JP5201554B2 - 酵素産生を向上させる方法 - Google Patents

Description

本発明は、食品加工および食品製造業界にて使用するための穀物より得ることが可能な加水分解酵素、オオムギなどの穀物の発芽、および穀物からの酵素の単離に関する。

穀物の多くの加水分解酵素（例えば、限定的には限界デキストリナーゼ (EC 3.2.1.142)、αおよびβアミラーゼ(EC 3.2.1.1、EC 3.2.1.2)、1-6-β-グルカナーゼ(EC 3.2.1.39)、β1 ,4-キシラナーゼ (EC 3.2.1.8)、アラビノキシラナーゼ (EC 3.2.1.136)、およびβグルコシダーゼ(EC 3.2.1.21)がある）が、様々な業界にて、とりわけ食品加工および製造業界にて用いられている。

加水分解酵素として知られているこれらの酵素は一般的に、穀類、豆類（pulsesおよびlegumes）などを含む植物組織などの組織、ならびに細菌による発酵物などより商業用途のために得られる。いくつかの状況においては、これらの酵素は組換え発現系にて産生され得る。

商業的用途のための多くの加水分解酵素を得るための方法における問題は、加水分解酵素の収率が低い傾向にあることである。したがって、商業的量の加水分解酵素を得るには、多額の費用を必要としている。

加水分解酵素を得るための方法における改良、とりわけ、加水分解酵素の収率を向上させることに関連する改良が求められている。

すなわち、特定の実施形態において、本発明は穀物中の酵素の量または発現量を増大させるための方法を提供する。

他の実施形態において、本発明は、酵素の相対存在量が高い穀物の産生方法を提供する。

他の実施形態において、本発明は酵素を産生するための方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は相対存在量の高い酵素を有する穀物の酵素を抽出、精製または単離するための方法を提供する。

一般的に、本方法は、発芽中の穀物を傷つけ、少なくとも1箇所に組織損傷を有する傷ついた穀物を形成すること（当該損傷は当該傷ついた穀物によって少なくとも部分的に修復され得る）、および当該傷ついた穀物が当該少なくとも1箇所の組織損傷を少なくとも部分的に修復して、修復された穀物を形成することを含む。別の言い方をすると、穀物の発芽を促す条件、および穀物に１または複数の損傷を施す条件を穀物に付する。また、これらの条件を、穀物に与えられた損傷が当該穀物によって修復されるように付す。

ある実施形態において、本方法は細根を穀物より成長させること、当該細根を穀物より取り除くこと、およびさらなる細根を穀物より成長させることを含む。

特定の実施形態において、相対存在量の高い酵素を有する穀物より酵素を抽出、精製または単離するための方法は、相対存在量の高い酵素を有する穀物より酵素を放出、あるいは抽出および／もしくは精製または単離するためのさらなる工程を含む。

さらなる実施形態において、本発明は相対存在量の高い酵素を有する穀物を提供する。穀物は一般に、穀物を発芽させ、穀物に1または複数の損傷を与える条件に当該穀物を付すことを含む方法により形成される。これらの条件によって、穀物の損傷が当該穀物により修復され得る。

組織を損傷および修復し得る条件下では、加水分解酵素の発現が顕著に増加し、組織中の加水分解酵素の相対存在量または相対量を顕著に増加し得ることを見出した。具体的に言うと、本明細書中に記載されるように、損傷も修復もしない条件下にて成長したオオムギ穀物よりも穀物が損傷し修復する条件下で成長したオオムギ穀物は、加水分解酵素、すなわちα-アミラーゼEC 3.2.1.1およびβ-アミラーゼEC 3.2.1.2の量がそれぞれ1.7倍および0.05倍多いことが見出された。他の加水分解酵素、例えば限界デキストリナーゼ EC 3.2.1.142およびβ1 ,4-キシラナーゼ EC 3.2.1.8の量は、これらの穀物において最大で16.8倍および6.5倍多いことがわかった。

これらの知見は特に重要である。なぜなら、損傷および修復した穀物を商業用の抽出方法または別の方法で、酵素放出のために処理した場合、加水分解酵素を向上した収率で得ることができるためである。

特定の実施形態において、本発明は穀物における酵素の量または発現量を増加するための方法を提供する。本方法は、穀物を発芽させ、穀物に1または複数の損傷を与えるため、つまり、穀物に1または複数の損傷を与えることによって穀物を傷つける条件下にて当該穀物を発芽するための条件を当該穀物に与える工程を含む。

他の実施形態において、本発明は相対存在量の高い酵素を有する穀物を産生するための方法を提供する。本方法は、穀物を発芽させ、当該穀物に1または複数の損傷を与えるための条件を当該穀物に与える工程を含む。

一実施形態において、穀物はオオムギ穀物である。しかし、他の穀物（例えば、コメ、コムギ、トウモロコシ(corn, maize)など）も処理され得ることが理解されるであろう。さらに、レンズ豆、大豆などのマメ類（legumes, pulses）も処理され得る。

上記方法に付された大部分の穀物は致命的損傷を受けるわけではないということが重要である。致命的な損傷は、穀物の胚の死滅を生じ得るか、または穀物が、当該穀物に与えた損傷を少なくとも部分的に修復するのを、もしくは発芽することを妨げ得る。

さらに、以下に詳細に記載されるように、生きている穀物の胚は、発芽の間の穀物からの1または複数の酵素の増大した分泌に関連することが見出された。

穀物は、当該穀物に物理的処理を施すことによって損傷し得る。物理的処理としては、穀物の磨耗、破裂、回転、撹拌または圧縮を生じるものが挙げられる。他の形式の物理的処理も意図される。

特に有用な物理的処理は細根またはその一部（細根の先端など）を損傷するか、穀物より細根またはその一部を取り除くか、または芽、穀物の殻もしくは果皮を損傷するものである。穀物の外層（アリューロン層またはヘミセルロース層など）に影響を与える処理もまた有用であり得る。

穀物を磨耗するための方法の一例が、米国特許第3754929号に示されている。穀物を圧縮するための方法が、米国特許第4052795号に示されている。

穀物はまた1または複数の化学的処理、温度、圧力または放射線に曝すことによって損傷し得る。

化学的処理としては、アルカリ処理が挙げられる。この処理は穀物の殻を可溶化または部分的に可溶化することに関して、他の処理の中で特に有用であり得る。アルカリ処理の一例としては、2回目の浸漬中、24時間かけて穀物を調製する方法が挙げられる。

化学的処理の他の形態としては、アンモニアを用いた処理が挙げられる。アンモニアを用いた化学的処理の一例は、米国特許第3134724号に示されている。

上記したように、穀物を当該穀物を加熱することによって損傷し得る。一般的に、穀物は4O℃を超えて加熱すべきではない。この温度を上回ると、穀物の胚は致命的に損傷し得る。加熱は一般的に2度目の浸漬中に行う。加熱は、穀物のグルカン外殻を柔らかくするのに有用であり得る。

穀物を処理するための特に有用な損傷方法は、穀物より細根を取り除き、そして修復機構により当該損傷した穀物よりさらなる細根を再成長させる。特定の実施形態において、細根は発芽開始より約5〜7日間まで成長させるが、他の期間も適している。一般的に発芽を開始する12日前に細根を取り除くのが好ましいが、いくつかの例においては、この時期よりも早く、例えば、発芽を開始する10日前に細根を取り除くのが好ましい。

根、細根、根の先端、芽および芽の先端を取り除くのが特に有用であるが、特定の実施形態において、他の穀物の器官、例えば、穀物の殻およびそれに付随した層を取り除いても良い。

一般的に、損傷していない穀物において見られる酵素産生よりも酵素産生を増強させるために、根、芽などを穀物より一度取り除く必要がある。特定の実施形態において、穀物を損傷させるための処理は繰り返し行う。これは全ての穀物が少なくとも一度、各穀物より根、芽などを取り除くことによって損傷することを確保する利点を有する。これは、全ての穀物が同一の発生段階に達していない場合などにおいて処理を施す際に特に有用であり得る。さらなる特定の実施形態において、1以上の根、芽などを穀物より取り除くことが都合が良い。

修復した穀物を再度傷つける必要はないということは理解されるであろう。さらに、損傷した穀物が完全に修復される必要はない。

傷つけるための器具の一例が、米国特許第3174909号に示されている。一般的に、器具は穀物を保持するためのドラムを備え、このドラムは、ドラムが回転してドラム内の入れられた穀物を撹拌するための内部バッフルを有し得る。さらに、当該器具はドラムを回転するためのローラーを備え得る。

特定の実施形態において、本発明は穀物中の加水分解酵素の量を増大させるための方法を提供する。当該方法は、穀物中の加水分解酵素の量を増大させるために、
穀物より細根を成長させること、当該細根を当該穀物より取り除くこと、および当該穀物よりさらなる細根を成長させることを含む。

発芽とは一般に、1または複数の組織が含水することにより穀物の体積の変調、酵素活性の変調、胚乳の構造および組成における変化、ならびに胚活性の変調を生じることを特徴とする過程として認識される。

一般的に、損傷および修復するための条件に付される穀物は発芽している穀物、すなわち、傷つける際にまさに発芽しようとしている穀物、傷つける際に発芽の活性状態にある穀物、または傷つける際に発芽が完了している穀物である。

特定の実施形態において、穀物は傷つける際に発芽の活性状態にあり、修復およびその後のさらなる損傷および修復工程の間もその状態を維持する。

一般的に、損傷および修復のプロセスが生じる際には、当該穀物は約40%またはそれより低い含水率である。含水率とは乾燥重量を含水重量で除した割合である。特定の実施形態において、約30〜35% の含水率が特に有用である。

一般に、含水率は約１0%以上、約１5%以上、約20%、約25%、約30%〜35%であり、一般に、40%を超えるべきではない。

特定の実施形態において、含水率は浸漬後に約25%以上であり、長期の発芽期後に約30%〜35%であり、いかなる時も40%を超えるべきではない。

望ましい含水率は、穀物を適当な水溶液中に浸漬することによって獲得し得る。当該溶液は単に水であっても良く、成長促進剤、ジベレリン酸、抗菌剤(SO₂など) 特に抗真菌剤などの化合物、または穀物を柔らかくするためおよびpHを上げるためのNH₄OH アルカリなどの化合物を含んでいても良い。

浸漬方法は、1回浸漬する工程からなっていても良いし、複数回浸漬する工程からなり、各工程が各浸漬工程の間に用いられる条件によって特徴付けされていても良い。例えば、最初の浸漬工程は、穀物が約40%未満含水する条件を含んでも良い。例えば、穀物は、最初の浸漬工程において、50ppm未満の SO₂の存在下にて約12〜24時間浸漬し、穀物の当初の含水率10%未満を約20% の含水率とするまで含水し得る。次に、この溶液を除去し、細菌を取り除いたり、表面タンパク質またはグルカンにおけるSO₂ との反応が持続することを回避したりし得る。第二の浸漬工程は、pHを8.0まで上げ、5〜20ppm ジベレリン酸の存在下にて、40℃までやや加熱し、最終的な浸漬時間の合計が12〜24時間とする中で、約20〜30% の含水率に穀物の含水量を調節することを含み得る。

特定の実施形態において、穀物を約5 日間浸漬するが、それよりも少ない日数、例えば、1、2、3または4日間浸漬させても良い。さらに、穀物を5 日よりも長く浸漬させるのも有効であり得る。しかしこのような場合、浸漬工程の間の真菌による汚染を制御することがより困難となる。

さらに、穀物を浸漬前、浸漬の間、または浸漬後 (すなわち、「溶液より取り出した」とき)に、傷つけ、および／または修復させても良い。

特定の実施形態において、従来の浸漬工程は必要でないこともあり得ることが理解されよう。

1または複数の浸漬工程を実施する場合、穀物を浸漬工程が完了した後12日間までに、傷つけ、そして修復させ得るが、損傷および修復はもっと長期にわたって生じ得る。その期間の長さは一部において、穀物中にて増大する酵素に依拠する。特定の穀物に好適な時間については、本明細書中にて考察する。特定の実施形態において、穀物を、浸漬が完了した後、約3 日間、約5 日間または約１0 日間、損傷および修復させる。この間、穀物をジベレリン酸などの成長促進剤で処理し、光の下35%未満の湿度で維持しても良い。

特定の実施形態において、浸漬または発芽の間、穀物の呼吸を最小限に抑えるように条件を制御する。呼吸は一般に、炭水化物などの分子よりエネルギーが放出されるプロセスとして理解される。呼吸を制限することの一つの利点は、損傷の修復に関係の無い生化学的プロセスの程度を抑えることができ、損傷の修復ためにエネルギーを保存し直接利用することができ、それによって、穀物における加水分解酵素の合成を増大させることができることである。別の利点は、呼吸に関連する分子（例えば、糖類、CO₂など）の産生を抑えることである。これらの分子は、真菌などの混入した微生物の増殖を支持し得る。

呼吸を抑える一つの方法は、発芽 および／または浸漬中の穀物の含水率を制御することである。これは、発芽 および／または浸漬中の環境における相対湿度を制御することによって、すなわち環境の温度および含水率を制御することによって達成できる。一般に、穀物中のデンプン粒が壊れることを防ぐ、呼吸を最小限に抑えるための条件を用いることが好ましい。一実施形態において、相対湿度は約 80% であり、温度は約20℃未満、好ましくは約10〜15℃である。

特定の実施形態において、穀物を当該穀物の表面に存在する微生物を除去するために処理しても良い。これは穀物が発芽中である場合、穀物の汚染を少なくとも抑えるために有用であり得る。特に有用な処理は、菌類または真菌の胞子を殺すための処理であり、この処理を用いなければ菌類は穀物の発芽中に当該穀物にて増殖し得る。処理の例としては、抗微生物剤中での洗浄、SO₂またはアンモニア中でのガス処理、尿素処理、照射処理（特にUV照射にて光に曝すことによる処理）を含む。

さらなるまたは代替的な方法としては、根または芽が発生し穀物の殻を貫通することを抑える方法である。ある状況下において、これらの器官が殻を貫通すると、微生物が胚乳に感染する機会を生じる。穀物中の特定の加水分解酵素の相対存在量のさらなる増大は、浸漬条件を改良することによって得られ得ることは理解されよう。特定の加水分解酵素に関連する改良法の例については、本明細書中にて考察する。

本明細書中で考察するプロセスについての特定の利点は、当該方法により得られた穀物は、さらなる後処理プロセス、例えばこれらの穀物より酵素を精製または抽出するプロセスに付すことが可能であるという点である。例えば、本明細書中にて考察されるプロセスにより得られた穀物は、プルルレナーゼ（pullulenase）を精製するための米国特許第4355110 号に記載されているプロセスに付すことが可能である。

本明細書中にて考察されるプロセスは、特に、アリューロン層、デンプン胚乳層、および胚に存在する穀物の加水分解酵素の発現を増大させるのに特に有用である。酵素の例としては、限界デキストリナーゼ、αおよびβアミラーゼ、1-6-β- グルカナーゼ、β1 ,4-キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、リポキシゲナーゼおよびβグルコシダーゼが挙げられる。

αおよびβアミラーゼは、2日間浸漬し、かつ3 日間発芽させることによって、増大した量で得ることができる。

限界デキストリナーゼは、2日間浸漬し、かつ7〜8 日間発芽させることによって、増大した量で得ることができる。

キシラナーゼは、2日間浸漬し、かつ10〜12 日間発芽させることによって、増大した量で得ることができる。

穀物を上記したように2日間浸漬し、 そして以下の条件を用いてさらに10〜15日間インキュベートした：
微生物の増殖を抑えるためのUV照射；
約 7〜13℃、通常約10℃に制御された温度；
強制的循環気流により80%に制御された相対湿度；
細根および芽が穀物の殻を貫通することを防ぐための30 分周期の定期的な回転（各回転時の後に、3時間の静止期が付随する）

Claims (18)

1. 穀物中の一以上の穀物の加水分解酵素の量を増大するための方法であって、穀物の一以上の選択した器官または組織が非致命的に損傷する条件下にて該穀物を発芽させることを含み、該選択した器官または組織が細根もしくはその一部または芽である、上記方法。
2. 穀物に物理的処理を施し、該穀物を非致命的に損傷させる条件下にて該穀物を発芽させる、請求項１記載の方法。
3. 穀物を回転、撹拌または加圧することによって、該穀物に物理的処理を施す、請求項２記載の方法。
4. 物理的処理を施すことにより、穀物を磨耗、破裂または傷つける、請求項３記載の方法。
5. 穀物に化学的処理または熱処理を施し、該穀物を非致命的に損傷させる条件下にて、該穀物を発芽させる、請求項１記載の方法。
6. 選択した器官または組織が穀物の細根である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 穀物に物理的処理を施し、該穀物より細根を部分的にまたは完全に除去する条件下にて、
   該穀物を発芽させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 穀物より細根が成長または再成長する条件に付する、請求項７記載の方法。
9. 穀物が約40%以下の含水率である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 穀物を発芽する前に、水溶液中に穀物を浸漬する工程を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 穀物を浸漬し、該穀物の含水率を約40%以下とする、請求項１０記載の方法。
12. 水溶液が成長促進剤、抗菌剤およびアルカリからなる群より選択される１または複数の化
    合物を含む、請求項１０または１１記載の方法。
13. 穀物を１以上の水溶液中に浸漬する、請求項１２記載の方法。
14. 穀物を最初に50ppm SO₂を含有する水溶液中に浸漬し約20%まで該穀物の含水率を高める、
    請求項１３記載の方法。
15. 穀物をさらに、5〜20 ppm ジベレリン酸を含有するpHが約8.0の水溶液中に浸漬し、該穀
    物の含水率を約40%まで高める、請求項１４記載の方法。
16. 穀物を、約5日間またはそれよりも短い期間浸漬する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 穀物が損傷する条件下にて約１0日間またはそれより短い期間、該穀物を発芽させる、請
    求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 一以上の穀物の加水分解酵素が、αアミラーゼ、βアミラーゼ、限界デキストリナーゼ、およびキシラナーゼからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。