CN101652468B - 重组微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白质或多肽生产率提高的重组微生物，以及使用该重组微生物产生蛋白质或多肽的方法。该重组微生物通过将编码所需的蛋白质或多肽的基因转染到微生物株中而获得，上述微生物株通过如下方法获得：遗传构建以过度表达枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因，并使选自芽孢形成相关基因和基因组中与芽孢形成相关基因对应的基因的一种或多种基因缺失或灭活。

Description

重组微生物
发明领域
本发明涉及用于产生有用的蛋白质或多肽的重组微生物，以及产生蛋白质或多肽的方法。
背景技术
使用微生物在工业上生产有用的物质被用于大范围的物质，其类型包括食品，例如酒精饮料、大豆酱和酱油，以及氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生素物质、碳水化合物、脂质、蛋白质等。这些物质的应用还扩展至更宽的领域，包括食品、药品、洗涤剂、日用品例如化妆品，以及多种化学原料。
关于这种通过微生物在工业上生产有用物质，一个重要的挑战是提高生产率，并且作为其措施，已经进行了通过遗传技术例如突变来培育生产性微生物。近年来，具体地，微生物遗传学和生物技术的进展已经使人们可以使用遗传重组技术和类似技术来更有效地培育生产性微生物。另外，近年来基因组分析技术的迅速进展使得能够尝试解读目标微生物的基因组数据，并且更积极地在工业上利用获得的信息。其基因组数据已公开的工业上有用的宿主微生物的实例包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)Marburg 168(非专利文献1)、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)K-12 MG1655(非专利文献2)、粒状棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC132032等等，并且已经使用这些基因组数据开发了进一步改良的微生物菌株。然而，尽管进行了这些努力，生产效率未必能令人满意。
对于某些类型的微生物，近年来已经构建了其中与芽孢形成早期相关的基因已被缺失或灭活的菌株，从而正在获得提高蛋白质或多肽的生产率的效果。例如，已有报道称，通过使用其中枯草杆菌的sigE基因、sigF基因、spoIIE基因、spoIISB基因或sigG基因、或者从spoIVCB基因延伸至spoIIIC基因的区中包括的一组基因已缺失的宿主株，增加纤维素酶和类似物的分泌的生产率(专利文献1)。
此外，在枯草杆菌中操纵蛋白质易位***的功能(Sec路线)由SecA分担，其作用是作为将分泌的蛋白质排出至细胞外部的发动机，并且三种蛋白质，SecY、SecE和SecG构成易位(translocation)0通道(分泌的蛋白质经过此通道)的主要部分，以及SecDF是易位通道的辅因子，等等。尤其是，已报道有能够过度表达编码SecG蛋白质的secG基因的表达载体(专利文献2)，或者其中已通过改变SecG基因的核糖体结合位点来改变secG基因的表达的***(专利文献3)。由此，显示出在产生外源蛋白质期间SecG基因被破坏的枯草杆菌种属的繁殖受到抑制。也有报道称，在大肠埃希杆菌中，secY基因的变异抑制低温下的繁殖或蛋白质的分泌(非专利文献3)。
然而，目前为止，过度表达secY基因、并且芽孢形成相关基因缺失或灭活的微生物还是未知的。
[专利文献1]JP-A-2003-47490
[专利文献2]JW-A-2001-510046
[专利文献3]US-A-2003/0157642
[非专利文献1]Nature，390，249，1997
[非专利文献2]Science，277，1453，1997
[非专利文献3]Cell，32，789，1983。
发明内容
本发明具有以下几个方面。
(1)一种重组微生物，其通过将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中而获得，所述微生物株通过如下方法获得：以遗传方式构建成过度表达枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因，并使选自芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因中的一种或多种基因从基因组中缺失或灭活。
(2)一种产生如权利要求1所述的重组微生物的方法，其包括：在微生物中，
将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点，导入至枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的基因组的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因或对应基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者导入一基因片段，其中，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的上游；
使选自芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因的一种或多种基因缺失或灭活；和
将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中。
(3)一种使用重组微生物产生所需的蛋白质或多肽的方法。
附图说明
图1是显示使用通过SOE-PCR法制备的结合核酸片段的基因转染的示意图。
图2是说明在枯草杆菌中芽孢形成信号转导的图。
图3是显示通过SOE-PCR制备用于产生secY表达增强的菌株的DNA片段的方法的示意图。
图4是显示使用SOE-PCR片段通过双交换(double crossover)法使目标基因缺失的示意图。
具体实施方式
最佳实施方式
本发明涉及蛋白质或多肽生产率提高的微生物，以及使用该微生物产生所需的蛋白质或多肽的方法。
本发明的发明人已经在微生物基因组上编码的多种基因当中搜索了影响有用的蛋白质或多肽的产生的基因，并发现，当对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因被转染到其中枯草杆菌secY基因已被增强以过度表达枯草杆菌的SecY、以及芽孢形成相关基因被调控的微生物株中时，与改变之前的生产率相比，所需蛋白质或多肽的生产率提高。
本发明的重组微生物对所需的蛋白质或所需的多肽具有很高的生产率。因此，当使用该重组微生物进行所需蛋白质或所需多肽的生产时，可以减少生产物质所需的时间或成本。
本发明中的氨基酸序列和碱基序列的同一性通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435(1985))计算。具体地，同一性通过使用遗传数据处理软件Genetyx-Win(Software Development Co.，Ltd.)的同源性分析程序(同源性搜索)执行分析来计算，比较的单位大小(ktup)设定为2。
在本说明书中，转录起始控制区是包括启动子和转录起始点的区，核糖体结合位点是与Shine-Dalgarno(SD)序列对应的位点，上述Shine-Dalgarno(SD)序列与起始密码子一起形成翻译起始控制区(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71，1342(1974))。
根据本发明，术语基因的上游和下游不是指关于复制起始点的位置，而是上游表示接着目的基因或区的5′-端的区，而下游表示接着目的基因或区的3′-端的区。
用于构建本发明的微生物的亲代微生物可以是具有枯草杆菌secY基因或与其对应的基因的任意微生物，并且这些微生物可以是野生型微生物以及突变的微生物。具体地，可以是芽孢杆菌属的细菌、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属的细菌、酵母或类似微生物，并且其中优选芽孢杆菌属细菌。而且，从下列角度来看更优选枯草杆菌：微生物的全部基因组信息已被披露，由此构建了遗传工程和基因组工程的相关技术，并且该微生物具有分泌和产生蛋白质至细菌细胞外部的能力。
本说明书所述的枯草杆菌的各种基因和基因区的名称均基于在Nature，390，249-256(1997)中报道、并且在日本站点：Japan FunctionalAnalysis Network for Bacillus subtilis(BSORFDB)(2004年3月10日更新的http://bacillus.genome.ad.JP/)上在互联网中公布的枯草杆菌基因组数据进行描述。
本发明的枯草杆菌secY基因是指具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列的基因。与枯草杆菌secY基因对应的基因是指功能与枯草杆菌secY基因基本相同的基因，例如，可以是主要通过基因组分析鉴定的各secY基因，以及在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、Oceanobacillus iheyensis等中编码SecY蛋白质的基因。此外，有许多情况下，在微生物诸如炭疽芽孢杆菌中鉴定出两种类型的相应基因。作为与枯草杆菌secY基因对应的基因，可以是下列(1)至(4)的基因的任意者。
(1)包括如下DNA的基因：与SEQ ID NO：1所示的碱基序列的同一性为至少90％、优选至少95％、且更优选至少99％，并且编码与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。
(2)包括如下DNA的基因：在严格条件下与包括与SEQ ID NO：1所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码与具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。
另外，对于本文所用的“严格条件”，可以是，例如，分子克隆-实验手册第三版(Molecular Cloning-A LABORATORY MANUALTHIRD EDITION)[Joseph Sambrook，David W.Russell，Cold SpringHarbor Laboratory Press]中所述的方法，例如，可以是如下杂交条件：在含6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)、0.5％SDS、5×Denhardts和1.00mg/mL鲱精(herring sperm)DNA的溶液中，与探针一起在65℃下保持恒温8-16小时。
(3)包括如下DNA的基因：编码与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的同一性为至少90％、优选至少95％、且更优选至少99％的氨基酸序列，并且编码与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。
(4)包括如下DNA的基因：编码在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或两个或更多个氨基酸的氨基酸序列，并且编码与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。
另外，如本文用，在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或两个或更多个氨基酸的氨基酸序列包括缺失、置换或添加一个或数个、优选1-10个氨基酸的氨基酸序列，并且所述添加包括在氨基酸序列的两个末端上添加一个至数个氨基酸。
另外，与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质是指功能与secY基因编码的蛋白质基本相同、并且能够构成分泌的蛋白质所通过的易位通道的重要部分的蛋白质。
术语枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的过度表达表示观察到在枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的宿主中表达的量超过通常的表达量。用于过度表达枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的方式的实例包括：将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点，导入至枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因在基因组中的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者导入一基因片段，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因的上游。
在此，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点不特别地限制，只要该区是在用作宿主的微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点即可，但优选，例如，位于枯草杆菌spoVG基因或aprE基因或与这些基因的任意者对应的基因的上游的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点，并且更优选位于枯草杆菌spoVG基因或与spoVG基因对应的基因的上游的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点。
作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区，可以是用于控制spoVG基因转录的区，spoVG基因是在JAFAN：Japan FunctionalAnalysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)的互联网站点(2004年3月10日更新的http://bacillus.genome.ad.jp/)中作为Gene No.BG10112公开的基因。更具体地，可以是具有由SEQ ID NO：9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基的碱基序列的DNA，或者包括与上述碱基序列同源的碱基序列、并且具有枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区的功能的DNA。此外，作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区-核糖体结合位点，可以是包括具有由SEQ ID NO：9所示的碱基序列的38号碱基至230号碱基的碱基序列的DNA，或者包括与上述碱基序列同源的碱基序列、并且具有枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区-核糖体结合位点的功能的DNA。
与由SEQ ID NO：9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基的碱基序列同源的碱基序列或与由SEQ ID NO：9所示的碱基序列的38号碱基至230号碱基的碱基序列同源的碱基序列的实例包括：(A)包括与如下DNA在严格条件下杂交的DNA的碱基序列：上述DNA包括与由SEQ ID NO：9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基或38号至230号碱基的碱基序列互补的碱基序列；(B)与由SEQ ID NO：9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基或38号碱基至230号碱基的碱基序列的同源性为至少90％、优选至少95％、且更优选至少99％的碱基序列；和类似序列。
另外，在此使用的术语“严格条件”可以如上所述的相同条件作为例子。
术语“具有枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的功能”表示当具有功能的DNA被导入至枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的上游，或导入至含有枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子(枯草杆菌rpsJ基因)的先导基因的上游时，secY基因或与secY基因对应的基因被过度表达，从而导致所需的蛋白质或多肽的生产率提高，并且提高的程度还与在下列情况下获得的提高相同：其中枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点被导入至枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的上游，或导入至含枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子(枯草杆菌rpsJ基因)的先导基因的上游。
转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点导入至secY基因或与secY基因对应的基因在基因组上的上游，或导入至含有枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子(枯草杆菌rpsJ基因)的先导基因的上游，包括部分或全部地置换枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因或含有枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子的初始转录起始控制区，以及***并同时保留初始转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点。
转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的置换可以例如使用涉及同源重组的已知方法来进行。即，首先，通过已知的方法例如SOE(重叠延伸拼接，splicing by overlap extension)-PCR法(Gene，77，61，1989)，在含有该转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的DNA片段的上游，连接含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段，以及药物抗性基因片段，而在前述基因片段的下游，连接含有部分或全部的rpsJ基因的转录起始控制区和结构基因区(其为含有secY基因的操纵子的先导基因)，或者连接含有部分或全部的rpsJ基因的结构基因区的DNA片段。以这种方式，获得DNA片段，其中含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段、药物抗性基因片段、含目标转录起始控制区或目标转录起始控制区结合核糖体的位点的DNA片段、以及含有部分或全部的rpsJ基因的转录起始控制区和结构基因区或含有部分或全部的rpsJ基因的结构基因区的DNA片段以该顺序连接。
接下来，当通过已知方法将该DNA片段转染到亲代微生物中时，在亲代微生物基因组的两点处发生双交换同源重组，例如在含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区，以及包括部分或全部的rpsJ基因的转录起始控制区和结构基因区或包括部分或全部的rpsJ基因的结构基因区的区。结果，可以使用药物抗性基因作为标记物分离出如下转化体：其中初始转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点被目标转录起始控制区或目标转录起始控制区-核糖体结合位点置换。以这种方式，导入至基因组上含secY基因的操纵子的上游的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点可以稳定地得以遗传保留。另外，作为用转染用DNA片段转染宿主微生物的已知方法，特别地可以是感受态细胞转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))、原生质体转化法(Mol.Gen.Genet.168，111(1979))、电穿孔法(FEMSMicrobiol.Lett.55，135(1990))等，特别优选感受态细胞转化法。
具体地，在使用枯草杆菌作为本发明的宿主微生物的情况下，可使用Mol.Gen.Genet.，223，268(1990)中所述的方法或类似方法，通过同源重组，进行从含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点到目标转录起始控制区或目标转录起始控制区-核糖体结合位点的置换。
如果适当地选择要***到需要***的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的两个末端的DNA片段的序列，可以通过如上述置换方法相同的方法，进行目标转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的***。例如，在该转录起始控制区的上游，连接含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段，以及药物抗性基因，而在该转录起始控制区的下游，连接含有部分或全部的初始转录起始控制区的DNA片段。以这种方式，获得DNA片段，其中含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段、药物抗性基因片段、目标转录起始控制区、以及含有部分或全部的初始转录起始控制区的DNA片段以该顺序连接。随后，将该DNA片段***至宿主微生物中，然后可以使用药物抗性基因作为标记物分离出转化体。在由此分离的转化体的基因组上，含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区和目标转录起始控制区可以稳定地保留，同时二者相互邻接，其间没有任何空隙。另外可选地，当制备和使用其中含secY基因的上游区的DNA片段和药物抗性基因连接在目标转录起始控制区的上游、而含部分或全部的secY基因的DNA片段连接在目标转录起始控制区的下游的DNA片段时，目标转录起始控制区可以稳定地保留，同时立即被导入至secY基因的上游。
根据本发明，导入有在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的基因组的上游包括secY基因。上游不受特别的限制，只要该区在rpsJ基因(其为操纵子先导基因)的起始密码子的上游侧，或secY基因的起始密码子的上游侧即可，但优选为包括2000个相邻碱基对的区，更优选包括500个碱基对的区，再更优选包括100个碱基对的区，再更优选包括50个碱基对的区。
根据本发明，使用通过将目标转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的片段与secY基因或与secY基因对应的基因的片段连接获得的基因片段，可以进行其中目标转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点连接在secY基因或与secY基因对应的基因的上游的基因片段的导入，上述片段已经通过已知的克隆方法获得，例如使用PCR法，使用枯草杆菌以外的微生物的基因组作为模板，通过已知方法例如限制性内切酶法或SOE(重叠延伸拼接)-PCR法(Gene，77，61(1989))而获得。可以根据已知的转化方法，通过在导入至细胞中的核酸片段与染色体之间的同源重组，可以将这些片段导入染色体。
要导入的secY基因或与secY基因对应的基因的碱基序列可以与微生物原始具有的secY基因或与该secY基因对应的基因的碱基序列不一致，只要它是secY基因或与secY基因对应的基因的碱基序列即可。此外，要导入的在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点(例如枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点)的碱基序列，可以与微生物所具有的碱基序列不一致，只要它是目标碱基序列即可。将核酸片段导入至宿主中的方法的例子可以是感受态细胞转化法、原生质体转化法、电穿孔法等，并且特别优选感受态细胞转化法。
此外，这些片段也可以通过载体例如质粒导入至细胞质中。另外，如稍后所述的实施例中所示，由于在通过质粒的方式导入时，通过每个细菌细胞导入一个拷贝，这些片段对于所需蛋白质或多肽的产生发挥充分的效应，因此即使在生产和培养期间一些质粒丢失也几乎不影响该片段。
另外，至于允许导入在宿主中的染色体区，优选非必需基因的内在部分、或非必需基因上游的非基因区的内在部分。例如，可以是aprE基因、sacB基因、nprE基因、amyE基因和ybxG基因的内在部分，或这些基因上游的非基因区的内在部分，但优选amyE基因的内在部分、或ybxG基因上游的非基因区的内在部分。
如本文所用，术语“非必需基因”是指即使当该基因被破坏时，至少在特定条件下具有该基因的宿主仍能存活的基因。另外，即使导入伴随着非必需基因的缺失，或部分或全部的非必需基因上游的非基因区的缺失，仍不会由此产生任何问题。
根据本发明，枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因的过度表达，以及与枯草杆菌的Sec途径相关的另一基因(例如，secE基因等)的过度表达可以在不影响所需蛋白质或多肽的生产率的提高的范围内进行，并且一种或两种或多种基因的灭活或缺失也可以并行地实现。另外，基因的灭活或缺失包括基因中的部分或全部碱基的置换和缺失，以及将碱基***至基因中。
下文将更详细地说明使用根据SOE(重叠延伸拼接)-PCR法(Gene，77，61(1989))制备的DNA片段，通过双交换的方式将其中spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点连接在secY基因上游的基因片段导入至宿主基因组的方法。然而，根据本发明的导入方法并无意于局限于以下方法。
用于本发明方法中的导入用DNA片段是如下的DNA片段：其中在邻近宿主基因组上的导入位点上游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段(下文中称为片段(1))和邻近导入位点下游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段(下文中称为片段(2))之间，以如下顺序***有含有spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的片段(下文中称为片段(3))、secY基因片段(下文中称为片段(4))、和药物抗性标记基因例如氯霉素抗性基因的片段(下文中称为片段(5))。首先，在第一轮PCR中制备片段(1)至片段(5)的5个片段。这时，使用如下设计的引物：例如，片段(3)上游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(1)的下游端，片段(3)下游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(4)的上游端，片段(5)上游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(4)的下游端，并且片段(5)下游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(2)的上游(图1)。
随后，使用在第一轮中制备的5种类型的PCR片段作为模板，并使用位于片段(1)上游的引物和位于片段(2)下游的引物进行第二轮PCR。从而，片段(3)在加入至片段(1)下游端的片段(3)的序列中发生退火，片段(3)在加入至片段(4)上游端的片段(3)的序列中发生退火，片段(5)在加入至片段(4)下游端的片段(5)的序列中发生退火，并且片段(5)在加入至片段(2)上游的片段(5)的序列中发生退火。由此，作为PCR扩增的结果，可以得到其中片段(1)至片段(5)的五个片段以(1)、(3)、(4)、(5)和(2)的顺序连接的DNA片段(图1)。
在此进行的PCR反应可以在文献(PCR Protocols.Current methodsand Applications，B.A.White主编，Humana Press，pp.251，1993；Gene，77，61(1989))中所述的常规条件下，使用表1所示的引物组，并使用常规PCR用酶试剂盒例如Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)而有利地进行。
当由此获得的转染用DNA片段通过感受态法或类似方法转染到细胞中时，在细胞内，在基因组上导入位点的上游和下游存在同一性的同源区中发生基因重组，并且通过基于药物抗性标记物的选择，可以分离出用如下基因片段转染的细胞：其中spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点连接在secY基因的上游。基于药物抗性标记物的选择可以通过以下方法有利地进行：分离在含氯霉素的琼脂培养基上生长的集落，然后选择基因组上的导入通过PCR法使用该基因组作为模板而得到确认的细胞，等等。
另外，药物抗性标记基因不受特别的限制，只要它可以用于使用通用的抗生素物质的选择即可，但除氯霉素抗性基因以外，还可以是例如红霉素抗性基因、新霉素抗性基因、壮观霉素(spectinomycin)抗性基因、四环素抗性基因和灭瘟素S抗性基因的药物抗性标记基因。
在本发明的重组微生物中，除了由secY基因增强引起的SecY过度表达以外，还实现了从基因组中使一种或多种芽孢形成相关基因和与其对应的基因缺失或灭活。如实施例2和3所示，基因的缺失或灭活是抑制芽孢形成的变化。
根据本发明，芽孢形成相关基因的实例包括加速芽孢形成的多组基因，由此这些基因的每一种的缺失或灭活导致芽孢形成的过程基本上被抑制，例如，编码对芽孢形成各期有特异性的sigma因子的一组基因，或者与sigma因子基因的表达和sigma因子的活化相关的一组基因。此外，还包括由相应的sigma因子转录并且参与加速芽孢形成的一组基因。
在芽孢杆菌属细菌中，对于枯草杆菌，已经鉴定出17种sigma因子，并且已知存在有如下sigma因子：从SigA开始，SigA是参与营养生长期中生长所必需的基因的转录的主要sigma因子(看家sigma因子)，SigH、SigF、SigE、SigG和SigK是控制芽孢形成过程的sigma因子，SigD是控制鞭毛形成或细胞壁消化的sigma因子，SigL是控制某些类型氨基酸或糖的代谢的sigma因子，SigB是控制对环境变化的响应的sigma因子，称为ECF sigma因子的sigma因子等(Bacillussubtilis and Its Closest Relatives：From Genes to Cells，A.L.Sonenshein主编，American Society for Microbiology，289页(2002))。
其中，已知控制芽孢形成过程的sigma因子根据芽孢形成过程的进程而相继地表达和活化，如图2所示。换句话说，当枯草杆菌进入营养饥饿状态时，首先经由涉及多种蛋白质的多级磷酸盐转导***(称为磷酸中继***)发生Spo0A(其为芽孢形成起始控制因子)的磷酸化(Cell，64，545(1991))。更具体地，由于营养饥饿导致细胞质中存在的KinA以及细胞膜中存在的KinB和KinC发生自磷酸化，并且磷酰基经由Spo0F和Spo0B转移至Spo0A，从而产生磷酸化的Spo0A(磷酸化Spo0A)。此外，在涉及KinB的芽孢形成过程的活化过程中需要KapB(Mol.Microbiol.，26，1097(1997))，同时KipA与KipI(其为KinA的自磷酸化抑制剂)结合，以避免其芽孢形成抑制作用(GenesDev.，11，2569(1997))。另外，PhrA抑制RapA的功能，RapA是磷酸化Spo0F的去磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，8612(1997))。KinA、KinB、KinC、Spo0F、Spo0B、Spo0A、KapB、KipI、KipA、RapA和PhrA分别由基因kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipI、kipA、rapA和phrA编码。
伴随着磷酸化Spo0A浓度的增加，抑制SigH的结构基因(sigH)表达的阻抑物AbrB的诱导受到抑制，因此，sigH的转录以依赖于SigA的方式被诱导(J.Bacteriol.，173，521(1991))。另外，在磷酸化Spo0A转录调节功能被参与染色体分离的Soj抑制的同时，也参与染色体分离的Spo0J抑制Soj的该作用(J.Bacteriol.，182，3446，2000)。Soj和Spo0J分别由soj基因和spo0J基因编码。在SigH活化后，不对称隔膜的形成将枯草杆菌的细胞质分隔为母细胞侧和子细胞侧。随后，在子细胞侧，磷酸化Spo0A和SigH接合，以诱导含有SigF的结构基因(sigF)的操纵子(spoIIAA-spoIIAB-sigF)的表达(Gene，101，113(1991))，并且在母细胞侧，磷酸化Spo0A和SigA接合，以诱导含SigE前体的结构基因(sigE)的操纵子(spoIIGA-sigE)的转录(J.Bacteriol.，169，3329(1987))。存在有两级抑制，其中SigF被抗sigma因子SpoIIAB在功能上抑制，而抗-抗sigma因子SpoIIAA抑制SpoIIAB的作用。即，如SigF的功能缺失的情况一样，SpoIIAA的功能缺失导致芽孢形成的抑制，已知SpoIIAB的功能缺失也能抑制芽孢形成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，9221(1990)；J.Bacteriol.，173，6678(1991))。而且，活化由SpoIIE控制，SpoIIE是SpoIIAA的去磷酸化酶(Genes Cells，1，881(1996))，并且活化的SigF诱导SpoIIR(其为信号转导蛋白质)的结构基因的转录。据设想，从子细胞侧分泌的SpoIIR活化SpoIIGA，SpoIIGA是位于母细胞侧上的不对称隔膜中的SigE前体活化蛋白酶，并且由此发生SigE的活化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，2012(1995))。SpoIIAA、SpoIIAB、SpoIIE、SpoIIR和SpoIIGA分别由spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR和SpoIIGA基因编码。此外，在子细胞侧，SigF诱导SigG的结构基因(sigG)的转录，并且在母细胞侧，SigE诱导SigK的结构基因(spoIIIC基因和spoIVCB gene)的转录。然而，在母细胞侧上的SigE活化后，在子细胞侧上发生SigG的活化，并且此后在母细胞侧上发生SigK的活化(Mol.Microbiol.，31，1285(1999))。
从图2中很显然，在上述的基因中，当缺失或灭活时抑制芽孢形成过程的基因是kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC和spoIVCB基因。在本发明中要缺失或灭活的芽孢形成相关基因优选地选自属于枯草杆菌的这些基因，并且更优选地选自枯草杆菌的sigF基因、sigE基因和phrA基因。
sigF基因是编码sigma因子的基因，其负责在芽孢形成阶段期间从II期开始在枯草杆菌细胞中形成不对称隔膜处的子细胞侧中发生的基因表达，而sigE基因是编码sigma因子的基因，其负责在芽孢形成阶段期间从II期开始在枯草杆菌细胞中形成不对称隔膜处的母细胞侧中发生的基因表达。
此外，phrA基因是涉及感受外部生长环境中的变化并以各种方式对其响应所需要的细胞间信息传输的机制中的基因之一，并且基因产物暂时分泌至细胞外。据报道，在细胞外被加工后，该基因作为五肽被摄取至细胞中，并且与RapA蛋白质结合，RapA控制用于传输芽孢形成起始信号的磷-中继***中的Spo0F的磷酸化，从而参与芽孢形成起始信号的转导(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，8612(1997))。
上述基因的每一种基因的基因编号和功能总结于表6。
与芽孢形成相关基因诸如kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC和spoIVCB对应的基因是功能与上述基因的任一种基本相同的基因，并且例如，可以是来自另一微生物的基因，优选来自芽孢杆菌属细菌的基因，其碱基序列与这些基因的任一种的碱基序列的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、再更优选至少95％、再更优选至少98％。另外，碱基序列的同一性在此根据Lipman-Pearson法计算(Science，227，1435(1985))。
这些基因的缺失或灭活可以是前述各种基因当中单个基因的缺失或灭活，或可以是其两种或多种的组合的缺失或灭活。此外，目标基因之外的基因的增强或缺失或灭活也可以并行地进行。另外，基因的缺失或灭活包括基因中的部分或全部碱基的置换或缺失，以及将碱基***至基因中。
对于一组基因或单个基因的缺失或灭活的顺序，可以是有意地缺失或灭活目标基因(靶基因)的方法，以及通过缺失或灭活使随机基因突变、然后进行蛋白质生产率的评价并通过适当方法进行遗传分析的方法。
为了使靶基因缺失或灭活，例如，可以使用涉及同源重组的方法。即，可以将通过将含有部分靶基因的DNA片段克隆到适当的质粒中获得的环状重组质粒，转染到亲代微生物的细胞中，使得亲代微生物的基因组上的靶基因被靶基因的某些区中的同源重组分开，从而使靶基因灭活。另外可选地，如图3所示，根据PCR法或类似方法，通过构建经由突变例如碱基置换或碱基***而灭活的靶基因，或者构建含有靶基因的上游和下游区但不含有靶基因的线性DNA片段，并将所得物转染到亲代微生物细胞中，从而在亲代微生物的基因组上的靶基因内突变位点外的两个位点处，或者在靶基因的上游侧和下游侧上，引起双交换同源重组，也可以用缺失或灭活的基因片段置换基因组上的靶基因。
具体地，在使用枯草杆菌作为构建本发明的微生物的亲代微生物的情况下，已经有几个关于通过同源重组缺失或灭活靶基因的方法的报道(Mol.Gen.Genet.，223，268(1990)等)，由此通过重复这些方法可以获得本发明的宿主微生物。
随机基因的缺失或灭活也可以通过诱导同源重组的方法进行，例如使用随机克隆DNA片段的上述方法，或者通过用放射照射亲代微生物的方法进行。
下文将更具体地解释使用根据SOE(重叠延伸拼接)-PCR法(Gene，77，61(1989))制备的缺失用DNA片段通过双交换进行缺失的方法，但本发明中的基因缺失方法并不限于以下方法。
本发明中使用的缺失用DNA片段是通过将药物抗性标记基因片段***在邻接于要被缺失基因上游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段和邻接于要被缺失基因下游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段之间而制备的片段。首先，通过第一轮PCR制备三个片段：要被缺失基因的上游片段和下游片段，以及药物抗性标记基因片段，这时，使用如下设计的引物：例如，药物抗性标记基因上游侧上的10-30个碱基对的序列加入至上游片段的下游端，反过来，药物抗性标记基因下游侧上的10-30个碱基对的序列加入至下游片段的上游端(图4)。
随后，使用在第一轮中制备的三种类型的PCR片段作为模板，并使用上游片段的上游侧引物和下游片段的下游引物进行第二轮PCR。从而，药物抗性标记基因片段在加入至上游片段的下游端和下游片段的上游端的药物抗性标记基因序列中发生退火，并且作为PCR扩增的结果，可以得到药物抗性标记基因***在上游侧片段和下游侧片段之间的DNA片段(图4)。
在使用氯霉素抗性基因作为药物抗性标记基因的情况下，通过在文献(PCR Protocols.Current methods and Applications，B.A.White主编，Humana Press，pp.251，1993；Gene，77，61(1989))中所述的常规条件下，使用表1所示的引物组，并使用常规PCR用酶试剂盒例如Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)来进行SOE-PCR，获得用于缺失各种基因的DNA片段。
当由此获得的缺失用DNA片段通过感受态法或类似方法转染到细胞中时，在细胞内，在要缺失的基因的上游和下游的存在同一性的同源区中发生基因重组，并且通过基于药物抗性标记物的选择，可以分离出其中所需基因已经被药物抗性基因置换的细胞。即，当使用表1所示的引物组制备的缺失用DNA片段被转染时，可以分离在含氯霉素的琼脂培养基上生长的集落，并通过使用基因组作为模板的PCR法或类似方法，确认基因组上的所需基因被氯霉素抗性基因置换。
本发明的微生物可以通过将编码所需蛋白质或所需多肽的基因转染到由此产生的微生物中而获得。在此，术语“所需蛋白质或多肽”是指目的之一是生产或纯化的蛋白质或多肽。另外，关于“具有编码所需蛋白质或多肽的基因的微生物”，其中的基因意在包括微生物原本具有的基因，以及该微生物原本不具有的基因，即外源基因。
所需蛋白质或所需多肽不受特别的限制，其实例包括在洗涤剂、食品、纤维、饲料、化学品、药物、诊断等中使用的各种工业酶或生理活性肽，并且优选工业酶。此外，就工业酶的功能而言，包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶/合成酶等，并且可以优选为水解酶，例如纤维素酶、γ-淀粉酶和蛋白酶。
对于蛋白酶，可以是来自微生物的蛋白酶，优选来自芽孢杆菌属细菌的蛋白酶，更优选来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16株(FERM BP-3376)的蛋白酶。来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16株的碱性蛋白酶的更具体的实例包括来自芽孢杆菌属细菌的碱性蛋白酶，其包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的1号氨基酸至380号氨基酸的氨基酸序列，或者是包括与上述氨基酸序列的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、再更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列的蛋白酶。
对于纤维素酶，可以是属于多糖水解酶类别中第5家族的纤维素酶(Biochem.J.，280，309(1991))，并且其中，可以是来自微生物的纤维素酶，尤其是来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶。例如，可以是来自芽孢杆菌属KSM-S237株(FERM BP-7875)和芽孢杆菌属KSM-64株(FERM BP-2886)的纤维素酶，并且其合适的实例包括来自芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶，其包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的1号氨基酸至795号氨基酸的氨基酸序列，或者是包括SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的1号氨基酸至793号氨基酸的氨基酸序列的碱性纤维素酶，或者是包括与上述氨基酸序列的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、再更优选95％、再更优选至少98％的氨基酸序列的纤维素酶。
此外，对于γ-淀粉酶，可以是来自微生物的γ-淀粉酶，优选来自芽孢杆菌属细菌的γ-淀粉酶，并且更优选来自芽孢杆菌属KSM-K38株的γ-淀粉酶。
合意地，要转染到本发明的微生物中的所需蛋白质或所需多肽的基因与上游的一个或多个区以适当的顺序连接，该一个或多个区选自以下区：与基因的转录、翻译和分泌有关的控制区，即，含有启动子和转录起始点的转录起始控制区；含核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始控制区；以及分泌信号肽区。具体地，优选具有三个结合区，包括转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号肽区的基因，另外，合意地，分泌信号肽区来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因，而转录起始控制区和翻译起始控制区是纤维素酶基因上游的大小为0.6-1kb的区，并且这些区适当地与所需蛋白质或所需多肽的基因连接。例如，合意地，来自芽孢杆菌属细菌(即KSM-S237株(FERM BP-7875)或KSM-64株(FERM BP-2886))的纤维素酶基因以及该纤维素酶基因的转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号肽区适当地与所需蛋白质或所需多肽的结构基因连接。更具体地，合意地，包括SEQ ID NO：5所示的碱基序列的1号碱基至659号碱基的碱基序列的DNA片段，或包括SEQ ID NO：7所示的碱基序列的1号碱基至696号碱基的碱基序列的DNA片段，或者包括与上述碱基序列的同一性为至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、再更优选至少95％、再更优选至少98％的碱基序列的DNA片段，或包括由任意上述碱基序列的一部分的缺失、置换或添加得到的碱基序列的DNA片段，适当地与所需蛋白质或所需多肽的结构基因连接。另外，如本文所用，包括由任意上述碱基序列的一部分的缺失、置换或添加得到的碱基序列的DNA片段是指其中任意上述碱基序列的一部分被缺失、置换或添加，但保留了与基因的转录、翻译和分泌相关的功能的DNA片段。
编码所需蛋白质或所需多肽的这些基因的导入可以通过如下方法进行：例如，(1)通过载体导入，或(2)***到基因组中。在(1)通过载体导入的情况下，可以通过适当的转化法，例如感受态细胞转化法、原生质体转化法或电穿孔法，导入含有以下基因的载体：该基因编码所需蛋白质或所需多肽，并且在上游与选自与基因的转录、翻译和分泌相关的控制区(即含启动子和转录起始点的转录起始控制区)、含核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始控制区和分泌信号肽区的一个或多个区以适当的形式连接。在此，载体不受特别的限制，只要它是用于将所需基因转染到宿主中以便增殖并表达该基因的合适的载体核酸分子即可，并且，载体可以是质粒，也可以是，例如，人工染色体，例如YAC和BAC，使用转座子的载体，黏端质粒等等。质粒的实例包括pUB110和pHY300PLK。
此外，(2)***至基因组中可以使用例如涉及同源重组的方法进行。即，具有用于诱导与编码所需蛋白质或所需多肽的基因连接的导入的染色体区的一部分的DNA片段，可以通过将该DNA片段转染到微生物的细胞中、并在染色体区的一些部分中诱导同源重组而结合至基因组中。在此，用于诱导导入的染色体区不受特别的限制，但优选非必需基因区或非必需基因区上游的非基因区。
使用本发明的重组微生物产生所需的蛋白质或多肽可以通过如下方法进行：将细菌菌株接种至含有可同化碳源、氮源和其他必需组分的培养基中，通过常规微生物培养方法培养菌株，并且培养完成后，收集和纯化蛋白质或多肽。如在后述的实施例中所述，与使用基因未被改变的微生物的情况相比，所需蛋白质或多肽的生产率得到提高。
下文将详细地描述构建本发明的重组微生物的方法，以及使用重组微生物产生纤维素酶和淀粉酶的方法。
实施例
在以下实施例中用于扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)中，使用GeneAmp PCR***(Applied Biosystems，Inc.)并使用PyrobestDNA聚合酶(Takara Bio，Inc.)和辅助试剂来进行DNA扩增。通过加入1μL适当稀释的模板DNA、20pmol各正义引物和反义引物、以及2.5U Pyrobest DNA聚合酶，并将反应溶液的总量调节至50μL，制备PCR反应溶液的组合物。在下列反应条件下进行PCR：重复30轮在98℃下10秒、在55℃下30秒和在72℃下1-5分钟(根据所需的扩增产物调节。大致标准是1分钟/1kb)的三阶段温度变化，然后反应在72℃下继续进行5分钟。
此外，在下列实施例中，基因的上游和下游不是指从复制起始点开始的位置，而是，上游表示在各种操作和过程中紧接着基因或目的区域的5′-端的区域，而下游表示在各种操作和过程中紧接着基因或目的区域的3′-端的区域。
此外，在下列实施例中各种基因和基因区的名称基于在Nature，390，249-256(1997)中报道、并在日本站点Japan Functional Analysis Networkfor Bacillus subtilis(BSORF DB)(http://bacillus.genome.ad.JP/，2004年3月10日更新)上在互联网上公布的枯草杆菌基因组数据进行描述。
枯草杆菌的转化以下列方式进行。具体地，将枯草杆菌株在SPI培养基(0.20％硫酸铵、1.40％磷酸氢二钾、0.60％磷酸二氢钾、0.10％柠檬酸三钠二水合物、0.50％葡萄糖、0.02％酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories，Inc.)、5mM硫酸镁、0.25μM氯化锰和50μg/mL色氨酸)中在37℃下振荡培养，直至生长度值(OD600)达到大约1。在振荡培养后，将一些培养溶液接种至9倍量的SPII培养基(0.20％硫酸铵、1.40％磷酸氢二钾、0.60％磷酸二氢钾、0.10％柠檬酸三钠二水合物、0.50％葡萄糖、0.01％酪蛋白氨基酸(Difco Laboratories，Inc.)、5mM硫酸镁、0.40μM氯化锰和5μg/mL色氨酸)中，并将细胞进一步振荡培养，直至生长度值(OD600)达到大约0.4。由此，制备枯草杆菌的感受态细胞。
随后，向100μL由此制备的感受态细胞悬液(SPII培养基中的培养溶液)中加入5μL含各种DNA片段的溶液(SOE-PCR反应溶液等)，将混合物在37℃下振荡孵育1小时，并且将全部的量涂在含适当药物的LB琼脂培养基(1％色氨酸、0.5％酵母提取物、1％NaCl和1.5％琼脂)上。在37℃下静止培养后，分离出生长的集落作为转化体。提取所获得的转化体的基因组，并使用该基因组作为模板通过PCR确认实现了所需的基因组结构的改变。
将编码所需蛋白质或多肽的基因转染到宿主微生物中遵循下列的任一种方法进行：感受态细胞转化法(J.Bacteriol.，93，1925(1967))、电穿孔法(FEMS Microbiol.Lett.，55，135(1990))和原生质体转化法(Mol.Gen.Genet.，168，111(1979))。
对于用于通过重组微生物产生蛋白质的培养，使用LB培养基(1％色氨酸、0.5％酵母提取物和1％NaCl)、2×YT培养基(1.6％色氨酸、1％酵母提取物和0.5％NaCl)、2×L-麦芽糖培养基(2％色氨酸、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖和7.5ppm硫酸锰四水合物或五水合物)或CSL发酵培养基(2％酵母提取物、0.5％玉米浸出液(CSL)、0.05％氯化镁七水合物、0.6％尿素、0.2％L-色氨酸、10％葡萄糖、0.15％磷酸二氢钠和0.35％磷酸氢二钠，pH 7.2)。
实施例1构建过度表达secY基因的菌株
如下进行过度表达secY基因的变异体的构建(见图3)。使用从枯草杆菌168株中提取的基因组DNA作为模板，并使用PVG-FW和PVG-R，以及secY/PVG-F和secY/Cm-R引物组，通过PCR扩增含spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点的0.2kb片段(A)和含spoVG基因的1.3kb片段(B)。此外，使用质粒pC194(J.Bacteriol.，150(2)，815(1982))作为模板，并使用表1所示的catf和catr引物组，通过PCR扩增含氯霉素(Cm)抗性基因的0.9kb片段(C)。
接下来，通过使用获得的三个片段(A)、(B)和(C)的混合物作为模板，并使用表1所示的PVG-FW2和catr2引物组进行SOE-PCR，获得大小为2.2kb的DNA片段(D)，其中三个片段(A)、(B)和(C)以该顺序连接，spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点连接在secY基因的上游(连接成secY基因的起始密码子位于spoVG基因的起始密码子的位置处)，并且Cm抗性基因结合在其下游。随后，使用从枯草杆菌168株提取的基因组数据作为模板，并使用表1所示的amyEfw2和amyE/PVG2-R以及amyE/Cm2-F和amyErv2引物组，通过PCR扩增含amyE基因的5′-端上的区的1.0kb片段(E)，和含amyE基因的3′-端上的区的1.0kb片段(F)。
随后，通过使用获得的三个片段(E)、(F)和(D)的混合物作为模板，并使用表1所示的amyEfw1和amyErv1引物组进行SOE-PCR，获得总碱基长度为4.2kb的DNA片段(G)，其中三个片段(E)、(D)和(F)以该顺序连接，secY基因连接在spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点的下游，并且在其下游连接有氯霉素抗性基因的大小为2.2kb的DNA片段***至amyE基因的中央。
使用获得的4.2kb的DNA片段(G)，通过感受态细胞法将枯草杆菌168株转化，并分离出在含(10μg/mL)的LB琼脂培养基上生长的集落作为转化体。通过使用从获得的转化体提取的基因组DNA作为模板，并使用表1所示的amyEfw2和secY/Cm-R以及secY/PVG-F和amyErv2引物组，通过PCR确认大小分别为2.5kb和3.1kb的DNA片段的扩增，并且确认其中secY基因连接在spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点的下游的DNA片段在枯草杆菌168株的基因组上的amyE基因位点处被***。由此获得的菌株称为secY-K株。
[表1-1]
  引物名称   序列(5′-3′)   SEQ ID NO.
  PVG-FW   GTTAGTCGAGATCGAAGTTA   10
  PVG-R   AGTAGTTCACCACCTTTTCC   11
  secY/PVG-F   GGAAAAGGTGGTGAACTACTATGTTGTTTAAAACAATCTCCAA   12
  secY/Cm-R   ATGGGTGCTTTAGTTGAAGACTAGTTTTTCATAAATCCAC   13
  catf   CAACTAAAGCACCCATTAG   14
  catr   CTTCAACTAACGGGGCAG   15
  PVG-FW2   TAAGAAAAGTGATTCTGGGA   16
  catr2   CTCATATTATAAAAGCCAGTC   17
  amyEfw2   GGAGTGTCAAGAATGTTTGC   18
  amyE/PVG2-R   TCCCAGAATCACTTTTCTTAATCATCGCTCATCCATGTCG   19
  amyE/Cm2-F   GACTGGCTTTTATAATATGAGGTTTAGGCTGGGCGGTGATA   20
  amyErv2   TCAATGGGGAAGAGAACC   21
  amyErv1   TCAAAACCTCTTTACTGCCG   22
  amyErv1   CACGTAATCAAAGCCAGGCT   23
  spf   ATCGATTTTCGTTCGTG   24
  spr   CATATGCAAGGGTTTATTG   25
  sigF-FW   GAAGAAAGCCGGGTTTATCA   26
  sigF/Sp-R   CACGAACGAAAATCGATCTGAGCGTTTTTGCCGTTTT   27
  sigF/Sp-F   CAATAAACCCTTGCATATGTCTGCAGTGCAGGCTAGCTT   28
  sigF-RV   CCCGACGAACAAACCTGCCA   29
  sigF-FW2   CGAATGACCACTAGTTTTGT   30
  sigF-RV2   TGAAGCGTCTCCCATCCCCC   31
  sigE-FW   AGTCAGATGTGAAAATCTATT   32
  sigE/Sp-R   CACGAACGAAAATCGATCTTCCTCTCCCTTCTAAATG   33
  sigE/Sp-F   CAATAAACCCTTGCATATGAAAATTTTATGGTTAGAACCC   34
  sigE-RV   CCTTACTTTTTCCAAAACGT   35
[表1-2]
  引物名称   序列(5′-3′)   SEQ ID NO.
  sigE-FW2   CTCACGGCATTTATTTTAAAA   36
  sigE-RV2   GCTTTTCATTATTGATGAATAT   37
  phrA-FW   AGAAGACCAAGATTTGCTGC   38
  phrA/Sp-R   CACGAACGAAAATCGATATGAAATGTTTTCCCTTCTG   39
  phrA/Sp-F   CAATAAACCCTTGCATATGGGTTCATGCAGGTGAAAC   40
  phrA-RV   ACTGGCCCCGTGTGATGCGG   41
  phrA-FW2   GAGTTTTCAGAATTGTTAGAA   42
  phrA-RV2   GAAGAGACTGCAGCTTTTT   43
  S237pKAPpp-F   ACTTTAAAAATATTTAGGAGGTAATATGAAGAAACCGTTGGGGAAA   44
  KAPter-R(BglII)   GGGAGATCTTCAGCGATCTATTTCTCTTTTTC   45
  S237ppp-F2(BamHI)   CCCGGATCCAACAGGCTTATATTTA   46
  S237pKAPpp-R   TTTCCCCAACGGTTTCTTCATATTACCTCCTAAATATTTTTAAAGT   47
  237UB1   TTGCGGATCCAACAGGCTTATATTTAGAGGAAATTTC   48
  237DB1   TTGCGGATCCAACAACTCTGTGTCCAGTTATGCAAG   49
  rsiX-FW   ATTCCAGTTACTCGTAATATAGTTG   50
  rsiX/Cm-R   CTAATGGGTGCTTTAGTTGACTTCATCATCCATTAGCTC   51
  rsiX/Cm-F   CTGCCCCGTTAGTTGAAGCTGCTCCAAATCCGATTTCC   52
  rsiX-RV   GTCCTGCATTTTTCGAAGTCTGG   53
  rsiX-FW2   ACTCCGGGTCTGGCATACCG   54
  rsiX-RV2   ACATCTGGAAGATAAAATTGT   55
  yacP-FW   CAGGCTGAGATCCTATTTTT   56
  yacP/Cm-R   CTAATGGGTGCTTTAGTTGGGGTCTTTATTCTCCCACAG   57
  yacP/Cm-F   CTGCCCCGTTAGTTGAAGGTTGACGCTTTTTTGCCCAA   58
  yacP-RV   ACGCATGTAAAAGACCTCCA   59
  yacP-FW2   GAGGCAGAAATGCCAAGTCA   60
[表1-3]
  引物名称   序列(5′-3′) SEQ ID NO.
  yacP-RV2   TTGCAAGTACTGCAGTATTT 61
  yvdE-FW   CTTCCTCCATTAAAAAGCCG 62
  yvdE/Cm-R   CTAATGGGTGCTTTAGTTGTTTCATCCCCTCCTTATCTG 63
  yvdE/Cm-F   CTGCCCCGTTAGTTGAAGGCGCCTTATTCTGTTATCGG 64
  yvdE-RV   CGGCATATCAGCTGTAAAAG 65
  yvdE-FW2   TTTCATCCATTTTTCTGCATC   66
  yvdE-RV2   CAGTCCTTATAGCGGGATTG   67
  yurK-FW   CTTCAGCCGCTTTGCTTTTT   68
  vurK/Cm-R   CTAATGGGTGCTTTAGTTGAGGGTAGCCTCCTTTTAACC   69
  vurK/Cm-F   CTGCCCCGTTAGTTGAAGCAGGCATAAAAAACGAGACA   70
  yurK-RV   GTCCTGCTGGCGGGGTTAAC   71
  yurK-FW2   TGCTGCTGTTCTATGATGCC   72
  yurK-RV2   TTGTCCGCGGGATTGCAAGC   73
  yhdQ-FW   TCACAAATCCAAGCGTTCGA   74
  yhdQ/Cm-R   CTAATGGGTGCTTTAGTTGCACGTTATAGTTATGAGAATA   75
  yhdQ/Cm-F   CTGCCCCGTTAGTTGAAGAACCATTTTATCTAACAGGAG   76
  yhdQ-RV   TGTGGACCCTCTCTTTTTGC   77
  yhdQ-FW2   GTCCAATCCGATATACCCGA   78
  yhdQ-RV2   AGGGTTGACGAATTGAGAAA   79
  glcT-FW   AAGCCGGTGTCTCTGTTACA   80
  glcT/Cm-R   CTAATGGGTGCTTTAGTTGTCAATACCTCATATCGTACA   81
  glcT/Cm-F   CTGCCCCGTTAGTTGAAGAATTTCATAAATTCAGTTTATCC   82
  glcT-RV   CTTATAGCTGAAGAATTCATA   83
  glcT-FW2   AAAAAGAGTGTTTGAGGCAA   84
  glcT-RV2   GTTCAATCACCCCGAAGATA   85
实施例2用药物抗性基因置换基因组中的sigF基因
用药物抗性基因置换基因组中的sigE基因的方法将基于图4进行说明。
使用从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，使用表1所示的sigF-FW和sigF/Sp-R引物组，通过PCR扩增邻近基因组中sigE基因上游的1.0kb片段(A)。另外，使用上述基因组DNA作为模板，使用sigF/sp-F和sigF-RV引物组，通过PCR扩增邻近基因组中sigF基因下游的1.0kb片段(B)。
此外，使用质粒pDG1727(Gene，167，335(1995))DNA作为模板，并使用表1所示的spf和spr引物组，通过PCR制备大小为1.2kb的壮观霉素(Sp)抗性基因区(C)。
随后，如图4所示，使用获得的1.0kb片段(A)、1.0kb片段(B)和Sp抗性基因区(C)三个片段的混合物作为模板，并使用表1所示的sigF-FW2和sigF-RV2引物组，根据SOE-PCR法获得其中以1.0kb片段(A)、Sp抗性基因区(C)和1.0kb片段(B)的顺序含有以上三个片段的2.8kb的DNA片段(D)。
然后，使用获得的DNA片段(D)，根据感受态细胞转化法进行168株的转化。转化后，分离出在含壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基上生长的集落作为转化株。
提取获得的转化体的基因组DNA，并通过PCR确认sigF基因被Sp抗性基因置换。这样，构建缺失sigF基因的菌株(ΔsigF株)。此外，使用在实施例1中构建的secY-K株通过在转化中用此株更换枯草杆菌168株，构建其中在secY-K株的基因组中sigF基因被Sp抗性基因置换的菌株(secYKΔsigF株)。
实施例3用药物抗性基因置换基因组中的sigE基因和phrA基因
以在实施例2中所示的用药物抗性基因置换sigE基因相同的方式，进行用壮观霉素抗性基因置换168株基因组中的sigE基因和phrA基因，从而构建缺失sigE基因的菌株(ΔsigE株)和缺失phrA基因的菌株(ΔphrA株)。对于各菌株的构建，使用表1所示的引物，并且各引物与构建ΔsigF株中使用的引物的对应关系显示于表2。
Figure G2008800111100D00261
通过用壮观霉素抗性基因置换实施例1中构建的secY-K株的基因组上的sigE基因或phrA基因，构建secYKΔsigE株和secYKΔphrA株。
实施例4评价碱性蛋白酶的分泌和产生
实施例1-3中获得的secY-K株、secYKΔsigF株、secYKΔsigE株和secYKΔphrA株的异源蛋白质生产率的评价如下进行：使用来自芽孢杆菌属细菌的碱性蛋白酶的生产率作为指标，上述蛋白酶包括SEQID NO：4所示的氨基酸序列。作为对照，对枯草杆菌168株、ΔsigF株、ΔsigE株和ΔphrA株也进行评价。即，使用从克劳氏芽孢杆菌KSM-K16株(FERM BP-3376)中提取的基因组DNA作为模板，并使用表1所示的S237pKAPpp-F和KAPter-R(BglH)引物组，通过PCR扩增大小为1.3kb的编码具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的碱性蛋白酶的DNA片段(W)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，43，473(1995))。另外，使用从枯草杆菌KSM-S237株(FERM BP-7875)中提取的基因组DNA作为模板，并使用表1所示的S237ppp-F2(BamHI)和S237pKAPpp-R引物组，通过PCR扩增大小为0.6kb的含碱性纤维素酶基因的启动子区(JP-A第2000-210081号)的DNA片段(X)。
随后，使用获得的两个片段(W)和(X)的混合物作为模板，并使用表1所示的S237ppp-F2(BamHI)和KAPter-R(BglII)等引物组进行SOE-PCR，获得大小为1.8kb的DNA片段(Y)，其中碱性蛋白酶基因连接在碱性纤维素酶基因的启动子区下游。将得到的1.8kb的DNA片段(Y)***在穿梭载体pHY300PLK(Yakult Honsha Co.，Ltd.)的BamHI-BglII限制性酶切位点处，以构建用于评价碱性蛋白酶产量的质粒pHYKAP(S237p)。
将根据原生质体转化法构建的质粒pHYKAP(S237p)转染到各菌株中。获得的各重组株在37℃下在10mL LB培养基中振荡培养过夜，将0.05mL该培养溶液接种至50mL 2×L-麦芽糖培养基(2％胰蛋白质胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰四水合物或五水合物和15ppm四环素)中，在30℃下振荡培养3天。培养后，测定通过离心去除细菌细胞的培养溶液的上清液的碱性蛋白酶活性，以确定培养期间分泌和产生至细菌细胞外的碱性蛋白酶的量。培养上清液中蛋白酶活性的测定如下进行。具体地，向50μL用2mM CaCl2溶液适当稀释的培养上清液中，加入含7.5mM琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸对硝基苯胺(STANA，Peptide Institute，Inc.)作为底物的100μL 75mM硼酸-KCl缓冲溶液(pH 10.5)并混合。当反应在30℃下进行时，脱离的对硝基苯胺量的定量通过测量420nm处的吸光度(OD420nm)的变化来进行。在1分钟内使1μ-mol对硝基苯胺脱离的酶量作为1U。
如表3所示，作为碱性蛋白酶活性的测定结果，当使用secY-K株作为宿主时，碱性蛋白酶的生产率等于对照168株(野生型)的生产率，并且特别地，观察不到生产率的提高。另一方面，观察到secYKΔsigF株、secYKΔsigE株和secYKΔphrA株的生产率显著提高，在这些菌株中结合了芽孢形成相关基因的缺失。对于没有进行secY基因表达增强的导入的ΔsigF株、ΔsigE株和ΔphrA株也观察到生产率的提高超过了168株的提高；然而，与secY基因表达的增强相结合，由这些基因的缺失所引起的生产率提高作用的表现显然是增加的。换句话说，设想当首先增加SecY蛋白质(其为分泌机构)的量，然后使芽孢形成相关基因例如sigF、sigE和phrA缺失时，在异源蛋白质生产率的提高方面获得了协同作用。
[表3]
  蛋白酶活性(相对值，％)   缺失的作用(％)
 168   100   -
 ΔsigF   219   119
 ΔsigE   253   153
 ΔphrA   154   54
 secY-K   100   -
 SecYKΔsigF   233   133
 SecYKΔsigE   278   178
 SecYKΔphrA   209   109
实施例5评价碱性纤维素酶的分泌和产生
其他异源蛋白质生产率的评价如下进行：使用来自芽孢杆菌属细菌的包括SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的碱性纤维素酶的生产率作为指标。具体地，使用表1所示的237UB1和237DB1引物组，扩增来自芽孢杆菌属KSM-S237株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因(JP-A第2000-210081号)的片段(3.1kb)，然后用BamHI限制性内切酶处理，以将该片段***在穿梭载体pHY300PLK的BamHI限制性酶切位点处。根据原生质体转化法将由此获得的重组质粒pHY-S237转染到各菌株中。由此获得的各重组株在与实施例4相同的条件下振荡培养3天。测定离心去除细菌细胞的培养溶液的上清液的碱性纤维素酶活性，以确定培养期间分泌和产生至细菌细胞外的碱性纤维素酶的量。
对于纤维素酶活性的测定，向50μL用1/7.5M磷酸盐缓冲液(pH7.4，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)适当稀释的样品溶液中加入50μL 0.4mM对硝基苯基-β-D-纤维三糖苷(Seikagaku Corporation)并混合，并且通过测量420nm处吸光度(OD420nm)的变化，当反应在30℃下进行时进行脱离的对硝基苯酚量的定量。在1分钟内使1μ-mol对硝基苯酚脱离的酶量作为1U。
如表4所示，作为碱性纤维素酶活性的测定结果，当使用secY-K株作为宿主时，与对照168株(野生型)相比，观察到较高的碱性纤维素酶的分泌和产生。另外，观察到secYKΔsigF株、secYKΔsigE株和secYKΔphrA株的生产率进一步显著提高，在这些菌株中结合了芽孢形成相关基因的缺失。对于没有进行secY基因表达增强的导入的ΔsigF株、ΔsigE株和ΔphrA株，也观察到生产率的提高超过了168株的提高；然而，与secY基因表达的增强相结合，由这些基因的缺失所引起的生产率提高作用的表现显然是增加的。换句话说，设想当首先增加SecY蛋白质(其为分泌机构)的量，然后使芽孢形成相关基因例如sigF、sigE和phrA缺失时，在生产率的提高方面获得了协同作用。
[表4]
  纤维素酶活性(相对值，％)   缺失的作用(％)
 168   100   -
 ΔsigF   142   42
 ΔsigE   145   45
 ΔphrA   130   30
 secY-K   115   -
 SecYKΔsigF   162   62
 SecYKΔsigE   167   67
 SecYKΔphrA   155   55
比较例1用药物抗性基因置换rsiX基因
以与实施例2所示的用壮观霉素抗性基因置换sigF基因相同的方式，用氯霉素抗性基因置换枯草杆菌168株的基因组上的rsiX基因，从而构建ΔrsiX株。使用的引物显示于表1，并且使用的各引物与构建ΔsigF株使用的引物的对应关系显示于表2。另外，以相同的方式用氯霉素抗性基因置换实施例2中构建的ΔsigF株的基因组上的rsiX基因，从而构建ΔsigFΔrsiX株。此外，rsiX基因是编码抑制SigX功能的抗sigma因子(抗-SigX)的基因，SigX是属于枯草杆菌的ECF(胞质外功能)家族的sigma因子之一。SigX在细胞周围环境在热应激或类似情况下发生变化时受到活化，并且具有通过诱导具有识别该活化作用的启动子的基因的转录或操纵子的转录来应付环境变化的功能(J.Bacteriol.，179，2915(1997))。
比较例2评价碱性蛋白酶的分泌和产生
比较例1中构建的ΔsigFΔrsiX株的碱性蛋白酶的分泌生产率的评价以与实施例4相同的方式进行。作为对照，对枯草杆菌168株、实施例1中构建的ΔrsiX株和ΔsigF株进行相同的评价。
结果，如表5所示，尽管rsiX基因缺失的ΔrsiX株的蛋白酶生产率高于野生株的生产率，但其中结合有sigF基因的缺失的ΔsigFΔrsiX株的生产率则低于ΔsigF株的生产率。换句话说，确认对于rsiX基因的缺失，没有观察到表现出当与芽孢形成相关基因的缺失结合时的产生异源蛋白质的协同作用。
[表5]
  蛋白酶活性(相对值，％)
168   100
ΔsigF   188
ΔrsiX   123
ΔrsiXΔsigF   178
比较例3用药物抗性基因置换yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因
通过实施例2所示的用壮观霉素抗性基因置换sigF基因的相同方式，用氯霉素抗性基因置换枯草杆菌168株的基因组上的yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因，从而分别构建ΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、ΔyhdQ株和ΔglcT株。使用的引物显示于表1，并且使用的各引物与构建ΔsigF株使用的引物的对应关系显示于表2。另外，通过用氯霉素抗性基因置换实施例2中构建的ΔsigF株的基因组上的yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因，分别构建ΔsigFΔyacP株、ΔsigFΔyvdE株、ΔsigFΔyurK株、ΔsigFΔyhdQ株和ΔsigFΔglcT株。
关于与本发明相关的基因，基因编号及其功能在表6中给出。
[表6]
  基因名称   基因编号  功能
  secY   BG10445  前蛋白质移位酶SecY亚单位
  spoVG   BG10112  V期芽孢形成蛋白质G(孢子皮质的合成)
  amyE   BG10473  α-淀粉酶
  sigA   BG10314  RNA聚合酶主要sigma因子
  kinA   BG10204  参与芽孢形成起始的双组分调控感受器组氨酸激酶A
  kinB   BG10745  参与芽孢形成起始的双组分调控感受器组氨酸激酶B
  kinC   BG10989  参与芽孢形成起始的双组分调控感受器组氨酸激酶C
  spo0F   BG10411  参与芽孢形成起始的双组分调控响应调节物
  spo0B   BG10336  引发芽孢形成的磷酸转移酶
  spo0A   BG10765  导致芽孢形成起始的双组分调控相应调节物
  kapB   BG10746  芽孢形成起始中KinB的活化
  kipI   BG11231  抑制KinA的功能
  kipA   BG11214  kip操纵子转录的控制因子
  rapA   BG10652  通过磷酸化Spo0F的去磷酸化抑制磷酸中继***的天冬氨酸磷酸酶A
  phrA   BG10653  天冬氨酸磷酸酶A(RapA)活性的抑制因子
  soj   BG10055  参与抑制细胞周期和复制起始的Soj蛋白质
  spo0J   BG10054  0期芽孢形成蛋白质J。抑制Soj的功能
  sigH   BG10159  对数期和静止期早期的RNA聚合酶sigma H因子
  sigF   BG10298  RNA聚合酶芽孢形成-特异性sigma F因子
  sigE   BG10235  RNA聚合酶芽孢形成-特异性sigma E因子
  spoIIAA   BG10296  抗-抗-sigma因子(SpoIIAB的拮抗剂)
  spoIIAB   BG10297  抗-sigma因子(抑制sigma F)
  spoIIE   BG10127  参与不对称隔膜形成的PP2C丝氨酸磷酸酶(活化sigmaF)
  spoIIR   BG10937  II期芽孢形成蛋白质R(活化SpoIIGA)
  spoIIGA   BG10234  通过加工Prosigma E来参与活性sigma E的生成的蛋白酶
  sigG   BG10236   RNA聚合酶芽孢形成-特异性sigma G因子
  spoIIIC   BG10919   RNA聚合酶芽孢形成-特异性sigma K因子(C-端侧)
  spoIVCB   BG10459   RNA聚合酶芽孢形成-特异性sigma K因子(N-端侧)
  rsiX   BG10537   抗-sigma X蛋白质(抑制sigma X因子)
  yacP   BG10158   功能未知的基因
  yvdE   BG12414   疑似转录因子(LacI家族)
  yurK   BG13997   疑似转录因子(GntR家族)
  yhdQ   BG13023   活化铜离子转运***操纵子(copZA)的转录的因子
  glcT   BG12593   表达ptsGHI操纵子必需的抗转录终止因子
比较例4评价碱性纤维素酶的分泌和产生
在比较例3中构建的ΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株、ΔyhdQ株和ΔglcT株的碱性纤维素酶的分泌生产率的评价通过与实施例5相同的方式进行。作为对照，对枯草杆菌168株也进行评价。结果，如表7所示，观察到ΔyacP株、ΔyvdE株、ΔyurK株和ΔglcT株的生产率高于野生株的生产率，而ΔyhdQ株的生产率则稍有下降。而且，在比较例3中构建的ΔsigFΔyacP株、ΔsigFΔyvdE株、ΔsigFΔyurK株、ΔsigFΔyhdQ株和ΔsigFΔglcT株的碱性纤维素酶的分泌生产率的评价通过与实施例5相同的方式进行。作为对照，对枯草杆菌158株和实施例1中构建的ΔsigF株也进行评价。结果，如表8所示，任何构建的菌株的纤维素酶生产率均低于ΔsigF株的生产率。换句话说，有力地表明，当与芽孢形成相关基因的缺失结合时表现出产生异源蛋白质的协同作用，是与增强secY基因的表达结合的特征。
[表7]
  纤维素酶活性(相对值，％)
  168   100
  ΔyacP   156
  ΔyvdE   109
  ΔyurK   118
  ΔyhdQ   97
  ΔglcT   110
[表8]
  纤维素酶活性(相对值，％)
  168   100
  ΔsigF   161
  ΔsigFΔyacP   154
  ΔsigFΔyvdE   147
  ΔsigFΔyurk   158
  ΔsigFΔyhdQ   154
  ΔsigFΔglcT   151
序列表
<110>花王株式会社
<120>重组微生物
<130>
<150>JP2007-102940
<151>2007-04-10
<160>85
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1296
<212>DNA
<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1296)
<400>1
ttg ttt aaa aca atc tcc aac ttt atg cgt gtg agt gat atc agg aat     48
Met Phe Lys Thr Ile Ser Asn Phe Met Arg Val Ser Asp Ile Arg Asn
1               5                   10                  15
aaa atc ata ttc act tta ctc atg ctt atc gtc ttt cgc ata ggt gcg     96
Lys Ile Ile Phe Thr Leu Leu Met Leu Ile Val Phe Arg Ile Gly Ala
            20                  25                  30
ttt att cct gtg cct tac gtt aac gct gaa gcg tta cag gca cag tct    144
Phe Ile Pro Val Pro Tyr Val Asn Ala Glu Ala Leu Gln Ala Gln Ser
        35                  40                  45
caa atg ggt gtt ttt gat ctc ctt aat aca ttt ggc ggc ggt gcg ctt    192
Gln Met Gly Val Phe Asp Leu Leu Asn Thr Phe Gly Gly Gly Ala Leu
    50                  55                  60
tac caa ttt tcc att ttc gca atg gga att act cct tat atc acg gct    240
Tyr Gln Phe Ser Ile Phe Ala Met Gly Ile Thr Pro Tyr Ile Thr Ala
65                  70                  75                  80
tcg atc atc att cag ctg ctt cag atg gat gtg gta ccg aag ttt acc    288
Ser Ile Ile Ile Gln Leu Leu Gln Met Asp Val Val Pro Lys Phe Thr
                85                  90                  95
gag tgg tct aag caa ggt gaa gtt ggc cgc cgt aaa tta gct cag ttc    336
Glu Trp Ser Lys Gln Gly Glu Val Gly Arg Arg Lys Leu Ala Gln Phe
            100                 105                 110
aca agg tac ttt acg att gtg ctt ggt ttc atc caa gcg tta ggt atg    384
Thr Arg Tyr Phe Thr Ile Val Leu Gly Phe Ile Gln Ala Leu Gly Met
        115                 120                 125
tca tat gga ttc aac aat ctg gca aac ggt atg ctg atc gaa aaa tcc    432
Ser Tyr Gly Phe Asn Asn Leu Ala Asn Gly Met Leu Ile Glu Lys Ser
    130                 135                 140
ggt gta tcg aca tat ctt atc att gct tta gtg ctc act ggc gga act    480
Gly Val Ser Thr Tyr Leu Ile Ile Ala Leu Val Leu Thr Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
gcc ttt tta atg tgg ctt ggg gaa caa att act tct cat gga gta ggc    528
Ala Phe Leu Met Trp Leu Gly Glu Gln Ile Thr Ser His Gly Val Gly
                165                 170                 175
aac gga ata tcg atc att atc ttc gcg ggg att gtg tct agt att cca    576
Asn Gly Ile Ser Ile Ile Ile Phe Ala Gly Ile Val Ser Ser Ile Pro
            180                 185                 190
aaa aca att ggg caa ata tat gag act caa ttt gtc ggc agc aac gat    624
Lys Thr Ile Gly Gln Ile Tyr Glu Thr Gln Phe Val Gly Ser Asn Asp
        195                 200                 205
cag ttg ttt att cat att gtg aaa gtc gca ctt ctt gtg att gcg att    672
Gln Leu Phe Ile His Ile Val Lys Val Ala Leu Leu Val Ile Ala Ile
    210                 215                 220
tta gca gtt att gtt gga gtt att ttc att cag caa gcc gta cgg aaa    720
Leu Ala Val Ile Val Gly Val Ile Phe Ile Gln Gln Ala Val Arg Lys
225                 230                 235                 240
att gcg att caa tat gct aaa ggc aca ggt cgt tca cct gct ggc gga    768
Ile Ala Ile Gln Tyr Ala Lys Gly Thr Gly Arg Ser Pro Ala Gly Gly
                245                 250                 255
ggt cag tct aca cac ctt cca ttg aaa gtg aat cct gca ggg gtt att    816
Gly Gln Ser Thr His Leu Pro Leu Lys Val Asn Pro Ala Gly Val Ile
            260                 265                 270
ccg gta atc ttt gcg gtt gcg ttt ttg ata acg ccg cgg acg atc gcg    864
Pro Val Ile Phe Ala Val Ala Phe Leu Ile Thr Pro Arg Thr Ile Ala
        275                 280                 285
tca ttc ttt gga aca aac gat gtg aca aag tgg att caa aac aac ttt    912
Ser Phe Phe Gly Thr Asn Asp Val Thr Lys Trp Ile Gln Asn Asn Phe
    290                 295                 300
gat aat acg cat ccg gtg ggt atg gcg ata tat gtt gcg ttg att att     960
Asp Asn Thr His Pro Val Gly Met Ala Ile Tyr Val Ala Leu Ile Ile
305                 310                 315                 320
gcc ttt acg tac ttt tat gct ttt gta cag gta aac cct gaa caa atg    1008
Ala Phe Thr Tyr Phe Tyr Ala Phe Val Gln Val Asn Pro Glu Gln Met
                325                 330                 335
gct gat aac ctt aaa aaa cag ggt ggc tat atc ccg ggg gtt cgt cca    1056
Ala Asp Asn Leu Lys Lys Gln Gly Gly Tyr Ile Pro Gly Val Arg Pro
            340                 345                 350
ggg aaa atg act caa gat aga att acg agc att ttg tat cga ctt acg    1104
Gly Lys Met Thr Gln Asp Arg Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Arg Leu Thr
        355                 360                 365
ttt gtg ggt tct ata ttc tta gcc gtg att tcc att ctt cct atc ttt    1152
Phe Val Gly Ser Ile Phe Leu Ala Val Ile Ser Ile Leu Pro Ile Phe
    370                 375                 380
ttc att caa ttc gct gga ttg cct caa agt gca caa att ggc gga aca    1200
Phe Ile Gln Phe Ala Gly Leu Pro Gln Ser Ala Gln Ile Gly Gly Thr
385                 390                 395                 400
tct ttg tta att gtt gtc ggg gta gcc ttg gag aca atg aaa caa cta    1248
Ser Leu Leu Ile Val Val Gly Val Ala Leu Glu Thr Met Lys Gln Leu
                405                 410                 415
gaa agc cag ttg gtg aaa cga aac tac cgt gga ttt atg aaa aac tag    1296
Glu Ser Gln Leu Val Lys Arg Asn Tyr Arg Gly Phe Met Lys Asn
            420                 425                 430
<210>2
<211>431
<212>PRT
<213>枯草杆菌
<400>2
Met Phe Lys Thr Ile Ser Asn Phe Met Arg Val Ser Asp Ile Arg Asn
1               5                   10                  15
Lys Ile Ile Phe Thr Leu Leu Met Leu Ile Val Phe Arg Ile Gly Ala
            20                  25                  30
Phe Ile Pro Val Pro Tyr Val Asn Ala Glu Ala Leu Gln Ala Gln Ser
        35                  40                  45
Gln Met Gly Val Phe Asp Leu Leu Asn Thr Phe Gly Gly Gly Ala Leu
    50                  55                  60
Tyr Gln Phe Ser Ile Phe Ala Met Gly Ile Thr Pro Tyr Ile Thr Ala
65                  70                  75                  80
Ser Ile Ile Ile Gln Leu Leu Gln Met Asp Val Val Pro Lys Phe Thr
                85                  90                  95
Glu Trp Ser Lys Gln Gly Glu Val Gly Arg Arg Lys Leu Ala Gln Phe
            100                 105                 110
Thr Arg Tyr Phe Thr Ile Val Leu Gly Phe Ile Gln Ala Leu Gly Met
        115                 120                 125
Ser Tyr Gly Phe Asn Asn Leu Ala Asn Gly Met Leu Ile Glu Lys Ser
    130                 135                 140
Gly Val Ser Thr Tyr Leu Ile Ile Ala Leu Val Leu Thr Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Phe Leu Met Trp Leu Gly Glu Gln Ile Thr Ser His Gly Val Gly
                165                 170                 175
Asn Gly Ile Ser Ile Ile Ile Phe Ala Gly Ile Val Ser Ser Ile Pro
            180                 185                 190
Lys Thr Ile Gly Gln Ile Tyr Glu Thr Gln Phe Val Gly Ser Asn Asp
        195                 200                 205
Gln Leu Phe Ile His Ile Val Lys Val Ala Leu Leu Val Ile Ala Ile
    210                 215                 220
Leu Ala Val Ile Val Gly Val Ile Phe Ile Gln Gln Ala Val Arg Lys
225                 230                 235                 240
Ile Ala Ile Gln Tyr Ala Lys Gly Thr Gly Arg Ser Pro Ala Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Gln Ser Thr His Leu Pro Leu Lys Val Asn Pro Ala Gly Val Ile
            260                 265                 270
Pro Val Ile Phe Ala Val Ala Phe Leu Ile Thr Pro Arg Thr Ile Ala
        275                 280                 285
Ser Phe Phe Gly Thr Asn Asp Val Thr Lys Trp Ile Gln Asn Asn Phe
    290                 295                 300
Asp Asn Thr His Pro Val Gly Met Ala Ile Tyr Val Ala Leu Ile Ile
305                 310                 315                 320
Ala Phe Thr Tyr Phe Tyr Ala Phe Val Gln Val Asn Pro Glu Gln Met
                325                 330                 335
Ala Asp Asn Leu Lys Lys Gln Gly Gly Tyr Ile Pro Gly Val Arg Pro
            340                 345                 350
Gly Lys Met Thr Gln Asp Arg Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Arg Leu Thr
        355                 360                 365
Phe Val Gly Ser Ile Phe Leu Ala Val Ile Ser Ile Leu Pro Ile Phe
    370                 375                 380
Phe Ile Gln Phe Ala Gly Leu Pro Gln Ser Ala Gln Ile Gly Gly Thr
385                 390                 395                 400
Ser Leu Leu Ile Val Val Gly Val Ala Leu Glu Thr Met Lys Gln Leu
                405                 410                 415
Glu Ser Gln Leu Val Lys Arg Asn Tyr Arg Gly Phe Met Lys Asn
            420                 425                 430
<210>3
<211>1140
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属KSM-K16
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1140)
<400>3
atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc att     48
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
  1               5                  10                  15
tct gtt gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct gct gag gaa gca aaa     96
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys
             20                  25                  30
gaa aaa tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa gca gtt agt gag ttt    144
Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe
         35                  40                  45
gta gag caa ata gag gca aat gac gat gtc gcg att ctc tct gag gaa    192
Val Glu Gln Ile Glu Ala Asn Asp Asp Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu
     50                  55                  60
gag gaa gtc gaa att gaa ttg ctt cat gag ttt gaa acg att cct gtt    240
Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val
 65                  70                  75                  80
tta tct gtt gag tta agt cca gaa gat gtg gac gcg ctt gag ctc gat    288
Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp
                 85                  90                  95
cca acg att tcg tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg    336
Pro Thr Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala
            100                 105                 110
caa tca gtg cca tgg gga att agc cgt gta caa gcc cca gct gcc cat    384
Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His
        115                 120                 125
aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat acg    432
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
    130                 135                 140
ggt att tcc acc cat cca gac tta aat att cgc ggt ggt gct agc ttt    480
Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
145                 150                 155                 160
gtg cca gga gaa cca tcc act caa gat gga aat gga cat ggc acg cat    528
Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His
                165                 170                 175
gtg gca ggg acg att gct gct tta aac aat tcg att ggc gtt ctg ggc    576
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
            180                 185                 190
gta gca ccg agc gcg gaa cta tac gct gta aaa gta tta ggc gcg agc    624
Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser
        195                 200                 205
ggt tca ggt tcg gtc agc tcg att gcc caa gga ttg gaa tgg gca ggg    672
Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly
    210                 215                 220
aac aat ggc atg cac gtt gcg aat ttg agt tta gga agc ccg tcg ccg    720
Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro
225                 230                 235                 240
agt gca aca ctt gag caa gct gtt aat agc gct act tct aga ggc gtt    768
Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
                245                 250                 255
ctt gtc gta gca gca tct ggt aat tca ggt gca ggc tca atc agc tat    816
Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr
            260                 265                 270
ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc gga gcg act gac caa aac    864
Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn
        275                 280                 285
aac aac cgc gct agc ttt tca cag tat gga gct ggg ctt gac att gtc    912
Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
    290                 295                 300
gcg cca ggt gtc aat gtg cag agc aca tac cca ggt tca aca tat gcc    960
Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala
305                 310                 315                 320
agc tta aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gtt gca ggt gta gca   1008
Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala
                325                 330                 335
gcc ctt gtt aaa caa aag aat cca tct tgg tcc aat gta caa atc cgc    1056
Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg
            340                 345                 350
aat cat cta aag aat acg gca acg ggt tta gga aac acg aac ttg tat    1104
Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Gly Leu Gly Asn Thr Asn Leu Tyr
        355                 360                 365
gga agc ggg ctt gtc aat gca gaa gcg gca aca cgc                    1140
Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
    370                 375                 380
<210>4
<211>380
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-K16
<400>4
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
  1               5                  10                  15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys
             20                  25                  30
Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe
         35                  40                  45
Val Glu Gln Ile Glu Ala Asn Asp Asp Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu
     50                  55                  60
Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp
                 85                  90                  95
Pro Thr Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala
            100                 105                 110
Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His
        115                 120                 125
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
    130                 135                 140
Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
145                 150                 155                 160
Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His
                165                 170                 175
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
            180                 185                 190
Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser
        195                 200                 205
Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly
    210                 215                 220
Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro
225                 230                 235                 240
Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
                245                 250                 255
Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr
            260                 265                 270
Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn
        275                 280                 285
Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
    290                 295                 300
Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala
                325                 330                 335
Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg
            340                 345                 350
Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Gly Leu Gly Asn Thr Asn Leu Tyr
        355                 360                 365
Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
    370                 375                 380
<210>5
<211>3150
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属KSM-S237
<220>
<221>CDS
<222>(573)..(3044)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(573)..(659)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(660)..(3044)
<400>5
gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa     60
taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt    120
gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac    180
gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata    240
aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa    300
tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat    360
gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta    420
gtaataatat agataactta taagttgttg agaagcagga gagcatctgg gttactcaca    480
agttttttta aaactttaac gaaagcactt tcggtaatgc ttatgaattt agctatttga    540
ttcaattact ttaaaaatat ttaggaggta at atg atg tta aga aag aaa aca      593
                                    Met Met Leu Arg Lys Lys Thr
                                                    -25
aag cag ttg att tct tcc att ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta      641
Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu
        -20                 -15                 -10
ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt      689
Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala G1u Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe
    -5              -1  1               5                   10
aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc      737
Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly
                15                  20                  25
gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga caa atg aca tta gta gat caa      785
Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln
            30                  35                  40
cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga atg agt aca cac gga tta cag     833
His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln
        45                  50                  55
tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac gca tac aaa gct ctt tct aac     881
Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn
    60                  65                  70
gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt gct atg tat gta ggt gaa aat     929
Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn
75                  80                  85                  90
ggg tac gct aca aac cct gag tta atc aaa caa aga gtg att gat gga     977
Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly
                95                  100                 105
att gag tta gcg att gaa aat gac atg tat gtt att gtt gac tgg cat    1025
Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His
            110                 115                 120
gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat cct gtt tat gca ggt gct aaa    1073
Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys
        125                 130                 135
gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta tac cct aat aat cca cac att    1121
Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile
    140                 145                 150
att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca    1169
Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala
155                 160                 165                 170
ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct    1217
Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala
                175                 180                 185
gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac    1265
Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn
            190                 195                 200
att atc att gtt ggt agt cca aac tgg agt cag cgt ccg gac tta gca    1313
Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala
        205                 210                 215
gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cac ttc    1361
Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe
    220                 225                 230
tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act    1409
Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr
235                 240                 245                 250
cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta    1457
Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu
                255                 260                 265
gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca gag tgg gga acg agt caa gct    1505
Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala
            270                 275                 280
agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gaa    1553
Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu
        285                 290                 295
ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat    1601
Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn
    300                 305                 310
aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct    1649
Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser
315                 320                 325                 330
aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca gat cat gtg tgg gca cca gaa    1697
Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro Asp His Val Trp Ala Pro Glu
                335                 340                 345
gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg    1745
Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val
            350                 355                 360
aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac    1793
Asn Tyr Glu Pro I1e Asp Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp
        365                 370                 375
ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt gga gtg aat tcg gat tct cca    1841
Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro
    380                 385                 390
aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat gaa aac aac act ttg aaa gtt    1889
Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val
395                 400                 405                 410
tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt tca gat ggc aac ttc tgg gct    1937
Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala
                415                 420                 425
aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg gga aaa agt gtt gat att tta    1985
Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu
            430                 435                 440
ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt att gtt gat gaa cca acg acg    2033
Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr
        445                 450                 455
gta gct att gcg gcg att cca caa agt agt aaa agt gga tgg gca aat    2081
Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn
    460                 465                 470
cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg gaa gat ttt gtc cag caa acg    2129
Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr
475                 480                 485                 490
gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca att aca gga gaa gat gct cct    2177
Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro
                495                 500                 505
aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa gaa gat aac aat atg aac aac    2225
Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn
            510                 515                 520
atc att ctg ttc gtg gga act gat gca gct gac gtt att tac tta gat    2273
Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp
        525                 530                 535
aac att aaa gta att gga aca gaa gtt gaa att cca gtt gtt cat gat    2321
Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp
    540                 545                 550
cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct gtt ttt gaa gac ggt aca cgt    2369
Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg
555                 560                 565                 570
caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct ggt gtg aaa aca gct tta aca    2417
Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr
                575                 580                 585
att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg tta tca tgg gaa ttt gga tat    2465
Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr
            590                 595                 600
cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg gca aca gct cca cgt tta gat    2513
Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp
        605                 610                 615
ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt gag aat gat tat gta gct ttt    2561
Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe
    620                 625                 630
gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca aca gaa ggc gca atg aat atc    2609
Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile
635                 640                 645                 650
aat tta gta ttc cag cca cct act aac ggg tat tgg gta caa gca cca    2657
Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro
                655                 660                 665
aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa tta gag gaa gcg aat caa gta    2705
Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val
            670                 675                 680
aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa att aac gta aga gat att aca    2753
Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr
        685                 690                 695
aac att caa gat gac acg tta cta cgt aac atg atg atc att ttt gca    2801
Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala
    700                 705                 710
gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga gtc ttt gta gat aat gtt cgt    2849
Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg
715                 720                 725                 730
ttt gag ggg gct gct act act gag ccg gtt gaa cca gag cca gtt gat    2897
Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp
                735                 740                 745
cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat gag aag gaa gcg aaa aaa gaa    2945
Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu
            750                 755                 760
caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa gaa gca gta aaa gaa gaa aag    2993
Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys
        765                 770                 775
aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca gtc aaa aat gag gct aag aaa    3041
Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys
    780                 785                 790
aaa taatctatta aactagttat agggttatct aaaggtctga tgtagatctt         3094
Lys
795
ttagataacc tttttcttgc ataactggac acagagttgt tattaaagaa agtaag      3150
<210>6
<211>824
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-S237
<400>6
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
                -25                 -20                 -15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly
            -10                 -5              -1  1
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
    5                   10                  15
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
20                  25                  30                  35
Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
                40                  45                  50
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
            55                  60                  65
Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu
        70                  75                  80
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile
    85                  90                  95
Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
100                 105                 110                 115
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
                120                 125                 130
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu
            135                 140                 145
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        150                 155                 160
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    165                 170                 175
Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys
180                 185                 190                 195
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
                200                 205                 210
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            215                 220                 225
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        230                 235                 240
Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    245                 250                 255
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
260                 265                 270                 275
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
                280                 285                 290
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            295                 300                 305
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        310                 315                 320
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
    325                 330                 335
Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
340                 345                 350                 355
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
                360                 365                 370
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            375                 380                 385
Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn
        390                 395                 400
Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
    405                 410                 415
Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
420                 425                 430                 435
Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val
                440                 445                 450
Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser
            455                 460                 465
Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala
        470                 475                 480
Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr
    485                 490                 495
Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu
500                 505                 510                 515
Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala
                520                 525                 530
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
            535                 540                 545
Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
        550                 555                 560
Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
    565                 570                 575
Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
580                 585                 590                 595
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
                600                 605                 610
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
            615                 620                 625
Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
        630                 635                 640
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
    645                 650                 655
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
660                 665                 670                 675
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
                680                 685                 690
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
            695                 700                 705
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
        710                 715                 720
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
    725                 730                 735
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
740                 745                 750                 755
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
                760                 765                 770
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
            775                 780                 785
Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys
        790                 795
<2l0>7
<211>3332
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属KSM-64
<220>
<221>CDS
<222>(610)..(3075)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(610)..(696)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(697)..(3075)
<400>7
agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg     60
cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt    120
cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca    180
acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta    240
tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc    300
tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa    360
atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc    420
tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat    480
aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga    540
aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta    600
ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att    651
          Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile
                          -25                 -20
ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg aca gct ctt gca gca      699
Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala
-15                 -10                 -5              -1  1
gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac      747
Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp
            5                   10                  15
aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc      795
Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val
        20                  25                  30
gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta      843
Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu
    35                  40                  45
cgt gga atg agt aca cac gga tta caa tgg ttt cct gag atc ttg aat      891
Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn
50                  55                  60                  65
gat aac gca tac aaa gct ctt gct aac gat tgg gaa tca aat atg att      939
Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile
                70                  75                  80
cgt cta gct atg tat gtc ggt gaa aat ggc tat gct tca aat cca gag      987
Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu
            85                  90                  95
tta att aaa agc aga gtc att aaa gga ata gat ctt gct att gaa aat     1035
Leu Ile Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn
        100                 105                 110
gac atg tat gtc atc gtt gat tgg cat gta cat gca cct ggt gat cct     1083
Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro
    115                 120                 125
aga gat ccc gtt tac gct gga gca gaa gat ttc ttt aga gat att gca    1131
Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala
130                 135                 140                 145
gca tta tat cct aac aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag    1179
Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu
                150                 155                 160
cca agt agt aac aat aat ggt gga gct ggg att cca aat aat gaa gaa    1227
Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu
            165                 170                 175
ggt tgg aat gcg gta aaa gaa tac gct gat cca att gta gaa atg tta    1275
Gly Trp Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu
        180                 185                 190
cgt gat agc ggg aac gca gat gac aat att atc att gtg ggt agt cca    1323
Arg Asp Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro
    195                 200                 205
aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat gat    1371
Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp
210                 215                 220                 225
cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct    1419
His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala
                230                 235                 240
tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac    1467
Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn
            245                 250                 255
gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta ttt    1515
Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe
        260                 265                 270
gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct tac    1563
Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr
    275                 280                 285
ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att    1611
Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile
290                 295                 300                 305
agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca    1659
Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala
                310                 315                 320
ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac cca    1707
Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro
            325                 330                 335
ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa    1755
Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu
        340                 345                 350
tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt    1803
Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg
    355                 360                 365
aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa    1851
Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln
370                 375                 380                 385
gga ttt gga gtg aat gga gat tct cca gtt gaa gat gta gtt att gag    1899
Gly Phe Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu
                390                 395                 400
aat gaa gcg ggc gct tta aaa ctt tca gga tta gat gca agt aat gat    1947
Asn Glu Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp
            405                 410                 415
gtt tct gaa ggt aat tac tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc gac ggt    1995
Val Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly
        420                 425                 430
tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gaa aaa ctt act atg gat    2043
Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp
    435                 440                 445
gtg att gtt gat gag ccg acc acg gta tca att gct gca att cca caa    2091
Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln
450                 455                 460                 465
ggg cca tca gcc aat tgg gtt aat cca aat cgt gca att aag gtt gag    2139
Gly Pro Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu
                470                 475                 480
cca act aat ttc gta ccg tta gga gat aag ttt aaa gcg gaa tta act    2187
Pro Thr Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr
            485                 490                 495
ata act tca gct gac tct cca tcg tta gaa gct att gcg atg cat gct    2235
Ile Thr Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala
        500                 505                 510
gaa aat aac aac atc aac aac atc att ctt ttt gta gga act gaa ggt    2283
Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly
    515                 520                 525
gct gat gtt atc tat tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt    2331
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
530                 535                 540                 545
gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct    2379
Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
                550                 555                 560
gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct    2427
Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
            565                 570                 575
ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg    2475
Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
        580                 585                 590
tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg    2523
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
    595                 600                 605
gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt    2571
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
610                 615                 620                 625
gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca    2619
Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
                630                 635                 640
aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac    2667
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
            645                 650                 655
ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa    2715
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
        660                 665                 670
tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa    2763
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
    675                 680                 685
att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt    2811
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
690                 695                 700                 705
aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga    2859
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
                710                 715                 720
gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg    2907
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
            725                 730                 735
gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg cct gtc gat    2955
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
        740                 745                 750
gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa    3003
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
    755                 760                 765
gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca    3051
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
770                 775                 780                 785
atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctaata aactagttat agggttatct   3105
Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys
                790
aaaggtctga tgcagatctt ttagataacc tttttttgca taactggaca tagaatggtt  3165
attaaagaaa gcaaggtgtt tatacgatat taaaaaggta gcgattttaa attgaaacct  3225
ttaataatgt cttgtgatag aatgatgaag taatttaaga gggggaaacg aagtgaaaac  3285
ggaaatttct agtagaagaa aaacagacca agaaatactg caagctt                3332
<210>8
<211>822
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-64
<400>8
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
                -25                 -20                 -15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly
            -10                 -5              -1  1
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
    5                   10                  15
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
20                  25                  30                  35
Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
                40                  45                  50
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
            55                  60                  65
Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile Arg Leu
        70                  75                  80
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu Leu Ile
    85                  90                  95
Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
100                 105                 110                 115
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
                120                 125                 130
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu
            135                 140                 145
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        150                 155                 160
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    165                 170                 175
Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp
180                 185                 190                 195
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
                200                 205                 210
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            215                 220                 225
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        230                 235                 240
Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    245                 250                 255
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
260                 265                 270                 275
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
                280                 285                 290
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            295                 300                 305
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        310                 315                 320
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro
    325                 330                 335
Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
340                 345                 350                 355
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
                360                 365                 370
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            375                 380                 385
Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu Asn Glu
        390                 395                 400
Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp Val Ser
    405                 410                 415
Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly Trp Gly
420                 425                 430                 435
Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile
                440                 445                 450
Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly Pro
            455                 460                 465
Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu Pro Thr
        470                 475                 480
Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr Ile Thr
    485                 490                 495
Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala Glu Asn
500                 505                 510                 515
Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly Ala Asp
                520                 525                 530
Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile
            535                 540                 545
Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe
        550                 555                 560
Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val
    565                 570                 575
Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser
580                 585                 590                 595
Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr
                600                 605                 610
Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn
            615                 620                 625
Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu
        630                 635                 640
Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr
    645                 650                 655
Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu
660                 665                 670                 675
Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn
                680                 685                 690
Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met
            695                 700                 705
Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe
        710                 715                 720
Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu
    725                 730                 735
Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys
740                 745                 750                 755
Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala
                760                 765                 770
Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ile Lys
            775                 780                 785
Asn Glu Ala Thr Lys Lys
        790
<210>9
<211>230
<212>DNA
<213>枯草杆菌
<400>9
gttagtcgag atcgaagtta ttgcactggt gaaataataa gaaaagtgat tctgggagag     60
ccgggatcac ttttttattt accttatgcc cgaaatgaaa gctttatgac ctaattgtgt    120
aactatatcc tattttttca aaaaatattt taaaaacgag caggatttca gaaaaaatcg    180
tggaattgat acactaatgc ttttatatag ggaaaaggtg gtgaactact               230
<210>10
<21l>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因spoVG的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>10
gttagtcgag atcgaagtta                                                20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因spoVG的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>11
agtagttcac caccttttcc                                                20
<210>12
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因secY的核苷酸序列设计，且5’-部分由枯
草杆菌基因spoVG的5’-侧翼区的核苷酸序列设计
<400>12
ggaaaaggtg gtgaactact atgttgttta aaacaatctc caa                       43
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因secY的核苷酸序列设计，且5’-部分由氯
霉素抗性基因的核苷酸序列设计
<400>13
atgggtgctt tagttgaaga ctagtttttc ataaatccac                           40
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为扩增氯霉素抗性基因用的正向PCR引物的寡核苷酸
<400>14
caactaaagc acccattag                                                  19
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为扩增氯霉素抗性基因用的正向PCR引物的寡核苷酸
<400>15
cttcaactaa cggggcag                                                   18
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因spoVG的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>16
taagaaaagt gattctggga                                       20
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为扩增氯霉素抗性基因用的反向PCR引物的寡核苷酸
<400>17
ctcatattat aaaagccagt c                                     21
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>18
ggagtgtcaa gaatgtttgc                                       20
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计，且5’-部分由枯
草杆菌基因spoVG的5’-侧翼区的核苷酸序列设计
<400>19
tcccagaatc acttttctta atcatcgctc atccatgtcg                 40
<210>20
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计，且5’-部分由氯
霉素抗性基因的核苷酸序列设计
<400>20
gactggcttt tataatatga ggtttaggct gggcggtgat a               41
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>21
tcaatgggga agagaacc                          18
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>22
tcaaaacctc tttactgccg                        20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因amyE的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>23
cacgtaatca aagccaggct                        20
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为用于从pDG1727扩增壮观霉素抗性基因的正向PCR引物的寡核苷酸
<400>24
atcgattttc gttcgtg                           17
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为用于从pDG1727扩增壮观霉素抗性基因的反向PCR引物的寡核苷酸
<400>25
catatgcaag ggtttattg                           19
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigF的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>26
gaagaaagcc gggtttatca                          20
<210>27
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因sigF的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且5’-
部分由质粒pDG1727的核苷酸序列设计
<400>27
cacgaacgaa aatcgatctg agcgtttttg ccgtttt       37
<210>28
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因sigF的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pDG1727的核苷酸序列设计
<400>28
caataaaccc ttgcatatgt ctgcagtgca ggctagctt     39
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigF的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>29
cccgacgaac aaacctgcca                                      20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigF的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>30
cgaatgacca ctagttttgt                                      20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigF的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>31
tgaagcgtct cccatccccc                                      20
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigE的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>32
agtcagatgt gaaaatctat t                                    21
<210>33
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因sigE的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pDG1727的核苷酸序列设计
<400>33
cacgaacgaa aatcgatctt cctctccctt ctaaatg           37
<210>34
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因sigE的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pDG1727的核苷酸序列设计
<400>34
caataaaccc ttgcatatga aaattttatg gttagaaccc        40
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigE的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>35
ccttactttt tccaaaacgt                              20
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigE的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>36
ctcacggcat ttattttaaa a                            21
<210>37
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因sigE的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>37
gcttttcatt attgatgaat at                              22
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因phrA的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>38
agaagaccaa gatttgctgc                                 20
<210>39
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因phrA的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且5’-
部分由质粒pDG1727的核苷酸序列设计
<400>39
cacgaacgaa aatcgatatg aaatgttttc ccttctg              37
<210>40
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因phrA的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pDG1727的核苷酸序列设计
<400>40
caataaaccc ttgcatatgg gttcatgcag gtgaaac               37
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因phrA的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>41
actggccccg tgtgatgcgg                                       20
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因phrA的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>42
gagttttcag aattgttaga a                                     21
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因phrA的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>43
gaagagactg cagcttttt                                        19
<210>44
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16碱性蛋白酶基因的核苷酸序列和芽孢
杆菌属KSM-S237碱性纤维素酶基因的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>44
actttaaaaa tatttaggag gtaatatgaa gaaaccgttg gggaaa          46
<210>45
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由克劳氏芽孢杆菌KSM-K16碱性蛋白酶基因下游区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核
苷酸
<400>45
gggagatctt cagcgatcta tttctctttt tc                           32
<210>46
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由芽孢杆菌属KSM-S237碱性纤维素酶基因上游区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷
酸
<400>46
cccggatcca acaggcttat attta                                   25
<210>47
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由芽孢杆菌属KSM-S237碱性纤维素酶基因的核苷酸序列和克劳氏芽孢杆菌KSM-K16碱性
蛋白酶基因的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>47
tttccccaac ggtttcttca tattacctcc taaatatttt taaagt            46
<210>48
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由芽孢杆菌属KSM-S237中碱性纤维素酶基因的上游区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡
核苷酸，其中在5’-端***有BamHI限制性内切酶位点
<400>48
ttgcggatcc aacaggctta tatttagagg aaatttc                      37
<210>49
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由芽孢杆菌属KSM-S237中碱性纤维素酶基因的下游区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡
核苷酸，其中在5’-端***有BamHI限制性内切酶位点
<400>49
ttgcggatcc aacaactctg tgtccagtta tgcaag                36
<210>50
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因rsiX的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>50
attccagtta ctcgtaatat agttg                            25
<210>51
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因rsiX的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>51
ctaatgggtg ctttagttga cttcatcatc cattagctc             39
<210>52
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因rsiX的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>52
ctgccccgtt agttgaagct gctccaaatc cgatttcc              38
<210>53
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因rsiX的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>53
gtcctgcatt tttcgaagtc tgg                              23
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因rsiX的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>54
actccgggtc tggcataccg                                   20
<210>55
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因rsiX的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>55
acatctggaa gataaaattg t                                  21
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yacP的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>56
caggctgaga tcctattttt                                    20
<210>57
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yacP的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>57
ctaatgggtg ctttagttgg ggtctttatt ctcccacag                  39
<210>58
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yacP的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>58
ctgccccgtt agttgaaggt tgacgctttt ttgcccaa                   38
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yacP的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>59
acgcatgtaa aagacctcca                                       20
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yacP的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>60
gaggcagaaa tgccaagtca                             20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yacP的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>61
ttgcaagtac tgcagtattt                             20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yvdE的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>62
cttcctccat taaaaagccg                             20
<210>63
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yvdE的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>63
ctaatgggtg ctttagttgt ttcatcccct ccttatctg        39
<210>64
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yvdE的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>64
ctgccccgtt agttgaaggc gccttattct gttatcgg         38
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yvdE的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>65
cggcatatca gctgtaaaag                             20
<210>66
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yvdE的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>66
tttcatccat ttttctgcat c                           21
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yvdE的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>67
cagtccttat agcgggattg                             20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yurK的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>68
cttcagccgc tttgcttttt                            20
<210>69
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yurK的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>69
ctaatgggtg ctttagttga gggtagcctc cttttaacc       39
<210>70
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yurK的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>70
ctgccccgtt agttgaagca ggcataaaaa acgagaca        38
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yurK的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>71
gtcctgctgg cggggttaac                            20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yurK的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>72
tgctgctgtt ctatgatgcc                             20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yurK的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>73
ttgtccgcgg gattgcaagc                             20
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yhdQ的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>74
tcacaaatcc aagcgttcga                             20
<210>75
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yhdQ的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>75
ctaatgggtg ctttagttgc acgttatagt tatgagaata       40
<210>76
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因yhdQ的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>76
ctgccccgtt agttgaagaa ccattttatc taacaggag         39
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yhdQ的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>77
tgtggaccct ctctttttgc                              20
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yhdQ的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>78
gtccaatccg atatacccga                              20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因yhdQ的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>79
agggttgacg aattgagaaa                            20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因glcT的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>80
aagccggtgt ctctgttaca                            20
<210>81
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因glcT的5’-侧翼区的核苷酸序列设计，且
5’-部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>81
ctaatgggtg ctttagttgt caatacctca tatcgtaca       39
<210>82
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为PCR引物的寡核苷酸，3’-部分由枯草杆菌基因glcT的3’-侧翼区的核苷酸序列设计，且5’-
部分由质粒pC194的核苷酸序列设计
<400>82
ctgccccgtt agttgaagaa tttcataaat tcagtttatc c    41
<210>83
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因glcT的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>83
cttatagctg aagaattcat a                   21
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因glcT的5’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>84
aaaaagagtg tttgaggcaa                    20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>作为由枯草杆菌基因glcT的3’-侧翼区的核苷酸序列设计的PCR引物的寡核苷酸
<400>85
gttcaatcac cccgaagata                    20

Claims (9)

1.一种重组微生物，其通过将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物中而获得，所述微生物通过如下方法获得：以遗传方式构建成过度表达枯草杆菌(Bacillus subtilis)的secY基因，并使选自芽孢形成相关基因中的一种或多种基因从基因组中缺失或灭活，
其中，所述微生物是枯草杆菌，
所述芽孢形成相关基因选自phrA、sigF和sigE基因。
2.一种重组微生物，其通过将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中而获得，所述微生物株通过如下方法获得：将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点导入至枯草杆菌的secY基因的基因组的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者所述微生物株通过如下方法获得：导入一基因片段，并使选自芽孢形成相关基因的一种或多种基因缺失或灭活，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因的上游，
其中，所述微生物是枯草杆菌，
所述芽孢形成相关基因选自phrA、sigF和sigE基因。
3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点来源于枯草杆菌的spoVG基因。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组微生物，其中选自与基因的转录、翻译和分泌有关的控制区的任何一个或多个区连接在对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因的上游，
其中，与基因的转录、翻译和分泌有关的控制区包括：含有启动子和转录起始点的转录起始控制区、含核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始控制区、以及分泌信号肽区。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其中连接有所述转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号区这三个区。
6.根据权利要求4所述的重组微生物，其中所述分泌信号区来自枯草杆菌的纤维素酶基因，并且所述转录起始控制区和所述翻译起始控制区来自所述纤维素酶基因上游的大小为0.6-1kb的区。
7.根据权利要求4所述的重组微生物，其中所述转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号区这三个区形成由一定碱基序列构成的DNA片段，其中所述一定碱基序列为由SEQ ID NO：5所示的碱基序列的纤维素酶基因的1号碱基至659号碱基的碱基序列。
8.一种产生如权利要求1所述的重组微生物的方法，其包括：在微生物中，
将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点，导入至枯草杆菌的secY基因的基因组的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者导入一基因片段，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因的上游；
使选自芽孢形成相关基因的一种或多种基因缺失或灭活；和
将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中，
所述芽孢形成相关基因选自phrA、sigF和sigE基因。
9.一种使用根据权利要求1-7中任意一项所述的重组微生物产生所需的蛋白质或多肽的方法。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1985695T3 (da) 2006-02-16 2013-03-11 Kao Corp Rekombinant mikroorganisme
AR076941A1 (es) 2009-06-11 2011-07-20 Danisco Us Inc Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina
JP5512177B2 (ja) * 2009-07-06 2014-06-04 旭松食品株式会社 胞子形成能低下納豆菌株および該株を用いて製造した胞子数の少ない納豆
CN104073458B (zh) * 2013-03-26 2018-10-12 南京百斯杰生物工程有限公司 一株可高效表达外源分泌蛋白的枯草芽孢杆菌
GB201803398D0 (en) * 2018-03-02 2018-04-18 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Cambridge Methods for controlling gene expression
CN110129247B (zh) * 2019-05-13 2021-02-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 赖氨酸生产菌株的构建方法和应用
CN112941088B (zh) * 2021-02-04 2023-06-16 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1513057A (zh) * 2001-05-29 2004-07-14 ������������ʽ���� 宿主微生物
WO2006068148A1 (ja) * 2004-12-20 2006-06-29 Kao Corporation 組換え微生物
CN1875095A (zh) * 2003-11-07 2006-12-06 花王株式会社 重组微生物

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5028515B2 (zh) * 1971-09-30 1975-09-16
JPS6023158B2 (ja) 1981-03-05 1985-06-06 花王株式会社 洗浄剤組成物
GB2095275B (en) 1981-03-05 1985-08-07 Kao Corp Enzyme detergent composition
ES2060590T3 (es) * 1986-10-28 1994-12-01 Kao Corp Celulasas alcalinas y microorganismos para su produccion.
JPH0630578B2 (ja) 1986-10-28 1994-04-27 花王株式会社 アルカリセルラ−ゼｋ
US5726042A (en) * 1988-04-07 1998-03-10 Abbott Laboratories Expression of heterologous proteins in Bacillus megaterium utilizing sporulation promoters of Bacillus subtilis
JPH04190793A (ja) 1990-11-26 1992-07-09 Kao Corp セルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び組換え微生物によるセルラーゼの製造方法
IT1244477B (it) * 1990-12-21 1994-07-15 Eniricerche Spa Ceppo asporigeno di bacillus subtilis e suo impiego come ospite per la preparazione di prodotti eterologhi
AU8405698A (en) * 1997-07-15 1999-02-10 Genencor International B.V. Increasing production of proteins in gram-positive microorganisms
US20030157642A1 (en) * 1997-07-15 2003-08-21 Caldwell Robert M. Increasing production of proteins in gram-positive microorganisms
JP2000210081A (ja) 1999-01-21 2000-08-02 Kao Corp 耐熱性アルカリセルラ―ゼ遺伝子
JP4336082B2 (ja) * 2001-05-29 2009-09-30 花王株式会社 宿主微生物
CN1639183A (zh) * 2002-02-08 2005-07-13 金克克国际有限公司 克劳氏芽孢杆菌的分泌、转录和芽孢形成基因
JP4388272B2 (ja) * 2002-11-27 2009-12-24 花王株式会社 宿主微生物
DE10309557A1 (de) * 2003-03-04 2004-09-23 Henkel Kgaa Ein Translokationsenzym als Selektionsmarker
JP2005137308A (ja) * 2003-11-07 2005-06-02 Kao Corp 組換え微生物
JP2006296268A (ja) * 2005-04-19 2006-11-02 Kao Corp 組換え微生物
JP4839144B2 (ja) * 2005-07-22 2011-12-21 花王株式会社 宿主微生物
DK1985695T3 (da) * 2006-02-16 2013-03-11 Kao Corp Rekombinant mikroorganisme

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1513057A (zh) * 2001-05-29 2004-07-14 ������������ʽ���� 宿主微生物
CN1875095A (zh) * 2003-11-07 2006-12-06 花王株式会社 重组微生物
WO2006068148A1 (ja) * 2004-12-20 2006-06-29 Kao Corporation 組換え微生物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nathalie Campo等.subcellular sites for bacterial protein export.《molecular microbiology》.2004,第53卷(第6期), *
沈卫锋等.枯草芽孢杆菌作为外源基因表达***的研究进展.《浙江农业学报》.2005,第17卷(第4期), *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2008259432A (ja) 2008-10-30
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WO2008126929A1 (en) 2008-10-23
US20110151567A1 (en) 2011-06-23
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