CN106048014B - 一种用于实时检测nasba产物的高特异探针 - Google Patents

一种用于实时检测nasba产物的高特异探针 Download PDF

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Abstract

本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针及检测NASBA产物的方法。本发明所述高特异探针由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1‑4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。本发明所述高特异探针应用于NASBA扩增产物的检测，灵敏度高，特异性强，且缩短了检测时间，使得NASBA检测技术可更好的应用于病原微生物的核酸检测。

Description

一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针
技术领域
本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针。
背景技术
近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于分子诊断试剂中。恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前恒温扩增技术主要有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链置换扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增等。恒温扩增具有快速、高效、特异性好等优点，且无需专用设备。
依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即NASBA扩增技术，是在PCR基础上发展起来的一种扩增RNA的新技术。NASBA是由一对带有T7启动子序列的引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增的过程。在41℃恒温条件下，在反应速度方面，NASBA扩增1h可将模板RNA扩增约109～1012倍，而通常的PCR反应需要2～3h。在检测灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低于10gene copies/μL的痕量靶标，而PCR的检测限在100gene copies/μL左右。因此，NASBA技术无论是扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅需要一个41℃的恒温条件，水浴锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降温等常规PCR所依赖的温控设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还具有操作简便、特异性强、灵敏度高等诸多优点，已广泛应用于病原体、肿瘤诊断和监控、疾病易发性检测、兽疾诊断等领域。
目前，NASBA扩增产物的检测主要包括直接检测、SBA电化学发光技术、寡核苷酸检测和SBA分子信标检测。直接检测即采用电泳凝胶的方式进行检测，属于初步检测反应产物；SBA电化学发光技术灵敏度高，但所需时间长。SBA分子信标检测灵敏度相对于SBA电化学发光技术略低，但所需时间短。NASBA扩增产物在线检测最常用的为分子信标的方法，但由于NASBA扩增反应由三酶联合共同作用，且三酶所用浓度相对较高，对体系中的核酸攻击性强，随着反应时间的延长，使得体系中的分子信标易于引物发生非特异性反应，造成假阳性信号的产生，导致结果误判，对后续诊断带来一定的困难。
发明内容
有鉴于此，本发明的为了解决上述问题，本发明提供了一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针，采用毗邻探针代替分子信标，可有效的避免上述问题，提高了NASBA扩增产物在线检测的特异性。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种高特异探针，其特征在于，由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。
本发明提供的NASBA产物检测的高特异探针由两条毗邻核苷酸序列组成，分别命名为探针Probe F和探针Probe R，所述两条毗邻核苷酸序列的组成均为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，核苷酸序列的3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，5’端均为脱氧核糖核苷酸碱基。
本发明所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列的链长为8-18个碱基。在一些实施方案中，所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列的链长为10-13个碱基。
本发明所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列与NASBA扩增产物通过碱基互补配对结合。所述探针Probe-F结合于单链RNA产物的上游，探针Probe-R结合在单链RNA产物的下游。
本发明所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列与NASBA扩增产物结合后两条链之间的距离为0-8个碱基之间。
所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列中处于上游的一条核酸序列Probe-F的3’端标记有荧光报告基团，处于下游的一条核酸序列的5’端标记有荧光淬灭基团Probe-R。当无NASBA扩增产物时，两条毗邻核苷酸序列游离于体系中，发射荧光，可检测到强荧光信号。当有NASBA扩增产物时，所述两条毗邻核苷酸序列与NASBA扩增产物结合后，Probe-F的3’端的荧光报告基团与Probe-R的5’端的荧光淬灭基团非常接近，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收，并以热能形式散失，使体系中荧光信号降低，实时检测显示数据为倒S形曲线。
其中，所述Probe-F的3’端标记的荧光报告基团可以为FAM，TET，HEX，JOE，CY3，CY5，ROX，Texas Red等。
所述Probe-R的5’端标记荧光淬灭基团可以为TAMRA，BHQ1，BHQ2，CY5等。
本发明所述的高特异探针在阴性对照试验中扩增6h仍有良好的特异性，无非特异扩增，表明所述高特异探针在NASBA产物实时检测中有很强的特异性。因此本发明还提供了上述高特异探针在NASBA扩增产物的实时在线检测中应用。
本发明还提供了一种NASBA扩增产物的实时在线检测方法，取包含所述高特异探针的恒温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板混合成反应体系，置于在实时荧光定量PCR仪中，在41℃反应1小时。
其中，所述恒温扩增缓冲液中高特异探针浓度优选为0.01μM-1μM。在一些实施方案中，所述高特异探针浓度为0.1μM。
优选的，所述反应体系中所述恒温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板的体积比为7:1:2。
在一些实施方案中，所述恒温扩增缓冲液其组成如下：恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.1μM上游探针Probe-F，0.1μM下游探针Probe-R，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。
在一些实施方案中，所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μL，T7RNA聚合酶5U/μL，核糖核酸酶H 0.5U/μL，焦磷酸酶0.5U/μL，RNA酶抑制剂5U/μL，BSA 0.5μg/μL。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针及检测NASBA产物的方法。本发明所述高特异探针由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。本发明所述高特异探针应用于NASBA扩增产物的检测，灵敏度高，特异性强，且缩短了检测时间，使得NASBA检测技术可更好的应用于病原微生物的核酸检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2毗邻探针检测NSABA扩增产物；其中，图a为甲型流感通用检测引物InfA-TY-PrimerF，InfA-TY-PrimerR，和探针InfA-TY-PrimerF、InfA-TY-PrimerR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流感MP基因RNA的检测结果；图b为甲型流感H1亚型引物InfA-H1-PrimerF、InfA-H1-PrimerR，和探针InfA-H1-ProbeF、InfA-H1-ProbeR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流感H1亚型HA基因RNA的检测结果；图c为甲型流感H3亚型引物InfA-H3-PrimerF、InfA-H3-PrimerR，和探针InfA-H3-ProbeF、InfA-H3-ProbeR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流感H3亚型HA基因RNA的检测结果；图d为乙型流感通用检测引物InfB-TY-PrimerF，InfB-TY-PrimerR，和探针InfB-TY-PrimerF、InfB-TY-PrimerR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增乙型流感MP基因RNA的检测结果；
图2示实施例3不同浓度毗邻探针扩增比较；其中，线1为探针浓度为1μM时的扩增检测结果，线2为探针浓度为0.1μM时的扩增检测结果，线3为探针浓度为0.01μM时的检测结果；
图3示实施例3毗邻探针特异性分析；其中，线1为采用毗邻探针检测甲型流感MP基因RNA扩增2h的检测结果，线2为阴性对照扩增两小时的检测结果，线3为采用普通分子信标阴性2h检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于流感病毒NASBA扩增产物检测的毗邻探针
本发明设计了四套用于流感病毒NASBA扩增产物检测的引物及毗邻探针，用于甲型流感病毒基因检测的引物为InfA-TY-PrimerF、InfA-TY-PrimerR，相应毗邻探针为InfA-TY-ProbeF、InfA-TY-ProbeR，用于甲型流感病毒H1亚型基因检测的引物为InfA-H1-PrimerF、InfA-H1-PrimerR，相应毗邻探针为InfA-H1-ProbeF、InfA-H1-ProbeR，用于甲型流感病毒H3亚型基因检测的引物为InfA-H3-PrimerF、InfA-H3-PrimerR，相应毗邻探针为InfA-H3-ProbeF、InfA-H3-ProbeR，用于乙型流感病毒基因检测的引物为InfB-TY-PrimerF、InfB-TY-PrimerR，相应毗邻探针为InfB-TY-ProbeF、InfB-TY-ProbeR。用于各病毒检测的NASBA引物如表1所示，毗邻探针序列如表2所示。
表1用于流感病毒特异性检测的NSABA引物序列
表2用于流感病毒特异性检测的NSABA毗邻探针序列
指标 Probe-F(5’-3’) Probe-R(5’-3’)
甲型流感病毒 CCTTGTGCUAUG GGTGTTCAUCAC
甲型流感病毒H1亚型 GCCAGTTGUAUG ACTCATATACAAC
甲型流感病毒H3亚型 CTCAACAGGUG TATGCGACAGUCC
乙型流感病毒 TGCTCGAACCAUU GATTCTUACA
采用上述引物和探针可特异检测甲型流感病毒、甲型流感病毒H1亚型、H3亚型以及乙型流感病毒。
实施例2、毗邻探针用于NASBA产物检测
一、RNA模板的制备
制备RNA模板所用质粒由博奥生物集团有限公司提供，包括含有甲型流感病毒基因的重组质粒pUC-InfA-TY，含有甲型流感病毒H1亚型HA基因的重组质粒pUC-InfA-H1，含有甲型流感病毒H3亚型HA基因的重组质粒pUC-InfA-H3，含有乙型流感病毒基因的重组质粒pUC-InfB-TY。RNA模板制备过程如下。
1、酶切：先将各供试重组质粒使用EcoRI内切酶37℃酶切2h。
2、转录：按5μL 5×Transcription Optimized Buffer(Promega)，2U T7RNA聚合酶，10mM DTT(Promega)，10U重组RNA酶抑制剂(Promega)，2mM rNTP，酶切产物5μL配制总体积为50μL的反应体系，震动均匀后37℃转录4h。
3、消化：将转录完成后的体系加入1μL的DNA消化酶(rDnaseI，5U/μL)，震荡离心，37℃孵育20min。
4、纯化：使用Macherey-Nagel公司的RNA纯化试剂盒产品，其产品目录号为740948，按如下步骤纯化转录产物RNA：
a)配制RA1-C2H5OH混合液：以RA1:C2H5OH＝1:1(体积比)的比例配制。每100μL的转录产物中，需要加入600μL RA1-C2H5OH混合液，即300μL RA1+300μL C2H5OH溶液，在这里需要根据转录产物的管数计算所配混合液的体积。若产物不足100μL，则用水将产物的量补到100μL(即在每管产物中加入50μL的天根Rnase-free H2O)。
b)将之前准备好的RA1-C2H5OH混合液分到1.5mL离心管内，两管，每管600μL，将100μL产物转入到相对应的离心管内，管内共700μL，充分震荡离心。
c)准备两个吸附柱，并做好相应的标记，将700μL产物混合液转入到吸附柱内(吸附柱最大容量为700μL)，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。
d)在吸附柱内加入700μL的RA3，放置1min，使其可以充分的分散在吸附柱的底部，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。
e)在吸附柱内加入350μL的RA3，放置2min，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。
f)在吸附柱内加入300μL的RA3，放置2min，1.2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。
g)打开吸附柱的盖子3min后，1.2万rpm空离2min，倒掉下层溶液，重复此步骤一次。
h)空离结束以后，把吸附柱转移到相对应的离心管中，打开吸附柱盖子放置15min，使乙醇挥发完全，在吸附柱中加入60μL Rnase-H2O(试剂盒里自带的)洗脱，放置2min，1.2万rpm离心2min。
i)将离心所得模板吸回吸附柱中，放置2min，1.2万rpm离心2min，重复此步骤两次。
j)丢掉吸附柱，将离心管内的模板取出2μL，用Nano drop测定其浓度，并记录其浓度及其260/280，260/230比值。根据测定浓度将RNA模板浓度稀释至1010copies/μL。
二、毗邻探针用于NASBA扩增产物的检测
1、将上述制备的RNA模板稀释至103copies/μL，作为NASBA扩增的模板。
2、NSABA扩增体系由恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液组成。其组成如下：恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH8.0)，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.1μM上游探针，0.1μM下游探针，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。按所述浓度配制相应的扩增缓冲液。
恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μL，T7RNA聚合酶5U/μL，核糖核酸酶H 0.5U/μL，焦磷酸酶0.5U/μL，RNA酶抑制剂5U/μL，BSA 0.5μg/μL。按所述浓度配制相应的酶溶液。
3、扩增体系配制
取7μL恒温扩增缓冲液(见步骤2)、1μL恒温扩增酶溶液(见步骤2)、2μL相应模板稀释液混合成10μL反应溶液于PCR管中，旋涡震荡均匀。将PCR管置于7500实时荧光定量PCR仪中，设置41℃反应1小时，并同时完成实时在线检测。
4、结果判读
扩增结果如图1所示，若体系有扩增则扩增曲线为倒S形曲线，若体系无扩增，则曲线为直线。由结果可以看出NSABA扩增具有良好的特异性。
实施例3、毗邻探针特性分析
一、毗邻探针使用浓度
1、不同毗邻探针浓度恒温扩增体系的配制
恒温扩增缓冲液B1：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，0.5μM InfA-TY-PrimerF，0.5μMInfA-TY-PrimerR，0.01μM InfA-TY-ProbeF，0.01μM InfA-TY-ProbeR，50mM DTT，10mMdNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。
恒温扩增缓冲液B2：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，0.5μM InfA-TY-PrimerF，0.5μMInfA-TY-PrimerR，0.1μM InfA-TY-ProbeF，0.1μM InfA-TY-ProbeR，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。
恒温扩增缓冲液B3：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，0.5μM InfA-TY-PrimerF，0.5μMInfA-TY-PrimerR，1μM InfA-TY-ProbeF，1μM InfA-TY-ProbeR，50mM DTT，10mM dNTP，10mMrNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。
恒温扩增酶溶液同实施例2中酶溶液配制方法相同。
按实施例2中扩增体系的配制方法配制三种不同毗邻探针浓度的NSABA扩增体系，将配好体系的PCR管置于7500实时荧光定量PCR仪中，设置41℃反应1小时，并同时完成实时在线检测。
2、结果分析
结果如图2所示，结果表明随着探针浓度的加大，其起始荧光值变大，其荧光变化率也有一定的增大，但变化不显著。为了获得较好的实验数据建议毗邻探针浓度设为0.1μM，该浓度既能很好的反应扩增过程中的荧光变化，且荧光值适中，不会因为荧光值过低或过高而超出检测器的检测范围。
二、毗邻探针特异性分析
1、恒温扩增缓冲液的配制
毗邻探针恒温扩增缓冲液的配制方法同步骤一中的恒温扩增缓冲液B2相同。
普通分子信标恒温扩增体系B4的配制如下：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，0.5μMInfA-TY-PrimerF，0.5μM InfA-TY-PrimerR，0.1μM InfA-TY-Pro，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。
按实施例2中的扩增体系的配制方法配制恒温扩增体系。将配制好的体系置于7500实时荧光定量PCR仪中，设置41℃反应1小时，并同时完成实时在线检测。
2、结果分析
结果如图3所示，结果表明，采用本发明提供的毗邻探针使NSABA扩增的特异性更好。随着扩增时间的延长，只要体系中无特异性模板，就不会产生假阳性的扩增信号，而采用普通的分子信标随着扩增时间延长，即便体系中没有特异性模板，也会有微弱的假阳性信号产生。

Claims (6)

1.一种高特异探针，其特征在于，由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基；所述两条毗邻的核苷酸序列与NASBA扩增产物碱基互补配对；两条毗邻的核酸序列中处于上游的一条核酸序列的3’端标记有荧光报告基团，处于下游的一条核酸序列的5’端标记有荧光淬灭基团；所述两条毗邻的核苷酸序列每条链链长均在8-18 碱基之间；两条毗邻的核苷酸序列与NSABA扩增产物碱基互补配对结合后，两条链之间的距离为0-8个碱基之间。
2.根据权利要求1所述的高特异探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。
3.权利要求1或2所述高特异探针在NASBA扩增产物的实时在线检测中应用。
4.一种NASBA扩增产物的实时在线检测方法，其特征在于，取包含权利要求1或2所述高特异探针的恒温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板混合成反应体系，置于在实时荧光定量PCR仪中，在41℃反应1小时；所述高特异探针浓度为0.01μM -1 μM。
5.根据权利要求4所述的实时在线检测方法，其特征在于，所述反应体系中所述恒温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板的体积比为7:1:2。
6.根据权利要求4所述的实时在线检测方法，其特征在于，所述恒温扩增缓冲液其组成如下：恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM pH 8.0 Tris-HCL，0.5 μM上游引物，0.5 μM下游引物，0.1μM上游探针，0.1μM下游探针，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15%体积百分含量DMSO，1M 山梨糖醇，20mM 四甲基氯化铵；所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶 1U/μL，T7 RNA 聚合酶 5U/μL，核糖核酸酶H 0.5U/μL，焦磷酸酶0.5U/μL， RNA酶抑制剂 5U/μL，BSA 0.5μg/μL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110527747B (zh) * 2019-08-01 2023-01-10 北京农学院 一种检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒
CN111004867B (zh) * 2020-01-03 2020-12-18 牡丹江医学院 一种甲型流感病毒检测引物、探针及其试剂盒
CN113564159A (zh) * 2021-07-22 2021-10-29 山东大学 一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1639357A (zh) * 2002-01-07 2005-07-13 诺奇普公司 检测人***瘤病毒mRNA的方法
CN1946858A (zh) * 2004-02-26 2007-04-11 诺奇普公司 人***瘤病毒的检测
CN100439515C (zh) * 2003-03-03 2008-12-03 清华大学 一种核酸分析芯片实验室***与应用
CN101657549A (zh) * 2007-02-06 2010-02-24 生物梅里埃有限公司 用于鉴别单核苷酸多态性（snp）的方法
CN102165077A (zh) * 2008-09-24 2011-08-24 生物梅里埃公司 降低诊断杂交测定中对靶核酸的序列变异的依赖性的方法
CN105274099A (zh) * 2015-10-23 2016-01-27 山东省农业科学院生物技术研究中心 快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1639357A (zh) * 2002-01-07 2005-07-13 诺奇普公司 检测人***瘤病毒mRNA的方法
CN100439515C (zh) * 2003-03-03 2008-12-03 清华大学 一种核酸分析芯片实验室***与应用
CN1946858A (zh) * 2004-02-26 2007-04-11 诺奇普公司 人***瘤病毒的检测
CN101657549A (zh) * 2007-02-06 2010-02-24 生物梅里埃有限公司 用于鉴别单核苷酸多态性（snp）的方法
CN102165077A (zh) * 2008-09-24 2011-08-24 生物梅里埃公司 降低诊断杂交测定中对靶核酸的序列变异的依赖性的方法
CN105274099A (zh) * 2015-10-23 2016-01-27 山东省农业科学院生物技术研究中心 快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用

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