JP4558322B2 - ヒトパピローマウイルスmRNAを検出するための方法 - Google Patents
ヒトパピローマウイルスmRNAを検出するための方法 Download PDFInfo
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Description
(a)好適なプライマー対、RNA依存性DNAポリメラーゼ、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAを加水分解することなくRNA−DNAハイブリッドのRNA鎖を加水分解するリボヌクレアーゼ、上記プロモーターを認識するRNAポリメラーゼ、ならびにリボヌクレオシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む反応媒体を組み立てる(調製する)工程;
(b)NASBA増幅反応を可能にする反応条件のもと、反応媒体を、HPVを含有すると思われる検査サンプルから単離された核酸調製物とインキュベーションする工程;
(c)NASBA増幅反応の任意のHPV特異的な生成物を検出し、かつ/または定量的に測定する工程。
Ru(bpy)3 2+−GATGCAAGGTCGCATATGAG−3’
を有する、Organon Teknikaから市販されている一般的なECL(商標)プローブにハイブリダイゼーションすることができる。
X2−arm1−標的−arm2−X3
(式中、「標的」は標的特異的なヌクレオチド配列を表し、「X2」および「X3」は蛍光性成分、および、蛍光性成分と消光剤成分との2つが非常に近くで一緒に保たれたときに蛍光性成分からの蛍光を実質的または完全に消光することができる消光剤成分を表し、「arm1」および「arm2」はステム二重鎖を形成することができる相補的な配列を表す)。
cgcatg−SEQ−catgcg
ccagct−SEQ−agctgg
cacgc−SEQ−gcgtg
cgatcg−SEQ−cgatcg
ccgtcg−SEQ−cgacgg
cggacc−SEQ−ggtccg
ccgaagg−SEQ−ccttcgg
cacgtcg−SEQ−cgacgtg
cgcagc−SEQ−gctgcg
ccaagc−SEQ−gcttgg
ccaagcg−SEQ−cgcttgg
cccagc−SEQ−gctggg
ccaaagc−SEQ−gctttgg
cctgc−SEQ−gcagg
ccaccc−SEQ−gggtgg
ccaagcc−SEQ−ggcttgg
ccagcg−SEQ−cgctgg
cgcatg−SEQ−catgcg
HAe6701p2またはHAe6702p2(両者とも、nt116)およびHAe6701p1またはHAe6702p1(両者とも、nt368)。
HAe6701p2またはHAe6702p2(両者とも、nt116)およびHPV16p1(nt258)。
H16e6702Ap2(nt142)、H16e6702Bp2(nt182)、H16e6702Cp2(nt185)またはH16e6702Dp2(nt188)およびHAe6701p1またはHAe6702p1(両者とも、nt368)。
HAe6701p2またはHAe6702p2(両者とも、nt116)およびHAe6702Ap1(nt208)、HAe6702Bp1(nt191)、HAe6702Cp1(nt186)またはHAe6702Dp1(185)。これらの組合せは、すべてのE6スプライス変化体を増幅するために好適である。
HAe6703p2またはHAe6704p2(両者とも、nt656)およびHAe6703p1またはHAe6704p1(両者とも、nt741)。これらの組合せは、(少なくともnt741までの)E7コード領域を含有する転写物のすべてを増幅するために好適である。
H18e6701p2(nt702)またはH18e6702p2(nt698)およびH18e6701p1またはH18e6702p1(両者とも、nt869)。
H18e6703p2(nt651)およびH18e6703p1(nt817)。
H18e6704p2(nt179)およびH18e6704p1(nt379)。
H31e6701p2またはH31e6702p2(両者とも、nt164)およびH31e6701p1またはH31e6702p1(両者とも、nt423)。
H31e6703p2(nt617)、H31e6704p2(nt619)またはH31e6705p2(nt617)およびH31e6703p1(nt766)、H31e6704p1(766)またはH31e6705p1(nt809)。
H33e6701p2(nt618)またはH33e6703p2(nt620)およびH33e6701p1(nt763)またはH33e6703p1(nt807)。
H33e6702p2(nt431)およびH33e6702p1(nt618)。
HPV45p2(nt430)およびHPV45p1(nt527)。
5' AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3'
5' AATGGCATTTGTTGGSIIAA 3'
5' AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3'
パプ塗抹標本およびHPVサンプルがオスロ(ノルウェー)での子宮頸部スクリーニングプログラムで5970名の女性から集められた。RNA/DNA抽出のために意図されたサンプルは下記のように処理された。
HeLa細胞株(HPV18)、SiHa細胞株(HPV16)およびCaSki細胞株(HPV16)から得られたDNAおよびRNAが、PCR反応およびNASBA反応のための陽性対照として使用された。これらの細胞株はまた、感度実験(実施例2)におけるサンプル材料として使用された。SiHa細胞は、細胞あたり1−2コピーの組み込まれたHPV16を有し、一方、CaSki細胞は、組み込まれた状態およびエピソーム状態の両方で、60−600コピーのHPV16を有する。HeLa細胞は、細胞あたり約10−50コピーのHPV18を有する。
子宮頸部切屑物に由来する単離されたDNAを、コンセンサスなGP5+/6+のプライマーを使用するPCRに供した(欧州特許EP−B−0517704)。PCRは、75mMのTris−HCl(25℃でpH8.8)、20mMの(NH4)2SO4、0.01%のTween20(商標)、200mMの各dNTP、1.5mMのMgCl2、1Uの組換えTaq DNAポリメラーゼ(MBI Fermentas)、3μlのDNAサンプル、ならびに、各50pmolのGP5+プライマーおよびGP6+プライマーを含有する50μlの反応体積において行われた。94℃での2分間の熱変性工程の後、PCRプロセッサー(Primus96、HPLブロック、MWG、ドイツ)による40サイクルの増幅が続いた。各サイクルには、1分の変性工程、40℃で2分間のプライマーアニーリング工程、および72℃で1.5分間の鎖伸張工程が含まれた。最後の伸張工程が、増幅されたDNAの完全な伸張を確実にするために4分伸ばされた。
HPV16、HPV31およびHPV33:PCRが、75mMのTris−HCl(25℃でpH8.8)、200mMの各dNTP、1.5mMのMgCl2、2.5Uの組換えTaq DNAポリメラーゼ(MBI Fermentas)、3μlのDNAサンプル、および25pmolの各プライマーを含有する50μlにおいて行われた。94℃での2分間の熱変性工程の後、PCRプロセッサー(Primus96、HPLブロック、MWG、ドイツ)による35サイクルの増幅が続いた。各サイクルには、30秒間の変性工程、57℃で30秒間のプライマーアニーリング工程、および72℃で1分間の鎖伸張工程が含まれた。最後の伸張工程が、増幅されたDNAの完全な伸張を確実にするために10分伸ばされた。HPV33に対するプロトコルは、52℃でのプライマーアニーリング工程を有した。HPV18のプロトコル:プライマーが、HPV18型を同定するために設計された。PCRが、75mMのTris−HCl(25℃でpH8.8)、20mMの(NH4)2SO4、0.01%のTween20、200mMの各dNTP、2.0mMのMgCl2、2.5Uの組換えTaq DNAポリメラーゼ(MBI Fermentas)、3μlのDNAサンプル、および25pmolの各プライマーを含有する50μlにおいて行われた。94℃での2分間の熱変性工程の後、PCRプロセッサー(Primus96、HPLブロック、MWG、ドイツ)における35サイクルの増幅が続いた。各サイクルには、30秒間の変性工程、57℃で30秒間のプライマーアニーリング工程、および72℃で1分間の鎖伸張工程が含まれた。最後の伸張工程が、増幅されたDNAの完全な伸張を確実にするために10分伸ばされた。
1.核酸の放出、単離および増幅/検出を別個の研究室領域で行う。
2.核酸の放出、単離および増幅/検出のための試薬を、核酸の放出、単離および増幅/検出がそれぞれ行われることになる研究室領域において保存し、調製する。
3.チューブおよびバイアルはすべて、使用していないときには閉じたままにしておく。
4.1つの研究室領域で使用されたピペットおよび他の装置は他の領域で使用してはならない。
5.それぞれのピペッティング動作について新しいピペットまたはピペットチップを使用する。
6.核酸を含有する可能性がある流体についてはエアロゾル防止チップとともにピペットを使用する。溶液のピペッティングは、常に、この動作のためだけに開閉される隔離されたチューブから、またはこの動作のためだけに開閉される隔離されたチューブに行わなければならない。他のチューブおよびバイアルはすべて、閉じられたままにされ、取り扱われているものから分離されていなければならない。
7.標的RNAを含有する可能性がある臨床材料、または増幅物に関して処理するときには使い捨て手袋を使用する。可能であれば、試験手順における各ピペッティング工程の後で、特に、混入の可能性のある材料と接触した後では手袋を交換する。
8.使用済みの使い捨て物を容器に集める。それぞれの試験操作の後、容器を閉じて片づける。
9.各試験操作の後、少なくとも1時間、核酸の単離または増幅/検出のときに使用されたチューブラックを洗剤(例えば、Merck Extran MA01アルカリ)に浸漬する。
1.酵素溶液の調製。
55μlの酵素希釈液(Nuclisens(商標) ベーシックキットから;これはソルビトールを水溶液中に含有する)を3つの凍結乾燥された酵素球体(Nuclisens(商標) ベーシックキットから;これは、AMV−RT、RNaseH、T7RNAポリメラーゼおよびBSAを含有する)のそれぞれに加える。この酵素溶液を室温で少なくとも20分間放置する。酵素溶液を1つのチューブにまとめ、指でチューブをはじくことによって十分に混合し、軽く遠心沈殿して、1時間以内に使用する。酵素混合物における最終濃度は、375mMのソルビトール、2.5μgのBSA、0.08UのRNaseH、32UのT7RNAポリメラーゼおよび6.4UのAMV逆転写酵素である。
10サンプルについて:80μlの試薬球体希釈液(Nuclisens(商標) ベーシックキットから;これはTris/HCl(pH8.5)、45%DMSOを含有する)を凍結乾燥された試薬球体(Nuclisens(商標) ベーシックキットから;これは、ヌクレオチド、ジチオスレイトールおよびMgCl2を含有する)に加え、直ちに十分にボルテックスする。これを3つの試薬球体に関して行い、溶液を1つのチューブで混合する。
それぞれの標的反応について、91μlの試薬球体/KCl溶液(工程2で調製されたもの)を新しいチューブに移す。25μlのプライマー/分子ビーコンプローブ溶液を加える(反応あたり、それぞれが約0.1μM〜0.5μMのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、そして約15pmol〜70pmolの分子ビーコンプローブの最終濃度にする)。ボルテックスによって十分に混合する。遠心はしない。
それぞれの標的RNA反応について:
96ウエルマイクロタイタープレートにおいて、10μlのプライマー/プローブ溶液(工程3で調製されたもの)を10個のウエルのそれぞれにピペットで入れる。5μlの核酸抽出物を各ウエルに加える。マイクロタイタープレートを65℃±1℃で4分間インキュベーションする。41±0.5℃に4分かけて冷却する。その後、各ウエルに5μlの酵素溶液を加える。直ちに、マイクロタイタープレートを蛍光検出装置(例えば、Nuclisens(商標) EasyQ Analyzer)に入れ、増幅を開始する。
表10には、細胞学結果に関連づけられる、リアルタイムNASBAでのHPV陽性事例(L1および/またはE6の発現)およびPCRでのHPV陽性事例の分布が示される。PCR増幅は、Karlsen等、J Clin Microbiol.、34:2095〜2100、1996に記載されるように行われた。予想された組織学に対する数字は、CIN III病変に関する類似した研究から得られた平均結果(Clavel等、Br J Cancer、84:1616〜1623、2001)に基づく。数例の代表的な事例から得られた結果が表11に示される。
子宮頸癌細胞株であるCaSki、SiHaおよびHeLaを、Organon Teknika/bioMerieuxから得られるBoom抽出方法を使用する核酸の自動処理抽出の前(並行1および並行3)、または核酸抽出の後(並行2)のいずれかで、溶解緩衝液で希釈した。リアルタイムNASBAが、上記に記載されたプロトコルに従って、テキサスレッド(16、L1および18)またはFAM(U1A、33および31)で標識された分子ビーコンプローブを使用して行われた。
PCR:Gp5+/6+を使用するHPVのコンセンサスPCRでは、104個までのSiHa細胞およびHeLa細胞が、そして103個までのCaSki細胞が検出された。しかしながら、型特異的なPCRプライマーセットはより高感度であり、HPV16の型特異的PCRプライマーセットについては103(102)個のSiHa細胞および0.1個のCaSki細胞が検出され、一方、HPV18の型特異的PCRプライマーセットでは、102個のHeLa細胞が検出された。
リアルタイムNASBAプライマーの組合せが、NASBAを使用してHPV型間の交差反応性について調べるために、HPV6/11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、58またはHPV XについてPCRにより陽性であった、オスロ研究から得られた490個の子宮頸部サンプルに対して試験された。すべてのサンプルが、HPVの39型(2)、52型(1)および58型(2)を除いて、コンセンサスPCRと、それぞれのHPV型について型特異的なPCRとによって型決定された。これらのサンプルは、PreTeck HPV−Prooferに対して試験するために加えられている。HPV Xは、Gp5+/6+でのコンセンサスPCRについて陽性であるが、HPV6/11、16、18,31、33、35、45および51については型特異的PCRによって陰性である。結果が表17に示される。交差反応性は示されなかった。表17からの選択された数の事例の配列確認が表18に示される。
患者/臨床サンプル
1999年〜2001年の期間にCINの処置のためにOstfold中央病院に入院した190名の女性から得られた生検試料。この研究に含まれる190名の女性の平均年齢は37.4歳であった(22歳〜74歳の範囲)。生検試料は採取後直ちに−80℃で凍結された。
日常的な細胞学報告が、細胞学的知見を記録するために使用された。スライド標本を再評価することは試みられなかった。スライド標本のそれぞれが、入院、膣鏡検査および生検のための根拠であるCIN II〜IIIの状態(すなわち、高悪性度の形成異常またはHSIL)を示していた。
生検試料(この場合、生検試料1と呼ばれる)が、高悪性度の細胞学報告の後で採取された。高悪性度の病変(CIN IIまたはIII)が確認された場合、その患者は、再度、今回は膣鏡誘導による円錐切除術のために入院させられた。円錐切除術の前に、しかし、局所麻酔が施された後、第2の生検試料(生検試料2)が、全体的な所見から判断して、形成異常が局在化している可能性が最も大きい部領域から採取された。この生検試料(2×2mm)は−80℃の冷凍庫で2分以内に凍結された。
核酸は、既に記載したように自動化Nuclisens抽出器を使用して単離された(Boom等、1990)。それぞれの生検試料は2つに分けられ、1つは組織学的検査のためであり、残る半分はRNA分析のためである。RNA分析のための材料は、ドライアイス(−80℃)上で保たれながら、より小さく分割され、1mlの溶解緩衝液(上記)に入れられ、その後、使い捨て乳棒を使用して20秒間のホモジネート化が行われた。100mlのサンプルが溶解緩衝液で更に10倍希釈され、その後、100mlがDNA/RNAのために抽出された。抽出されたDNA/RNAは約40mlの溶出緩衝液(Organon Teknika)により溶出され、−70℃で保存された。
NASBA反応で使用されたのと同じ抽出物および量がPCRのために使用された。L1コンセンサスプライマーのGp5+/6+が、HPVのDNAを含有するすべてのサンプルを検出するために使用された。PCR増幅は、上に記載されるように行われた。最初のDNA変性が94℃で2分間行われ、その後、40サイクルのPCRが行われた:94℃で1分間の変性、40℃で2分間のアニーリング、72℃で1.5分間の伸張、その後、72℃で4分間の最後の伸張。HPVの型決定が、上に記載されるように、HPV16、HPV18、HPV31およびHPV33(HPV6/11、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV58)に対するPCR用の型特異的プライマーを使用することによって行われた。
最初に、190名の患者は、生検が、CIN I、CIN IIまたはCIN IIIの診断が細胞学によってなされた後に行われた。高悪性度の病変が組織学的検査によって確認され、150サンプルがCIN IIIとして診断された(78.9%)。円錐切除術の前に採取された生検試料2がRNA分析のために使用された。しかしながら、この生検試料の組織学的検査では、最初の150サンプルのうちの53個のみがCIN IIIとして診断されただけであった[54個は診断を与えず、24個がCIN IIとして診断され、18個がCIN Iとして診断され、4個がHPV/コンジロームとして診断された]。CIN IIサンプルの数は16個(8.4%)から30個(15.8%)に増大した[組織学Iにより、24個がCIN IIIとして診断され、4個がCIN IIとして診断され、1個が癌腫として診断され、1個がCIN Iとして診断された。組織学Iに由来する12例のCIN IIには、組織学IIではより低い診断が与えられた]。CIN Iの程度は6サンプル(3.2%)から32サンプル(16.8%)に増大した。2つの扁平上皮癌が、組織学IIでは、CIN IIIとして診断され、腺癌がCIN IIとして診断された。71サンプル(38.4%)において、高悪性度の病変が検出されなかった。
細胞学および組織学と比較されるPreTect HPV−ProoferおよびPCRによって検出されるHPV
本発明は、HPVのE6遺伝子に由来するmRNA転写物を検出するためのキットを提供する。このキットは、下記のプライマー対の1つ以上、2つ以上、そして好ましくはすべてと、付随する同定プローブとを含む。
HPV 16:HPV16.txt 7905 b.p
HPV16P2:
p2:116 (20) GATGCAAGGTCGCATATGAGCCACAGGAGCGACCCAGAAA
16 p1 (no7)
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG ATT CCC ATC TCT ATA TAC TA (51 baser)
HPV16PO2:
po:230 (20) TATGACTTTGCTTTTCGGGA
H16e6702po
HPV 18:HPV18.txt 7857 b.p
HPV18P2:
p2:698 (22) GATGCAAGGTCGCATATGAGGAAAACGATGAAATAGATGGAG
H18e6702p2
HPV18P4:
p1:817 (20) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGGTCGTCTGCTGAGCTTTCT
H18e6703p1 (Multiplex)
HPV18PO2:
po:752 (21) GAACCACAACGTCACACAATG
H18e6702po
HPV 31:HPV31.txt 7912 b.p
HPV31P3:
p2:617 (20) GATGCAAGGTCGCATATGAGACTGACCTCCACTGTTATGA
H31e6703p2
p1:766 (20) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTATCTACTTGTGTGCTCTGT
H31e6703p1
HPV31PO4:
po:686 (26) GGACAAGCAGAACCGGACACATCCAA
H31e6704po
HPV 33:HPV33.txt 7909 b.p
HPV33P1:
p2:618 (22) GATGCAAGGTCGCATATGAGTATCCTGAACCAACTGACCTAT
H33e6701p2
p1:763 (19) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTTGACACATAAACGAACTG
H33e6701p1
HPV33PO3:
po:699 (23) GGACAAGCACAACCAGCCACAGC
H33e6703po
分子ビーコンプローブ:
H16e6702mb2-FAM ccagctTATGACTTTGCTTTTCGGGAagctgg
H18e6702mb1-TxR cgcatgGAACCACAACGTCACACAATGcatgcg
H31e6704mb2-FAM ccgtcgGGACAAGCAGAACCGGACACATCCAAcgacgg
H33e6703mb1-FAM ccaagcGGACAAGCACAACCAGCCACAGCgcttgg
HPV45: HPV45.txt 7858 bp (X74479)
HPV45P1:
p2:430 (21): GATGCAAGGTCGCATATGAGAACCATTGAACCCAGCAGAAA
H45e6701p2
p1:527 (22): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGTCTTTCTTGCCGTGCCTGGTCA
H45e6701p1
HPV45PO1:
po:500 (20): GTACCGAGGGCAGTGTAATA
H45e6701po
H45e6701mb1 cgatcgGTACCGAGGGCAGTGTAATAcgatcg
HPV52: HPV52.txt 7942 bp (X74481)
HPV52P1:
p2:144 (22): GATGCAAGGTCGCATATGAGTTGTGTGAGGTGCTGGAAGAAT
H52e6701p2
p1:358 (18): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCCTCTCTTCTAATGTTT
H52e6701p1
HPV52PO1:
Po:296 (20): GTGCCTACGCTTTTTATCTA
H52e6701po
HPV58 HPV58.txt 7824 bp (D90400)
HPV58P2:
p2:173 (18): GATGCAAGGTCGCATATGAGTCTGTGCATGAAATCGAA
H58e6702p2
p1:291 (18): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAGCACACTTTACATACTG
H58e6702p1
HPV58PO2:
po:218 (22): TTGCAGCGATCTGAGGTATATG
H58e6702po
HPV51 HPV51.txt 7808 bp (M62877)
HPV51PA/P:
p2:655 (23): GATGCAAGGTCGCATATGAG AGA GGA GGA GGA TGA AGT AGA TA
H51e6702p2
p1:807 (20): AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG GCC CAT TAA CAT CTG CTG TA H51e6701p1
HPV51POA:
po:771 (24): TGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACA
H51e67o2po
H52e6701mb1 cgatcgGTGCCTACGCTTTTTATCTAcgatcg
H58e6702mb1 ccgtcgTTGCAGCGATCTGAGGTATATGcgacgg
H51e6702mb1 cgatcgTGG CAG TGG AAA GCA GTG GAG ACAcgatcg
Claims (8)
- 子宮頸癌を発症する危険性を評価するためにヒト被験者をスクリーニングするインビトロ方法であって、HPVの16型、18型、31型および33型のE6遺伝子のmRNA転写物の発現について被験者をスクリーニングすること、および、E6mRNAの発現に基づいて子宮頸癌の発症について2つの危険性カテゴリーの1つに被験者を分類することを含み、HPVの16型、18型、31型および33型の少なくとも1つからのE6mRNAの発現について陽性である個体が、組み込まれたHPVまたは改変されたエピソームHPVゲノムを保有するとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について危険性が高いとして分類され、これに対して、E6mRNAの発現について陰性である個体が、組み込まれたHPVまたは改変されたエピソームHPVゲノムを保有しないとして評価され、従って、子宮頸癌の発症について検出できるほどの危険性がないとして分類される方法。
- 子宮頸部における異常な細胞変化を有するヒト被験者を同定するインビトロ方法であって、HPVの16型、18型、31型および33型のE6遺伝子のmRNA転写物の発現について被験者をスクリーニングすることを含み、HPVの16型、18型、31型および33型の少なくとも1つからのE6mRNAの発現について陽性である個体が、子宮頸部における異常な細胞変化を有するとして同定される方法。
- E6mRNA転写産物の発現についてのスクリーニングが、増幅産物のリアルタイム検出と組み合わせた等温増幅を使用して行なわれ、該等温増幅が、NASBA、転写介在増幅、RNAのシグナル介在増幅または等温液相増幅である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- E6mRNAの発現についてのスクリーニングが、リアルタイムNASBAを使用して行われる、請求項3に記載の方法。
- ヒト被験者が、子宮頸部の細胞においてヒトパピローマウイルスDNAが感染しているとして以前に確認された被験者である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト被験者が、ASCUS、CIN1病変またはコンジローマの診断を以前に受けた被験者である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- HPVの16型、18型、31型、33型および45型に由来するE6mRNAを検出することができる技術を使用してE6mRNAの発現についてスクリーニングすることを含み、
HPVの16型、18型、31型、33型または45型の少なくとも1つに由来するE6mRNAの発現について陽性である個体が、組み込まれたHPVを保有するとして評価される、請求項6に記載の方法。 - HPVの52型及び/又は58型に由来するE6mRNAの発現についてスクリーニングすることをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
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