JP5138851B2 - 触媒的に活性な組換えメマプシンおよびその使用方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、アルツハイマー病の治療および/または予防において有用な、特異的インヒビターの設計およびスクリーニングにおける触媒的に活性なメマプシン2(Memapsin 2)(ベータ−セクレターゼ)の発現およびその使用の分野に関する。
【0002】
アルツハイマー病(AD)は、認識能力が著しく低下し汎発性痴呆を有する患者の1人を調べたアリオス・アルツハイマー(Alios Alzheimer)によって1907年に最初に記載された脳の変性障害である(The early story of Alzheimer’s Disease, Bickら編(Raven Press, New York 1987))。ADは、高齢者の痴呆の主な原因である。AD患者は、記憶力低下、および正常な個体のように機能することができない程度にまで進行する知的機能に関して、深刻な問題を有する。知的能力の低下により、患者は、性格の変化、社会的にふさわしくない行動、および精神***病の様相を呈する(A Guide to the Understanding of Alzheimer’s Disease and Related Disorders, Jorm編(New York University Press, New York 1987))。この不可避な神経変性に対する有効な待期的または予防的治療法がないため、ADは罹患者およびその家族にとって大きな悲劇である。
【0003】
ADは、皮質、海馬、鉤状回、海馬傍回、および扁桃内の直径が200μmにもなる神経炎性斑(neuritic plaque)に関係している。神経炎性斑の主な構成要素の1つはアミロイドであり、これは、コンゴ レッド(Congo Red)によって染色される(Fisher (1983); Kelly Microbiol. Sci. 1(9):214−219(1984))。コンゴ レッドによって染色されたアミロイド斑は、細胞外であり、明視野においてピンク色または赤色であり、および偏光中では複屈折する。この斑は、ポリペプチド筋原線維から構成され、しばしば血管周辺に存在し、脳内の様々なニューロンへの血液供給を減少させる。
【0004】
遺伝的素因、感染因子、毒素、金属および頭部損傷などの様々な要因は全て、AD神経細胞障害の可能なメカニズムとして提唱されてきた。有力な証拠は、ADの遺伝的素因には異なるタイプが存在することを強力に裏付けている。まず、分子分析により、AD患者のいるある家族においてアミロイド前駆体タンパク質(APP)遺伝子における突然変異の証拠が得られた(Goateら,Nature 349:704−706(1991); Murrellら,Science 254:97−99(1991); Chartier−Harlinら,Nature 353:844−846(1991); Mullanら,Nature Genet. 1:345−347(1992))。早期発症ADの優性形態の更なる遺伝子は第14染色体および第1染色体上に存在する(Rogaevら,Nature 376:775−778(1995);Levy−Lahadら,Science 269:973−977(1995);Sherringtonら,Nature 375:754−760(1995))。ADに関係する他の遺伝子座は、第19染色体上にあり、アポリポタンパク質Eの異型をコードする(Corder, Science 261:921−923(1993))。
【0005】
アミロイド斑は、AD患者および40歳まで生き残っているダウン症患者において豊富に存在する。ダウン症におけるAPPの過剰発現は、30歳を超えたダウン症患者におけるADの発生の原因となりうることが認識されている(Rumbleら,New England J. Med. 320:1446−1452(1989));Mannら,Neurobiol. Aging 10:397−399(1989))。また斑は、数は少ないが、正常な高齢者の脳内にも存在する。これらの斑は主に、脳血管のアミロイド沈着物の中の主要なタンパク質成分でもあるアミロイドβペプチド(Aβ;文献中においてβ−アミロイドペプチドまたはβペプチドと呼ばれることもある)(GlennerおよびWong,Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885:890(1984))で構成されている。アミロイドは、β−プリーツシート状に配列される線維状物質である。Aβは、最長で43アミノ酸を含む疎水性ペプチドである。
【0006】
そのアミノ酸配列の決定により、APP cDNAがクローニングされた(Kangら,Nature 325:733−735(1987); Goldgaberら,Science 235:877−880(1987); Robakisら,Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4190−4194(1987); Tanziら,Nature 331:528:530(1988)およびゲノムAPP DNA(Lemaireら,Nucl. Acids Res. 17:517:522(1989); Yoshikaiら,Gene 87, 257−263(1990))。APP cDNAの多くの形態が同定されており、そのうち最も豊富な3つの形態は、APP695、APP751およびAPP770である。これらの形態は、単一の前駆体RNAからの選択的スプライシングによって発生する。この遺伝子は18個のエキソンを有する175kbを超える大きさである(Yoshikaiら, (1990))。APPは、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。Aβは、疎水性膜貫通ドメインのすぐ外側の最長で28個のアミノ酸と、最長で15残基からなるこの膜貫通ドメインとで構成される。Aβは通常、脳および他の組織(例えば心臓、腎臓および脾臓など)の中に見られる。しかしAβ沈着物は、通常は脳内のみに豊富に見られる。
【0007】
Van Broeckhavenら,Science 248:1120−1122(1990)は、APP遺伝子が2組のオランダ人家族におけるアミロイド症を伴う遺伝性脳出血(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis,HCHWA−D)と強く関連していることを示した。これは、2人のオランダ人患者におけるAPPコード領域の中の点突然変異の発見によって確認された(Levyら,Science 248:1124−1128(1990))。この突然変異は、Aβの22番目(APP695の618番目、またはAPP770の693番目)のグルタミン酸をグルタミンに置き換えたものであった。さらに、ある家族は、全長タンパク質の717番目にアミノ酸置換をもたらす突然変異により、アルツハイマー病に遺伝的にかかり易い(家族性アルツハイマー病(FAD)とも呼ばれる症状)(Goateら,(1991);Murrellら(1991);Chartier−Harlinら(1991))。これらの突然変異は、その家族において病気と一致分離し(co‐segregate)、後期発症ADを有する家族においては存在しない。717番目のアミノ酸におけるこの突然変異は、APPからのAβのAβ1-42形態の産生量を増加させる(Suzukiら,Science 264:1336−1340(1994))。他の突然変異形態は、全長タンパク質の670番目および671番目のアミノ酸における変化を含む(Mullanら,(1992))。670番目および671番目のアミノ酸のこの突然変異により、APPからの総Aβ産生量が増加する(Citronら,Nature 360:622−674(1992))。
【0008】
APPは3つの部位でin vivoでプロセッシングされる。この証拠は、膜会合メタロプロテアーゼによるβ−セクレターゼ部位での開裂が生理現象であることを示唆している。この部位は原形質膜の内腔表面から離れたAPP12残基の中に位置している。β−セクレターゼ部位(原形質膜の内腔表面から28残基)とβ−セクレターゼ部位(膜貫通領域内)の切断により、40/42−残基β−アミロイドペプチド(Aβ)が生成される。脳内におけるその産生および蓄積量の上昇は、アルツハイマー病の病的発生過程における中心的な事象である(概説についてはSelkoe,D.J.Nature 399:23−31(1999)を参照されたい)。ヒト脳内に見られる他の膜タンパク質であるプレセニリン1(Presenilin 1)は、APP(βセクレターゼ部位)での加水分解を制御し、それ自体が原因プロテアーゼであると考えられていた(Wolfe,M.S.ら,Nature 398:513−517(1999))。プレセニリン1は一本鎖分子として発現され、その急速な分解を防ぐためには、プロテアーゼ(プレセニリナーゼ(presenilinase))によるそのプロセッシングが必要である(Thinakaran,G.ら,Neuron 17:181−190(1996)およびPodlisny,M.B.ら,Neurobiol.Dis.3:325−37(1997))。プレセニリナーゼの正体は不明である。β‐セクレターゼ部位のin vivoプロセッシングは、Aβ産生における律速段階であると考えられており(Sinha,S.& Lieberburg,I.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:11049−11053(1999))、よって、有力な治療標的である。
【0009】
アミロイド斑の形成を減少させるのに有効なインヒビターの設計は、APPを切断して42アミノ酸ペプチド(AβのAβ1-42形態)を生じるのに不可欠な酵素の同定にかかっている。幾つかの酵素は同定されたが、活性酵素を産生することは不可能であった。活性酵素無しでは、基質特異性を確認することも、基質特異性を決定することも、速度論や重要な活性部位残基を決定することもできない(これらは全てインヒビターの設計に必須である)。
【0010】
メマプシン2は、ヒト脳におけるベータ−アミロイド前駆体タンパク質からのベータ−アミロイドペプチドの産生に関与する重要なプロテアーゼである、ベータ−セクレターゼであることが分かった(概説についてはSelkoe,D.J.Nature 399:23−31(1999)を参照されたい)。現在では、ヒト脳内におけるベータ−アミロイドペプチドの蓄積がアルツハイマー病の主な原因であることは、一般的に受け入れられている。ヒトメマプシン2に対して特異的に設計されるインヒビターは、ベータ−アミロイドペプチドの形成およびアルツハイマー病の進行を阻害または減少させるものでなければならない。
【0011】
メマプシン2は、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーに属する。メマプシン2は、他の真核生物のアスパラギン酸プロテアーゼと相同なアミノ酸配列を有し、このファミリーに独特なモチーフを含む。これらの構造的類似性は、メマプシン2および他の真核生物のアスパラギン酸プロテアーゼが共通の触媒機構を共有することを暗示している(Davies,D.R.,Annu.Rev.Biophys.Chem.19,189(1990))。アスパラギン酸プロテアーゼの最も優秀なインヒビターは、これらの酵素の遷移状態の模倣体(mimics)である。これらのインヒビターは、カルボニル基の炭素とアミド基の窒素との間の開裂された平面構造ペプチド結合が2つの四面体原子(tetrahedral atom)(例えばヒドロキシエチレン[−CH(OH)−CH2 −])に置きかえられた基質様構造(もとはペプスタチンの構造において発見された(Marciniszynら,1976))を有する。
【0012】
しかし、臨床使用する場合、血液脳関門を通過し且つ簡単に合成することができる小分子インヒビターとすることが好ましい。また、インヒビターは比較的製造コストが安価であり、経口投与することができるものであることが望ましい。これらの特性について数千もの化合物をスクリーニングするには、膨大な労力が必要である。アルツハイマー病を治療するためのメマプシン2インヒビターを合理的に設計するためには、メマプシン2の三次元構造、特にこのプロテアーゼの活性部位におけるインヒビターの結合様式を知ることが重要である。
【0013】
従って、本発明の目的は、精製され組換えされた活性メマプシン2のみならず、その基質およびサブサイト特異性、ならびに重要な活性部位残基を提供することである。
【0014】
本発明の他の目的は、メマプシン2のインヒビターを合成するための組成物および方法を提供することである。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、メマプシン2またはその基質と相互作用してメマプシン2による切断を阻害する組成物であって、血液脳関門(BBB)を通過することができる組成物を提供することである。
【0016】
従って、本発明の目的は、メマプシン2を阻害する化合物の合理的な設計およびスクリーニングのための手段を提供することである。
【0017】
発明の概要
触媒的に活性な精製組換えメマプシン2の生産方法を開発した。触媒的に活性な該酵素の基質およびサブサイト特異性を決定した。活性酵素および触媒活性についてのアッセイは、該酵素のインヒビターについてライブラリーをスクリーニングする際に有用である。
【0018】
基質およびサブサイト特異性情報を用いて、メマプシン2の機能を阻害することができる天然メマプシン2基質の基質アナログを設計した。この基質アナログは、メマプシン2の天然ペプチド基質に関係することが判明したペプチド配列に基づく。この基質アナログは、メマプシン2により切断されえないアミド(ペプチド)結合の少なくとも1つのアナログを含む。重要なアミノ酸残基からなる部位にアイソスター(isostere)を含む2つの基質アナログを合成する方法を開発し、基質アナログOM99−1およびOM99−2を合成した。OM99−2は、オクタペプチドGlu−Val−Asn−Leu−Ala−Ala−Glu−Phe(配列番号28)に基づき、Leu−Alaペプチド結合が遷移状態のアイソスターであるヒドロキシエチレン基によって置換されたものである。OM99−2の阻害定数は組換えプロメマプシン2に対して1.6×10-9Mである。このインヒビターに結合したメマプシン2の結晶学を用いて、該タンパク質の三次元構造、ならびに結合における様々な残基の重要性を決定した。
【0019】
この情報を当業者が用いることにより、市販されているソフトウェアプログラム、ならびに有機化学および酵素学の分野で良く知られている新しいインヒビターの設計技法を用いて、新しいインヒビターを設計することができる。例えば、インヒビターの側鎖は、阻害力を強化するために、(水素結合、疎水性相互作用、電荷相互作用、および/またはファン−デル−ワールス相互作用を介した)より強力な相互作用をもたらすように修飾することができる。このタイプの情報に基づいて、相互作用の小さな残基を新しいインヒビター設計から排除して、インヒビターの分子量を小さくしてもよい。該酵素から構造的障害を受けない側鎖を架橋して、効果的なインヒビターの立体配座を閉じ込めることができる。またこのタイプの構造は、メマプシン2の結合部位を効率的に埋めつつより良い医薬的特性を生み出すペプチド代用薬の設計を可能とする。
【0020】
実施例は、触媒的に活性な酵素の生産、インヒビターの設計および合成、ならびに結晶構造がどのように得られたかを示す。したがって、実施例は、化合物のライブラリーを他のインヒビターについてスクリーニングするため、およびインヒビターを設計するために、本明細書中に記載される方法および物質をどのように用いるのかを示す。これらのインヒビターは、APPの切断におけるベータ−セクレターゼメマプシン2の作用により媒介される、アルツハイマー病の予防および/または治療法において有用である。
【0021】
発明の詳細な説明
I.触媒活性を有する組換えメマプシン2の調製
メマプシン2のクローニング及び発現
実施例1に記載のようにして、メマプシン2がクローニングされ、ヌクレオチド配列(配列番号:1)及び予測アミノ酸配列(配列番号:2)が決定された。cDNAは、断片から構築した。ヌクレオチド配列及び推定タンパク質配列は、それぞれ配列番号:1及び2に示されている。タンパク質は、SmithKline Beecham PharmaceuticalsによるEP0855444A(1998年7月29日公開)に記載され、後にSinhaら,Nature 402,537−540(1999年12月)及びVassarら,Science 286,735−741(1999年10月22日)により報告されたアスパラギン酸プロテイナーゼ2(ASP2)と同一である。
【0022】
プロメマプシン2は、他のヒトアスパラギン酸プロテアーゼと相同である。アラインメントによると、プロメマプシン2は、pro領域、アスパラギン酸プロテアーゼ領域、及びC末端近傍の膜貫通領域を含有する。C末端ドメインは、80残基超の長さである。活性酵素はメマプシン2であり、そのプロ酵素がプロメマプシン2である。
【0023】
触媒活性を有する酵素のリフォールディング( refolding )
基質特異性を決定し、インヒビターを設計するためには、触媒活性を有する組換え酵素を発現させる必要がある。膜貫通ドメインを含有するプロテアーゼは他には知られていない。膜貫通ドメインの存在は、これらのタンパク質の組み換え発現を、より予測しにくく、より困難なものにする。タンパク質の分泌が起こるためには、膜貫通領域の除去が必要である場合が多い。しかしながら、膜貫通領域の除去は、タンパク質の構造及び/又は機能を改変させる場合が多い。
【0024】
出発仮定は、他のアスパラギン酸プロテアーゼと相同なメマプシン2の領域は、膜貫通ドメインの非存在下でも独立にフォールディングされ、C末端膜貫通領域の非存在下でもプロテアーゼ活性を保持しているであろうというものであった。膜貫通領域は膜アンカーとして機能すると考えられる。活性部位は膜貫通領域には存在せず、活性は膜への固定を必要としないため、実施例3に記載のようにして、大腸菌において、いずれも膜貫通領域を含まない2つの異なる長さのメマプシン2を発現させ、精製した。トランスフェクトされた細菌の培養、組換えタンパク質の合成の誘導、並びに組換えタンパク質を含有する封入体の回収及び洗浄のための手法は、Linら(1994)により記載されたものと本質的に同様である。しかしながら、リフォールディングは、単純ではなかった。2つの異なるリフォールディング法はいずれも、満足のゆく結果を生じた。いずれの方法においても、8M尿素/100mM β−メルカプトエタノールのような強力な変性/還元溶液にタンパク質を溶解させた。タンパク質がリフォールディングされる速度及び溶液の種類が、活性にとって重要であった。一方の方法においては、タンパク質を、8M尿素/100mM β−メルカプトエタノールに溶解させ、次いで20容量の20mMトリス(pH9.0)で迅速に希釈し、次いで1M HClにより徐々にpH8へと調整した。次いで、リフォールディング用溶液を4℃で24〜48時間維持した後、精製へと進んだ。第2の方法においては、等容量の20mMトリス、0.5mM酸化型/1.25mM還元型グルタチオン(pH9.0)を、急速に撹拌されたプロメマプシン2を含む8M尿素/100mM β−メルカプトエタノールへと添加する。その過程を1時間間隔でさらに3回繰り返す。次いで、最終尿素濃度が0.4Mとなるよう、得られた溶液を十分な容量の20mMトリス塩基に対して透析する。次いで、溶液のpHを、1M HClにより徐々に8.0へと調整する。
【0025】
次いで、リフォールディングされたタンパク質を、分子量排除に基づくカラムクロマトグラフィ、及び/又は塩勾配を使用した溶出によりさらに精製し、還元条件下及び非還元条件下でのSDS−PAGE分析により分析する。
【0026】
II. メマプシン2の基質特異性及び酵素反応速度論
基質特異性
メマプシン2の組織分布を、実施例2に記載のようにして決定した。脳におけるメマプシン2(M2)の存在は、該メマプシン2の存在がβ−アミロイド前駆体タンパク質(APP)を加水分解するかもしれないことを示した。下記のように、詳細な酵素的及び細胞的な研究により、M2がβ−セクレターゼとしての基準に全て合致することが証明された。
【0027】
M2の三次構造は、I型内在性膜タンパク質としてモデル化された。モデルは、その球状プロテアーゼ単位が、膜表面から20〜30残基の範囲の距離で、膜に固定されたポリペプチドを加水分解しうることを示唆した。脳の膜貫通タンパク質として、APPは、可能性のある基質であり、原形質膜表面から約28残基に位置した、そのベータ−セクレターゼ部位は、M2によるタンパク質分解の範囲内である。
【0028】
この部位に由来する合成ペプチド(SEVKM/DAEFR)(配列番号:4)は、ベータ−セクレターゼ部位(/により示されている)において、M2pd(Ala-8P からAla326 までのアミノ酸を含む改変M2)により加水分解された。APPベータ−セクレターゼ部位に由来し、かつ細胞におけるアルファ−ベータ産生のレベルを上昇させることが既知(Citron,M.et al.,Nature 260:672−674(1992))である「スウェーデン型変異(Swedish mutation)」(Mullan,M.et al.,Nature Genet.2:340−342(1992))を含む第2のペプチド(SEVNL/DAEFR)(配列番号:5)は、より高い触媒効率でM2pdにより加水分解された。両基質は、pH4.0において最適に分解された。プレセニリン1のプロセシング部位に由来するペプチド(SVNM/AEGD)(配列番号:6)も、比較的低効率の反応速度論パラメータでM2pdにより加水分解された。APPガンマ−セクレターゼ部位に由来するペプチド(KGGVVIATVIVK)(配列番号:7)は、M2pdにより加水分解されなかった。ペプスタチンAによりM2pdをわずかに阻害した(およそのIC50は約0.3mM)。反応速度論的パラメータは、プレセニリン1(kcat 、0.67s-1;Km 、15.2mM;kcat /Km 、43.8s-1M-1)と天然APPペプチド(kcat /Km 、39.9s-1M-1)との両方が、スウェーデン型APPペプチド(kcat 、2.45s-1;Km 、1mM;Kcat /Km 、2450s-1M-1)ほど優れた基質ではないことを示す。
【0029】
M2が哺乳動物細胞におけるAPPベータ−セクレターゼ機能を保持しているか否かを決定するため、メマプシン2をHeLa細胞において一過性発現させ(Lin,X.,et al.,FASEB J.7:1070−1080(1993))、35S−Metで代謝的にパルス標識し、次いでSDS−ポリアクリルアミド電気泳動及びイメージングの後、APPより生成した断片の可視化のため、抗APP抗体により免疫沈降させた。パルスチェイス実験の順化培地(2h)からの免疫沈降されたAPP Nβ−断片(97kDバンド)のSDS−PAGEパターンは、APPがM2により分解されたことを示した。APP単独でトランスフェクトされた対照、及びバフィロマイシンA1が添加されたAPPとM2とによる共トランスフェクトを、実施した。APP βC−断片(12kD)のSDS−PAGEパターンは、前記と同じ実験の順化培地から免疫沈降させた。APP単独でトランスフェクトされた対照、APPとM2とによる共トランスフェクト、バフィロマイシンA1を用いたAPPとM2とによる共トランスフェクト、スウェーデン型APPのトランスフェクション、並びにスウェーデンAPPとM2とによる共トランスフェクションを実施した。免疫沈降されたM2(70kD)、M2トランスフェクト細胞、長時間のフィルム感光後の非トランスフェクトHeLa細胞、及びHEK293細胞由来の内因性M2のSDS−PAGEゲルも泳動させた。異なるAPP領域に特異的な抗体を使用した免疫沈降後に順化培地から回収されたAPP断片(100kDのベータN−断片及び95kDのベータN−断片)のSDS−PAGEパターンは、メマプシン2がAPPを切断することを示した。
【0030】
APPとM2との両方を発現する細胞は、順化培地中に97kDのAPPベータN−断片(N末端からベータ−セクレターゼ部位まで)を産生し、細胞溶解物中に12kDのベータC−断片(ベータ−セクレターゼ部位からC末端まで)を産生した。APP単独でトランスフェクトされた対照は、ほとんど検出不可能なベータN−断片を産生し、ベータC−断片は産生しなかった。リソソーム/エンドソームの小胞内pHを上昇させることが既知であり、かつベータ−セクレターゼによるAPP分解を阻害することが示されているバフィロマイシンA1(Knops,J.et al.,J.Biol.Chem.270:2419−2422(1995))は、共トランスフェクト細胞におけるベータNとベータCとの両方のAPP断片の産生を消失させた。スウェーデン型APP単独でトランスフェクトされた細胞は、細胞溶解物中にベータC−断片バンドを産生しなかったが、スウェーデン型APPとM2との共トランスフェクションは産生した。このスウェーデン型ベータC−断片バンドは、野生型APPのバンドよりも強かった。97kDのベータN−バンドも順化培地中に見られるが、その強さは野生型APPトランスフェクションとほぼ同等である。
【0031】
これらの結果は、M2が、エンドソームのような酸性コンパートメントにおいて、APPのベータ−セクレターゼ部位をプロセシングすることを示している。トランスフェクトされたM2遺伝子の発現を確立するため、パルス標識された細胞を溶解させ、抗M2抗体により免疫沈降させた。M2遺伝子でトランスフェクトされた細胞においては、ベータ−セクレターゼを発現することが既知のHEK293細胞(Citron,M.et al.,Nature 260:672−674(1992))由来の主要なバンドと同一の移動度を有する70kDのM2バンドが見られた。また、非トランスフェクトHeLa細胞において、長いフィルム感光の後、M2の極めて希薄なバンドが見られ、このことから、M2トランスフェクションなしではベータN−断片及びベータC−断片を産生するには不十分である極めて低いレベルの内因性M2を示した。アルファ−ベータペプチドの残基1〜17を特異的に認識する抗体アルファ−ベータ1-17を用い、正確なベータ−セクレターゼ部位切断を確認した。APPとM2とによりトランスフェクトされた細胞においては、両断片に存在するAPPのN末端領域を認識する抗体を使用して、ベータN−断片とベータN−断片との両方が可視である。抗体Aベータ1-17は、非トランスフェクト細胞において内因性ベータ−セクレターゼにより産生されたベータN−断片を認識する。しかしながら、この抗体は、APPとM2とにより共トランスフェクトされた細胞に存在することが既知のベータN−断片を認識することはできなかった。これらの観察は、ベータN−断片が、M2によるベータ−セクレターゼ部位切断の産物であり、それがアルファ−ベータ1-17の認識エピトープを消失させたことを追認した。
【0032】
M2によるAPPのプロセシングは、2つのタンパク質の細胞内局在が予測される。APPとM2とを共発現するHeLa細胞を、APP及びM2に対する抗体で染色し、100×対物レンズを使用してCSLMにより同時に可視化した。共存の領域は、黄色で出現した。
【0033】
APPとM2との両方の共焦点顕微鏡により観察された免疫検出は、スーパーインポーズスキャンにおいて、それらの共存を明らかにした。両タンパク質の分布は、リソソーム/エンドソームコンパートメントにおけるそれらの存在と一致する。
【0034】
特異性研究において、M2pdが、活性化後16hのインキュベーション中に、そのproペプチド(2部位)及びプロテアーゼ部分(2部位)を切断することが見出された(表1)。前記の3つのペプチドの他に、M2pdも酸化型ウシインスリンB鎖及び合成ペプチドNchを切断した。天然タンパク質は、M2pdにより切断されなかった。
【0035】
データは、ヒトM2がβ−アミロイド前駆体タンパク質(APP)を切断するベータ−セクレターゼとしての基準を全て満たすことを示している。(a)M2及びAPPは、いずれも、ヒト脳に存在する膜タンパク質であり、哺乳動物細胞において共存している。(b)M2は、合成ペプチド及び細胞内APPのベータ−セクレターゼ部位を特異的に切断する。(c)M2は、野生型APPよりもスウェーデン型APPに由来するベータ−セクレターゼ部位を優先的に切断する。(d)M2活性に酸性pHが最適であること、及び細胞中においてM2によるAPPプロセシングがバフィロマイシンA1により阻害されることは、ベータ−セクレターゼによる切断が酸性小胞において起こるという以前の観察(Knops,J.et al.,J.Biol.Chem.270:2419−2422(1995))と一致する。酸性溶液中の組換えプロM2の活性の自然発生は、細胞内で、このチモーゲンが自らエンドソームのような酸性小胞において活性を生成させうることを示唆する。
【0036】
II. 阻害剤の設計及び合成
メマプシン2の基質アナログの設計
5つのヒトアスパラギン酸プロテアーゼは、相同なアミノ酸配列を有しており、かつ類似した三次構造を有している。活性部位には2個のアスパラギン酸残基が存在し、各残基は特徴的なアスパラギン酸プロテアーゼ配列モチーフAsp−Thr/Ser−Gly−(配列番号:8)の内に見出される。一般に、アスパラギン酸プロテアーゼには2つの相同ドメインがあり、三次構造において、基質結合部位はこれら2つのドメインの間に位置する。アスパラギン酸プロテアーゼの基質結合部位は、一般に、8個のアミノ酸残基を認識する。一般に、アスパラギン酸プロテアーゼにより切断されるアミド結合の両側に4個の残基が存在する。
【0037】
典型的には、各アミノ酸の側鎖は、基質/アスパラギン酸プロテアーゼ相互作用の特異性に関与する。各基質残基の側鎖は、集合的にサブサイトと呼ばれる酵素の領域により認識される。プロテアーゼサブサイトのための一般に認められている記号、及びそれらの対応する基質残基を以下に示す。なお、ダブルスラッシュは結合切断の位置を表す。
【0038】
アスパラギン酸プロテアーゼの基質認識のための一般的なモチーフは存在するが、各プロテアーゼは極めて異なる基質特異性及び特異性の広さを有する。アスパラギン酸プロテアーゼの特異性が既知となれば、その特異性に基づき、天然基質が効率的に切断されるのを防止する様式で、アスパラギン酸プロテアーゼと相互作用するインヒビターを設計することができる。いくつかのアスパラギン酸プロテアーゼは、加水分解の成功のため、サブサイトのそれぞれにおいて多くの異なる残基を適応させうるような特異性を有する。ペプシン及びカテプシンDは、この型の特異性を有し、「広域」基質特異性を有すると言われる。レニンの場合など、あるサブサイトにおいて極少数の残基のみが認識されうる場合には、そのアスパラギン酸プロテアーゼは、厳密な、又は狭い特異性を有すると言われる。
【0039】
アスパラギン酸プロテアーゼの特異性に関する情報は、特定のサブサイトに好ましい残基が位置しており、かつ分解されるペプチド結合が遷移状態アナログに置換されている特異的インヒビターを設計するために使用されうる。これらのアナログは、遷移状態アイソスターと呼ばれる。アスパラギン酸プロテアーゼは、加水分解メカニズムによりアミド結合を切断する。この反応メカニズムは、アミノ酸のβ−炭素に対する水酸化物イオンによる攻撃を含む。切断対象である結合を介してβ−炭素に付いた他の原子にはプロトン化が起こらなければならない。β−炭素の求電子性が不十分であるか、又は切断対象の結合に付いた原子の求核性が不十分である場合には、その結合は加水分解メカニズムによって切断されないであろう。遷移状態を模倣しないが、加水分解できないアナログも存在するが、遷移状態アイソスターは、遷移状態を特異的に模倣し、かつ加水分解できない。
【0040】
遷移状態理論は、酵素が最も高い親和性を有する中間体であって、酵素が触媒する反応の遷移状態中間体であることを示す。特定の酵素に対して最も高い親和性を有するのは、基質の定常状態構造ではなく遷移状態構造である。アミド結合の加水分解の遷移状態は、四面体であるが、定常状態構造は、平面である。アスパラギン酸プロテアーゼの典型的な遷移状態アイソスターは、Marciniszynら(1976)により、ペプスタチンにおいて最初に発見されたように、−CH(OH)−CH2 −である。遷移状態アナログ原理は、アスパラギン酸プロテアーゼであるヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼのためのインヒビター薬物に適用され成功を収めている。これらの多くは、現在、臨床使用されている。インヒビターの構造、特異性、及び型に関する情報は、Tang,Acid Proteases,Structure,Function and Biology,Adv.in Exptl.Med.Biol.第95巻(Plenum Press,NY 1977);Kostka,Aspartic Proteinases and their Inhibitors(Walter de Gruyter,Berlin 1985);Dunn,Structure and Funcitons of the Aspartic Proteinases,Adv.in Exptl.Med.Biol.306(Plenum Press,NY 1991);Takahashi,Aspartic Proteases,Structure,Funciton,Biology,Biomedical Implications,Adv.in Exptl.Med.Biol.362(Plenum Press,NY 1995);及びJames,Aspartic Proteinases,Retroviral and Cellular Enzymes,Adv.in Exptl.Med.Biol.436(Plenum Press,NY 1998)に見出される。
【0041】
基質アナログの構成は、一般に、一般式X−L4 −P4 −L3 −P3 −L2 −P2 −L1 −P1 −L0 −P1 ' −L1 ' −P2 ' −L2 ' −P3 ' −L3 ' −P4 ' −L4 ' −Yである。基質アナログの構成は、小ペプチド分子のアナログである。それらの基本構造は、構造/機能研究により決定されたペプチド配列に由来する。Px により表される位置は、−L0 −により表される切断部位からの相対的な基質特異性位置を表すことが理解される。Lx により表される組成の位置は、各基質特異性位置Px の間の連結領域を表す。
【0042】
メマプシン2の天然基質において、Px −Lx 対は、切断対象のペプチドの単一アミノ酸を表すであろう。本一般式において、式の各Px 部分は、アミノ酸であろうもののα−炭素及び側鎖官能基をいう。従って、アラニンのPx −Lx 対のPx 部分はHC−CH3 を表す。一般的な組成のPx 部分を表す一般式は、−R1 CR3 −である。
【0043】
一般に、R1 はCH3 (アラニンの側鎖)、CH(CH3 )2 (バリンの側鎖)、CH2 CH(CH3 )2 (ロイシンの側鎖)、(CH3 )CH(CH2 CH3 )(イソロイシンの側鎖)、CH2 (インドール)(トリプトファンの側鎖)、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メチオニンの側鎖)、H(グリシンの側鎖)、CH2 OH(セリンの側鎖)、CHOHCH3 (トレオニンの側鎖)、CH2 (フェノール)(チロシンの側鎖)、CH2 SH(システインの側鎖)、CH2 CH2 OHNH2 (グルタミンの側鎖)、CH2 CONH2 (アスパラギンの側鎖)、CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 (リジンの側鎖)、CH2 CH2 CH2 NHC(NH)(NH2 )(アルギニンの側鎖)、CH2 (イミダゾール)(ヒスチジンの側鎖)、CH2 COOH(アスパラギン酸の側鎖)、CH2 CH2 COOH(グルタミン酸の側鎖)、並びにこれらの機能的な天然及び非天然の誘導体又は合成代用物(substitution)である。
【0044】
R3 が単独のHであるのが最も好ましい。しかしながら、一般に、R3 はメマプシン2との結合を可能にする基であるアルケニル、アルキナル(alkynal)、アルケニルオキシ、及びアルキニルオキシ基でありうる。好ましくは、アルケニル基、アルキニル基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基は、2〜40個の炭素を有し、より好ましくは2〜20個の炭素、2〜10個の炭素、又は2〜3個の炭素を有し、これらの機能的な天然及び非天然の誘導体又は合成代用物でありうる。
【0045】
Px −Lx 対のLx 部分は、Px 領域を互いに連結する原子を表す。天然の基質において、Lx は、鎖内の次のアミノ酸であろうもののアミノ部分と付いたβ−炭素を表す。従って、Lx は、−CO−NH−により表されるであろう。Lx の一般式は、R2 により表される。一般に、R2 は、CO−HN(アミド)、CH(OH)(CH2 )(ヒドロキシエチレン)、CH(OH)CH(OH)(ジヒドロキシエチレン)、CH(OH)CH2 NH(ヒドロキシエチルアミン)、PO(OH)CH2 (ホスフィネート)、CH2 NH(還元アミド)でありうる。基質アナログがアスパラギン酸プロテアーゼ機能を阻害するよう機能するのであれば、複数個のLがアイソスターでありうることが理解される。
【0046】
アイソスターでないLは、アミド結合、又は加水分解できないアミド結合の模倣体(mimetic)のいずれかでありうる。
【0047】
X及びYは、典型的には、アスパラギン酸プロテアーゼ認識部位による認識に関与せず、認識を妨害しない分子を表す。これらの分子は:基質アナログの分解に対する抵抗性を与えることが好ましい。好ましい例は、加水分解できない結合を介して基質アナログとカップリングしたアミノ酸であろう。その他の好ましい化合物は、キャッピング剤(capping agent)であろう。さらに他の好ましい化合物は、基質アナログの精製において使用されうるビオチンなどの化合物であろう。
【0048】
本明細書において使用されるように、アルキルとは、置換又は非置換の直鎖状、分岐状、又は環状のアルキル基をいい、アルコキシル(alkoxyl)とは、置換又は非置換の直鎖状、分岐状、又は環状のアルコキシをいう。好ましくは、アルキル基及びアルコキシ基は、1〜40個の炭素を有し、より好ましくは1〜20個の炭素、1〜10個の炭素、又は1〜3個の炭素を有する。
【0049】
本明細書において使用されるように、アルケニルとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルケニル基をいい、アルキニルとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルキニル基をいい、アルケニルオキシとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルケニルオキシをいい、アルキニルオキシとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルキニルオキシをいう。好ましくは、アルケニル基、アルキニル基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基は、2〜40個の炭素を有し、より好ましくは2〜20個の炭素、2〜10個の炭素、又は2〜3個の炭素を有する。
【0050】
本明細書において使用されるように、アルカリール(alkaryl)とは、アリール置換基を有するアルキル基をいい、アラルキルとは、アルキル置換基を有するアリール基をいい、複素環−アルキルとはアルキル置換基を有する複素環基をいい、アルキル−複素環とは複素環置換基を有するアルキル基をいう。
【0051】
アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基の置換基は、ハロゲン、シアノ、アミノ、チオ、カルボキシ、エステル、エーテル、チオエーテル、カルボキシアミド、ヒドロキシ、又はメルカプトでありうる。さらに、前記官能基は、所望によりO、NH、又はSなどのヘテロ原子と置換されたメチレン基を1個以上有していてもよい。
【0052】
多数の異なる基質が試験され、分析され、メマプシン2の切断法則が決定された。分析された基質の結果は表1に示されており、これらの結果から決定された法則は以下のように要約される。
(1)メマプシン2基質の第1の特異性部位は、サブサイト部位P1 ' である。これは、メマプシン2における基質特異性のための最も重要な決定基がアミノ酸S1' であることを意味している。メマプシン2が基質を認識するためには、P1 ' は小さい側鎖を含まなければならない。好ましい態様は、P1 ' 位のR1 がH(グリシンの側鎖)、CH3 (アラニンの側鎖)、CH2 OH(セリンの側鎖)、又はCH2 OOH(アスパラギン酸の側鎖)である基質アナログである。CH3 (アラニンの側鎖)又はCH2 OH(セリンの側鎖)よりも構造的に小さいR1を有する態様も、好ましい。
(2)P4 位、P3 位、P2 位、P1 位、P2 ' 位、P3 ' 位、及びP4 ' 位における特異的配列要件はない。各部位は、第3法則が満たされるのであれば、任意の他の単独アミノ酸を適合させうる。
(3)残りの7個の位置P4 、P3 、P2 、P1 、P2 ' 、P3 ' 、及びP4 ' のうちの少なくとも2個は、疎水性残基から構成されたR1 を有していなければならない。残りの7個の位置P4 、P3 、P2 、P1 、P2 ' 、P3 ' 、及びP4 ' には、少なくとも3個の疎水性残基が存在することが好ましい。疎水性基を含む位置のための好ましいR1 基は、CH3 (アラニンの側鎖)、CH(CH3 )2 (バリンの側鎖)、CH2 CH(CH3 )2 (ロイシンの側鎖)、(CH3 )CH(CH2 CH3 )(イソロイシンの側鎖)、CH2 (インドール)(トリプトファンの側鎖)、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メチオニンの側鎖)、CH2 (フェノール)(チロシンの側鎖)である。疎水性基は大きい疎水性基であることが、より好ましい。大きい疎水性基を含む好ましいR1 は、CH(CH3 )2 (バリンの側鎖)、CH2 CH(CH3 )2 (ロイシンの側鎖)、(CH3 )CH(CH2 CH3 )(イソロイシンの側鎖)、CH2 (インドール)(トリプトファンの側鎖)、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メチオニンの側鎖)、CH2 (フェノール)(チロシンの側鎖)である。疎水性R1 を有する位置は、CH(CH3 )2 (バリンの側鎖)、CH2 CH(CH3 )2 (ロイシンの側鎖)、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)、CH2 CH2 SCH3 (メチオニンの側鎖)、又はCH2 (フェノール)(チロシンの側鎖)であることが、最も好ましい。
(4)8個の位置P4 、P3 、P2 、P1 、P1 ' 、P2 ' 、P3 ' 、及びP4 ' は、いずれも、R1位にプロリン側鎖を有していてはならない。
(5)全てのサブサイトがアナログ中に表されたPを有している必要はない。例えば、基質アナログは、X−P2 −L1 −P1 −L0 −P1 ' −L1 ' −P2 ' −L2 ' −P3 ' −L3 ' −Yを有してもよく、X−L1 −P1 −L0 −P1 ' −L1 ' −P2 ' −L2 ' −P3 ' −L3 ' −P4 ' −L4 ' −Yを有してもよい。
【0053】
好ましい基質アナログは、P1とP1' との間に加水分解できないアナログを有する、表1に開示された配列を有するアナログである。
【0054】
インヒビターを作製するためのコンビナトリアルケミストリー
コンビナトリアルケミストリーとしては、限定されないが、小分子又は他の巨大分子のいずれかと結合することができる分子を単離するための全ての方法が挙げられる。タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び多糖が、巨大分子の例である。例えば、所定の機能、触媒又はリガンド結合を有するオリゴヌクレオチド分子が、「インビトロ遺伝学」と呼ばれるものにおいて、ランダムオリゴヌクレオチドの複雑な混合物から単離されうる(Szostak,TIBS 19:89,1992)。ランダムな及び決められた配列を保持する大きな分子プールを合成し、その複雑な混合物、例えば、100μgの100ヌクレオチドRNAにおける約1015個の各配列を、何らかの選択及び濃縮の過程に供する。Ellington and Szostak(1990)は、カラム上のリガンドと結合した分子のアフィニティクロマトグラフィ及びPCR増幅の繰り返しサイクルにより、1010個のRNA分子のうちの1個が小分子色素と結合するようフォールディングされることを推定した。かかるリガンド結合挙動を有するDNA分子も、同様に単離されている(Ellington and Szostak,1992;Bock et al,1992)。
【0055】
小有機分子、タンパク質、及びペプチド、並びに当業者に既知のその他の分子のための、類似した目標を目的とした技術が存在する。小さい合成分子のライブラリー、オリゴヌクレオチドのライブラリー、タンパク質のライブラリー又はペプチドのライブラリーに基づくのであろうとなかろうとも、所望の活性に関して分子セットをスクリーニングすることを、広義に、コンビナトリアルケミストリーという。
【0056】
新たな(de novo)活性又は修飾された活性を有するタンパク質を単離するための多数の方法が存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、長年にわたり使用されている。一定の機能を有するタンパク質を単離するための好ましい方法は、Roberts及びSzostak(Roberts R.W.and Szostak J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94(23)12997−302(1997))により記載されている。ペプチドを単離するために設計されたもう1つの好ましいコンビナトリアル法は、Cohenら(Cohen B.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(24):14272−7(1998))に記載されている。この方法は、修飾されたツーハイブリッド技術を利用する。酵母ツーハイブリッド系は、タンパク質−タンパク質相互作用の検出及び分析のため有用である。酵母サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において最初に記載されたツーハイブリッド系は、目的のタンパク質に特異的な新規制御分子を同定するための強力な分子遺伝学的技術である(Fields and Song,Nature 340:245−6(1989))。Cohenらは、選択された分子と結合する合成ペプチド又は工作ペプチドの配列間の新規相互作用を同定することができるよう、この技術を修飾した。この型の技術の利点は、選択が細胞内環境において実施される点である。その方法は、酸性活性化ドメインと接着するペプチド分子のライブラリーを利用する。選択されたペプチド、例えばメマプシン2の細胞外部分を、Gal4のような転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインと接着させる。この型の系においてツーハイブリッド技術を実施することにより、メマプシン2の細胞外部分と結合する分子が同定されうる。
【0057】
小分子ライブラリーのスクリーニング
これらのより専門的な技術に加え、様々な小分子ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーと組み合わされた、当業者に周知の方法を、所望の標的、メマプシン2又はその基質のいずれかと結合するか、又は相互作用する分子を単離し特徴決定するために使用することができる。これらの化合物の相対的な結合親和性を比較し、当業者に周知の競合的又は非競合的な結合研究を使用して最適なインヒビターを同定することができる。好ましい競合的インヒビターは、メマプシン2の非加水分解性のアナログである。もう1つは、メマプシン2が正確に機能すること又はフォールディングされることを防止するアロステリックな再編成を引き起こす。
【0058】
コンピュータを利用した合理的薬物設計
インヒビターを単離するためのもう一つの手段は、合理的設計によるものである。これは、構造情報及びコンピュータモデリングにより達成される。コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元的原子構造の可視化、及び分子と相互作用するであろう新化合物の合理的設計を可能にする。三次元構築物は、典型的には、選択された分子のx線結晶解析又はNMRイメージングからのデータに依存する。分子動力学は、力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新化合物が標的分子とどのように関連しているかの予測を可能にし、結合特異性を完全化するための化合物及び標的分子の構造の実験的操作を可能にする。例えば、NMR分光法を使用して、Inouyeらは、TSHK(膜貫通センサーヒスチジンキナーゼ(transmembrane sensor histidine kinases))の触媒部位の各サブドメインの構造を保持しているN末端短縮TSHK断片の構造情報を得ることができた。NMR研究に基づき、彼らは、可能性のあるTSHKインヒビターを同定することができた(Inouyeの米国特許第6,077,682号)。もう1つの好例は、カルシニュリン活性部位結合ポケット及び補助的FKBP12/FK506結合ポケットの両方の形状及び構造を得るため、高分解能X線結晶学を使用して決定されたカルシニュリン/FKBP12/FK506複合体の三次元構造に基づく(Armisteadの米国特許第5,978,740号)。この情報を入手すれば、研究者は、天然のリガンド又は基質とそれらの対応する受容体又は酵素の結合ポケットとの会合をよく理解することができ、従って効率的なインヒビターを設計し作製することができる。
【0059】
一方又は両方に小さな変更がなされる場合、分子−化合物相互作用の予測は、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーなメニュー選択方式のインターフェースと通常接続された、分子力学ソフトウェア及び計算集中コンピュータ(computationally intensive computers)を必要とする。分子モデリングシステムの例は、CHARMm及びQUANTAプログラム(Polygen Corporation,Waltham,MA)である。CHARMmは、エネルギー最小化及び分子動力学のファンクションを実行する。QUANTAは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実行する。QUANTAは、相互対話式の分子挙動の構築、修飾、可視化、及び分析を可能にする。
【0060】
Rotivinen,et al.,1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97,159−166;Ripka,New Scientist 54−57(1988年6月16日);McKinaly and Rossmann,1989 Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29,111−122;Perry and Davies,OSAR;Quantitative Structure−Activity Relationships in Drug Design 189−193頁(Alan R.Liss,Inc.1989);Lewis and Dean,1989 Proc.R.Soc.Lond.236,125−140及び141−162のような多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説しており、核酸成分のためのモデル酵素に関してはAskew,et al.,1989 J.Am.Chem.Soc.111,1082−1090が概説している。化学物質をスクリーニングし図形的に描写するその他のコンピュータプログラムは、BioDesign,Inc.(Pasadena,CA.,Allelix,Inc,Mississauga,Ontario,Canada)及びHypercube,Inc.(Cambridge,Ontario)のような会社から入手可能である。
【0061】
結合を改変することができる化合物の設計及び生成に関して記載したが、天然生成物又は合成化学物質を含む既知の化合物、及びタンパク質を含む生物学的活性を有する材料のライブラリーを、基質結合活性又は酵素活性を改変させる化合物に関して、スクリーニングすることもできる。
【0062】
ライブラリーのスクリーニング
基質アナログの設計及び合理的薬物設計は、活性部位及び標的の知識に基づいており、酵素及びその基質の詳細な構造、並びに単独で、又はインヒビターの存在下でそれらが相互作用する様式を作出するコンピュータソフトウェアプログラムを利用する。これらの技術は、x線結晶解析データを入手することにより大きく増強される。インヒビターは、触媒活性を有する酵素を阻害する化合物に関して、既存の化合物のライブラリーをスクリーニングすることによっても得られる。メマプシン2に関する文献における報告とは対照的に、本明細書に記載の酵素は、天然に産生された酵素と類似した活性を有し、内因性活性を阻害する化合物を同定するための手段を提供する。これらの可能性のあるインヒビターは、典型的には、酵素、基質(好ましくは、発色性基質)、及び可能性のあるインヒビター(通常、一連の濃度においてスクリーニングされる)が混合されたハイスループットアッセイを使用して同定され、基質の分解の程度が決定される。有用である可能性のあるインヒビターは、分解の量を減少させるものである。
【0063】
III .診断及び治療の方法
インヒビターは、42アミノ酸ペプチド分解産物のレベルの上昇、及び老人斑におけるペプチドの蓄積のような、アルツハイマー病、及びそれと関連した状態の診断及び治療及び/又は予防において使用されうる。
【0064】
診断的使用
基質アナログは、実施例に記載のように、メマプシン2又はメマプシン2アナログと特異的に結合し、メマプシン2の単離及び精製又は特徴決定を補助するための試薬として使用されうる。インヒビター及び精製された組換え酵素は、遺伝学的にアルツハイマー病を発症する傾向が高い個体のスクリーニングにおいて使用されうる。
【0065】
治療的使用
組換えヒトメマプシン2は、配列LVNM/AEGD(配列番号:9)を有する基質を分解する。この配列は、ヒトプレセニリンのインビボプロセシング部位の配列である。プレセニリン1及びプレセニリン2は、いずれも、内在性膜タンパク質である。それらは、未プロセシング型からN末端配列を除去するプロテアーゼ分解によりプロセシングされる。プロセシングされた後、プレセニリンは、未プロセシングのプレセニリンと比較して安定な2本鎖のヘテロ二量体を形成する(Capell et al.,J.Biol.Chem.273,3205(1998);Thinakaran et al.,Neurobiol.Dis.4,438(1998);Yu et al.,Neurosci Lett.2:254(3);125−8(1998))。未プロセシングのプレセニリンは、迅速に崩壊する(Thinakaran et al.,J.Biol.Chem.272,28415(1997);Steiner et al.,J.Biol.Chem.273,32322(1998))。プレセニリンは、ベータ−セクレターゼのインビボ活性を調節し、ベータ−セクレターゼは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)を分解し、アルファ−ベータ42の形成をもたらすことが知られている。脳細胞におけるアルファ−ベータ42の蓄積は、アルツハイマー病の主因であることが知られている(概説については、Selkoe,1998を参照のこと)。従って、プレセニリンの活性は、アルツハイマー病の進行を増強する。これは、プレセニリン遺伝子の非存在下では、アルファ−ベータ42ペプチドの産生が低下するという観察(De Strooper et al.,Nature 391,387(1998))により支持される。未プロセシングのプレセニリンは迅速に崩壊するため、プロセシングされたヘテロ二量体プレセニリンが、アルツハイマー病へと至るアルファ−ベータ42の蓄積の原因であるはずである。メマプシン2によるプレセニリンのプロセシングは、アルファ−ベータ42の産生を増強し、従ってアルツハイマー病の進行をさらに増強する。従って、血液脳関門を通過するメマプシン2インヒビターは、アルファ−ベータ42の沈積により媒介されるアルツハイマー病の発症の確率を減少させるか、又はその進行を遅延させるために使用されうる。メマプシン2はベータ分解部位でAPPを分解するため、ベータ分解部位におけるAPP分解の防止により、アルファ−ベータ42の増大が防止されるであろう。
【0066】
ワクチン
触媒活性を有するメマプシン2、又は2つの触媒性アスパラギン酸残基及び基質結合間隙の存在により定義される活性部位を含むその断片は、メマプシン2に対する免疫応答を誘導するために使用されうる。メマプシン2は、ブロッキング抗体、即ち脳におけるメマプシン2の天然に存在する基質の分解を防止する抗体を誘発するために有効な量で投与される。未修飾のワクチンは、アルツハイマー病の予防及び治療において有用でありうる。ワクチンに対する応答は、アジュバントの包含、組換え酵素の産生からのウイルスタンパク質のような組成、及び/又は投与方式(量、投与部位、投与頻度等)に影響されうる。酵素は活性であるためには適切にフォールディングされていなければならないことは明らかであるため、内因性メマプシン2に対して活性な抗体が誘発されるはずである。内因性酵素に対して有効である抗体は、適切にリフォールディングされていない酵素に対しては産生される可能性が低い。
【0067】
薬学的に許容される担体
インヒビターは、典型的には、経口又は注射により投与されよう。経口投与が好ましい。又は、肺、粘膜、又は経皮的な経路による送達のための、その他の製剤が使用されうる。インヒビターは、通常、製薬学的に許容される担体と組み合わせて投与されよう。製薬学的担体は、当業者に既知である。適当な担体は、典型的には、投与の様式に基づき選択されよう。医薬組成物は、抗微生物剤、抗炎症剤、及び鎮痛剤のような活性成分を1個以上含んでいてもよい。
【0068】
非経口投与又は注射による投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒質を含む、水、アルコール性/水性溶液、乳濁液、又は懸濁液が含まれる。好ましい非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース(Ringer’s dextrose)、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル(lactated Ringer’s)、又は固定油が含まれる。静脈内賦形剤には、流体、及び栄養補給剤、及び(リンゲルデキストロースに基づくもののような)電解質補給剤が含まれる。
【0069】
局所投与(口腔、肺、鼻腔、膣、又は直腸を含む粘膜表面への適用を含む)のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、スプレー、液体、及び粉末が含まれる。これらの適用のための製剤は既知である。例えば、典型的には、1〜3ミクロンの空気力学的直径を有する粒子を有する粉末を製剤化するための噴霧乾燥を使用して、薬物、又は重合体及び/もしくは界面活性剤と組み合わされた薬物からなる多数の肺製剤が、開発されている。
【0070】
経口投与用組成物には、粉末又は顆粒、懸濁液、又は水もしくは非水性媒質の溶液、カプセル、サチェット、又は錠剤が含まれる。濃化剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましい場合もある。
【0071】
本明細書に記載のようなペプチドは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸のような有機酸との反応、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、及びモノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、アリールアミン、及び置換されたエタノールアミンのような有機塩基との反応により形成される、製薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩としても投与されうる。
【0072】
用量
投薬は、治療する状態の重度及び応答性に依存するが、通常、1日1回以上であり、治療コースは数日から数ヶ月、又は医師がさらなる利益は得られないであろうと決定するまで継続されよう。当業者であれば、最適な用量、投薬方法、及び反復速度を決定することができる。
【0073】
用量範囲は、メマプシン2により媒介される障害の症状が緩解するか(典型的には、老人斑のサイズ及び/又は数の減少、又はサイズもしくは量の増加の停止により特徴付けられる)、又はアルファ−ベータ42ペプチドの分解が減少する、所望の効果を生じるために十分な大きさのものである。用量は、反対適応(counterindications)の場合には、各医師により調整されうる。
【0074】
以下の非制限的な実施例を参照することにより、本発明はさらに理解されるであろう。
【0075】
実施例1.メマプシン2のクローニング
1.プロ−メマプシン2のクローニングと塩基配列
EST IMAGEデータベース中の以下の登録配列の中にヒトアスパラギン酸プロテアーゼに相同な新規の配列が見い出された。AA136368妊婦子宮由来ATCC947471、AA207232神経上皮由来ATCC214526、およびR55398ヒト***由来ATCC392689。これらに対応するバクテリア菌株で、EST配列を含む#947471、#214526および#392689をATCC(メリーランド州のロックビル(Rockville, MD))から入手した。ATCCから入手したこれらのクローンの配列を決定したところ、既知のヒトアスパラギン酸プロテアーゼとは一致しない配列を含んでいることが確認された。これらのクローンの全配列をまとめたところ、約80%のプレプロ−M2 cDNAになった。以下の方法を用いて、これらのクローンの全長cDNAを得た。
【0076】
ヒト膵臓マラソン既製cDNA(Human Pancreas Marathon−Ready cDNA)(クローンテック社(Clonetech))は、ヒト組織に由来するmRNAの逆転写、プライマー付加、および第二鎖合成によって得られた二本鎖DNAであるが、これをPCR増幅用の鋳型として用いた。アダプタープライマー(AP1)およびネスティドアダプタープライマー(AP2)を5' −および3' −RACE PCRに用いた。メマプシン2cDNAの5' −領域のPCRには、AP1およびNHASPR1というプライマーを用いた。cDNAの3' 末端に対するプライマーは、NHASPF2およびAP1である。cDNAの中央は、NHASPF1プライマーおよびNHASPR2プライマーによって増幅された。プライマーの配列は以下の通りである。
NHASPF1:
(配列番号:10)、
NHASPR1:
(配列番号:11)、
NHASPF2:
(配列番号:12)、
NHASPR2:
(配列番号:13)、
AP1:
(配列番号:14)、および
AP2:
(配列番号:15)。
【0077】
メマプシン2も、ラムダgt10およびラムダgt11ベクターに組み込まれているヒト膵臓ライブラリー(クイックスクリーニングヒトcDNAライブラリーパネル(Quick−Screen Human cDNA Library Panel))からクローニングされた。ベクター由来のプライマー、GT10FWD、GT10REV、GT11FWD、およびGT11REVを外部プライマーとして使用した。用いたプライマーの配列は、
GT10FWD:
(配列番号:16)、
GT10REV:
(配列番号:17)、
GT11FWD:
(配列番号:18)、
GT11REV:
(配列番号:19)であった。
【0078】
なお、メマプシン2cDNAは、ヒト膵臓ラムダgt10およびラムダgt11ライブラリーから直接増幅した。プライマーの配列は、
PASPN1:
(配列番号:20)、および
NHASPC1:
(配列番号:21)であった。
【0079】
増幅されたメマプシン2の断片を中間PCRベクター(インビトロジェン社(Invitrogen))にクローニングし、シーケンスした。
【0080】
前記断片から集められたcDNA、ヌクレオチド、および推定されるタンパク質配列を配列番号:1と配列番号:2に示す。
【0081】
プロメマプシン2は、別のヒトアスパラギン酸プロテアーゼに相同である。アラインメントによれば、プロメマプシン2は、pro領域、アスパラギン酸プロテアーゼ領域、およびC−末端側に膜貫通領域を持っている。この活性型酵素は、メマプシン2であり、そのプロ酵素はプロメマプシン2である。
【0082】
実施例2.ヒト組織におけるメマプシン2の分布
クローンテック社から入手した多数組織cDNAパネルを、メマプシン2cDNAの0.82 kbの断片をPCR増幅するための鋳型として用いた。メマプシン2用に使用したプライマーはNHASPF1およびNHASPR2であった。メマプシン2またはメマプシン2の断片を含む組織から増幅されたPCR産物が得られた。増幅産物の量から、メマプシン2は、以下の組織に多い順に存在していることが示された。膵臓、脳、肺、腎臓、肝臓、胎盤、および心臓。また、メマプシン2は、脾臓細胞、前立腺細胞、精巣細胞、卵巣細胞、小腸細胞および結腸細胞にも存在している。
【0083】
実施例3.大腸菌(E. coli)におけるプロメマプシン2cDNAの発現、プロメマプシン2のリフォールディングと精製
プロメマプシン2をPCR増幅して、pET11aベクターのBamHI部位にクローニングした。得られたベクターは、Ala−8pからAla326までの配列をもつプロメマプシン2を発現する。図1に2種類の発現ベクターpET11−メマプシン2−T1(以下T1)とpET11−メマプシン2−T2(以下T2)の構造を示す。いずれのベクターにおいても、発現された組換えタンパク質のN−末端側の15残基は、発現ベクターに由来するものである。プロメマプシン2の残基は、残基Ala−16から開始する。2種類の組換えプロメマプシン2は、C−末端側の長さが異なっている。クローンT1はThr−456で終わっており、クローンT2はAla−421で終わっている。T1構築物はT2構築物よりも長いC−末端を持っているが、予想される膜貫通ドメインを全く発現しない。
【0084】
組換えタンパク質の発現と封入体の回収
T1およびT2発現ベクターを別々に大腸菌の菌株BL21(DE3)にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細菌を培養する方法、組換えタンパク質の合成誘導、および組換えタンパク質を含む封入体の回収と洗浄は、本質的には、既述した通りである(Linら、1994)。
【0085】
3つの異なるリフォールディング方法は,満足な結果を生じた。
【0086】
(i)迅速希釈法
8M尿素/100mMベータ−メルカプトエタノールに入れたOD280nm =5のプロメマプシン2を、20倍容量の20mM−トリス、pH9.0に直ちに希釈した。この溶液を1M HClでゆっくりとpH8に調整した。そして、精製に移る前にリフォールディング用溶液を24時間4℃に置いた。
【0087】
(ii)逆透析法
等量の20 mMトリス、0.5 mMの酸化型/1.25 mMの還元型グルタチオン、pH 9.0を、8 M尿素/10 mMベータ−メルカプトエタノールに入れたOD280nm =5のプロメマプシン2を激しく撹拌したものに加える。この処理を1時間置きにさらに3回繰り返す。そして、得られた溶液を十分な量の20 mMトリス塩基に対して透析して、尿素の最終濃度を0.4 Mとした。次に、この溶液のpHを、1 M HClによってゆっくりと8.0に調整する。
【0088】
iii. リフォールディングのための好適な方法
封入体を8 M尿素、 0.1 Mトリス、1 mMグリシン、1 mM EDTA、100 mMベータ−メルカプトエタノール、pH10.0に溶解させる。封入体のOD280 値を、ベータ−メルカプトエタノールを含まない8 M尿素溶液で5.0に調整する。最終溶液には、以下の還元剤を入れる。
10 mMベータ−メルカプトエタノール、10 mM DTT(ジチオスレイトール)、1 mM還元型グルタチオン、および0.1 M酸化型グルタチオン。溶液の最終pHは10.0である。
【0089】
上記溶液は、20倍容量の20 mM−トリスベースに速やかに希釈してpHを9.0に調整し、得られた溶液を16時間4℃に置く。この溶液を、6時間で室温まで平衡化させ、pHを8.5に調整する。溶液を再び4℃に戻して18時間置く。
【0090】
この溶液を、再び6時間、室温まで平衡化させ、pHを8.0に調整する。溶液を再び4℃に戻して4日から7日置く。
【0091】
リフォールディング方法は、M2のサブサイト特異性を調べるため、M2インヒビターの阻害能力を解析するため、無作為構造物ライブラリーまたは既存の化合物ライブラリーコレクションのいずれかを用いてインヒビターをスクリーニングするため、M2の構造を結晶学的に研究するための結晶を製造するため、およびM2のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を製造するために使用することのできる、酵素活性のある調製物を得るために非常に重要である。
【0092】
組換えプロメマプシン2−T2の精製
リフォールディングした材料を限外濾過によって濃縮し、20 mMトリス塩酸、0.4M尿素、pH 8.0で平衡化させたセファクリル(SEPHACRYLTM)S−300カラム上で分離する。S−300カラムからのリフォールディング物ピーク(2番目のピーク)は、20 mMトリス塩酸、0.4M尿素、pH 8.0で平衡化したFPLCリソース−Q(FPLC RESOURCE−Q TM )カラムでさらに精製することができる。NaClの直線的勾配によって、酵素をカラムから溶出させる。S−300からのリフォールディング物ピークは、さらなる精製を行なう前に活性化することもできる。活性化するためには、画分を等量の0.2 M酢酸ナトリウム、70%グリセロール、pH 4.0と混合する。この混合液は、22℃で18時間インキュベートしてから、20倍容量の20 mM−ビス−トリス(Bis−Tris)、0.4 M尿素、pH 6.0に対し2回透析する。そして、透析された材料を、20 mM−ビス−トリス、0.4 M尿素、pH 6.0で平衡化したFPLCリソース−Q(FPLC RESOURCE−Q TM )カラム上でさら精製する。酵素をNaClの直線的勾配によって溶出させる。
【0093】
還元条件下および非還元条件下でS−300画分をSDS−PAGE分析したところ、プロメマプシン2は、非還元条件下で、まず、非常に高分子量のバンド(約42 kDよりも大きい)として溶出することを示した。このことは、タンパク質のジスルフィド架橋によって、このタンパク質が、これらの分画では正しくフォールディングされないことを示している。その後の画分は、予想されたプロメマプシン2−T2のサイズ(約42 kDa)のタンパク質を含んでいる。これらの画分で得られたプロ酵素は、自己触媒による活性化を行なうためのタンパク質分解活性ももつ。これらの画分をプールして、FPLCリソース(FPLC RESOURCE TM )カラムでクロマトグラフィーを行ない、NaClの直線的勾配によって溶出した。いくつかの画分は、非還元条件下でSDS−PAGEを用いて解析した。この解析によって、画分6および7が活性タンパク質の大部分を含んでいることが明らかになり、このことは、活性タンパク質を含む1番目のFPLCピークと一致していた。主要ピークは、ショルダーピークと一緒になっており、これは、同じリソースQ(RESOURCE TM Q)カラムで精製を繰り返しても出現した。主要なショルダーピークは、これらの条件下で異なったコンフォメーションで存在する活性プロメマプシン2であることが確認された。
【0094】
実施例4.組換えメマプシン2のタンパク質分解活性と切断部位選択性
メマプシン2の特異性を確認するために、タンパク質切断部位近傍のアミノ酸配列を決定した。自己触媒切断を生じさせるため、組換えプロメマプシン2−T1を0.1 M酢酸ナトリウム、pH 4.0に入れ室温で16時間インキュベートした。この産物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析した。プロ−メマプシン2の分子量よりも小さい分子量に相当するバンドがいくつか観察された。電気泳動によるバンドをPVDF膜上にトランスブロットした。4本のバンドを選んで、タンパク質シークエンサーでN−末側配列を決定した。これらのバンドのN−末側配列によって、プロメマプシン2上のタンパク質切断部位の位置を確認した。
【0095】
さらに、ウシインシュリンの酸化型β−鎖と2種類の合成ペプチドをメマプシン2に対する基質として用いて、他の加水分解部位の範囲を決定した。これらの反応は、0.1 M酢酸ナトリウム、pH 4.0中で自己活性化したプロメマプシン2を、次いでペプチドとインキュベートすることによって行なった。加水分解産物を逆相C−18カラム上でHPLCを行ない、断片の分子量を測定するために、溶出ピークをエレクトロスプレー質量解析にかけた。酸化型インシュリンB−鎖については2つの加水分解部位を同定した(表1)。ペプチドNCH−ガンマからは3個の加水分解部位が同定された。合成ペプチドPS1−ガンマには1個の切断部位が見られ、その配列(LVNMAEGD)(配列番号:9)は、ヒトプレセニリン1のβ−プロセッシング部位に由来するものである(表1)。
【0096】
【表1】
【0097】
実施例5.プロメマプシン2の活性化および酵素の反応速度論
0.1 M酢酸ナトリウム、pH 4.0に入れ22℃で16時間インキュベートしたところ、自己触媒によってプロ−M2pdがM2pdに変換した。まず、加水分解試験を行うために2種類の合成ペプチドを別々にプロ−M2pdとともに0.1 M酢酸ナトリウム、pH 4.0の中で時間を変えて2時間から18時間インキュベートした。インキュベートした試料について、加水分解産物を同定するためにLC/MSを行なった。反応速度論研究のため、同定済みのHPLC(ベックマン・システムゴールド(Beckman System Gold)産物のピークを定量するためにまとめた。プレセニリン1およびスウェーデン型APPペプチド(表1)についてのKm 値とkcat 値を定常状態の反応速度論によって測定した。APPペプチドの各Km 値とkcat 値は、常法によっては正確に測定することができなかったため、プレセニリン1ペプチドに対する混合基質の競合的加水分解によって、そのkcat /Km 値を測定した(Fersht, A.「酵素の構造と作用(Enzyme Structre and Mechanism)」第2版、ニューヨークのダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー社(W. H. Freeman and Compnany, New York)(1985))。
【0098】
結果を図2Aおよび2Bに示す。pH 4.0におけるプロ−M2pdの小断片への変換をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動によって示した。プロ−M2pdと変換された酵素で移動度が異なることは、この2つを混同したものにおいて明らかである。図2Aは、さまざまなpHにおける、M2pdによる合成ペプチドswAPP(表1参照)の加水分解初速度を示すグラフである。図2Bは、M2pdによるペプチド基質の加水分解の定常状態における反応速度論に関する相対的kcat /Km 値を示すグラフである。
【0099】
実施例6.哺乳動物細胞における発現
方法
PM2 cDNAをpSecTagAベクター(インビトロジェン社(Invitrogen))のEcoRV部位にクローニングした。ヒト胎盤8−gt11ライブラリー(クローンテック社(Clontech))からヒトAPP cDNAをPCR増幅し、pSecTagAのNheI部位とXbaI部位にクローニングした。T7による発現を行わせるためのヒーラ(HeLa)細胞への形質転換およびワクシニアウイルス感染を行うための方法は、Lin, X., FASEB J. 7:1070−1080 (1993)に記載されている方法と実質的に同一である。
【0100】
トランスフェクトされた細胞を、0.5 mlの無血清/無メチオニン培地において、200マイクロCi35Sメチオニンおよびシステイン(トランスラベル(TransLabel); ICN)によって30分間代謝標識し、1 mlの培地で洗浄し、2 mlのDMEM/10%FCSで置き換えた。小胞の酸性化を防止するために、バフィロマイシン(Bafilomycin)A1を培地に加えた(Perez, R. G.ら、J. Biol. Chem. 271:9100−9107 (1996))。さまざまな時点(追跡)で培地を取り出し、細胞を回収して、10mMヨードアセトアミド、10:M TPCK、10:M TLCK、および2マイクログラム/mlのロイペプチンを含む50 mMトリス、0.3 M NaCl、5 mM EDTA、1%トリトンX−100、pH 7.4中で溶菌した。溶菌液の上清(14,000×g)および培地を、プロテインGセファロース(シグマ社(Sigma))に結合した抗体上に免疫吸着させた。抗APP N−末端ドメイン抗体(ケミコン社(Chemicon))を用いてAPPのベータN−断片を回収し、抗アルファ−ベータ1-17抗体(ケミコン社(Chemicon))、アルファ−ベータのN−末端側17残基を認識する)を用いて12 kDaのβC−断片を回収した。前者の抗体は、変性したタンパク質しか認識しなかったため、免疫吸着させる前に、まず、培地を2 mMジチオスレイトール、0.1% SDSの中で30分間55℃でインキュベートした。試料を冷却し、抗APP N−末端ドメイン(ケミコン社(Chemicon))を加える前に等量の細胞溶解用バッファーで希釈した。ビーズを洗浄し、泳動用バッファーで溶出し、SDS−PAGE(ノベックス(NOVEXTM))を行ない、アンプリファイ(Amplify)(アマーシャム社(Amersham))によって増感されたゲルのオートラジオグラムまたはホスフォールイメージング(phosphorimaging)(モレキュラー・ダイナミクス社(Molecular Dynamics))によって可視化した。PVDF膜へのトランスブロット、および抗アルファ−ベータ1-17および化学発光基質(アマーシャム社(Amersham))を用いる検出法によりベータN−末側断片の免疫検出を行なった。
【0101】
結果
4穴のチャンバースライドに入れた、APPまたはM2によってトランスフェクトされたHeLa細胞をアセトンで10分間固定し、PBS中0.2%トリトンX−100(Triton X−100)の中で6分間透過化処理を行なった。M2を局在化させるために、ヤギ抗−プロ−M2pdポリクローナル抗体をDEAE−セファロース6B上で精製し、アフィゲル(Affigel)(バイオラド社(BioRad))上に固定化した組換えプロ−M2pdに対するアフィニティー精製を行なった。製造業者のプロトコールに従って、精製した抗−プロ−M2pd抗体をAlexa568(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probe))に結合させた。固定化した細胞を、0.1% BSA入りPBSで1:100に希釈した抗体とともに一晩インキュベートしてから、PBSで4回洗浄した。APPについては、2種類の抗体を用いた。抗体Aβ1-17(上記)、およびベータ−セクレターゼ切断部位に続く最初の26残基を認識する抗体Aβ17-42 (ケミコン社(Chemicon))。PBSで4回洗った後、1:200の希釈率で細胞を抗マウスFITC結合体とともに一晩インキュベートした。プロロング(Prolong)抗フェード(anti−fade)試薬(モレキュラー・プローブ社(Molecular Probe))中で細胞をマウントし、ライカ(Leica)TCS共焦点レーザー走査型顕微鏡上で可視化した。
【0102】
実施例7:OM99−1およびOM99−2の設計と合成
メマプシン2の特異性研究の結果に基づいて、P1およびP1' の位置に適した残基はLeuとAlaであろうと推定された。そして、特異性データから、P1' は、AlaやSerなどの小さな残基の方を好むと測定されたが、結晶構造(以下の実施例9で決定された)からは、この部位はもっと大きな残基を収容できることが示される。メマプシン2のP1' は、Ala、SerおよびAspなど、小さな側鎖をもつ残基が選択されるという、最も厳格な特異性条件をもつ位置であることが実証された。アルツハイマー病を治療するためのメマプシン2インヒビター薬物を設計するための条件である、血液脳関門を通過する上では、Alaの方がSerやAspよりも疎水性があって好適であるため、P1' には主にAlaが選択された。このため、LeuとAlaの間で遷移状態アナログ等配電子体(Leu*Alaと表示する。ここで、*は遷移状態にある等配電子体、−CH(OH)−CH2 −を意味する)が置かれるようにインヒビターを設計し、サブサイトP4、P3、P2、P2' 、P3' およびP4' は、ベータ−アミロイドタンパク質のスウェーデン型変異のベータ−セクレターゼ部位配列を充填した。インヒビターOM99−1およびOM99−2の構造を、以下、および図3Aと3Bにそれぞれ示す。
OM99−1:
(配列番号:27)
OM99−2:
(配列番号:28)
【0103】
Leu*Alaジペプチド等配電子体は、以下の通りに合成した。
【0104】
M2 インヒビターに対するLeu−Alaジペプチド等配電子体をL−ロイシンから調製した。スキーム1に示すように、L−ロイシンをジエチルエーテル中10% NaOH存在下でBOC2 Oで12時間処理することによって、そのBOC誘導体2として保護した。そして、クロロギ酸イソブチルおよびN−メチルピペリジンで処理した後、得られた混合無水物をN,O−ジメチルヒドロキシアミンで処理することによって、Boc−ロイシン2をウエインレブアミド3(Weinreb amide 3)に変換した(NahmとWeinreb、Tetrahedron Letters 1981, 32, 3815)。ジエチルエーテルに入れたリチウムアルミニウム水素化物によって3を還元したところアルデヒド4がえられた。エチルプロピオラート(ethyl propiolate)とリチウムジイソプロピルアミドの処理から生じるリチウムプロピオラート(lithium propiolate)とアルデヒド4を反応させると、42%の単離収率でジアステレオマーの分離不可能な混合物(5.8:1)としてアセチレンアルコール5が生成された(Fray, KayeおよびKeinman, J. Org. Chem. 1986, 51, 4828−33)。Pd/BaSO4 上で5の触媒的な水素化を行ない、得られたガンマ−ヒドロキシエステルの酸触媒作用によるラクトン化を、還流しているトルエン中で触媒量の酢酸を用いて行ない、73%の収率でガンマ−ラクトン6および7を得た。これらの異性体は、溶離剤であるヘキサン中40%酢酸エチルを用いて、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離した。7をヨウ化メチルによって立体選択的にアルキル化することによって、C−2位へのメチル基の付加を行なった(スキーム2)。このように、テトラヒドロフラン中−78℃でリチウムヘキサメチルジシラジド(lithium hexamethyldisilazide)(2.2当量)(30分)によってラクトン7の2価アニオンを生成し、−78℃で30分間ヨウ化メチルによってアルキル化した後、プロピオン酸(5当量)で急冷したところ、少量(5%未満)の対応エピマーとともに所望のアルキル化ラクトン8が提供された(収率76%)(GhoshとFidanze, 1998 J. Org. Chem. 1998, 63, 6146−54)。溶媒系として酢酸エチルおよびヘキサンの混合液(3:1)を用いた、シリカゲルに対するカラムクロマトグラフィーによって、エピマーのシス−ラクトンを除去した。アルキル化ラクトン8の立体化学的な配分は、広範な1 H−NMR NOE実験に基づいて行われた。水性リチウム水酸化物は、ラクトン8の加水分解を促進し、その後、ジメチルホルムアミド中、イミダゾールとジメチルアミノピリジン存在下、tert−ブチルジメチルシリル(tert−butyldimethylsilyl)塩化物によってガンマ位のヒドロキシル基が保護され、常法による精密操作とクロマトグラフィーの後に90%の収率で酸9が生じた。ジクロロメタンに入れたトリフルオロ酢酸によって0℃で1時間処理することによってBOC基の選択的な除去を行なった。次に、得られたアミン塩を、水性NaHCO3 存在下ジオキサンの中で市販の(ミルウォーキーのアルドリッチ社(Aldrich, Milwaukee))Fmoc−スクシニミド誘導体と反応させたところ、クロマトグラフィーの後、65%の収率でFmoc−保護されたL*A等配電子体10が得られた。保護された等配電子体10は、無作為配列インヒビターライブラリーの調製に使用した。
【0105】
実験手順
N−(tert−ブトキシカルボニル)−L−ロイシン(2)
ジエチルエーテル140 mL中10 g(76.2 mmol)のL−ロイシンの懸濁液に80 mLの10%NaOHを加えた。全ての固体を溶解した後、20 mL(87.1 mmol)のBOC2 Oを反応混合物に加えた。得られた反応混合物を23℃で12時間撹拌した。この時間経過後、層を分離して、1NのHCl水溶液を0℃で慎重に加えて、水層をpH 1になるまで酸性化した。得られた混合液を酢酸エチル(3×100 mL)で抽出した。有機層をまとめ、鹹水で洗浄してから、無水Na2 SO4 の上で乾燥させた。減圧下で溶剤を除去して、表題の産物を得、さらなる精製を行なうことなく次の反応に直接用いた(収率97%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ( 4.89 (broad d, 1 H, J = 8.3 Hz), 4.31 (m, 1 H), 1.74 - 1.49 (m, 3 H), 1.44 (s, 9 H), 0.95 (d, 6 H, J = 6.5 Hz).
【0106】
N−(tert−ブトキシカルボニル)−L−ロイシン−N' −メトキシ−N' −メチルアミド(3)
0℃のN2 雰囲気下で無水ジクロロメタン(25 mL)に入れたN,O−ジメチルヒドロキシアミン塩酸塩(5.52 g, 56.6 mmol)の撹拌溶液に、メチルピペリジン(6.9 mL, 56.6 mmol)を一滴ずつ加えた。得られた混合液を0℃で30分間撹拌した。別のフラスコの中で、N−(tert−ブチルオキシカルボニル)−L−ロイシン(1)(11.9 g, 51.4 mmol)を、N2 雰囲気下でTHF(45 mL)とジクロロメタン(180 mL)の混合液に溶解した。得られた溶液を−20℃に冷却した。この溶液に1−メチルピペリジン(6.9 mL, 56.6 mmol)を加えてから、クロロギ酸イソブチル(7.3 mL, 56.6 mmol)を加えた。得られた混合液を−20℃で5分間撹拌して、これに上記N,O−ジメチルヒドロキシアミン溶液を加えた。反応混合液を30分間−20℃に保った後、23℃まで温めた。反応液を水で急冷して層分離させた。水層をジクロロメタン(3×100 mL)で抽出した。一緒にした有機層を10%クエン酸、飽和重炭酸ナトリウムおよび鹹水で洗浄した。有機層を無水Na2 SO4 で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュ・シリカゲルクロマトグラフィー(25%酢酸エチル/ヘキサン)で精製して、表記化合物3を黄白色のオイルとして回収した(13.8 g, 97%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ( 5.06 (broad d, 1 H, J = 9.1 Hz), 4.70 (m, 1 H), 3.82 (s, 3 H), 3.13 (s, 3 H), 1.70 (m, 1 H), 1.46 - 1.36 (m, 2 H) 1.41 (s, 9 H), 0.93 (dd, 6 H, J = 6.5, 14.2 Hz).
【0107】
N−(tert−ブトキシカルボニル)−L−ロイシナール(4)
−40℃でN2 雰囲気下にある無水ジエチルエーテル(60 mL)に入れたリチウムアルミニウム水素化物(770 mg, 20.3 mmol)の撹拌懸濁液に、ジエチルエーテル(20 mL)に入れたN−tert−ブトキシカルボニル−L−ロイシン−N' −メトキシ−N' −メチルアミド(5.05 g, 18.4 mmol)を加えた。得られた反応混合液を30分間撹拌した。この時間経過後、反応液を10% NaHSO4 溶液(30 mL)で急冷した。次に、得られた反応混合液を23℃まで温め、この温度で30分間撹拌した。得られた溶液を濾過し、濾過ケーキを二部のジエチルエーテルで洗浄した。まとめた有機層を飽和重炭酸ナトリウム、鹹水で洗浄してから、無水MgSO4 の上で乾燥させた。減圧下で溶剤を蒸発させると、表題のアルデヒド4(3.41 g)が黄白色のオイルとして得られた。得られたアルデヒドは、それ以上精製することなく直ちに使用した。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ( 9.5 (s, 1 H), 4.9 (s, 1 H), 4.2 (broad m, 1 H), 1.8 - 1.6 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H), 1.49 - 1.39 (m, 1 H), 0.96 (dd, 6 H, J = 2.7, 6.5 Hz).
【0108】
エチル(4S,5S)−および(4R,5S)−5−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノ]−4−ヒドロキシ−7−メチロクト(methyloct)−2−イノエート(ynoate)(5)
【0109】
N2 雰囲気下で0℃で無水THF(60 mL)に入れたジイソプロピルアミンの撹拌溶液(1.1 mL, 7.9 mmol)に、n−BuLi(ヘキサン中1.6 M, 4.95 mL, 7.9 mmol)を一滴ずつ加えた。得られた溶液を0℃で5分間撹拌してから、23℃に温めて15分間撹拌した。この混合液を−78℃に冷却して、THF(2 mL)に入れたエチルプロピオラート(801 μL)を5分間にわたって一滴ずつ加えた。この混合液を30分間撹拌した後、8 mLの無水THFに入ったN−Boc−L−ロイシナール4(1.55 g, 7.2 mmol)を加えた。得られた混合液を−78℃で1時間撹拌した。この時間経過後、反応液をTHF(20 mL)に入れた酢酸(5 mL)で急冷した。反応混合液を23℃まで温め、鹹水溶液を加えた。層を分離させて、有機層を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、Na2 SO4 上で乾燥させた。溶剤を減圧下で蒸発させて残留物を得、それをフラッシュ・シリカゲルクロマトグラフィー(15%酢酸エチル/ヘキサン)で精製すると、アセチレンアルコール5の混合物(3:1)が得られた(0.96g、42%)。1H NMR (300 MHz, CDCl3) ( 4.64 (d, 1 H, J = 9.0 Hz), 4.44 (broad s, 1 H), 4.18 (m, 2 H), 3.76 (m, 1 H), 1.63 (m, 1 H), 1.43 - 1.31 (m, 2 H), 1.39 (s, 9 H), 1.29 - 1.18 (m, 3 H), 0.89 (m, 6 H).
【0110】
(5S,1’S)−5−[1’−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノ]−3’−メチルブチル]−ジヒドロフラン−2(3H)−オン(7)
酢酸エチル(20mL)に入れた上記アセチレンアルコールの混合物(1.73 g, 5.5mmol)の撹拌溶液に5% Pd/BaSO4 (1g)を加えた。得られた混合液は、50 psiで1.5時間水素化した。この時間経過後、セライト(Celite)の詰め物で触媒を濾過して除き、濾液を減圧下で濃縮した。残留物をトルエン(20mL)と酢酸(100μL)に溶解した。反応混合液を6時間還流した。この時間経過後、反応液を23℃に冷却し、溶剤を蒸発させると残留物が得られたので、これをフラッシュ・シリカゲルクロマトグラフィー(40%ジエチルエーテル/ヘキサン)で精製すると、(5S,1S' )−ガンマ−ラクトン7(0.94g, 62.8および(5R,1S' )−ガンマ−ラクトン6(0.16g, 10.7%)が得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) ( 4.50 - 4.44 (m, 2 H), 3.84 - 3.82 (m, 1 H), 2.50 (t, 2 H, J = 7.8 Hz), 2.22 - 2.10 (m, 2 H), 1.64 - 1.31 (m, 3 H), 1.41 (s, 9 H), 0.91 (dd, 6 H, J = 2.2, 6.7 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) ( 177.2, 156.0, 82.5, 79.8, 51.0, 42.2, 28.6, 28.2, 24.7, 24.2, 23.0, 21.9.
【0111】
(3R,5S,1S' )−5−[1' −[(tert−ブトキシカルボニル)アミノ]−3' −メチルブチル]−3−メチルジヒドロフラン−2(3H)−オン(8)
−78℃でN2 雰囲気下、無水THF(8 mL)中のラクトン7の撹拌溶液(451.8 mg, 1.67 mmol)にリチウムヘキサメチルジシラザン(disilazane)(THF中、3.67 mL, 1.0 M)を3分間にわたって加えた。得られた混合液を−78℃で30分間撹拌して、リチウムエノラートを生成させた。この時間経過後、Mel(228μL)を一滴ずつ加えて、得られた混合液を−78℃で20分間撹拌した。この反応液を飽和NH4 Cl水溶液で急冷し、23℃まで温めた。この反応混合液を減圧下で濃縮し、残留物を酢酸エチル(3×100 mL)で抽出した。まとめた有機層を鹹水で洗浄してから、無水Na2 SO4 の上で乾燥させた。溶剤を蒸発させると、シリカゲルクロマトグラフィー(15%酢酸エチル/ヘキサン)で精製されて、アモルファス固体としてアルキル化ラクトン8(0.36 g, 76%)を提供する残留物が生成された。1H NMR (300 MHz, CDCl3) ( 4.43 (broad t, 1 H, J = 6.3 Hz), 4.33 (d, 1 H, J = 9.6 Hz), 3.78 (m, 1 H), 2.62 (m, 1 H), 2.35 (m, 1 H), 1.86 (m, 1 H), 1.63 - 1.24 (m, 3 H), 1.37 (s, 9 H), 1.21 (d, 3 H, J = 7.5 Hz), 0.87 (dd, 6 H, J = 2.6, 6.7 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) ( 180.4, 156.0, 80.3, 79.8, 51.6, 41.9, 34.3, 32.5, 28.3, 24.7, 23.0, 21.8, 16.6.
【0112】
(2R,4S,5S)−5−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノ]−4−[(tert−ブチルジメチルシリル)オキシ]−2,7−ジメチルオクタン酸(9)
THF(2 mL)中のラクトン8の撹拌溶液(0.33 g, 1.17 mmol)に1N LiOHの水溶液(5.8 mL)を加えた。得られた混合液を23℃で10時間撹拌した。この時間経過後、この反応混合液を減圧下で濃縮し、残った水性残留物を0℃に冷却してから、25%クエン酸溶液でpH 4まで酸性化した。得られた酸性溶液を酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。まとめた有機層を鹹水で洗浄してから、Na2 SO4 の上で乾燥して濃縮し、対応するヒドロキシ酸(330 mg)を白色の泡として回収した。このヒドロキシ酸をさらに精製することなく、そのまま次の反応に用いた。
【0113】
無水DMF中の上記ヒドロキシ酸(330 mg, 1.1 mmol)にイミダゾール(1.59 g, 23.34 mmol)とブチルジメチルクロロシラン(1.76 g, 11.67 mmol)を加えた。得られた混合液を23℃で24時間撹拌した。この時間経過後、MeOH(4 mL)を加えて、混合液を1時間撹拌した。この混合液を25%クエン酸(20 mL)で希釈し、酢酸エチル(3×20 mL)で抽出した。抽出物をまとめたものを水、鹹水で洗浄してから、無水Na2 SO4 の上で乾燥した。溶剤を蒸発させると、粘性のあるオイルが得られ、それをシリカゲル(35%酢酸エチル/ヘキサン)上でフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、シリル(silyl)保護された酸9(0.44 g, 90%)が生成した。IR (neat) 3300-3000 (broad) 2955, 2932,2859,1711cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 343 K) delta 6.20 (broad s, 1 H), 3.68 (m, 1 H), 3.51 (broad s, 1 H), 2.49 - 2.42 (m, 1 H), 1.83 (t, 1 H, J = 10.1 Hz), 1.56 (m, 1 H), 1.37 (s, 9 H), 1.28 - 1.12 (m, 3 H), 1.08 (d, 3 H, J = 7.1 Hz), 0.87 (d, 3 H, J = 6.1 Hz) 0.86 (s, 9 H), 0.82 (d, 3 H, J = 6.5 Hz), 0.084 (s, 3 H), 0.052 (s, 3 H).
【0114】
(2R,4S,5S)−5−[(フルオルエニルメチルオキシカルボニル)アミノ]−4−[(tert−ブチルジメチルシリル)オキシ]−2,7−ジメチルオクタン酸(10)
ジクロロメタン(2 mL)中の酸9溶液(0.17 g, 0.41 mmol)に、0℃でトリフルオロ酢酸(500μL)を加えた。得られた混合液を0℃で1時間撹拌し、さらにこの混合液にトリフルオロ酢酸を一部(500μL)加えた。混合液をさらに30分間撹拌して、反応の進行をTLCでモニターした。この時間経過後、水浴の温度が5℃を超えないようにして、減圧下で溶剤を慎重に除去した。残留物を5 mLのH2 O中のジオキサン(3mL)とNaHCO3 (300 mg)に溶解した。この溶液に5 mLのジオキサンに入れたFmocスクシニミド(166.5 mg, 0.49 mmol)を加えた。得られた混合液を23℃で8時間攪拌した。次に、この混合液をH2 O(5 mL)で希釈し、25%水性クエン酸でpH 4に酸性化した。この酸性溶液を酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。抽出物をまとめたものを鹹水で洗浄してから、Na2 SO4 の上で乾燥し、減圧下で濃縮して、粘性のあるオイル残留物を得た。残留物をシリカゲルによるフラッシュ・クロマトグラフィーで精製したところ、Fmoc保護された酸10(137 mg, 61%)が白色の泡となって生じた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 343 K) ( 7.84 (d, 2 H, J = 7.4 Hz), 7.66 (d, 2 H, J = 8 Hz), 7.39 (t, 2 H, J = 7.4 Hz), 7.29 (m, 2 H), 6.8 (s, 1 H), 4.29 - 4.19 (m, 3 H), 3.74 - 3.59 (m, 2 H), 2.49 (m, 1 H), 1.88 (m, 1 H), 1.58 (m, 1 H), 1.31 - 1.17 (m, 3 H), 1.10 (d, 3 H, J = 7.1 Hz), 0.88 (s, 9 H), 0.82 (d, 6 H, J = 6.2 Hz), 0.089 (s, 3 H), 0.057 (s, 3 H).
【0115】
第4工程でLeu*Alaを取り込む固体状態ペプチド合成法(solid state peptide synthesis)によってOM99−1とOM99−2の合成を行なった。合成されたインヒビターを逆相HPLCによって精製し、質量分析法によってそれらの構造を確認した。
【0116】
実施例8.OM99−1およびOM99−2によるメマプシン2の阻害
OM99−1またはOM99−2を付加する以外は、上記した通りに酵素活性を測定した。OM99−1は、図5Aに示された通り、組換えメマプシン2を阻害した。計算されたKiは3×10-8Mである。用いられた基質は蛍光発生性合成ペプチド基質であった。同じ蛍光発生性基質を用いて組換えメマプシン2に対するOM99−2の阻害を測定した。Ki値は、図5Bに示すように、9.58×10-9Mであると判定された。
【0117】
これらの結果は、予想されたサブサイト特異性が正確であることと、予想された特異性に基づいてインヒビターを設計できることを実証している。
【0118】
M2インヒビターは、血液脳関門(BBB)を通過しなければならないため、P1およびP1' における残基が非常に重要である。P1' にAlaを選択すると、BBBの通過が容易になる。Ala側鎖のアナログも有効であろう。例えば、Alaのメチル側鎖以外に、置換されたメチル基、およびメチル基やエチル基とほぼ同じ大きさの基でAlaの側鎖を置換することができる。P1におけるLeuも、同じような大きさの基、またはLeuの側鎖上の置換によって置き換えることができる。BBBを通過するには、インヒビターを小さくすることが望ましい。したがって、OM99−1を出発点として、外側のサブサイトP4,P3、P3' およびP4' を切り捨てることができる。そして、強固に結合するM2インヒビターでBBBを通過することもできるものを置換することによって、Asn−Leu*Ala−Ala(配列番号:29)という保持された構造はさらに改善される。
【0119】
実施例9.特に設計されたインヒビターOM99−2と複合体化したヒトメマプシン2のプロテアーゼドメインの結晶化およびX線回折研究
OM99−2と複合体化した組換えヒトメマプシン2の結晶化の条件および予備的X線回折データを測定した。
【0120】
組換えメマプシン2の製造
約50 mgの組換えメマプシン2を、実施例3に記載した通りに精製した。最適な結晶成長を得るためには、メマプシン2を高度に精製する必要がある。pET11a−M2pdベクターからメマプシン2を過剰発現させた。このメマプシン2は、C末端側の伸長部分の末端までに前駆体ドメインおよび触媒ドメインを含むが、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない酵素原ドメインである。このベクターを大腸菌BL21(DE3)に形質転換して、50 mg/リットルのアンピシリンを含むZBアガー上に植菌した。シングルコロニーを選び出して、5 mgのアンピシリンを含む100 mlの液体ZBに接種し、220 RPMで振とうしながら30℃で18時間培養した。一晩培養した培養液から約15 mlの当量液を用いて、50 mgのアンピシリンを含むLB各1リットルに植菌した。180 RPMで振とうしながら37℃で培養菌を光学濃度が600 nmでほぼ0.8になるまで増殖させた。この時点で、各1リットルの培養液に119 mgのIPTGを加えることによって発現を誘導した。誘導後さらに3時間インキュベーションを続けた。
【0121】
細菌を回収し、50 mMトリス、150 mM NaCl, pH 7.5(TNバッファー)に懸濁し、6 mgのリゾチームと30分間インキュベートして溶菌した後、−20℃で18時間凍結した。溶菌液を融解して、撹拌しながら、1 mM MgCl2 、その後1000 KunitzユニットのDNAseを加えて、30分間インキュベートした。0.1%のTriton X−100を含むTN(TNTバッファー)によって容量を500 mlに増加させた。90%よりも多量のメマプシン2タンパク質を含む不溶性の封入体を遠心分離してペレットにし、1〜2時間撹拌しながらTNTで再懸濁して洗浄した。さらに3回TNTで洗浄した後、40 mlの8 M尿素、1 mM EDTA、1 mMグリシン、100 mMトリス塩基、100 mM β−メルカプトエタノール(8 M尿素バッファー)にメマプシン2の封入体を溶かした。280 nmにおける光学濃度を測定し、最終O.D.がほぼ0.5になるように、全部で10 mMとなるように十分な量のβ−メルカプトエタノール加え、また、10 mM DTT、1 mM還元型グルタチオン、および0.1 mM酸化型グルタチオンを加えつつ、8 M尿素緩衝液を用いて容量を増加させた。溶液のpHを10.0以上になるように調整してから、各200 mlの当量液4つに分けた。各200 mlを迅速に撹拌しながら、4リットルの20 mMトリス塩基で直ちに希釈した。1 M HClでpHをすぐに9.0に調整してから、4℃で一晩保存した。翌朝、希釈したメマプシン2溶液を室温に4〜6時間維持した後、pHを8.5に調整してから、該フラスコを4℃の部屋に置き換えた。翌日、pHを8.0に調整しながら同じ手順を行なった。
【0122】
このメマプシン2溶液を4℃に2〜3週間置いた。限外濾過(ミリポア社(Millipore))およびスター−セル(stir−cells)(アミコン社(Amicon))を用いて、全量で約16リットルを40 mlまで濃縮し、予め4℃に平衡化させておいたローターの中で140,000×gで30分間遠心分離した。回収した上清を、0.4 M尿素、20 mMトリス塩酸、pH 8.0で平衡した2.5×100 cmのS−300カラムにアプライして、同じ緩衝液によって30 ml/時で溶出を行なった。メマプシン2の活性画分を集めて、1 mlのリソース−Q(ファルマシア社(Pharmacia))カラムを用いたFPLCでさらに精製した。試料を濾過し、0.4 M尿素、50 mMトリス塩酸、pH 8.0で平衡化したリソース−Qカラムにアプライした。試料を同一緩衝液中0〜1 M NaClの勾配によって、2 ml/分で30 mlを超えるまで溶出した。メマプシン2を含む溶出液は、ほぼ0.4 M NaCl付近に出現したので、結晶化処理のためにほぼ5 mg/mlの濃度でプールした。
【0123】
結晶化前に、このタンパク質のアミノ末端配列を決定したところ、それぞれ28pと30pの残基で開始する2種類の配列を示した。明らかに、組換えプロメマプシン2の前駆ペプチドは、未確認のタンパク質分解活性によって調製を行っている間に切断された。
【0124】
フォールディングされた酵素前駆体から成熟酵素であるメマプシン2への活性化は、上記したようにして、すなわち、0.1 Mの酢酸ナトリウムpH 4.0中、22℃で16時間インキュベートして実施した。リソース−Q陰イオン交換カラムによる陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて、活性化された酵素をさらに精製した。酵素の純度は、SDS−ゲル電気泳動によって明らかにした。酵素の活性を確認するため、精製の各工程で上記したようにして酵素の比活性を測定した。
【0125】
OM99−2による予備的結晶化
Ki = 10 nMをもち、基質ベースの遷移状態にあるインヒビターOM99−2と複合体になっている精製メマプシン2について結晶実験を行なった。OM99−2は、S1とS1' (L−A)の間のペプチド結合が、遷移状態の等配電子体であるヒドロキシエチレンによって置換されている8個のアミノ酸残基(EVNLAAEFという配列中にサブサイトS4、S3、S2、S1 S1' 、S2' 、S3' 、およびS4' を含む)に相当する。精製したM2を濃縮して、10倍過剰モル量のインヒビターと混合した。この混合液を室温で2〜3時間インキュベートして、インヒビターの結合を最適化した。水滴蒸気拡散法(hanging drop vapor diffusion procedure)を用いて20℃で結晶化実験を行なった。メマプシン2/OM99−2インヒビター複合体の最適な結晶化条件を見つけるために、さまざまな結晶化条件を用いた体系的な調査を行なった。第一段階では、可能な条件範囲を広くカバーすることを目指して、ハンプトンリサーチ社(Hampton Research)から購入したスパースマトリクス結晶化スクリーニングキット(Sparse Matrix Crystallization Kits)を用いて大まかなスクリーニングを行なった。タンパク質濃度と温度を付加的な変数として用いた。続いて、pH、沈殿剤濃度などの細密なグリッドを用いて、有望な(微小)結晶を生じた条件を最適化の出発点として用いた。
【0126】
30%PEG8000、0.1 M Naコカダイレート(Cocadylate)、pH 6.4でメマプシン−インヒビター複合体の結晶が得られた。溶解した結晶のSDSゲル電気泳動によって、結晶の内容がメマプシン2であることを確認した。Raxis IV画像プレート上でデータ収集するために、いくつかの単結晶(約0.3 mm×0.2 mm×0.1 mmのサイズをもつ)を塊から注意深く取り出した。これらの結果は、結晶が2.6Åまで回折することを示していた。典型的なタンパク質の回折パターンを図6に示す。X線画像の可視化および統合用ソフトウエア−Denzoを用いて可視化し、回折データを指標化した。Denzoによって、原始的な斜方晶格子が、偏向度指数が有意に低く、最も高い対称性をもつことを確認した。単位格子パラメータは、α=89.1Å,b=96.6Å,c=134.1Å,α=β=γ=90°であると測定された。結晶学的な非対称単位当たり2個のメマプシン2/OM99−2複合体が存在し、結晶のVm値は2.9Å3 /Daである。回折の消滅によって、空間群はP21 21 21 であることを示唆していた。
【0127】
本結晶が2.6Åまで回折することから、これらのデータから得られた結晶構造は、原子的な解決、すなわち、原子の三次元的配置を明らかにする可能性があり、インビボおよびメマプシン2における化学結合を導き出すことができるかもしれない。メマプシン2の配列は、例えば、ペプシンまたはカテプシンDなど、哺乳動物の他のアスパラギン酸プロテアーゼに相同性があるため、メマプシン2の三次構造は、それらの構造物に類似(同一ではないが)していると予想される。したがって、本結晶から得られた回折データからX線構造を決定するときには、アスパラギン酸プロテアーゼの既知の結晶構造を検索モデルとして用いる分子置換法から位相の解が得られる可能性が高い。
【0128】
さらなる結晶化研究
濃縮したメマプシン2を10倍モル過剰のインヒビターと混合した。この混合液を室温で2〜3時間インキュベートして、インヒビター結合を最適化してから、0.2ミクロンのフィルターによって、遠心分離を用いて清澄化した。同量の酵素−インヒビターおよび充分量の溶液を用いた水滴蒸気拡散法によって、メマプシン2−インヒビター複合体の結晶を20℃で成長させた。回折実験に適した品質の結晶が、0.1 Mカコダイレート(cacodylate)ナトリウム、pH 7.4、0.2 M (NH4 )2 SO4 、および22.5%PEG8000において2週間で得られた。結晶の一般的な大きさは約0.4×0.4×0.2 mm3 であった。
【0129】
回折データは、リガク(Rigaku)X線発生器を有するRaxis IV画像プレート上で測定し、HKLプログラムパッケージによって処理した[Z. Otwinowski、W. Minor, Methods Enzymol. 276, 307 (1997)]。大きさが約0.4×0.4×0.2 mm3 の単一結晶を、25%PEG8000、20%グリセロール、0.1 Mカコダイレートナトリウム、pH 6.6、および0.2M (NH4 )2 SO4 からなる凍結防止液で処理してから、データを集めるため、液体窒素によって瞬時に−180℃まで冷却した。回折は1.9Å以上で観察された。結晶形は、空間群P21 に属し、結晶学的な非対称ユニット当たり2個のメマプシン2/OM99−2複合体をもち、溶剤含量が56%であった。
【0130】
分子置換は、プログラムAmoRe、CCP4パッケージ[Navaza, J.,Acta Crystallog. Sect. A. 50, 157 (1994)]を使用し、15.0〜3.5Åの範囲にあるデータを用いて行なった。22%の配列同一性を有するヒトアスパラギン酸プロテアーゼであるペプシンを検索モデル(PDB id 1psn)として使用した。ローテーションおよびトランスレーション検索を行なった後、リジッドボディーリファインメント(rigid body refinement)を行なって、最上解(top solution)を確認し、両方の分子を非対称ユニット内に位置づけた。最初の解は、相関係数が22%で、R−ファクターが0.51であった。プログラムCNSを用いて修正を行なった[Brungerら、Acta Crystallgr. Sect. D, 54, 905 (1998)]。Rfreeモニタリングに対するリファインメントを行なう前に、10%の反射を無作為に選択した[Bruger, A.T., X−PLORバージョン3.1:X線結晶学およびNMRのための装置(A system for X−ray Crystallography and NMR)、コネチカット州ニューヘブン(New Heaven, CT)のイェール大学出版(Yale University Press)(1992)]。マップを表示し、モデルを構築するために分子グラフプログラム(molecular graphic program)[Jones, T.A.ら、電子密度マップにおけるタンパク質モデルを構築するための改良法、およびこれらのモデルにおける誤差の位置(Improved methods for building protein models in electron density maps and location of errors in these models)、Acta Crystallogr. Sect. A 47, 110 (1991)]を用いた。配列アラインメントに従って、最初のペプシンモデルから、対応するアミノ酸残基をメマプシン2のアミノ酸残基に変えた。最初の電子密度マップおよびロトマー(rotomer)ライブラリーによって側鎖のコンフォメーションを決定した。分子の動態およびCNSのエネルギー最小化作用によってこのモデルを修正した[Bruger,ATら、Acta Crystallgr. Sect. D, 54, 905 (1998)]。最初のサイクルの修正では、Rworking が41%、Rfreeが45%となった。この段階では、オミットマップ(omit map)における電子密度は、活性部位の間隙におけるインヒビターコンフィギュレーションを明らかに示していた。鎖トレーシング、二次構造、挿入、欠失、および伸長(検索モデルと比較して)において、メマプシン2に独特な構造的な特徴を同定して、さらに、結晶学的なリファインメントとマップへのフィッティングを繰り返した。インヒビターを対応する電子密度の中に構築した。
【0131】
次に、3シグマレベルに合わせた|Fo|−|Fc|マップにおいて同定された構造体に約440個の溶媒分子を徐々に加えた。非結晶学的な対称限定および平均化法をリファインメントおよびモデル構築の初期の段階で用いた。リファインメントを行なっている間、大量の溶媒と異方性全Bファクター補正を適用した。Laskowski, R.A.ら、J. Appl. Crystallog. 26, 283 (1993)のPROCHECKプログラムによって最終構造物を確認したところ、95%の残基がラマチャンドラン(Ramachandran)プロットの最も好適な領域に位置づけられている。主鎖および側鎖のパラメータはすべて、標準的な基準の範囲内にあるか、それよりも優れている。最終的なRworking とRfreeは、それぞれ18%と22%である。リファインメントの統計値は表2に挙げてある。
【0132】
【表2】
【0133】
、ここで、Ihkl.i は、ith測定値の強度を示し、<Ihkl>は、Ihkl の測定値すべての重みづけをした平均値である。
、ここで、F0 およびFcは、測定され計算された構造因子である。かっこ内の数字は、最高の解像構造(resolution shell)(2.00〜1.9Å)に対して対応する数である。
による反射は、リファインメントとRファクターの計算の中に含まれる。
【0134】
メマプシン2の結晶構造
メマプシン2の二裂片性(bilobal)構造(図7)は、球形のコアという保存されたフォールディングをもつアスパラギン酸プロテアーゼの特徴である(Tang, J.,ら、Nature 271, 618−621 (1978))。基質結合間隙は、インヒビターが結合するところである(図7)が、2つのローブ(lobes)の間にある。N−末側ローブ(1〜180位の残基)およびC−末側ローブ(181〜385位の残基)の間にある(図7)疑似二重対称体は、4Åカットオフを用いると、全体で2.3Årmsの偏差で61個の重ね合わせ可能な原子を共有する。ペプシンでこれらに相当する数字は67個の原子および2.2Åである。活性部位のAsp32とAsp228 、および周囲の水素結合ネットワークは、間隙の中央に位置し(図7)、一般的な活性部位のコンフォメーションによって保存されている(Davies, D.R.,Annu. Rev. Biophys. Chem. 19, 189 (1990))。しかし、活性部位にあるカルボキシル基は、同一平面上にはなく、その角度(50°)は以前に測定されたものを上回っている。
【0135】
ペプシンと比較すると、N−末側ローブのコンフォメーションは実質的に保存されている(Sieleckiら、1990)。もっとも重要な構造上の違いは、C−末側ローブにおける挿入とC末端の伸長である。ヘリックスおよびループにある4つの挿入(図7)は、隣接する分子表面上にある。挿入Fは、4個の酸性残基を有しているが、この分子上で最も負に荷電した表面である。まとめると、これらの挿入によって、ペプシンと比較すると、メマプシン2の分子の境界線が有意に広がったのである(図8)。これらの表面の構造変化は、メマプシン2が他の細胞表面成分と結合するときに機能するのかもしれない。挿入BおよびEは、分子の別の側面上にある(図7)。後者は、C末端から伸長したGの一部と対合するベータ鎖を有している。活性部位間隙の反対面上のフラップに面しているループ上の329位のところで6残基の欠失が起きていて、外見上、より結合しやすい間隙ができている。C末端伸長の大部分(359〜393位の残基)は非常に秩序正しい構造になっている。369〜376位の残基は、鎖293〜299位に対する7個の水素結合によってベータ構造を形成し、一方、378〜383位の残基は、ヘリックスを形成している(図7および8)。メマプシン2に独特な2個のジスルフィド対(155/359位および217/382位の残基)は、伸長した領域の両端をC−末側ローブに固定化している。このC末端伸長は、以前観察されたものよりもずっと長く、コンフォメーションからして異なっている[Cutfield, S. M.ら、Structure 3, 1261 (1995);Abad−Zapatero, C.ら、Protein Sci. 5, 640 (1996); Symersky, J.ら、Biochemistry 36, 12700 (1997);Yang, J.ら、Acta Crystallogr. D 55, 625 (1999)]。最後の8残基(386〜393位)は電子密度マップでは見られず、それらは、球形の触媒ドメインと膜アンカードメインの間で結合用ステムを形成するのかもしれない。
【0136】
21個の推定前駆体残基のうち、最後の6個、43p〜48pだけが電子密度マップで可視化することができる。残りは、移動する可能性が高い。哺乳動物培養細胞中で発現したプロメマプシンはGlu33p がN末側位置である。しかし、残基43p〜44pに存在するArg−Arg配列は、例えば、プロレニン(prorenin)(Corvol, P.ら、Hypertension 5. 13−9 (1983))におけるように、プロタンパク質プロセッシングのための頻出シグナルである。この切断に由来する組換えメマプシン2は完全に活性をもつ。残基28p〜42pの移動性は、これらが成熟メマプシン2の構造の一部でないことを示唆している。
【0137】
メマプシン2−OM99−2相互作用
8残基からなるインヒビターOM99−2の活性部位間隙における結合は、他のアスパラギン酸プロテアーゼ−インヒビター複合体といくつか共通の構造的な特徴を有する〔Davies, D.R., Annu. Rev. Biophys. Chem. 19,189(1990);BaileyとCooper,(1994);Dealwisら,(1994)〕。これらには、遷移状態にある等配電子体のヒドロキシル基に対する、活性部位にある2つのアスパラギン酸の間における4個の水素結合、インヒビターの中央部分をフラップ(69〜75位の残基)で覆うこと、およびインヒビターの骨格に対する10個の水素結合が含まれる(図9)。後者の大部分はアスパラギン酸プロテアーゼの中で高度に保存されている〔Davies, D.R., Annu. Rev. Biophys. Chem. 19,189(1990);BaileyとCooper,(1994);Dealwisら,(1994)〕。ただし、Gly11およびTyr198 への水素結合はメマプシン2に固有のものである。これらの観察結果は、基質ペプチドの骨格に対するメマプシン2の遷移状態にある鋳型、および触媒の機序が、他のアスパラギン酸プロテアーゼと同様になる方法を具体的に示している。しかしながら、これらの共通の特徴は、高度な選択性をもつ特定のメマプシン2インヒビターを設計する上で決定的な要因ではない。
【0138】
インヒビター薬物を設計する上で重要な観察結果は、インヒビターの各側鎖と接触しているメマプシン2の残基(図9)は、他のアスパラギン酸プロテアーゼの残基とは全く異なっているということである。これら側鎖の接触は、高い選択性をもって固く結合するインヒビターを設計する上で重要である。OM99−2の5個のN末端残基は、引き延ばされた形のコンフォメーションになっているが、P1 ' Ala以外はすべて、活性部位の間隙にある酵素残基と、明らかに限定された(インヒビターの側鎖の4Å以内で)接触をもつ(図9)。
【0139】
プロテアーゼのS4 サブサイト(subsite)は、ほとんど親水性で、溶媒に対して開いている。インヒビターのP4 Gluの側鎖位置は、Gly11およびP2 Asn(図9)、および近傍にあるArg235 およびArg307 の側鎖への水素結合によって規定されるが、このことが、OM99−2からこの残基をなくすとKi値が10倍増加する理由を説明している。同様に、プロテアーゼのS2 サブサイトは、比較的親水性が高く、溶媒に対して開いている。インヒビターのP2 Asn側鎖は、P4 GluとArg235 に水素結合している。比較的小さなS2 である残基Ser325 とSer327 (ペプシンではそれぞれGlnおよびMet)は、Asnよりも大きな側鎖に適合することができる。メマプシン2のS1 およびS3 サブサイトは、大部分が疎水性残基からできているが、ペプシンのヘリクスhH2が欠失しているために、ペプシンとは非常に異なったコンフォメーションをもっている〔Dealwisら、(1994)〕。インヒビターの側鎖であるP3 ValおよびP1 Leuは、互いに対して密接に折り畳まれており、この酵素と実質的に疎水性結合しており(図9)、特に、P3 は、Tyr71およびPhe108 と相互作用する。未変性のAPPのベータ−セクレターゼ部位において、P2 およびP1 残基はそれぞれLysおよびMetである。スウェーデン型変異APPは、これらの位置にそれぞれAsnおよびLeuをもち、その結果、kcat /Km 値が未変性のAPPの値よりも60倍増加し、Mullan, M.ら[Nat. Genet. 2, 340(1992)]が記載した早期AD発病がもたらされた。この構造は、インヒビターのP2 Lysがその正の電荷をArg235 との好ましからざる相互作用に投入して、Arg235 との水素結合を失う一方で、P1 Metは、ロイシンがこの部位でもつ接触よりも好ましからざる接触をメマプシン2との間でもつことを示唆している(図10)。メマプシン2との密接な接触は、P1'Alaでは見られないので、この位置にあるアスパラギン酸は、APPにおけると同じように、Arg228 と相互作用することによって居場所を確保する可能性がある。
【0140】
インヒビターの鎖の方向は、P2'のところで変化して、P3'およびP4'をタンパク質の表面に導く(図10)。その結果、P2'Alaの側鎖位置が、通常の伸長型のコンフォメーションよりずれる。P3'GluおよびP4'Pheの側鎖は両方とも、プロテアーゼとの重要な相互作用をほとんどすることなく分子表面に向かわされる(図10)。比較的高いB−ファクター(Gluについては58.2Å2 、Pheについては75.6Å2 )と、十分には定義されていない電子密度は、これら2つの残基が、レニン(renin)インヒビター(CH−66)複合体(Dealwisら、1994)中のS3'およびS4'サブサイトの特定された構造とは対照的に比較的可動的であることを示唆している。これらのレニンサブサイトとトポロジー的に同等の領域(ペプシンの残基番号では292〜297位)は、メマプシン2では欠失している。これらの観察結果は、OM99−2の3個のC末端残基のコンフォメーションがメマプシン2の機能的な特徴であり、活性部位間隙から長いタンパク質基質を導きだす方法であるかもしれないことを示唆している。
【0141】
実施例10.インヒビターを設計するための結晶構造の使用
製薬学的に許容されるインヒビター薬物には、通常、800ダルトンよりも小さいというサイズ限定が付されている。メマプシン2インヒビターの場合、薬物が血液脳関門を通過しなければならないために、この要件はさらに厳格であろう[KearneyとAweeka、(1999)]。今回のモデルでは、P4 からP2'までを使用する十分に定義されたサブサイト構造によって、このような薬物を合理的に設計するための十分な鋳型領域が提供される。この結晶構造から明らかであるように、それぞれのインヒビターの側鎖と、それに対応する酵素のサブサイトとの空間的な関係によって、これらの位置それぞれにおいて、新しいインヒビター構造物の設計が可能である。サブサイトP2'、P3'およびP4'のユニークなコンフォメーションをメマプシン2インヒビターの選択性の中に取り込むことも可能である。今回の結晶構造に基づいたインヒビター設計の実例を以下に示す。
【0142】
実施例A:P3 ValおよびP1 Leuの側鎖は、互いに対して固くまとまっていて、その間に酵素構造がないため、これらの側鎖を架橋すれば、インヒビターのメマプシン2に対する結合強度を高めることができよう。これは、酵素に結合するときに、架橋したインヒビターは架橋していない同じものよりも遊離型と結合型の間にエントロピーの違いがでにくいであろう[Khan, A.R.ら、Biochemistry 37, 16839 (1998)]。架橋した側鎖の取りうる構造には、図11に示すものが含まれる。
【0143】
実施例B:同じ状況が、P4GluとP2Asnの間に存在する。今回の結晶構造は、これらの側鎖がすでに互いに水素結合しているので、これらの間を架橋しても、実施例Aに記載したような結合利益が派生するだろう。架橋した構造物には、図12に示すものなどがある。
【0144】
実施例C:今回の結晶構造に基づいて、新しい疎水性、ファンデルワールス力、およびH−結合による相互作用を付加するため、P1’Ala側鎖を延長させることができる。このような設計の一例が図13の略図に含まれている。
【0145】
実施例D:今回の結晶構造に基づいて、P1領域、P2領域およびP3領域の中のポリペプチド骨格、およびP1−Leuの側鎖を2個の原子を付加することによって橋架けして環にすることができる(図14のAおよびB)。また、メチル基をP1−Leuのベータ位炭素に付加することもできる(図14)。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、ベクターpET−11a−メマプシン2−T1およびpET−11a−メマプシン2−T2のプラスミド構築物を示す。T7プロモーター、該ベクター由来のアミノ酸配列(T7タンパク質)(配列番号:3)およびメマプシン2 T1およびT2構築物の始点および終点を示す。構築物プロメマプシン2−T1は、結晶化用のタンパク質の調製に用いた。これは、ベクターpET−11aに由来する残基1v〜15vを含む。残基1p〜48pは推定プロペプチドである。残基1〜393は成熟プロテアーゼドメインおよびC末端伸長に対応する。メマプシン2の残基のナンバリングはアラインメントを行ったペプシンのN末端位置で始まる(図3)。
【図2】 図2Aは、異なるpHでのM2pdによる合成ペプチドswAPP(表1を参照)の加水分解の初速度を示すグラフである。図2Bは、M2pdによるペプチド基質の加水分解の定常状態の速度論についての相対的なkcat /Km 値を示すグラフである。
【図3】 図3Aおよび図3Bは、メマプシン2インヒビターOM99−2およびOM99−1の化学構造である。
【図4】 図4Aは、OM99−1による組換えメマプシン2の阻害を示すグラフである。図4Bは、OM99−2による組換えメマプシン2の阻害を示すグラフである。
【図5】 図5A〜図5Eは、組換えメマプシン2‐OM99−2複合体の結晶の写真である。
【図6】 図6は、OM99−2が結合したメマプシン2プロテアーゼドメインの結晶構造の立体図である。メマプシン2のポリペプチド骨格をリボン図で示す。N‐ローブおよびC−ローブは、それぞれ「青色」および「黄色」で示される。ただし例外として、C−ローブ中の挿入ループ(A〜Gで示す、図6参照)は「マゼンタ色」で示され、C末端伸長は「緑色」で示される。これらのローブの間のインヒビター結合は「赤色」で示される。
【図7】 図7は、メマプシン2およびペプシンの三次元構造の比較を示す立体図である。前者の分子表面は、表面ループならびにヘリックスの挿入およびC末端伸長により、かなり大きいものとなっている。ヒトメマプシン2の鎖のトレースは「濃い青色」で示され、ヒトペプシンの場合は「グレー色」で示される。「淡い青色」で示されたボールは、トポロジー同等である同じ残基を示す。ジスルフィド結合は、メマプシン2の場合は「赤色」で示され、およびペプシンの場合は「オレンジ色」で示される。C末端伸長は「緑色」で示される。
【図8】 図8は、OM99−2とメマプシン2プロテアーゼドメインとの相互作用を示す概略図である。S3 ’およびS4 ’サブサイトは規定されていない。
【図9】 図9は、インヒビターOM99−2(「オレンジ色」で示される)とメマプシン2(「淡い青色」で示される)との相互作用を示す立体図である。窒素原子および酸素原子はそれぞれ「青色」および「赤色」で示される。水素結合は破線で示される。結合サブサイトを含むメマプシン2残基が含まれる。OM99−2の残基P4 、P3 、P2 、P1 およびP1 ’(図8中で規定)は、より広い範囲の立体配座の中にある。インヒビター鎖は残基P 2 ’で折り返しており、この位置で目立ったキンク(kink)を形成する。P3 ’およびP4 ’の骨格により、該インヒビターは活性部位からはみ出ている。
【図10】 図10は、今回の結晶構造に基づくメマプシン2の新しいインヒビターの設計におけるP3 Val側鎖とP1 Leu側鎖との間の架橋を示す概略図である。位置P2 およびP1 ’のRおよびR’は、アミノ酸側鎖を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【図11】 図11は、今回の結晶構造に基づくメマプシン2の新しいインヒビターの設計におけるP4 Glu側鎖とP2 Asn側鎖との間の架橋を示す図である。位置P3 のRは、アミノ酸側鎖を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【図12】 図12は、今回の結晶構造に基づく新しいメマプシン2インヒビターのP1 ’サブサイトにある側鎖の設計を示す概略図である。矢印はメマプシン2とインヒビターとの間で起こりうる相互作用を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【図13】 図13は、原子AおよびBを加えることによるインヒビター構造内での2つの6員環の設計を示す概略図である。環形成は、P1 、P2 およびP3 付近のペプチド骨格のP1 −Leu側鎖を含む。新しい結合は破線で示す。P1 −Leuのβ炭素にメチル基を加えることができる。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【配列表】
Claims (7)
- 配列番号:3のアミノ酸残基1〜456からなり、かつベータ−セクレターゼ活性を有する組換えメマプシン2タンパク質であって、該メマプシン2タンパク質は、細菌細胞中で発現され、細菌細胞中での発現後にリフォールディングされたものである、組換えメマプシン2タンパク質。
- 該メマプシン2タンパク質が、
(a)メマプシン2タンパク質を含む封入体を、8Mの尿素濃度および少なくとも1つの還元剤を有する少なくともpH 8.0のpHの尿素溶液中に溶解する工程;
(b)工程(a)で得られた溶液を、少なくともpH 9のpHを有する水性緩衝液中に希釈する工程;
(c)工程(b)で得られた溶液のpHをpH 8に調整する工程;ならびに
(d)工程(c)で得られた溶液を、24〜48時間の範囲の時間、4℃の温度で維持する工程
を含む方法によってリフォールディングされる、請求項1記載のメマプシン2タンパク質。 - 該メマプシン2タンパク質が、
(a)メマプシン2タンパク質を含む封入体を、8Mの尿素濃度および少なくとも1つの還元剤を有する少なくともpH 8.0のpHの尿素溶液中に溶解する工程;
(b)工程(a)で得られた溶液を、少なくともpH 9のpHを有し、酸化型グルタチオンおよび還元型グルタチオンを含む水性緩衝液中に希釈し、それによって、メマプシン2タンパク質の希釈溶液の尿素濃度が0.4Mまで減少される工程;ならびに
(c)工程(b)で得られた溶液のpHをpH 8に調整する工程
を含む方法によってリフォールディングされる、請求項1記載のメマプシン2タンパク質。 - 該メマプシン2タンパク質が、
(a)メマプシン2タンパク質を含む封入体を、8Mの尿素濃度およびpH 10以上のpHを有する尿素溶液中に溶解する工程;
(b)工程(a)で得られた溶液を水性緩衝液中に希釈する工程;
(c)工程(b)で得られた溶液のpHをpH 9.0に調整する工程;ならびに
(d)工程(c)で得られた溶液を、4℃の温度で16時間維持する工程
を含む方法によってリフォールディングされる、請求項1記載のメマプシン2タンパク質。 - 該方法が、
(e)工程(d)で得られた溶液を6時間室温まで平衡化する工程;
(f)工程(e)で得られた溶液のpHを8.5に調整する工程;
(g)工程(f)で得られた溶液を18時間4℃の温度まで冷却する工程;
(h)工程(g)で得られた溶液を6時間室温まで平衡化する工程;
(i)工程(h)で得られた溶液のpHを8.0に調整する工程;および
(j)工程(i)で得られた溶液を4〜7日間4℃の温度まで冷却する工程
をさらに含む、請求項4記載のメマプシン2タンパク質。 - 配列番号:3のアミノ酸残基43〜456または配列番号:3のアミノ酸残基45〜456からなる、メマプシン2タンパク質。
- 請求項6記載のメマプシン2タンパク質、または配列番号:3のアミノ酸残基43〜456からなるメマプシン2タンパク質および配列番号:3のアミノ酸残基45〜456からなるメマプシン2タンパク質の混合物を含む、組成物。
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