JP5191291B2 - 便検体中ヘモグロビンの測定方法及び測定試薬キット - Google Patents
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Description
金コロイド凝集法やラテックス凝集法のような直接凝集によるヘモグロビン測定方法においては、測定値がヘモグロビン濃度とともに増加するので、ヘモグロビンが一定の濃度範囲にあるときには直線性が期待できる。しかしながら、測定対象であるヘモグロビンが過剰に存在すると、期待通りの直線性が維持できずに低濃度とおなじような測定値(異常低値)を示すことがある。このような偽陰性反応は凝集反応のプロゾーン現象やフック作用と呼ばれ、さまざまな対策が試みられてきた(特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4)。
しかしながら、上述の如き改良された測定方法を用いたとしても、糞便試料の中には、正常値からかけ離れた測定値を示すものが稀に存在していた。即ち、一般に、金コロイド凝集法やラテックス凝集法による糞便試料中のヘモグロビンの測定方法における測定では、試料を希釈して測定した測定値(希釈測定値)に希釈倍数を乗じた値は、希釈せずに測定した値(未希釈測定値)と一致する。しかしながら、不特定の糞便試料においては、未希釈測定値が、希釈測定値に希釈倍数を乗じた値に比べて著しく低い値(異常低値)を示すものが存在することが確認されていた。そのため、このような異常低値を示す糞便試料であっても精度良く測定できる測定方法の開発が望まれていた。
本発明は、(1)便検体中のヘモグロビンを測定する免疫学的測定方法であって、抗ハプトグロビン抗体を反応系中に共存させることを特徴とする、便検体中のヘモグロビンの測定方法、並びに(2)抗ヘモグロビン抗体を担持した担体を含有する試薬及び抗ハプトグロビン抗体を含有する試薬を含んでなる、或いは抗ヘモグロビン抗体を担持した担体及び抗ハプトグロビン抗体を含有する試薬を含んでなる、便検体中のヘモグロビン測定用試薬キットに関する。
なお、ハプトグロビンはヒト血漿中に存在する糖タンパク質であり、血液内でヘモグロビンを回収する役割を担っているものと考えられている。赤血球から溶血などによって血液中に放出されたヘモグロビンは、すみやかにハプトグロビンと結合しヘモグロビン−ハプトグロビン複合体を形成し、該複合体は、ヘモグロビン単体よりも安定であることが知られていた。そのため、ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体自体を免疫学的に測定する方法やハプトグロビンをヘモグロビンの安定化剤として添加することも知られていたが、糞便中に通常量存在してもヘモグロビンの免疫学的測定に影響を及ぼすことがなかったため、糞便中に多量に存在する場合ヘモグロビンの免疫学的測定にどのような影響を及ぼすかは知られていなかった。
上記ポリクローナル抗体としては、その由来についても特に限定されないが、例えば、兎、馬、羊、山羊、ラット、マウス等に由来する、上記した如き性質を有するものが挙げられる。市販のものを使用しても良いし、また、動物抗血清から公知の方法(例えば、「タンパク質精製法,Robert.K.Scopes著,シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社,1985年,37頁〜179頁」等に記載された方法等。)で取得されるものを使用しても良い。また、上記ポリクローナル抗体は、2種以上を適宜混合して用いても良い。
なお、上記モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体においては、抗体を、パパイン等で部分分解して得られるFabフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られるF(ab’)2フラグメント、F(ab’)2フラグメントを還元処理して得られるFab’フラグメント等の、所謂抗体フラグメントも抗ハプトグロビン抗体に含まれる。尚、このようなフラグメントとして使用した方が、ヘモグロビン測定時における非特異的反応を回避し易くなるのでより好ましい。
本発明に係る抗ヘモグロビン抗体を担持した担体(以下、本発明に係る抗ヘモグロビン抗体担持担体と略記する場合がある)は、上記抗ヘモグロビン抗体を上記担体に自体公知の方法に準じて担持させればよい。担体中の抗ヘモグロビン抗体量は、その担体により異なるが、担体1gに対して通常0.5〜2000mgAb、好ましくは2〜500mgAbとなるように調製され、例えば担体が金コロイドの場合、抗ヘモグロビン抗体含量は、金コロイド1gに対して通常0.5〜200mgAb、好ましくは10〜150mgAbであり、担体がラテックスの場合、ラテックス1gに対して通常0.5〜2000mgAb、好ましくは2〜500mgAbである。
また、例えばラテックス粒子に本発明に係る抗ヘモグロビン抗体を担持させる場合、以下の如くして抗ヘモグロビン抗体を担持させればよい。即ち、本発明に係る抗ヘモグロビン抗体を通常0.05〜2mg/ml、好ましくは0.1〜1mg/ml含む緩衝液等の溶媒中にラテックス粒子を通常0.1〜10w/v%、好ましくは0.2〜5w/v%となるように添加、懸濁させ、通常5〜30℃で通常2〜3時間反応させた後、この分野で行われる後処理、例えば遠心分離、例えば牛血清アルブミン(BSA)等の適当なタンパク質を含有する溶液を用いるブロッキング処理等の処理を行うことにより担持させることができる。
(1)抗ヘモグロビン抗体担持担体とヘモグロビンとの反応開始後、反応液の光学的測定を適当な間隔で2回行い、その測定値の差を光学的変化とする。
(2)抗ヘモグロビン抗体担持担体とヘモグロビンとの反応開始後の反応液の光学的変化率(特に、その最大変化率)を吸光度変化とする。
上記光学的変化の測定のうち、(1) 抗ヘモグロビン抗体担持担体とヘモグロビンとの反応開始後、反応液の光学的測定を適当な間隔で2回行い、その測定値の差を光学的変化とする方法がより好ましい。
本発明の測定方法に於ける抗ハプトグロビン抗体の使用量としては、抗ハプトグロビン抗体がポリクローナル抗体の場合、反応開始時の反応溶液中の濃度が通常1〜250μgAb/mL、好ましくは2〜100μgAb/mLとなるように設定されればよく、抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体の場合、反応開始時の反応溶液中の濃度が通常5〜500μgAb/mL、好ましくは25〜250μgAb/mLとなるように設定されればよい。また、抗ヘモグロビン抗体担持担体の使用量は、反応溶液中の濃度が0.001〜10w/v%、好ましくは0.005〜5w/v%となるように設定されればよい。また、本発明のヘモグロビンの測定方法における反応溶液としては、上記本発明に係る抗ヘモグロビン抗体担持担体の項で記載した溶媒と同じものが挙げられる。
即ち、便検体10mgに対して例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液1〜20mL添加したものを便検体抽出液とする。この抽出液を、要すれば適宜ろ過した後、得られた便検体抽出液中の0.2mLに、例えば、0.001〜10w/v%抗ヘモグロビン抗体担持担体及び2〜500μgAb/mL抗ハプトグロビン抗体を含む溶液1.8mLを添加し、25〜40℃で反応を開始させ、4分以内に500〜550nmで吸光度を測定し吸光度測定値1を得る。その後、10分間反応させ、再度同波長で吸光度を測定し吸光度測定値2を得る。更に、吸光度測定値2から吸光度測定値1を引き、吸光度変化を算出する。一方、濃度既知のヘモグロビン溶液を用いて、上記と同様の方法により吸光度変化を算出して予め作成した検量線により、吸光度測定値2から吸光度測定値1を引いた該吸光度変化の値から便検体中のヘモグロビン濃度を算出することによりなされる。なお、抗ハプトグロビン抗体は、上記のように抗ヘモグロビン抗体担持担体及び抗ハプトグロビン抗体を含む溶液中に存在させるのが好ましいが、反応溶液中に2〜500μgAb/mL存在するようにすればよいため、抗ヘモグロビン抗体担持担体及び抗ハプトグロビン抗体を含む溶液中ではなく、便検体抽出液中に存在させてもよく、また、別途抗ハプトグロビン抗体を含む溶液として反応溶液に添加してもよい。
本発明のヘモグロビンの測定方法を自動分析装置を用いて行う場合には、例えば
図1に記載のタイムスケジュールで行われる。尚、図1中のR1試薬は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液を、R2試薬は、例えば、0.001〜10w/v%抗ヘモグロビン抗体担持担体及び2〜500μgAb/mL抗ハプトグロビン抗体を含む溶液を表す。
図1について説明すると、便検体10mgに対して例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液1〜20mLを添加して調製した便検体抽出液を試料とし、その10〜20μLとR1試薬50〜150μLを測定容器に添加し、その1〜2分後にR2試薬を、試料とR1試薬の総量と同量添加して反応させ、R2試薬添加後1〜2分後(この場合、試料及びR1試薬添加後2〜4分後)に例えば吸光度(1回目)を測定し、R2試薬添加後5〜8分後(この場合、試料及びR1試薬添加後6〜10分後)に再度吸光度(2回目)を測定する。尚、この際の反応温度は、通常30〜40℃であり、吸光度測定する場合の主波長は500〜550nm、副波長は650〜700nmである。上記のようにして得られた吸光度(1回目)と(2回目)の差を算出して吸光度変化とする。一方、濃度既知のヘモグロビン溶液を試料として、上記と同様の方法により吸光度を測定し、吸光度変化を算出し、濃度と該吸光度変化の検量線を作成しておき、該検量線を用いることで、便検体中のヘモグロビン濃度を算出する。
以下実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれによって限定されるものでない。
便中の反応阻害物を、ヘモグロビンと特異的に結合する血清タンパクであるハプトグロビンと想定し、ハプトグロビンの存在によるヘモグロビン測定への影響を調べた。
まず、ヒトハプトグロビン製剤である「ハプトグロビン注−ヨシトミ」を0.004単位/mLとなるように約1800ng/mLのヘモグロビン溶液[0.5%BSA、0.2mol塩化アンモニウムバッファー(pH6.8)]に添加してハプトグロビン添加ヘモグロビン溶液を調製した。これとハプトグロビン(Hp)無添加の約1800ng/mLのヘモグロビン溶液を検体として、該溶液のヘモグロビン濃度を、便中ヘモグロビン測定試薬であるLタイプIGオートHem(合同酒精(株)製)をR2試薬として用い、便潜血自動測定機FOBITWAKO(ヒロセ電子システム(株)製)によって測定した。なお、LタイプIGオートHemは、抗ヘモグロビン抗体を担持させた金コロイドを含む試薬であり、FOBITWAKOは、金コロイドの凝集による吸光度の測定を自動で測定する測定機である。FOBITWAKOでは、検体(検体抽出液)16μLとR1試薬[0.5%BSA、0.2mol塩化アンモニウムバッファー(pH6.8)]104μLを反応容器に添加した後、1.2分後にR2試薬120μLを添加して反応させ、その1.2分後に1回目の吸光度測定を行い、更に試薬添加後5.3分後に再度吸光度測定を行い、2回の吸光度の差から吸光度変化が算出される。更に、予め求めておいた既知標準品の濃度と吸光度変化の検量線からヘモグロビン濃度が算出される。なお、吸光度測定の主波長は530nm、副波長は660nm、反応温度は37℃である。
次いで、該溶液を、ヘモグロビン溶液で倍々希釈して該希釈溶液を測定し、希釈倍数を乗じてハプトグロビン添加ヘモグロビン溶液中のヘモグロビン値を求めた。ハプトグロビンを添加した溶液と無添加の溶液について、得られた値を表1に示した。なお、表中で、FOBITWAKOの測定上限の1600ng/mLを超えるものについては1600<と記した。
実験例1より、ヘモグロビン測定系に共存するハプトグロビンが測定に影響を及ぼすことが確認されたので、抗ハプトグロビン抗体を添加することにより、その影響を回避できるかどうかの検討を行った。
まず、実験例1において調製したハプトグロビン添加ヘモグロビン溶液に、抗ヒトハプトグロビン抗体(ウサギ、DAKO社製A0030)が18.7μgAb/mL、37.5μg Ab/mL、75μg Ab/mL、150μg Ab/mL、300μg Ab/mLとなるように添加した溶液及び該抗体を添加しない溶液を検体として、試薬としてLタイプIGオートHem(合同酒精(株)製)を、測定機としてFOBITWAKO(ヒロセ電子システム(株)製)を用いて各検体のヘモグロビン濃度を測定した。得られた結果を表2に示す。
3種類の便検体A、B、Cを採便容器F(合同酒精(株)製)で採取し、試薬としてLタイプIGオートHem(合同酒精(株)製)を、測定機としてFOBITWAKO(ヒロセ電子システム(株)製)を用いて、ヘモグロビン濃度を測定した。その結果、検体Aは893ng/mL、検体Bは249ng/mL、検体Cは154ng/mLであった。次いで、便懸濁液を、検体抽出液(採便容器Fの内容液)で倍々希釈した溶液を測定し、得られた値に希釈倍数を乗じて便懸濁液中のヘモグロビン濃度を求めた。その結果を表3に示した。
検体抽出液[0.5%BSA、0.2mol塩化アンモニウムバッファー(pH6.8)]で調製した便検体A、B、Cの便懸濁液のヘモグロビン量を実施例1に記載した試薬と装置を用いて測定したところ、検体Aは971ng/mL、検体Bは263ng/mL、検体Cは153ng/mLであった。この検体溶液を、10倍希釈して測定した結果、測定値に希釈倍数を乗じた濃度(=10倍希釈値)は、検体Aでは980ng/mLと未希釈値とほぼ一致したが、検体Bでは910ng/mL、検体Cでは1920ng/mLと、未希釈より数倍高かった。
また、10倍希釈値と未希釈値の差が見られなかった検体Aにおいては、抗ハプトグロビン抗体300μgAb/mL添加した場合であっても、抗体添加によるヘモグロビン測定への影響はみられなかったことから、抗ハプトグロビン抗体による効果は異常検体に対して生じ、通常検体には悪影響を与えないことが判った。
実施例2と同様に、抗ヒトハプトグロビン・マウスモノクローナル抗体(日本バイオテスト(株)製FG-101)を添加した検体抽出液を用いて、検体A及びCについてヘモグロビンの測定を行った。その結果を表5に示した。
抗ヒトハプトグロビン抗体(ウサギ、DAKO社製A0030)を実施例1に用いたLタイプIGオートHemのR2試薬に所定量添加し、3検体A、C、Eを用いて、実施例3と同様に実験を行いヘモグロビン濃度を測定した。その結果を、表6に示した。
従って、このことから、抗ヒトハプトグロビン抗体は、検体抽出液中に予め入れても、試薬中に入れてもハプトグロビンによる影響を回避できることが判った。特に、R2試薬に入れても、その効果を示していることから、反応直前に抗ハプトグロビン抗体を添加しても、ハプトグロビンによるヘモグロビンの測定への影響を抑制することができることが判った。
本発明の方法を用いれば、例えばヘモグロビンが測定可能な一定濃度範囲に入るように試料を希釈して測定する方法において、未希釈測定値が希釈測定値に比べて著しく低い値となるような試料便についても、試料を希釈して測定した値に希釈倍数を乗じて求めた値と希釈せずに測定した値が一致する。
このように、本発明の測定方法であれば、試料を希釈しないで測定してもハプトグロビン等の反応阻害物質の影響を回避した測定結果が得られるので、大腸癌などの下部消化器疾患の検査において、より精度の高いヘモグロビンの測定が可能となる。
Claims (13)
- 便検体中のヘモグロビンを測定する免疫学的測定方法であって、担体にも標識物質にも結合していない抗ハプトグロビン抗体を反応系中に共存させ、抗ヘモグロビン抗体を担持した担体と便検体抽出液とを反応させて生じる凝集反応に由来する光学的変化に基づいて測定することを特徴とする、便検体中のヘモグロビンの測定方法。
- 光学的変化が、抗ヘモグロビン抗体を担持した担体とヘモグロビンの反応開始後、反応液の光学的測定を適当な間隔で2回行った時の測定値の差、又は抗ヘモグロビン抗体を担持した担体とヘモグロビンとの反応開始後の反応液の光学的変化率である、請求項1に記載の測定方法。
- 担体が金コロイド又はラテックス粒子である請求項1又は2に記載の測定方法。
- 担体が金コロイドである請求項3に記載の測定方法。
- 抗ヘモグロビン抗体がモノクローナル抗体である請求項1〜4の何れかに記載の測定方法。
- 抗ハプトグロビン抗体がポリクローナル抗体である請求項1〜5の何れかに記載の測定方法。
- 光学的変化が吸光度変化である、請求項1〜6の何れかに記載の測定方法。
- 光学的変化が500〜550nmの吸光度変化である、請求項7に記載の測定方法。
- 抗ヘモグロビン抗体を担持した担体を含有する試薬、及び担体にも標識物質にも結合していない抗ハプトグロビン抗体を含有する試薬を含んでなる、或いは抗ヘモグロビン抗体を担持した担体、及び担体にも標識物質にも結合していない抗ハプトグロビン抗体を含有する試薬を含んでなる、免疫凝集法による便検体中のヘモグロビン測定用試薬キット。
- 担体が金コロイド又はラテックス粒子である請求項9記載のキット。
- 担体が金コロイドである請求項10記載のキット。
- 抗ヘモグロビン抗体がモノクローナル抗体である請求項9〜11の何れかに記載のキット。
- 抗ハプトグロビン抗体がポリクローナル抗体である請求項9〜12の何れかに記載のキット。
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