JP5140307B2 - 組換え微生物 - Google Patents

Description

本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、このような取り組みにも拘わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではない。

最近、ある種の微生物について、胞子形成初期に関わる遺伝子を欠失又は不活性化した菌株が構築され、タンパク質やポリペプチドの生産性向上効果が得られている。例えば、枯草菌のsigE遺伝子 、sigF遺伝子、spoIIE遺伝子、spoIISB遺伝子、sigG遺伝子、又は、spoIVCB遺伝子からspoIIIC遺伝子までの領域に含まれる遺伝子群を欠失した宿主菌株を用いることによって、セルラーゼなどの分泌生産性が向上することが報告されている（特許文献１）。
また、枯草菌におけるタンパク質輸送システム（Sec経路）は、分泌タンパク質を細胞外へ押し出すモーターの役割を担うSecA、また分泌タンパク質が通過する輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの３つのタンパク質のほか、輸送チャネルの補助因子であるSecDF等によって、その機能が担われているが、このうち、SecGタンパク質をコードするsecG遺伝子を過剰発現し得る発現ベクター（特許文献２）や、secG遺伝子のリボソーム結合部位を改変することによりsecG遺伝子の発現を変化させたグラム陽性菌（特許文献３）に関する報告がなされており、secG遺伝子を破壊した枯草菌の生育が、異種タンパク質生産時に阻害されること等が示されている。また大腸菌において、secY遺伝子の変異が低温での生育やタンパク質の分泌を阻害することが報告されている（非特許文献３）。

しかしながら、secY遺伝子を過剰発現しており、且つ胞子形成関連遺伝子の欠失又は不活性化を施した微生物はこれまで知られていない。
特開２００３−４７４９０号公報 特表２００１−５１００４６号公報 米国特許出願公開第２００３／０１５７６４２号明細書 Nature,390,249,1997 Science,277,1453,1997 Cell, 32, :789 (1983)

本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を利用して、目的のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法を提供することに関する。

本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、枯草菌secY遺伝子を強化して枯草菌SecYを過剰に発現させると共に、胞子形成関連遺伝子を制御した微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が改変前と比較して向上することを見出した。

すなわち、本発明は、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築され、且つ胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子をゲノムから欠失又は不活化した微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え微生物に係るものである。

また本発明は、当該組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法に係るものである。

本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。

本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。

本発明において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。

本発明の微生物を構築するための親微生物としては、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。

本発明の枯草菌のsecY遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌のsecY遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌のsecY遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各secY遺伝子、及びSecYタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。尚、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）の様に当該遺伝子が２種類同定されているものもある。また枯草菌のsecY遺伝子に相当する遺伝子としては以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられる。

（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。

（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor LaboratoryPress］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン***DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。

（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。

なお、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、secY遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能を有し、分泌タンパク質が通過する輸送チャネルの主要部分を構成することのできるタンパク質をいう。

本発明において枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の過剰発現とは、宿主における通常の発現量を超える枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の発現が認められることを指す。枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現させる手段としては、例えば微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子の上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入することが挙げられる。

ここで、微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主となる微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位であれば特に限定されないが、例えば、枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましく、特に枯草菌spoVG遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましい。

枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としては、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）により、遺伝子番号BG101126として開示された遺伝子spoVG遺伝子の転写を制御する領域が挙げられる。より具体的には、配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAが挙げられる。また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、配列番号９の塩基番号38〜230で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAが挙げられる。

配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列や塩基番号38〜230で示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、（Ａ）配列番号９の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる塩基配列、（Ｂ）配列番号９の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列等が挙げられる。
尚、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、上記したものと同様の条件が挙げられる。

また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するとは、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流に導入した際に、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現され、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上し、しかも、その向上の程度が、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流に導入した時と同等に向上するものをいう。

当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流への導入には、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。

当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、斯かる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片の上流にsecY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にsecY遺伝子を含むオペロンの先頭の遺伝子であるrpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、rpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。

次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのsecY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域、及びrpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のsecY遺伝子を含むオペロンの上流へ導入された当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55,135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。

また、当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域と当該転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。或いは、かかる転写開始制御領域の上流に、secY遺伝子の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流にsecY遺伝子の一部又は全部を含むDNA断片を結合させたDNA断片を調製して用いることにより、当該転写開始制御領域がsecY遺伝子の直上流に導入された状態で安定に保持されることとなる。

本発明において、微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、secY遺伝子を含むオペロンの先頭の遺伝子であるrpsJ遺伝子の開始コドンの上流側、或いはsecY遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。

本発明における当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の導入は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得た当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing byoverlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結して得た遺伝子断片を用いて行うことができる。かかる断片は、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。

導入するsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列は、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列である限り、その微生物が本来有するsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列と一致しないものであってもよい。また導入する枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位等、微生物において機能する転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列は、当該塩基配列である限り、その微生物が本来有する塩基配列と一致しないものであってもよい。核酸断片の宿主への導入方法としては、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
またかかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができる。尚、後記実施例に示す様に、かかる断片は1菌体当たり１コピーの導入で目的タンパク質又はポリペプチドの生産に対し充分な効果を発揮することから、プラスミドによって導入した場合、生産培養中に一部のプラスミドが脱落しても、その影響を受け難い。

なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。
ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。

本発明においては、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性の向上に影響を与えない範囲で、上記枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現することに加え、枯草菌のSec経路に関する他の遺伝子、例えばsecE遺伝子等の過剰発現を行ってもよいし、Sec経路以外の機能に関与する遺伝子の過剰発現、或いは１又は２以上の遺伝子の不活性化や欠失を併せて行っても良い。尚、遺伝子の不活性化や欠失には当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。

以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いたspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による宿主のゲノム上への導入方法について説明するが、本発明に於ける導入方法は下記に限定されるものではない。
本方法で用いる導入用DNA断片は、宿主のゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（２））の間に、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、secY遺伝子断片（以下、断片（４））、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を順に挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に断片（５）の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加された断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加された断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じるので、PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。

ここで行うPCR反応は、表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。
尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子の他には、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。

本発明の組換え微生物においては、上記のsecY遺伝子強化によるSecYの過剰発現に加えて、胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子の1以上をゲノムから欠失又は不活化がなされる。当該遺伝子の欠失又は不活性化は、実施例２及び３に示すように、胞子形成を抑制する改変である。
本発明において、胞子形成関連遺伝子とは、胞子形成期特異的シグマ因子をコードする遺伝子群や当該シグマ因子遺伝子群の発現、及びシグマ因子の活性化に関わる遺伝子群等、胞子の形成を促進し、それらの各遺伝子を欠失又は不活性化することにより実質的に胞子形成過程が阻害される遺伝子群が挙げられる。また、当該シグマ因子によって転写され、胞子形成の促進に関与する遺伝子群も包含される
バチルス属細菌のうち、枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるSigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子SigBやECFシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）。

これらの中で、胞子形成過程を制御するシグマ因子は、図２に示す様に胞子形成過程の進行に伴って順次発現・活性化されることが知られている。即ち、枯草菌が栄養飢餓状態に陥ると、まずリン酸リレー系と呼ばれる複数のタンパク質間での多段階リン酸伝達系を経て胞子形成開始制御因子であるSpo0Aのリン酸化が引き起こされる（Cell, 64, 545, (1991)）。より詳細には、栄養飢餓により細胞質に存在するKinA、細胞膜に存在するKinB及びKinCの自己リン酸化が起こり、そのリン酸基がSpo0F、Spo0Bを経てSpo0Aに転移することによりリン酸化Spo0A（Spo0A〜P）が産生する。尚、KapBはKinBを介した胞子形成過程の活性化に必要であり（Mol. Microbiol., 26, 1097, (1997)）、KipAはKinAの自己リン酸化阻害因子であるKipIに結合してその胞子形成抑制作用を回避する（Genes Dev., 11, 2569, 1997）。またPhrAはリン酸化Spo0Fの脱リン酸化酵素であるRapAの機能を阻害する（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,8612,(1997)）。KinA、KinB、KinC、Spo0F、Spo0B、Spo0A、KapB、KipI、KipA、RapA及びPhrAは、それぞれkinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipI、kipA、rapA及びphrAの各遺伝子によりコードされる。

Spo0A〜Pの濃度上昇に伴い、SigHの構造遺伝子（sigH）の発現を抑制しているリプレッサーAbrBの誘導が抑制され、結果的にsigHの転写がSigA依存的に誘導される（J. Bacteriol., 173, 521, (1991)）。尚、Spo0A〜Pの転写調節機能は染色体分配に関与するSojによる阻害を受けるが、同じく染色体分配に関与するSpo0JはSojのその様な作用を抑制している（J. Bacteriol., 182, 3446, 2000）。SojとSpo0Jはそれぞれsoj遺伝子とspo0J遺伝子にコードされる。SigHが活性化された後、非対象隔膜形成により枯草菌の細胞質は母細胞側と娘細胞側に分割され、次いで娘細胞側でSpo0A〜PとSigHが共役してSigFの構造遺伝子（sigF）を含むオペロン（spoIIAA−spoIIAB−sigF）の転写を誘導し（Gene, 101, 113, (1991)）、母細胞側ではSpo0A〜PとSigAが共役してSigE前駆体の構造遺伝子（sigE）を含むオペロン（spoIIGA−sigE）の転写を誘導する（J. Bacteriol., 169, 3329, (1987)）。SigFはアンチ−シグマ因子SpoIIABによる機能抑制を受け、アンチ−アンチ−シグマ因子SpoIIAAはSpoIIABの作用を抑制する二段階制御が存在する。即ちSpoIIAAの機能欠損はSigFの機能欠損と同様、胞子形成の阻害を示すが、SpoIIABの機能欠損についても胞子形成が阻害されることが知られている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,9221,(1990)、J. Bacteriol., 173, 6678, (1991)）。更にSpoIIAAの脱リン酸化酵素であるSpoIIEにより活性化を制御されており（Genes Cells, 1, 881 (1996)）、活性化したSigFはシグナル伝達タンパクであるSpoIIRの構造遺伝子の転写を誘導する。娘細胞側から分泌されたSpoIIRは母細胞側の非対象隔膜に局在するSigE前駆体活性化プロテアーゼであるSpoIIGAを活性化し、これによってSigEの活性化が起こると考えられている（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92,2012, (1995)）。SpoIIAA、SpoIIAB、SpoIIE、SpoIIR及びSpoIIGAは、それぞれspoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR及びspoIIGAの各遺伝子によりコードされる。更に娘細胞側ではSigFがSigGの構造遺伝子（sigG）の転写を誘導し、母細胞側ではSigEがSigKの構造遺伝子（spoIIIC遺伝子及びspoIVCB遺伝子）の転写を誘導するが、娘細胞側でのSigGの活性化は母細胞側でのSigEの活性化の後に起こり、母細胞側でSigKの活性化はこの後に起こる（Mol. Microbiol., 31, 1285, (1999)）。

上記遺伝子のうち、欠失又は不活性化によって胞子形成過程が阻害される遺伝子は、図２からも明らかな様にkinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC及びspoIVCB）の各遺伝子である。本発明において欠失又は不活性化する胞子形成関連遺伝子は、枯草菌におけるこれらの遺伝子から選ばれるものが好ましく、枯草菌のsigF遺伝子、sigE遺伝子及びphrA遺伝子から選ばれるものがより好ましい。
sigF遺伝子は、胞子形成期において、枯草菌細胞内の非対称隔膜が形成されたII期以降に娘細胞側で起こる遺伝子発現を司るシグマ因子をコードする遺伝子であり、sigE遺伝子は、胞子形成期において、枯草菌細胞内の非対称隔膜が形成されたII期以降に母細胞側で起こる遺伝子発現を司るシグマ因子をコードする遺伝子である。
また、phrA遺伝子は、外部の生育環境の変化を感知して様々な応答を行う際に要する細胞間情報伝達機構に関与する遺伝子の一つであり、その遺伝子産物はひとまず細胞外へ分泌される。そして細胞外でプロセッシングを受けた後、ペンタペプチドとして細胞内に取り込まれ、胞子形成開始シグナルを伝達するフォスフォリレー系のSpo0Fのリン酸化を制御するRapAタンパク質に結合して、胞子形成開始のシグナル伝達に関与することが報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,8612,(1997)）。
上記各遺伝子の遺伝子番号及び機能を表６にまとめて示した。

kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC及びspoIVCB等の胞子形成関連遺伝子に相当する遺伝子とは、当該各遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、これらの各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子が挙げられる。尚、ここで、塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。

斯かる遺伝子の欠失又は不活性化は、上記各遺伝子単独の欠失又は不活性化でもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。また当該遺伝子以外の遺伝子の強化や欠失又は不活性化を併せて行っても良い。尚、遺伝子の欠失や不活性化には、当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。

上記遺伝子群若しくは遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、当該遺伝子（標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。

標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図３のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。

特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。

また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。

以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。

本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図４）。

次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片との間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図４）。

薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。

かくして得られた欠失用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、目的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。即ち、表１に示したプライマーセットを用いて調製した欠失用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換していることを確認すれば良い。

本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。ここで、「目的タンパク質又はポリペプチド」は、製造又は精製が目的の一つであるタンパク質又はポリペプチドをいう。また、「目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する微生物」において、遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物は本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。

目的タンパク質又は目的ポリペプチドは特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
プロテアーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来、より好ましくはBacillus clausii KSM-K16株（FERM BP-3376）由来のプロテアーゼが挙げられる。Bacillus clausii KSM-K16株株由来のアルカリプロテアーゼのより具体的な例としては、配列番号４のアミノ酸番号1〜380のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
また、セルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号６のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号８のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
また、α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来、より好ましくはBacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼが挙げられる。

本発明の微生物に導入されるべき目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチド遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、又は配列番号７で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。

このような目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子の導入は、例えば、（１）ベクターによる導入、（２）ゲノムへの挿入により行うことができる。（１）ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域」が適正な形で結合されている目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的とする遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、YAC,BACなどの人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、pUB110、pHY300PLKが挙げられる。

また、（２）ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したDNA断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。

本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性は、上記遺伝子の改変をしていない微生物を用いた場合と比較して、その向上が達成されている。

以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼ及びアミラーゼの生産方法について具体的に説明する。

以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
さらに、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。

枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/mL トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/mL トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。

目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）、プロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）のいずれかによって行った。
組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、LB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）、2xYT培地（1.6％トリプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl）、2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物）、或いはCSL発酵培地（2%酵母エキス、0.5%コーンスティープリカー（CSL）、0.05%塩化マグネシウム七水和物、0.6%尿素、0.2%L-トリプトファン、10%グルコース、0.15%リン酸二水素ナトリウム、0.35%リン酸水素二ナトリウム、pH7.2）を用いた。

実施例１ secY遺伝子過剰発現株の構築
以下の様に、secY遺伝子を過剰発現する変異株の構築を行った（図３参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-R、及びsecY/PVG-FとsecY/Cm-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びsecY遺伝子を含む1.3kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型として、表１に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子を含む0.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。
次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とcatr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がsecY遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にsecY遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にCm耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Cm2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5'側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。
次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.2kbのDNA断片（Ｇ）を得た。
得られた4.2kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とsecY/Cm-R、及びsecY/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.5kb及び3.1kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をsecY-K株と命名した。

実施例２ ゲノム中sigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
図４に基づいて、ゲノム中sigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したsigF-FW及びsigF/Sp-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、sigF/Sp-F及びsigF-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
さらに、プラスミドpDG1727（Gene, 167, 335, (1995））DNAを鋳型とし、表１に示したspf及びsprのプライマーセットを用いて、1.2kbのスペクチノマイシン（Sp）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
次に、図４に示すように、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びSp耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したsigF-FW2及びsigF-RV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、Sp耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.8kbのDNA断片（D）を得た。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片（D）を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、スペクチノマイシン（100μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってsigF遺伝子がSp耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、sigF遺伝子欠失株（ΔsigF株）を構築した。また上記形質転換における168株に替えて実施例１にて構築したsecY-K株を用いることによりsecY-K株ゲノム中のsigF遺伝子をSp耐性遺伝子にて置換した菌株（secYKΔsigF株）を構築した。

実施例３ ゲノム中sigE遺伝子及びphrA遺伝子群の薬剤耐性遺伝子による置換
実施例２に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のsigE遺伝子及びphrA遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換を行い、sigE遺伝子欠失株（ΔsigE株）及びphrA遺伝子欠失株（ΔphrA株）を構築した。各菌株の構築には表１に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表２に示した。

また実施例１にて構築したsecY-K株のゲノム上のsigE遺伝子、或いはphrA遺伝子を同様にスペクチノマイシン耐性遺伝子にて置換することにより、secYKΔsigE株及びsecYKΔphrA株を構築した。

実施例４ アルカリプロテアーゼ分泌生産評価
実施例１〜３にて得られたsecY-K株、secYKΔsigF株、secYKΔsigE株、及びsecYKΔphrA株の異種タンパク質生産性評価として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼの生産性を指標として以下の様に行った。対照として枯草菌168株、ΔsigF株、ΔsigE株、及びΔphrA株についても評価を行った。即ち、バチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995)）をコードする1.3kbのDNA断片（Ｗ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｘ）を増幅した。
次いで、得られた（Ｗ）（Ｘ）の2断片を混合して鋳型とし、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した1.8 kbのDNA断片（Ｙ）を得た。得られた1.8 kbのDNA断片（Ｙ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP(S237p)を構築した。
構築したプラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの２×Ｌ−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。培養上清中のプロテアーゼの活性測定は以下のとおり行った。すなわち、2mM CaCl₂溶液で適宜希釈した培養上清50μLに、7.5mMのSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA ペプチド研究所)を基質として含む75mM ほう酸-KCl緩衝液（pH10.5）を100μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度変化(OD420nm)により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロアニリンを遊離させる酵素量を1Uとした。

アルカリプロテアーゼ活性測定の結果、表３に示した様に、宿主としてsecY-K株を用いた場合、そのアルカリプロテアーゼ生産性は対照の168株（野生型）と同等であり、特に生産性向上は認められなかった。一方、胞子形成に関与する遺伝子の欠失を組み合わせたsecYKΔsigF株、secYKΔsigE株、及びsecYKΔphrA株においては顕著な生産性向上が認められた。secY遺伝子発現強化を導入していないΔsigF株、ΔsigE株、及びΔphrA株においても168株以上の生産性向上が見られたが、これらの遺伝子欠失による生産性向上効果の発揮はsecY遺伝子発現強化との組み合わせにおいて明らかに増大していた。即ち、分泌装置であるSecYタンパク質量を増加した上でsigF、sigE、phrA等の胞子形成に関与する遺伝子の欠失を施すことにより、異種タンパク質生産性向上に相乗的な効果が現れたものと考えられた。

実施例５ アルカリセルラーゼ分泌生産評価
他の異種タンパク質生産性評価として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）断片（3.1 kb）を表１に示した237UB1と237DB1のプライマーセットを用いて増幅した後BamHI制限酵素処理し、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を実施例４と同様の条件にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。

アルカリセルラーゼ活性測定の結果、表４に示した様に、宿主としてsecY-K株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。また胞子形成に関与する遺伝子の欠失を組み合わせたsecYKΔsigF株、secYKΔsigE株、及びsecYKΔphrA株においては更に顕著な生産性向上が認められた。secY遺伝子発現強化を導入していないΔsigF株、ΔsigE株、及びΔphrA株においても168株以上の生産性向上が見られたが、これらの遺伝子欠失による生産性向上効果の発揮はsecY遺伝子発現強化との組み合わせにおいてより増大していた。即ち、アルカリプロテアーゼに加えてアルカリセルラーゼについても、分泌装置であるSecYタンパク質量を増加した上でsigF、sigE、phrA等の胞子形成に関与する遺伝子の欠失を施すことにより、生産性向上に相乗的な効果が現れたものと考えられた。

比較例１ rsiX遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
枯草菌168株ゲノム上のrsiX遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子への置換を、実施例２に示したsigF遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換と同様にして行い、ΔrsiX株を構築した。使用したプライマーを表１に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表２に示した。また実施例２にて構築したΔsigF株のゲノム上のrsiX遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、ΔsigFΔrsiX株を構築した。尚、rsiX遺伝子は枯草菌のECF（extracytoplasmic function）ファミリーに属するシグマ因子の一つであるSigXの機能を抑制するアンチシグマ因子（anti-SigX）をコードする遺伝子である。SigXは、熱ストレス等、細胞周囲の環境が変化すると活性化され、その認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導することによって環境変化に対応する機能を有する（J. Bacteriol., 179, 2915, (1997)）。

比較例２ アルカリプロテアーゼ分泌生産評価
比較例１にて構築したΔsigFΔrsiX株のアルカリプロテアーゼ分泌生産性評価を、実施例４と同様に行った。対照として枯草菌168株、ΔrsiX株及び実施例１にて構築したΔsigF株についても評価を行った。
その結果、表５に示した様に、rsiX遺伝子を欠失したΔrsiX株のプロテアーゼ生産性が野生株168株より高いにも関わらず、sigF遺伝子欠失と組み合わせたΔsigFΔrsiX株の生産性はΔsigF株よりむしろ低下していた。即ち、胞子形成に関連する遺伝子の欠失を組み合わせた際の異種タンパク質生産に対する相乗的な効果の発揮は、rsiX遺伝子欠失に対しては認められないことが確認された。

比較例３ yacP遺伝子、yvdE遺伝子、yurK遺伝子、yhdQ遺伝子、glcT遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
枯草菌168株ゲノム上のyacP遺伝子、yvdE遺伝子、yurK遺伝子、yhdQ遺伝子、glcT遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子への置換を、実施例２に示したsigF遺伝子のスペクチノマイシン耐性遺伝子による置換と同様にして行い、ΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、ΔyhdQ株、及びΔglcT株を構築した。使用したプライマーを表１に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表２に示した。また実施例２にて構築したΔsigF株のゲノム上のyacP遺伝子、yvdE遺伝子、yurK遺伝子、yhdQ遺伝子、glcT遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、ΔsigFΔyacP株、ΔsigFΔyvdE株、ΔsigFΔyurK株、ΔsigFΔyhdQ株、及びΔsigFΔglcT株を構築した。
本発明に関連のある遺伝子について、遺伝子番号及び機能を表６に示した。

比較例４ アルカリセルラーゼ分泌生産評価
比較例３にて構築したΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、ΔyhdQ株、及びΔglcT株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例５と同様に行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。その結果、表７に示した様に、ΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、及びΔglcT株にて野生株以上の生産性が認められ、ΔyhdQ株については若干低下した。
つづいて比較例３にて構築したΔsigFΔyacP株、ΔsigFΔyvdE株、ΔsigFΔyurK株、ΔsigFΔyhdQ株、及びΔsigFΔglcT株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例５と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したΔsigF株についても評価を行った。その結果、表８に示した様に、構築したいずれの株についてもそのセルラーゼ生産性はΔsigF株を下回っていた。即ち、胞子形成に関連する遺伝子の欠失を組み合わせた際の異種タンパク質生産に対する相乗的な効果の発揮は、secY遺伝子発現強化との組み合わせにおける特徴であることが強く示唆された。

SOE-PCR法により調製した結合核酸断片を用いた遺伝子導入を模式的に示した図である。 枯草菌の胞子形成シグナル伝達を示した図である。 SOE−PCRによるprsA発現強化株作成用DNA断片の調製方法を模式的に示した図である。 SOE-PCR断片を用いた２重交差法による標的遺伝子の欠失を模式的に示した図である。

Claims (11)

1. 枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築され、且つ胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子をゲノムから欠失又は不活化した微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え微生物であり、前記胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子がkinA遺伝子、kinB遺伝子、kinC遺伝子、spo0F遺伝子、spo0B遺伝子、spo0A遺伝子、kapB遺伝子、kipA遺伝子、phrA遺伝子、spo0J遺伝子、sigH遺伝子、sigF遺伝子、sigE遺伝子、spoIIAA遺伝子、spoIIAB遺伝子、spoIIE遺伝子、spoIIR遺伝子、spoIIGA遺伝子、sigG遺伝子、spoIIIC遺伝子、spoIVCB遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子である組換え微生物。
2. 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子の上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入し、且つ胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化してなる微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物であり、前記胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子がkinA遺伝子、kinB遺伝子、kinC遺伝子、spo0F遺伝子、spo0B遺伝子、spo0A遺伝子、kapB遺伝子、kipA遺伝子、phrA遺伝子、spo0J遺伝子、sigH遺伝子、sigF遺伝子、sigE遺伝子、spoIIAA遺伝子、spoIIAB遺伝子、spoIIE遺伝子、spoIIR遺伝子、spoIIGA遺伝子、sigG遺伝子、spoIIIC遺伝子、spoIVCB遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子である組換え微生物。
3. 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、枯草菌のspoVG遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子由来のものである請求項２記載の組換え微生物。
4. 胞子形成関連遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子が、sigF遺伝子、sigE遺伝子、phrA遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子である請求項１〜３の何れか１項記載の組換え微生物。
5. 微生物がバチルス属（Bacillus）細菌である請求項１〜４のいずれか１項記載の組換え微生物。
6. バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項５記載の組換え微生物。
7. 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻
   訳開始制御領域又は分泌シグナル領域のいずれか１以上の領域を結合した請求項１〜６のいずれか１項記載の組換え微生物。
8. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項７記載の組換え微生物。
9. 分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである請求項７又は８記載の組換え微生物。
10. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号５で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと９０%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片である請求項７〜９のいずれか１項記載の組換え微生物。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項記載の組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

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