь описаны олигонуклеотидные праймеры для Е6, которые можно применять для амплификации областей мРНК Е6 различных типов НРУ посредством ΝΛ8ΒΛ или ПЦР.
В предпочтительном осуществлении способы, включающие скрининг на наличие экспрессии мРНК Ь1, могут включать скрининг на наличие экспрессии мРНК Ь1 с применением способа, позволяющего определять мРНК Ь1, по существу, всех известных типов НРУ или, по меньшей мере, основных ассоциированных с раком типов НРУ (например, предпочтительно всех НРУ типов 16, 18, 31 и 33) . Здесь описаны праймеры и зонды для Ь1, обеспечивающие определение мРНК Ь1 НРУ типов 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35 и 51 в образцах шейки матки.
Определение транскриптов Ь1 может представлять собой определение вирулентности НРУ, имея в виду присутствие литической активности НРУ. Определение транскриптов Е6/Е7 можно назвать определением патогенеза НРУ, так как экспрессия данных мРНК указывает на молекулярные события, ассоциированные с риском развития карциномы.
При исследовании 4589 женщин с применением способа, основанного на скрининге на наличие экспрессии мРНК Е6 и Ь1 (см. сопроводительные примеры), оказалось возможным определить за исключением одного все случаи повреждений ΟΝ III или рака.
В дополнительных осуществлениях описанные выше способы по изобретению могут включать скрининг на наличие экспрессии транскриптов мРНК человеческого гена р161пк4а, в дополнение к скринингу на наличие экспрессии транскриптов Ь1 и/или Е6 НРУ.
Положительный результат для экспрессии мРНК р161пк4а принимают как дополнительное указание на риск развития карциномы шейки матки.
Р161пк4а и представители родственного семейства могут функционировать путем регуляции фосфорилирования и супрессии увеличения продукта гена ретинобластомы (КВ). В подтверждение этого, обнаружили, что существует обратная зависимость между экспрессией белка р161пк4а и присутствием нормального КВ в выбранных линиях раковых клеток; белок р161пк4а определяют тогда, когда КВ является мутантным, удаленным или инактивированным, и его значительно меньше, или он отсутствует в линиях клеток, содержащих нормальный КВ. КЮГ е! а1. (Кйе1Г 8Ν е! а1., Ргос. N111. Асаб. 8с1. И8А 93:4350-4354. 1996), обнаружили, что белок р161пк4а экспрессирован в клетках карциномы шейки матки человека, содержащих мутантный КВ или функционально инактивированный посредством Е7 КВ дикого типа. Они также показывали, что инактивация КВ коррелирует с повышающей регуляцией р161пк4а, подтверждая обратную связь, вовлекающую р161пк4а и КВ. МИбе-йапдозсй е! а1. (МИбе-йапдозсй К., е! а1. (2001) νίτс1ю\\ъ Атсй 439: 55-61) обнаружили, что существуют значительные корреляции между высокой экспрессией р16 и инфекцией НРУ 16/18, а также между высокой экспрессией р16 и экспрессией онкогенов Е6/Е7 НРУ 16/18. К1аез е! а1. (К1аез К, е! а1., (2001) 1п!. 1. Сапсег 92: 276-284) наблюдали сильно повы
- 8 006975 шенную экспрессию продукта гена р1б1пк4а в 150 из 152 выраженных диспластических очагов повреждения шейки матки (от ΟΙΝ II до инвазивного рака), в то время как нормальный эпителий шейки матки или воспалительные или метапластические повреждения не окрашивались специфичными для р1б1пк4а моноклональными антителами ЕбН4. Для всех очагов повреждения, относящихся к ί,'ΙΝ I, ассоциированных с ЬЯ-НРУ типами, реакционной способности не показали или показали только фокальную или случайную реакционную способность, в то время как все кроме двух повреждений, относящихся к ί,'ΙΝ I, ассоциированных с НЯ-НРУ типами, показали сильное и диффузное окрашивание на р1б1пк4а.
Описанные способы скрининга можно проводить на препарате нуклеиновой кислоты, выделенной из клинического образца или образца биопсии, содержащих клетки шейки матки, полученных у тестируемого субъекта. Подходящие образцы, которые можно применять как источник нуклеиновых кислот, включают (в качестве неограничивающих примеров) мазки из шейки матки, образцы биопсии шейки матки, соскобы из шейки матки, образцы биопсии кожи/бородавок, а также заключенные в парафин ткани и клетки, фиксированные формалином или метанолом.
Препарат нуклеиновой кислоты для скрининга с применением описанных способов должен включать мРНК, однако, он не должен представлять собой препарат очищенной поли А+мРНК, а для реакции ΝΑ8ΒΑ как исходный материал подходят также препараты тотальной РНК или неочищенные препараты тотальной нуклеиновой кислоты, содержащие РНК и геномную ДНК, или даже неочищенные лизаты клеток. По существу, для выделения препарата нуклеиновой кислоты из тестового образца можно использовать любой способ, известный в данной области. Предпочтительный способ представляет собой Воот, описанный в И8-А-5234809 и ЕР-В-0389063. Данный способ, который можно применять для выделения препарата нуклеиновой кислоты, содержащего РНК и ДНК, основан на свойствах нуклеиновой кислоты связываться с частицами диоксида кремния в присутствии вызывающего диссоциацию комплексов средства гуанидинтиоцианата (Οιιδί’Ν).
Способы по изобретению основаны на оценке активной транскрипции генома НРУ в клетках шейки матки. Способы не ограничены в отношении точного способа, применяемого для определения экспрессии мРНК. В данной области известно множество способов определения специфичных последовательно стей мРНК и их можно применять по изобретению. Например, специфичные мРНК можно определять посредством способов гибридизации, амплификации или секвенирования.
Наиболее предпочтительно выявлять экспрессию мРНК посредством способа амплификации, наиболее предпочтительно, изотермической амплификацией, такой как ΝΑ8ΒΑ, опосредованной транскрипцией амплификацией, способом опосредованной сигналом амплификации РНК, изотермической амплификацией в жидкой фазе т.д. Все данные способы хорошо известны в данной области. Наиболее предпочтительно экспрессию мРНК определяют посредством изотермической амплификации в сочетании с определением продукта амплификации в реальном времени. Наиболее предпочтительное сочетание представляет собой амплификацию посредством ΝΑ8ΒΑ, сопряженную с определением продукта амплификации в реальном времени с применением способа с зондами в виде молекулярных беконов, как описано у Ьеопе е1 а1., Νιιοίοίο Αείάδ Яекеагсй, 1998, Уо1 2б, 2150-2155.
Способы для определения НРУ в тестируемом образце с применением способа ΝΑ8ΒΑ как правило включают следующие стадии:
(a) составление реакционной смеси, содержащей подходящие пары праймеров, РНК-зависимую ДНК-полимеразу, рибонуклеазу, гидролизующую цепь РНК гибрида РНК-ДНК без гидролиза одноцепочечной или двухцепочечной РНК или ДНК, РНК-полимеразу, распознающую данный промотор и рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
(b) инкубацию реакционной смеси с препаратом нуклеиновой кислоты, выделенной из тестируемого образца, в котором предполагают наличие НРУ в реакционных условиях, обеспечивающих реакцию амплификации ΝΑ8ΒΑ, и (c) определения и/или количественного измерения любого специфичного для НРУ продукта реакции амплификации ΝΑ8ΒΑ.
Определение специфичного(ых) продукта(ов) реакции ΝΑ8ΒΑ (т.е. смысловых и/или антисмысловых копий РНК-мишени) можно проводить посредством ряда различных путей. В одном подходе продукт(ы) ΝΑ8ΒΑ можно определять с применением специфичных к НРУ гибридизационных зондов, способных к специфичному отжигу с продуктом ΝΑ8ΒΑ. Гибридизационный зонд может являться связанным с детектируемой меткой, например, флуоресцентным, люминесцентным, радиоактивным или хемилюминесцентным соединением или ферментной меткой или любой другой меткой известной специалисту в данной области. Точная природа метки не важна, но она должна являться способной к продукции сигнала, детектируемого внешними способами или самостоятельно или в соединении с одним или более дополнительными веществами (например, субстратом для фермента).
Предпочтительный способ определения представляет собой так называемую ΝΑ8ΒΑ в реальном времени, обеспечивающую непрерывный мониторинг образования продукта реакции ΝΑ8ΒΑ во время протекания реакции. В предпочтительном осуществлении этого можно достичь с применением зондов в виде молекулярных беконов, содержащих специфичную для НРУ последовательность, способную к отжигу с продуктом ΝΑ8ΒΑ, формирующую спаренный стебель олигонуклеотидную последователь
- 9 006975 ность и пару групп люминофор/гаситель, как известно в данной области и описано здесь. Если зонд в виде молекулярного бекона добавляют к реакционной смеси до амплификации, то возможно контролировать образование продукта ΝΑ8ΒΑ в реальном времени (Ьеоие с1 а1., Νιιοίοίο Λοίάκ Векеагей, 1998, Уо1 26, 2150-2155). Наборы реагентов и устройства для проведения определения посредством ΝΑ8ΒΑ коммерчески доступны (например, №с118еик™ ЕакуО кук1ет, из Огдапоп Текшка).
В дополнительном подходе технологию молекулярных беконов можно включить в олигонуклеотиды праймера 2, что обеспечивает мониторинг реакции ΝΆ8ΒΆ в реальном времени без необходимости отдельного гибридизационного зонда.
В еще одном дополнительном подходе образование продуктов реакции ΝΆ8ΒΆ можно контролировать с применением общего меченого зонда для детекции, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью на 5'-конце олигонуклеотидного праймера 2. Это представляет собой эквивалент системы детекции №е118епк™ поставляемой Огдапоп Текшка. В данной системе специфичности для продуктов ΝΆ8ΒΆ, полученных из мРНК-мишени НРУ, можно достичь посредством применения специфичных к НРУ захватывающих зондов, содержащих, как описано здесь, олигонуклеотиды зонда, прикрепленные к твердой основе, такой как магнитные микрогранулы. Наиболее предпочтительный общий меченый зонд для детекции представляет собой зонд ЕСЬ™ для детекции, поставляемый Огдапоп Текшка. Ампликоны ΝΑ8ΒΑ гибридизуются со специфичными для НРУ захватывающими зондами и общим зондом ЕСЬ (посредством комплементарной последовательности на праймере 2). После гибридизации комплексы гранула/ампликон/зонд ЕСЬ можно уловить на магнитный электрод автоматического устройства для считывания ЕСЬ (например, №е118епк™ геайег, поставляемый Огдапоп Текпка). Далее импульс напряжения запускает реакцию ЕСЬ™.
Определение мРНК НРУ также имеет клиническую значимость при раках, отличных от карциномы шейки матки, включающих, например, карциному головы и шеи, карциному полости рта и языка, карциному кожи, анальную и вагинальную карциному. Определение мРНК НРУ также может являться очень полезным при диагностике микрометастазов в лимфатических узлах нижней части тела. Следовательно, изобретение также относится к способам скрининга на наличие восприимчивости к указанным выше видам рака, основанным на скрининге на наличие экспрессии транскриптов Ь1 и Е6 НРУ.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения предоставляют набор для применения в обнаружении транскриптов генов Ь1 и Е6 НРУ, где набор содержит по меньшей мере одну пару праймеров, пригодных для применения в амплификации области транскриптов Ь1 по меньшей мере из НРУ типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также НРУ 45, и одну или более пар праймеров, позволяющих амплификацию областей транскриптов Е6 из НРУ типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также НРУ 45.
Пара праймеров принимают для обозначения пары праймеров, которые можно применять в сочетании для амплификации специфичной области мРНК Ь1 или Е6 с применением любой известной технологии нуклеиновых кислот. В предпочтительных осуществлениях пара праймеров, включаемая в набор, подходит для применения при амплификации ΝΑ8ΒΑ или подобном способе изотермической амплификации.
Отдельные праймеры, составляющие каждую пару праймеров, включенную в набор, можно поставлять отдельно (например, отдельный контейнер для каждого праймера) или более предпочтительно можно поставлять смешанными в одном контейнере. Сочетания двух или более пар праймеров можно поставлять готовыми в одном контейнере набора. Может являться удобным поставлять две или более пары праймеров в одном контейнере, где две или более реакции амплификации должны являться множественными, что означает непрерывное проведение в одном реакционном сосуде.
Пара(ы) праймеров, пригодная для применения в амплификации области транскриптов Е6, должна обеспечивать амплификацию области мРНК Е6, по меньшей мере, большинства ассоциированных с раками НРУ типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также НРУ 45. Существует несколько различных путей, которыми этого можно достичь.
В одном осуществлении набор может содержать отдельные пары праймеров, специфичные к каждому НРУ типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также НРУ 45. Данные пары праймеров можно поставлять в наборе в раздельных контейнерах или их можно поставлять как смеси двух или более пар праймеров в одном контейнере, например, для обеспечения многократности реакций амплификации.
В дополнительном осуществлении набор может содержать одну пару праймеров способную к амплификации области гена Е6 НРУ типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также НРУ 45, которая также обеспечивает амплификацию всех четырех (предпочтительно пяти) типов в одной реакции амплификации. Этого, например, можно достичь с применением пары вырожденных праймеров или выбора области мРНК Е6, высококонсервативной в типах НРУ.
Пара праймеров для Е6 может соответствовать любой области мРНК Е6 и может обеспечивать амплификацию целых открытых рамок считывания Е6 и/или Е7 или их частей.
Набор может дополнительно содержать пары праймеров, пригодных для применения в амплификации мРНК Е6 из НРУ типов, отличных от типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также НРУ 45. На
- 10 006975 пример, набор можно дополнить праймерами для Е6 для определения типа НРУ, являющегося эндемичным в конкретной географической области или популяции.
Пара(ы) праймеров, пригодная для применения в амплификации области транскриптов Ь1, должна обеспечивать амплификацию области мРНК Ь1, по меньшей мере, большинства ассоциированных с раком НРУ типов 16, 18, 31 и 33, а предпочтительно также НРУ 45, и предпочтительно должна являться пригодной для применения в амплификации области мРНК Ь1 по существу всех известных типов НРУ. С применением таких праймеров возможно тестировать наличие активной транскрипции мРНК Ь1 множества типов НРУ в одной реакции амплификации.
Конструировать праймеры, способные к определению транскриптов Ь1 множества типов НРУ, возможно посредством отбора областей транскриптов Ь1, являющихся высококонсервативными.
В дополнительном подходе, специфичности для множества типов НРУ можно достичь с применением вырожденных олигонуклеотидных праймеров или комплексных смесей полинуклеотидов, с незначительными изменениями последовательности, предпочтительно соответствующих участкам изменчивости последовательности в генотипах НРУ. Рациональное обоснование применения таких вырожденных праймеров или смесей представляет собой то, что смесь может содержать по меньшей мере одну пару праймеров, способную к определению каждого типа НРУ.
В еще одном дополнительном подходе специфичности для множества типов НРУ можно достичь посредством включения в праймеры одного или более нуклеотидов инозина предпочтительно в участки изменчивости последовательности в генотипах НРУ.
Пары праймеров для Е6 и Ь1 можно поставлять в раздельных контейнерах набора или пару(ы) праймеров для Ь1 можно поставлять в качестве смеси с одним или более парами праймеров для Е6 в одном контейнере.
Наборы могут дополнительно содержать один или более зондов, пригодных для применения в определении продуктов реакций амплификации, проводимых с применением включенных в набор пар праймеров. Зонд(ы) можно поставлять как отдельный реагент в наборе. Альтернативно, зонд(ы) можно поставлять как смесь с одной или более парами праймеров.
Праймеры и зонды, включенные в набор, предпочтительно представляют собой одноцепочечные молекулы ДНК. Также можно применять неприродные, синтетические полинуклеотиды, сохраняющие способность образовывать пары оснований с комплементарной молекулой нуклеиновой кислоты, включающие синтетические олигонуклеотиды, с введенными в них модифицированными основаниями и синтетические олигонуклеотиды, где связи между отдельными нуклеотидами включают связи, отличные от фосфодиэфирных связей. Праймеры и зонды можно получать хорошо известными в данной области способами, такими как химический синтез с применением стандартных устройств и протоколов для олигонуклеотидного синтеза.
Праймеры и зонды, как правило, представляют собой выделенные одноцепочечные полинуклеотиды не более чем из 100 оснований в длину, более типично - менее чем из 55 оснований в длину. Во избежание неопределенности здесь устанавливают, что термины праймер и зонд исключают природные полноразмерные геномы НРУ.
В набор можно включить некоторые общие типы олигонуклеотидных праймеров и зондов, содержащие специфичные для НРУ последовательности. Как правило, такие праймеры и зонды могут содержать дополнительные, не относящиеся к НРУ последовательности, например последовательности, необходимости для реакции амплификации или облегчения детекции продуктов реакции амплификации.
Первым типом праймеров являются олигонуклеотиды праймера 1 (также обозначаемые здесь как праймеры Р1 для ΝΑ3ΒΑ), представляющие собой олигонуклеотиды, как правило, приблизительно 50 оснований в длину, содержащие в среднем приблизительно 20 оснований на З'-конце, которые комплементарны области мРНК-мишени. Олигонуклеотиды, пригодные для применения в качестве праймеров Р1 для ΝΑ3ΒΑ, в табл. 1 обозначают как Р1/РСК. Олигонуклеотиды праймера Р1, как правило, обладают структурой Х|-ЗЕО. где ЗЕО представляет собой последовательность, специфичную для НРУ, а Х1 представляет собой последовательность, содержащую промотор, который распознается специфичной РНК-полимеразой. Для использования в олигонуклеотидах по настоящему изобретению предпочтительными являются промоторы бактериофагов, например, промоторы Т7, ТЗ и ЗР6, так как они обеспечивают преимущества высокого уровня транскрипции, которая зависит только от связывания соответствующей РНК-полимеразы. В предпочтительном осуществлении последовательность Х1 может содержать последовательность ΑΑΤΤСΤΑΑΤΑС6ΑСΤСΑСΤΑΤΑ666 или последовательность ΑΑΤΤСΤΑΑΤΑС6ΑСΤ САСТЛТЛСССЛСЛЛСС. Данные последовательности содержат промотор Т7, включая участок инициации транскрипции для РНК-полимеразы Т7. Специфичные для НРУ последовательности в праймерах, обозначенных в табл. 1 как Р1/РСК., также можно адаптировать для применения в стандартных праймерах ПЦР. Когда данные последовательности применяют как основу праймеров Р1 для ΝΑ3ΒΑ, они обладают общей структурой Х^ЗЕО, как определено выше. Промоторная последовательность X! существенна в праймере Р1 для ΝΑ3ΒΑ. Однако когда те же последовательности применяют как основу праймеров стандартной ПЦР присоединение Х1 не является обязательным.
- 11 006975
Второй тип праймеров представляют собой олигонуклеотиды праймера 2 для ΝΆ8ΒΆ (также обозначаемые здесь как праймеры Р2 для ΝΆ8ΒΆ), которые, как правило, включают последовательность приблизительно из 20 оснований, в основном идентичных мРНК-мишени. Олигонуклеотидные последовательности, обозначенные в табл. 1 как Р2/РСК пригодны для применения и в праймерах Р2 для ΝΆ8ΒΆ и в праймерах для стандартной ПЦР.
Предназначенные для использования в качестве праймеров Р2 для ΝΆ8ΒΆ олигонуклеотиды в конкретном, но не ограничивающем осуществлении, дополнительно содержат последовательность нуклеотидов на 5'-конце, которая не связана с мРНК-мишенью, но способна к гибридизации с общим зондом для детекции. Зонд для детекции предпочтительно является меченным, например, флуоресцентной, люминесцентной или ферментативной меткой. В одном осуществлении зонд для детекции является меченым меткой, обеспечивающей детекцию с применением способа ЕСЬ™, хотя необходимо принимать во внимание, что изобретение ни в коем случае не ограничено данным конкретным способом детекции. В предпочтительном осуществлении 5'-конец олигонуклеотидов праймера 2 может содержать последовательность ОЛТОСЛЛООТСОСЛТЛТОЛО. Данная последовательность способна гибридизоваться с общим зондом ЕСк™, доступным из Огдапоп Текшка и обладающим следующей структурой:
Ви(Ьру)з2+-ОЛТОСЛЛООТСОСЛТЛТОЛО-3'
В другом осуществлении олигонуклеотиды праймера 2 могут содержать технологию молекулярных беконов, известную в данной области и описанную, например, в АО 95/13399, выданном Туад1 и Кгатег, Ха1иге Βίο№οΙιπο1ορ\·. 14: 303-308, 1996, для обеспечения мониторинга реакции ΝΆ8ΒΆ в реальном времени.
Также в набор можно включить олигонуклеотиды зонда, специфичного к мишени. Олигонуклеотиды зонда, как правило, включают последовательность приблизительно из 20-25 нуклеотидов, в основном идентичную области мРНК-мишени или комплементарную ей. Примеры, специфичные для НРУ олигонуклеотидных последовательностей, пригодных для применения в качестве зондов, обозначены в табл. 1 как РО. Олигонуклеотиды зонда можно применять как специфичные для мишени гибридизационные зонды для детекции продуктов реакций ΝΆ8ΒΆ или ПЦР. В таком контексте олигонуклеотиды зонда можно. связывать с твердой основой, такой как парамагнитные гранулы, для формирования захватывающего зонда (см. ниже). В предпочтительном осуществлении 5'-конец олигонуклеотида зонда может быть мечен биотином. Добавление биотиновой метки облегчает прикрепление зонда к твердой основе посредством связи биотин/стрептавидин или биотин/авидин.
Специфичные к мишени зонды, обеспечивающие детекцию продуктов амплификации в реальном времени, могут включать технологию молекулярных беконов, которая известна в данной области и описана, например, у Туад1 и Кгатег, Ха1иге ΒΐοΙ^οΒηοΙο^. 14: 303-308, 1996 и в АО 95/13399. Примеры специфичных для НРУ олигонуклеотидных последовательностей, пригодных для применения в качестве молекулярных беконов обозначены в табл. 1 как ΜΒ.
Термин зонды в виде молекулярных беконов, как применяют здесь, применят для обозначения молекул со структурой
Х2-плечо1-мишень-плечо2-Х3 где мишень представляет собой специфичную к мишени последовательность нуклеотидов, Х2 и Х3 представляют собой флуоресцентную группу и группу гасителя, способную к существенному или полному гашению флуоресценции флуоресцентной группы, когда они оба удерживаются вместе в непосредственной близости, а плечо1 и плечо2 представляют собой комплементарные последовательности, способные к формированию спаренного стебля.
Предпочтительные сочетания последовательностей плечо1 и плечо2 представляют собой следующее, однако, это предназначено скорее для иллюстрации, чем ограничения изобретения.
сдса£д-5ЕО-саЪдсд ссадсЁ-ЗЕО-адскдд сасдс-ЗЕО-дсдЪд сдаСсд-ЗЕО-сдаЬсд ссд£сд-5ЕО-сдасдд сддасс-ЗЕф-дд^ссд ссдаадд-ЗЕО-ссгседд сасд1сд-5Е0-сдасдЪд сдсадс-ЗЕО-дсХдсд ссаадс-ЗЕО-дсХ^дд ссаадсд-ЗБО-сдсЪСдд сссадс-8ЕО-д<Хддд ссааадс-8Б0~дсхзддд сс£дс~8Е0-дсадд
- 12 006975 ссассс-ЗВД-дддЪдд ссаадсс-ЗЕО-ддсЫдд ссадсд-ЗЕО-сдсЕдд сдсаид-5Е0-са1дсд
Применение технологии молекулярных беконов обеспечивает мониторинг реакций амплификации, например амплификации ΝΑ8ΒΑ, в реальном времени (см. Ьеопе οί а1., ΝιιοΙοίο Άοΐάδ КезеагсР., 1998, νοί: 26, рр 2150-2155). Зонды в виде молекулярных беконов, как правило, включают комплементарные последовательности, фланкирующие специфичную для НРУ последовательность, представленные здесь обозначением плечо 1 и плечо2, которые способны гибридизоваться друг с другом, формируя структуру спаренного стебля. Точные последовательности плечо 1 и плечо2 не являются предметом изобретения, за исключением необходимости того, что данные последовательности должны являться способными к формированию спаренного стебля, когда зонд не связан с последовательностью-мишенью НРУ.
Зонды в виде молекулярных беконов также включают флуоресцентную группу и группу гасителя, где флуоресцентная группа и группа гасителя представлены здесь посредством обозначения Х2 и Х3. Специалисту необходимо принять во внимание, что группы люминофора и гасителя выбирают так, чтобы группа гасителя являлась способной к существенному или полному гашению флуоресценции флуоресцентной группы, когда две группы находятся в непосредственной близости, например, когда зонд находится в закрытой конформации шпильки в отсутствии последовательности-мишени. При связывании с последовательностью-мишенью флуоресцентная группа и группа гасителя разделяются, так что флуоресценция флуоресцентной группы больше не гасится.
В данной области известно много примеров пригодных пар групп гаситель/люминофор, которые можно применять по изобретению (см. АО 95/13399, Туащ и Кгатег, там же). Применяют широкий диапазон флуорофоров, выполненных в различных цветах, включающих, например, 5-(2'-аминоэтил) аминонафталин-1-сульфоновую кислоту (ΡΙ)ΑΝ5), флуоресцеин, РАМ и техасский красный (см. Туа§1, ВгаШ апб Кгатег, 1998, №1иге ВкЯес11по1оцу, 16, 49-53). Применение зондов, меченых флуорофорами с различной окраской дает возможность множественной детекции двух или более различных зондов в одном реакционном сосуде. Предпочтительный гаситель представляет собой 4-(4'-диметиламинофенилазо)бензойную кислоту (ΌΑΒΟΥΡ), нефлуоресцирующий хромофор, служащий в качестве универсального гасителя для широкого диапазона флуорофоров. Группы люминофора и гасителя можно ковалентно связать с зондом в любой ориентации с люминофором на 5'-конце или вблизи него и гасителем на 3'-конце или вблизи него или наоборот. Протоколы для синтеза зондов в виде молекулярных беконов известны в данной области. Подробный протокол для синтеза предоставлен в статье, озаглавленной Мо1еси1аг Веасопз: 11уЬпс11/а1юп РгоЬез 1ог ^еίесί^οη оТ Шс1ею Ас1б§ ΐη Нотодепош 8о1ийоп§, написанной Ландау Туащ еί а1., ОераПтеп! оТ Мо1еси1аг ОепеДс§, РиЬНс Неа1111 КезеагсР ИшРЮе, 455 ΓΪΓδί Ανеηие, №\ν Υο^к, ΝΥ 10016, И8А, доступной в режиме онлайн с веб-сайта РНК1 (на \\'\у\у.р11п.пуи.еск| или \у\у\у.то1еси1а1Окд1соп+огц).
Пригодные сочетания праймеров Р1 для ΝΑ8ΒΑ и Р2 для ΝΑ8ΒΑ можно применять для проведения реакции амплификации ΝΑ8ΒΑ. Для проведения реакции амплификации ΝΑ8ΒΑ олигонуклеотиды праймера 1 и праймера 2 должны являться способными служить затравкой для синтеза двухцепочечной ДНК с области-мишени мРНК. Для того чтобы это произошло олигонуклеотиды праймера 1 и праймера 2 должны содержать специфичные для мишени последовательности, комплементарные к областям смысловой и антисмысловой цепи мРНК-мишени соответственно.
На первой фазе цикла амплификации ΝΑ8ΒΑ, так называемой нециклической фазе, олигонуклеотиды праймера 1 отжигаются с комплементарной последовательностью мРНК-мишени, а их 3'-конец удлиняется под действием РНК-зависимой ДНК-полимеразы (например, обратная транскриптаза) с формированием первой цепи синтеза кДНК. Цепь РНК полученного гибрида РНК: ДНК затем расщепляется, например, под действием КНа§еН, оставляя одноцепочечную ДНК. Олигонуклеотиды праймера 2 отжигаются с комплементарной последовательностью 3'-конца данной одноцепочечной ДНК, а его конец удлиняется (под действием обратной транскриптазы), формируя двухцепочечную ДНК. РНК-полимераза затем способна транскрибировать множество копий РНК с транскрипционно активной теперь промоторной последовательности в двухцепочечной ДНК. Данный транскрипт РНК, представляющий собой антисмысловую цепь исходной мРНК-мишени, может действовать в качестве матрицы для дальнейшего цикла реакций ΝΑ8ΒΑ, с праймером 2, отжигающимся к РНК и служащем затравкой для синтеза первой цепи кДНК и праймером 1, служащем затравкой для синтеза второй цепи кДНК. Основные принципы реакции ΝΑ8ΒΑ хорошо известны в данной области (см. СотрЮп, I. №1иге. 350: 91-92).
Описанные здесь специфичные к мишени олигонуклеотиды зонда также можно связать с твердой основой, такой как магнитные микрогранулы, и применять в качестве захватывающих зондов для иммобилизации продукта реакции амплификации ΝΑ8ΒΑ (одноцепочечной РНК). Описанные здесь специфичные к мишени зонды в виде молекулярных беконов можно применять для мониторинга реакции ΝΑ8ΒΑ в реальном времени.
- 13 006975
Наборы по изобретению также могут содержать положительный контроль, включающий мРНК Е6 и/или Ь1 известного типа НРУ. Подходящие контроли включают, например, экстракты нуклеиновой кислоты, полученные из клеточных линий, зараженных известными типами НРУ (например, НеЬа, Са8к1).
Набор дополнительно может содержать праймеры внутреннего контроля амплификации, например, праймеры, специфичные для человеческой РНК ϋ1Ά.
Содержащие праймеры (и необязательно зонды) наборы, пригодные для применения в амплификации ΝΆ8ΒΆ могут дополнительно содержать смесь ферментов, необходимых для реакции ΝΆ8ΒΆ, например ферментную смесь, содержащую РНК-зависимую ДНК-полимеразу (например, обратную транскриптазу), рибонуклеазу, гидролизующую цепь РНК гибрида РНК-ДНК без гидролиза одно- или двухцепочечной РНК или ДНК (например, 1\\а8е11), и РНК-полимеразу. РНК-полимераза должна представлять собой РНК-полимеразу, распознающую промоторную последовательность, представленную в 5'концевой области праймеров Р1 для NΑ8ΒΑ поставляемых в наборе реагентов. Набор также может содержать запас буфера для ΝΑ8ΒΑ, содержащего рибонуклеозиды и дезоксирибонуклеозиды, необходимые для синтеза РНК и ДНК. Состав стандартного буфера для реакции ΝΑ8ΒΑ хорошо известен специалистам в данной области (см. также Ьеопе е1 а1., там же).
Таблица 1 Специфичные для Е6 последовательности для включения в праймеры и зонды NΑ8ΒΑ/ПЦР
8Е0ГО Νο Гип праймера юнда ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ТИП НРУ пе
1 Р2/РСН СХАСАССАСССАСССАСАААСТТА 16 116
2 Р1/РСЙ Ха-АСбвТТТСТТСТАТТбСТСТТС 16 368
3 Р2/РСК ССАСАСаАбСОАСССАОААА 16 116
4 Р1/РСА х^естттсттстАттсстеттс 16 368
5 Р1/РСК Χ,-АТТОХАТСТСТАТАТАСТА 16 258
б Р1/РСК Χ,-ТСАССТСбСАСТААСТСТ 16 208
Ί Р1/РСК Х,-ТТССТТ5САСТАСАСАСА 16 191
8 Р1/РСК Х.-ТОСАОТАСАСАСАТТСТА 16 186
9 Р1/РСВ Ха-^САбТАСАСАСАТТСТАА 16 185
10 Р2/РСН АСАСТТАТ6САСАСАССТ 16 142
11 Р2/РСК АТАТТАСААТ6Т6ТСТАС 16 182
12 Р2/РСК ТТАСААТСТСТСТАСТОС 16 185
13 Р2/РСК СААТСТОТОТАСТвСААв 16 188
- 14 006975
14 РО АСАСТТАТССАСАСАССТ 16 142
15 РО АТАТТАСААТСТСТСТАС 16 182
16 РО ТТАСААТСТСТСТАСТСС 16 185
17 РО СААТСТСТСТАСТССААС 16 188
18 РО СТТТССТТТТССССАТТТАТСС 16 235
19 РО ТАТСАСТТТССТТТТССССА 16 230
20 МВ Х2-азлп1-ТАТСАСТТТОСТТТТСОаСА-аппг-Хз 16 230
21 Р2/РСВ САСАССАССАССАТСАААТАСТА 16 656
22 Р1/РСК Х1-ССАСААСССААСССТАСАСТСАСАС 16 741
23 РО ТС6АСАА6САСААССССАСАСАСС 16 687
24 Р2/РСВ САЗАССАССАССАТСАААТАСА 16 656
25 Р1/РСВ X ί-ССАСААСССААСССТАСАСТСА 16 741
26 РО АССАСААССОСАСАСАССССАТТА 16 693
27 Р2/РСВ АССАТСАААТАСАТССАСТТ 18 702
28 Р1/РСВ Х^САСССАСАСАСАААССАСАС 18 869
28 РО АССССААССАСААССТСАСА 18 748
30 Р2/РСК СААлАСОАТслААТАСАТССАС 18 698
31 Р1/РСК X!-АСАССАСССАСАСАСАААССАСАС 18 869
32 РО СААССАСААССТСАСАСААТС 18 752
33 МВ Хг-агпд-СААССАСААССТСАСАСААТС-агтг-Хз 18 752
34 Р2/РСК ТТСС6СТТСАССТТСТАТ6Т 18 651
35 Р1/РСК Х^ССТССТСТССТСАССТТТСТ 18 817
36 Р2/РСВ ССААСАСАТАСАААТААССТС 18 179
37 Р1/РСК Х^АСССАСТСТТАСТТАСТТ 18 379
38 РО ТССААСАСАСТАТТССААСТ 18 207
39 Р2/РСК ССАААТАСССТАССАТСААС 31 164
40 Р1/РСВ Хз-ООАСАСААСССТСТТТбАСА 31 423
41 РО АТАСССАССАСАСАССАСАСССАС 31 268
42 Р2/РСВ ССАААТАСССТАССАТСААСТА 31 164
43 Р1/РСК Хз-СТСОАСАСААССОТСТТТСАСА 31 423
44 РО ТАСССАССАСАСАССАСАСССА 31 269
45 Р2/РСВ АСТСАССТССАСТСТТАТСА 31 617
46 Р1/РСВ Х1-ТАТСТАСТТСТСТССТСТСТ 31 766
47 РО САСААССАСААССССАСАСАТС 31 687
48 Р2/РСК ТСАССТССАСТСТТАТСАССААТТ 31 619
49 Р1/РСВ Х^ТСССААТАТСТАСТТСТСТССТСТ СТ 31 766
50 РО ССАСААССАСААССССАСАСАТССАА 31 686
51 МВ Х2- а гш, -ССАСААССАСААССССАСАСАТССААагш2-Х3 31 686
52 Р2/РСК АСТСАССТССАСТСТТА'Г 31 617
53 Р1/РСК Хз-САССАТТССАААТСАССССАТ 31 809
54 Р2/РСВ ТАТССТСААССААСТОАССТАТ 33 618
55 Р1/РСК X! -ТТСАСАСАТАААССААСТС 33 763
56 РО САСАТССАСААССАСААСС 33 694
57 Р2/РСВ ТССТСААССААСТСАССТАТ 33 620
58 Р1/РСН Хз-СССАТААСТАСТТССТСТАТ 33 807
59 РО ССАСААССАСААССАСССАСАСС 33 699
60 МВ Х2- а гпц-ССАСААССАСААССАСССАСАССагш2-Хэ 33 699
- 15 006975
61 Р2/РСЯ САССТТТСТСТССТСААСАА 33 431
62 Р1/РСЯ X! -АССТСАСТТССТТСАССАТА 33 618
63 РО АСАААСТССАСТСТСАССТСТ 33 543
64 Р2/РСЯ АТТАСАССССАСТСАССТАТ 35 217
65 Р1/РСЯ Χχ-СТСТТТССТТТТСААСТССА 35 442
66 РО АТАСАСААССССАСССАТАТ 35 270
67 Р2/РСЯ ТСАСАССАССАССААСАТАСТА 35 655
68 Р1/РСЯ Χχ-САТТАТССТСТСТСТСААСА 35 844
69 Р2/РСЯ ССССАСССААСТСАССТАТА 35 610
70 Р1/РСЯ Χχ-СТСААТСТСТСТССТСТСТА 35 770
71 РО САСААССААААССАСАСАССТССАА 35 692
72 РО САСААССААААССАСАСАСС 35 692
73 Р2/РСЯ ТТСТСТСАССТССТССААСААТ 52 144
74 Р1/РСЯ Χχ-СССТСТСТТСТААТСТТТ 52 358
75 РО СТСССТАСССТТТТТАТСТА 52 296
76 Р2/РСЯ СТСССТАСССТТТТТАТСТА 52 296
77 Р1/РСЯ Χχ-ССССТСТССААСАСТСТСААСА 52 507
78 РО ТССАААСААСССАТТТСА 52 461
79 Р2/РСЯ ТСАССССТТССАСАСАТС 58 157
80 Р1/РСЯ Χχ-АССААТССТААССАСАСТ ‘ 58 301
81 Р2/РСЯ ТСТСТССАТСАААТССАА 58 173
82 Р1/РСЯ Χχ-АССАСАСТТТАСАТАСТС 58 291
83 РО ТСАААТСССТТСААТССА 58 192
84 РО ТТССАСССАТСТСАССТАТАТС 58 218
85 Р2/РСЯ ТАСАСТССТССАСААСАТ В (11) 514
86 Р1/РСЯ Χχ-ТСАТСТТСТСАССТСТСТ В (11) 619
87 Р2/РСЯ ТАСАСТССТССАСААСАТССА В (11) 514
88 Р1/РСЯ Х1 -СТСАСАТССАСАССААСАССТСА В(11) 693
89 РО СТАСССТТАСАТТССТАТСА В(11) 590
90 РО СТАСССТТАСАТТССТАТСАСС В(11) 590
91 Р2/РСЯ ТСАССТСТТССТСТССАТСТСА В(11) 693
92 Р1/РСЯ Χχ-ТАССТСААТССТСССССАТ В (11) 832
93 РО АТКСТСТСТСССАТСТСС В(11) 794
94 Р2/РСЯ САТСССАТАААТСТАТАСА С (18 39 45) 295
95 Р1/РСЯ Χχ-САССССАСССАССТТАТТАА С(18 39 45 408
96 РО АСААТТАСАСААТТААСА С(18 39 45 324
97 Р2/РСЯ ССАСАССАССАСТАСАССААА 39 210
98 Р1/РСЯ Хх-АСАСССАСТСССАСТААТА 39 344
99 РО АТАСССАСССССААССАСТ 39 273
100 Р2/РСЯ ТАТТАСТСССАСТСССТСТ 39 344
101 Р1/РСЯ Хх-СТТСССТТТСТСТТССТОТТА 39 558
102 РО ССАССАСААААССССАССАС 39 531
103 Р2/РСК САААТАСАТСААССССАССА 39 703
104 Р1/РСК Хх -ССАСАССАСССАСАСАСААА 39 886
105 РО ТАСССАСАССССАТСААССАСАСС 39 749
106 Р2/РСЯ ААССАТТСААСССАССАСААА 45 430
- 16 006975
107 Р1/РСК Х^ТСТТТСТТССССТСССТССТСА 45 527
108 РО СТАСССАССССАСТСТААТА 45 500
109 Р2/РСК ААССАТТСААСССАССАСААА 45 430
110 Р1/РСК ХГТСТТТСТТССССТСССТССТСА 45 527
111 Р2/РСЯ САААССАТТСААСССА6СА0АААА 45 428
112 Р1/РСВ Х1-ТТССТАТАСТТ6ТСТТТСССТАСС 45 558
113 РО СТАСССАОббСАбТОТААТА 45 500
114 РО ССАСАААССААСАТТТСАСА 45 467
115 Р2/РСР бТТОАССТбТТОТбТТАССАССААТ 45 656
116 Р1/РСК X1 -САССАСССАСАСАСАААССАСААС 45 868
117 Р2/РСК СТбТТСАССТбТТбТбТТАСбА 45 654
118 Р1/РСВ Х1-ССАС6САСАСАСАААббАСААб 45 868
119 Р2/РСВ СТТСАССТСТТСТОТТАССА 45 656
120 Р1/РСЯ X!-АСССАСАСАСАААССАСААС 45 868
121 РО САСТСАСАССАССААААССАТС 45 686
122 РО АССААААССАТСААбСАСАТССАСТ 45 696
123 РО АСААСТАССАСССССАССАССССАА 45 730
124 Р2/РСК ССАССАССАТСААСТАСАТА 51 658
125 Р1/РСЯ Х^ССССАТТААСАТСТССТСТА 51 807
126 Р2/РСК АСАССАССАССАТСААСТАСАТА 51 655
127 ρι/рса X! -АСССССАААССАСССТТАСТ 51 829
128 ΡΟ ССАССТСТТСААСТСТАСТА 51 747
129 РО ТСССАСТССАААССАОТССАСАСА 51 771
130 Р2/РСН ТТСС66ТССТС6АСАСАААСАТСТ 56 519
131 Р1/РСК Х^ТТСАТССТСАТССТСАТССТСТСА 56 665
132 Р2/РСК Т6С0СТССТС0АСАСАААСАТС 56 520
133 Р1/РСВ. Х^САТССТСАТССТСАТССТСТСА 56 665
134 Р2/РСЯ ТТССеСТбСТССАСАСАААСАТ 56 519
135 Р1/РСК X! -ССАСАААСТТАСАСТСАСААСА 56 764
136 РО АААСТАССААСССТССААСАССТ 56 581
137 РО АСААСТААСАССТСАААСАСАААТ 56 610
138 РО АСТАССААСССТССААСАССТТ 56 583
139 Р1/РСВ Х1-ТТССАСАССТСАСАббАТСАСа 56 656
140 Р2/РСК САТТТТССТТАТбСАОТбТб 56 279
141 Р1/РСК X ΐ-САСАТСТСТАССАССТТАТТ 56 410
142 РО САСТАТТСАСТСТАТССАСС 56 348
143 РО СААСТСАУСТМУАСТбТТАТСА А (16 31 35)
144 МВ Х2-агт1-СААСТСА¥СТМ¥АСТбТТАТаА-агт2-Х3 А (16 31 35)
145 РО СААМСААСТСАССТАУНСТССТАТ А (33 52 58)
146 МВ Х2-агт1-бААМСААСТ6АССТАУИСТССТАТ- Э1ГШ2Хз А (33 52 58)
147 РО ААСАСАТТАТТСАСАСТС С (18 45 39)
148 МВ Х2-агш1-ААбАСАТТАТТСА6АСТС-агт2-Х3 С (18 45 39)
- 17 006975
Таблица 2 Специфичные для Ь1 последовательности для включения в праймеры и зонды ΝΑδΒΑ/ПЦР
8Е0 ГО Тип праймера/ зонда ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
149 Р2/РСК ААТСССАТТТСТТС®3(ЗТАА
150 Р1/РСК Х1-ТСАТАТТССТССССАТСТС
151 РО ТТСТТАСТСТТСТТОАТАСТАС
152 Р2/РСЯ ААТООСАТТТСТТвСЗВНАА
153 Р1/РСК Х^ТСАТАТТССТСММСАТСОС
154 ₽0 ТТСТТАСТСТТСТТСАТАСУАС
155 РО ТТСТТАСТОТТСТТСАТАССАС
156 Р2/РСН . ААТ06САТТТСТТСС31ΙΑΑ
157 Р2/РСК ААТбССАТТТБТГССИНАА .
158 Р2/РСК ААТ0ССАТТТСТТО61К1АА
159 Р2/РСК ААТСОСАТТТОТТОСССТАА
160 Р2/РСК ААТСССАТТТСТТЗСССААА
161 Р2/РСК ДАТСССАТТТСТТСССАТАА
162 Р2/РСН ААТСССАТТТСТТС030САА
163 Р2/РСК ААТСОСАТТТСТТОССАСАА
164 Р1/РСН Х^ТСАТАГГССТСМТСАТСЮ
165 Р1/РСН Х^ТСАТАТТССТСААСАТСЮ
166 Р1/РСВ Х1-ТСАТАТТССТС11САТСТС
167 Р1/РСК Х^ТСАТАТТССТС! 1САТС6С
168 Р1/РСК Х1-ТСАТАТТССТС11САТСАС 3'
169 Р1/РСК Χχ-ТСАТАТТССТСИСАТОСС 3’
Предпочтительные праймеры, пригодные для применения в обнаружении мРНК Ь1 и Е6 посредством ΝΑ8ΒΑ, приведены в следующих таблицах. Однако они приведены только с целью иллюстрации и не означают того, что объем изобретения должен являться ограниченным данными конкретными молекулами.
В следующих таблицах праймеры Р2 для ΝΑ8ΒΑ (р2) включают на 5'-конце последовательность 0ΑТ0СΑΑό0ТС0СΑТΑТ0Α0; праймеры Р1 для ΝΑ8ΒΑ (р1) включают на 5'-конце последовательность ΑΑТТСТΑΑТΑСΟΑСТСΑСТΑТΑΟΟΟΑΟΑΑΟΟ. Подходящие для применения в качестве зондов олигонуклеотиды идентифицируют посредством ро.
Праймеры Р2, как правило, включают последовательности НРУ положительной цепи, тогда как праймеры р1 как правило включают последовательности НРУ отрицательной цепи. ηΐ относится к положению нуклеотида в соответствующей геномной последовательности НРУ.
- 18 006975
Таблица 3
Предпочтительные праймеры и зонды для ΝΑ8ΒΑ Еб
Название поаймеюа Последовательность Тип ΗΡν пЪ
НАе6701р2 САТССАА6СТС6САТАТСАСССАСАС6А6ССАСССАС АААЗТТА 16 116
НАе6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССАСССТТ ТСТТСТАТТССТСТТС 16 368
НАеб702р2 САТССААССТСССАТАТСАСССАСАССАСССАСССАС ААА 16 116
НАе6702р1 ААТТСТААТАС6АСТСАСТАТА666АСАА6666ТТТ6 ТТСТАТТССТ6ТТС 16 368
ΗΡνίβρΙ ААТТСТААТАС6АСТСАСТАТАСССАСААССАТТССС АТСТСТАТАТАСТА 16 258
НАе67О2Ар1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТСА ССТС6САСТААСТСТ 16 208
НАе6702Вр1 ААТТСТААТАС6АСТСАСТАТА6С6АСААССТТ6 СТТССАСТАСАСАСА 16 191
НАе6702Ср1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСС6АСААССТСС А6ТАСАСАСАТТСТА 16 186
ΗΑβ6702ϋρ1 ААТТСТААТАСбАСТСАСТАТАбСбАВААЗСССА СТАСАСАСАТТСТАА 16 185
Н16е6702Ар2 САТССААССТСССАТАТСАСАСАСТТАТССАСАСАССТ 16 142
Н16е6702Вр2 САТССААССТСССАТАТСАСАТАТТАСААТСТСТСТАС 16 182
Н1бе6702Ср2 САТССААССТСССАТАТ6АСТТА6ААТСТСТСТАСТСС 16 185
Η16β6702ϋρ2 САТССААССТСССАТАТСАССААТСТСТСТАСТССААС 16 188
Н16е6702Аро АСАСТТАТССАСАСАССТ 16 142
Н1бе6702Вро АТАТТАСААТСТСТСТАС 16 182
Н16еб702Сро ТТА6ААТ6Т6Т6ТАСТСС 16 185
- 19 006975
Η16β6702ϋρο СААТСТСТСТАСТССААС 16 188
НАеб701ро СТТТССТТТТССССАТТТАТСС 16 235
НАе6702ро ТАТСАСТТТССТТТТССС6А 16 230
НАеб702тЫ Х2-сдса±дТАТСАСТТТССТТТТССССАса±дсд -Х3 16 230
НАе6702тЬ2 Хг-ссадсБТАТСАСТТТССТТТТССССАадсЬдд -Х3 16 230
НАе6702тЬЗ Хг-сасдсТАТСАСТТТССТТТТССССАдсдСд -Х3 16 230
Н16е6702тЬ4 Хг-сдаЕсдТАТСАСТТТССТТТТССССАсдаЬсд -Х3 16 230
НАе6703р2 САТССААССТСССАТАТСАССАСАССАССАССАТСАА АТА6ТА 16 656
НАе6703р1 ААТТСТЛЛТАССАСТСЛСТАТАСССАСААССССАСАА СССААСССТАСАСТСАСАС 16 741
НАе6703ро ТССАСААбСАСААССССАСАСАСС 16 687
НАеб704р2 САТССЛЛ6СТСССЛТАТСАССАСАССАССАССАТСАА АТАСА 16 656
НАе67О4р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССАСАА СССААСССТАСАСТСА 16 741
НАе6704ро АССАСААССС6АСАСАССССАТТА 16 693
Н18е6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСАССАТСАААТАСАТССА СТТ 18 702
Н18е6701р1 ААТТСТААТАС6АСТСАСТАТА66САСААСССАСССА САСАСАААССАСАС 18 869
Н18еб701ро АССССААССАСААССТСАСА 18 748
Н18е6702р2 САТССААССТСССАТАТСАС6ААААССАТСАААТАСА ТССАС 18 698
Н18е6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССА6ААССАСАССА СССАСАСАСАААССАСАС 18 869
Н18е6702ро СААССАСААССТСАСАСААТС 18 752
Н18еб702тЫ Х2-сдсаЪдСААССАСААССТСАСАСААТСсаЪдсд-Х3 18 752
Н18еб702тЬ2 Хг-ссдСсдСААССАСААССТСАСАСААТСсдасдд-Х3 18 752
Н18е6702тЬЗ Х2- сддассСААССАСААССТСАСАСААТСддЁ ссд -X 3 18 752
Н18еб702тЬ4 Х2-сда1:сдСААССАСААССТСАСАСААТСсда1:сд-Х3 18 752
Н18е6703р2 САТССААССТСССАТАТСАСТТССССТТСАССТТСТА ТОТ 18 651
Н18е6703р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССТССТ СТССТСАССТТТСТ 18 817
Н18еб704р2 САТССААССТСССАТАТСАСССААСАСАТАСАААТАА ССТС 18 179
Н18е6704р1 ААТТСТААТАС6АСТСАСТАТАСССАСААССАСССАС ТСТТАСТТАСТТ 18 379
Н18е6704ро ТССААСАСАСТАТТССААСТ 18 207
Н31е6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСССАААТАСССТАССАТС ААС 31 164
- 20 006975
Н31е6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССАСАС ААСССТСТТТСАСА 31 423
Н31е6701ро АТАСССАССАСАСАССАСАСССАС 31 268
Н31еб702р2 САТССААССТСССАТАТСАСССАААТАСССТАССАТС ЛАСТА 31 164
Н31е6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССТССАС АСААСССТСТТТСАСА 31 423
Н31еб702ро ТАСССАССАСАСАССАСАСССА 31 269
Н31е6703р2 САТССААССТСССАТАТСАСАСТСАССТССАСТСТТА ТСА 31 617
Н31еб703р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТАТСТА СТТСТСТОСТСТСТ 31 766
Н31еб703ро САСААССАСААССССАСАСАТС 31 687
Н31еб704р2 САТССААССТСССАТАТСАСТСАССТССАСТСТТАТС АССААТТ 31 619
Н31е6704р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТСССАА ТАТСТАСТТСТСТССТСТ СТ 31 766
Н31еб704ро С6АСААССАСААССССАСАСАТССАА 31 686
Н31е6704тЫ Х2-ссдааддССАСААССАСААССССАСАСАТСС ААссе^сдд -Х3 31 686
Н31е6704тЬ2 Х2-ссдБсдССАСААССАСААССССАСАСАТССА Асдасдд -Х3 31 686
Н31е6704тЬЗ Х2-сасдйсдССАСААССАСААССССАСАСАТССАА сдасдЬд -Х3 31 686
Н31еб704тЬ4 Х2-сдсадсССАСААССАСААССССАСАСАТССАА дсСдсд -Х3 31 686
Н31е6704тЬ5 Х2-сдайсдССАСААССАСААССССАСАСАТССАА сдаЪсд -Х3 31 686
Н31е6705р2 САТССААССТСССАТАТСАСАСТСАССТССАСТСТТАТ 31 617
н31еб705р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССАССАТ ТССАААТСАССССАТ 31 809
НЗЗеб701р2 САТССААССТСССАТАТСАСТАТССТСААССААСТСА ССТАТ 33 618
НЗЗеб701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТТСАСА САТАААССААСТС 33 763
Н33е6701ро САСАТССАСААССАСААСС 33 694
НЗЗе67ОЗр2 САТССААССТСССАТАТСАСТССТСААССААСТСАСС ТАТ 33 620
НЗЗе67ОЗр1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССССАТА АСТАСТТССТСТАТ 33 807
Н33е6703ро ССАСААССАСААССАСССАСАСС 33 699
НЗЗе67ОЗтЫ Х2-ссаадсССАСААССАСААССАСССАСАССдсЕ Сдд -Х3 33 699
НЗЗе67ОЗтЬ2 Хг-ССаадсдССАСААССАСААССАСССАСАСС сдсЕЬдд -Х3 33 699
НЗЗе67ОЗшЬЗ
Х2-сссадсССАСААССАСААССАСССАСАССдсБ
699
- 21 006975
ддд
НЗЗе67ОЗтЬ4 Хг-ссааадсССАСААССАСААССАСССАСАССд сЬСЬдд -Х3 33 699
НЗЗеб7ОЗтЬ5 Хг-сс±дсССАСААССАСААССАСССАСАССдсадд-Х3 33 699
НЗЗе67ОЗтЬ6 Хг-сда±сдССАСААССАСААССАСССАСАССсда ±сд -Х3 33 699
НЗЗе6702р2 САТССААССТСССАТАТСАССАССТТТСТСТССТСАА САА 33 431
НЗЗе6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССАССТСА СТТССТТСАССАТА 33 618
Н33еб702ро АСАААСТССАСТСТСАССТСТ 33 543
Н35е6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСАТТАСАССССАСТСАСС ТАТ 35 217
Н35еб701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССТСТТТ ССТТТТСААСТССА 35 442
Н35е5б01ро АТАСАСААССССАСССАТАТ 35 270
Н35е6702р2 САТССАА6СТСССАТАТСАСТСАСАССАССАССААСА ТАСТА 35 655
Н35еб702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСС6АТТАТ ССТСТСТСТСААСА 35 844
Н35еб703р2 САТССАА6СТС6САТАТСАСССССАСССААСТСАССТ АТА 35 610
Н35е6703р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССТСААТ СТСТСТССТСТСТА 35 770
Н35е6702ро САСААССААААССАСАСАССТССАА 35 692
Н35еб703ро САСААССААААССАСАСАСС 35 692
Н52е6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСТТСТСТСАССТССТССА АСААТ 52 144
Н52е6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССССТСТ СТТСТААТСТТТ 52 358
Н52е6701ро СТСССТАСССТТТТТАТСТА 52 296
Н52е6702р2 САТССААССТСССАТАТСАССТСССТАСССТТТТТАТ СТА 52 296
Н52е6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССЗСТС ТССААСАСТСТСААСА 52 507
Н52еб702ро ТССАААСААСС6АТТТСА 52 461
Н58еб701р2 САТССААССТСССАТАТСАСТСАССССТТССАСАСАТС 58 157
Н58е6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССАССААТ ССТААССАСАСТ 58 301
Н58еб702р2 САТССААССТСССАТАТСАСТСТСТССАТСАААТССАА 58 173
Н58е6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССАССАСА СТТТАСАТАСТС 58 291
Н58еб701ро ТСАААТСССТТСААТССА 58 192
Н58е6702ро ТТССАСССАТСТСАССТАТАТС 58 218
НВе6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСТАСАСТССТССАСААСАТ В(11) 514
НВе6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСС6А6ААС0ТСАТСТ В (11) 619
- 22 006975
ТСТСАССТСТСТ
НВе6702р2 САТССААССТСССАТАТСАСТАСАСТССТССАСААСА ТССА В( 11) 514
НВе6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССТСАСА ТССАСАССААСАССТСА В (11) 693
НВе6701ро СТАСССТТАСАТТССТАТСА В(11) 590
НВе6702ро СТАСССТТАСАТТССТАТСАСС В<11) 590
НВе6703р2 САТССААССТС6САТАТСАСТСАССТСТТССТСТССА ТСТСА В (11) 693
НВе6703р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТАССТС ААТССТСССССАТ В(11) 832
НВе6703ро АТИСТСТСТСССАТСТСС В(11) 794
НСе6701р2 САТССААССТСССАТАТСАССАТСССАТАААТСТАТАСА С (18 39 45) 295
НСеб701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССАСССС АСССАССТТАТТАА С (18 39 45 408
НСе6701ро АСААТТАСАСААТТААСА С (18 39 45 324
Н39еб701р2 САТССААССТСССАТАТСАСССАСАССАССАСТАСАС СААА 39 210
Н39е6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССАСАССС АСТСССАСТААТА 39 344
Н39е6701ро АТАСССАСССССААССАСТ 39 273
Н39еб702р2 САТССААССТСЗСАТАТСАСТАТТАСТСССАСТСССТСТ 39 344
Н39е6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССТТССС ТТТСТСТТССТСТТА 39 558
Н39е6702ро ССАССАСААААССССАССАС 39 531
Н39е6703р2 САТССААССТСССАТАТСАССАААТАСАТСААССССА ССА 39 703
Н39е6703р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССАСАС САСССАСАСАСААА 39 886
Н39е6703ро ТАСССАСАССССАТСААССАСАСС 39 749
ΗΡν45ρ2 САТССААССТСССАТАТСАСААССАТТСААСССАССА СААА 45 430
ΗΡν45ρ1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТСТТТС ТТССССТСССТССТСА 45 527
Η₽ν45ρο СТАСССАССССАСТСТААТА 45 500
Н45е6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСААССАТТСААСССАССА СААА 45 430
Н45е6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТСТТТС ТТССССТСССТССТСА 45 527
Н45е6702р2 САТССААССТСССАТАТСАССАААССАТТСААСССАС САСАААА 45 428
Н45еб702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТТССТА ТАСТТСТСТТТСССТАСС 45 558
Н45еб701ро СТАСССАССССАСТСТААТА 45 500
Н45е6702ро ССАСАААССААСАТТТСАСА 45 4 67
- 23 006975
Н45е6703р2 САТССААССТСССАТАТСАССТТСАССТСТТСТСТТА ССАССААТ 45 656
Н45е6703р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССАССАС ССАСАСАСАААССАСААС 45 868
Н45е6704р2 САТССААССТСССАТАТСАССТСТТСАССТСТТСТСТ ТАССА 45 654
Н45е6704р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССАССС АСАСАСАААССАСААС 45 868
Н45е6705р2 САТССААССТСССАТАТСАССТТСАССТСТТСТСТТА ССА 45 656
Н45е6705р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССАСССАС АСАСАААССАСААС 45 868
Н45е6703ро САСТСАСАССАССААААССАТС 45 686
Н45е6704ро АССААААССАТСААССАСАТССАСТ 45 696
Н45еб705ро АСААСТАССАСССССАССАССССАА 45 730
Н51е6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСССАССАССАТСААСТАС АТА 51 658
Н51е6701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССССАТ ТААСАТСТССТСТА 51 807
Н51еб702р2 САТССААССТСССАТАТСАСАСАССАССАССАТСААС ТА6АТА 51 655
Н51е6702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССАССССС АААССАСССТТАСТ 51 829
Н51е6701ро ьСаССтьттСАлСтСтаБта 51 747
Н51е6702ро ТСССАСТССАААССАСТССАСАСА 51 771
Н56е6701р2 САТССААССТСССАТАТСАСТТССССТССТССАСАСА ААСАТСТ 56 519
Н56еб701р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССТТСАТС СТСАТССТСАТССТСТСА 56 665
Н56е6702р2 САТССААССТСССАТАТСАСТССССТССТССАСАСАА АСАТС 56 520
Н5беб702р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССАТССТ САТССТСАТССТСТСА 56 665
Н5бе6703р2 САТССААССТСССАТАТСАСТТССССТССТССАСАСА ААСАТ 56 519
Н56е6703р1 ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССАСАА АСТТАСАСТСАСААСА 56 764
Н5бе6701ро АААСТАССААСССТССААСАССТ 56 581
Н56е6702ро АСААСТААСАССТСАААСАСАААТ 56 610
Н5бе6703ро АСТАССААСССТССААСАССТТ 56 583
Н5беб703ро1 ТТССАСАССТСАСАС6АТСА6С 56 656
Н56еб704р2 САТССААССТСССАТАТСАССАТТТТССТТАТССАСТ СТС 56 279
Н5беб704р1 ААТТСТААТАС6АСТСАСТАТА6С6АСААС6САСАТС ТСТАССАССТТАТТ 56 410
Н56еб704ро 6АСТАТТСАСТ6ТАТ6СА6С 56 348
НРУАРО1А СААСТСАУСТМУАСТСТТАТСА А (16
- 24 006975
31 35)
НРУАро1АтЫ Х2-сдса£дСААСТСАУСТМУАСТСТТАТ<эАсаСдсд -Хэ А (16 31 35)
НРУАро1АтЬ2 Хг-ссдЪсдСААСТСАУСТМУАСТСТТАТСАсда сдд -Х3 А (16 31 35)
НРУАро1АтЬЗ Х2-ссасссСААСТСАУСТМУАСТСТТАТСАдд дСдд -Х3 А (16 31 35)
НРУАро1АтЬ4 НРУАРО4А НРУАРО4АтЫ НРУАРО4АтЬ2 НРУАРО4АтЬЗ НРУАРО4АтЬ4 НРУАРО4АтЬ5 НРУСРО4 Хг-сдаСсдСААСТСАУСТМУАСТСТТАТСАсда Ссд -Х3 ОААМСААСТСАССТАУИСТОСТАТ Хг-ссаадсСААМСААСТСАССТАУИСТССТАТдс седд -Х3 Х2-ССаадссСААМСААСТбАССТАУИСТбСТАТ ддсССдд -Х3 Х2-ссаадсдОААМСААСТСАССТАУИСТССТА ТсдсЪЪдд -Х3 Х2-ссадсд<ЗААМСААСТСАССТАУ»СТССТАТсд сЬдд -Х3 Х2-сдаесдбААМСААСТСАССТАУИСТССТАТсд аЪсд -Хэ ААСАСАТТАТТСАСАСТС А (16 31 35) А (33 52 58) А (33 52 58) А (33 52 58) А (33 52 58) А (33 52 58) А (33 52 58) С (18 45 39)
НРУСРО4АтЫ Хг-ссаадсААСАСАТТАТТСАСАСТСдсЪЪдд -Х3 С (18 45 39)
НРУСРО4АтЬ2 Хг-сдсаЪдААСАСАТТАТТСАСЗАСТСса-едсд -Хэ С (18 45 39)
НРУСРО4АтЬЗ Х2-сссадсААСАСАТТАТТСАОАСТСдсЪддд -Х3 С (18 45 39)
НР7СРО4АтЬ4 Х2-сдаСсдАА6АСАТТАТТСАбАСТСсдаСсд -Х3 С (18 45 39)
Пары праймеров Р1 и Р2, обладающие одинаковым префиксом (например, НАе6701р1 и НАе6701р2), предназначены для применения в сочетании. Однако также можно применять другие сочетания, как обобщено ниже для НРУ типов 16, 18, 31, 33 и 45.
Пригодные пары праймеров для амплификации мРНК Е6 НРУ 16 представляют собой следующие пары:
НАе6701р2 или НАе6702р2 (оба п! 116) с НАе6701р1 или НАе6702р1 (оба п! 368).
НАе6701р2 или НАе6702р2 (оба п! 116) с НРУ16р1 (п! 258).
Н16е6702Ар2 (п! 142), Н16е6702Вр2 (п! 182), Н16е6702Ср2 (п! 185) или Н16е6702Пр2 (п! 188) с НАе6701р1 или НАе6702р1 (оба п! 368).
НАе6701р2 или НАе6702р2 (оба п! 116) с НАе6702Ар1 (п! 208), НАе6702Вр1 (п! 191), НАе6702Ср1 (п! 186) или 11.Ае6702[)р1 (185). Данные сочетания пригодны для амплификации всех вариантов сплайсинга Е6.
НАе6703р2 или НАе6704р2 (оба п! 656) с НАе6703р1 или НАе6704р1 (оба п! 741). Данные сочетания пригодны для амплификации всех транскриптов, содержащих кодирующую область Е7 (по меньшей мере, до п! 741).
Следующие пары праймеров предпочтительны для амплификации мРНК Е6 НРУ 18:
Н18е6701р2 (п! 702) или Н18е6702р2 (п! 698) с Н18е6701р1 или Н18е6702р1 (оба п! 869).
Н18е6703р2 (п! 651) с Н18е6703р1 (п! 817).
Н18е6704р2 (п! 179) с Н18е6704р1 (п! 379).
Следующие пары праймеров предпочтительны для амплификации мРНК Е6 НРУ 31:
Н31е6701р2 или Н31е6702р2 (оба п! 164) с Н31е6701р1 или Н31е6702р1 (оба п! 423).
Н31е6703р2 (п! 617), Н31е6704р2 (п! 619) или Н31е6705р2 (п! 617) с Н31е6703р1 (п! 766), Н31е6704р1 (766) или Н31е6705р1 (п! 809).
Следующие пары праймеров предпочтительны для амплификации мРНК Е6 НРУ 33:
Н33е6701р2 (п! 618) или Н33е6703р2 (п! 620) с Н33е6701р1 (п! 763) или Н33е6703р1 (п! 807).
Н33е6702р2 (п! 431) с Н33е6702р1 (п! 618).
Следующие пары праймеров предпочтительны для амплификации мРНК Е6 НРУ 45:
НРУ45р2 (п! 430) с НРУ45р1 (п! 527)
- 25 006975
Таблица 4
Праймеры для ПЦР Е6
Название праймера
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
ТипНРУ
ИАе6701РСК2 НАе6701РСК1 НАе6702РСЙ2 НАе67Р2РСЯ1 НАеб703РС&2 НАе67ОЗРСЯ1 НАе6704РСК2 НАе6704РСВ1 Н18е6701РСЙ2 Н16е6701РСК1 Н18еб?02РСК2 К18е6702РСВ1 Н18еб703РСК2 Н18е6703РСВ1 Н18е6704РСК2
ССАСАБСАбССАСССАСАААбТТА
АС66ТТТ6ТТ6ТАТТВСТ6ТГС
ССАСАССАСССАСССАСААА
66ТТТСТТ6ТАТТ6СТСТТС САСАСОАВбАССАТСАДАТАбТА ССАСААСССААСССТАБАСТСАСАС
САСА6САС0АССАТСАААТАСА
ССАСААСССААСССТАСАСТСА
АС6АТ6АААТАСАТ65А6ТТ САСССАСАСАСАДАССАСАС
6ААААС6АТ5АААТА6АТССАС АСАССАСОСАСАСАСАААССАСАС ТТССССТТСАССТТСТАТСТ ССТССТСТССТСАССТТТСТ 6СААСАСАТАСАААТААССТС
Н18»б704РСЙ1 Н31еб701РСЕ2 Н31е6701РСЙ1 И31е6702РСК2 Н31С6702РСК1 Н31еб703РСК2 Н31е6703₽СК1 Н31е6704РСН2 Н31е6704РСК1 Н31е6705РСН2 Н31е6705РСВ1 НЗЗе6701РСК2 НЗЗеб701₽СН1 НЗЗеб7ОЗРСК2 НЗЗе67ОЗРСА1 НЗЗеб702РСК2 НЗЗеб702РСН1 Н35е6701₽СК2 Н35е6701РСН1 Н35е6702РСК2 Н35е6702РСЯ1 Н35е6703РСК2 Н35е6703РСК1 Н52«б701РСК2 Н52е6701РСК1 Н52е6702РСА2 Н52еб702РСК1 Н58еб701РСК2 Н58е6701РСК1 Н58е6702РС82 Н58еб702РСВ1 НВеб701РСВ2 НВе6701РСВ1 НВеб702РСВ2 НВеб702РСК1 ИВе6703РСК2 ИВе6703РСК1 НСеб701РСН2
АСССАСТСТТАСТТАСТТ ССАААТАСССТАССАТСААС_______
ССАСАСААСССТСТТТ6АСА_______
66АААТАСССТАССАТ6ААСТА СТ56АСАСААС66ТСТТТ6АСА
АСТСАССТССАСТСТТАТСА ТАТСТАСТТ6Т6Т6СТСТСТ_______
ТСАССТССАСТБТТАТСАССААТТ ТСССААТАТСТАСТТСТСТССТСТ СТ АСТСАССТССАСТСТТАТ_________
САССАТТССАААТСАССССАТ______
ТАТССТСААССААСТСАССТАТ ТТСАСАСАТАААССААСТС________
ТССТСААССААСТСАССТАТ_______
СССАТАА6ТАСТТССТОТАТ_______
САССТТТ6Т6ТССТСАА0АА_______
АССТСАСТГССТТСАССАТА АТТАСАССССАСТСАССТАТ СТСТТТССТТТТСААСТССА .ТСАСАССАССАССААСАТАСТА САТТАТ6СТСТСТСТСААСА_______
ССССАСССААСТСАССТАТА_______ бТСААТбТбТбТОСТСТбТА_______
ТТСТСТСАССТССТССААСААТ_____
СССТСТСТТСТААТСТТТ_________
СТСССТАСССТТТТТАТСТА_______
0С66ГСТССААСАСТСТ6ААСА ТСАССССТТСБАСАСАТС_________
АССААТС6ТАА6САСАСТ_________
ТСТ6Т5САТБАААТССАА_________
АССАСАСТТТАСАТАСТС_________
ТАСАСТССТССАСААСАТ ТСАТСТТСТСАССТСТСТ_________
ТАСАСТССТССАСААСАТССА______
СТСАСАТССАСАССААСАС6ТСА ТСАССТСТТССТСТССАТСТСА ТАССТСААТССТСС6ССАТ_________
САТОССАТАААТСТАТАбА
НСе6701₽СК1
САССССАСССАССТТАТТАА
Н39е6701РСК2 Н39е6701РСМ Н39е6702РСВ2 Н39е6702РСН1 Н39С6703РСВ2 Н39е6703РСВ1 Н45еб701РСЯ2 Н45еб701РСЯ1 Н45е6702РСН2 Н45е6702₽СП1
ССАСАССАССАСТАСАССААА
АСАСССАСТСССАСТААТА
ТАТТАСТС66АСТС56Т6Т СТТБССТТТСТСТТССТСТТА 6АААТА5АТ6ААССС6АССА 0САСАССАС66АСАСАСААА
ААССАТТСААСССАССАСААА
ТСТТТСТТССССТБССТ6СТСА САААССАТТСААСССАССАСАААА ТТОСТАТАСТТСТСТТТСССТАСС
31
31
31
31
33
33
33.....
35
35___
35___
52___
52___
5В
58___
58___
В{11) В(11> В(11) Βί 111 В(11) в (11} С (18 39 45 С (18 39 45 39
39
39___
39___
39___
45___
45
116
36В
116
368
656
741
656
741
702
869 ~698~
869
651
817
179 ~379
164
423
164
423
617
766
619
766
617
809
618
763
620
807
431
61В
217
442
655
844
610
770
144
358
296
507
157
301
173
291
514
619
514
693
693
832
295
40В
210
344
344
558
703
886
430
527
428
558
- 26 006975
Н45е6703РСА2 СТТСАССТСТТСТетТАССАССААТ 45 656
Н45е6703РСВ1 САССАСССАСАСАСАААССАСААС 45 868
Н45е6704РСК2 СТСТТСАССТСТТСТСТТАССА 45 654
Н45еб704РС81 ССАСССАСАСАСАААЗЗАСААЗ 45 868
Н45е6705РСК2 ЗТТЗАССТСТТЗТСТТАСЗА 45 656
Н45е6705РСЙ1 АСООАСАСАСАААЗСАСАА6 45 868
Н51в6701РСК2 ВЗАЗЗАЗВАТЗААСТАЗАТА 51 658
Н51е6701РСК1 ЗСССАТТААСАТСТССТСТА 51 807
Н51е6702РСВ2 азасзасзазсатзаавтасата 51 655
Н51е6702РСР1 АСССССАААССАЗССТТАСТ 51 829
Н56е6701РСВ2 ТТССССТССТССАСАСАААСАТСТ 56 519
Н56е6701₽СЯ1 ТТСАТССТСАТССТСАТССТСТСА 56 665 -
Н5бе6702РСН2 ТЗСЗЗТЗСТЗЗАЗАСАААСАТС 56 520
Н5бе6702РСК1 САТССТСАТССГСАТССТСТОА 56 665
Н56е6703₽СН2 ТТ6В66Т6СТЗЗАЗАСАААСАТ 56 519
Н56е6703РСК1 ССАСАААСТТАСАСТСАСААСА 56 764
И56е6704РСй2 САТТТГССТТАТССАСТСТЗ 56 279
Н56е6704₽СК1 ВАСАТСТВТАВСАССТТАТТ 56 410
Предпочтительные пары праймеров для ПЦР к НРУ типов 16, 18, 31 и 33 представляют собой аналоги пар праймеров для ΝΆ8ΒΆ.
Таблица 5
Предпочтительные праймеры и зонды для ΝΆ8ΒΆ Е1
Название праймера ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Опс2А2 5’ САТССААЗЗТСССАТАТСАЗААТСССАТТТЗТТСЗЗСТАА 3’
0пс2А1 5’ ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАЗСЗАЗААССТСАТАТТССТССССАТЗТС 3’
Опс2РоА 5' ТТЗТТАСТСТТСТТСАТАСТАС 3’
Опс2В2 5’ САТССААЗЗТСССАТАТЗАЗААТСССАТТТЗТТЗЗЗаНАА 3'
Ог.сЗВ! 5» ААТТСТААТАСЗАСТСАСТАТАОЗЗАЗААЗЗ-САТАТТССТСпНСА-йОС 3*
Опс2РоВ 5' ТТСТТАСТСТТВТТСАТАСУАС 3’
Опс2₽оС 5' ТТСТТАСТЗТТСТТЗАТАССАС 3*
Опс2С2 5' БАТВСАА36ТС8САТАТ8АЗААТЗССАТТТЗТТВ3511АА 3’
Опс2Ц2 5' ЗАТССААССТСССАТАТСАСААТСЗСАТТТСТТЗЗИНАА 3'
ОПС2Е2 5' ЗАТССААССТСССАТАТСА0ААТСЗСАТТТЗТТЗВ1К1АА 3’
Опс2Г2 5’ САТССААбСТСВСАТАТЗАСААТбвСАТТТВТТСВВСТАА 3'
Опс232 5' САТЗСААССТСССАТАТСАСААТСбСАТТТЗТТЗСЗСААА 3'
Опс2Н2 5' САТЗСААСЗТСЗСАТАТСАСААТСЗСАТТТСТТЗССАТАА 3’
Опс2Х2 5’ ЗАТССААССТСЗСАТАТбАбААТЗЗСАТТТСТТСССЗСАА 3’
Опс2Л2 5* САТССААСВТСВСАТАТСАВААТСССАТТТЗТТСССАСАА 3’
Опс2К1 5* ААТТСТААТАСЗАСТСАСТАТАСЗЗАЗААЗСТСАТАТТССТСМ1САТ61С 3’
Опс2Ы 5’ ААТТСТААТАСЗАСТСАСТАТАЗЗЗАЗААССТСАТАТТССТСААСАТС1С 3*
Опс2М1 5* ААТТСТААТАСЗАСТСАСТАТАЗСЗАВААССТСАТАТТССТСЫСАТОТС 3*
Опс2Н1 5' ааттстаатасзастсастатаззсазаасзтсататтсстсисатссс 3’
Опс2О1 5’ ААТТСТААТАСЗАСТСАСТАТАССЗАСААЗЗТСАТАТТССТСИСАТСАС 3’
Опс2Р1 5' ААТТСТААТАСЗАСТСАСТАТА6СЗАЗААССТСАТАТТССТС11САТССС 3'
- 27 006975
Таблица 6
Предпочтительные праймеры для ПЦР Ы
<а»ваниапраймара ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Олс2А1-РСй 5* ААТ6ССАТТТСТТС6ССТАА 3’
Опс2А2-РСК 5' ТСАТАТТССТССССАГСТС 3’
Опс2Э1-РСВ 5’ ААТС6САТТГСТТС05КНАА 3’
Опс2В2-РСК 5’ ТСАТАТТССТСММСАТСЮС 3*
Опс2С1-РСВ 5’ ААТСаСАТТТСТТССЗИАА 3’
Опс2О1-₽СВ 5' ААТСССАТТТСТТССИНАА 3’
Опс2Е1-РСЯ 5« ААТСССАТТТСТТСС1В1АА 3*
0ПС2Г1-РСВ 5' ААТСОСАТТТСТТбСбСТАА 3'
Олс2С1-?СВ 5‘ ААТСССАГТТСТТССССААА 3'
ОПС2Н1-РСЯ 5’ ААТСЮСАТТТСТТСССАТАА 3’
0ПС211-РСЙ 5' ААТСССАТТТСТТСССССАА 3’
0ПС2Л-РСВ 5* ААТСССАТТТОТТСССАСАА 3’
Опс2К2-РСН 5’ ТСАТАТТССТСМ1САТС1С 3’
Опс2Ь2-₽СВ 5' ТСАТАТТССТСААСАТХИС 3'
ОПС2М2-РСН 5’ ТСАТАТТССТСИСАТСТС 3’
Опс2»2-₽СВ 5‘ ТСАТАТТССТС11САТССС 3’
Опс2О2-РСК 5’ ТСАТАТТССТС11САТСАС 3’
Опа2₽2-₽СК 5’ ТСАТАТТССТС11САТССС 3‘
Специфичные для НРУ последовательности 51:0 ΙΌ ΝΟ. 149 и 150 (праймеры Οηс2Α2/Οηс2Α1-РСΚ и Οηс2Α1/Οηс2Α2-РСΚ) идентичны фрагментам геномной последовательности НРУ типа 16 в положениях 6596-6615 (5Ер ΙΌ ΝΟ. 149; Οηс2Α2/Οηс2Α1-РСΚ) и в положениях 6729-6747 (5Ер ΙΌ ΝΟ. 150; Οηс2Α1/Οηс2Α2-РСΚ).
Специфичные для НРУ последовательности 51:0 ΙΌ ΝΟ. 152 и 153 (Οηс2Β2/Οηс2Β1-РСΚ и (О^Ш/СО^Ю-РСк) представляют собой варианты указанных выше последовательностей, соответственно, включая несколько вырожденных оснований. Представление последовательностей описанных здесь вырожденных олигонуклеотидов применяет стандартный код ΙϋΒ для смешанных участков оснований: Ν=Θ,Α,Τ£; У=ОА,С; Β=Ο,Τ£; Н=А,Т,С; Ό=Θ,Α,Τ; К=О,Т; 5=О,С; Α=Α,Τ; Μ Α,Ο Υ=€,Τ; Κ=Α,Θ.
Также возможно применять варианты специфичной для НРУ последовательности 51:0 ΙΌ ΝΟ. 152 (Οηс2Β2/Οηс2Β1-РСΚ) и 51:0 ΙΌ ΝΟ. 153 (Οηс2Β1/Οηс2Β2-РСΚ) там, где любой из двух нуклеотидов 5КН на 3'-конце последовательности заменен инозином (Ι), как указано ниже:
5' ΑΑΤΘΘСΑΤΤΤΘΤΤΘΘIIНΑΑ 3'
5' ΑΑΤΘΘСΑΤΤΤΘΤΤΘΘ5IIΑΑ 3'
5' ΑΑΤΘΘСΑΤΤΤΘΤΤΘΘIΚIΑΑ 3'
Специфичные для НРУ последовательности 51:0 ΙΌ ΝΟ. 156-163 (представленные в праймерах Ο^^2, (,)пс21)2, Οηс2Е2, Ο^2Γ2, Ο^2Θ2, Ο^2^, Ο^2Ι2, Ο^2Ι2, С^СЬРСК, Οηс2^1-РСΚ, Οηс2Е1-РСΚ, Οηс2Γ1-РСΚ, Οηс2Θ1-РСΚ, Οηс2Н1-РСΚ, Οηс2I1-РСΚ и Οηс2Л-РСΚ) представляют собой варианты, основанные на специфичной для НРУ последовательности 51:0 ΙΌ ΝΟ. 152 (Οικ2132/Οικ2131РСК), тогда как специфичные для НРУ последовательности 51:0 ΙΌ ΝΟ. 164-169 (представленные в праймерах Ο^2Κ1, Ο^^Π, Ο^2Μ1, Ο^2Ν1, Ο^2Ο1, Ο^^, Οηс2К2-РСΚ, Οηс2^2-РСΚ, Ο^2Μ2РСК, Οηс2N2-РСΚ, Οηс2Ο2-РСΚ и Οηс2Р2-РСΚ) представляют собой варианты, основанные на специфичной для НРУ последовательности 51:0 ΙΌ ΝΟ. 153 (Ο^2Β1/Ο^2Β2-?ΟΚ). Данные варианты содержат вырожденные основания, а также остатки инозина (Ι). Данная разновидность последовательности позволяет олигонуклеотидам, включающим различные последовательности, связываться с множеством типов НРУ. Основания инозина не препятствуют гибридизации и таким образом их можно внести в участках изменчивости типов НРУ для конструирования консенсусного праймера, способного связываться с множеством типов НРУ.
Для амплификации ΝΑ5ΒΑ мРНК Ы НРУ можно применять любой из одного или более праймеров Οικ2Α2, Οικ2Β2, Οηс2С2, Οικ2Ι)2, Οηс2Е2, Οικ21;2, Οικ262, Οηс2Н2, Οικ2Ι2 и Οικ2.Ι2 в сочетании с любым из одного или более праймеров Οηс2А1, Οηс2В1, Ο^2Κ1, Οικ2Ο, Ο^2Μ1, Ο^2Ν1, (.)пс2(')1 и Οηс2Р1.
Для амплификации ПЦР мРНК Ы НРУ можно применять любой из одного или более праймеров Ο^2Α1-?^, Ο^2Β1-?^, Ο^2α^Κ, Οηс2^1-РСΚ, Οηс2Е1-РСΚ, Οηс2Γ1-РСΚ, Οηс2Θ1-РСΚ,
- 28 006975
Опс2Н1-РСК, Опс211-РСК и Опс2Н-РСК в сочетании с любым из одного или более праймеров Опс2Л2РСК, Оηс2Β2-РСК, Опс2К2-РСК, Опс2Ь2-РСК, Опс2М2-РСК, Опс2№-РСК, Опс2О2-РСК и Опс2Р2-РСК.
Изобретение будет более понятным при ссылке к следующим экспериментальным примерам и фигурам, где на фиг. 1А представлены результаты одиночной реакции анализа ΝΑ8ΒΑ в реальном времени с применением молекулярного бекона с ΡΑΜ на образце от пациентки для НРУ 16, тогда как на фиг. 1В представлен множественный анализ ΝΑ8ΒΑ в реальном времени с применением молекулярного бекона с ΡΑΜ фиг. 1А и молекулярного бекона, меченного техасским красным для υΐΑ;
на фиг. 2А представлена одиночная реакция ΝΑ8ΒΑ в реальном времени с молекулярным беконом с ΡΑΜ на образце от пациентки для НРУ 18, тогда как на фиг. 2В представлена множественная версия с меченным техасским красным молекулярным беконом для НРУ 18 и меченного ΡΑΜ бекона для НРУ 33;
на фиг. ЗА представлена одиночная реакция ΝΑ8ΒΑ в реальном времени с молекулярным беконом, меченным ΡΑΜ для НРУ 31, тогда как на фиг. ЗВ представлена множественная версия, включающая меченный техасским красным молекулярный бекон для НРУ 45;
на фиг. 4А представлена одиночная реакция ΝΑ8ΒΑ в реальном времени с молекулярным беконом, меченным ΡΑΜ для НРУ 33, тогда как фиг. 4В представляет собой множественную версию, включающую меченный техасским красным молекулярный бекон для НРУ 18;
на фиг. 5А представлена одиночная реакция ΝΑ8ΒΑ в реальном времени с молекулярным беконом, меченным ΡΑΜ для НРУ 45, тогда как на фиг. 5В представлена множественная версия, включающая меченный техасским красным молекулярный бекон для НРУ 45 и меченный ΡΑΜ молекулярный бекон для НРУ 31; и на фиг. 6 представлен НРУ, выявляемый посредством РгеТес! НРУ-РгооГег и ПЦР, в сравнении с цитологией или гистологией.
Пример 1. Выявление мРНК НРУ посредством основанной на ΝΑ8ΒΑ амплификации нуклеиновой кислоты и детекции в реальном времени.
Сбор и подготовка клинических образцов.
Образцы мазков по Папаниколау и НРУ собирали у 5970 женщин из программы скрининга шейки матки в Осло, Норвегия. Образцы, предназначенные для экстракции РНК/ДНК, обрабатывали, как указано ниже.
Образцы из шейки матки собирали у каждой женщины, проходящей по программе скрининга шейки матки, с применением клеточного мазка (Коуегк Μеά^са1 Оеуюех. Тйе №1Ьег1апЙ8). Клеточный мазок затем погружали в 9 мл лизирующего буфера (5 М гуанидинтиоционат). Так как РНК в 5 М гуанидинтиоционате лучше всего защищена при -70°С только 1 мл общего объема образца применяли для каждого цикла экстракции. Образцы в лизирующем буфере хранили при -20°С не более чем одну неделю, затем при -70°С до выделения ДНК/РНК.
В первом цикле экстракции РНК и ДНК автоматически выделяли от 5300 женщин с применением 1 мл от общего образца в объеме 9 мл лизирующего буфера. РНК и ДНК эктрагировали по способу выделения Βоот8 из Огдапоп Текшка (Огдапоп Текшка В. У., Βο^ΐωά 15, Р.О. Βοχ 84, 5280 ΑΒ Βаxΐе1, Тке №1Ьег1апЙ8; в настоящий момент Рютенеих, 69280 Μηΐΐν 1'Е1ойе, Ргапсе) с применением устройства для экстракции Жс118еп5™, следуя протоколу автоматической экстракции.
Клеточные линии.
ДНК и РНК клеточных линий НеЬа (НРУ 18), 81На (НРУ 16) и Са8к1 (НРУ 16) применяли в качестве положительных контролей для реакций ПЦР и ΝΑ8ΒΑ. Данные клетки также применяли как материал образца в исследовании чувствительности (пример 2). Клетки 81На обладают 1-2 интегрированными копиями НРУ 16 на клетку, тогда как клетки Са8к1 обладают от 60 до 600 копий НРУ 16 и в интегрированном и в эписомальном состоянии. Клетки НеЬа обладают приблизительно 10-50 копиями НРУ 18 на клетку.
Выявление и типирование НРУ посредством ПЦР.
Выделенную из соскоба шейки матки ДНК подвергали ПЦР с применением консенсусных праймеров ОР5+/6+ (ЕР-В-0 517 704). ПЦР проводили в 50 мкл объема реакционной смеси, содержащей 75 мМ ТГ18-НС1 (рН 8,8 при 25°С), 20 мМ (ЯН4)28О4, 0,01% Тмееп 20™, 200 мМ каждого άΝΊΤ, 1,5 мМ ΜдС12, 1 Ед рекомбинантной ДНК-полимеразы Тад (ΜΒΙ Регтеп1ак) , 3 мкл образца ДНК и 50 пмоль каждого из праймеров ОР5+ и ОР6+. После 2 мин стадии денатурации при 94°С проводили 40 циклов амплификации на устройстве для ПЦР (Рптик 96, НРЬ Ыоск, Μ^Ο, Оегтапу). Каждый цикл включал стадию денатурации длительностью 1 мин, стадию отжига праймеров при 40°С длительностью 2 мин и стадию удлинения цепи при 72°С длительностью 1,5 мин. Последнюю стадию удлинения продлевали на 4 мин для гарантии полного удлинения амплифицированной ДНК.
Положительные на ОР5+/6+ образцы подвергали ПЦР по протоколам для НРУ типов 16, 31 и 33, как указано ниже:
НРУ 16, 31 и 33: ПЦР проводили в 50 мкл содержащих 75 мМ ТП5-НС1 (рН 8,8 при 25°С), 200 мМ каждого άΝΊΤ, 1,5 мМ ΜдС12, 2,5 Ед рекомбинантной ДНК-полимеразы Тад (ΜΒΙ Регтеп1а§), 3 мкл образца ДНК и 25 пмоль каждого из праймеров. После 2 мин стадии денатурации при 94°С проводили 35
- 29 006975 циклов амплификации на устройстве для ПЦР (Рптиз 9б, НРЬ Ь1оск, МУО, Оегтапу). Каждый цикл включал стадию денатурации длительностью 30 с, стадию отжига праймеров при 57°С длительностью 30 с и стадию удлинения цепи при 72°С длительностью 1 мин. Последнюю стадию удлинения продлевали на 10 мин для гарантии полного удлинения амплифицированной ДНК. В протоколе для НРУ 33 стадия отжига проходит при 52°С. Протокол для НРУ 18. Праймеры конструировали для определения НРУ типа 18. ПЦР проводили в 50 мкл содержащих 75 мМ Тг1з-НС1 (рН 8,8 при 25°С), 20 мМ (ХН4)28О4, 0,01% Тмееп 20, 200 мМ каждого СХТР, 2,0 мМ МдС12, 2,5 Ед рекомбинантной ДНК-полимеразы Тац (МΒI Регтеп1аз), 3 мкл образца ДНК и 25 пмоль каждого из праймеров. После 2 мин стадии денатурации при 94°С проводили 35 циклов амплификации на устройстве для ПЦР (Рптиз 9б, 11РР Ь1оск, МУО, Оегтапу). Каждый цикл включал стадию денатурации длительностью 30 с, стадию отжига праймеров при 57°С длительностью 30 с и стадию удлинения цепи при 72°С длительностью 1 мин. Последнюю стадию удлинения продлевали на 10 мин для гарантии полного удлинения амплифицированной ДНК.
Набор праймеров к гену человеческого β-глобина применяли как контроль качества ДНК (ОрегаЦпд ргосеСиге, ипУегзйу Нозрйа1 Угце ишуегзйей, Αтδίе^άат, Т11е ХеФеНапсП). ПЦР проводили в 50 мкл содержащих 75 мМ ТЙ8-НС1 (рН 8,8 при 25°С), 200 мМ каждого с.1\ТР, 1,5 мМ МдС12, 1 Ед рекомбинантной ДНК-полимеразы Тац (МΒI Регтеп1аз), 3 мкл образца ДНК и 25 пмоль каждого из праймеров. После 2 мин стадии денатурации при 94°С проводили 35 циклов амплификации на устройстве для ПЦР (Рптиз 9б, НРЬ Ь1оск, МУО, Оегтапу). Каждый цикл включал стадию денатурации при 94°С длительностью 1 мин, стадию отжига праймеров при 55 °С длительностью 1,5 мин и стадию удлинения цепи при 72°С длительностью 2 мин. Последнюю стадию удлинения продлевали на 4 мин для гарантии полного удлинения амплифицированной ДНК. В качестве положительного контроля для НРУ 18 применяли НеЬа, тогда как в качестве положительного контроля для НРУ 1б применяли 81На или СаБкк В качестве отрицательного контроля применяли воду.
Применяемые для ПЦР НРУ праймеры
“ТИП— Праймер ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРАЙМЕРА Сложение 1ПИНЭ п.к.)
ВРУН Рг1 Рг2 5' ТСА ААА ОСС АСТ СТС ТСС ТСА 3’ 5’ СОТ ОТТ СТТ ОАТ ОАТСТО САА 3’ 421-440 521-540 119
ΗΡνιβ Рг1 Рг2 (5’ ТТС ССС ГТО АСС ТТС ТАТ ОТ 3’) (5’ СОТ СОТ СТС СТО АОС ТТТ СТ 3·) 651-670 817-836 186
НРУ31 Ρτί Рг2 5’ СТА САО ТАА ССА ТТС ТСС ТАТ ОС 3* 5’ АСС ТАА ТОО АОА СОТТОС ААТ ААС СС 3’ 3835-3875 3963-3988 153
НРУЗЗ Рг1 Рг2 5’ ААС ОСС АТС АОА ООА САС ААО 3’ 5· АСА САТ ААА ССА АСТ ОТО ТОТ 3’ 567-587 758 - 778 211
Ор+ О о 1 Ϊ 5’ ПТ СТТ АСТ ОТО ОТА ОАТ АСТ АС 3’ 5* САА ААА ТАА АСТ СТА ААТ САТ АТТ С 6624 - 6649 6719 - 6746 150
ВОРСОЗ ВОРСО5 Рг1 Рг2 5’ АСА САА СТ<3 ТОТ ТСА СТА СС 5’ САА АСС САА ОАО ТСТ ТСТСТ
Визуализацию продуктов ПЦР проводили на ДНК-чипе 500 ^дИеп! ТесЬпо1од1ез, ϋ8Α) согласно его инструкции. В ДНК-чипе применяют гель-электрофорез в микромасштабе с оптимальным пределом детекции от 0,5 до 50 нг/мл. Результаты обрабатывали с применением программного обеспечения 111оапа1у/ег 2100 ^дИеп! Тесйпо1о§1ез, ϋ8Α).
Следующая ниже таблица подтверждает праймеры, применяемые для ПЦР НРУ в образцах от пациенток и указывает дополнительные праймеры для ПЦР, пригодные для НРУ 35, 39, 45, 51, 52, 58 и НРУ б/11.
- 30 006975
Праймеры для ПЦР для выявления НРУ
ТИП ПРАЙМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРАЙМЕРА Положение Длина (п.н.)
НРУ 6/11 Рг1 5’ТАС АСТ ОСТ (ЮА САА САТ 3’ 5Μ-531 123
Η₽νΐ6 Рг2 РН 5’ ТСА ТСТ ТСТ ОАО СТС ТСТ 3' 5’ТСА ААА ССС АСТ ОТО ТСС ТОАЗ’ 619-634 421 -441 120
НРУ18 РЯ РН 5’ ССТ ОТТ СТГ ОАТ ОАТ СТО САА 3‘ 5’ ТТС ССС ТТС АСС ТТС ТАТ ОТ 3’ 520 - 540 651-670 186
НРУЗЕ Рг2 РН 5’ ООТ СОТ СТО СТС АОСТТТСТЗ’ 5’ СТА САС ТАА ССА ТТС ТСС ТАТ ОС 3’ 817-836 3835 - 3857 155
нрузз Рг2 РН 5'АСС ТА А ТСС АО А ССТ ТСС ААТ ААС СС 3' 5’ ААС ОСС АТС АСА ОСА САС ААО 3’ 3964-3989 567 - 587 212
НРУ 33 Рг2 РН 5’АСА САТ ААА СОА АСТ ОТО ОТО 3’ 5’ССС ОАО ОСА АСТ САС СТА ТА 3’ 758-778 610-629 231
НРУ 39 Рг2 РН 5’ ССС ОСА САСТАТТСС АА АТОЗ’ 5' ОСА ОАС САС САС ТАС АСС ААА 3’ 821-840 210-230 153
НРУ 45 Рг2 РН 5'АСА ССС АСТ ССС АСТ ДАТ АЗ’ 5’САА АСС АТТ САА ССС АСС АСА ААА 3’ 344 - 362 421-451 154
НРУ 51 Рг2 РН 5’ ТТС СТА ТАС ТТС ТОТ ТТС ССТ АС<3 3’ 5’ СОА ООАООАТОА АСТ АОАТАЗ’ 551-511 651-677 169
НРУ 52 Рг2 РН 5’ ССС САТ ТАА САТ СТО СТО ТАЗ’ 5’ СТС ССТ АСО СТГ ТГТ АТС ТА 3’ 807-826 296 - 315 233
НРУ 51 Рг2 РН 5’ 000 СТС ТСС ААС АСТ СТС ААС АЗ’ 5’ ТСА ОСС ОТТ ОСА ОАС АТС 3’ 507 - 521 157-174 162
Ор+ Рг2 Ср5* 5’АСС ААТ СОТ ААО САС АСТ 3' 5’ТТТ ОТТ АСТ СТО ОТА ОАТ АСТ АС 3 ’ 301-311 150
ВСРСОЗ Срб* РН 5’ САА ААА ТАА АСТ ОТА ДАТ САТ АТГ С У АСА САА СТО ТОТ ТСА СТА ОС
ВСРСО5 Рг2 5’САА АСС САА ОАС ТСТ ТСТ СТ
Амплификация РНК ΝΑ8ΒΑ
Меры предосторожности для исключения загрязнения.
1. Проводить высвобождение, выделение и амплификацию/детекцию нуклеиновых кислот в раздельных лабораторных зонах.
2. Хранить и получать реагенты для высвобождения, выделения и амплификации/детекции нуклеиновых кислот в тех лабораторных зонах, где проводят высвобождение, выделение и амплификацию/детекцию нуклеиновых кислот соответственно.
3. Держать все пробирки и ампулы закрытыми, когда их не используют.
4. Пипетки и другое оборудование, которое применяют в одной лабораторной зоне, не должны применяться в другой зоне.
5. Применять чистую пипетку или наконечник пипетки для каждого действия с пипеткой.
6. Применять наконечники для пипеток, стойкие к аэрозолю для жидкостей, возможно содержащих нуклеиновую кислоту. Пипетирование растворов всегда необходимо проводить из отдельной пробирки или в отдельную пробирку, которую открывают и закрывают исключительно для данного действия. Все другие пробирки и ампулы необходимо держать закрытыми и отдельно от пробирки, с которой производят манипуляции.
7. Применять одноразовые перчатки при работе с клиническим материалом, возможно содержащим РНК-мишень или амплифицированный материал. Если возможно, менять перчатки после каждой стадии пипетирования в процедуре теста, особенно после контакта с возможно загрязненным материалом.
8. Собирать использованные одноразовые материалы в контейнер. Закрывать и удалять контейнер после каждого цикла тестов.
9. Замачивать штативы для пробирок, применяемые во время выделения или амплификации/детекции нуклеиновых кислот, в детергенте (например, щелочном Мегск Рх!гап МА01) по меньшей мере, на 1 ч после каждого цикла тестов.
Следующие процедуры проводили с применением реагентов из ЫисНЗепз™ Ваз1е Κΐΐ, поставляемого Огдапоп Текшка. Процедура для п=10 образцов:
1) . Приготовление раствора фермента.
Добавить 55 мкл разбавителя фермента (из ЫиеНЗепз™ Ваз1е Κΐΐ; содержит сорбит в водном растворе) к каждой из 3 лиофилизированных гранул фермента (из ЫиеНЗепз™ Ваз1е Κΐΐ; содержит АМУ-КТ, КЫазеН, РНК-полимеразу Т7 и БСА). Оставить данный раствор фермента по меньшей мере на 20 мин при комнатной температуре. Собрать растворы ферментов в одной пробирке, хорошо перемешать легкими ударами пальцев по пробирке, подвергнуть недлительному центрифугированию и применять в течение 1 ч. Конечные концентрации смеси фермента представляют собой 375 мМ сорбит, 2,5 мкг БСА, 0,08 ЕД КЫазеН, 32 ЕД РНК-полимеразы Т7 и 6,4 ЕД обратной транскриптазы АМУ.
2) . Приготовление раствора гранула реагентов/КС1.
- 31 006975
Для 10 образцов: добавить 80 мкл разбавителя гранулы реагентов (из МюПБеик™ Вак1с К1!; содержит Тпк-НС1 (рН 8,5), 45% ДМСО) к лиофилизированной грануле реагентов (из ХисНБеик™ Вак1с К1!; содержит нуклеотиды, дитиотреитол и МдС12) и немедленно хорошо перемешать путем встряхивания. Произвести данную операцию с тремя гранулами реагентов и смешать растворы в одной пробирке.
К воссозданному раствору гранулы реагентов добавить 3 мкл воды для ХАБВА (из ХисНБеик™ Вак1с К1!) и хорошо перемешать.
Добавить 56 мкл маточного раствора КС1 (из МюНБеик™ Вак1с К1!) и хорошо перемешать. Применение данной смеси КС1/вода приведет к взаимодействию NА8ВА с конечной концентрацией КС1 70 мМ. Конечные концентрации в растворе реагенты/КС1 представляют собой 1 мМ каждого бХГР, 2 мМ АТФ, УТФ и ЦТФ, 1,5 мМ ГТФ и 0,5 мМ ИТФ, 0,5 мМ дитиотреитол, 70 мМ КС1, 12 мМ МдС12, 40 мМ Тпк-НС1 (рН 8,5).
3). Приготовление раствора праймер/зонд, содержащего специфичные для мишени праймеры и зонд в виде молекулярного бекона.
Для каждой целевой реакции перенести 91 мкл раствора гранула реагентов/КС1 (полученного на стадии 2) в чистую пробирку. Добавить 25 мкл раствора праймеров/зонда в виде молекулярного бекона (для получения конечной концентрации ~ 0,1-0,5 мкМ каждого из смысловых и антисмысловых праймеров и ~ 15-70 пмоль зонда в виде молекулярного бекона на реакцию). Хорошо смешать посредством встряхивания. Не центрифугировать.
В случае проведения менее чем 10 амплификации РНК-мишени обращаться к таблице ниже для подбора количеств раствора гранулы реагентов, раствора КС1/вода и праймеров для применения. Раствор праймеров необходимо применять в течение 30 мин после приготовления._____________________
Реакции (п) Раствор гранулы реагентов (мкл) КС1/вода (мкл) Смесь праймеров (мкл)
10 80 30 10
9 72 27 9
8 7 6 5 4 64 56 48 40 32 24 21 18 15 12 8 7 6 5 4
3 24 9 3
2 16 6 2
'1 8 3 1
4). Добавление образцов.
Для каждой реакции с РНК-мишенью в 96-луночный планшет для микротитрования в каждую из 10 лунок добавить пипеткой по 10 мкл раствора праймер/зонд (полученного на стадии 3). К каждой лунке добавить 5 мкл экстракта нуклеиновой кислоты. Инкубировать планшет для микротитрования 4 мин при 65±1°С. Охладить до 41±0,5°С на 4 мин. Затем к каждой лунке добавить 5 мкл раствора фермента. Немедленно поместить планшет для микротитрования в устройства для детекции флуоресценции (например, ХисйБеик™ Еаку() Аиа1у/ег) и запустить амплификацию.
Результаты клинического исследования
В табл. 7 представлено распределение положительных случаев НРУ (экспрессия Ь1 и/или Е6 НРУ) при ХАБВА в реальном времени и НРУ при ПЦР соотнесенных с результатами цитологии. Амплификацию ПЦР проводили, как описано у Каг1кеи е! а1., 1 С1т М1сгоЬю1. 34: 2095-2100, 1996. Данные для ожидаемой гистологии основываются на средних результатах из сходного изучения повреждений ί'ΊΝ III (С1ауе1 е! а1., Вг 1 Саисег, 84: 1616-1623, 2001). Результаты некоторых примерных случаев приведены в табл. 8.
- 32 006975
Таблица 7
Норма Легкая форма Кондилома С1Ы III
Цитология 4474 66 16 15
ПЦР 9,0% 44,6% 87,5% 73,3%
ΝΑ5ΒΑ в реальном времени 1% 24,6% 37,5% 73,3%
Ожидаемая гистология 0,2% 5-15% 15-20% 71%
Таблица 8
Внутренний №
289
926
743
1512
3437
3696
2043
3873
3634
4276
4767
1482
5217
4696
Цитология
Отриц
Отриц.
Отриц.
Доброкачественная
Доброкачественная
Доброкачественная
Доброкачественная
Кондилома
Кондилома
ΟΙΝ II
ΟΙΝ III
ΟΙΝ III
ΟΙΝ III
ΟΙΝ III
ΟΙΝ III
ПЦР
Отриц.
Отриц.
Отриц.
Отриц
16, 51
16, 51
Отриц.
Отриц.
Отриц.
ΝΑ5ΒΑ Ы
Отриц
Положит.
Положит.
Отриц.
Положит
Отриц
Положит.
Положит.
Положит.
Отриц.
Отриц.
Отриц.
Положит
Отриц
Отриц.
ΝΆ5ΒΑ Е6
Отриц.
Отриц.
Пример 2. Чувствительность ΝΛ8ΚΛ в реальном времени на контрольных клеточных линиях.
Клеточные линии рака шейки матки, Са8к1, 81На и НеБа разводили в лизирующем буфере или перед автоматическим выделением нуклеиновых кислот с применением способа выделения Воот от Огдапоп Текшка/ЬюМепеих (параллели 1 и 3) или после выделения нуклеиновой кислоты (параллель 2). в реальном времени проводили с применением зондов в виде молекулярных беконов, меченных техасским красным (16, 1.1 и 18) или ЕАМ (и1А, 33 и 31), следуя описанному ранее протоколу.
Таблица 9
Таким образом, с применением в реальном времени возможным являлось выявлять мРНК
Е6 НРУ менее чем в 1 клетке.
У^ВА в реальном времени тестировали при множественном анализе и как одиночные реакции. Результаты следующего изучения чувствительности основываются на параллельных циклах с клеточны
- 33 006975 ми линиями Са8к1, 81На и НеЬа и на трех параллельных циклах с синтетическими олигонуклеотидами ДНК для НРУ типов 16, 18, 31 и 33. Определение предела детекции представляет собой то, что оба из образцов в параллели являются положительными. Число в скобках (х) указывает на то, что количество клеток также детектировали в некоторых циклах. Чувствительность определяли как количество клеток, необходимых для выявления НРУ в двух параллельных циклах. Типы НРУ определяли посредством ПЦР, а специфичность основывается на ΝΑ8ΒΑ в сравнении с ПЦР.
Чувствительность.
ПЦР: ПЦР с консенсусными Ор5+/6+ для НРУ выявляла только до 104 клеток 81На и НеЬа и до 103 клеток Са8к1. Однако типоспецифичные наборы праймеров для ПЦР являлась более чувствительной, выявляя 103 (102) клеток 81На и 0,1 клетку Са8к1 для специфичного для НРУ типа 16 набора праймеров для ПЦР, тогда как специфичный для НРУ типа 18 набора праймеров для ПЦР выявлял 102 клеток НеЬа.
ΝΑ8ΒΑ в реальном времени: ΝΑ8ΒΑ в реальном времени с праймерами для И1А выявляла в реакционной смеси 10 (1) клеток 81На и Са8к1 и 1 клетку НеЬа. Для специфичных для НРУ 16 праймеров нижний предел выявления составлял (10) (102, 1) клеток 81На и 10 (1) клеток Са8к1, а для специфичных для НРУ 18 праймеров предел выявления составлял 1 (0,1) клетку НеЬа. Универсальные праймеры для 1.1 выявляли 10 клеток Са8к1.
Универсальные праймеры для 1.1 не выявляли клетки 81На и Нека.
Множественная ΝΑ8ΒΑ в реальном времени со специфичными для ϋ1Α праймерами обладала нижним пределом выявления величиной 102 (10) клеток 81На и 10 (1) клеток Са8к1, когда ее комбинировали со специфичными для НРУ 16 праймерами, обладавшими нижним пределом выявления 10 (1) клеток 81На и 10 (1) клеток Са8к1. Специфичные для 1.1 праймеры в сочетании со специфичными к НРУ 33 праймерами выявляли 103 (102) клеток Са8к1. В реакционной смеси не присутствовал конкурирующий образец НРУ 33. Для специфичных для НРУ 18 праймеров нижний предел выявления составлял 1 (0,1) клетку НеЬа при сочетании со специфичными для НРУ 31 праймерами. В реакционной смеси не присутствовал конкурирующий образец НРУ 31. Чувствительность специфичных для НРУ 31 и НРУ 33 праймеров не тестировали, ввиду отсутствия клеточных линий, несущих данные типы НРУ. Их тестировали в отношении образцов, содержащих НРУ 31 и НРУ 33, но количество клеток и число копий НРУ 31 и НРУ 33 в данных клетках являлось неизвестным и, наиболее вероятно, варьировало в различных образцах.
Таблица 10
ΝΑ8ΒΑ в реальном времени проводили на образцах от женщин, проходящих лечение от ΟΝ в Οδίίο1ά Сепйа1 Ноьрйа1 в период с 1999 по 2001 год (см. пример 3). Зонды в виде молекулярных беконов, меченные ΓΑΜ и техасским красным применяли вместе выделением нуклеиновой кислоты и протоколами ΝΑ8ΒΑ, описанными выше. Результаты представлены на фиг. 1А и 1Β (НРУ 16 - образец от пациентки 205), фиг. 2А и 2В (НРУ 18 - образец от пациентки 146), фиг. 3А и 3В (НРУ 31 - образец от пациентки 236), фиг. 4А и 4В (НРУ 33 - образец от пациентки 218) и фиг. 5А и 5В (НРУ 45 - образец от пациентки 343). В каждом случае фиг. А представляет собой одиночную реакцию, тогда как фиг. В представляет собой множественный анализ.
Специфичность: перекрестная реактивность ΝΑ8ΒΑ в реальном времени.
Сочетания праймеров в ΝΑ8ΒΑ в реальном времени тестировали на 490 образцах из шейки матки от исследования в Οδ1ο, с положительными результатами ПЦР для НРУ 6/11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58 или НРУ X для проверки перекрестной реактивности между типами НРУ при применении ΝΑ8ΒΑ. Все образцы типировали посредством консенсусной ПЦР и типоспецифичной ПЦР для соответствующих типов НРУ, за исключением НРУ типов 39(2), 52(1) и 58(2). Данные образцы добавляли к тесту в сравнении с РгеТе^ НРУ-Ргоокег. НРУ X является положительным в консенсусной ПЦР с Ор5+/6+, но отрицательным в специфичной ПЦР для НРУ 6/11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 51. Результаты представлены в табл. 14. Перекрестной реактивности не показывали. Подтверждение последовательности выбранного ряда случаев из табл. 14 представлены в табл. 14а.
ПЦР: всего при ПЦР и РгеТе^ НРУ-Ргоокег (множественная ΝΑ8ΒΑ в реальном времени) тестировали 773 образца из шейки матки, и всего 24,6% (190/773) образцов являлись положительными при применении в ПЦР консенсусных праймеров Ор5+/6+. 74,1% (83/112) типировали как представляющие собой НРУ 16, 13% (15/112) - НРУ 18, 17% (19/112) - НРУ 31 и 12% (13/112) - НРУ 33, включая множест
- 34 006975 венную инфекцию. Всего в 103 образцах выявляли одиночную или множественную инфекцию НРУ, а в 91,3% (94/103) выявили только одиночную инфекцию НРУ. Двойная инфекция НРУ имела место в 8,7% (9/103) образцов. Все образцы сначала тестировали с консенсусными праймерами для ПЦР Ор5+/6+. Отрицательные при ПЦР на НРУ с применением консенсусных Ор5+/6+ образцы затем тестировали с контрольными праймерами для β-глобина для проверки целостности ДНК. Положительные при ПЦР на НРУ образцы не подвергали данному контролю ДНК. Отрицательные на НРУ образцы в данном исследовании все являлись положительными при ПЦР с контрольными праймерами для β-глобина. Только те образцы ДНК, которые являлись положительными при ПЦР с Ор5+/6+, подвергали типоспецифичной для НРУ ПЦР. Интересующими типами НРУ являлись НРУ 16, 18, 31 и 33.
Множественная ΝΑ8ΒΑ в реальном времени: Для реакций ΝΑ8ΒΑ в реальном времени в качества контроля качества целостности РНК применяли праймеры и зонды для продукта гена υ1Α. Отрицательные на υ1Α образцы признавали негодными. Всего 14,2% (110/773) образцов являлись положительными, по меньшей мере, с одними из типоспецифичных для НРУ праймеров для ΝΑ8ΒΑ, включая образцы с множественной инфекцией НРУ. Из данных образцов 54,5% (60/110) являлись положительными при применении в ΝΑ8ΒΑ праймеров для НРУ 16, 13,6% (15/110) при применении праймеров для НРУ 18, 21,8% (24/110) при применении праймеров для НРУ 31 и 13,6% (15/110) при применении праймеров для НРУ 33. Всего 45 образцов являлись положительными при применении консенсусных праймеров для Ь1 и обычно вместе с экспрессией онкогена Е6/Е7 НРУ 16 82,2% (37/45). Консенсусный Ь1 выявили в 2,2% (1/45) вместе с любым из НРУ 18, 31 и 33 соответственно. Также Ь1 выявили самостоятельно в 8,9% (4/45) случаев, и они все являлись положительными при ПЦР с праймерами Ор5+/6+. Всего в 108 образцах выявили одиночную или множественную инфекцию НРУ, и в 98,1% (106/108) выявили только одиночные инфекции НРУ. Двойная экспрессия мРНК имела место в 1,9% (2/108) образцов.
Множественная ΝΑ8ΒΑ в реальном времени в сравнении с ПЦР: всего при ПЦР на НРУ 16 или РгеТес! НРУ-РгооГег показали присутствие ДНК или РНК НРУ 16 в 87 образцах. 64,4% (56/87) выявили как положительные на НРУ 16 и при ПЦР, и при ΝΑ8ΒΑ в реальном времени. 39,1% (34/87) являлись положительными только при ПЦР, а 3,4% (3/87) являлись положительными только при ΝΑ8ΒΑ в реальном времени. Всего для НРУ 18 или при ПЦР или при ΝΑ8ΒΑ в реальном времени присутствие ДНК или РНК НРУ 18 показали в 20 образцах. Из данных 20 образцов 50% (10/20) являлись положительными в обоих тестах, и 35% (7/20) являлись положительными только при ПЦР, а 15% (3/20) являлись положительными только при ΝΑ8ΒΑ в реальном времени. Всего или при ПЦР или при ΝΑ8ΒΑ в реальном времени присутствие ДНК или РНК НРУ 31 показали в 27 образцах. Из данных 27 образцов 59,3% (16/27) являлись положительными в обоих тестах, и 11,1% (3/27) являлись положительными только при ПЦР, а 18,5% (5/27) являлись положительными только при ΝΑ8ΒΑ в реальном времени. Всего для НРУ 33 или при ПЦР или при РгеТес1-НРУ РгооГег в реальном времени присутствие ДНК или РНК НРУ показали всего в 18 образцах, и 55,6% (10/18) из данных образцов являлись положительными в обоих тестах, 16,7% (3/18) являлись положительными только при ПЦР, а 22,2% (4/18) являлись положительными только при ΝΑ8ΒΑ в реальном времени.
Таблица 11 Статистическое распределение НРУ в образцах при ПЦР и ΝΑ8ΒΑ в реальном времени
ПЦР % ΝΑ3ΒΑ %
Всего образцов 773 773
Всего положитель ных образцов 190 24,6 110 14,2
НРУ 16 83 74,1 60 54,5
НРУ 18 15 13 15 13, 6
НРУ 31 19 17 24 21,8
НРУ 33 13 12 15 13,6
НРУ X 78 69,6 - -
- 35 006975
Таблица 12
Соответствие между ПЦР и ХА8ВА в реальном времени
Таблица 13
Результаты ХА8ВА в реальном времени для 1.1
Таблица 14 Генетическая специфичность множественной ХЛ8ВЛ в реальном времени в сравнении с ПЦР
Таблица 14а для включения в статью) из ПЦР с
Внутр.№ Тип ΗΡν при ПЦР Тип НРУ при РгеТесЕ-НРУ Ргоо£ег Тип НРУ при секвенировании
1272 16 16 16
152 35 35
2655 58 58
- 36 006975
2924 33
2942 18
2987 16
3016 33
3041 35
3393 35
3873 16
4767 18
5707 18
845 X
33 33
18 18
16 16
33 33
35
35
16 16
18 18
18 18
39
Обсуждение.
Чувствительность ΝΑ8ΒΑ в реальном времени, как правило, являлась лучшей, чем чувствительность ПЦР. Общая чувствительность ΝΑ8ΒΑ в реальном времени для всех маркеров составляла от 1 до 102 клеток, что существенно лучше, чем для реакции ПЦР с диапазоном чувствительности от 102 до 104. Как ожидалось, чувствительность специфичных праймеров и зондов являлась лучшей, чем чувствительность универсальных праймеров и зондов. ΝΑ8ΒΑ в реальном времени являлась почти такой же или более чувствительной, чем множественная ΝΑ8ΒΑ в реальном времени.
Праймеры и зонды в виде молекулярных беконов для ΝΑ8ΒΑ в реальном времени к υ1Α (человеческий ген домашнего хозяйства) применяли в качестве контроля качества материала образцов в реакции ΝΑ8ΒΑ в реальном времени для гарантии того, что РНК в материале образца не повреждена. Положительный сигнал в данной реакции являлся необходимым для подтверждения реакции ΝΑ8ΒΑ в реальном времени.
Чувствительность универсальной ΝΑ8ΒΑ в реальном времени для 14 (главный капсидный белок НРУ) являлась намного лучшей, чем при универсальной ПЦР с Ορ5+/6+, также направленной на Ь1, с чувствительностью 10 клеток в сравнении с 103 (102) клеток Са8к1. Данные два набора праймеров (для ПЦР и ΝΑ8ΒΑ) обладают мишенями в одной и той же области консервативного гена Е1 различных типов НРУ. Различия в чувствительности могут являться следствием того факта, что обычно существует одна копия каждого гена на клетку, тогда как количество копий мРНК может составлять несколько сотен. Праймеры для 14 в ΝΑ8ΒΑ в реальном времени не выявляют клетки 81На или НеЬа, как это делают праймеры Ορ5+/6+ для ПЦР, указывая на отсутствие экспрессии Е1 в данных клеточных линиях. Праймеры Ορ5+/6+ для ПЦР выявляют 104 клеток 81На или НеЬа. Принимая во внимание количество копий НРУ в каждой клетке, имеет смысл то, что клетки Са8к1 выявляли в 1/10 количества клеток 81На и НеЬа, так как клетки Са8к1 обладают от 60-600 копиями интегрированного и эписомального НРУ на клетку, тогда как клетки 81На обладают 1-2 копиями интегрированного НРУ на клетку, а клетки НеЬа обладают 10-50 копиями интегрированного НРУ на клетку. Набор праймеров для 14 выявил только клетки Са8к1 с интегрированными и эписомальными формами НРУ, но не клетки 81На или НеЬа только с интегрированными формами НРУ. Это может указывать на то, что ген 14 экспрессируется только в эписомальных состояниях при инфекции НРУ и, следовательно, Е1 может являться полноценным маркером интеграции и персистирования инфекции НРУ.
Типоспецифичные праймеры для НРУ для ΝΑ8ΒΑ направлены к полноразмерному транскрипту Е6/Е7, который экспрессирован в большом количестве раковых клеток из-за отсутствия продукта гена Е2. Специфичные для 16 типа праймеры для ΝΑ8ΒΑ в реальном времени выявляют 10 (1) клеток 81На и 10 (1) клеток Са8к1 в сравнении с праймерами для ПЦР для НРУ 16, которые выявляют 103 (102) клеток 81На. Объяснением этому может являться различное количество копий НРУ в каждой клеточной линии. Клетки Са8к1 обладают и интегрированными, и эписомальными формами НРУ, тогда как 81На обладает только интегрированными формами НРУ. Это может происходить вследствие высокой экспрессии мРНК с генов Е6/Е7. Для выявления клеток Са8к1 предел выявления для праймеров для НРУ 16 для ΝΑ8ΒΑ составлял 10 (1) клеток Са8к1 в сравнении с 0,1 клеткой Са8к1 для праймеров для НРУ 16 для ПЦР. Это является странным, но объяснение может состоять в том, что клетки Са8к1 содержат от 60 до 600 копий ДНК НРУ 16, так что представляется возможным выявлять 0,1 клетку Са8к1 с 6-60 копиями ДНК НРУ 16. Меньшая чувствительность ΝΑ8ΒΑ в реальном времени в сравнении с ПЦР может указывать на то, что экспрессия Е6/Е7 в клетках Са8к1 является умеренной/низкой. Деградация нестабильной мРНК также может являться объяснением. Количество копий НРУ в клетках Са8к1 может являться порядка в 60600 раз большим, чем в клетках 81На, что показано более чувствительным выявлением клеток Са8к1.
Специфичные для НРУ типа 18 праймеры для ПЦР выявляли 102 клеток НеЬа. Данная величина в 100 раз лучшая, чем для консенсусных праймеров Ορ5+/6+ для НРУ и указывает на то, что специфичные праймеры, как правило, более чувствительны, чем консенсусные праймеры. Чувствительность праймеров
- 37 006975 для НРУ типа 18 для ΝΑ8ΒΑ составляла 1 (10) клеток 81На и Са8к1, указывая на высокую экспрессию Е6/Е7 в клетках НеЬа.
Чувствительность праймеров для υ1Α для ΝΑ8ΒΑ составляла 10 клеток 81На или Са8к1. Мишень для набора праймеров для υ1Α представляет собой ген домашнего хозяйства, который экспрессируется в каждой человеческой клетке.
Чувствительность ПЦР и ΝΑ8ΒΑ варьирует для различных наборов праймеров и материала образца, а типоспецифичные праймеры, как правило, являются более чувствительными, чем консенсусные праймеры вследствие несоответствия пар оснований в консенсусных наборах праймеров. Температуру отжига для праймеров в реакции ПЦР можно оптимизировать, создавая оптимальные реакционные условия для праймеров. В противоположность температуре отжига при ПЦР, температура отжига для праймеров для ΝΑ8ΒΑ необходимо фиксировать при 41°С. Данное отсутствие гибкости в изменении температуру может делать праймеры для ΝΑ8ΒΑ менее чувствительными, чем праймеры для ПЦР.
При ПЦР амплифицируется двухцепочечная (бк)ДНК, а мишень также обычно присутствует как одна копия на клетку, а этот факт делает ее зависимой от количества клеток в материале образца. Мишень для реакции ΝΑ8ΒΑ представляет собой РНК, а мРНК может присутствовать в виде множества копий на клетку в зависимости от экспрессии генов. При выборе высоко экспрессированного гена количество копий мРНК может составлять несколько сотен на клетку и, следовательно, ее легче выявлять.
бкДНК в клетке является относительно стабильной и материал длительное время остается неповрежденным. В противоположность бкДНК, мРНК, как правило, не очень стабильна, а деградация мРНК является быстрой, в зависимости от клетки. В лизирующем буфере не выявили активности ДНКазы или РНКазы, так что и бкДНК и 8&РНК должны оставаться стабильными. Аутокаталитическая активность может разрушить ДНК и РНК. ДНК/РНК из образца из шейки матки должны оставаться неповрежденными при хранении в лизирующем буфере 24 ч при 15-30°С, 7 суток при 2-8°С или при -70°С при длительном строке хранения.
Ограничением реакции ΝΑ8ΒΑ в реальном времени является концентрация зондов в виде молекулярных беконов. Количество продуктов превысит концентрацию зондов в виде молекулярных беконов и, следовательно, его невозможно будет выявить, так как высокая концентрация зонда в виде молекулярных беконов сделает реакционную смесь более сложной и будет подавлять реакцию амплификации. Нуклеотиды также могут служить ограничением конечного количества продукта амплификации как при ПЦР, так и при реакции ΝΑ8ΒΑ. Конечная концентрация продукта амплификации может сама по себе ингибировать дальнейшую амплификацию, вследствие количества продукта и сложности реакционной смеси. В течение реакции ΝΑ8ΒΑ в присутствии молекулярных беконов зонд может конкурировать с амплификацией посредством гибридизации к матрице, делая невозможным дальнейший синтез РНК. В данном случае РНК устраняется как субстрат для стадии обратной транскрипции и дальнейшего синтеза посредством РНК-полимеразы Т7. Данная конкуренция не существенна при малых количествах молекулярного бекона, а при больших количествах молекулярного бекона данное ингибирование можно преодолеть большим числом копий исходной РНК.
Линейную зависимость между количеством исходной РНК и временем до положительного сигнала тестировали в серии десятикратных разведений различных линий клеток с НРУ.
Существовало четкое свидетельство тому, что положительный сигнал зависел от количества исходной РНК и времени. Множественная реакция нуждалась в большем времени, чем одиночная реакция для выявления положительного сигнала. Это может являться следствием конкуренции в более сложной смеси в резервуаре для множественной реакции, а также следствием того факта, что множественная реакция обладает различной и меньшей концентрацией праймера и зонда. Связь между количеством РНКмишени и временем до положительного сигнала обнаруживается для реакции множественной количественной амплификации с внутренними стандартами РНК в каждом реакционном резервуаре.
ΝΑ8ΒΑ в реальном времени: одиночная против множественной. ΝΑ8ΒΑ в реальном времени, как правило, более чувствительна, чем множественная ΝΑ8ΒΑ в реальном времени. Этого ожидали, вследствие конкуренции между праймерами и зондами во множественной реакции. Конечные концентрации праймеров и зондов в виде молекулярных беконов оптимизировали во множественной реакции так, чтобы по меньшей мере для одного из наборов праймеров и зондов концентрация являлась меньшей, чем для одиночной реакции. Из этого следует, что с меньшей концентрацией праймеров уменьшается чувствительность реакции или, по меньшей мере, уменьшается скорость реакции. Для достижения экспоненциальной фазы реакции амплификации потребуется большее время и, следовательно, большее время потребуется для выявления продуктов. Концентрация праймеров не является ограничением конечной концентрации продукта реакции ΝΑ8ΒΑ вследствие того, что создаваемая с данных праймеров двухцепочечная ДНК продолжает служить матрицей для РНК-полимеразы снова и снова в цикле. Чувствительность множественной ΝΑ8ΒΑ в реальном времени являлась одинаковой для НРУ 16 и НРУ18 в сравнении с одиночной ΝΑ8ΒΑ в реальном времени, но чувствительность для Ь1 радикально уменьшалась от предела выявления 10 (1) в одиночной реакции до 103 (102) клеток Са8к1 во множественной реакции. Для праймеров для υ1Α для ΝΑ8ΒΑ чувствительность уменьшалась от 10 (1) до 102 (10) клеток Са8к1, тогда как предел выявления для клеток Са8к1 оставался таким же. Данное уменьшение предела выявления мо
- 38 006975 жет привести к более сложной конкуренции праймеров и зондов в виде молекулярных беконов во множественной реакции. Конечная концентрация праймеров и зондов в виде молекулярных беконов может являться не лучшей, а различные праймеры и зонды в виде молекулярных беконов во множественной реакции могут мешать друг другу. Праймеры для И1А для ПА8ВА выявляют 1 клетку НеЬа. Можно было бы ожидать такой же уровень выявления во всех клеточных линиях, но чувствительность клеток НеЬа составила 1/10 уровня выявления клеток 81На и Са8к1. Данные клеточные линии представляют собой раковые клетки, а они могут обладать различным влиянием на клетки так, что экспрессия И1А различается. Различия также могут являться следствием различного количества клеток в каждой реакции, вследствие ошибок подсчета при сборе клеток.
При ПА8ВА в реальном времени не показали перекрестной реактивности НРУ 16, 18, 31 и 33 или с НРУ 6/11, 35, 39, 45, 51, 52, 58 или с НРУ X.
Специфичность реакции ПЦР может являться лучшей, чем специфичность ПА8ВА в реальном времени вследствие того, что реакция ПА8ВА представляет собой изотермическую реакцию при 41 °С без возможностей изменить температуру отжига праймеров. Праймеры в основном предназначены для той же цели, что и праймеры при ПЦР. При реакции ПЦР специалист имеет возможность изменить температуру отжига в противоположность реакции ПА8ВА и, следовательно, выбирать ту температуру отжига, которая является оптимальной для данных двух праймеров. Это делает отжиг праймеров более специфичным. Результаты ПЦР визуализировали электрофорезом в геле. Но зонды в виде молекулярных беконов при реакции ПА8ВА в реальном времени представляют собой дополнительный в сравнении с ПЦР параметр и, следовательно, суммарно могут делать реакцию ПА8ВА более специфичной. Также проще найти две различных области на последовательности ДНК для отжига праймеров, вследствие того, что существует большая гибкость в выборе длины продукта ПЦР, чем продукта ПА8ВА, которая должна составлять менее чем 250 п.н. Для специфичности реакции ПА8ВА важен выбор уникальной области, не являющейся консервативной в различных типах НРУ. Спаривание несоответствующих пар оснований может все еще приводить к амплификации или гибридизации мишени.
Выявление в клетках Са8к1 (в интегрированном или эписомальном состоянии) с универсальными праймерами для Ь1 для ПА8ВА, но не в 81На или НеЬа (в обоих в интегрированном) может указывать на то, что интегрированный НРУ не демонстрирует никакой экспрессии Ь1, тогда как НРУ в эписомальном состоянии может обладать экспрессией Ь1.
В итоге разработан анализ идентификации для НРУ типов 16, 18, 31 и 33, с помощью которого можно точно идентифицировать экспрессию онкогенных Е6/Е7 данных типов НРУ. С помощью анализа также можно идентифицировать экспрессию главного капсидного белка Ь1.
Пример 3. Дополнительное клиническое исследование 190 пациентов.
Пациенты/клинические образцы.
Образцы биопсии от 190 женщин, проходящих лечение от ΟΝ в Оз(ГоШ Сеп!га1 Нозрйа1 в период с 1999 по 2001 г. Средний возраст 190 женщин, включенных в исследование, составлял 37,4 года (диапазон 22-74 года). Образцы биопсии замораживали при -80°С непосредственно после получения.
Цитологическое исследование образцов.
Для записи цитологических данных анализа использовали стандартные цитологические отчеты. Попыток повторной оценки образов не проводили. В каждом из них показано состояние ΟΝ ΙΙ-ΙΙΙ, т.е. выраженная дисплазия или Н8ГЬ, которая являлась основанием для госпитализации, кольпоскопии и биопсии.
Гистологическое исследование образцов.
Образец биопсии, обозначенный здесь как образец биопсии 1, забирали после отчета о выраженной цитологии. Если подтверждали выраженные повреждения (ΟΝ ΙΙ или ΙΙΙ) пациентки снова госпитализировали, в этот раз для кольпоскопически проводимой конизации. Перед конизацией, но после применения локальной анестезии забирали второй образец биопсии (образец биопсии 2) из области той части, где с наибольшей вероятностью находится дисплазия, исходя из грубых данных. Данный образец биопсии (2x2 мм) замораживали в течение 2 мин в морозильной камере при -80°С.
Образец биопсии 2 после заморозки разделяли на две части и половину использовали для экстракции ДНК/РНК. Другую половину фиксировали в 10% буферизованном формальдегиде и обрабатывали для гистопатологического обследования. Некоторые очаги повреждения являлись неправильно ориентированными в парафиновом блоке и их переориентировали или серийно рассекали для выявления подходящего поверхностного эпителия. Следовательно, невозможно гарантировать то, что для выделения и для гистопатологической оценки применяли ту же ткань нельзя. Наконец, образец конизации оценивал патолог данного учреждения, который во всех случаях мог подтвердить наличие дисплазии. Она не всегда являлась такой же степени, как и в исходном образце биопсии, а во многих случаях не такой же, как в образце биопсии 2.
Экстракция нуклеиновых кислот.
Нуклеиновые кислоты выделяли с применением №1с1|8епз Ех(гас!ог, описанного ранее (Воот е! а1., 1990). Каждый образец биопсии разрезали на две части: одна предназначена для гистологического обследования, а другая половина для анализа РНК. Предназначенный для анализа РНК материал разделяли
- 39 006975 на меньшие части на сухом льду (-80°С) и помещали в 1 мл лизирующего буфера (как описано выше) с последующими 20 с гомогенизации с применением одноразовых пестиков. 100 мл образца далее разбавляли в 10 раз в лизирующем буфере и 100 мл затем выделяли для ДНК/РНК. Экстрагированную ДНК/РНК разбавляли ~ 40 мл буфера для элюции (Огдапоп Текпка) и хранили при -70°С.
Все зонды в виде молекулярных беконов, применяемые в данном исследовании, содержали на 5'конце структуры флуорофор РАМ (6-карбоксифлуоресцеин). Он связывался с изменяющейся последовательностью стебель-петля, связанной на 3'-конце с универсальным гасителем 4-(4'-диметиламинофенилазо)бензойной кислотой (ПАВСУЬ). Зонды поставляла фирма Ецгодеп!ес, Ве1дшт. Конечная концентрация МВ, применяемая в реакции, составляла 2,5 мМ. Для ΝΛ3ΒΛ в реальном времени авторы настоящего изобретения применяли Ыис118еп8 Ваис Кй (Огдапоп Текшка, №!йег1апЙ8), предназначенный для разработки определенных пользователем анализов амплификации РНК. Амплификацию ЫА8ВА проводили в объеме 20 мкл. Наборы праймеров и зонды являлись направленными к полноразмерной мРНК Е6/Е7 для НРУ высокого риска 16, 18, 31 и 33. Как контроль качества, во избежание ложноотрицательных результатов вследствие деградации нуклеиновой кислоты, авторы настоящего изобретения применяли набор праймеров и зонд, направленные к человеческому белку А, специфичному для малого ядерного рибонуклеопротеина И1 (кпКНР) (мРНК И1А) (№1к§еп е! а1., 1991). Все образцы анализировали в двух экземплярах на отдельных устройствах (устройства для анализа микропланшетов для измерения флуоресценции и поглощения, Вю-1ек РЬ-600 РА от М\УС). Выделенная из клеток Са8к1/81На или НеЬа мРНК служила в качестве положительных контролей для транскриптов НРУ 16 и НРУ 18, соответственно. Отрицательные контроли, состоящие из реакционной смеси, содержащей все реагенты кроме мРНК, включали для каждых 7 реакций.
Анализ ДНК НРУ: полимеразная цепная реакция.
Те же экстракты и количества, которые применяли в реакции ЫА8ВА, применяли для ПЦР. Консенсусные праймеры Ср5+/Ср6+ для Ь1 применяли для выявления всех образцов, содержащих ДНК НРУ. Амплификацию ПЦР проводили, как описано выше. Первую денатурацию ДНК проводили 2 мин при 94°С, затем проводили 40 циклов ПЦР: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 2 мин при 40°С, удлинение - 1,5 мин при 72°С с последующим финальным удлинением 4 мин при 72°С. Типирование НРУ проводили с применением типоспецифичных праймеров для ПЦР к НРУ НРУ 16, 18, 31 и 33 (6/11, 35, 45, 51, 52, 58), как описано выше.
Результаты.
Исходно у 190 пациенток брали биопсию после постановки диагноза СГЫ I, СГЫ II или СГЫ III посредством цитологии. Выраженные очаги повреждения подтверждали гистологическим обследованием, 150 образцов диагностировали как СГЫ III (78,9%). Образцы биопсии 2, собранные до конизации, применяли для анализа РНК. Однако при гистологическом обследовании данных образцов биопсии как СГЫ III диагностировали только 53 образца из исходных 150 [54 не поставили диагноз, 24 диагностировали как СГЫ II, 18 как СГЫ II и 4 как НРУ/кондилома]. Количество образцов с СГЫ II увеличилось с 16 (8,4%) до 30 (15,8%) [при гистологическом обследовании I 24 диагностировали как СГЫ III, 4 как СГЫ II, 1 как карциному и 1 как СГЫ I. В 12 случаях СГЫ II из гистологического обследования I поставили более мягкий диагноз при гистологическом обследовании II]. Уровень СГЫ I увеличился с 6 образцов (3,2%) до 32 образцов (16,8%). 2 случая плоскоклеточной карциномы при гистологическом обследовании II диагностировали как СГЫ III, аденокарциному как СГЫ II. В 71 образце (38,4%) не диагностировали выраженные повреждения.
Онкогенную РНК НРУ выявили у 69 (36%) из 190 пациенток. Из 53 образцов (28%), диагностированных как СГЫ III при гистологическом обследовании II, авторы настоящего изобретения обнаружили 40 (76%) случаев, показавших онкогенную экспрессию НРУ 16, 18, 31 или 33. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили онкогенную экспрессию в 9 из 30 (30%) случаях СГЫ II, в 4 из 32 случаях (13%) СГЫ I, в 14 из 71 случая (20%), в которых не показали клеточных аномалий и в 2 из 4 (50%) случаях, диагностированных как НРУ/кондилома.
РНК НРУ 16 обнаружили у 42 из 190 пациенток, НРУ 18 обнаружили у 7 (3,7%), НРУ 31 у 15 (7,9%) и НРУ 33 у 8 (4,2%). У одной пациентки обнаружили смешанную инфекцию НРУ 16 и НРУ 18 и у одной НРУ 16 и НРУ 31.
С применением консенсусных праймеров Ср5+/Ср6+ направленных к гену Ь1, кодирующему главный капсидный белок, при помощи ПЦР выявили НРУ 18 у 81 из 190 образцов биопсии из шейки матки (43%). Из 119 случаев с поставленным диагнозом при втором гистологическом обследовании (115 диагностированных как СГЫ, 4 как НРУ/кондилома) в 63 обнаружили содержание ДНК НРУ. В дополнительных выявленных 18 случаях не поставили никакого гистологического диагноза. 20 из 81 случая не выявляли посредством ЫА8ВА; 7 из них поставили диагноз СГЫ III, 2 диагностировали как СГЫ II, 4 диагностировали как СГЫ I и 7 не поставили никакого диагноза.
С применением типоспецифичной ПЦР выявили 85 случаев содержания НРУ; 66 несли НРУ 16, 10 НРУ 18, 14 - НРУ 31, 7 - НРУ 33. В 12 случаях обнаружили множественную инфекцию: 3 с НРУ 16+18; 4 с НРУ 16+35, 5 с НРУ 16+31. В 20 случаях диагноза не поставили.
- 40 006975
Пример 4.
Выявленный посредством РгеТес( НРУ-Ргоо£ег и ПЦР НРУ в сравнении с цитологией и гистологией.
Нормальные образцы и образцы с А8Си8 (включая мазки с пограничными случаями) определяли посредством цитологии. Все образцы тестировали в консенсусных ПЦР и РгеТес( НРУ-Ргоо£ег, но только положительные при консенсусных анализах образцы типировали посредством ПЦР. Образцы с СШ 3 и раком определяли посредством гистологии, а все образцы тестировали всеми тремя способами. Результаты представлены на фиг. 6. Соответствие между множественной NА8ВА в реальном времени и ПЦР в сравнении с цитологией или гистологией представлено в табл. 15 ниже.
Таблица 15
Соответствие между множественной NА8ВА в реальном времени и ПЦР в сравнении с цитологией или гистологией
Цитология/ гистология Соответствие3 (Кол-во) Соответствие19 (Кол-во)
Норма 98,2% (4043) 42,8%(138)
лзсизс 94,5%(55) 78,6%(14)
С1Ы 3 94,3%(53) 93,2%(44)
Рак 99,0%(196) 98,8%(170)
Типировали только образцы, положительные при ПЦР с Ср5+/6+.
а Включая положительные и отрицательные при ПЦР и множественной NА8ВА в реальном времени образцы.
Ь Включая только положительные при ПЦР и множественной NА8ВА в реальном времени образцы.
с А8СИ8 исключая мазки с пограничными случаями.
Пример 5.
Изобретение относится к набору для выявления транскриптов мРНК с гена(ов) Е6 НРУ, содержащему одну или более, две или более, а предпочтительно все из следующих пар праймеров и сопровождающие зонды для идентификации.
НРУ 16:НРУ 16.1x17905 п.н.
НРУ16Р2:
¢2:116 (20) ОАТаСААОСТСОСАТАТаАОССАСАбСАСССАСССАСААА р1 (поТ)
ААТГСТААТАССАСТСАСТАТАССОАОААОС АТТ ССС АТС ТСТ АТА ТАС ТА (51
Ывег)
НРУ16РО2:
ро:230 (20) ТАТСАСТГТОСТГГГСОССА
Н16с6702ро
ΗΡνΐ8:ΗΡνΐί.Μ7857 пл.
НРУ18Р2.
р2:698 (22) ОАТССДЛО<ГГСОСАТАТОАОСААААССАТ<ЗАААТАСАТаСАО Н18е6702р2
НРУ18Р4:
р1:817(20)
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАОССАОААОСОСТСОГСТССТСАаСТТТСТ
Н18е6703р1 (МиШр1ех)
НРУ18РО2ро:752(21) ОААССАСААССТСАСАСААТС
Н18еб7О2ро
НРУ 31:НРУ31.ЙЙ 7912 П.Н.
ΗΡΥ3ΙΡ3:
р2:617 (20) НЛТ(ЮААСХПГХХ^<ГАтаАОАСТСАССТССАСТ^
- 41 006975
Н31е6703р2 р1:766 (20)
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАООСАОААООТАТСТАСТТСЗТаТССТСТСТ
Н31е6703р1
НРУ31РО4:
ро:68б(2б) ООАСААССАОААССССАСАСАТССАА
Н31сб704ро
НРУ 33:ИРУЗЗ.йй 7909 П.Н.
НРУЗЗР1:
р2:61« (22) САТТЗСААССТСССАТАТСАбТАТССТОААССААСТСАССТАТ
НЗЗеб7О1р2 р1:763 (19)
ААТТСТААТАС6АСТСАСТАТА0С0А0ААССТТ0АСАСАТАААССААСТС
НЗЗе6701р1
НРУЗЗРОЗ:
рО*699(23) ООАСААОСАСААССАОССАСАОС Н33е6703ро
В качестве альтернативы зондам, представленным выше, набор может необязательно содержать один или более следующих зондов в виде молекулярных беконов.
Зонды в виде молекулярных беконов:
Н1бе6702тЬ2-ГАМ се^1ТАТОАСТТГОСГГГГССООА«Вс11В
Н18еб702тЫ-ТхК
Н31еб7О4тЬ2-ГАМ скса^ААССАСААССТСАСАСААТОса^ сс^К8СЗОАСААОСАСАА€СООАСАСАТССААс8асв8 ссаа^сОСАСААССАСААССАСССАСАСС^сПи
НЗЗеб7ОЗгиЫ-ЕАМ
Предпочтительно набор по изобретению также включает следующие пару праймеров и зонд:
НРУ45: НРУ45.Ш 7858П.Н(Х74479)
НРУ45Р1:
р2:430 (21): аАТССААООТГОСАТАТЦАОААССАТТСААСССАОСАОААА
Н45е6701р2 р1:527(22):
ААТТСТААТАСОАСТСАСТАТАСССАСААОСТСТТТСТТОСССТаССТбСТСА
Н45е67О1р1
НРУ45РО1:
ро:500(20> 0ТАСС0А600САСТСТААТА
Н45с6701ро
Зонд для НРУ 45, указанный выше, можно заменить на зонд для НРУ в виде молекулярного бекона, как указано ниже: Н45е6701тЬ1 сда!сдОТАССОАОООСАОТОТААТАсда1:сд. Кроме того, набор может содержать один или более из следующих пар праймеров и сопровождающих зондов в зависимости от географической области применения данного набора.
- 42 006975
НРУ52: НРУ52.» 7М2П.Н(Х744«1)
НРУ52Р1:
р2:144(22): ОАТСКЬ\А(ХПаХ^ТАТОА<ПТОТСТОАССТОСТООААСААТ
Н52с6701р2 р! :3 5 8 (18): ААТГСТААТАСОАСТС^СТАТАССаАСААОСХХСТСТиТТСТААТШТТ
Н52е6701р1
НРУ52РО1:
Ро:296(2О): ОТОССТАСОСТГГТТАТСТА
Н52е6701ро
НРУ58 ΗΡΥ58.!χί 7824П.Н (090400)
НРУ58Р2:
р2:173 (18): ОАТО^аСГСОСАТАТОАСТСТОТОСАТСАААТССАА
Н58е6702р2 р!291 (18):
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАОСОАСААСЮАбСАСАСТТГАСАТАСТС
Н58е6702р1
НРУ58РО2;
ро:218(22): ТГССАСССАТСТОАССТАТАТС
Н58е6702ро
НРУ 51 НРУ51.ех17808ПЛ(М62877)
НРУ51РА/Р:
р2:655 (23): ОАТОСААООТСОСАТАТОАС АОА (ЗОА ОСА СОА ТОЛ АСТ АСА ТА
Н51е6702р2 р1:807(20): ААТТСТААТАСОАСТСАСТАТАОООАОААОО ССССАТТААСАТ СТО
СТО ТА Н51еб701р1 .
НРУ51РОА:
ро:771 (24): ТОО САС ТОО ААА ОСА ОТО ОАО АСА
Н51в67о2ро
Зонды, представленные выше, в наборе можно заменить на следующие зонды в виде молекулярных беконов:
Н52еб701тЫ с|а1с8СТСССТАСССТТТТТАТСТАсёассе
Н58е6702тЫ сс^с&ТТОСАСССАТСТСАССТАТАТОс<»С88
Н51е6702шЫ ΕβϋϋβΤΰα САС ТОО ААА ОСА ОТО ОАО АСАсв«с§

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ ΐη νίΐΐΌ скрининга субъектов-людей для оценки у них риска развития карциномы шейки матки, включающий скрининг субъекта на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Е6 НРУ и классификация субъекта в одну из двух категорий риска развития карциномы шейки матки, основанных на экспрессии мРНК Е6, при этом индивидуумов, положительных по экспрессии мРНК Е6, считают несущими интегрированный НРУ или модифицированный эписомальный геном НРУ и, следовательно, классифицируют как подверженных высокому риску развития карциномы шейки матки, тогда как индивидуумов, отрицательных по экспрессии мРНК Е6, считают не несущими интегрированный НРУ или модифицированный эписомальный геном НРУ и, следовательно, классифицируют как не подверженных выявляемому риску развития карциномы шейки матки; характеризующийся тем, что скрининг на наличие экспрессии мРНК Е6 проводят с применением изотермической амплификации в сочетании с детекцией продукта амплификации в реальном времени.
    - 43 006975
  2. 2. Способ ш νίΐΐΌ идентификации субъектов-людей с аномальными клеточными изменениями в шейке матки, включающий скрининг субъекта на наличие экспрессии транскриптов мРНК гена Е6 НРУ, при этом индивидуумов с наличием экспрессии мРНК Е6 идентифицируют как несущих аномальные клеточные изменения в шейке матки; характеризующийся тем, что скрининг на наличие экспрессии мРНК Е6 проводят с применением изотермической амплификации в сочетании с детекцией продукта амплификации в реальном времени.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что изотермическая амплификация представляет собой ΝΑ8ΒΑ, опосредованную транскрипцией амплификацию, опосредованную сигналом амплификацию РНК или изотермическую амплификацию в жидкой фазе.
  4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что скрининг на наличие экспрессии проводят с применением ΝΑ8ΒΑ в реальном времени.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что субъекты-люди представляют собой субъектов, у которых ранее было идентифицировано инфицирование ДНК вируса папилломы человека в клетках шейки матки.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что субъекты-люди представляют собой субъектов, с ранее поставленным диагнозом Α8Сυ8, повреждения СЧХ 1 или кондилома.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что включает скрининг на наличие экспрессии мРНК Е6 с использованием технологии, способной обнаружить мРНК Е6 по меньшей мере одного ассоциированного с раком типа НРУ.
  8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что включает скрининг на наличие экспрессии мРНК Е6 с использованием технологии, способной обнаружить мРНК Е6 НРУ типов 16, 18, 31, 33 и предпочтительно 45.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что индивидуумов, положительных по экспрессии мРНК Е6 по меньшей мере одного из НРУ типов 16, 18, 31, 33 или 45, считают несущими интегрированный НРУ.
  10. 10. Набор, используемый для обнаружения транскриптов мРНК гена(ов) Е6 НРУ, включающий одну или более пар праймеров, позволяющих проводить амплификацию области транскриптов Е6 НРУ типов 16, 18, 31 и 33 посредством ΝΑ8ΒΑ и один или более зондов в виде молекулярного бекона.
  11. 11. Набор по п.10, отличающийся тем, что включает отдельные пары праймеров, специфичные для каждого из НРУ типов 16, 18, 31 и 33.
  12. 12. Набор по п.10 или 11, отличающийся тем, что включает одну или более, две или более, а предпочтительно все из следующих пар праймеров и сопровождающих зондов для идентификации:
EA200400919A 2002-01-07 2003-01-07 Способ обнаружения мрнк вируса папилломы человека EA006975B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0200239A GB0200239D0 (en) 2002-01-07 2002-01-07 Method for detecting human papillomavirus mRNA
GB0214124A GB0214124D0 (en) 2002-06-19 2002-06-19 Method for detecting human papillomavirus mRNA
PCT/GB2003/000034 WO2003057914A2 (en) 2002-01-07 2003-01-07 METHOD FOR DETECTING HUMAN PAPILLOMAVIRUS mRNA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400919A1 EA200400919A1 (ru) 2005-02-24
EA006975B1 true EA006975B1 (ru) 2006-06-30

Family

ID=26246916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400919A EA006975B1 (ru) 2002-01-07 2003-01-07 Способ обнаружения мрнк вируса папилломы человека

Country Status (21)

Country Link
US (4) US7553623B2 (ru)
EP (5) EP1463839B1 (ru)
JP (2) JP4558322B2 (ru)
CN (1) CN100422342C (ru)
AT (1) ATE354677T1 (ru)
AU (2) AU2003201639C1 (ru)
BR (1) BR0306723A (ru)
CA (1) CA2472026A1 (ru)
CY (1) CY1106621T1 (ru)
DE (1) DE60311961T2 (ru)
DK (2) DK2913407T3 (ru)
EA (1) EA006975B1 (ru)
ES (2) ES2282599T3 (ru)
HK (1) HK1065827A1 (ru)
IL (2) IL162722A0 (ru)
MX (1) MXPA04006440A (ru)
NO (1) NO20042769L (ru)
NZ (1) NZ533703A (ru)
PT (1) PT1463839E (ru)
SI (1) SI1463839T1 (ru)
WO (1) WO2003057914A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US20110111389A1 (en) * 2001-11-07 2011-05-12 Diagcor Bioscience Incorporation Limited Rapid genotyping analysis for human papillomavirus and the device thereof
SI1463839T1 (sl) * 2002-01-07 2007-08-31 Norchip As Metoda za detekcijo mRNA humanega papiloma virusa
EP1369694A1 (en) * 2002-04-09 2003-12-10 MTM Laboratories AG Method for discrimination of metaplasias from neoplastic or preneoplastic lesions
ATE434167T1 (de) * 2003-03-07 2009-07-15 Univ New Jersey Med Optisch dekodierbare mikroträger, arrays und verfahren
US7361460B2 (en) * 2003-04-11 2008-04-22 Digene Corporation Approach to molecular diagnosis of human papillomavirus-related diseases
EP1510820B1 (en) * 2003-08-25 2010-03-17 MTM Laboratories AG Method for detecting medically relevant conditions in a solubilized LBC sample
ATE289685T1 (de) * 2003-08-25 2005-03-15 Mtm Lab Ag Verfahren zum nachweis von karzinomen in solubilisierten zervikalen körperproben
WO2005030041A2 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Third Wave Technologies, Inc. Detection of hpv
WO2005033333A2 (en) 2003-10-07 2005-04-14 Dako Denmark A/S Methods and compositions for the diagnosis of cancer
WO2005062940A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 John Wayne Cancer Institute Method and apparatus for in vivo collection and surveillance of circulating biological components
GB0404315D0 (en) * 2004-02-26 2004-03-31 Norchip As Improved detection of human papillomavirus
ITMO20040126A1 (it) 2004-05-21 2004-08-21 Bioanalisi Ct Sud S N C Di Per Sistema per la ricerca ed identificazione di agenti patogeni
WO2006137939A2 (en) * 2004-11-09 2006-12-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group a streptococci
WO2006063065A2 (en) 2004-12-08 2006-06-15 Gen-Probe Incorporated Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses
ES2511218T5 (es) 2005-06-20 2017-12-07 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Kits y productos para detección de ácidos nucleicos en células individuales y para identificación de células raras en grandes poblaciones de células heterogéneas
KR20080084809A (ko) 2005-11-15 2008-09-19 게노이드 케이에프티. 병원체를 검출하는 방법
ES2476277T3 (es) * 2006-04-11 2014-07-14 Bio-Rad Innovations Detección y cuantificación de VPH por amplificación múltiple en tiempo real
US7833716B2 (en) * 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
WO2008071998A2 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Oncomethylome Sciences Sa Diagnostic methods for diseases caused by a hpv infection comprising determining the methylation status of the hpv genome
EP3121286B1 (en) 2006-12-21 2019-11-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US7838215B2 (en) * 2007-09-25 2010-11-23 Canvir, Inc. Advanced cervical cell screening methods
JP5299986B2 (ja) * 2007-11-01 2013-09-25 国立大学法人山口大学 核酸の定量方法
HUE029729T2 (en) * 2007-11-01 2017-03-28 Self-Screen B V A new method for detecting cervical HPVs
WO2009129505A2 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions, methods, and kits using synthetic probes for determining the presence of a target nucleic acid
EP2347011B1 (en) 2008-10-27 2017-01-18 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and system
EP2184368A1 (en) 2008-11-07 2010-05-12 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Diagnostic transcript and splice patterns of HPV16 in different cervical lesions
CA2760542A1 (en) * 2009-05-01 2010-11-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample
CA2773320C (en) * 2009-09-14 2018-02-20 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
EP2521778B1 (en) * 2010-01-04 2014-03-19 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Methods, compositions, and kits for recovery of nucleic acids or proteins from fixed tissue samples
CA2787924A1 (en) * 2010-01-29 2011-08-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
CA2787781A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of an hpv in a sample
US20110275698A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-10 Norchip A/S "test and treat" strategy for treating transforming hpv infection
AU2011255638B2 (en) 2010-05-19 2016-08-25 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
EP2576840B1 (en) 2010-05-25 2018-10-17 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
CN103429755A (zh) 2010-10-21 2013-12-04 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
US20120196274A1 (en) * 2011-01-07 2012-08-02 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and methods for genotyping and quantifying a high-risk human papillomavirus
WO2012103414A2 (en) * 2011-01-28 2012-08-02 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Rnascope® hpv assay for determining hpv status in head and neck cancers and cervical lesions
EP2678442B1 (en) 2011-02-24 2019-01-16 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acid
US20130095474A1 (en) * 2011-10-13 2013-04-18 Joseph Mamone Design of stem-loop probes and utilization in snp genotyping
EP2773745B1 (en) 2011-11-03 2019-04-10 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Materials and method for immobilizing, isolating, and concentrating cells using carboxylated surfaces
CN102864224A (zh) * 2012-09-11 2013-01-09 南京大学 一种血清microRNAs试剂盒及其应用
GB201310933D0 (en) 2013-06-19 2013-07-31 Norchip As A method of cervical screening
US10072302B2 (en) * 2013-12-05 2018-09-11 Optipharm.Co., Ltd. Cervical cancer diagnosing method and diagnostic kit for same
WO2016005789A1 (en) * 2014-07-07 2016-01-14 Institut Pasteur Broad range gene and genotype papillomavirus transcriptome as a biomarker of papillomavirus- associated cancer stages
CN106048014B (zh) * 2016-06-07 2019-12-10 博奥生物集团有限公司 一种用于实时检测nasba产物的高特异探针
US20190112673A1 (en) * 2017-05-10 2019-04-18 Genomic Vision Association between integration of high-risk hpv genomes detected by molecular combing and the severity and/or clinical outcome of cervical lesions
JP6831772B2 (ja) 2017-12-22 2021-02-17 株式会社Ｓｕｂａｒｕ 画像投影装置
CN114214343A (zh) * 2021-11-15 2022-03-22 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一组高危型HPV整合所致的***中特异表达的mRNA序列

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR930007580B1 (ko) 1986-03-21 1993-08-13 엥스띠뛰 빠스뙤르 유두종 비루스 게놈으로부터 유도된 결정 dna 서열, 그의 시험관내 진단 목적용 용도 및 항원 조성물의 제조 방법
EP0357611B1 (en) * 1987-02-26 1995-04-26 The University Of Sydney A method of detection of carcinogenic human papillomavirus
US5639871A (en) * 1988-09-09 1997-06-17 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction
US5182377A (en) 1988-09-09 1993-01-26 Hoffmann-La Roche Inc. Probes for detection of human papillomavirus
DE3838269A1 (de) * 1988-11-11 1990-05-17 Behringwerke Ag Nachweis humaner papillomavirus dna und ihrer expression in zervix-abstrichen
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
JP2791685B2 (ja) 1989-06-08 1998-08-27 寳酒造株式会社 パピローマウイルスの検出方法
EP0502994B1 (en) * 1989-12-01 1995-09-06 Amoco Corporation Detection of hpv transcripts
US5580970A (en) * 1989-12-01 1996-12-03 Amoco Corporation Detection of HPV transcripts
NL9000134A (nl) 1990-01-19 1991-08-16 Stichting Res Fonds Pathologie Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papilloma virus genotypen m.b.v. pcr.
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5506105A (en) 1991-12-10 1996-04-09 Dade International Inc. In situ assay of amplified intracellular mRNA targets
AU6945694A (en) * 1993-05-06 1994-12-12 Dade International Inc. Human papillomavirus detection assay
US6174668B1 (en) 1993-05-14 2001-01-16 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of two or more target DNA's using primers having matched melting temperatures
ATE545711T1 (de) 1993-11-12 2012-03-15 Phri Properties Inc Hybridisierungssonden zur nukleinsäuredetektion sowie universelle stämme, verfahren und kits
DE4431174A1 (de) * 1994-09-01 1996-03-07 Deutsches Krebsforsch Nachweisverfahren für tumorspezifische mRNA
DE19506561C1 (de) 1995-02-24 1996-10-10 Deutsches Krebsforsch Verfahren zur Früherkennung von HPV-assoziierten Karzinomen bzw. von hochgradigen, durch HPV-verursachten Dysplasien
AU726047B2 (en) * 1995-11-15 2000-10-26 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes complementary to human papillomavirus nucleic acid and related methods and kits
US6027981A (en) 1997-10-27 2000-02-22 Texas Instruments - Acer Incorporated Method for forming a DRAM cell with a fork-shaped capacitor
CA2313641A1 (en) * 1997-12-12 1999-06-24 Digene Corporation Universal collection medium
WO2000000638A2 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Akzo Nobel N.V. Tagging of rna amplicons generated by transcription-based amplification
US20020132227A1 (en) * 2000-03-28 2002-09-19 Biosearch International Pty. Ltd. Approaches for HPV detection and staging by targeting the E6 gene region of the viral genome
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
GB0018050D0 (en) 2000-07-21 2000-09-13 Norchip As Detection of human papillomavirus mRNA
US20050175987A1 (en) * 2001-08-23 2005-08-11 Kathrin Jansen Fluorescent multiplex hpv pcr assays using multiple fluorophores
GB0200258D0 (en) * 2002-01-07 2002-02-20 Norchip As Detection of human papillomavirus
SI1463839T1 (sl) 2002-01-07 2007-08-31 Norchip As Metoda za detekcijo mRNA humanega papiloma virusa
GB0404315D0 (en) * 2004-02-26 2004-03-31 Norchip As Improved detection of human papillomavirus

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
US9803232B2 (en) 2008-09-30 2017-10-31 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
US10689685B2 (en) 2008-09-30 2020-06-23 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples

Also Published As

Publication number Publication date
EP2267155B1 (en) 2013-03-13
BR0306723A (pt) 2004-12-21
EA200400919A1 (ru) 2005-02-24
ES2654909T3 (es) 2018-02-15
CA2472026A1 (en) 2003-07-17
US20050118568A1 (en) 2005-06-02
NZ533703A (en) 2006-05-26
US8420314B2 (en) 2013-04-16
EP1715062A2 (en) 2006-10-25
DK1463839T3 (da) 2007-07-02
EP2267155A3 (en) 2011-06-08
EP2272988A3 (en) 2011-06-15
AU2003201639A1 (en) 2003-07-24
NO20042769L (no) 2004-10-04
EP1715062A3 (en) 2007-07-11
IL162722A0 (en) 2005-11-20
CN1639357A (zh) 2005-07-13
JP2010131020A (ja) 2010-06-17
DK2913407T3 (en) 2018-01-15
JP5204132B2 (ja) 2013-06-05
PT1463839E (pt) 2007-05-31
ES2282599T3 (es) 2007-10-16
IL162722A (en) 2013-09-30
EP2913407B1 (en) 2017-11-01
SI1463839T1 (sl) 2007-08-31
US7812144B2 (en) 2010-10-12
EP1463839A2 (en) 2004-10-06
EP1463839B1 (en) 2007-02-21
CY1106621T1 (el) 2012-01-25
HK1065827A1 (en) 2005-03-04
US20130309658A1 (en) 2013-11-21
DE60311961T2 (de) 2007-10-18
EP1715062B1 (en) 2015-03-11
AU2003201639C1 (en) 2009-02-26
WO2003057914A2 (en) 2003-07-17
WO2003057914A3 (en) 2004-02-26
US20090253124A1 (en) 2009-10-08
EP2267155B2 (en) 2016-09-07
US7553623B2 (en) 2009-06-30
EP2272988A2 (en) 2011-01-12
EP2913407A1 (en) 2015-09-02
MXPA04006440A (es) 2005-03-31
CN100422342C (zh) 2008-10-01
JP4558322B2 (ja) 2010-10-06
JP2005514038A (ja) 2005-05-19
DE60311961D1 (de) 2007-04-05
US20090275044A1 (en) 2009-11-05
EP2267155A2 (en) 2010-12-29
AU2003201639B2 (en) 2008-05-15
AU2008205436A1 (en) 2008-09-04
ATE354677T1 (de) 2007-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA006975B1 (ru) Способ обнаружения мрнк вируса папилломы человека
Millholland et al. Detection of low frequency FGFR3 mutations in the urine of bladder cancer patients using next-generation deep sequencing
WO2006075245A2 (en) Systems, methods, and compositions for detection of human papilloma virus in biological samples
EP1718774B1 (en) Detection of human papillomavirus
EP2773776B1 (en) Broad detection of dengue virus serotypes
WO2022089550A1 (en) Novel compositions and methods for coronavirus detection
US20070281295A1 (en) Detection of human papillomavirus E6 mRNA
EA014648B1 (ru) Способ обнаружения патогенов
WO2004087957A2 (en) Hypermethylated genes and cervical cancer
JP2003528595A (ja) ヒト乳頭腫ウイルスの検出
ZA200404971B (en) Method for detecting human papillomavirus mRNA.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU