JP2009100766A - メマプシン２のインヒビターおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】β-アミロイド前駆体タンパク質からのβ-アミロイドタンパク質の産生に関与するプロテアーゼの新規な、改善されたインヒビター（例えば、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療に有効なメマプシン２インヒビター等）を開発すること。
【解決手段】（１）メマプシン２と少なくとも1つのメマプシン２基質および標準ペプチドの混合物とを接触させる工程；
（２）メマプシン２により標準ペプチドを加水分解して標準ペプチド加水分解産物を形成する工程；
（３）メマプシン２により少なくとも1つのメマプシン２基質を加水分解してメマプシン２基質加水分解産物を形成する工程；
（４）MALDI-TOF/MSデバイスを用いて標準ペプチド加水分解産物およびメマプシン２基質加水分解産物を同定および定量し、それにより標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の初期加水分解速度を決定する工程
を含む、標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の加水分解速度を決定する方法。
【選択図】なし
【解決手段】（１）メマプシン２と少なくとも1つのメマプシン２基質および標準ペプチドの混合物とを接触させる工程；
（２）メマプシン２により標準ペプチドを加水分解して標準ペプチド加水分解産物を形成する工程；
（３）メマプシン２により少なくとも1つのメマプシン２基質を加水分解してメマプシン２基質加水分解産物を形成する工程；
（４）MALDI-TOF/MSデバイスを用いて標準ペプチド加水分解産物およびメマプシン２基質加水分解産物を同定および定量し、それにより標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の初期加水分解速度を決定する工程
を含む、標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の加水分解速度を決定する方法。
【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、2001年３月14日に出願された米国仮出願第60/275,756号、および2000年12月28日に出願された同第60/258,705号の利益を主張し、その両者の全体の教示は参考としてその全体が援用される。
本出願は、2001年３月14日に出願された米国仮出願第60/275,756号、および2000年12月28日に出願された同第60/258,705号の利益を主張し、その両者の全体の教示は参考としてその全体が援用される。
発明の背景
本発明は、アルツハイマー病の治療および／または予防に有用なアスパラギン酸プロテアーゼメマプシン（memapsin）２（ベータ-セクレターゼ、またはβ-セクレターゼ）の特異的インヒビターの設計および合成の分野に属する。
本発明は、アルツハイマー病の治療および／または予防に有用なアスパラギン酸プロテアーゼメマプシン（memapsin）２（ベータ-セクレターゼ、またはβ-セクレターゼ）の特異的インヒビターの設計および合成の分野に属する。
アルツハイマー病（AD）は、Alios Alzheimerにより、認知能力における劇的な低下を患い、一般的な痴呆を有する彼の患者の１人を検査した後に、1907年に最初に記載された脳の変性障害である（The early story of Alzheimer's Disease, Bickらによる編集（Raven Press, New York 1987））。これは、高齢者における痴呆の主な原因である。AD患者は、記憶喪失および正常な個体として機能することができない点まで進行する知性機能に関する増大した問題を有する。知的技術の損失により、患者は、人格変化、社会的に不適当な行動および精神***病を示す（A Guide to the Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders, Jormによる編集（New York University Press, New York 1987））。ADは、回避不能な神経変性に対する有効な対症的または予防的な治療が存在しないために、被害者および彼らの家族の両方に対して破壊的である。
ADは、皮質、海馬、鉤状回、海馬傍回、および扁桃体において直径200μmまでの寸法の神経炎性局面（neuritic plaque）を付随する。神経炎性局面の主要な成分の１つは、アミロイドであり、これは、コンゴーレッドにより染色される（Fisher (1983); Kelly Microbiol.Sci. 1(9):214-219 (1984)）。コンゴーレッドにより染色されるアミロイド斑は細胞外にあり、明るいフィールドにおいて細胞外のピンクまたはサビ色であり、偏光において複屈折する。局面は、ポリペプチド原線維からなり、しばしば血管の周りに存在し、脳内の種々のニューロンへの血液供給を低減させる。
遺伝的素因、感染性因子、毒素、金属、および頭部外傷等の種々の因子は、AD神経障害の考えられうる機序として示唆されている。入手可能な証拠は、ADに関する個々の型の遺伝的素因が存在することを示唆する。最初に、分子解析は、所定のAD-罹患家族においてアミロイド前駆体タンパク質（APP）における変異の証拠を提供した（Goateら、Nature 349:704-706 (1991); Murrellら、Science 254:97- 99 (1991); Chartier-Harlinら、Nature 353:844-846 (1991); Mullanら、Nature Genet. 1: 345-347 (1992)）。早発性ADの優性な形態のさらなる遺伝子は、第14染色体および第１染色体にある（Rogaevら、Nature 376:775-778 (1995); Levy-Lahadら、Science 269:973-977 (1995); Sherringtonら、Nature 375: 754-760 (1995)）。ADに関連する別の遺伝子座位が第19染色体上にあり、アポリポタンパク質Ｅのバリアント形態をコードする（Corder, Science 261: 921-923 (1993)）。
アミロイド斑は、AD患者および40歳まで生存しているダウン症候群の個体において豊富に存在する。ダウン症候群におけるAPPの過剰発現は、30歳以上のダウン症患者におけるADの考えられうる原因として認識されている（Rumbleら、New England J. Med. 320: 1446-1452 (1989); Mannら、Neurobiol. Aging 10:397-399 (1989)）。斑はまた、より少数ではあるが、正常な加齢した脳に存在する。これらの斑は、主としてアミロイドβペプチドからなる（Aβ; 文献中ではまた、ときにはβ-アミロイドペプチドまたはβペプチドとも呼ばれる）（GlennerおよびWong, Biochem.Biophys. Res.Comm. 120:885-890 (1984)、これはまた、脳血管アミロイド沈着物中の主要なタンパク質成分である。アミロイドは、βプリーツ（pleated）シートに再配列される糸状材料である。Aβは、43アミノ酸までを含む疎水性ペプチドである。
そのアミノ酸配列の決定は、APP cDNA（Kangら、Nature 325:733-735 (1987); Goldgaberら、Science 235:877-880 (1987); Robakisら、Proc.Natl.Acad.Sci. 84:4190-4194 (1987); Tanziら、Nature 331:528-530 (1988))およびゲノムAPP DNA（Lemaireら、Nucl.Acids Res. 17:517-522 (1989); Yoshikaiら、Gene 87, 257-263 (1990)）のクローニングを導いた。３つの最も豊富な形態、APP695、APP751、およびAPP770を含む、多数の形態のAPP cDNAが同定された。これらの形態は、オルタナティブスプライシングにより単一の前駆体RNAから生じる。前記遺伝子は、18エキソンを伴って175kbよりも大きい（Yoshikaiら、1990)）。APPは、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。Aβは、疎水性膜貫通ドメインのすぐ外側に28アミノ酸まで、およびこの膜貫通ドメインの15残基までからなる。Aβは、通常、脳ならびに心臓、腎臓および脾臓等の他の組織で見出される。しかし、Aβ沈着物は、脳において唯一豊富に見出される。
Van Broeckhavenら、Science 248:1120-1122（1990）は、APP遺伝子が２組のオランダ人の家族において、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（HCHWA-D）に堅固に連鎖していることを示した。これは、２名のオランダ人患者におけるAPPコード領域内の点変異の発見により確認された（Levyら、Science 248: 1124-1128 (1990)）。前記変異は、Aβの22位のグルタミン酸をグルタミンに置換した（APP695の618位、またはAPP770の693位）。さらに、所定の家族は、アルツハイマー病（FAD）に遺伝的に罹りやすく、全長タンパク質の717位でのアミノ酸置換を生じる変異により、家族性アルツハイマー病（FAD）と呼ばれる条件にある（Goateら、(1991); Murrellら、(1991); Chartier-Harlinら、(1991)）。これらの変異は、家族内の疾患とともに同時分離し、遅発性ADを有する家族では存在しない。アミノ酸717でのこの変異は、APPからのAβのAβ1-42型の産生を増大する（Suzukiら、Science 264:1336-1340 (1994)）。別の変異体型は、全長タンパク質の670位および671位でのアミノ酸の変化を含む（Mullanら、(1992)）。アミノ酸670および671へのこの変異は、APPからの全Aβの産生を増大する（Citronら、Nature 360:620-674 (1992)）。
APPは、３つの部位でインビボにてプロセシングされる。この証拠は、膜会合メタロプロテアーゼによるβ-セクレターゼ部位での切断が生理的事象であることを示唆する。この部位は、原形質膜の管腔表面から12残基離れてAPPに位置する。β-セクレターゼ部位（原形質膜の管腔表面から28残基）およびβ-セクレターゼ部位（膜貫通領域内）の切断は、40/42-残基β-アミロイドペプチド（Aβ）を生じ、脳におけるその上昇した産生および蓄積は、アルツハイマー病の病原において中心的な事象である（総説については、Selkoe, D.J. Nature 399:23-31 (1999)）。プレセニリン１、ヒト脳において見出された別の膜タンパク質、はAPPγβ-セクレターゼ部位での加水分解を制御し、それ自身が原因となるプロテアーゼであると推論されている（Wolfe, M.S.ら、Nature 398:513-517 (1999)）。プレセニリン１は、単鎖分子として発現され、プロテアーゼ、プレセニリナーゼによるそのプロセシングは、迅速な分解からそれを防ぐのに必要とされる（Thinakaran, G.ら、Neuron 17:181-190 (1996)およびPodlisny, M.B.ら、Neurobiol.Dis. 3:325-37 (1997)）。プレセニリナーゼの正体は不明である。β-セクレターゼ部位のインビボプロセシングは、Aβ産生の律速段階であると考えられ（Sinha, S.& Lieberburg, I., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 96:11049-11053 (1999)）、それゆえ、強い治療標的である。
アミロイド斑形成の減少に有効なインヒビターの設計は、42アミノ酸ペプチド、AβのAβ1-42型を生じるようなAPPの切断における決定的な酵素の同定に依存する。いくつかの酵素が同定されたが、活性酵素を作製することは可能ではなかった。活性酵素なしでは、全てインヒビターの設計に必須である、基質特異性を確認することも、サブサイト特異性を決定することも、反応速度論または決定的活性部位残基を決定することもできない。
メマプシン２は、β-セクレターゼ、β-アミロイド前駆体タンパク質からのβ-アミロイドペプチドのヒト脳における産生に関与する鍵となるプロテアーゼであることが示された（総説については、Selkoe, D.J. Nature 399:23-31 (1999)）。現在、一般に、ヒト脳におけるβ-アミロイドペプチドの蓄積は、アルツハイマー病の主要な原因であると認められている。ヒトメマプシン２に対して特異的に設計されたインヒビターは、β-アミロイドペプチドの形成およびアルツハイマー病の進行を阻害または減少するはずである。
メマプシン２は、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーに属する。これは、アミノ酸配列において他の真核生物アスパラギン酸プロテアーゼに相同であり、そのファミリーに特異的なモチーフを含む。これらの構造的類似性は、メマプシン２および他の真核生物アスパラギン酸プロテアーゼが共通の触媒機序を有することを予測する、Davies, D.R., Annu.Rev.Biophys.Chem. 19, 189 (1990)。アスパラギン酸プロテアーゼに対する最も良好なインヒビターは、これらの酵素の遷移状態の擬態である。これらのインヒビターは、２つの四面体原子（例えば、ヒドロキシエチレン［-CH(OH)-CH2-］、これは最初にペプスタチンの構造において発見された（Marciniszynら、1976））により置換されるカルボニル炭素とアミド窒素との間の切断される平面のペプチド結合を有する基質様構造を有する。
β-アミロイド前駆体タンパク質からのβ-アミロイドタンパク質の産生に関与するプロテアーゼの新規な、改善されたインヒビター（例えば、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療に有効なメマプシン２インヒビター等）を開発する必要性が存在する。
本発明の要旨は、
〔１〕（１）メマプシン２と少なくとも1つのメマプシン２基質および標準ペプチドの混合物とを接触させる工程；
（２）メマプシン２により標準ペプチドを加水分解して標準ペプチド加水分解産物を形成する工程；
（３）メマプシン２により少なくとも1つのメマプシン２基質を加水分解してメマプシン２基質加水分解産物を形成する工程；
（４）MALDI-TOF/MSデバイスを用いて標準ペプチド加水分解産物およびメマプシン２基質加水分解産物を同定および定量し、それにより標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の初期加水分解速度を決定する工程
を含む、標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の加水分解速度を決定する方法、
〔２〕前記加水分解速度が初期加水分解速度である〔１〕記載の方法
に関する。
〔１〕（１）メマプシン２と少なくとも1つのメマプシン２基質および標準ペプチドの混合物とを接触させる工程；
（２）メマプシン２により標準ペプチドを加水分解して標準ペプチド加水分解産物を形成する工程；
（３）メマプシン２により少なくとも1つのメマプシン２基質を加水分解してメマプシン２基質加水分解産物を形成する工程；
（４）MALDI-TOF/MSデバイスを用いて標準ペプチド加水分解産物およびメマプシン２基質加水分解産物を同定および定量し、それにより標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の初期加水分解速度を決定する工程
を含む、標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の加水分解速度を決定する方法、
〔２〕前記加水分解速度が初期加水分解速度である〔１〕記載の方法
に関する。
本発明は、β-アミロイド前駆体タンパク質からのβ-アミロイドタンパク質の産生に関与するプロテアーゼの新規な、改善されたインヒビター（例えば、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療に有効なメマプシン２インヒビター等）を提供する。
発明の要旨
本発明は、メマプシン２活性のインヒビターおよびヒトにおけるアルツハイマー病を治療するためのメマプシン２のインヒビターの使用方法に関する。
本発明は、メマプシン２活性のインヒビターおよびヒトにおけるアルツハイマー病を治療するためのメマプシン２のインヒビターの使用方法に関する。
一つの態様では、本発明は、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターであり、該インヒビターは10-7M以下のKiを有する。
別の態様では、本発明は、MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070、およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物を含む。
さらに別の態様では、本発明は、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-070およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物を含む。
別の態様は、MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-070、およびMMI-071からなる群より選ばれるメマプシン２のインヒビターの有効量を個体に投与することを含むアルツハイマー病の発症の可能性または進行を減少させるために患者を治療する方法を含む。
さらなる態様では、本発明は、メマプシン２基質の混合物をメマプシン２と反応させる工程およびメマプシン２基質の混合物の相対初期加水分解速度を測定することによりメマプシン２のサブサイト優先度を決定する工程を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法である。
さらに別の態様では、本発明は、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法を含む。OM99-2から取得された塩基配列を含むメマプシン２インヒビターのコンビナトリアルライブラリーが調製される。インヒビターのライブラリーは、メマプシン２でプロービングされ、ここでメマプシン２は、１つまたは複数のインヒビターに結合し、１つまたは複数の結合メマプシン２が生成され、結合メマプシン２はメマプシン２に対して惹起された抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体で検出される。
さらなる態様では、本発明は、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターをヒトに投与することを含み、該インヒビターは10-7M以下のKiを有する、アルツハイマー病を患うヒトを治療する方法を含む。
さらに別の態様では、本発明は、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターをヒトに投与することを含み、該インヒビターは10-7M以下のKiを有し、ここで該インヒビターは配列番号：２のアミノ酸28〜441の側鎖および骨格原子について0.5Å根平均二乗差（root mean square difference）を有する、アルツハイマー病を患うヒトを治療する方法に関する。
本発明のさらなる態様は、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-070およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物をヒトに投与することを含む、アルツハイマー病を患うヒトを治療する方法である。
さらに別の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、10-7M以下のKiを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用に関する。
さらなる態様では、本発明は、ヒトにおけるアルツハイマー病の血治療のための医薬の製造のための、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビター、該インヒビターは10-7M以下のKiを有し、ここで該インヒビターはメマプシン２のアミノ酸18〜379の側鎖および骨格原子について0.5Å以下の根平均二乗差を有する、の使用に関する。
さらに別の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物の使用に関する。
組換えの触媒的に活性なメマプシン２の基質およびサブサイト特異性を使用して、メマプシン２の機能を阻害しうる天然のメマプシン２基質の基質アナログを設計した。最初に、基質アナログ、OM99-2に結合したメマプシン２のＸ線結晶解析結晶学を使用して、メマプシン２の三次元構造、ならびに結合における種々の残基の重要性を決定した。次いで、基質アナログを、メマプシン２の天然のペプチド基質に関連することが示されているペプチド配列および結晶学的構造に基づいて設計した。基質アナログは、メマプシン２により切断され得ないアミド（ペプチド）結合の少なくとも１つのアナログを含む。
触媒的に活性なメマプシン２の基質およびサブサイト特異性は、質量分析、例えば、MALDI-TOF/MS（マトリックス補助レーザー脱離／イオン化-飛行時間/質量分析）を用いて基質の初期加水分解速度を測定する方法によりさらに決定された。あるいは、メマプシンのサブサイト特異性を、メマプシン２でインヒビターのライブラリーをプロービングし、続いてメマプシン２に対して惹起した抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いて結合メマプシンを検出することによりさらに決定した。基質およびサブサイト特異性情報を用いて、メマプシン２の機能を阻害しうる天然のメマプシン２基質のさらなる基質アナログを設計した。
決定的なアミノ酸残基の部位での同配体を含む基質アナログの合成のプロセスを開発した。基質アナログ、OM99-1、OM99-2および70より多くの他の基質アナログを合成した。OM99-2は、遷移状態同配体ヒドロキシエチレン基により置換されたLeu-Alaペプチド結合をともなうオクタペプチドGlu-Val-Asn-Leu-Ala-Ala-Glu-Phe（配列番号：28）に基づく。OM99-2の阻害定数は、組換えプロ-メマプシン２に対して1.6x10-9Mである。MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-066、MMI-070、およびMMI-071の阻害定数は、組換えプロ-メマプシン２に対して1.4〜61.4x10-9Mの範囲の阻害定数を有する。
メマプシン２アスパラギン酸プロテアーゼ活性を阻害する組成物は小分子であり得、これは血液脳関門を容易に通過し、経口投与され、腸酵素により不活化されない。さらに、かかる組成物は、製造するのに比較的に安価であり、β-アミロイド前駆体タンパク質のメマプシン２切断を優先的に阻害することが望ましい。
この情報は、有機化学および酵素学の当業者が精通している市販のソフトウェアプログラムおよび技術を用いて、さらなる新規インヒビターを設計するために当業者により使用されうる。例えば、インヒビターの側鎖は、阻害効力を増大するために、より強い相互作用（水素結合、疎水性相互作用、電荷相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を介して）を生成するために変更され得る。このタイプの情報に基づき、小さな相互作用を有する残基は、インヒビターの分子量を減少するための新規インヒビター設計から除去されうる。酵素に由来する構造的妨害を有さない側鎖は、効果的なインヒビターコンフォメーションにロックするように架橋されうる。このタイプの構造はまた、メマプシン２の結合部位を効率的にふさぎ、さらにより良好な薬学特性を生じうるペプチド代用物の設計を可能にする。インヒビター用化合物の合理的な設計およびスクリーニング、ならびにそれらの特徴付けが本発明において提供される。メマプシン２の阻害に効果的な組成物は、小分子インヒビター、および血液脳関門を通過しうるインヒビターを含む。かかるインヒビターは、メマプシン２、またはその基質と相互作用し、メマプシン２による切断を阻害しうる。
本発明は、メマプシン２活性を阻害する化合物、特にメマプシン２のアスパラギン酸プロテアーゼ活性を阻害する化合物を提供し、これはβ-アミロイド前駆体タンパク質をβ-アミロイドに変換する。本発明の化合物はヒトにおけるアルツハイマー病を治療するために使用されうる。
本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、本発明の好ましい態様の以下のより詳細な記載から明らかである。
発明の詳細な説明
本発明の特徴および他の詳細は、本発明の工程としてまたは本発明の部分の組合せのいずれかとして、ここでより詳細に記載され、特許請求の範囲に指摘される。本発明の特定の態様は、説明のために示されるのであって、本発明の限定のためではないことが理解される。本発明の原理特徴は、本発明の範囲から逸脱すること無く種々の態様において使用されうる。
本発明の特徴および他の詳細は、本発明の工程としてまたは本発明の部分の組合せのいずれかとして、ここでより詳細に記載され、特許請求の範囲に指摘される。本発明の特定の態様は、説明のために示されるのであって、本発明の限定のためではないことが理解される。本発明の原理特徴は、本発明の範囲から逸脱すること無く種々の態様において使用されうる。
Ｉ．インヒビターの設計および合成
メマプシン２の基質アナログの設計
５個のヒトアスパラギン酸プロテアーゼが、相同なアミノ酸配列を有し、類似の三次元構造を有する。活性部位に２個のアスパラギン酸残基があり、各残基は、サインアスパラギン酸プロテアーゼ配列モチーフであるAsp-Thr/Ser-Gly-内に見出される。一般に、２個の相同なドメインがアスパラギン酸プロテアーゼ内にあり、基質結合部位は、三次元構造に基づいてこれらの２個のドメイン間に配置される。アスパラギン酸プロテアーゼの基質結合部位は、一般に、８個のアミノ酸残基を認識する。一般に、アスパラギン酸プロテアーゼにより切断されるアミド結合の各側に４つの残基が存在する。
メマプシン２の基質アナログの設計
５個のヒトアスパラギン酸プロテアーゼが、相同なアミノ酸配列を有し、類似の三次元構造を有する。活性部位に２個のアスパラギン酸残基があり、各残基は、サインアスパラギン酸プロテアーゼ配列モチーフであるAsp-Thr/Ser-Gly-内に見出される。一般に、２個の相同なドメインがアスパラギン酸プロテアーゼ内にあり、基質結合部位は、三次元構造に基づいてこれらの２個のドメイン間に配置される。アスパラギン酸プロテアーゼの基質結合部位は、一般に、８個のアミノ酸残基を認識する。一般に、アスパラギン酸プロテアーゼにより切断されるアミド結合の各側に４つの残基が存在する。
典型的に、各アミノ酸の側鎖は、基質／アスパラギン酸プロテアーゼ相互作用の特異性に関与する。各基質残基の側鎖は、集合的にサブサイトと呼ばれる酵素の領域により認識される。プロテアーゼサブサイトおよびその対応する基質残基のための一般に是認された命名法が以下に示され、ここで二重斜線は、結合切断の位置を表わす。
プロテアーゼサブサイト S4 S3 S2 S1 S1' S2' S3' S4'
基質残基 P4 P3 P2 P1 // P1' P2' P3' P4'
プロテアーゼサブサイト S4 S3 S2 S1 S1' S2' S3' S4'
基質残基 P4 P3 P2 P1 // P1' P2' P3' P4'
アスパラギン酸プロテアーゼ基質認識のための一般的なモチーフがある一方、各プロテアーゼは非常に異なる基質特異性および特異性の幅を有する。一度アスパラギン酸プロテアーゼの特異性がわかると、その特異性に基づいて天然基質が効率よく切断されるのを妨げるようにアスパラギン酸プロテアーゼと相互作用するインヒビターが設計されうる。いくつかのアスパラギン酸プロテアーゼは、首尾よい加水分解のために各サブサイトにおける多くの異なる残基を順応させることができる特性を有する。ペプシンおよびカテプシンＤは、この型の特性を有し、「広範な」基質特異性を有すると言われる。レニンにおけるように非常に少ない残基のみがサブサイトで認識されうる場合、アスパラギン酸プロテアーゼは、ストリンジェントなまたは狭小な特異性を有すると言われる。
アスパラギン酸プロテアーゼの特異性に関する情報は、好ましい残基が特異的なサブサイトに配置され、切断されたペプチド結合が遷移状態のアナログに置換される特異的なインヒビターを設計するために使用されうる。これらのアナログは、遷移状態同配体と呼ばれる。アスパラギン酸プロテアーゼは、アミド結合を加水分解機構により切断する。この反応機構は、アミノ酸のβ−炭素上の水酸化物イオンによる攻撃を伴う。プロトン化が、切断される結合を介してβ−炭素に付着した他の原子で生じる必要がある。β−炭素が不十分に求電子性であるか、または切断対象の結合に付着した原子が不十分に求核性である場合、結合は加水分解機構により切断されないであろう。遷移状態を模倣しないが非加水分解型であるアナログが存在するが、遷移状態同配体は、遷移状態を特異的に模倣し、非加水分解型である。
遷移状態理論は、酵素がその最も高い親和性を有するのは、酵素が触媒する反応の遷移状態中間体であることを示す。所定の酵素に対して最も高い親和性を有するのは、基質の基底構造ではなく、遷移状態構造である。アミド結合の加水分解についての遷移状態は四面体である一方、基底状態構造は平面である。Marciniszynら(1976)によりペプスタチンにおいて最初に発見されたように、アスパラギン酸プロテアーゼの典型的な遷移状態同配体は、-CH(OH)-CH2-である。遷移状態アナログ原理は、ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼであるアスパラギン酸プロテアーゼに対するインヒビター薬物に首尾よく応用されている。これらの多くは、現在臨床的に使用されている。インヒビターの構造、特異性および型における情報は、Tang, Acid Proteases, Structure, Function and Biology, Adv. in Exptl. Med. Biol. vol. 95(Plenum Press, NY 1977); Kostka, Aspartic Proteinases and their Inhibitors(Walter de Gruyter, Berlin 1985); Dunn, Structure and Functions of the Aspartic Proteinases, Adv. in Exptl. Med. Biol. 306(Plenum Press, NY 1991); Takahashi, Aspartic Proteases, Structure, Function, Biology, Biomedical Implications, Adv. in Exptl. Med. Biol. 362(Plenum Press, NY 1995); and James, Aspartic Proteinases, Retroviral and Cellular Enzymes, Adv. in Exptl. Med. Biol. 436(Plenum Press, NY 1998) において見出され得、その全教示は全体として本発明に取り込まれる。
一般に、基質アナログ組成物は、一般式 X-L4-P4-L3-P3-L2-P2-L1-P1-L0-P1'-L1'-P2'-L2'-P3'-L3'-P4'-L4'-Y である。基質アナログ組成物は、小ペプチド分子のアナログである。その基本構造は、構造／機能研究を介して決定されたペプチド配列に由来する。 Pxにより表される位置は、-L0-により表される切断部位に関連する基質特異性位置を表わすことが理解される。 Lxにより表される組成物の位置は、各基質特異性位置 Pxの間の連結領域を表わす。
メマプシン２に対する天然の基質において、 Px-Lx対は、切断対象のペプチドの単一のアミノ酸を表わすであろう。この一般式において、式の各 Px部は、それぞれのα−炭素および側鎖官能基がアミノ酸であることを言う。したがって、アラニンに対する Px-Lx対の Px部分は、HC-CH3を表わす。一般の組成物の Px部分を表わす一般式は、-R1CR3- である。
一般に、R1は、CH3(アラニンの側鎖) 、CH(CH3)2(バリンの側鎖) 、CH2CH(CH3)2(ロイシンの側鎖) 、(CH3)CH(CH2CH3)(イソロイシンの側鎖) 、CH2(インドール)(トリプトファンの側鎖) 、CH2(ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖) 、CH2CH2SCH3(メチオニンの側鎖) 、H(グリシンの側鎖) 、CH2OH(セリンの側鎖) 、CHOHCH3(トレオニンの側鎖) 、CH2(フェノール)(チロシンの側鎖) 、CH2SH(システインの側鎖) 、CH2CH2CONH2(グルタミンの側鎖) 、CH2CONH2(アスパラギンの側鎖) 、CH2CH2CH2CH2NH2(リジンの側鎖) 、CH2CH2CH2NHC(NH)(NH2)(アルギニンの側鎖) 、CH2(イミダゾール)(ヒスチジンの側鎖) 、CH2COOH(アスパラギン酸の側鎖) 、CH2CH2COOH( グルタミン酸の側鎖) 、およびこれらの機能的な天然および非天然誘導体または合成置換基のいずれかでありうる。
R3が単一のＨであることが、最も好ましい。しかしながら、一般に、R3は、メマプシン２に結合することが可能であるアルケニル、アルキニル(alkynal) 、アルケニルオキシおよびアルキニルオキシ基でありうる。好ましくは、アルケニル、アルキニル、アルケニルオキシ、およびアルキニルオキシ基は、 2〜40個の炭素、より好ましくは2 〜20個の炭素、2 〜10個の炭素、または2 〜3 個の炭素、これらの機能的天然および非天然誘導体またはその合成置換基を有する。
Px-Lx対の Lx部は、Px領域を互いに連結する原子を表わす。天然の基質において、 Lxは、鎖における次のアミノ酸であるアミノ部分に付着するβ−炭素を表わす。したがって、 Lxは、-CO-NH- により表されうる。 Lxに対する一般式は、R2により表される。一般にR2は、CO-NH(アミド) 、CH(OH)(CH2)(ヒドロキシエチレン) 、CH(OH)CH(OH) (ジヒドロキシエチレン) 、CH(OH)CH2NH(ヒドロキシエチルアミン) 、PO(OH)CH2(ホスフィネート) 、CH2NH(還元アミド) でありうる。基質アナログがアスパラギン酸プロテアーゼ機能を阻害するように機能する限り、１つより多いL-が同配体でありうることが理解される。
同配体でないLsは、アミド結合でありうるか、または非加水分解型であるアミド結合の模倣体でありうる。
X およびY は、アスパラギン酸プロテアーゼ認識部位による認識に典型的には関与しないが、認識を妨げない分子を表わす。これらの分子は、基質アナログの分解に対する耐性を与えることが好ましい。好ましい例は、非加水分解型結合を介して基質アナログに結合したアミノ酸である。他の好ましい化合物は、キャッピング薬剤である。さらに他の好ましい化合物は、ビオチンなどの基質アナログの精製において使用されうる化合物である。
本明細書で使用される場合、アルキルは、置換または非置換の直鎖、分枝または環状のアルキル基のことを言い；アルコキシは、置換または非置換の直鎖、分枝または環状のアルコキシのことを言う。好ましくは、アルキルおよびアルコキシ基は、 1〜40個の炭素、より好ましくは1 〜20個の炭素、1 〜10個の炭素、または1 〜3 個の炭素を有する。
本明細書で使用される場合、アルケニルは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルケニル基のことを言い；アルキニルは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルキニル基のことを言い；アルケニルオキシは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルケニルオキシのことを言い；アルキニルオキシは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルキニルオキシのことを言う。好ましくは、アルケニル、アルキニル、アルケニルオキシおよびアルキニルオキシ基は、 2〜40個の炭素、より好ましくは2 〜20個の炭素、2 〜10個の炭素、または2 〜3 個の炭素を有する。
本明細書で使用される場合、アルカリール（alkaryl）は、アリール置換基を有するアルキル基のことを言い；アラルキルは、アルキル置換基を有するアリール基のことを言い；ヘテロ環−アルキルは、アルキル置換基を有するヘテロ環基のことを言い；アルキル−ヘテロ環は、ヘテロ環置換基を有するアルキル基のことを言う。
アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、およびアルキニルオキシ基に対する置換基は、ハロゲン、シアノ、アミノ、チオ、カルボキシ、エステル、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、ヒドロキシ、またはメルカプトでありうる。さらに、この基は、O 、NHまたはS などのヘテロ原子で置換された１つ以上のメチレン基を任意に有しうる。
多数の異なる基質が試験および解析され、メマプシン２に対する切断規則が決定された。解析された基質の結果を表１に示し、この結果から決定した規則を以下に要約する。
（１）メマプシン２の基質に対する主要な特異性部位は、サブサイト位置S1' である。これは、メマプシン２における基質特異性に対する最も重要な決定基がアミノ酸のP1' であることを意味する。P1' は、メマプシン２が基質を認識するために小さい側鎖でありうる。好ましい態様は、基質アナログであり、ここでP1位ノR1は、H(グリシンの側鎖) 、CH3(アラニンの側鎖) 、CH2OH(セリンの側鎖)、またはCH2COOH(アスパラギン酸の側鎖) のいずれかである。構造的にCH3(アラニンの側鎖) またはCH2OH(セリンの側鎖) より小さいR1を有する態様もまた好ましい。しかしながら、表１における基質は、そのアミノ酸組成のために、メマプシン２の基質特異性の完全な提示を与えない。それゆえ、P1' は、言及した小残基に限定されないが、以下のものも含む：
CH2CH(CH3)2(ロイシンの側鎖)
(CH3)CH(CH2CH3)(イソロイシンの側鎖)
CH2(インドール)(トリプトファンの側鎖)
CH2(ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)
CH(CH3)2(バリンの側鎖)
CH2(フェノール)(チロシンの側鎖)
CH2CH2SCH3(メチオニンの側鎖)
CH(CH3OH)(トレオニンの側鎖)
CH2CONH(アスパラギンの側鎖)
CH2CH2CONH (グルタミンの側鎖)
CH2CH2COOH (グルタミン酸の側鎖)
CH2CH2CH2CH2NH3(リジンの側鎖)
CH2CH2CH2NC(NH2)2(アルギニンの側鎖)
CH2(イミダゾール)(ヒスチジンの側鎖)
CH2CH(CH3)2(ロイシンの側鎖)
(CH3)CH(CH2CH3)(イソロイシンの側鎖)
CH2(インドール)(トリプトファンの側鎖)
CH2(ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖)
CH(CH3)2(バリンの側鎖)
CH2(フェノール)(チロシンの側鎖)
CH2CH2SCH3(メチオニンの側鎖)
CH(CH3OH)(トレオニンの側鎖)
CH2CONH(アスパラギンの側鎖)
CH2CH2CONH (グルタミンの側鎖)
CH2CH2COOH (グルタミン酸の側鎖)
CH2CH2CH2CH2NH3(リジンの側鎖)
CH2CH2CH2NC(NH2)2(アルギニンの側鎖)
CH2(イミダゾール)(ヒスチジンの側鎖)
（２）位置P4, P3, P2, P1, P2', P3'およびP4' に特異的配列必要条件はない。各部位は、規則第３を満たす限り、特性において任意の他のアミノ酸残基を適応しうる。
（３）残りの７個の位置P4, P3, P2, P1, P2',P3' およびP4' の少なくとも２個は、疎水性残基を作製するR1を有さなければならない。残りの７個の位置P4、P3、P2、P1、P2' 、P3' およびP4' において、少なくとも３個の疎水性残基があることが好ましい。疎水性基を含むこの位置のための好ましいR1基は、CH3(アラニンの側鎖) 、CH(CH3)2(バリンの側鎖) 、CH2CH(CH3)2 (ロイシンの側鎖) 、CH3CH(CH2CH3)(イソロイシンの側鎖) 、CH2(インドール)(トリプトファンの側鎖) 、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖) 、CH2CH2SCH3(メチオニンの側鎖) 、CH2(フェノール)(チロシンの側鎖) である。疎水性基が大きな疎水性基であることがより好ましい。大きな疎水性基を含む好ましいR1は、CH(CH3)2 (バリンの側鎖) 、CH2CH(CH3)2(ロイシンの側鎖) 、(CH3)CH(CH2CH3)(イソロイシンの側鎖) 、CH2(インドール)(トリプトファンの側鎖) 、CH2 (ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖) 、CH2CH2SCH3(メチオニンの側鎖) 、CH2 (フェノール)(チロシンの側鎖) である。疎水性R1を有する位置が、CH(CH3)2(バリンの側鎖) 、CH2CH(CH3)2 (ロイシンの側鎖) 、CH2(ベンゼン)(フェニルアラニンの側鎖) 、CH2CH2SCH3 (メチオニンの側鎖) 、またはCH2(フェノール)(チロシンの側鎖) であるのが最も好ましい。
（４）８個の位置P4, P3, P2, P1, P1', P2', P3' およびP4' のいずれもR1位にプロリン側鎖を有さないであろう。
（５）全てのサブサイトが、アナログにおいて表されるP を有する必要があるというわけではない。例えば、基質アナログは、X-P2-L1-P1-L0-P1'-L1'-P2'-L2'-P3'-L3'-Y を有しうるか、または X-L1-P1-L0-P1'-L1'-P2'-L2'-P3'-L3'-P4'-L4'-Y を有しうる。
好ましい基質アナログは、P1およびP1' 間に非加水分解型アナログを持つ表１に開示された配列を有するアナログである。
インヒビターを作製するためのコンビナトリアル化学
コンビナトリアル化学は、小分子または別の高分子のいずれかに結合可能である分子を単離するための全ての方法を含むが、それらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチド、および多糖が、高分子の例である。例えば、所定の機能、触媒性またはリガンド結合を有するオリゴヌクレオチド分子は、ランダムオリゴヌクレオチドの複合混合物から単離され得、これは「インビトロ遺伝学」と呼ばれている(Szostak, TIBS 19:89, 1992、その教示は、全体として本明細書に取り込まれる) 。１つは、ランダム配列および規定配列を保有する分子のラージプールを合成し、複合混合物、例えば、100 ヌクレオチドRNA の100 μg の中約1015の個々の配列を、ある選択および富化プロセスに供する。カラム上のリガンドに結合した分子のアフィニティークロマトグラフィーおよびPCR 増幅の繰り返しサイクルを介して、Ellington およびSzostak(1990) は、1010RNA 分子の中の１つが小分子色素に結合する方法でフォールディングされると見積もった。かかるリガンド結合挙動を有するDNA 分子は、良好に単離されている(EllingtonおよびSzostak, 1992; Bock ら、1992、その全教示は、全体として本明細書に取り込まれる) 。
コンビナトリアル化学は、小分子または別の高分子のいずれかに結合可能である分子を単離するための全ての方法を含むが、それらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチド、および多糖が、高分子の例である。例えば、所定の機能、触媒性またはリガンド結合を有するオリゴヌクレオチド分子は、ランダムオリゴヌクレオチドの複合混合物から単離され得、これは「インビトロ遺伝学」と呼ばれている(Szostak, TIBS 19:89, 1992、その教示は、全体として本明細書に取り込まれる) 。１つは、ランダム配列および規定配列を保有する分子のラージプールを合成し、複合混合物、例えば、100 ヌクレオチドRNA の100 μg の中約1015の個々の配列を、ある選択および富化プロセスに供する。カラム上のリガンドに結合した分子のアフィニティークロマトグラフィーおよびPCR 増幅の繰り返しサイクルを介して、Ellington およびSzostak(1990) は、1010RNA 分子の中の１つが小分子色素に結合する方法でフォールディングされると見積もった。かかるリガンド結合挙動を有するDNA 分子は、良好に単離されている(EllingtonおよびSzostak, 1992; Bock ら、1992、その全教示は、全体として本明細書に取り込まれる) 。
類似の目標を目指す技術が、小有機分子、タンパク質およびペプチドならびに当業者に公知の他の分子について存在する。小さい合成分子、オリゴヌクレオチド、タンパク質またはペプチドのライブラリーに基づくかどうかの所望の活性に対する分子のスクリーニングセットは、広くコンビナトリアル化学と呼ばれる。
デノボ活性または改変された活性のいずれかを有するタンパク質を単離するための多数の方法がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーが何年も使用されている。所定の機能を有するタンパク質を単離するための好ましい方法は、Roberts およびSzostak に記載されている(Roberts R.W. およびSzostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302(1997)、その教示は全体として本明細書に取り込まれる) 。ペプチドを単離するために設計されたコンビナトリアル法のための別の好ましい方法は、Cohen らに記載されている(Cohen B.A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (24):14272-7(1998)、その教示は、全体として本明細書に取り込まれる) 。この方法は、改変ツーハイブリッド技術を利用する。酵母ツーハイブリッドシステムが、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および解析のために有用である。酵母サッカロミセスセレビジエにおいて最初に記載されたツーハイブリッドシステムは、目的のタンパク質に特異的な新規調節分子を同定するための強力な分子遺伝的技術である(Fields およびSong, Nature 340:245-6(1989)、その教示は全体として本明細書に取り込まれる) 。Cohen らはこの技術を改変したので、選択分子に結合する合成または遺伝子工学によるペプチド配列の間の新規相互作用が、同定されうる。このタイプの技術の利益は、選択が細胞内環境においてなされることである。この方法は、酸性活性化ドメインに付着するペプチド分子のライブラリーを利用する。選択ペプチド、例えばメマプシン２の細胞外部分は、Gal4などの転写活性化タンパク質のDNA 結合ドメインに付着する。このタイプのシステムでツーハイブリッド技術を行うことにより、メマプシン２の細胞外部分に結合する分子が同定されうる。
小分子ライブラリーのスクリーニング
これらのより専門化された技術に加えて、当業者に周知の方法論が、種々の小分子またはコンビナトリアルライブラリーと組み合わせて、所望の標的であるメマプシン２またはその基質のいずれかに結合するか、またはそれと相互作用する分子を単離し、かつ特徴付けるために使用されうる。この化合物の関連する結合アフィニティーが比較され得、最適のインヒビターが、当業者に周知の競合または非競合結合研究を用いて同定されうる。好ましい競合インヒビターは、メマプシン２の非加水分解型アナログである。もう１つは、メマプシン２の機能または正しいフォールディングを妨害するアロステリック再配列を生じる。
これらのより専門化された技術に加えて、当業者に周知の方法論が、種々の小分子またはコンビナトリアルライブラリーと組み合わせて、所望の標的であるメマプシン２またはその基質のいずれかに結合するか、またはそれと相互作用する分子を単離し、かつ特徴付けるために使用されうる。この化合物の関連する結合アフィニティーが比較され得、最適のインヒビターが、当業者に周知の競合または非競合結合研究を用いて同定されうる。好ましい競合インヒビターは、メマプシン２の非加水分解型アナログである。もう１つは、メマプシン２の機能または正しいフォールディングを妨害するアロステリック再配列を生じる。
コンピューター補助合理的薬物設計
インヒビターを単離するための別の方法は、合理的設計を介する。これは、構造情報およびコンピューターモデリングを介して達成される。コンピューターモデリング技術は、選択分子の三次元原子構造の視覚化、および分子と相互作用する新規化合物の合理的設計を可能にする。三次元構造は、典型的には、選択分子のＸ線結晶学解析またはNMR イメージングに由来するデータに依存する。分子動力学は、力場(force field) データを必要とする。コンピューターグラフィックスシステムは、どのように新規化合物が、標的分子に結合し、結合特異性を完成するための化合物および標的分子の構造の実験操作を可能にするのかに対する予測を可能にする。例えば、NMR 分光法を用いて、Inouyeおよび共同研究者は、TSHK（膜貫通センサーヒスチジンキナーゼ）の触媒部位の個々のサブドメインの構造を保持するＮ末端切形TSHKフラグメントの構造情報を得ることができた。NMR 研究を基礎として、彼らは潜在的なTSHKインヒビターを同定することができた（Inouye、米国特許第 6,077,682号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。別の良好な例は、高分解能Ｘ線結晶学を用いて決定されたカルシニューリン／FKBP12／FK506 複合体の三次元構造に基づき、カルシニューリン活性部位結合ポケットと補助のFKBP12／FK506 結合ポケットの両方の形状および構造を得る（Armistead に対する米国特許第 5,978,740号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。手中のこの情報を用いて、研究者は、天然のリガンドまたは基質とそれに対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合をよく理解し得、したがって有効なインヒビターを設計および作製しうる。
インヒビターを単離するための別の方法は、合理的設計を介する。これは、構造情報およびコンピューターモデリングを介して達成される。コンピューターモデリング技術は、選択分子の三次元原子構造の視覚化、および分子と相互作用する新規化合物の合理的設計を可能にする。三次元構造は、典型的には、選択分子のＸ線結晶学解析またはNMR イメージングに由来するデータに依存する。分子動力学は、力場(force field) データを必要とする。コンピューターグラフィックスシステムは、どのように新規化合物が、標的分子に結合し、結合特異性を完成するための化合物および標的分子の構造の実験操作を可能にするのかに対する予測を可能にする。例えば、NMR 分光法を用いて、Inouyeおよび共同研究者は、TSHK（膜貫通センサーヒスチジンキナーゼ）の触媒部位の個々のサブドメインの構造を保持するＮ末端切形TSHKフラグメントの構造情報を得ることができた。NMR 研究を基礎として、彼らは潜在的なTSHKインヒビターを同定することができた（Inouye、米国特許第 6,077,682号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。別の良好な例は、高分解能Ｘ線結晶学を用いて決定されたカルシニューリン／FKBP12／FK506 複合体の三次元構造に基づき、カルシニューリン活性部位結合ポケットと補助のFKBP12／FK506 結合ポケットの両方の形状および構造を得る（Armistead に対する米国特許第 5,978,740号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。手中のこの情報を用いて、研究者は、天然のリガンドまたは基質とそれに対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合をよく理解し得、したがって有効なインヒビターを設計および作製しうる。
分子−化合物の相互作用の予測は、小さな変化が一方または両方でなされる場合、分子力学ソフトウエアおよび計算的に強いコンピューターを必要とし、通常分子設計プログラムとユーザーの間の使いやすい、メニュー選択方式接点とあわされる。分子モデリングシステムの例は、CHARMmおよびQUANTAプログラム、Polygen Corporation, Waltharn, MA である。CHARMmは、エネルギー最小化および分子動力学機能を行なう。QUANTAは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を行なう。QUANTAは、互いの分子の挙動の相互作用構築、改変、視覚化、および解析を可能にする。
Rotivinen ら、1988, Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166; Ripka, New Scientist 54-57(June 16, 1988); McKinaly and Rossmann, 1989 Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 111-122; PerryおよびDavies, QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193(Alan R. Liss, Inc. 1989; LewisおよびDean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236, 125-140 および141-162 ；および核酸成分に対するモデル酵素に関してAskew ら、1989 J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-1090 、その全教示は全体として本明細書に取り込まれる) などの多くの文献が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリングを概説する。化学物質を選抜し、線図で描く他のコンピュータープログラムは、BioDesign,Inc., Pasadena, CA., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada,およびHypercube, Inc., Cambridge, Ontario などの会社から入手可能である。
結合を変更しうる化合物の設計および作製に関して上記したが、天然産物または合成化学物質、およびタンパク質を含む生物学的活性物質を含む公知の化合物のライブラリーを、基質結合または酵素活性を変更する化合物のために選抜することもできる。
ライブラリーのスクリーニング
基質アナログの設計および合理的薬物設計は、活性部位および標的の理解に基づき、酵素およびその基質の詳細な構造を作製するコンピューターソフトウエアプログラム、ならびに単独またはインヒビターの存在下でそれらが相互作用する手段を利用する。これらの技術は、手中のＸ線結晶学データを用いて有意に増強される。インヒビターはまた、触媒的に活性な酵素を阻害するものに対して存在する化合物のライブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。メマプシン２に関する文献における報告とは対照的に、本明細書に記載の酵素は、天然産生酵素に対して活性類似性を有し、内因性活性を阻害する化合物を同定するための手段を提供する。これらの潜在的インヒビターは、酵素、基質（好ましくは発色基質）および潜在的インヒビター（濃度の範囲全域で通常スクリーニングされる）が混合され、基質の切断の程度が決定される高スループットアッセイを用いて典型的に同定される。潜在的に有用なインヒビターは、切断の量を減少させるものである。
基質アナログの設計および合理的薬物設計は、活性部位および標的の理解に基づき、酵素およびその基質の詳細な構造を作製するコンピューターソフトウエアプログラム、ならびに単独またはインヒビターの存在下でそれらが相互作用する手段を利用する。これらの技術は、手中のＸ線結晶学データを用いて有意に増強される。インヒビターはまた、触媒的に活性な酵素を阻害するものに対して存在する化合物のライブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。メマプシン２に関する文献における報告とは対照的に、本明細書に記載の酵素は、天然産生酵素に対して活性類似性を有し、内因性活性を阻害する化合物を同定するための手段を提供する。これらの潜在的インヒビターは、酵素、基質（好ましくは発色基質）および潜在的インヒビター（濃度の範囲全域で通常スクリーニングされる）が混合され、基質の切断の程度が決定される高スループットアッセイを用いて典型的に同定される。潜在的に有用なインヒビターは、切断の量を減少させるものである。
II．触媒的に活性な組換えメマプシン２の調製
メマプシン２のクローニングおよび発現
実施例１に記載のように、メマプシン２をクローニングし、ヌクレオチド配列（配列番号：１）および予測アミノ酸配列（配列番号：２）を決定した。cDNAをフラグメントから組み立てた。ヌクレオチドおよびその規定するタンパク質配列を、それぞれ配列番号：１および配列番号：２に示す。タンパク質は、EP 0 855 444 A SmithKline Beecham Pharmaceuticals, (1998年 7月29日発行) 、米国特許第 6,319,689号明細書、Sinha ら、Nature 402, 537-540 (1999 年12月) およびVassarら、Science 286, 735-741(1999 年10月22日) （その全教示は全体として本明細書に取り込まれる）に記載のアスパラギン酸プロテアーゼ２(ASP2)と同一である。
メマプシン２のクローニングおよび発現
実施例１に記載のように、メマプシン２をクローニングし、ヌクレオチド配列（配列番号：１）および予測アミノ酸配列（配列番号：２）を決定した。cDNAをフラグメントから組み立てた。ヌクレオチドおよびその規定するタンパク質配列を、それぞれ配列番号：１および配列番号：２に示す。タンパク質は、EP 0 855 444 A SmithKline Beecham Pharmaceuticals, (1998年 7月29日発行) 、米国特許第 6,319,689号明細書、Sinha ら、Nature 402, 537-540 (1999 年12月) およびVassarら、Science 286, 735-741(1999 年10月22日) （その全教示は全体として本明細書に取り込まれる）に記載のアスパラギン酸プロテアーゼ２(ASP2)と同一である。
プロ−メマプシン２は、他のアスパラギン酸プロテアーゼに相同であり、マウスAPS1とホモロジーを共有する（米国特許第 6,291,223号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。アラインメントに基づいて、プロ−メマプシン２は、プロ領域、アスパラギン酸プロテアーゼ領域、およびＣ末端近くの膜貫通領域を含む。Ｃ末端ドメインは、80残基長を超える。活性酵素はメマプシン２であり、そのプロ−酵素はプロ−メマプシン２である。
触媒的に活性な酵素の再フォールディング
基質特異性を決定し、かつインヒビターを設計するために、触媒的に活性な組換え酵素を発現させることが必要である。活性部位は膜貫通領域中ではなく、活性は膜固定を必要としないので、メマプシン２は、実施例３に記載のように、２つの異なる長さで、両者とも膜貫通領域無しで大腸菌中で発現させ、精製した。トランスフェクトした細菌の培養、組換えタンパク質の合成の誘導、ならびに組換えタンパク質を含む封入体の回収および洗浄のための手順は、本質的にLin ら、(1994)（その教示は全体として本明細書に取り込まれる) により記載されたものである。再フォールディングのために、8M尿素／100mM β−メルカプトエタノールなどの強い変性／還元溶液中にタンパク質を溶解させる。タンパク質が再フォールディングされる割合、およびどの溶液中であるかが、活性に重要である。ある方法では、タンパク質が8M尿素／100mM β−メルカプトエタノール中に溶解され、次いで20容量の20mM-Tris 、pH9.0 中に迅速に希釈され、それを次いで1M HClを用いてpH8 にゆっくり調整する。次に、再フォールディング溶液を、精製を行なう前に24〜48時間 4℃に保つ。第２の方法では、等量の20mM Tris 、0.5mM 酸化型／1.25mM還元型グルタチオン、pH 9.0が、急速攪拌した8M尿素／10mMβ−メルカプトエタノール中のプロ−メマプシン２に添加される。このプロセスが、１時間の間隔でさらに３回繰り返される。次に、最終尿素濃度が0.4Mになるように、得られた溶液を十分な容量の20mM Tris ベースに対して透析する。次に、溶液のpHを1M HClを用いて8.0 にゆっくり調整する。
基質特異性を決定し、かつインヒビターを設計するために、触媒的に活性な組換え酵素を発現させることが必要である。活性部位は膜貫通領域中ではなく、活性は膜固定を必要としないので、メマプシン２は、実施例３に記載のように、２つの異なる長さで、両者とも膜貫通領域無しで大腸菌中で発現させ、精製した。トランスフェクトした細菌の培養、組換えタンパク質の合成の誘導、ならびに組換えタンパク質を含む封入体の回収および洗浄のための手順は、本質的にLin ら、(1994)（その教示は全体として本明細書に取り込まれる) により記載されたものである。再フォールディングのために、8M尿素／100mM β−メルカプトエタノールなどの強い変性／還元溶液中にタンパク質を溶解させる。タンパク質が再フォールディングされる割合、およびどの溶液中であるかが、活性に重要である。ある方法では、タンパク質が8M尿素／100mM β−メルカプトエタノール中に溶解され、次いで20容量の20mM-Tris 、pH9.0 中に迅速に希釈され、それを次いで1M HClを用いてpH8 にゆっくり調整する。次に、再フォールディング溶液を、精製を行なう前に24〜48時間 4℃に保つ。第２の方法では、等量の20mM Tris 、0.5mM 酸化型／1.25mM還元型グルタチオン、pH 9.0が、急速攪拌した8M尿素／10mMβ−メルカプトエタノール中のプロ−メマプシン２に添加される。このプロセスが、１時間の間隔でさらに３回繰り返される。次に、最終尿素濃度が0.4Mになるように、得られた溶液を十分な容量の20mM Tris ベースに対して透析する。次に、溶液のpHを1M HClを用いて8.0 にゆっくり調整する。
次に、分子量排除および／または塩グラジエントを用いる溶出に基づくカラムクロマトグラフィーを用いて再フォールディングタンパク質をさらに精製し、還元および非還元条件下でのSDS-PAGE解析により解析する。
III. 基質特異性およびメマプシン２の酵素動力学
インヒビターは、メマプシン２によるその基質の結合および切断の阻害に対してスクリーニングされうる。
インヒビターは、メマプシン２によるその基質の結合および切断の阻害に対してスクリーニングされうる。
基質特異性
脳におけるメマプシン２の存在(M2)は、β−アミロイド前駆体タンパク質(APP) を加水分解しうることを示した。下記のように、詳細な酵素および細胞の研究は、M2がβ−セクレターゼの基準に全て適合することを示した。M2の三次元構造を、タイプＩ完全膜タンパク質としてモデル化した。モデルは、その球状プロテアーゼユニットが、膜表面から20〜30残基の距離範囲で膜固定したポリペプチドを加水分解しうることを示唆した。脳の膜貫通タンパク質として、APP は潜在的な基質であり、原形質膜表面から約28残基に位置するそのβ−セクレターゼ部位は、M2タンパク質分解の範囲内である。
脳におけるメマプシン２の存在(M2)は、β−アミロイド前駆体タンパク質(APP) を加水分解しうることを示した。下記のように、詳細な酵素および細胞の研究は、M2がβ−セクレターゼの基準に全て適合することを示した。M2の三次元構造を、タイプＩ完全膜タンパク質としてモデル化した。モデルは、その球状プロテアーゼユニットが、膜表面から20〜30残基の距離範囲で膜固定したポリペプチドを加水分解しうることを示唆した。脳の膜貫通タンパク質として、APP は潜在的な基質であり、原形質膜表面から約28残基に位置するそのβ−セクレターゼ部位は、M2タンパク質分解の範囲内である。
この部位に由来する合成ペプチド(SEVKM／DAEFR)（配列番号：５）を、M2pd(Ala-8P〜Ala326のアミノ酸を含む改変M2) によりβ−セクレターゼ部位（／によりしるしをつけた）で加水分解した。APP β−セクレターゼ部位に由来し、「スウェーデン変異(Swedish mutation)」(Mullan, M. ら、Nature Genet. 2:340-342(1992) 、その教示は全体として本明細書に取り込まれる) を含む第２ペプチド(SEVNL／DAEFR)（配列番号：６）は、細胞において Aβ産生のレベルを高めることが知られており(Citron, M. ら、Nature 260: 672-674(1992) 、その教示は全体として本明細書に取り込まれる) 、非常に高い触媒効率でM2pdにより加水分解された。両方の基質は、pH4.0 で最適に切断された。プレセニリン１のプロセシング部位に由来するペプチド (SVNM／AEGD) （配列番号：７）もまた、低効率の速度論的パラメーターでM2pdにより切断された。APP γ−セクレターゼ部位に由来するペプチド(KGGVVIATVIVK)（配列番号：８）は、M2pdにより切断されなかった。ペプスタチンＡは、M2pdをわずかに阻害した（IC50約0.3mM ）。速度論的パラメーターは、プレセニリン１(kcat,0.67s -1, Km, 15.2mM; Kcat/Km,43.8s -1M -1)および天然APP ペプチド(Kcat/Km,39.9s-1M -1) の両方がスウェーデン(Swedish)APPペプチド(kcat, 2.45s -1,Km, 1mM; Kcat/Km,2450s-1 M-1) ほど良好な基質ではないことを示す。
M2が、哺乳動物細胞においてAPP β−セクレターゼ機能を所有するかどうかを決定するために、メマプシン２をHela細胞中で一過性に発現させ(Lin, X.ら、FASEB J. 7:1070-1080(1993)、その教示は、全体として本明細書に取り込まれる) 、35S-Met を用いて代謝的にパルス標識し、次にSDS-ポリアクリルアミド電気泳動後のAPP-生成フラグメントの可視化および画像化のために抗-APP抗体を用いて免疫沈降した。パルス−チェイス実験のならし培地(2h)由来の免疫沈降 APP Nβ−フラグメント(97kD バンド) のSDS-PAGEパターンは、APP がM2により切断されることを示した。対照をAPP 単独でトランスフェクトし、APP およびM2を用いて同時トランスフェクトし、バフィロマイシンA1を用いた添加を行なった。APP βC-フラグメント(12kD)のSDS-PAGEパターンが、上記と同じ実験のならし培地から免疫沈降された。対照をAPP 単独でトランスフェクトし；APP およびM2を用いて同時トランスフェクトし；APP およびM2を用い、バフィロマイシンA1を用いて同時トランスフェクトし；スウェーデンAPP のトランスフェクション；ならびにスウェーデンAPP およびM2の共トランスフェクションを行った。SDS-PAGEゲルはまた、免疫沈降M2(70kD)、M2トランスフェクト細胞；長時間のフィルム曝露後の非トランスフェクトHela細胞；およびHEK293細胞由来の内因性M2のランであった。異なるAPP 領域に特異的な抗体を用いた免疫沈降後のならし培地から回収したAPP フラグメント(100kDβN-フラグメントおよび95kDβN-フラグメント) のSDS-PAGEパターンは、メマプシン２がAPP を切断することを示した。
APP およびM2の両方を発現する細胞は、ならし培地中で97kD APPβN-フラグメント（Ｎ末端からβセクレターゼ部位まで）および細胞溶解産物中で12kDβC-フラグメント（βセクレターゼ部位からＣ末端まで）を産生した。APP 単独でトランスフェクトした対照は、検出可能ではないほどのβN-フラグメントを産生し、βC-フラグメントを産生しない。バフィロマイシンA1は、リソソーム／エンドソームの小胞内pHを上げることが公知であり、かつβ−セクレターゼによりAPP 切断を阻害することが示されており(Knops, J.ら、J. Biol. Chem. 270: 2419-2422(1995) 、その教示は、その全体が本明細書に取り込まれる) 、同時トランスフェクト細胞におけるβN-およびβC-の両方のAPP フラグメントの産生を廃止する。スウェーデンAPP 単独でトランスフェクトした細胞は、細胞溶解産物においてβC-フラグメントバンドを産生しなかったが、スウェーデンAPP およびM2の共トランスフェクションはそれを産生した。このスウェーデンβC-フラグメントバンドは、野生型APP よりも強力であた。97kDβN-バンドがまた、ならし培地で見られたが、野生型APP トランスフェクションとほぼ同じ強度であった。
これらの結果は、M2がエンドソームなどの酸性区画においてAPP のβセクレターゼ部位をプロセスすることを示す。トランスフェクトされたM2遺伝子の発現を達成するために、パルス標識細胞は、溶解され、抗M2抗体により免疫沈降された。βセクレターゼを発現することが公知のHEK293細胞由来の主要バンドと同じ移動度を有する70kDのM2バンドは、M2遺伝子でトランスフェクトされた細胞において知見された（Citron, M.ら、Nature 260:672-674(1992)、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。M2の非常にかすかなバンドがまた、長いフィルム曝露後にトランスフェクトされていないHeLa細胞において知見され、これは非常に低レベルの内因性M2を示し、このレベルは、M2トランスフェクションなしにβN-またはβC-フラグメントを産生するのには不十分である。Ａβペプチドの残基１〜１７を特異的に認識する抗体Ａβ1-17を使用して、正確なβセクレターゼ部位切断を確認した。APP およびM2でトランスフェクトされた細胞において、βN-およびβN-フラグメントは共に、両フラグメントに存在するAPP のN 末端領域を認識する抗体を用いて認識できる。抗体Ａβ1-17は、トランスフェクトされていない細胞において内因性βセクレターゼによって産生されたβN-フラグメントを認識する。しかし、この抗体は、APP およびM2で同時トランスフェクトされた細胞に存在することが公知のβN-フラグメントを認識することができなかった。これらの観察は、βN-フラグメントがＡβ1-17の認識エピトープを破壊したM2によるβセクレターゼ部位切断の産物であることを確認した。
特異性研究において、M2pdが活性化後16時間のインキュベーションの間にそのプロペプチド（２部位）およびプロテアーゼ部分（２部位）を切断したことを見出した（表１）。上記で考察した３つのペプチドのほかにも、M2pdはまた、酸化ウシインスリンB 鎖および合成ペプチドNch を切断した。天然タンパク質は、M2pdにより切断されなかった。
これらの同じ方法は、メマプシンを阻害する効能をスクリーニングするために開示されているインヒビターと組合わせて使用され得る。
ＩＶ．診断および処置方法
インヒビターは、アルツハイマー病およびそれに関連する状態（例えば、42アミノ酸ペプチド切断産物のレベルの上昇およびアミロイド（amyeloid）プラークにおけるペプチドの蓄積など）の診断および処置および／または予防に使用され得る。
インヒビターは、アルツハイマー病およびそれに関連する状態（例えば、42アミノ酸ペプチド切断産物のレベルの上昇およびアミロイド（amyeloid）プラークにおけるペプチドの蓄積など）の診断および処置および／または予防に使用され得る。
診断的使用
基質アナログは、実施例に記載されるように、メマプシン２またはメマプシン２アナログに特異的に結合するため、およびメマプシン２単離および精製または特徴付けを補助するための試薬として使用され得る。インヒビターおよび精製組換え酵素は、より遺伝的にアルツハイマー病を発生する傾向のある個体のスクリーニングに使用され得る。
基質アナログは、実施例に記載されるように、メマプシン２またはメマプシン２アナログに特異的に結合するため、およびメマプシン２単離および精製または特徴付けを補助するための試薬として使用され得る。インヒビターおよび精製組換え酵素は、より遺伝的にアルツハイマー病を発生する傾向のある個体のスクリーニングに使用され得る。
治療的使用
組換えヒトメマプシン２は、配列LVNM/AEGD （配列番号：９）を有する基質を切断する。この配列は、ヒトプレセニリンのインビボプロセシング部位配列である。プレセニン１およびプレセニン２は共に、内在性膜タンパク質である。これらは、プロセスされていない形態からN 末端配列を除去するプロテアーゼ切断によってプロセスされる。一旦プロセスされると、プレセニリンは、プロセスされていないプレセニリンと比較して安定な２本鎖ヘテロダイマーを形成する（Capellら、J.Biol.Chem.273,3205(1998)；Thinakaranら、Neurobiol.Dis.4,438(1998) ；Yuら、Neurosci Lett.2;254(3):125-8(1998)、これら全ての教示はその全体が本明細書中に援用される）。プロセスされていないプレセニリンは、速やかに分解される（Thinakaranら、J.Biol.Chem.272,28415(1997) ；Steiner ら、J.Biol.Chem.273,32322(1998) 、これら全ての教示はその全体が本明細書中に援用される）。プレセニリンがβセクレターゼのインビボ活性を制御し、次いでＡβ42の形成をもたらすためにアミロイド前駆体タンパク質（APP ）を切断することは公知である。脳細胞におけるＡβ42の蓄積は、アルツハイマー病の主な原因であることが公知である（概略について、Selkoe,1998 を参照のこと、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。従って、プレセニリンの活性は、アルツハイマー病の進行を高める。これは、プレセニリン遺伝子の不在下で、Ａβ42ペプチドの産生が低下するという観察（De Strooper ら、Nature 391,387(1998)、この教示はその全体が本明細書中に援用される）により支持される。プロセスされていないプレセニリンは速やかに分解されるので、プロセスされたヘテロダイマーのプレセニリンがアルツハイマー病をもたらすＡβ42の蓄積の原因であるはずである。メマプシン２によるプレセニリンのプロセシングは、Ａβ42の産生を高め、従ってさらにアルツハイマー病の進行を高める。従って、血液脳関門を通過するメマプシン２インヒビターは、Ａβ42の沈着により媒介されるアルツハイマー病の発生の見込みを減少するか、またはアルツハイマー病の進行を遅らせるために使用され得る。メマプシン２はAPP をβ切断部位で切断するので、β切断部位でのAPP 切断の防止は、Ａβ42の蓄積を防止する。
組換えヒトメマプシン２は、配列LVNM/AEGD （配列番号：９）を有する基質を切断する。この配列は、ヒトプレセニリンのインビボプロセシング部位配列である。プレセニン１およびプレセニン２は共に、内在性膜タンパク質である。これらは、プロセスされていない形態からN 末端配列を除去するプロテアーゼ切断によってプロセスされる。一旦プロセスされると、プレセニリンは、プロセスされていないプレセニリンと比較して安定な２本鎖ヘテロダイマーを形成する（Capellら、J.Biol.Chem.273,3205(1998)；Thinakaranら、Neurobiol.Dis.4,438(1998) ；Yuら、Neurosci Lett.2;254(3):125-8(1998)、これら全ての教示はその全体が本明細書中に援用される）。プロセスされていないプレセニリンは、速やかに分解される（Thinakaranら、J.Biol.Chem.272,28415(1997) ；Steiner ら、J.Biol.Chem.273,32322(1998) 、これら全ての教示はその全体が本明細書中に援用される）。プレセニリンがβセクレターゼのインビボ活性を制御し、次いでＡβ42の形成をもたらすためにアミロイド前駆体タンパク質（APP ）を切断することは公知である。脳細胞におけるＡβ42の蓄積は、アルツハイマー病の主な原因であることが公知である（概略について、Selkoe,1998 を参照のこと、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。従って、プレセニリンの活性は、アルツハイマー病の進行を高める。これは、プレセニリン遺伝子の不在下で、Ａβ42ペプチドの産生が低下するという観察（De Strooper ら、Nature 391,387(1998)、この教示はその全体が本明細書中に援用される）により支持される。プロセスされていないプレセニリンは速やかに分解されるので、プロセスされたヘテロダイマーのプレセニリンがアルツハイマー病をもたらすＡβ42の蓄積の原因であるはずである。メマプシン２によるプレセニリンのプロセシングは、Ａβ42の産生を高め、従ってさらにアルツハイマー病の進行を高める。従って、血液脳関門を通過するメマプシン２インヒビターは、Ａβ42の沈着により媒介されるアルツハイマー病の発生の見込みを減少するか、またはアルツハイマー病の進行を遅らせるために使用され得る。メマプシン２はAPP をβ切断部位で切断するので、β切断部位でのAPP 切断の防止は、Ａβ42の蓄積を防止する。
薬学的に許容可能なキャリア
インヒビターは、経口的にまたは注射によって典型的に投与される。経口投与が好ましい。あるいは、他の製剤は、肺、粘膜または経皮経路によって送達するために使用され得る。インヒビターは、通常、薬学的に許容可能なキャリアと組合わせて投与される。薬学的キャリアは、当業者にとって公知である。適切なキャリアは、投与の方式に基づいて典型的に選択される。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、および鎮痛剤などの１つ以上の活性成分を含み得る。
インヒビターは、経口的にまたは注射によって典型的に投与される。経口投与が好ましい。あるいは、他の製剤は、肺、粘膜または経皮経路によって送達するために使用され得る。インヒビターは、通常、薬学的に許容可能なキャリアと組合わせて投与される。薬学的キャリアは、当業者にとって公知である。適切なキャリアは、投与の方式に基づいて典型的に選択される。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、および鎮痛剤などの１つ以上の活性成分を含み得る。
非経口投与または注射投与のための調製物としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物オイル、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性キャリアとしては、水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒質が挙げられる）が挙げられる。好ましい非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流動性および栄養充填剤（replenisher ）、ならびに電解質充填剤（リンガーブドウ糖に基づくものなど）が挙げられる。
局所（粘膜表面への塗布が挙げられる、口、肺、鼻、膣または直腸が挙げられる）投与のための製剤としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末が挙げられ得る。これらの適用のための製剤は公知である。例えば、多数の肺製剤は、典型的に噴霧乾燥を使用して、薬物あるいはポリマーおよび／または界面活性剤と組合わせた薬物からなる１〜３ミクロンの間の空力学的直径を持つ粒子を有する粉末を製剤化することで開発されている。
経口投与のための組成物としては、散剤または顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁剤もしくは溶液、カプセル剤、サシェット（sachet）、あるいは錠剤が挙げられる。シックナー、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が所望され得る。
本明細書に記載されるようなペプチドはまた、無機酸（例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）、および有機酸（例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応、または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）および有機塩基（例えば、モノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミン）との反応により形成される薬学的に許容可能な酸−または塩基−付加塩として投与され得る。
投与量
投薬は、処置対象の状態の重篤度および敏感性に依存するが、通常、数日〜数ヶ月続く処置の過程、または所属医師がこれ以上利益が得られないと決定するまでは一日あたり１以上の用量である。当業者は、最適投薬、投薬方法論および反復率を決定し得る。
投薬は、処置対象の状態の重篤度および敏感性に依存するが、通常、数日〜数ヶ月続く処置の過程、または所属医師がこれ以上利益が得られないと決定するまでは一日あたり１以上の用量である。当業者は、最適投薬、投薬方法論および反復率を決定し得る。
投薬範囲は、メマプシン２媒介障害の症状が緩和される（典型的にはアミロイドプラークのサイズおよび／または数の減少あるいはサイズまたは量の増加がないことに特徴付けられる）、またはＡβ42ペプチドの切断が減少するという所望の効果を生ずるのに充分大きな範囲である。この投薬は、任意の逆適応（counterindication ）の場合には個々の医師によって調節され得る。
本発明はさらに、いかなる限定も意図されない以下の実施例によって説明される。
実施例
実施例１．組換えメマプシン２のタンパク質分解活性および切断部位選択
APP のタンパク質切断部位の周りのアミノ酸配列を、メマプシン２の特異性を確立するために決定した。組換えプロメマプシン２-T1 を、自触切断を作製するために室温にて16時間0.1M酢酸ナトリウム（pH4.0 ）中でインキュベートした。この産物を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析した。プロメマプシン２の分子量よりも小さい分子量に対応するいくつかのバンドを観察した。電気泳動バンドをPVDF膜上にトランスブロットした（trans-blotted ）。４つのバンドを選択し、タンパク質シーケンサー（Protein Sequencer ）におけるN-末端配列決定に供した。これらのバンドのN-末端配列は、プロメマプシン２上のタンパク質切断部位の位置を確立した。
実施例１．組換えメマプシン２のタンパク質分解活性および切断部位選択
APP のタンパク質切断部位の周りのアミノ酸配列を、メマプシン２の特異性を確立するために決定した。組換えプロメマプシン２-T1 を、自触切断を作製するために室温にて16時間0.1M酢酸ナトリウム（pH4.0 ）中でインキュベートした。この産物を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析した。プロメマプシン２の分子量よりも小さい分子量に対応するいくつかのバンドを観察した。電気泳動バンドをPVDF膜上にトランスブロットした（trans-blotted ）。４つのバンドを選択し、タンパク質シーケンサー（Protein Sequencer ）におけるN-末端配列決定に供した。これらのバンドのN-末端配列は、プロメマプシン２上のタンパク質切断部位の位置を確立した。
さらに、ウシインスリンの酸化β鎖および２つの異なる合成ペプチドをメマプシン２に対する基質として使用して、他の加水分解部位の程度を決定した。これらの反応を0.1M酢酸ナトリウム（pH4.0）中で自己活性化プロメマプシン２により実施し、次いでペプチドと共にインキュベートした。加水分解産物を、逆相C-18カラム上のHPLCに供し、溶出ピークをフラグメントの分子量の決定のために電気スプレー質量分光法（electrospray mass spectrometry）に供した。酸化インスリンB 鎖上の２つの加水分解部位を同定した（表１）。３つの加水分解部位をペプチドNCH-γから同定した。唯一の切断部位を合成ペプチドPS1-γにおいて観察し、その配列（LVNMAEGD）（配列番号：１０）はヒトプレセニリン１のβプロセシング部位由来である（表１）。
実施例２．プロメマプシン２の活性および酵素速度論
22℃にて16時間の0.1M酢酸ナトリウム（pH4.0 ）中のインキュベーションは、自触反応的にプロM2pdをM2pdへ変換した。初期加水分解試験のために、２つの合成ペプチドを、２〜１８時間の範囲の種々の期間、0.1M酢酸Na（pH4.0 ）中でプロM2pdと共に別個にインキュベートした。インキュベートした試料を、加水分解産物の同定のためにLC/MS に供した。速度論研究のために、同定したHPLC（Beckman System Gold ）産物ピークを定量のために統合した。プレセニリン１およびスウェーデン（Swedish ）APP ペプチドに対するKm値およびkcat値（表１）を定常状態速度論によって測定した。APP ペプチドに対する個々のKm値およびkcat値は、標準的方法により正確に測定できなかった、それゆえ、そのkcat/Km値を、プレセニリン１ペプチドに対する混合基質の競合的加水分解により測定した（Fersht, A.「Enzyme Structure and Mechanism」、第２版、W.H. Freeman and Company、New York. (1985)、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。
22℃にて16時間の0.1M酢酸ナトリウム（pH4.0 ）中のインキュベーションは、自触反応的にプロM2pdをM2pdへ変換した。初期加水分解試験のために、２つの合成ペプチドを、２〜１８時間の範囲の種々の期間、0.1M酢酸Na（pH4.0 ）中でプロM2pdと共に別個にインキュベートした。インキュベートした試料を、加水分解産物の同定のためにLC/MS に供した。速度論研究のために、同定したHPLC（Beckman System Gold ）産物ピークを定量のために統合した。プレセニリン１およびスウェーデン（Swedish ）APP ペプチドに対するKm値およびkcat値（表１）を定常状態速度論によって測定した。APP ペプチドに対する個々のKm値およびkcat値は、標準的方法により正確に測定できなかった、それゆえ、そのkcat/Km値を、プレセニリン１ペプチドに対する混合基質の競合的加水分解により測定した（Fersht, A.「Enzyme Structure and Mechanism」、第２版、W.H. Freeman and Company、New York. (1985)、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。
pH4.0 でのプロM2pdのより小さなフラグメントへの変換を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動によって示した。プロM2pdと変換した酵素との間の移動度の差は、この２つの混合物において明らかである。
実施例３：メマプシン２インヒビターOM99-1およびOM99-2の設計および合成
メマプシン２の特異性研究の結果に基づいて、P1およびP1' 位についてのよい残基はLeu およびAla であると予測した。続いて、P1' が小さな残基（例えば、Ala およびSer ）を好むことを特異性データから決定した。しかし、結晶構造（下で決定した）は、この部位が多くのより大きな残基を適応し得ることを示す。メマプシン２のP1' が最もストリンジェントな特異性必要性を有する位置であり、小さな側鎖の残基（例えば、Ala 、Ser 、およびAsp ）が好ましいことを示した。Ala を、主にP1' に対して選択した。なぜならば、Ser およびAsp を超えるその疎水性が血液−脳関門の透過（アルツハイマー病を処置するためのメマプシン２インヒビター薬物の設計に必要）に有利であるからである。従って、Leu とAla との間に遷移状態のアナログ同配体を配置（Leu*Ala として示され、ここで* は遷移状態の同配体、-CH(OH)-CH2-を表す）するようにインヒビターを設計し、サブサイトP4、P3、P2、P2' 、P3' およびP4' をβアミロイドタンパク質由来のスウェーデン変異体のβセクレターゼ部位配列で満たす。
メマプシン２の特異性研究の結果に基づいて、P1およびP1' 位についてのよい残基はLeu およびAla であると予測した。続いて、P1' が小さな残基（例えば、Ala およびSer ）を好むことを特異性データから決定した。しかし、結晶構造（下で決定した）は、この部位が多くのより大きな残基を適応し得ることを示す。メマプシン２のP1' が最もストリンジェントな特異性必要性を有する位置であり、小さな側鎖の残基（例えば、Ala 、Ser 、およびAsp ）が好ましいことを示した。Ala を、主にP1' に対して選択した。なぜならば、Ser およびAsp を超えるその疎水性が血液−脳関門の透過（アルツハイマー病を処置するためのメマプシン２インヒビター薬物の設計に必要）に有利であるからである。従って、Leu とAla との間に遷移状態のアナログ同配体を配置（Leu*Ala として示され、ここで* は遷移状態の同配体、-CH(OH)-CH2-を表す）するようにインヒビターを設計し、サブサイトP4、P3、P2、P2' 、P3' およびP4' をβアミロイドタンパク質由来のスウェーデン変異体のβセクレターゼ部位配列で満たす。
OM99-1： Val-Asn-Leu*Ala-Ala-Glu-Phe （配列番号：２０）
OM99-2：Glu-Val-Asn-Leu*Ala-Ala-Glu-Phe （配列番号：２１）
OM99-2：Glu-Val-Asn-Leu*Ala-Ala-Glu-Phe （配列番号：２１）
Leu*Ala ジペプチド同配体を以下のように合成した：
M2- インヒビターに対するLeu-Ala ジペプチド同配体をL-ロイシンから調製した。以下の記載における太字数字（例えば２、３、４など）は、合成スキーム１、２および３においてそれぞれ番号を付けた化合物をいう。太字数字はまた、本明細書において合成スキームの「化合物」（例えば、化合物２）としていう。
スキーム１に示すように、L-ロイシンを、ジエチルエーテル中10％NaOHの存在下BOC2O で12時間処理することによりそのBOC 誘導体２として保護した。次いでBoc-ロイシン２を、イソブチルクロロ蟻酸およびN-メチルピペリジンで処理し、続いて得られた混合無水物をN,O-ジメチルヒドロキシルアミンで処理することによりWeinreb アミド３へ変換した（NahmおよびWeinreb 、Tetrahedron Letters 1981, 32:3815 、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。ジエチルエーテル中でのリチウムアルミニウム水素化物を用いた３の還元は、アルデヒド４を生成した。プロピオール酸エチルおよびリチウムジイソプロピルアミドの処理から誘導されるプロピオール酸リチウムとアルデヒド４との反応は、42％の単離収率でアセチレンアルコール５をジアステレオマーの分離不可混合物（5.8 ：1 ）として得た（Fray, KayeおよびKleinman、J.Org.Chem.1986, 51:4828-33 、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。Pd/BaSO2に通す５の触媒性水素化に続いて、還流でのトルエン中の触媒性量の酢酸を用いた、得られたγヒドロキシエステルの酸触媒ラクトン化は、73％収率でγラクトン６および７を供給した。
異性体を、溶出剤としてヘキサン中40％酢酸エチルを用いることでシリカゲルクロマトグラフィーにより分離した。メチル基のC-2 での導入を、メチルヨウ化物を用いる７の立体選択的アルキル化により達成した（スキーム２）。従って、-78 ℃にて（30分）テトラヒドロフラン中リチウムヘキサメチルジシラジド（2.2 当量）を用いるラクトン７のジアニオンの生成および-78 ℃にて30分間のメチルヨウ化物（1.1 当量）でのアルキル化、続いてプロピオン酸（５当量）でのクエンチングは、少量（５％未満）の対応エピマーに加えて所望のアルキル化ラクトン８（76％収率）を得た（Ghosh およびFidanze 、1988 J.Org.Chem.1998,63,6146-54 、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。エピマーcis-ラクトンを、溶媒系として酢酸エチルおよびヘキサンの混合物（３：１）を用いてシリカゲルに通すカラムクロマトグラフィーにより除去した。アルキル化ラクトン８の立体化学割り当てを、広範囲1H-NMR NOE実験に基づいて作製した。水性水酸化リチウムはラクトン８の加水分解を促進し、続いて、ジメチルホルムアミド中イミダゾールおよびジメチルアミノピリジンの存在下で塩化tert- ブチルジメチルシリルを用いるγヒドロキシ基の保護は、酸９を標準的ワークアップ（work-up ）およびクロマトグラフィー後90％収率で得た。BOC 基の選択的除去は、１時間０℃にてジクロロメタン中トリフルオロ酢酸を用いる処理によりもたらされた。次いで、得られたアミン塩を、水性NaHCO3の存在下、ジオキサン中で市販の（Aldrich, Milwaukee）Fmoc- スクシニミド誘導体と反応させて、Fmoc- 保護L*A 同配体１０をクロマトグラフィー後65％収率で得た。保護同配体１０を無作為配列インヒビターライブラリーの調製に利用した。
実験手順
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-ロイシン（化合物２）
140mL のジエチルエーテル中に10g （76.2mmol）のL-ロイシンの懸濁液に、80mLの10％NaOHを添加した。全ての固体が溶解した後、20mL（87.1mmol）のBOC2O を反応混合物に添加した。得られた反応混合物を12時間23℃にて攪拌した。この期間後、層を分離し、水層を０℃にて1Nの水性HCl を注意深く添加してpH1 まで酸性化した。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した（３×100mL ）。有機層を混合し、鹹水で洗浄し、無水Na2SO4に通して乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、さらなる精製なしに次反応に直接使用する表題の産物を得た（収率97％）。
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-ロイシン（化合物２）
140mL のジエチルエーテル中に10g （76.2mmol）のL-ロイシンの懸濁液に、80mLの10％NaOHを添加した。全ての固体が溶解した後、20mL（87.1mmol）のBOC2O を反応混合物に添加した。得られた反応混合物を12時間23℃にて攪拌した。この期間後、層を分離し、水層を０℃にて1Nの水性HCl を注意深く添加してpH1 まで酸性化した。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した（３×100mL ）。有機層を混合し、鹹水で洗浄し、無水Na2SO4に通して乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、さらなる精製なしに次反応に直接使用する表題の産物を得た（収率97％）。
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-ロイシン-N'-メトキシ-N'-メチルアミド（methyla-mide）（化合物３）
０℃にてN2雰囲気下で乾燥ジクロロメタン（25mL）中塩酸N,O-ジメチルヒドロキシアミン（5.52g 、56.6mmol）の攪拌溶液に、- メチルピペリジン（6.9mL 、56.6mmol）を滴下した。得られた混合物を30分間０℃にて攪拌した。別のフラスコに、N-(tert-ブチルオキシカルボニル)-L-ロイシン（２）（11.9g 、51.4mmol）を、N2雰囲気下でTHF （45mL）とジクロロメタン（180mL ）の混合物中に溶解した。得られた溶液を-20 ℃まで冷却した。この溶液にl-メチルピペリジン（6.9mL、56.6mmol）、続いてイソブチルクロロ蟻酸（7.3mL 、56.6mmol）を添加した。得られた混合物を-20 ℃にて５分間攪拌し、N,O-ジメチルヒドロキシアミンの上記溶液を添加した。反応混合物を30分間-20 ℃で保存し、次いで23℃に暖めた。この反応を水でクエンチし、層を分離した。水層をジクロロメタンで抽出した（３×100mL ）。混合した有機層を10％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、および鹹水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4に通して乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（25％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題の化合物３を淡黄色油として得た（13.8g 、97％）。
０℃にてN2雰囲気下で乾燥ジクロロメタン（25mL）中塩酸N,O-ジメチルヒドロキシアミン（5.52g 、56.6mmol）の攪拌溶液に、- メチルピペリジン（6.9mL 、56.6mmol）を滴下した。得られた混合物を30分間０℃にて攪拌した。別のフラスコに、N-(tert-ブチルオキシカルボニル)-L-ロイシン（２）（11.9g 、51.4mmol）を、N2雰囲気下でTHF （45mL）とジクロロメタン（180mL ）の混合物中に溶解した。得られた溶液を-20 ℃まで冷却した。この溶液にl-メチルピペリジン（6.9mL、56.6mmol）、続いてイソブチルクロロ蟻酸（7.3mL 、56.6mmol）を添加した。得られた混合物を-20 ℃にて５分間攪拌し、N,O-ジメチルヒドロキシアミンの上記溶液を添加した。反応混合物を30分間-20 ℃で保存し、次いで23℃に暖めた。この反応を水でクエンチし、層を分離した。水層をジクロロメタンで抽出した（３×100mL ）。混合した有機層を10％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、および鹹水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4に通して乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（25％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題の化合物３を淡黄色油として得た（13.8g 、97％）。
N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-ロイシナール（leucinal）（化合物４）
N2雰囲気下-40 ℃にて乾燥ジエチルエーテル（60mL）中リチウムアルミニウム水素化物（770mg 、20.3mmol）の攪拌懸濁液にジエチルエーテル（20mL）中N-tert- ブチルオキシカルボニル-L- ロイシン-N'-メトキシ-N'-メチルアミド（5.05g 、18.4mmol）を添加した。得られた反応混合物を30分間攪拌した。この期間後、この反応を、10％NaHSO4溶液（30mL）でクエンチした。次いで、得られた反応混合物を23℃に暖め、30分間その温度にて攪拌した。得られた溶液を濾過し、濾過ケークを２部のジエチルエーテルで洗浄した。混合した有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、鹹水で洗浄し、無水MgSO4に通して乾燥した。減圧下の溶媒エバポレーションで表題のアルデヒド４（3.41g ）を淡黄色油として得た。得られたアルデヒドをさらなる精製なしに速やかに使用した。
N2雰囲気下-40 ℃にて乾燥ジエチルエーテル（60mL）中リチウムアルミニウム水素化物（770mg 、20.3mmol）の攪拌懸濁液にジエチルエーテル（20mL）中N-tert- ブチルオキシカルボニル-L- ロイシン-N'-メトキシ-N'-メチルアミド（5.05g 、18.4mmol）を添加した。得られた反応混合物を30分間攪拌した。この期間後、この反応を、10％NaHSO4溶液（30mL）でクエンチした。次いで、得られた反応混合物を23℃に暖め、30分間その温度にて攪拌した。得られた溶液を濾過し、濾過ケークを２部のジエチルエーテルで洗浄した。混合した有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、鹹水で洗浄し、無水MgSO4に通して乾燥した。減圧下の溶媒エバポレーションで表題のアルデヒド４（3.41g ）を淡黄色油として得た。得られたアルデヒドをさらなる精製なしに速やかに使用した。
エチル(4S,5S)-および(4R,5S)-5-[(tert- ブトキシカルボニル) アミノ]-4-ヒドロキシ-7- メチルオクト-2- イノエート（化合物５）
N2雰囲気下0 ℃にて乾燥THF （60mL）中ジイソプロピルアミン（1.1mL 、7.9mmol ）の攪拌溶液にn-BuLi（ヘキサン中1.6M、4.95mL、7.9mmol ）を滴下した。得られた溶液を５分間０℃にて攪拌し、次いで、23℃に温め、15分間攪拌した。混合物を-78 ℃に冷却し、THF （2mL ）中プロピオール酸エチル（801 μL ）を５分間にわたって滴下した。混合物を、8mL の乾燥THF 中N-Boc-L-ロイシナール４（1.55g 、7.2mmol ）を添加した後、30分間攪拌した。得られた混合物を１時間-78 ℃にて攪拌した。この期間後、反応をTHF （20mL）中酢酸（5mL ）でクエンチした。反応混合物を23℃まで暖め、鹹水溶液を添加した。層を分離し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、Na2SO4に通して乾燥した。減圧下溶媒のエバポレーションで残渣を得、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（15％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、アセチレンアルコール５の混合物（３：１）を得た（0.96g 、42％）。
N2雰囲気下0 ℃にて乾燥THF （60mL）中ジイソプロピルアミン（1.1mL 、7.9mmol ）の攪拌溶液にn-BuLi（ヘキサン中1.6M、4.95mL、7.9mmol ）を滴下した。得られた溶液を５分間０℃にて攪拌し、次いで、23℃に温め、15分間攪拌した。混合物を-78 ℃に冷却し、THF （2mL ）中プロピオール酸エチル（801 μL ）を５分間にわたって滴下した。混合物を、8mL の乾燥THF 中N-Boc-L-ロイシナール４（1.55g 、7.2mmol ）を添加した後、30分間攪拌した。得られた混合物を１時間-78 ℃にて攪拌した。この期間後、反応をTHF （20mL）中酢酸（5mL ）でクエンチした。反応混合物を23℃まで暖め、鹹水溶液を添加した。層を分離し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、Na2SO4に通して乾燥した。減圧下溶媒のエバポレーションで残渣を得、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（15％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、アセチレンアルコール５の混合物（３：１）を得た（0.96g 、42％）。
(5S,1'S)-5-[1'-[(tert-ブトキシカルボニル) アミノ]-3'- メチルブチル]-ジヒドロフラン-2(3H)- オン（化合物７）
酢酸エチル（20mL）中アセチレンアルコール（1.73g 、5.5mmol ）の上記混合物の攪拌溶液に、５％Pd/BaSO4（1g）を添加した。生じた混合物を1.5 時間50psi で水素化した。この期間後、触媒を、セライトのプラグを介して濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をトルエン（20mL）および酢酸（100 μL ）に溶解した。反応混合物を６時間還流した。この期間後、反応を23℃に冷却し、溶媒をエバポレートして残渣を得、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（40％ジエチルエーテル／へキサン）によって精製して、 (5S,1S')-γ- ラクトン７（0.94g 、62.8）および(5R,1S')- γ- ラクトン６（0.16g 、10.7％）を得た。
酢酸エチル（20mL）中アセチレンアルコール（1.73g 、5.5mmol ）の上記混合物の攪拌溶液に、５％Pd/BaSO4（1g）を添加した。生じた混合物を1.5 時間50psi で水素化した。この期間後、触媒を、セライトのプラグを介して濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をトルエン（20mL）および酢酸（100 μL ）に溶解した。反応混合物を６時間還流した。この期間後、反応を23℃に冷却し、溶媒をエバポレートして残渣を得、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（40％ジエチルエーテル／へキサン）によって精製して、 (5S,1S')-γ- ラクトン７（0.94g 、62.8）および(5R,1S')- γ- ラクトン６（0.16g 、10.7％）を得た。
(3R,5S,1'S)-5-[1'-[(tert- ブトキシカルボニル) アミノ]-3'- メチルブチル（methylbut-yl）]-3-メチルジヒドロフラン-2(3H)- オン（化合物８）
N2雰囲気下-78 ℃にて乾燥THF （8mL ）中ラクトン７（451.8mg 、1.67mmol）の攪拌溶液に、３分間にわたってリチウムヘキサメチルジシラザン（3.67mL、THF 中1.0M）を添加した。得られた混合物を30分間-78 ℃にて攪拌して、リチウムエノラートを生成した。この期間後、MeI （228 μL ）を滴下して、得られた混合物を20分間-78 ℃にて攪拌した。反応を飽和水性NH4Cl溶液でクエンチし、23℃に暖めた。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出した（３×100mL ）。混合した有機層を鹹水で洗浄し、無水Na2SO4に通して乾燥した。溶媒のエバポレーションで残渣を得、シリカゲルクロマトグラフィー（15％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、アモルファス固体としてアルキル化ラクトン８を得た（0.36g 、76％）。
N2雰囲気下-78 ℃にて乾燥THF （8mL ）中ラクトン７（451.8mg 、1.67mmol）の攪拌溶液に、３分間にわたってリチウムヘキサメチルジシラザン（3.67mL、THF 中1.0M）を添加した。得られた混合物を30分間-78 ℃にて攪拌して、リチウムエノラートを生成した。この期間後、MeI （228 μL ）を滴下して、得られた混合物を20分間-78 ℃にて攪拌した。反応を飽和水性NH4Cl溶液でクエンチし、23℃に暖めた。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出した（３×100mL ）。混合した有機層を鹹水で洗浄し、無水Na2SO4に通して乾燥した。溶媒のエバポレーションで残渣を得、シリカゲルクロマトグラフィー（15％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、アモルファス固体としてアルキル化ラクトン８を得た（0.36g 、76％）。
(2R,4S,5S)-5-[(tert-ブトキシカルボニル) アミノ]-4-[(tert- ブチルジメチルシリル) オキシ]-2,7-ジメチルオクタン酸（化合物９）
THF （2mL ）中ラクトン８（0.33g 、1.17mmol）の攪拌溶液に、1N水性LiOH溶液（5.8mL ）を添加した。得られた混合物を10時間23℃にて攪拌した。この期間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残った水性残渣を０℃に冷却し、25％クエン酸溶液を用いてpH4 に酸性化した。得られた酸性溶液を酢酸エチルで抽出した（３×50mL）。混合した有機層を鹹水で洗浄し、Na2SO4に通して乾燥し、濃縮して白色泡沫として対応するヒドロキシ酸（330mg ）を得た。このヒドロキシ酸をさらなる精製なしに次反応に直接使用した。
THF （2mL ）中ラクトン８（0.33g 、1.17mmol）の攪拌溶液に、1N水性LiOH溶液（5.8mL ）を添加した。得られた混合物を10時間23℃にて攪拌した。この期間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残った水性残渣を０℃に冷却し、25％クエン酸溶液を用いてpH4 に酸性化した。得られた酸性溶液を酢酸エチルで抽出した（３×50mL）。混合した有機層を鹹水で洗浄し、Na2SO4に通して乾燥し、濃縮して白色泡沫として対応するヒドロキシ酸（330mg ）を得た。このヒドロキシ酸をさらなる精製なしに次反応に直接使用した。
無水DMF 中の上記ヒドロキシ酸（330mg 、1.1mmol ）に、イミダゾール（1.59g 、23.34mmol ）およびtert- ブチルジメチルクロロシラン（1.76g 、11.67mmol ）を添加した。得られた混合物を24時間23℃にて攪拌した。この期間後、MeOH（4mL ）を添加し、混合物を１時間攪拌した。混合物を25％クエン酸（20mL）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×20mL）。混合した抽出物を水、鹹水で洗浄し、無水Na2SO4に通して乾燥した。溶媒のエバポレーションで粘性油を得、シリカゲルに通すフラッシュクロマトグラフィー（35％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、シリル保護酸９（0.44g 、90％）を得た。
(2R,4S,5S)-5-[( フルオレニルメチルオキシカルボニル) アミノ]-4-[(tert- ブチルジ- メチルシリル) オキシ]-2,7-ジメチルオクタン酸（化合物１０）
０℃にてジクロロメタン（2mL ）中酸９（0.17g 、0.41mmol）の攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸（500 μL ）を添加した。得られた混合物を１時間０℃にて攪拌し、さらなる部（500 μL ）のトリフルオロ酢酸を反応混合物に添加した。混合物をさらに30分間攪拌し、反応の進行をTLCによってモニターした。この期間後、溶媒を、５℃を超えないような浴温度にて減圧下で注意深く除去した。残渣を5mL のH2O 中ジオキサン（3mL ）およびNaHCO3（300mg ）に溶解した。この溶液に、5mL のジオキサン中Fmoc- スクシニミド（166.5mg 、0.49mmol）を添加した。得られた混合物を８時間23℃にて攪拌した。次いで、混合物をH2O （5mL ）で希釈して、25％水性クエン酸でpH4 に酸性化した。酸性溶液を酢酸エチルで抽出した（３×50mL）。混合した抽出物を鹹水で洗浄し、Na2SO4に通して乾燥し、減圧下で濃縮して、粘性油残渣を得た。シリカゲルに通すフラッシュクロマトグラフィーによる残渣の精製で、白色泡沫としてFmoc- 保護酸１０（137mg 、61％）を得た。
０℃にてジクロロメタン（2mL ）中酸９（0.17g 、0.41mmol）の攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸（500 μL ）を添加した。得られた混合物を１時間０℃にて攪拌し、さらなる部（500 μL ）のトリフルオロ酢酸を反応混合物に添加した。混合物をさらに30分間攪拌し、反応の進行をTLCによってモニターした。この期間後、溶媒を、５℃を超えないような浴温度にて減圧下で注意深く除去した。残渣を5mL のH2O 中ジオキサン（3mL ）およびNaHCO3（300mg ）に溶解した。この溶液に、5mL のジオキサン中Fmoc- スクシニミド（166.5mg 、0.49mmol）を添加した。得られた混合物を８時間23℃にて攪拌した。次いで、混合物をH2O （5mL ）で希釈して、25％水性クエン酸でpH4 に酸性化した。酸性溶液を酢酸エチルで抽出した（３×50mL）。混合した抽出物を鹹水で洗浄し、Na2SO4に通して乾燥し、減圧下で濃縮して、粘性油残渣を得た。シリカゲルに通すフラッシュクロマトグラフィーによる残渣の精製で、白色泡沫としてFmoc- 保護酸１０（137mg 、61％）を得た。
OM99-1およびOM99-2の合成を固体状態ペプチド合成手順（Leu*Ala が第４工程で組み込まれる）を用いて達成した。合成インヒビターを逆相HPLCにより精製し、その構造を質量分光法により確認した。
実施例４：さらなるインヒビターの設計、合成および分析
OM99-1およびOM99-2以外の種々の基質アナログを、同様に設計し、合成し得る。例えば、66個のさらなるインヒビターアナログ（MMI-001 〜MMI-062 、MMI-065 、MMI-066 、MMI-070 およびMMI-071 、これら全てはメマプシン２の活性部位の同配体に似ている）を設計した。さらなる基質アナログの合成はOM99-1およびOM99-2の合成に従う。さらなる基質アナログの化学構造を表３に列挙する。種々のインヒビターの一般的合成をスキーム３に概略する。
OM99-1およびOM99-2以外の種々の基質アナログを、同様に設計し、合成し得る。例えば、66個のさらなるインヒビターアナログ（MMI-001 〜MMI-062 、MMI-065 、MMI-066 、MMI-070 およびMMI-071 、これら全てはメマプシン２の活性部位の同配体に似ている）を設計した。さらなる基質アナログの合成はOM99-1およびOM99-2の合成に従う。さらなる基質アナログの化学構造を表３に列挙する。種々のインヒビターの一般的合成をスキーム３に概略する。
スキーム３に示すように、標準的なペプチドカップリング手順を用い、バリン誘導体１１を、ＤＭＦおよびＣＨ2Ｃｌ2の混合物中、塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、トリエチルアミンおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下で、ジペプチド同配体９と反応させ、アミド誘導体１２を得た。フッ化テトラブチルアンモニウム含有ＴＨＦでの処理によるシリル保護基の除去により、インヒビター１３（ＭＭＩ−００１）を得た。１３のトリフルオロ酢酸含有ＣＨ2Ｃｌ2への曝露は、ＢＯＣ基の除去をもたらした。得られたアミンのＢＯＣ−アスパラギンとのカップリングによりインヒビター１４（ＭＭＩ−０１１）を得た。標準条件下での１４のトリフルオロ酢酸での処理、および得られたアミンのＢＯＣ−バリンとのカップリングによりインヒビター１６（ＭＭＩ−０１２）を得た。インヒビターＭＭＩ−１５の合成のため、化合物１３をトリフルオロ酢酸と反応させ、得られたアミンをＢＯＣ−メチオニンとカップリングさせて、インヒビター１５（ＭＭＩ−０１５）を得た。１６のＢＯＣ基の除去および得られたアミンのＢＯＣ−バリンとのカップリングによりインヒビター１７（ＭＭＩ−０１７）を得た。
インヒビターＭＭＩ−００１、ＭＭＩ−０１１、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１５およびＭＭＩ−１７の調製：
バリン誘導体（化合物１１）の調製：Ｎ−Ｂｏｃバリン（５００ｍｇ、２．３０ｍｍｏｌ）およびベンジルアミン（０．５０ｍL、４．６０ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＨＯＢｔ（３７３ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５２９ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（２．４ｍＬ、１３．８０ｍｍｏｌ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ3（ａｑ）に注入した。得られた混合物を３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、４４２ｍｇ（６３％）のカップリング生成物を得た。得られたアミンをＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）に溶解した。次いで、ＴＦＡ（４ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を０．５時間撹拌し、減圧下で濃縮した。アミン１１が定量可能な収率で得られた。
バリン誘導体（化合物１１）の調製：Ｎ−Ｂｏｃバリン（５００ｍｇ、２．３０ｍｍｏｌ）およびベンジルアミン（０．５０ｍL、４．６０ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＨＯＢｔ（３７３ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５２９ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（２．４ｍＬ、１３．８０ｍｍｏｌ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ3（ａｑ）に注入した。得られた混合物を３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、４４２ｍｇ（６３％）のカップリング生成物を得た。得られたアミンをＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）に溶解した。次いで、ＴＦＡ（４ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を０．５時間撹拌し、減圧下で濃縮した。アミン１１が定量可能な収率で得られた。
アミド誘導体（化合物１２）の調製：ジペプチド同配体９（４１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびアミン１１（４１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ3（ａｑ）に注入した。混合物を３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、５５ｍｄ（９５％）のアミド１２を得た。
インヒビターＭＭＩ−００１（化合物１３）の調製：アミド１２（６１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１．０ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ：０．３ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を２３℃で添加し、一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、ＭＭＩ−００１（１３、４１ｍｇ、８３％）を得た。
インヒビターＭＭＩ−０１１（化合物１４）の調製：１３（４４ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．２ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−アスパラギン（４１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（３４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ3（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（４％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製し、１２．５ｍｇ（２３％）のＭＭＩ−０１１（１４）を得た。
インヒビターＭＭＩ−０１５（化合物１５）の調製：化合物１３（６４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（４ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−メチオニン（６５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ3（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３７．２ｍｇ（４６％）のＭＭＩ−０１５（１５）を得た。
インヒビターＭＭＩ−０１２（化合物１６）の調製：１３（８．４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（１ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．２ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−バリン（６ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．８ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５．３ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ3（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（４％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製し、２．１ｍｇ（２１％）のインヒビターＭＭＩ−０１２（１６）を得た。
インヒビターＭＭＩ−１０７（化合物１７）の調製：１５（１４．５ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（２ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−バリン（１０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６．２ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（８．８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ3（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）で精製し、５．５ｍｇ（３３％）のＭＭＩ−０１７（１７）を得た。Ｒｆ＝（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）。
同配体の酵素活性を上述のようにして測定したが、ＯＭ９９−１、ＯＭ９９−２、またはＭＭＩ−００１〜ＭＭＩ−０６２、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１のうちの１つのいずれかを添加した。ＯＭ９９−１は組換えメマプシンを、３×１０-8Ｍと計算されたＫiで阻害した。使用した基質は、合成の蛍光生成(fluorogenic)ペプチド基質であった。ＯＭ９９−２の組換えメマプシン２に対する阻害を、同じ蛍光生成基質を用いて測定した。Ｋｉ値は、９．５８×１０-9Ｍと測定された。
Ｐ１およびＰ１’における残基は、Ｍ２インヒビターが血液脳関門（ＢＢＢ）を透過しなければならないので、非常に重要である。Ｐ１’におけるＡｌａの選択は、ＢＢＢの透過を容易にする。Ａｌａ側鎖のアナログもまた、有効である。例えば、Ａｌａのメチル側鎖に加えて、置換メチル基、およびメチルまたはエチル基とほぼ同じ大きさの基で、Ａｌａ側鎖を置換しうる。Ｐ１におけるＬｅｕもまた、同様の大きさの基またはＬｅｕ側鎖上に置換を有する基で置換されうる。ＢＢＢを透過させるため、インヒビターを小さくすることが望ましい。したがって、ＯＭ９９−１を開始点として使用し、外側サブサイト(subsite)Ｐ４、Ｐ３、Ｐ３’およびＰ４’を廃棄することができる。次いで、同様にＢＢＢを透過しうる強固結合性Ｍ２インヒビターを置換することにより、保持された構造Ａｓｎ−Ｌｅｕ*Ａｌａ−Ａｌａをさらに発展させる。
他の基質アナログ、ＭＭＩ−００１〜ＭＭＩ−０７１もまた、酵素阻害について試験した。例えば、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１のＫi値は、ＯＭ９９−２の値と同等であり、これらもまた、良好なメマプシンインヒビターであることを示す。ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２６、またはＭＭＩ−０６６のＫi値は、ＯＭ９９−２の値より約１等級(magnitude)高く、これらが、メマプシン阻害の有能な候補成分であることを示す。さらなる基質アナログのそれぞれのＫi値およびその対応する化学構造を表３に列挙する。
実施例５．メマプシン２（β−セクレターゼ）のサブサイト特異性
ＯＭ９９−２で得られた結果は、８個すべてのサブサイトをＯＭ９９−２で誘発することにより、高度阻害力(potency)（Ｋi＝１．６ｎＭ）が達成されうること示す。しかしながら、血液脳関門を透過して脳に達するためには、臨床的に有用なメマプシン２インヒビターは小さく（すなわち、典型的には、５００〜７００ダルトン未満で）なければならない。メマプシン２のサブサイト特異性に関する詳細な情報は、小さいが強固結合性のインヒビターの設計のための良好な理解を提供しうる。メマプシン２の完全なサブサイト優先を、基質動力学およびランダム配列インヒビターライブラリーのプロービングの両方の結果に基づいて決定した。
ＯＭ９９−２で得られた結果は、８個すべてのサブサイトをＯＭ９９−２で誘発することにより、高度阻害力(potency)（Ｋi＝１．６ｎＭ）が達成されうること示す。しかしながら、血液脳関門を透過して脳に達するためには、臨床的に有用なメマプシン２インヒビターは小さく（すなわち、典型的には、５００〜７００ダルトン未満で）なければならない。メマプシン２のサブサイト特異性に関する詳細な情報は、小さいが強固結合性のインヒビターの設計のための良好な理解を提供しうる。メマプシン２の完全なサブサイト優先を、基質動力学およびランダム配列インヒビターライブラリーのプロービングの両方の結果に基づいて決定した。
実験手順
規定の基質混合物の設計
上述のＡＰＰおよびメマプシン２インヒビターＯＭ９９−２におけるβ−セクレターゼ切断部位由来の、鋳型配列ＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号：２２）における８個の位置のそれぞれをプロービングするためのペプチド混合物を合成した。各位置の特性付けのため、７個のアミノ酸誘導体の等モル混合物を、固相合成（Research Genetics, Invitrogen, Huntsville, Alabama）の適切なサイクルにおいて添加し、１つの位置で７個のアミノ酸のうち１個が異なる７個のペプチドの混合物を生じた。基質および加水分解産物の迅速定量を容易にするため、ハイ・スループットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用した。したがって、いくつかのアミノ酸の質量が同一（これは、その同定を妨げる）であるので、単一の混合物において、すべての共通のアミノ酸側鎖（全部で１９、システインを除く）を置換することは可能でなかった。したがって、異なるアミノ酸置換を、その質量における差を最大にするように３つの群（表４および５）に分け、各サブサイトにおける１９の異なるアミノ酸（システイン以外(less cysteine)）の完全な組を、１つの位置に各アミノ酸を組み込むようにペプチドが合成された３つの基質混合物に含有した。相対的ｋcat／Ｋmの計算のため、混合物間の定量的情報に関連づける目的で、標準的なペプチドを各群に含めた。既知のｋcat／Ｋm値の基質を相対初期速度の正規化および他の基質のｋcat／Ｋm値の計算ための内部標準として利用する。Ｐ1’、Ｐ2’、Ｐ3’およびＰ4’位について、鋳型配列をＣ末端で４残基伸長し（鋳型ＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ、配列番号：２３、表４）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおけるその検出を容易にした。４個のさらなる残基を同様に鋳型のＮ−末端に付加し、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3およびＰ4位の特異性を特性付けした（鋳型ＲＷＨＨＥＶＮＬＡＡＥＦ、配列番号：２４、表５）。
規定の基質混合物の設計
上述のＡＰＰおよびメマプシン２インヒビターＯＭ９９−２におけるβ−セクレターゼ切断部位由来の、鋳型配列ＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号：２２）における８個の位置のそれぞれをプロービングするためのペプチド混合物を合成した。各位置の特性付けのため、７個のアミノ酸誘導体の等モル混合物を、固相合成（Research Genetics, Invitrogen, Huntsville, Alabama）の適切なサイクルにおいて添加し、１つの位置で７個のアミノ酸のうち１個が異なる７個のペプチドの混合物を生じた。基質および加水分解産物の迅速定量を容易にするため、ハイ・スループットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用した。したがって、いくつかのアミノ酸の質量が同一（これは、その同定を妨げる）であるので、単一の混合物において、すべての共通のアミノ酸側鎖（全部で１９、システインを除く）を置換することは可能でなかった。したがって、異なるアミノ酸置換を、その質量における差を最大にするように３つの群（表４および５）に分け、各サブサイトにおける１９の異なるアミノ酸（システイン以外(less cysteine)）の完全な組を、１つの位置に各アミノ酸を組み込むようにペプチドが合成された３つの基質混合物に含有した。相対的ｋcat／Ｋmの計算のため、混合物間の定量的情報に関連づける目的で、標準的なペプチドを各群に含めた。既知のｋcat／Ｋm値の基質を相対初期速度の正規化および他の基質のｋcat／Ｋm値の計算ための内部標準として利用する。Ｐ1’、Ｐ2’、Ｐ3’およびＰ4’位について、鋳型配列をＣ末端で４残基伸長し（鋳型ＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ、配列番号：２３、表４）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおけるその検出を容易にした。４個のさらなる残基を同様に鋳型のＮ−末端に付加し、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3およびＰ4位の特異性を特性付けした（鋳型ＲＷＨＨＥＶＮＬＡＡＥＦ、配列番号：２４、表５）。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる初期速度の測定
基質混合物を２ｍｇ／ｍｌで１０％氷酢酸に溶解し、適切な濃度のＮａＯＨ中に希釈し、ｐＨ４．１の酢酸ナトリウム中でμＭ範囲の基質混合物を得た。アリコートを２５℃で平衡化し、メマプシン２のアリコートの添加により反応を開始した。ある時間毎にアリコート（１０μｌ）を取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス（α−ヒドロキシ桂皮酸含有アセトン、２０ｍｇ／ｍｌ）と合わせ、直ちに、ステンレス鋼ＭＡＬＤＩＩ試料プレート上に２連でスポットした。キャンパス内のMolecular Biology Resource CenterでPE Biosystems Voyager DE装置を用い、１５０ｎｓｅｃ遅延での正モードの２０，０００ボルト加速で作動させたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置を用いることにより試料を解析に供した。質量対電荷比(mass-to-charge ratio)（ｍ／ｚ）を有するイオンを４００〜２０００ａｍｕ（原子質量単位）の範囲で検出した。Voyager Data Explorer モジュールによりデータを解析し、目的の質量種のイオン強度データを得た。
基質混合物を２ｍｇ／ｍｌで１０％氷酢酸に溶解し、適切な濃度のＮａＯＨ中に希釈し、ｐＨ４．１の酢酸ナトリウム中でμＭ範囲の基質混合物を得た。アリコートを２５℃で平衡化し、メマプシン２のアリコートの添加により反応を開始した。ある時間毎にアリコート（１０μｌ）を取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス（α−ヒドロキシ桂皮酸含有アセトン、２０ｍｇ／ｍｌ）と合わせ、直ちに、ステンレス鋼ＭＡＬＤＩＩ試料プレート上に２連でスポットした。キャンパス内のMolecular Biology Resource CenterでPE Biosystems Voyager DE装置を用い、１５０ｎｓｅｃ遅延での正モードの２０，０００ボルト加速で作動させたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置を用いることにより試料を解析に供した。質量対電荷比(mass-to-charge ratio)（ｍ／ｚ）を有するイオンを４００〜２０００ａｍｕ（原子質量単位）の範囲で検出した。Voyager Data Explorer モジュールによりデータを解析し、目的の質量種のイオン強度データを得た。
ランダム配列インヒビターライブラリー
ランダム配列インヒビターライブラリーは、４個のサブサイト、Ｐ2、Ｐ3、Ｐ2’およびＰ3’位でのランダムアミノ酸（システイン以外）を有するＯＭ９９−２の配列に基づくものであった。Ｐ1およびＰ1’位を固定するために、合成で二同配体(diisostere)Ｌｅｕ*Ａｌａ（*はヒドロキシエチレン遷移状態同配体を表す）を用いた。ペプチドを、固体状態ペプチド合成法により合成し、樹脂ビーズを付着したままにしておいた。「スプリット合成(split-synthesis)」手順（Lamら、1991）を用いることにより、樹脂ビーズのそれぞれは、たった１つの配列を含んだが、該配列はビーズにより異なった。全ライブラリー配列は：
ここで、Ｘｘｎ残基（ここで、ｎは１，２，３または４のいずれかである）は、１９個のアミノ酸を用いて各位置でランダム化される、であった。Ｐ2’から始まる、より短い形態のペプチド
はまた、より長い配列に対して約７：３の比で、各ビーズに存在した。同配体が無い場合、短配列は有意な強度でメマプシン２に結合しないが、その存在は、自動Ｅｄｍａｎ分解による残基の同定にとって都合がよかった。ランダム化位置から同定された残基は以下のとおりである。
ランダム配列インヒビターライブラリーは、４個のサブサイト、Ｐ2、Ｐ3、Ｐ2’およびＰ3’位でのランダムアミノ酸（システイン以外）を有するＯＭ９９−２の配列に基づくものであった。Ｐ1およびＰ1’位を固定するために、合成で二同配体(diisostere)Ｌｅｕ*Ａｌａ（*はヒドロキシエチレン遷移状態同配体を表す）を用いた。ペプチドを、固体状態ペプチド合成法により合成し、樹脂ビーズを付着したままにしておいた。「スプリット合成(split-synthesis)」手順（Lamら、1991）を用いることにより、樹脂ビーズのそれぞれは、たった１つの配列を含んだが、該配列はビーズにより異なった。全ライブラリー配列は：
ここで、Ｘｘｎ残基（ここで、ｎは１，２，３または４のいずれかである）は、１９個のアミノ酸を用いて各位置でランダム化される、であった。Ｐ2’から始まる、より短い形態のペプチド
はまた、より長い配列に対して約７：３の比で、各ビーズに存在した。同配体が無い場合、短配列は有意な強度でメマプシン２に結合しないが、その存在は、自動Ｅｄｍａｎ分解による残基の同定にとって都合がよかった。ランダム化位置から同定された残基は以下のとおりである。
Ｅｄｍａｎサイクル番号 １ ２ ３ ４
配列１、長配列由来： Ｇｌｙ Ｘｘ１ Ｘｘ２ Ｌｅｕ
配列２、短配列由来： Ｘｘ３ Ｘｘ４ Ｐｈｅ Ａｒｇ
配列１、長配列由来： Ｇｌｙ Ｘｘ１ Ｘｘ２ Ｌｅｕ
配列２、短配列由来： Ｘｘ３ Ｘｘ４ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｘｘ３およびＸｘ２割当ては、それぞれ、サイクル１および３で唯一の未知残基であるので、あいまいさはなかった。アミノ酸Ｘｘ１およびＸｘ４を、その相対量により割当てた。メチオニンの存在により、ＣＮＢｒ切断を可能にし、その後、ＭＳ／ＭＳによりペプチドを同定する。
ランダム配列ライブラリーのプロービング
１．１ｍｌの固定ビーズに含まれると推定される、ライブラリーの１コピーに相当する、約１３０，０００の個々のビーズを、バッファーＡ（５０ｍＭ 酢酸Ｎａ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４Ｍ尿素、０．０２％アジ化Ｎａ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ３．５；５ミクロンフィルターで濾過）中で水和した。ビーズを３％ＢＳＡ含有バッファーＡ中に１時間浸漬し、非特異的結合をブロックし、同じバッファーで２回リンスした。組換えメマプシン２をバッファーＡ中で４ｎＭに希釈し、ライブラリーとともに１時間インキュベートした。１回のストリンジェンシー洗浄を行い、このとき、６．７μＭ遷移状態同配体インヒビターＯＭ９９−２をバッファーＢ（５０ｍＭ 酢酸Ｎａ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０２％アジ化Ｎａ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ５．５；５ミクロンフィルターで濾過）中に含んでいた。その後、さらにＯＭ９９−２を含まないバッファーＢで２回洗浄した。組換えメマプシン２に対して特異的な親和性精製ＩｇＧをバッファーＢ中で１００倍に希釈し、ライブラリーとともに３０分インキュベートした。バッファーＢで３回洗浄した後、親和性精製抗ヤギアルカリホスファターゼコンジュゲートをバッファーＢ中で希釈（１：２００）し、３０分間インキュベートし、続いて３回洗浄した。アルカリホスファターゼ基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）の錠剤１つを１０ｍｌの水に溶解し、１ｍｌをビーズに塗布し、１時間インキュベートした。ビーズを０．０２％アジ化ナトリウム含有水に再懸濁し、解剖顕微鏡下で検査した。ぼんやりと染色されたビーズを視覚によりランク付けし、個々に単離し、８Ｍ尿素中に２４時間ストリップ(strip)し、ＤＭＦ中で汚れを除いた。キャンパス内のMolecular Biology Resource Center にて、Applied Biosystems Protein Sequenceer において、ビーズの配列決定を行ない、逆相ＨＰＬＣを用いてＰＴＨ−アミノ酸を定量した。
１．１ｍｌの固定ビーズに含まれると推定される、ライブラリーの１コピーに相当する、約１３０，０００の個々のビーズを、バッファーＡ（５０ｍＭ 酢酸Ｎａ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４Ｍ尿素、０．０２％アジ化Ｎａ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ３．５；５ミクロンフィルターで濾過）中で水和した。ビーズを３％ＢＳＡ含有バッファーＡ中に１時間浸漬し、非特異的結合をブロックし、同じバッファーで２回リンスした。組換えメマプシン２をバッファーＡ中で４ｎＭに希釈し、ライブラリーとともに１時間インキュベートした。１回のストリンジェンシー洗浄を行い、このとき、６．７μＭ遷移状態同配体インヒビターＯＭ９９−２をバッファーＢ（５０ｍＭ 酢酸Ｎａ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０２％アジ化Ｎａ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ５．５；５ミクロンフィルターで濾過）中に含んでいた。その後、さらにＯＭ９９−２を含まないバッファーＢで２回洗浄した。組換えメマプシン２に対して特異的な親和性精製ＩｇＧをバッファーＢ中で１００倍に希釈し、ライブラリーとともに３０分インキュベートした。バッファーＢで３回洗浄した後、親和性精製抗ヤギアルカリホスファターゼコンジュゲートをバッファーＢ中で希釈（１：２００）し、３０分間インキュベートし、続いて３回洗浄した。アルカリホスファターゼ基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）の錠剤１つを１０ｍｌの水に溶解し、１ｍｌをビーズに塗布し、１時間インキュベートした。ビーズを０．０２％アジ化ナトリウム含有水に再懸濁し、解剖顕微鏡下で検査した。ぼんやりと染色されたビーズを視覚によりランク付けし、個々に単離し、８Ｍ尿素中に２４時間ストリップ(strip)し、ＤＭＦ中で汚れを除いた。キャンパス内のMolecular Biology Resource Center にて、Applied Biosystems Protein Sequenceer において、ビーズの配列決定を行ない、逆相ＨＰＬＣを用いてＰＴＨ−アミノ酸を定量した。
動力学パラメータの測定
単一のペプチドを用いた動力学パラメータ、Ｋmおよびｋcatならびに遊離インヒビターに対するＫiを、上述のようにして測定した。
単一のペプチドを用いた動力学パラメータ、Ｋmおよびｋcatならびに遊離インヒビターに対するＫiを、上述のようにして測定した。
メマプシン２に結合するＯＭ００−３のモデル構築
メマプシン２との複合体におけるＯＭ９９−２の結晶構造を、初期モデルとして使用した。対応するサブサイト残基を、ＯＭ００−３のものと置換した。側鎖コンホメーションを、非結合相互作用による結合ポケット内への最も良好な適合についてロトマー(rotomer)ライブラリーから視覚的に選択した。次いで、ＥｎｇｈおよびＨｕｂｅｒエネルギーパラメータ（Acta Cryst. A47, 392-400 (1991)のEngh, R.A.およびHuber 「Accurate bond and angle parameters for X-ray structure refinement」）を用いるＣＮＳプログラムにより、エネルギー最小化を行った。該最小化プロセス中、Ｃα原子およびインヒビターから５オングストロームを超えた距離を有する該原子を調和拘束(harmonic restrains)に供した。
メマプシン２との複合体におけるＯＭ９９−２の結晶構造を、初期モデルとして使用した。対応するサブサイト残基を、ＯＭ００−３のものと置換した。側鎖コンホメーションを、非結合相互作用による結合ポケット内への最も良好な適合についてロトマー(rotomer)ライブラリーから視覚的に選択した。次いで、ＥｎｇｈおよびＨｕｂｅｒエネルギーパラメータ（Acta Cryst. A47, 392-400 (1991)のEngh, R.A.およびHuber 「Accurate bond and angle parameters for X-ray structure refinement」）を用いるＣＮＳプログラムにより、エネルギー最小化を行った。該最小化プロセス中、Ｃα原子およびインヒビターから５オングストロームを超えた距離を有する該原子を調和拘束(harmonic restrains)に供した。
結果
メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先の測定
メマプシン２の基質裂溝は、結晶構造において示されるような側鎖に対して、８個のサブサイトを適応する。メマプシン２のすべてのサブサイトに対する古典的な酵素動力学により解析された側鎖優先の完全な組は、これまでに、広域特異性を有するいずれのアスパラギン酸プロテアーゼについても達成されていない単調で退屈な作業である、１６０対の個々のｋcatおよびＫm値の測定を必要とする。しかしながら、サブサイト優先は、相対的触媒効率、異なる側鎖を有する基質のｋcat／Ｋm値により規定され、これは、基質の規定混合物の相対的初期加水分解速度から測定されうる（Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism, 第2版, Freeman, New York, (1985)、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。この方法を、他のアスパラギン酸プロテアーゼの特異性を解析するために良好に使用している（Kasselら、1995; Koelschら、2000、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。速度の測定を、生成物および基質の相対量の定量のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳイオン強度の使用によりさらに簡素化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳイオン強度を、血漿および細胞培養物由来の化合物を定量するため（Anal. Biochem. 274:90-97 (1999)のSugiyamaら、「A quantitative analysis of serum sulfatide by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry with delayed ion extraction」; Anal Chem. 69:3767-71 (1997)のWuら、「An automated MALDI mass spectrometry approach for optimizing cyclosporin extraction and quantitation」、そのすべての教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）、および細胞培養物由来のＡβ４０およびＡβ４２の相対量を測定するため（Annu Rev Biophys Biophys Chem. 19:189-215 (1990)のDaviesら、「The structure and function of the aspartic proteunases」、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）に適切に使用されている。本方法に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの利点としては、その感度およびデータの迅速な獲得が挙げられる。良好な相間関係を生じた、生成物および基質の混合物に関するイオン強度データの直線性は、混合物中における各基質と一致し、補正係数を必要としなかった。続いて、この方法を用いて、各混合物中の各ペプチドに関する加水分解の初期速度を測定した。これらの初期速度の比率は、その相対的触媒効率ｋcat／Ｋm（Fersht, 1985）に正比例する。
メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先の測定
メマプシン２の基質裂溝は、結晶構造において示されるような側鎖に対して、８個のサブサイトを適応する。メマプシン２のすべてのサブサイトに対する古典的な酵素動力学により解析された側鎖優先の完全な組は、これまでに、広域特異性を有するいずれのアスパラギン酸プロテアーゼについても達成されていない単調で退屈な作業である、１６０対の個々のｋcatおよびＫm値の測定を必要とする。しかしながら、サブサイト優先は、相対的触媒効率、異なる側鎖を有する基質のｋcat／Ｋm値により規定され、これは、基質の規定混合物の相対的初期加水分解速度から測定されうる（Fersht, A. Enzyme Structure and Mechanism, 第2版, Freeman, New York, (1985)、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。この方法を、他のアスパラギン酸プロテアーゼの特異性を解析するために良好に使用している（Kasselら、1995; Koelschら、2000、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。速度の測定を、生成物および基質の相対量の定量のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳイオン強度の使用によりさらに簡素化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳイオン強度を、血漿および細胞培養物由来の化合物を定量するため（Anal. Biochem. 274:90-97 (1999)のSugiyamaら、「A quantitative analysis of serum sulfatide by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry with delayed ion extraction」; Anal Chem. 69:3767-71 (1997)のWuら、「An automated MALDI mass spectrometry approach for optimizing cyclosporin extraction and quantitation」、そのすべての教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）、および細胞培養物由来のＡβ４０およびＡβ４２の相対量を測定するため（Annu Rev Biophys Biophys Chem. 19:189-215 (1990)のDaviesら、「The structure and function of the aspartic proteunases」、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）に適切に使用されている。本方法に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの利点としては、その感度およびデータの迅速な獲得が挙げられる。良好な相間関係を生じた、生成物および基質の混合物に関するイオン強度データの直線性は、混合物中における各基質と一致し、補正係数を必要としなかった。続いて、この方法を用いて、各混合物中の各ペプチドに関する加水分解の初期速度を測定した。これらの初期速度の比率は、その相対的触媒効率ｋcat／Ｋm（Fersht, 1985）に正比例する。
基質の８個のサブサイト位置に関するメマプシン２の相対的触媒効率を図５に示す。これらの結果は、メマプシン２の８個のサブサイトのいずれも絶対的にストリンジェントでないという以前の観察を確認するものである。Ｐ側およびＰ’側の両方において、中心サブサイト（Ｐ1およびＰ1’）は、外側サブサイト（Ｐ4およびＰ4’）よりもストリンジェントであった。これは、好ましくない残基（バックグラウンド）の加水分解効率を好ましい残基と比較する場合に明白である。ストリンジェンシーの欠如は、Ｐ’側の４個のサブサイト、特に、バックグラウンドが相対的に高いＰ3’およびＰ4’についてより顕著である。これらの２個のサブサイトの不十分なストリンジェンシーは、ＯＭ９９−２のＰ3’およびＰ4’側鎖が、結晶構造内の酵素と有意に相互作用しないという観察に一致する。
サブサイトＰ4は、ＧｌｎよりもＧｌｕを好むが、次にＧｌｎはＡｓｐよりも好まれる。ＯＭ９９−２のＰ4−Ｇｌｕは、複数の相互作用でＳ４ポケット内に良好に適合する。Ｐ4−ＧｌｕのＧｌｎとの置換による触媒効率の低下は、Ｐ4側鎖のＡｒｇ235およびＡｒｇ307との電荷相互作用の損失によるものでありうる。Ｐ4−ＧｌｕのＡｓｐとの置換による触媒効率のさらなる低下は、Ｐ2−Ａｓｐへの水素結合の非存在によるものであろう。サブサイトＰ３では、ＯＭ９９−２の場合、ＶａｌよりもＩｌｅが好ましい。これは、Ｓ3疎水性ポケットにおけるより良好な適合によるものである。
コンビナトリアルライブラリーで測定されたインヒビター側鎖優先
インヒビター結合に対するサブサイト優先も研究した。ビーズ上に固定した約１．３×１０5の異なるインヒビターのコンビナトリアルライブラリーを合成し、メマプシン２でプロービングした。ライブラリーの塩基配列をＯＭ９９−２、ＥＶＮＬ*ＡＡＥＦ（配列番号：６９）（*は同配体ヒドロキシエチレンを表す）から採用し、ここで、サブサイトＰ3、Ｐ2、Ｐ2’およびＰ3’（太字）をシステインを除くすべてのアミノ酸についてランダム化した。Ｐ1およびＰ1’を、ライブラリー合成におけるＬ*Ａの使用のため一定に維持した。Ｐ4およびＰ4’は、ライブリーサイズを操作可能に維持するためにランダム化しなかった。また、それらの外側サブサイトに関する情報は、より小さいインヒビターの設計のためにはあまり重要でない。尿素溶液で洗浄することにより、ライブラリーに対するメマプシン２の結合選択性を増強させた後、ビーズ上に結合したメマプシン２を、メマプシン２に対して惹起した抗体およびアルカリホスファターゼ複合二次抗体により検出した。光学顕微鏡下で観察すると、約１３０，０００個のビーズの約６５個が強く染色されていた。自動Ｅｄｍａｎシークエンシングにより、１０個の最も強く染色されたビーズ由来のインヒビター配列を決定した（表２）。４つのランダム化位置での明白な共通点（太字）がＥＬＤＬＡＶＥＦ（配列番号：７０）であると観察された。陽性ビーズにおける明白な共通点および陰性ビーズにおける共通点の欠如（表２）は、メマプシン２がライブラリー内の好ましい配列に結合した、という論点を裏付ける。また、共通のインヒビター配列は、基質研究から得られた結果と充分に一致する。共通配列ＥＬＤＬ*ＡＶＥＦ（配列番号：７１）を有するインヒビターＯＭ００−３を、上述の方法を用いて合成した。このインヒビターのＫiは、０．３１ｎＭであることが示され、ＯＭ９９−２のＫiのほぼ５倍低かった。
インヒビター結合に対するサブサイト優先も研究した。ビーズ上に固定した約１．３×１０5の異なるインヒビターのコンビナトリアルライブラリーを合成し、メマプシン２でプロービングした。ライブラリーの塩基配列をＯＭ９９−２、ＥＶＮＬ*ＡＡＥＦ（配列番号：６９）（*は同配体ヒドロキシエチレンを表す）から採用し、ここで、サブサイトＰ3、Ｐ2、Ｐ2’およびＰ3’（太字）をシステインを除くすべてのアミノ酸についてランダム化した。Ｐ1およびＰ1’を、ライブラリー合成におけるＬ*Ａの使用のため一定に維持した。Ｐ4およびＰ4’は、ライブリーサイズを操作可能に維持するためにランダム化しなかった。また、それらの外側サブサイトに関する情報は、より小さいインヒビターの設計のためにはあまり重要でない。尿素溶液で洗浄することにより、ライブラリーに対するメマプシン２の結合選択性を増強させた後、ビーズ上に結合したメマプシン２を、メマプシン２に対して惹起した抗体およびアルカリホスファターゼ複合二次抗体により検出した。光学顕微鏡下で観察すると、約１３０，０００個のビーズの約６５個が強く染色されていた。自動Ｅｄｍａｎシークエンシングにより、１０個の最も強く染色されたビーズ由来のインヒビター配列を決定した（表２）。４つのランダム化位置での明白な共通点（太字）がＥＬＤＬＡＶＥＦ（配列番号：７０）であると観察された。陽性ビーズにおける明白な共通点および陰性ビーズにおける共通点の欠如（表２）は、メマプシン２がライブラリー内の好ましい配列に結合した、という論点を裏付ける。また、共通のインヒビター配列は、基質研究から得られた結果と充分に一致する。共通配列ＥＬＤＬ*ＡＶＥＦ（配列番号：７１）を有するインヒビターＯＭ００−３を、上述の方法を用いて合成した。このインヒビターのＫiは、０．３１ｎＭであることが示され、ＯＭ９９−２のＫiのほぼ５倍低かった。
メマプシン２の活性部位におけるＯＭ００−３の結合
ＯＭ９９−２の結晶構造とＯＭ２０００−１の分子モデルとの比較は、後者のメマプシン２に対する改良されたインヒビター結合を明らかにする。ＯＭ９９−２と比較すると、ＯＭ００−３のＰ3およびＰ2’サブサイトにおける側鎖の疎水性が大きいほど、改良されたファンデルワールス相互作用によって、酵素サブサイトにより良好に適応する。これらの中には６個の重要な新しい相互作用：インヒビターのＰ3−Ｌｅｗと酵素のＬｅｗおよびＧｌｙ、ならびにＰ2’−ＶａｌとＶａｌ、Ｔｙｒ、ＩｌｅおよびＴｙｒがある。また、モデルは、Ｐ2位置でのＡｓｐによるＡｓｎの置換が、Ｐ2−Ａｓｐの側鎖原子ＣＤ１およびＣＤ２と、Ａｒｇ−２３５のＮＥおよびＮＨ１のものとの間に３つの新しい塩橋を導入することを示す。これらの塩架橋の原子間距離は、それぞれ３．６、３．４および３．５オングストロームである。これらの電荷相互作用は、結合自由エネルギー(free energy of binding)を、ＯＭ９９−２内のＰ2−Ａｓｐのものよりも高くするはずである。２つのインヒビターの結合間で観察されたこれらの構造の違いは、ＯＭ９９−２からＯＭ００−３へのＫi値における４．５倍の低下と一致する。
ＯＭ９９−２の結晶構造とＯＭ２０００−１の分子モデルとの比較は、後者のメマプシン２に対する改良されたインヒビター結合を明らかにする。ＯＭ９９−２と比較すると、ＯＭ００−３のＰ3およびＰ2’サブサイトにおける側鎖の疎水性が大きいほど、改良されたファンデルワールス相互作用によって、酵素サブサイトにより良好に適応する。これらの中には６個の重要な新しい相互作用：インヒビターのＰ3−Ｌｅｗと酵素のＬｅｗおよびＧｌｙ、ならびにＰ2’−ＶａｌとＶａｌ、Ｔｙｒ、ＩｌｅおよびＴｙｒがある。また、モデルは、Ｐ2位置でのＡｓｐによるＡｓｎの置換が、Ｐ2−Ａｓｐの側鎖原子ＣＤ１およびＣＤ２と、Ａｒｇ−２３５のＮＥおよびＮＨ１のものとの間に３つの新しい塩橋を導入することを示す。これらの塩架橋の原子間距離は、それぞれ３．６、３．４および３．５オングストロームである。これらの電荷相互作用は、結合自由エネルギー(free energy of binding)を、ＯＭ９９−２内のＰ2−Ａｓｐのものよりも高くするはずである。２つのインヒビターの結合間で観察されたこれらの構造の違いは、ＯＭ９９−２からＯＭ００−３へのＫi値における４．５倍の低下と一致する。
ＡＤの臨床治療に有用であるためには、メマプシン２インヒビターは、血液脳関門を透過しなければならず、それゆえ、大きさが小さくなければならない（＜７００ダルトン）。ＯＭ００−３などの８残基インヒビターは９１７ダルトンである。より小さいインヒビターは、より少ないサブサイト、おそらく、わずか４か５個にわたるサブサイトを用いて設計することができる。サブサイト優先に関する本明細書に記載の情報ならびにサブサイトの三次元構造に関する情報を、これらのインヒビターの設計に使用することができる。
実施例６:インヒビターを設計するための結晶構造の使用
薬学的に許容され得るインヒビター薬物は、通常、８００ダルトン未満である。メマプシン２インヒビターの場合、この要件は、血液脳を透過する薬物である必要性により、さらにより厳密でありうる。現在のモデルにおいて、Ｐ4からＰ2’における充分に規定されたサブサイト構造は、かかる薬物の合理的な設計のための充分な鋳型領域を提供する。この結晶構造において明らかにされたような個々のインヒビター側鎖と酵素の対応するサブサイトとの特別な関係は、これらの位置のそれぞれにおける新しいインヒビター構造の設計を可能にする。また、サブサイトＰ2’、Ｐ3’およびＰ4’の特有のコンホメーションをメマプシン２インヒビターの選択性に組み込むことも可能である。現在の結晶構造に基づくインヒビター設計の例を以下に示す。
薬学的に許容され得るインヒビター薬物は、通常、８００ダルトン未満である。メマプシン２インヒビターの場合、この要件は、血液脳を透過する薬物である必要性により、さらにより厳密でありうる。現在のモデルにおいて、Ｐ4からＰ2’における充分に規定されたサブサイト構造は、かかる薬物の合理的な設計のための充分な鋳型領域を提供する。この結晶構造において明らかにされたような個々のインヒビター側鎖と酵素の対応するサブサイトとの特別な関係は、これらの位置のそれぞれにおける新しいインヒビター構造の設計を可能にする。また、サブサイトＰ2’、Ｐ3’およびＰ4’の特有のコンホメーションをメマプシン２インヒビターの選択性に組み込むことも可能である。現在の結晶構造に基づくインヒビター設計の例を以下に示す。
実施例Ａ：Ｐ3 ＶａｌおよびＰ1 Ｌｅｕの側鎖は互いに対して束ねられ、これらの間には酵素構造が存在しないので、これらの側鎖を架橋すると、メマプシン２に対するインヒビターの結合強度が増大する。これは、酵素に結合すると、架橋インヒビターが、その非架橋対照物よりも遊離形態と結合形態との間で小さなエントロピー差を有するためである（Khan, A.R.ら、Biochemistry, 37: 16839 (1998)、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。架橋側鎖の可能な構造としては、図１に示すものが挙げられる。
実施例Ｂ：同じ状況がＰ４ ＧｌｕとＰ２ Ａｓｎとの間にも存在する。現在の結晶構造は、これらの側鎖がすでに互いに水素結合されているため、これらの間の架橋がまたＡに記載のような結合の利点を誘導することを示す。架橋構造としては、図２に示すものが挙げられる。
実施例Ｃ：現在の結晶構造に基づいて、Ｐ1’ Ａｌａ側鎖を伸長して、新しい疎水性のファンデルワールス力およびＨ−結合相互作用を付加しうる。かかる設計の例を図３に図示する。
実施例Ｄ：現在の結晶構造に基づいて、２つの原子を付加することにより、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の領域におけるポリペプチド骨格、ならびにＰ１−Ｌｅｕの側鎖を環に架橋することができる（図４のＡおよびＢ）。また、Ｐ１−Ｌｅｕのβ−炭素にメチル基を付加することができる（図４）。
本明細書に記載した方法および材料の修正および変形は当業者に自明であり、添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
発明をその好ましい態様に関して具体的に示し記載したが、当業者は、添付の請求の範囲により包含される本発明の範囲を逸脱することなく本明細書において形態および詳細の種々の変更を行いうることを理解されたい。
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、10-7M以下のKiを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビター。
［２］メマプシン２の活性部位の同配体を含有してなる［１］記載のインヒビター。
［３］一般形態
X-L4-P4-L3-P3-L2-P2-L1-P1-L0-P1-L1'-P2'-L2'-P3'-L3'-P4'-L4'-Y、
式中、Pxは、-L0-により表される切断部位に関する基質特異性位置を表し、Lxは各基質特異性位置、Px間の連結領域を表し、ここでL0は、非加水分解性結合であり、P1'は-R4CR3-であり、ここでR1はCH2OH（セリンの側鎖）よりも小さい基であり、少なくとも２つの他のP位は疎水性基である、
を有する分子を含有してなる［２］記載のインヒビター。
［４］10-6M以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［５］2nM以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［６］1nM以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［７］配列番号：２のアミノ酸28〜441の側鎖および骨格原子について0.5Å以下の根平均二乗差を有する［１］記載のインヒビター。
［８］血液脳関門に透過可能である［１］記載のインヒビター。
［９］900ダルトン未満の分子量である［１］記載のインヒビター。
［１０］生理的条件下でメマプシン２による切断をブロックする［１］記載のインヒビター。
［１１］10-6M以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［１２］MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070、およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物。
［１３］MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-070、およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物。
［１４］MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-070およびMMI-071からなる群より選ばれるメマプシン２のインヒビターの有効量を個体に投与することを含む、アルツハイマー病の発症の可能性または進行を減少させるために患者を治療する方法。
［１５］インヒビターが経口投与される［１４］記載の方法。
［１６］インヒビターがAPPの切断をブロックする［１４］記載の方法。
［１７］ａ）メマプシン２基質の混合物とメマプシン２とを反応させる工程；および
ｂ）メマプシン２基質の混合物の相対初期加水分解速度を測定することによりメマプシン２のサブサイト優先度を決定する工程
を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法。
［１８］初期加水分解速度が、MALDI-TOF/MSデバイスを用いることにより測定され、ここでMALDI-TOF/MS測定値に由来するイオン強度が、基質、および基質の加水分解により形成されたその産物の相対量の定量に使用される［１７］記載の方法。
［１９］ａ）メマプシン２インヒビターのコンビナトリアルライブラリーを調製する工程、ここで該インヒビターはOM99-2から取得された塩基配列を含む；
ｂ）メマプシン２を用いてインヒビターのライブラリーをプロービングする工程、ここでメマプシン２は、１つまたは複数のインヒビターに結合し、１つまたは複数の結合したメマプシン２を生成する；および
ｃ）メマプシン２に対して惹起された抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いて、結合したメマプシン２を検出する工程
を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法。
［２０］インヒビターがビーズに固定される［１９］記載の方法。
［２１］塩基配列がEVNL*AAEFであり、メマプシン２のP3、P2、P2'、およびP3'サブサイトが無作為化される［１９］記載の方法。
［２２］ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒的アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、10-7M以下のKiを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用。
［２３］ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、10-7M以下のKiを有し、側鎖およびアミノ酸18〜379の骨格原子について0.5Å以下の根平均二乗差を有する、触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用。
［２４］ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物の使用。
［１］２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、10-7M以下のKiを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビター。
［２］メマプシン２の活性部位の同配体を含有してなる［１］記載のインヒビター。
［３］一般形態
X-L4-P4-L3-P3-L2-P2-L1-P1-L0-P1-L1'-P2'-L2'-P3'-L3'-P4'-L4'-Y、
式中、Pxは、-L0-により表される切断部位に関する基質特異性位置を表し、Lxは各基質特異性位置、Px間の連結領域を表し、ここでL0は、非加水分解性結合であり、P1'は-R4CR3-であり、ここでR1はCH2OH（セリンの側鎖）よりも小さい基であり、少なくとも２つの他のP位は疎水性基である、
を有する分子を含有してなる［２］記載のインヒビター。
［４］10-6M以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［５］2nM以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［６］1nM以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［７］配列番号：２のアミノ酸28〜441の側鎖および骨格原子について0.5Å以下の根平均二乗差を有する［１］記載のインヒビター。
［８］血液脳関門に透過可能である［１］記載のインヒビター。
［９］900ダルトン未満の分子量である［１］記載のインヒビター。
［１０］生理的条件下でメマプシン２による切断をブロックする［１］記載のインヒビター。
［１１］10-6M以下のKiを有する［１］記載のインヒビター。
［１２］MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070、およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物。
［１３］MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-070、およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物。
［１４］MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-070およびMMI-071からなる群より選ばれるメマプシン２のインヒビターの有効量を個体に投与することを含む、アルツハイマー病の発症の可能性または進行を減少させるために患者を治療する方法。
［１５］インヒビターが経口投与される［１４］記載の方法。
［１６］インヒビターがAPPの切断をブロックする［１４］記載の方法。
［１７］ａ）メマプシン２基質の混合物とメマプシン２とを反応させる工程；および
ｂ）メマプシン２基質の混合物の相対初期加水分解速度を測定することによりメマプシン２のサブサイト優先度を決定する工程
を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法。
［１８］初期加水分解速度が、MALDI-TOF/MSデバイスを用いることにより測定され、ここでMALDI-TOF/MS測定値に由来するイオン強度が、基質、および基質の加水分解により形成されたその産物の相対量の定量に使用される［１７］記載の方法。
［１９］ａ）メマプシン２インヒビターのコンビナトリアルライブラリーを調製する工程、ここで該インヒビターはOM99-2から取得された塩基配列を含む；
ｂ）メマプシン２を用いてインヒビターのライブラリーをプロービングする工程、ここでメマプシン２は、１つまたは複数のインヒビターに結合し、１つまたは複数の結合したメマプシン２を生成する；および
ｃ）メマプシン２に対して惹起された抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いて、結合したメマプシン２を検出する工程
を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法。
［２０］インヒビターがビーズに固定される［１９］記載の方法。
［２１］塩基配列がEVNL*AAEFであり、メマプシン２のP3、P2、P2'、およびP3'サブサイトが無作為化される［１９］記載の方法。
［２２］ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒的アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、10-7M以下のKiを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用。
［２３］ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、10-7M以下のKiを有し、側鎖およびアミノ酸18〜379の骨格原子について0.5Å以下の根平均二乗差を有する、触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用。
［２４］ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070およびMMI-071からなる群より選ばれる化合物の使用。
Claims (2)
- （１）メマプシン２と少なくとも1つのメマプシン２基質および標準ペプチドの混合物とを接触させる工程；
（２）メマプシン２により標準ペプチドを加水分解して標準ペプチド加水分解産物を形成する工程；
（３）メマプシン２により少なくとも1つのメマプシン２基質を加水分解してメマプシン２基質加水分解産物を形成する工程；
（４）MALDI-TOF/MSデバイスを用いて標準ペプチド加水分解産物およびメマプシン２基質加水分解産物を同定および定量し、それにより標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の初期加水分解速度を決定する工程
を含む、標準ペプチドと比較したメマプシン２基質の加水分解速度を決定する方法。 - 前記加水分解速度が初期加水分解速度である請求項１記載の方法。
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