JP2005137308A - 組換え微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 枯草菌の遺伝子spo0A、spoIIIC、spoIIID、spoVT、spo0J、spo0F、spo0B及びspoIIIEのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか1以上の遺伝子が削除又は不活性化された微生物変異株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【選択図】 なし
Description
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2に示したspo0J-AFとspo0J-A/CmR、及びspo0J-B/CmFとspo0J-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のspo0J遺伝子の上流に隣接する0.6kb断片(A)、及び下流に隣接する0.6kb断片(B)をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194(J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982))のクロラムフェニコール耐性遺伝子をプラスミドpUC18のXbaI−BamHI切断点に挿入した組換えプラスミドpCBB31を鋳型として、表2に示したCmFとCmRプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む1kb断片(C)を調製した。次に、得られた(A)(B)(C)3断片を混合して鋳型とし、表2のプライマーspo0J-AFとspo0J-BRを用いたSOE−PCRを行うことによって、3断片を(A)(C)(B)の順になる様に結合させ、2.2kbのDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってspo0J遺伝子が削除され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。
一方、実施例1と同様にして表2に示したプライマーセット(遺伝子名-AF、遺伝子名-A/CmR、遺伝子名-B/CmF、遺伝子名-BR、CmF、CmR)を用いて調製した削除用DNA断片を用いて、ゲノム上のspo0A遺伝子(BG10765)、spoIIIC遺伝子(BG10919)、spoIIID遺伝子(BG10408)、或いはspoVT遺伝子(BG10119)が削除され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した胞子形成遺伝子削除株をそれぞれ分離した。また、同様に表2に示したプライマーセット(遺伝子名-AF、遺伝子名-A/Cm3R、遺伝子名-B/Cm3F、遺伝子名-BR、Cm3F、Cm3R)を用い、spo0F遺伝子(BG10411)、spo0B遺伝子(BG10336)及びspoIIIE遺伝子(BG10763)がそれぞれ削除され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した胞子形成遺伝子削除株を分離した。
実施例1、2にて得られた各遺伝子削除株、及び対照として枯草菌168株に、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)断片(3.1kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03mLを30mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表3に示した様に、胞子形成遺伝子削除株を用いた場合はいずれも、対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
実施例1−3にて得られた遺伝子削除株、及び対照として枯草菌168株に、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−K38株由来のアルカリアミラーゼ遺伝子(特開2000−184882号公報、Eur. J. Biochem., 268, 2974 (2001))の成熟酵素領域(Asp1−Gln480)をコードするDNA断片(1.5kb)の上流に配列番号3に示されるアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域とシグナル配列領域の一部を含む上流側0.6kb断片を結合して成る2.1kb断片(配列番号5)をシャトルベクターpHY300PLKのBglII−XbaI制限酵素切断部位に挿入された組換えプラスミドpHSP−K38を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.6mLを30mLの2×L−マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表4に示した様に、各遺伝子削除株を宿主として用いた場合、対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。
Claims (6)
- 枯草菌の遺伝子spo0A、spoIIIC、spoIIID、spoVT、spo0J、spo0F、spo0B及びspoIIIEのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか1以上の遺伝子が削除又は不活性化された微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
- 微生物が枯草菌又はその他のバチルス属細菌である請求項1記載の組換え微生物。
- 異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は分泌用シグナル領域を結合した請求項1又は2記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域に由来するものである請求項3記載の組換え微生物。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である請求項3記載の組換え微生物。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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