JP7184054B2 - 測定試料希釈液およびキットおよび測定方法 - Google Patents

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Description

本発明は、イムノクロマト法による測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合：ヘモグロビンＡ１ｃ（％）の測定方法、前記測定方法に用いる測定試料希釈液および測定試料希釈液を含むキットに関する。
世界糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）によると、世界の糖尿病患者数はアメリカ、ヨーロッパなどの先進国に加え、中国、インド、ブラジルなどの新興国を含めて急増しており、２０１５年で約４．２億人存在し、２０４０年には約６．４億人に及ぶと予測され、糖尿病診断の重要性は増している。
糖尿病診断項目の一つであるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す場合がある）とは、血液中の酸素を運搬する役割を担うヘモグロビン（以下、Ｈｂと略す場合がある）に糖（グルコース）が結合した糖化Ｈｂの内、Ｈｂのβ鎖のＮ末端側に位置するバリン残基が糖化された物質を指し、総Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ量の割合であるＨｂＡ１ｃ（％）が過去１～２ヶ月間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の長期的な経過を観察するのに利用されている。
従来、ＨｂＡ１ｃ（％）の測定には、ＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法、酵素比色法、免疫比濁法などの測定技術が利用されていたが、これらの測定方法は専門知識を有することや分析装置が大型かつ高額であるなどの理由から、主に大規模病院や多数の検査を行う検査センターで利用されており、小規模病院ではＨｂＡ１ｃ（％）を簡単に測定できない点が問題となっていた。
近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、糖尿病診断においてもＰＯＣＴが広まりつつある。
ＨｂＡ１ｃ（％）の測定を目的としたＰＯＣＴの中に、イムノクロマト法を利用した技術が提案されている。イムノクロマト法とは、毛細管現象を利用した免疫測定法であり、妊娠検査やインフルエンザ検査などにおいて世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、イムノクロマトリーダー等の分析装置を利用して測定試料中に含まれる分析対象物質の量を定量化する技術が開発されつつある。
イムノクロマト法を用いて分析対象物質の量を定量する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では分析対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、金コロイド、着色ラテックス粒子、蛍光粒子等の検出粒子と感作した検出抗体として使用する。他方の抗体は、多孔質支持体の表面に線状に固定した捕捉抗体としてテストラインを形成する。加えて、前記検出抗体を特異的に捕捉する抗体を多孔質支持体の表面の、前記テストラインとは異なる位置に線状に固定しコントロールラインを形成する。測定試料中に含まれる分析対象物質は、多孔質支持体の一端（上流側）から展開し、検出抗体と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。分析対象物質と免疫複合体を形成しなかった遊離の検出試薬はテストライン上を通過し、コントロールラインの抗体に捕捉され発色する。これらの発色強度からイムノクロマトリーダー等の装置を利用することで分析対象物質の量を定量することができる。
前述の通り、イムノクロマト法によりＨｂＡ１ｃ（％）を測定するには、ＨｂＡ１ｃの糖化されている部位（Ｈｂのβ鎖のＮ末端側に位置するバリン残基）に特異的な抗体を使用するが、前記糖化部位はＨｂの表面に存在するのではなく、Ｈｂの内部に埋もれており、生理的な条件下では抗体が結合し難い場所に存在することが判明している。このような性状より、前記糖化部位をエピトープとして認識する抗体を効率良く反応させて測定を行うために、前記エピトープをＨｂの表面に露出させる（以下、変性と称す場合がある）技術が報告されている。
特許文献１、２には、測定試料希釈液に界面活性剤を含み、イムノクロマト試験片に環状多糖類を担持した構成が開示されている。前記発明は、下流の抗原抗体反応を阻害せず、かつエピトープを露出させるという点、つまり測定感度の向上に関しては一定の効果が期待される。しかしながら、前記発明は下流への展開斑が生じるため、測定精度が十分ではなかった。また、実際のイムノクロマトキットにおける測定試料の希釈操作は用手で行うことが想定されるため、測定試料と測定試料希釈液とを混合してからイムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間（以下、混合時間と略す場合がある）に明確な個人差が生じる。しかしながら、前記発明は測定試料希釈液中でのエピトープ露出反応の速度、つまり前記混合時間による測定結果の変動を考慮した界面活性剤種の選定がなされていないため、作業者により測定精度がさらに悪化する。さらに、前記発明では検出粒子として金コロイドまたはラテックス粒子を使用しているため、感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性の観点から十分ではなかった。なお、前記発明には測定試料希釈液の最適な組成は、使用する検出粒子によって異なることが記載されているがセルロース粒子に関しては言及されていない。
特許文献３、４には、測定試料希釈液に非イオン性界面活性剤を含み、イムノクロマト試験片に陰イオン性界面活性剤を担持した構成が開示されている。前記発明は、展開斑の向上に関しては一定の効果が期待される。しかしながら、前記発明は、イムノクロマト試験片に担持した界面活性剤が、希釈測定試料が展開する僅かな時間でエピトープをＨｂの表面に露出させることができないため、測定感度が十分ではなく、また前記混合時間の影響を大きく受けてしまう。さらに、前記発明は検出粒子として金コロイドを使用しているため、感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性の観点から十分ではなかった。
特開２０１２－２５１７８９号公報 特開２０１５－１５８５１５号公報 特開２０１５－２００５１７号公報 特開２０１６－１６１３２９号公報
本発明は、上記の問題点に鑑みて、従来技術よりも感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性の高い、イムノクロマト法による測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）の測定方法、前記測定方法に用いる測定試料希釈液、測定試料希釈液を含むキットを提供することを課題とするものである。より詳しくは、従来よりも測定試料と測定試料希釈液とを混合してからＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間の影響を受けにくい、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）の測定方法、前記測定方法に用いる測定試料希釈液、および測定試料希釈液を含むキットを提供することを課題とするものである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、測定試料希釈液として少なくとも非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および緩衝剤を含む水溶液を使用することで、従来技術よりも感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性が大幅に向上し、かつ測定試料と測定試料希釈液とを混合してからイムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間の影響を受けないことを見出した。また、前記測定試料希釈液に酸化剤および／またはアジ化剤を含む水溶液を使用することで、感度・精度・ＨＰＬＣ法との相関性がさらに向上することを見出し、本発明を完成させた。なお、本発明の測定試料希釈液は、検出粒子がセルロース粒子の場合に、特に有効である。
すなわち、代表的な本発明は以下の通りである。
１． 測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合であるヘモグロビンＡ１ｃ（％）を定量するためのイムノクロマト用測定試料希釈液であって、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および緩衝剤を含む水溶液である、測定試料希釈液。
２． 前記陰イオン性界面活性剤はアルキル硫酸塩である、１に記載の測定試料希釈液。
３． 前記非イオン性界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、１または２に記載の測定試料希釈液。
４． 前記非イオン性界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの混合物である、１または２に記載の測定試料希釈液。
５． 前記陰イオン性界面活性剤を０．０５～２．０ｗｔ％、かつ前記非イオン性界面活性剤を０．０５～３．０ｗｔ％含む、１から４のいずれかに記載の測定試料希釈液。
６． さらに酸化剤を含む、１から５のいずれかに記載の測定試料希釈液。
７． 前記酸化剤は亜硝酸塩である、６に記載の測定試料希釈液。
８． さらにアジ化剤を含む、１から７のいずれかに記載の測定試料希釈液。
９． 前記アジ化剤はアジ化ナトリウムである、８に記載の測定試料希釈液。
１０． １から９のいずれかに記載の測定試料希釈液、イムノクロマト試験片、およびイムノクロマトリーダーからなる、ヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量するための測定キット。
１１． 前記イムノクロマト試験片は、
（１）サンプルパッドと、
（２）前記測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを捕捉するための抗体とセルロース粒子との複合体を坦持したコンジュゲーションパッドと、
（３）測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを特異的に捕捉するための抗体を線状に固定したメンブレンと、
（４）吸収パッドと、
から構成される、１０に記載の測定キット。
１２． １から１１のいずれかに記載の測定試料希釈液または測定キットを用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（ｉｉｉ）をこの順に経て、測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量する方法。
工程（ｉ）：測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：４９～１：９９９で混合し希釈する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、イムノクロマト試験片のサンプルパッドに滴下する工程
工程（ｉｉｉ）：イムノクロマト試験片のテストラインの反射吸光度とコントロールラインの反射吸光度とからヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を比色定量する工程
１３． 測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：９９～１：４９９で混合し希釈する、１２に記載の方法。
本発明の測定試料希釈液は、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および緩衝剤を含む水溶液であるため、高感度・高精度・ＨＰＬＣ法との高相関性でかつ測定試料と測定試料希釈液とを混合してからイムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間の影響を受けずに、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）を測定することができる。
本発明に用いるイムノクロマト試験片の一例を示す（上面）図である。 本発明に用いるイムノクロマト試験片の一例を示す（側面）図である。
本発明において、測定試料は、特に限定されないが、例えば、血液、リンパ液、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料が挙げられる。血液においては、全血のほか、血液を遠心分離して得られた血清、血球または血漿を試料とすることができる。また、測定試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳動物由来の生体試料も対象である。また、本発明における測定項目は、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）である。
本発明の測定試料希釈液は、少なくとも、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および緩衝剤を含む水溶液である。前記測定試料希釈液中に陰イオン性界面活性剤を含むことによって、測定試料と測定試料希釈液とを混合してからイムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間差による測定値（例えば、後述のテストラインの反射吸光度）の変動を抑制し、測定感度および測定精度を高めることができる。また、前記測定試料希釈液中に非イオン性界面活性剤を含むことによって、イムノクロマト試験片を移動（流動）する測定試料の展開斑を抑えることができるため測定精度を高めることができる。また、緩衝剤を含んでいないと、測定試料のｐＨによっては下流での抗原抗体反応が阻害され、測定感度が低下することがある。なお、本発明における測定項目は、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合（ＨｂＡ１ｃ（％））であるため、前記非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤のいずれかは、溶血作用を示す界面活性剤である必要がある。
前記陰イオン性界面活性剤としては、前記測定試料中のＨｂＡ１ｃを即座に変性し、かつ下流の抗原抗体反応を阻害しなければ、特に限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）等のアルキル硫酸塩、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の胆汁酸塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルメチルアラニン、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム塩等のアシルアミノ酸塩、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、βナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩及び特殊ポリカルボン酸型高分子界面活性剤等が挙げられる。これらの中でも、アルキル硫酸塩が好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。なお、前記アルキル硫酸塩は溶血作用を示す界面活性剤である。
本発明において、測定試料希釈液中の前記陰イオン性界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、０．０５～２．０ｗｔ％が好ましく、０．１～１．０ｗｔ％がより好ましい。濃度が低いと、ＨｂＡ１ｃの変性に時間がかかるため、測定試料と測定試料希釈液とを混合してからイムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間により、測定値（例えば、後述のテストラインの反射吸光度）が変動し、測定感度および測定精度が低下することがある。一方、濃度が高いと、下流の抗原抗体反応を阻害するため、測定感度が低下することがある。
本発明において、前記非イオン性界面活性剤としては、前記測定試料の展開均一性を向上させ、かつ下流の抗原抗体反応を促進する作用を有するものであれば、特に限定されないが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（エマノーン（登録商標）等）、ポリオキシエチレンアルキルアミン（アミート（登録商標）等）、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（レオドール（登録商標）等）、ソルビタン脂肪酸エステル（レオドール（登録商標）等）、グリセリン脂肪酸エステル（レオドール（登録商標）等）、アルキルアルカノールアミド（アミノーン（登録商標）等）、アルキルイミダゾリン（ホモゲノール（登録商標）等）、ショ糖脂肪酸エステルが挙げられる。これらの中でも、測定試料の展開均一性の観点からポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等）が、下流の抗原抗体反応促進の観点からポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）等）がそれぞれ好ましく、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等）と、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）等）との両方を含むのがより好ましい。なお、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等）の市販品としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（共に、和光純薬工業社製）等が好適に用いられ、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）等）の市販品としては、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）１００、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０（共に、和光純薬工業社製）等が好適に用いられる。なお、前記ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等）に溶血作用は乏しいが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）等）は溶血作用を示す界面活性剤である。
本発明において、測定試料希釈液中の非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０５～３．０ｗｔ％であるのが好ましい。また、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等）およびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）等）の混合物を用いる場合、前者の濃度は、０．０５～３．０ｗｔ％が好ましく、０．１～２．０ｗｔ％がより好ましい。濃度が低いと、下流への展開困難となるか、展開しても不均一となり測定精度が大幅に低下することがある。一方、濃度が高いと、物理的に吸着している検出粒子と検出抗体、および／またはメンブレンと捕捉抗体とが乖離し、測定値が得られないか、得られたとしても測定感度が大幅に低下することがある。また、後者の濃度は、０．１～２．０ｗｔ％が好ましく、０．１～１．０ｗｔ％がより好ましい。濃度が低いと、下流の抗原抗体反応の促進効果が得られず、測定感度が低下することがある。一方、濃度が高いと、物理的に吸着している検出粒子と検出抗体、および／またはメンブレンと捕捉抗体とが乖離し、測定値が全く得られないか、得られたとしても測定感度が大幅に低下することがある。
本発明において、前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において十分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）が挙げられる。これらの中でも、本発明に用いる抗体の至適ｐＨ範囲である７．０付近において十分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましく、トリス、リン酸、ＰＩＰＥＳがより好ましい。前記緩衝剤の濃度は、目的とするｐＨ範囲において十分な緩衝能力を有していれば、特に限定されないが、１０～１００ｍＭ程度が好ましい。
本発明において、測定試料希釈液は非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および緩衝剤に加えて、酸化剤を含んでいてもよい。前記酸化剤としては、Ｈｂを酸化し、かつ下流の抗原抗体反応を阻害しなければ、特に限定されないが、ハロゲンオキソ酸塩、遷移金属錯体の塩、過酸化物、過マンガン酸塩、クロム酸塩、亜硝酸塩、および超酸化物が挙げられる。ハロゲンオキソ酸塩として、例えば、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、次亜臭素酸、亜臭素酸、臭素酸、過臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜ヨウ素酸、ヨウ素酸、および過ヨウ素酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。遷移金属錯体の塩として、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩のフェリシアン化塩が挙げられる。過酸化物として、例えば有機過酸化物が挙げられる。過マンガン酸塩として、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属の過マンガン酸塩が挙げられる。これらの中でも、亜硝酸塩が好ましく、亜硝酸ナトリウムがより好ましい。酸化剤を含むことで、測定試料中のＨｂの酸化斑に起因する抗原抗体反応斑を抑制することができ、測定精度の向上が期待できる。また、測定試料中の非特異反応の原因となる物質をも酸化することで、非特異反応の進行を抑制でき、測定精度の向上が期待できる。
本発明において、測定試料希釈液中の前記酸化剤の濃度は、特に限定されないが、０．０１～１．０ｗｔ％が好ましい。濃度が低いと、Ｈｂの酸化が不十分となり、測定値（例えば、後述のテストラインの反射吸光度）が変動し、測定精度が低下することがある。一方、濃度が高いと、下流の抗原抗体反応を阻害するため、測定感度が低下することがある。
本発明の測定試料希釈液は非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および緩衝剤に加えて、アジ化剤を含んでいてもよい。前記アジ化剤としては、Ｈｂをアジ化し、かつ下流の抗原抗体反応を阻害しなければ、特に限定されないが、アジ化ナトリウムが好ましい。なお、前記アジ化剤は保存時には防腐剤としても作用する。アジ化剤を含むことで、測定試料中のＨｂのアジ化斑に起因する抗原抗体反応斑を抑制することができ、測定精度の向上が期待できる。また、測定試料中の非特異反応の原因となる物質をもアジ化することで、非特異反応の進行を抑制でき、測定精度の向上が期待できる。
前記アジ化剤の濃度は、特に限定されないが、０．０１～０．１ｗｔ％が好ましい。濃度が低いと、Ｈｂのアジ化が不十分となり、測定値（例えば、後述のテストラインの反射吸光度）が変動し、測定精度が低下することがある。一方、濃度が高いと、下流の抗原抗体反応を阻害するため、測定感度が低下することがある。また、０．１ｗｔ％以上のアジ化ナトリウムは毒物であるため好ましくない。
本発明の測定試料希釈液は、必要に応じて、ブロッキング用タンパク質（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＢＰＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等）、塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アルミニウム等）、および／または抗体安定化剤（単糖類、オリゴ糖類、多糖類、糖アルコール、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類、アルブミン類、グロブリン類、繊維性タンパク質等）を添加してもよい。
前記測定試料希釈液による測定試料の希釈倍率は、特に限定されないが、５０～１０００倍希釈が好ましく、１００～５００倍希釈がより好ましい。測定試料の希釈倍率が小さいと、下流への展開が困難となる。また、測定試料中の夾雑物質の影響も受けやすくなり、測定精度が低下することがある。一方、測定試料の希釈倍率が大きいと、測定試料中のＨｂおよびＨｂＡ１ｃの濃度が低下し、測定感度が低下することがある。
本発明において、イムノクロマト測定キットは、測定試料希釈液に加え、イムノクロマト試験片、およびイムノクロマトリーダーを含む。
本発明において、イムノクロマト試験片の構成は、特に限定されないが、イムノクロマト試験片の測定試料溶液の添加部（滴下部）を上流側として、前記添加部を有するサンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドの順に連接配置されている構成が好ましい。次いで、本発明のイムノクロマト試験片の一例を、図面を参照して説明するが、本発明を何ら限定するものではない。図１および２において、１はサンプルパッド、２はコンジュゲーションパッド、３はメンブレン、４は吸収パッド、５はバッキングシート、６はテストライン、７はコントロールライン、８は粘着シートをそれぞれ示す。
図１および２の例では、イムノクロマト試験片は、幅３～５ｍｍ（好ましくは、４ｍｍ程度）、長さ４０～１００ｍｍ（好ましくは６０ｍｍ程度）の細長い短冊状の形態をしている。なお、イムノクロマト試験片のメンブレン３の上流側の端部から約１５ｍｍの位置に捕捉抗体を線状に固定したテストライン６が形成される。また、前記端部から約２０ｍｍの位置に別の捕捉抗体を線状に固定したコントロールライン７が形成される。さらに、イムノクロマト試験片のコンジュゲーションパッド２には検出抗体と検出粒子との複合体であるテストライン検出試薬、および標識したブロッキング用タンパク質と検出粒子との複合体であるコントロールライン検出試薬が坦持されている。
サンプルパッド１の材質は、測定試料を速やかに吸収した後、下流のコンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドへ展開できる材質のものであれば、特に限定されない。例えば、セルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記サンプルパッド１の厚さは、０．１～２．０ｍｍが好ましく、０．２～１．０ｍｍがより好ましい。厚さが薄いと、下流での測定試料の流れが不均一となり測定精度が低下することがある。一方、厚さが厚いと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多く必要になる。
コンジュゲーションパッド２の材質は、テストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持でき、かつ測定試料の下流への展開と共に前記両検出試薬を速やかに放出することができる材質のものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、ガラス製のろ紙が好ましい。また、前記コンジュゲーションパッド２の厚さは、０．１～２．０ｍｍが好ましく、０．２～１．０ｍｍがより好ましい。厚さが薄いと、目的量のテストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持できないことがある。一方、厚さが厚いと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多くなる。
メンブレン３の材質は、測定試料を精度よく均一に展開できるものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、またはナイロン製のメンブレンが挙げられる。これらの中でも、ニトロセルロース製のメンブレンが好ましい。
吸収パッド４の材質は、上流より展開してきた測定試料を速やかに吸収した後、逆流しないよう保持できる材質のものであれば、特に限定されないが、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記吸収パッド４の厚さは、０．２～５．０ｍｍが好ましく、０．５～２．０ｍｍがより好ましい。厚さが薄いと、測定試料の滴下量によっては一度吸収パッドに吸収された測定試料がメンブレン側に逆流することがある。一方、厚さが厚いと、イムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を覆うハウジングケースのサイズも大きくなり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。
コンジュゲーションパッド２に担持するテストライン検出試薬は、特に限定されないが、検出抗体と検出粒子との複合体が好ましい。
前記検出抗体は、特に限定されないが、抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体が好ましく、抗ＨｂＡ１ｃ抗体がより好ましい。抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、分子サイズも特に限定されない。
前記検出粒子は、特に制限されないが、着色粒子や蛍光粒子を用いることができる。着色粒子としては金属粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子などを例示することができる。金属粒子としては金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどを例示することができ、平均粒子径は１～１００ｎｍが好ましい。ラテックス粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などの材質からなるものを例示することができ、平均粒子径は２５～５００ｎｍが好ましい。蛍光粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができ、蛍光色素としてはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体などを例示することができる。これらの中でも、分散性が高く、視認性に優れたセルロース粒子が好ましい。以下、セルロース粒子について詳述する。
前記セルロース粒子は、大量の水酸基を有するため、多くの反応性染料を共有結合により保持することができるだけでなく、濃染化した後も水などへの安定分散性を保持することができる。セルロース粒子として、再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース等を用いることができるし、一部誘導体化されたセルロースを用いてもよい。前記セルロース粒子の重量の２０～９０ｗｔ％はセルロース由来であることが好ましく、２０～８０ｗｔ％がより好ましく、２０～７０ｗｔ％がさらに好ましい。
前記セルロース粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、１００～１０００ｎｍが好ましく、２００～８００ｎｍがより好ましい。平均粒子径が１０００ｎｍより大きいと、下流への展開が遅くなり、測定時間が長くなる。また、メンブレン上に捕捉されやすくなり、バックグラウンド自体が発色してしまうことでテストラインおよびコントロールラインでの発色が不明瞭になることがある。一方、平均粒子径が１００ｎｍより小さいと、物理吸着または化学結合できる抗体量が低下し、測定感度が低下することがある。
前記セルロース粒子の色は、特に限定されないが、例えば赤色、青色、黄色、緑色、黒色、白色、蛍光色が挙げられる。これらの中でも、バックグラウンドのＨｂ由来の赤色の影響を受けにくい青色、黒色が好ましく、青色がより好ましい。このようなセルロース粒子としては、旭化成社製の着色セルロースナノビーズ（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標））が挙げられるが、この中でもＮａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）、Ｂｌａｃｋ（ＫＲ１）が好ましく、Ｎａｖｙ（ＢＬ１）、Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ（ＢＬ２）がより好ましい。
前記テストライン検出試薬は、ブロッキング用タンパク質によりブロッキングするのが好ましい。前記ブロッキング用タンパク質は、特に限定されないが、微生物由来タンパク質のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下、ＢＰＦと略す場合がある）、動物由来タンパク質のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す場合がある）、カゼインが好ましく、微生物由来タンパク質のＢＰＦがより好ましい。ＢＰＦ（約２２ｋＤａ）はＢＳＡ（約６６ｋＤａ）よりも分子量が小さいため、より高精度の測定が可能である。また、ＢＳＡはウシ由来であるため外来性物質に起因する汚染のリスクがあるが、ＢＰＦは微生物由来であるため前記リスクはない。一方、カゼインの溶解にはアルカリ条件（ｐＨ＝８．５～１０）のホウ酸緩衝液を使用する必要があるため、抗体が失活し感度が低下することがある。また、ホウ酸緩衝液は環境リスクも高い。一方、ＢＰＦの溶解には中性条件のトリス、リン酸、ＰＩＰＥＳ等を使用することができるため好ましい。ブロッキング用タンパク質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、分子サイズも、特に限定されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にブロッキング用タンパク質の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するブロッキング用タンパク質の結合量は増加するので、測定精度の向上に寄与する。
前記検出抗体と前記セルロース粒子との結合方法は、特に限定されないが、疎水結合による物理吸着または共有結合による化学結合で感作するのが好ましく、操作が簡便でありかつコストも安い物理吸着がより好ましい。なお、感作効率を向上させるため、セルロース粒子に反応性活性基を導入してもよい。反応性活性基としては、特に限定されないが、例えばカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、水酸基が挙げられる。これらの中でも、カルボキシル基、アミノ基が好ましい。カルボキシル基の場合は、カルボジイミドを用いてリガンドのアミノ基と共有結合を形成することができる。
本発明で用いるコンジュゲーションパッド２に担持するコントロールライン検出試薬は、特に限定されないが、標識したブロッキング用タンパク質と検出粒子との複合体が好ましい。
前記テストライン検出試薬の検出粒子の平均粒子径と、前記コントロールライン検出試薬の検出粒子の平均粒子径とは、実質的に同一であることが好ましい。ここで、実質的に同一であるとは、平均粒子径が±５０ｎｍ以内であることを意味する。両者の平均粒子径が異なると、下流への展開速度や発色強度に差異が生じ、コントロールラインによるテストラインの補正がうまく機能せず、測定精度が低下することがある。
前記テストライン検出試薬の検出粒子の色と、前記コントロールライン検出試薬の検出粒子の色とは、実質的に同一であることが好ましい。ここで、実質的に同一であるとは、最大吸光波長が±２０ｎｍ以内であることを意味する。両者の色が異なると、例えば一般的な発光ダイオード（以下、ＬＥＤと略す場合がある）－フォトダイオード（以下、ＰＤと略す場合がある）の測定装置で測定する場合に、テストラインとコントロールラインの各色に対応する複数のＬＥＤ－ＰＤの組み合わせが必要となり、装置が大型化する。
前記標識したブロッキング用タンパク質における標識物質は、特に限定されないが、比較的安価で、入手し易いことやタンパク質標識分野等で実績があることから、ビオチンまたはジゴキシゲニンが好ましく、ビオチンがより好ましい。
前記標識したブロッキング用タンパク質の標識方法は、特に限定されないが、化学反応により共有結合を形成するものが好ましく、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド法を例示できる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド法を用いることで、例えばビオチンのカルボキシル基をＮ－ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤存在下で縮合反応し、選択的に活性化し、ブロッキング用タンパク質のアミノ基とアミド結合を介して標識することができる。前記縮合反応に使用するＮ－ヒドロキシアミン系化合物は、特に限定されないが、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド、２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸エチルエステル、２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸アミド、Ｎ－ヒドロキシピペリジン、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド、Ｎ－ヒドロキシイミダゾール、Ｎ－ヒドロキシマレイミドが挙げられる。これら化合物を２種以上用いてもよい。これらの中でも、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと略す場合がある）が、比較的安価で、入手し易いことやペプチド合成分野等で実績があることから好ましい。また、前記縮合反応に使用する脱水縮合剤としては、特に限定されないが、例えば１－エチル－３－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩、１－シクロヘキシル－（２－モルホニル－４－エチル）－カルボジイミド・メソｐ－トルエンスルホネートが挙げられる。これらの中でも、１－エチル－３－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣと略す場合がある）がペプチド合成分野等で汎用的な水溶性縮合剤として実績があることから好ましい。また、反応温度は、特に限定されないが、１０～５０℃が好ましく、２０～４０℃がより好ましい。反応時間は反応温度によって異なるが、通常は５分～２４時間である。なお、反応液中に含まれる未反応のＮ－ヒドロキシアミン系化合物や脱水縮合剤は濾過や遠心分離などにより水溶媒から容易に分離することができる。
前記標識したブロッキング用タンパク質におけるブロッキング用タンパク質は、特に限定されないが、微生物由来タンパク質のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下、ＢＰＦと略す場合がある）、動物由来タンパク質のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す場合がある）、カゼインが好ましく、微生物由来タンパク質のＢＰＦがより好ましい。ＢＰＦ（約２２ｋＤａ）はＢＳＡ（約６６ｋＤａ）よりも分子量が小さいため、より高感度の測定が可能である。また、ＢＳＡはウシ由来であるため外来性物質に起因する汚染のリスクがあるが、ＢＰＦは微生物由来であるため前記リスクはない。一方、カゼインの溶解にはアルカリ条件（ｐＨ＝８．５～１０）のホウ酸緩衝液を使用する必要があるが、ホウ酸緩衝液は環境リスクが高い。一方、ＢＰＦの溶解には中性条件のトリス、リン酸、ＰＩＰＥＳ等を使用することができるため好ましい。ブロッキング用タンパク質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、分子サイズも、特に限定されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にブロッキング用タンパク質の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するブロッキング用タンパク質の結合量は増加するので、測定感度の向上に寄与する。
コンジュゲーションパッド２に前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬を担持させる方法は、特に限定されないが、例えば前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬を一定比率で混合した後、前記混合液をコンジュゲーションパッドに均一に塗布、噴霧または含浸した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記混合液の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り５～５０μＬが好ましい。また、前記混合液の検出粒子濃度は、特に限定されないが、０．０１～０．５ｗｔ％が好ましく、０．０２～０．２ｗｔ％がより好ましく、０．０２～０．１ｗｔ％がさらに好ましい。濃度が０．０１ｗｔ％より低いと、ＨｂおよびＨｂＡ１ｃを十分捕捉・検出することができず、測定感度が低下することがある。一方、濃度が０．５ｗｔ％より高くても、測定感度の向上は見られず、コストだけが高くなる。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃～８０℃が好ましく、２０℃～６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５～１２０分間である。
本発明で用いるメンブレン３上のテストライン６を形成する線状に固定した捕捉抗体は、特に限定されないが、抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体が好ましく、抗Ｈｂ抗体がより好ましい。抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、分子サイズも特に限定されない。
本発明で用いるメンブレン３上のコントロールライン７を形成する線状に固定した捕捉抗体は、特に限定されないが、コントロールライン検出試薬の標識物質を特異的に捕捉するための抗体が好ましく、具体的には標識物質がビオチンの場合は抗ビオチン抗体であり、標識物質がジゴキシゲニンの場合は、抗ジゴキシゲニン抗体である。なお、抗ビオチン抗体または抗ジゴキシゲニン抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいし、分子サイズも特に限定されない。
メンブレン３に前記テストラインを形成する捕捉抗体と前記コントロールラインを形成する捕捉抗体を線状に固定する方法は、特に限定されないが、例えば前記テストラインを形成する捕捉抗体と前記コントロールラインを形成する捕捉抗体を、それぞれ線上に一定量を異なる位置に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記両捕捉抗体の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り０．１～２μＬが好ましい。また、前記両捕捉抗体の塗布濃度は、特に限定されないが、０．１～１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．２～５ｍｇ／ｍＬがより好ましく、０．５～２ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。濃度が低いと、ＨｂおよびＨｂＡ１ｃを十分捕捉・検出することができず、測定感度が低下することがある。一方、濃度を高くしても、測定感度の向上は見られず、コストだけが高くなる。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃～８０℃が好ましく、２０℃～６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５～１２０分間である。
本発明において、イムノクロマト試験片は、前記作製したメンブレン３を粘着シート８の中央付近に貼り付け、次いでコンジュゲーションパッド２をメンブレン３の一方の末端上に一部重ね合わせて貼り付け、次いでサンプルパッド１をコンジュゲーションパッド２のメンブレン３との重なりとは逆の末端上に一部重ね合わせて貼り付け、次いで吸収パッド４をメンブレン３の他方の末端上に一部重ね合わせて貼り付けた後、一定幅の短冊状に切断することで作製することができる。なお、テストライン６およびコントロールライン７は試験片を作製した後に調製してもよいし、試験片を作製する前に調製してもよい。
前記イムノクロマト試験片は、少なくともサンプルパッド１上に測定試料を滴下するための第一の開口部、メンブレン３上にテストライン６とコントロールライン７を測定するための第二の開口部を有する適当なプラスチック製のハウジングケースに収容されたものでも良い。
本発明の測定試料希釈液、およびイムノクロマト試験片を用いてメンブレン上でＨｂＡ１ｃ（％）の測定を行う方法は、特に限定されないが、以下の方法が例示できる。初めに、測定試料と測定試料希釈液とを所定の希釈倍率で混合することで展開可能な希釈測定試料を得る。次いで、前記希釈測定試料をサンプルパッド１に滴下することで、希釈測定試料は毛細管現象によりサンプルパッド１を通過してコンジュゲーションパッド２に展開する。その際、希釈測定試料はコンジュゲーションパッド２に坦持されたテストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を溶解しながら、希釈測定試料中のＨｂＡ１ｃとテストライン検出試薬中の抗ＨｂＡ１ｃ抗体で感作したセルロース粒子とが免疫複合体を形成する。なお、希釈測定試料中のＨｂＡ１ｃ以外のＨｂ（例えば、ＨｂＡ０等）はテストライン検出試薬とは免疫複合体を形成しない。次いで、前記希釈測定試料はメンブレン３に展開する。希釈測定試料がテストライン６に到達すると、前記免疫複合体はテストラインを形成する捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）で捕捉されて集積し、テストライン６が発色する。なお、希釈測定試料中のＨｂＡ１ｃ以外のＨｂ（例えば、ＨｂＡ０等）もテストラインを形成する捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）で捕捉されて集積するため、テストライン上では免疫複合体とＨｂＡ１ｃ以外のＨｂ（例えば、ＨｂＡ０等）との競合的な捕捉が生じ、捕捉される確率は測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合：ＨｂＡ１ｃ（％）に依存する。つまり、テストラインの発色強度から、ＨｂＡ１ｃ（％）を直接測定することが可能となる。その後、前記希釈測定試料がコントロールライン７に到達すると、コントロールライン検出試薬中の標識物質（ビオチン）で標識したブロッキング用タンパク質で感作したセルロース粒子はコントロールラインを形成する捕捉抗体（抗ビオチン抗体）で捕捉されて集積し、コントロールライン７が発色する。最後に、前記希釈測定試料は吸収パッド４で吸収される。
前記ＨｂＡ１ｃ（％）はテストラインの発色強度から直接測定してもよいし、希釈測定試料の流動斑を考慮し、テストラインの発色強度をコントロールラインの発色強度で割り算した補正値から測定してもよい。
本発明において、イムノクロマト試験片のテストラインおよびコントロールラインの測定方法は、特に限定されず、市販のイムノクロマトリーダーを用いてもよいし、別途公知の方法でイムノクロマトリーダーを製造してもよい。検出系としては、特に限定されないが、例えばＬＥＤ－ＦＤ、ＬＥＤ－ＣＭＯＳ、ＬＥＤ－ＣＣＤを使用することができる。
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で記載するＨｂＡ１ｃ（％）は全てＮＧＳＰ値である。
（実施例１）
（１）ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬の調製
８．５７ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ ＳＹＳＴＥＭ ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｗｔ％のセルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４－０７８８５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）９００μＬ、および前記１．０ｍｇ／ｍＬ（０．１ｗｔ％）の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１２０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のカゼイン（０３０－０１５０５、和光純薬工業社製）、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなるブロッキング液（ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）で６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ－３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０－０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、５０ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ１０．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ－３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０－０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５ｗｔ％のスクロース（１９６－０００１５、和光純薬工業社製）、０．２ｗｔ％のカゼイン（０３０－０１５０５、和光純薬工業社製）、６２ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ９．２）２．０ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬中の検出粒子濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０５ｗｔ％）、抗体濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬ（０．００５ｗｔ％）であった。
（２）ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬の調製
Ｄビオチン（０４８２２－９１、ナカライテスク社製）１６ｍｇ、およびジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ（０８９０４－１４、ナカライテスク社製）１０００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、Ｄビオチン溶液を得た。次いで、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ（１５０２２－８６、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド：ＮＨＳ（１８９４８－０２、ナカライテスク社製）２０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン溶液１００μＬおよび前記ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１５分間静置し、Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：ＢＰＦ（ＢＰＦ－３０１、東洋紡社製）１０ｍｇ、および蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＢＰＦ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１００μＬと前記ＢＰＦ溶液１００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ３０分間静置し、Ｄビオチン－ＢＰＦ溶液を得た。次いで、１．０ｗｔ％のセルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４－０７８８５、和光純薬工業社製）（ＰＨ７．０）９００μＬ、および前記Ｄビオチンン－ＢＰＦ溶液１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１２０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のカゼイン（０３０－０１５０５、和光純薬工業社製）、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなるブロッキング液（ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）で６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ－３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０－０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、５０ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなる洗浄液（ｐＨ１０．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ－３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０－０４、トミー精工社製）を用い、１０，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５ｗｔ％のスクロース（１９６－０００１５、和光純薬工業社製）、０．２ｗｔ％のカゼイン（０３０－０１５０５、和光純薬工業社製）、６２ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１－０２１９５、和光純薬工業社製）からなる塗布液（ｐＨ９．２）２．０ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ－５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理し、ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬を得た。なお、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬中の検出粒子濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０５ｗｔ％）、ブロッキング用タンパク質の標識導入比は１：７であった。
（３）ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの作製
３．６ｍｇ／ｍＬの抗Ｈｂモノクローナル抗体（ＨＢＡ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２６、ＡＶＩＶＡ ＳＹＳＴＥＭ ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体（Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａ１５０－１１１Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、上流側に２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部、中央に２５ｍｍ×３００ｍｍのメンブレン部、下流側に１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部から構成される６０ｍｍ×３００ｍｍのメンブレンカード（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ １２０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃａｒｄｓ、ＨＦ１２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のメンブレン部の上流側から１５ｍｍの位置に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズル（ＢＨＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記１．０ｍｇ／ｍＬの抗Ｈｂモノクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ－５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成した。さらに、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から２０ｍｍの位置に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズル（ＢＨＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記０．５ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ－５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成することで、ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードを得た。
（４）ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドの作製
前記ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬および前記ＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬を、６：１の割合（質量比）で混合した。なお、ＨｂＡ１ｃ測定用テストライン検出試薬およびＨｂＡ１ｃ測定用コントロールライン検出試薬中の粒子濃度が同一である場合は、体積比６：１の割合で混合すればよい。次いで、１０ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記混合液を１５μＬ／ｃｍの塗布量で均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ－５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを得た。
（５）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と５ｍｍ重なるよう前記ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドと５ｍｍ重なるよう２０ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンカードの下流側の１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と２ｍｍ重なるよう２０ｍｍ×３００ｍｍの吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、ギロチン式カッティングモジュール（ＣＭ５０００、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、幅４ｍｍ、長さ６３ｍｍの短冊状にカットすることで、ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を得た。
（６）測定試料希釈液の調製
りん酸緩衝生理食塩粉末（１６２－１９３２１、和光純薬工業社製）１袋、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１６６－２１２１３、和光純薬工業社製）２．０ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム：ＳＤＳ（１９４－１３９８５、和光純薬工業社製）１．０ｇ、亜硝酸ナトリウム（１９９－０２５６５、和光純薬工業社製）０．２ｇ、アジ化ナトリウム（１９９－１１０９５、和光純薬工業社製）０．２ｇを蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１５０ｍＬに溶解し、蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で２００ｍＬにメスアップした後、５００ｍＬガラス瓶に移し、測定試料希釈液（５０ｍＭ ＰＢＳ、１．０ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５ｗｔ％ＳＤＳ、０．１ｗｔ％亜硝酸ナトリウム、０．１ｗｔ％アジ化ナトリウム）を調製した。
（７）希釈試料の調製
市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料（ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７－１、検査医学標準物質機構社製、Ｌ１～Ｌ５の５水準）を、それぞれ前記測定試料希釈液にて５００倍に希釈することで、ＨｂＡ１ｃ（％）がＬ１＝５．０１％、Ｌ２＝５．６５％、Ｌ３＝７．３５％、Ｌ４＝９．５１％、Ｌ５＝１１．２６％で、かつＨｂ濃度がＬ１～Ｌ５＝０．２８０ｇ／Ｌの希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１～Ｌ５）を得た。
（８）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：感度の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、混合時間が１０秒間の前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０－１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を２０本使用）で行った。感度の指標として、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ４）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値と、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値との差：ΔＬ４－Ｌ１（ｍＡｂｓ）を算出し、ΔＬ４－Ｌ１≧１８０ｍＡｂｓを３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、１５０ｍＡｂｓ≦ΔＬ４－Ｌ１＜１８０ｍＡｂｓを２点（ｇｏｏｄ）、１００ｍＡｂｓ≦ΔＬ４－Ｌ１＜１５０ｍＡｂｓを１点（ａｖｅｒａｇｅ）、ΔＬ４－Ｌ１＜１００ｍＡｂｓを０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の感度はΔＬ４－Ｌ１＝１７０ｍＡｂｓで２点と、高感度な測定が可能であった。
（９）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：精度の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、混合時間が１０秒間の前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０－１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を２０本使用）で行った。精度の指標として、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ４）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をコントロールラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）で割算した補正値（Ｌ１、Ｌ４）をそれぞれ算出した後、得られた補正値（Ｌ１、Ｌ４）のＮ＝１０におけるＣＶ（Ｌ１、Ｌ４）（％）をそれぞれ算出し、さらにＣＶ（Ｌ１）（％）とＣＶ（Ｌ４）（％）との平均値：ＣＶ（％）を算出し、ＣＶ＜３％を３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、３％≦ＣＶ＜５％を２点（ｇｏｏｄ）、５％≦ＣＶ＜１０％を１点（ａｖｅｒａｇｅ）、ＣＶ≧１０％を０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の精度はＣＶ＝３．３％で２点と、高精度な測定が可能であった。
（１０）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：ＨＰＬＣ法との相関性の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、混合時間が１０秒間の前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１～Ｌ５）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０－１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１～Ｌ５）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を５０本使用）で行った。相関性の指標として、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１～Ｌ５）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をコントロールラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）で割算した補正値（Ｌ１～Ｌ５）をそれぞれ算出した後、得られた補正値（Ｌ１～Ｌ５）と、前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１～Ｌ５）のＨｂＡ１ｃ（％）、Ｌ１＝５．０１％、Ｌ２＝５．６５％、Ｌ３＝７．３５％、Ｌ４＝９．５１％、Ｌ５＝１１．２６％とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ≧０．９５を３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９０≦ｒ＜０９５を２点（ｇｏｏｄ）、０．８５≦ｒ＜０．９０を１点（ａｖｅｒａｇｅ）、ｒ＜０．８５を０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の相関性はｒ＝０．９６で３点と、ＨｂＡ１ｃ（％）との高い相関性を有していた。
（１１）ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の評価：混合時間依存性の評価
前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、混合時間が１０秒間および１５分間の前記希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ４）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０－１０、測定モード：Ｌａｔｅｘ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を混合時間が１０秒間の希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ４）および混合時間が１５分間の希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ４）に対してそれぞれＮ＝１０（合計で前記ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を２０本使用）で行った。混合時間依存性の指標として、前記混合時間が１５分間の希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ４）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値と、前記混合時間が１０秒間の希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ４）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値との差：Δ１５－１０（ｍＡｂｓ）を算出し、Δ１５－１０≦２０ｍＡｂｓを３点（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、２０ｍＡｂｓ＜Δ１５－１０≦１００ｍＡｂｓを２点（ｇｏｏｄ）、１００ｍＡｂｓ＜Δ１５－１０≦２００ｍＡｂｓを１点（ａｖｅｒａｇｅ）、Δ１５－１０＞２００ｍＡｂｓを０点（ｂａｄ）と評価した。実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の混合時間依存性はΔ１５－１０＝－１０ｍＡｂｓで３点と、測定試料と測定試料希釈液とを混合してからＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間：混合時間によるテストラインの反射吸光度の変動はほぼないことを確認した。
（実施例２～２７）
測定試料希釈液の組成を変更する以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。使用した測定試料希釈液の組成および得られた評価結果を表１に示す。なお、表１中のＬＤＳはドデシル硫酸リチウム（１２１－０２７４１、和光純薬工業社製）を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０はポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（１６３－２１６２５、和光純薬工業社製）を、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）１００はポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（１６０－２４７５１、和光純薬工業社製）を、ＮＰ－４０はＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ－４０（２３６４０－６５、ナカライテスク社製）を、ＫＮＯ２は亜硝酸カリウム（１６９－２７３２５、和光純薬工業社製）を、ＰＩＰＥＳはＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（２８１０４－１６、ナカライテスク社製）を、Ｔｒｉｓはトリス緩衝液（ｐＨ７．５）（２０４－０７８８５、和光純薬工業社製）をそれぞれ示す。
（実施例２８～３１）
希釈測定試料の調製工程において、市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料（ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７－１、検査医学標準物質機構社製、Ｌ１～Ｌ５の５水準）を、それぞれ測定試料希釈液にて５００倍に希釈する代わりに、５０倍（実施例２８）、１００倍（実施例２９）、１０００倍（実施例３０）、２０００倍（実施例３１）に希釈する以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。
Figure 0007184054000001
（比較例１～５）
測定試料希釈液の組成を変更する以外は実施例１と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。使用した測定試料希釈液の組成および得られた評価結果を表２に示す。
表２に示されるように、界面活性剤を含まない測定試料希釈液を用いた比較例１では、測定対象物であるＨｂＡ１ｃが変性されず、コンジュゲーションパッドにてＨｂＡ１ｃと抗ＨｂＡ１ｃ抗体で感作した検出粒子とが免疫複合体を形成できないため、テストラインが視認できないほど薄く、測定感度が著しく低い結果となった。なお、比較例１では、テストラインの反射吸光度が検出下限付近であったため、精度、相関性、混合時間依存性の評価を行なわなかった。
また、陰イオン性界面活性剤を含まない、すなわち非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ（登録商標）２０のみが含まれている測定試料希釈液を使用した比較例２も同様に、測定対象物であるＨｂＡ１ｃが変性されず、コンジュゲーションパッドにてＨｂＡ１ｃと抗ＨｂＡ１ｃ抗体で感作した検出粒子とが免疫複合体を形成できないため、テストラインが視認できないほど薄く、測定感度が著しく低い結果となった。なお、比較例２では、テストラインの反射吸光度が検出下限付近であったため、その後の精度、相関性、混合時間依存性の評価を行なわなかった。
また、２種類の非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）１００）を含む測定試料希釈液を使用した比較例３、４では、測定対象物であるＨｂＡ１ｃが変性されるまでに時間がかかるため、測定試料と測定試料希釈液とを混合してからＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間：混合時間によりテストラインの反射吸光度が大きく変動する結果となった。また、前記混合時間依存性の影響により、特に通常のイムノクロマト試験で想定される、混合直後の測定感度、測定精度が著しく低い結果となった。
また、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳのみを含む測定試料希釈液を使用した比較例５では、希釈した測定試料の下流への展開斑（場合によっては、測定時間内に下流へ展開しない）が生じ、測定精度が著しく低い結果となった。
（比較例６）
りん酸緩衝生理食塩粉末（１６２－１９３２１、和光純薬工業社製）１袋、ドデシル硫酸ナトリウム：ＳＤＳ（１９４－１３９８５、和光純薬工業社製）１０ｇを蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１５０ｍＬに溶解し、蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で２００ｍＬにメスアップした後、５００ｍＬガラス瓶に移し、サンプルパッド塗布液（５０ｍＭ ＰＢＳ、５ｗｔ％ＳＤＳ）を調整した。次いで、２０ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記サンプルパッド塗布液を３０μＬ／ｃｍの塗布量で均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ－５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、界面活性剤を担持したサンプルパッドを得た。ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の作製工程において、２０ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の代わりに前記界面活性剤を担持したサンプルパッドを使用する以外は比較例２と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。使用した測定試料希釈液の組成および得られた評価結果を表２に示す。
非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ（登録商標）２０のみを含む測定試料希釈液を使用し、かつ陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳをサンプルパッドに担持したイムノクロマト試験片を使用した比較例６では、テストラインが薄く、測定感度が低い結果となった。これは、希釈測定試料がサンプルパッドを通過する僅かな時間では、ＳＤＳの溶解およびＨｂＡ１ｃの変性が完全には進みきらず、コンジュゲーションパッドにてＨｂＡ１ｃと抗ＨｂＡ１ｃ抗体で感作した検出粒子とが免疫複合体を形成し辛いためと考えられた。つまり、陰イオン性界面活性剤はサンプルパッドではなく、測定試料希釈液に含む必要があることを示している。
（比較例７）
りん酸緩衝生理食塩粉末（１６２－１９３２１、和光純薬工業社製）１袋、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１６６－２１２１３、和光純薬工業社製）２０ｇを蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）１５０ｍＬに溶解し、蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で２００ｍＬにメスアップした後、５００ｍＬガラス瓶に移し、サンプルパッド塗布液（５０ｍＭ ＰＢＳ、１０ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０）を調整した。次いで、２０ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ－ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記サンプルパッド塗布液を３０μＬ／ｃｍの塗布量で均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ－５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、界面活性剤を担持したサンプルパッドを得た。ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片の作製工程において、２０ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の代わりに前記界面活性剤を担持したサンプルパッドを使用する以外は比較例５と同様にしてＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片を作製し評価した。使用した測定試料希釈液の組成および得られた評価結果を表２に示す。
陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳのみが含まれている測定試料希釈液を使用し、かつ非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ（登録商標）２０をサンプルパッドに担持したイムノクロマト試験片を使用した比較例７においても、測定感度が低い結果となった。これは、希釈測定試料がサンプルパッドを通過する僅かな時間で、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）の溶解が完全には進みきらず、展開斑が完全には解消されないためと考えられた。つまり、非イオン性界面活性剤はサンプルパッドではなく、測定試料希釈液に含む必要があることを示している。
Figure 0007184054000002
本発明により、高感度・高精度・ＨＰＬＣ法との高相関性でかつ測定試料と測定試料希釈液とを混合してからイムノクロマト試験片へ滴下するまでの時間の影響を受けずに、測定試料中のＨｂＡ１ｃ量のＨｂ量に対する割合であるＨｂＡ１ｃ（％）を測定できるイムノクロマト試験片を提供することができる。
１：サンプルパッド
２：コンジュゲーションパッド
３：メンブレン
４：吸収パッド
５：バッキングシート
６：テストライン
７：コントロールライン
８：粘着シート

Claims (11)

  1. 測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合であるヘモグロビンＡ１ｃ（％）を定量するためのイムノクロマト用測定試料希釈液であって、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および緩衝剤を含む水溶液であり、
    前記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの混合物であり、
    前記ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの濃度は０．１～２．０ｗｔ％であり、
    前記ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの濃度は０．１～１．０ｗｔ％である、
    測定試料希釈液。
  2. 前記陰イオン性界面活性剤はアルキル硫酸塩である、請求項１に記載の測定試料希釈液 。
  3. 前記陰イオン性界面活性剤を０．０５～２．０ｗｔ％、かつ前記非イオン性界面活性剤を０．０５～３．０ｗｔ％含む、請求項１又は２に記載の測定試料希釈液。
  4. さらに酸化剤を含む、請求項１から３のいずれかに記載の測定試料希釈液。
  5. 前記酸化剤は亜硝酸塩である、請求項４に記載の測定試料希釈液。
  6. さらにアジ化剤を含む、請求項１から５のいずれかに記載の測定試料希釈液。
  7. 前記アジ化剤はアジ化ナトリウムである、請求項６に記載の測定試料希釈液。
  8. 請求項１から７のいずれかに記載の測定試料希釈液、イムノクロマト試験片、およびイ ムノクロマトリーダーからなる、ヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量するための測定キット。
  9. 前記イムノクロマト試験片は、
    （１）サンプルパッドと、
    （２）前記測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを捕捉するための抗体とセルロース粒子との複合体を坦持したコンジュゲーションパッドと、
    （３）測定試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃを特異的に捕捉するための抗体を線状に固定したメンブレンと、
    （４）吸収パッドと、
    から構成される、請求項８に記載の測定キット。
  10. 請求項１から９のいずれかに記載の測定試料希釈液または測定キットを用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（ｉｉｉ）をこの順に経て、測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を定量する方法。
    工程（ｉ）：測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：４９～１：９９９で混合し希釈する工程
    工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、イムノクロマト試験片のサンプルパッドに滴下する工程
    工程（ｉｉｉ）：イムノクロマト試験片のテストラインの反射吸光度とコントロールラインの反射吸光度とからヘモグロビンＡ１ｃ量のヘモグロビン量に対する割合を比色定量する工程
  11. 測定試料と測定試料希釈液とを体積比１：９９～１：４９９で混合し希釈する、請求項１０に記載の方法。
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