JP5075641B2 - 遺伝子改変動物およびその用途 - Google Patents
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Description
これらの知見から、GPR40に特異的に作用する化合物は、血中インスリン濃度をコントロールできる可能性が考えられ、GPR40作動薬は糖尿病に対する新規の作用メカニズムを有する予防・治療薬として期待されている。しかしながら、GPR40の生体での機能については、まだ十分に解明されていない点も多い。
遺伝子の機能解析においては、トランスジェニックマウスやノックアウトマウス等の遺伝子改変動物が大いに威力を発揮する。GPR40の遺伝子導入マウスおよび遺伝子欠損マウスも報告されている(非特許文献3、特許文献4)。それによると、GPR40遺伝子欠損マウスは高脂肪食負荷による耐糖能悪化に対して抵抗性であるのに対し、GPR40遺伝子導入マウスはインスリン分泌不全を伴う糖尿病を発症する。
他方、本発明者らは、相同組換えを用いてGPR40遺伝子を破壊したGPR40遺伝子ノックアウト(KO)動物を作出することにも成功した。該KOマウスをC57BL/6J系統に戻し交配した結果得られたコンジェニック系統においては、野生型マウスと比較して顕著な表現型は認められなかった。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1]外来性GPR40をコードするDNAを発現可能な状態で保持するトランスジェニックマウスであって、対応する非トランスジェニックマウスと比較して
(1)インスリン分泌能が増大している、および/または
(2)耐糖能が改善されている
ことを特徴とするマウスまたはその生体の一部、
[2]外来性GPR40をコードするDNAがインスリンプロモーターの制御下にある上記[1]記載のマウスまたはその生体の一部、
[3]外来性GPR40が配列番号:2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記[1]記載のマウスまたはその生体の一部、
[4]上記[1]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、GPR40アゴニスト活性またはGPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴とするGPR40アゴニストまたはGPR40アンタゴニストのスクリーニング方法、
[5]上記[1]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能を測定することを特徴とする、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法、
[6]インスリンプロモーターの制御下にある外来性GPR40をコードするDNAを保持するマウスの受精卵、
[7]外来性GPR40がマウスにとって異種であり、かつ内在性GPR40遺伝子発現不全である上記[1]記載のマウスまたはその生体の一部、
[8]異種GPR40がヒト由来である上記[7]記載のマウスまたはその生体の一部、
[9]上記[7]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、GPR40アゴニスト活性またはGPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種GPR40アゴニストまたは異種GPR40アンタゴニストのスクリーニング方法、
[10]上記[7]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能を測定することを特徴とする、異種哺乳動物における(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法、
[11]上記[1]記載のマウスと他の病態モデルマウスとの交配によって生じる病態モデルマウスまたはその生体の一部、
[12]上記[1]記載のマウスに対する薬剤誘発またはストレス負荷によって生じる病態モデルマウスまたはその生体の一部、
[13]上記[11]または[12]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、病態の改善を検定することを特徴とする該病態を伴う疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、
[14]病態もしくは疾患が、代謝性症候群またはその1以上の症候である上記[13]記載の方法、などを提供するものである。
本発明のTg動物の生体の一部としては、膵臓、肝臓、脂肪組織、骨格筋、腎臓、副腎、血管、心臓、消化管、脳などの臓器や、当該臓器由来の組織片および細胞などが好ましく例示される。
また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類が本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、例えばヒトGPR40の場合、配列番号:2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号:2で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。「実質的に同質の活性」としては、例えば、リガンド[即ち、遊離脂肪酸など(アゴニスト、アンタゴニストを含む)]結合活性、細胞内Ca++濃度上昇作用、cAMP生成抑制作用、膵β細胞からのインスリン分泌促進作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が定性的に同等であることを示す。したがって、リガンド結合活性、細胞内Ca++濃度上昇作用、cAMP生成抑制作用、インスリン分泌促進作用などの活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2倍)や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性、細胞内Ca++濃度上昇作用、cAMP生成抑制作用、インスリン分泌促進作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、上記特許文献3に記載されるスクリーニング方法等に従って測定することができる。
ヒト以外の哺乳動物由来のGPR40をコードするDNAとしては、上記特許文献3に記載されるマウス、ラット、ハムスター由来DNA等が挙げられる。
用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス(好ましくはC57BL/6J(B6)などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など)を用いる場合は、雌が約4〜約6週齢、雄が約2〜約8ヶ月齢程度のものが好ましく、また、約12時間明期条件(例えば7:00-19:00)で約1週間飼育したものが好ましい。
体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と1個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰***を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の***誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン(妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にPMSGと略する)、次いで黄体形成ホルモン(ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にhCGと略する)を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス(好ましくはC57BL/6J(B6)などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など)の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約48時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約20〜約50IU/個体、好ましくは約30IU/個体、黄体形成ホルモンの投与量は約0〜約10IU/個体、好ましくは約5IU/個体である。
一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地(例:M16培地、修正Whitten培地、BWW培地、M2培地、WM-HEPES培地、BWW-HEPES培地等)中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下でDNA顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
受胚用雌は自然***のものを用いてもよいし、あるいは精管切除(結紮)雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン(一般にLHRHと略する)もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。LHRH類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH、[D-Ala6]-LH-RH、[des-Gly10]-LH-RH、[D-His(Bzl)6]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。LHRHもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス(好ましくはICR系のマウスなど)の場合には、通常、LHRHもしくはその類縁体を投与した後、約4日目に雄マウスと交配させることが好ましく、LHRHあるいはその類縁体の投与量は、通常、約10〜60μg/個体、好ましくは約40μg/個体である。
通常、F0動物は相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のF0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に外来性GPR40をコードするDNAを有するホモ接合体を得るためには、F0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してF1動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。1遺伝子座にのみ導入DNAが組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
また、第二次セレクションとして、例えば、G-バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100%が望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞への遺伝子導入の後、正常細胞(例えば、マウスでは染色体数が2n=40である細胞)に再びクローニングすることが望ましい。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年;G. R. Martin, プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)第78巻、7634頁、1981年;T. C. Doetschmanら, ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明の外来性GPR40をコードするDNAを導入されたES細胞を分化させて得られる外来性GPR40発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおける外来性GPR40の細胞生物学的検討において有用である。
いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのES細胞の寄与率を毛色(コートカラー)で判定し得るように、ES細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ES細胞が129系マウス(毛色:アグーチ)由来であれば、採卵用雌としてC57BL/6マウス(毛色:ブラック)やICRマウス(毛色:アルビノ)を用い、ES細胞がC57BL/6もしくはDBF1マウス(毛色:ブラック)由来やTT2細胞(C57BL/6とCBAとのF1(毛色:アグーチ)由来)であれば、採卵用雌としてICRマウスやBALB/cマウス(毛色:アルビノ)を用いることができる。
また、生殖系列キメラ形成能はES細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、129系統由来のES細胞に対してはC57BL/6系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、C57BL/6系統由来のES細胞に対してはBALB/c系統由来の宿主胚等が好ましい。
採卵用雌マウスは約4〜約6週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約2〜約8ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン(卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン)を投与して過剰***を誘起した後に行なわれる。
共培養法による場合は、8細胞期胚および桑実胚(例えばマウスの場合、交配後約2.5日)を採卵用雌の卵管および子宮から採取して(あるいは8細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で8細胞期または桑実胚期まで培養してもよい)酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中に外来性GPR40をコードするDNAが導入されたES細胞塊(細胞数約10〜約15個)を入れ、さらに上記8細胞期胚または桑実胚(好ましくは2個)を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
生殖系列キメラの選択は、まずES細胞の雌雄が予め判別されている場合はES細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し(通常は雄性ES細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される)、次いで毛色等の表現型からES細胞の寄与率が高いキメラマウス(例えば、50%以上)を選択する。例えば、129系マウス由来の雄性ES細胞であるD3細胞とC57BL/6マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるF1動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌C57BL/6マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるF1の毛色はアグーチとなる。
さらに、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)第98巻, 第13090-13095頁, 2001年に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をSTOフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よく外来性GPR40へテロTg(+/-)産仔を得ることができる。
(1)インスリン分泌能が増大している、および/または
(2)耐糖能が改善されている
を有することを特徴とする。
従来公知のGPR40 Tgマウス(非特許文献3、特許文献4を参照)はインスリン分泌不全を伴う糖尿病を発症した。しかしながら、上記の本発明のTg動物の表現型は、GPR40作動薬が膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、糖尿病の予防・治療薬として有用であるとのコンセプトを支持するものである。即ち、本発明のTg動物では、外来性GPR40をコードするDNAはインスリンプロモーターの制御下であり、本来のβ細胞の機能亢進が達成されたと考えられる。また、本発明のTg動物の表現型は、実施例に記載するように2系統において認められたことから、導入遺伝子に基づく効果であり、正常なGPR40機能を反映していることが支持される。これに対し、公知のGPR40 TgマウスはIpf-1プロモーターによる発現マウスであり、用いたプロモーターが異なり、発現部位、発現時期、発現レベル、染色体への挿入場所の違い、または何らかの理由で表現型に相違がみられたと考えられる。
したがって、本発明はまた、本発明のTg動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、GPR40アゴニスト活性またはGPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴とする、GPR40アゴニストまたはGPR40アンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。また、ヒト型遺伝子を発現させた場合は、ヒト型遺伝子のみに作用する化合物の評価に有用となる。
ここで「アゴニスト活性」とは、GPR40に特異的に結合し、GPR40の活性型と不活性型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいい、その程度は特に限定されない。従って、「アゴニスト活性を有する物質(作動薬)」には、いわゆるフルアゴニストの他、パーシャルアゴニストも包含される。一方、「アンタゴニスト活性」とは、GPR40のリガンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない性質、あるいはGPR40の任意の部位に結合して、GPR40の活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。従って、本明細書において「アンタゴニスト活性を有する物質(拮抗薬)」とは、いわゆるニュートラルアンタゴニストとインバースアゴニストの両方を包含する概念として定義されるものとする。
GPR40作動薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、糖尿病の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人(体重60kg)においては、一日につき約0.1mg〜約100mg、好ましくは約1.0〜約50mg、より好ましくは約1.0〜約20mgである。非経口投与の場合、当該作動薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病の治療目的で注射剤として成人(体重60kg)に投与する場合、一日につき約0.01〜約30mg程度、好ましくは約0.1〜約20mg程度、より好ましくは約0.1〜約10mg程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(1)インスリン分泌能が増大している、および/または
(2)耐糖能が改善されている
ことを特徴とすることから、該動物は、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能調節薬のスクリーニングに特に有用である。
したがって、本発明はまた、本発明のTg動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能を測定することを特徴とする、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法を提供する。
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたDNAは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内在性GPR40遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはPCR法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ(HSV-tk)遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はHSV-tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内在性GPR40遺伝子座にターゲッティングされた細胞はHSV-tk遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをPCRもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入DNAの存在を確認する。
GPR40をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスDNAとしては、GPR40をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスDNAであってもよい。
特に、GPR40をコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、(a)翻訳阻害を指向したアンチセンスDNAの場合は、GPR40蛋白質のN末端部位をコードする部分の塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAが、(b)RNaseHによるRNA分解を指向するアンチセンスDNAの場合は、イントロンを含むGPR40をコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAがそれぞれ好適である。
さらに、本発明のアンチセンスDNAは、GPR40のmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるGPR40遺伝子と結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはDNA:RNAハイブリッドを形成してRNaseHによる分解を誘導するものであってもよい。
より長いアンチセンスRNA(例えば、GPR40 mRNAの相補鎖全長など)をコードするDNA発現ベクターは、常法によりクローニングしたGPR40 cDNAを、必要に応じて適当なリンカー(アダプター)配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に挿入することにより調製することができる。
一方、siRNAをコードするDNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードするDNAとして別個に合成し、それぞれを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。siRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該ベクターが導入された動物細胞内で、センス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ転写されてアニーリングすることにより、siRNAが形成される。shRNAはセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ(例えば15から25塩基程度)を間に挿入したユニットを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしてはU6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー(dicer)などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。あるいは、Pol II系プロモーターで、ターゲットのsiRNA配列を含むマイクロRNA(miRNA)を発現させてRNAiによりノックダウンを達成することも可能である。この場合には組織特異的発現を示すプロモーターにより、組織特異的ノックダウンも可能となる。
をC57BL/6Jマウスに戻し交配して得られたコンジェニック系のマウスでは、野生型マウスと比較して顕著な表現型を認めなかった。
被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、DNAライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど)の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
被験物質を適用していない動物またはその生体の一部と比較して、レポーター活性に有意な差が認められた場合、該被験物質をGPR40遺伝子のプロモーター活性を調節する物質として選択することができる。
また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された異種GPR40の発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端にloxP配列もしくはfrt配列を配したターゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期にCreもしくはFlpリコンビナーゼまたは該リコンビナーゼ発現ベクター(例:アデノウイルスベクターなど)を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出すことが好ましい。あるいは、Cre-loxP系やFlp-frt系を用いる代わりに、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出してもよい。
「GPR40の活性調節が関与する疾患」とは、GPR40活性の異常に起因するかもしくは結果的にGPR40活性の異常を生じる疾患だけでなく、GPR40活性を調節することにより予防および/または治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握されるべきである。
例えば、GPR40を活性化することにより予防・治療可能な疾患として、糖尿病(I型およびII型)、耐糖能障害、高脂血症、代謝性症候群、その他、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、動脈硬化、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが、GPR40を阻害することにより予防・治療可能な疾患として、肥満、高脂血症、II型糖尿病、インスリン抵抗性症候群、その他、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などがそれぞれ挙げられる。
これらの「他の遺伝子改変を有する疾患モデル」は、例えば、米国のJackson研究所などから購入可能であるか、あるいは周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作製することができる。
具体的な病態としては、好ましくは、代謝性症候群にみられる症候、例えば、糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能異常、肥満、高血圧、動脈硬化、高TG血症、高LDL-C血症、低HDL-C血症等が挙げられる。
被験物質を投与していない動物と比較して有意な病態の改善が認められた場合、該被験物質を該病態を伴う疾患の予防・治療活性を有する物質として選択することができる。
〔配列番号:1〕ヒトGPR40をコードするDNA(CDS)の塩基配列を示す。
〔配列番号:2〕ヒトGPR40のアミノ酸配列を示す。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
Gly :グリシン
Ala :アラニン
Val :バリン
Leu :ロイシン
Ile :イソロイシン
Ser :セリン
Thr :スレオニン
Cys :システイン
Met :メチオニン
Glu :グルタミン酸
Asp :アスパラギン酸
Lys :リジン
Arg :アルギニン
His :ヒスチジン
Phe :フェニルアラニン
Tyr :チロシン
Trp :トリプトファン
Pro :プロリン
Asn :アスパラギン
Gln :グルタミン
pGlu :ピログルタミン酸
Me :メチル基
Et :エチル基
Bu :ブチル基
Ph :フェニル基
TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基
ヒトGPR40遺伝子をマウス膵臓で高発現させるために、マウスインスリンIIプロモーターの下流に3’非翻訳領域を含むヒトGPR40遺伝子を導入したプラスミド pISLII4/GPR40を以下のようにして作製した。
マウスゲノム DNA (クロンテック社製)から、5’端にHindIIIおよびMluI 制限酵素部位を含むプライマー(5’-ATTAGAAAGCTTACGCGTGAGAGATAGAGGAGGAGGGACCATTAAGTG-3’;配列番号:3)、5’端にSalI 制限酵素部位を含むプライマー(5’-GTCGACACAATAACCTGGAAGATAGGCTGGGTTGAGGATAGCAAA-3’;配列番号:4)、および、KOD polymerase(東洋紡社製)を用いて94℃ 2 min→(94℃ 15sec →68℃ 45sec)×25 回の条件にてPCRを行い、マウスインスリンIIプロモーターを含む断片を pCR4-TOPO Blunt(インビトロジェン社製)にサブクローニングした。同様に、ヒトゲノム DNA (クロンテック社製)から、5’端にSalI制限酵素部位を含むプライマー(5’-ATTATTGTCGACCACCATGGACCTGCCCCCGCAGCTCTCCTTCGGCCTCTATGTGG-3’;配列番号:5)、5’-TATGCACGCAAACACAAACTCTAT-3’(配列番号:6)の配列を有するプライマー、および、KOD polymerase(東洋紡社製)を用いて94℃ 2 min →(94℃ 15sec →68℃ 3min)×25 回の条件にてPCRを行い、ヒトGPR40遺伝子コーディング領域および3’非翻訳領域を含むDNA断片をpCR4-TOPO Blunt(インビトロジェン社製)にサブクローニングした。
マウスインスリンIIプロモーターをサブクローニングしたプラスミドをHindIIIとSalIで二重消化し、得られた673bpのマウスインスリンIIプロモーター断片をpCAN618(WO 00/14226に記載)のHindIIIおよびSalI部位に導入した。次に、このプラスミドを SalIとSpeIで二重消化した部位に、ヒトGPR40遺伝子コーディング領域と3’非翻訳領域をサブクローニングしたプラスミドからSalIとSpeIの二重消化で得られた2256bpのDNA断片を挿入し、マウスインスリンIIプロモーター制御下でのヒトGPR40遺伝子発現プラスミドpISLII4/GPR40を作製した。これを大腸菌DH5αに導入して、形質転換体Escherichia coli DH5α/pISLII4/GPR40を得た。該菌株は2005年12月1日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-10462として寄託されている。
上記のpISLII4/GPR40をMluI、KpnI、および、SpeIで三重消化した後、低融点アガロースゲル(宝酒造社製)電気泳動にかけ、2928bpのDNA断片を切り出した。DNA断片をNucleotrap(日本ジェネティックス社製)で精製することにより、ヒトGPR40遺伝子発現ユニットを含むDNA断片を取得した(図1A)。
マイクロインジェクションによるトランスジェニックマウス作製はHoganらの方法(Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994)に従って行った。実施例1にて作製したヒトGPR40遺伝子発現ユニットを含むDNA断片は1/10 TE溶液 (1mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH8.0)にて1〜3.3 μg/ml の濃度に調整した。C57BL/6J系統由来受精卵をミネラルオイルで覆われたM2培地のドロップ中に入れてホールディングピペットで吸引固定し、上記のDNA溶液をインジェクションピペットに吸引し、マイクロマニピュレーター(ナリシゲ社製)を用いて受精卵の雄性前核に注入した。インジェクションした受精卵を偽妊娠雌マウスに移植し、飼育した。得られた産仔のうち、離乳した154匹のマウスについて、4週齢に達した時点で、尾からDNAを採取した。取得したDNAに対して、5'-GGAGTGTGGTGCTTAATCCGCTGGT-3'(配列番号:7)および5'-AGACTGCCTCCTCCTTCCCGTAAGTACAA-3'(配列番号:8)の配列を有するプライマーセットを用いてPCRを行い、27匹のトランスジェニックマウスを取得した。
取得されたヒトGPR40遺伝子トランスジェニックマウスが8週齢以降に達した段階でC57BL/6J系統マウスと交配を行い、産仔を得て、実施例2と同様のPCR法にてトランスジェニックマウス個体を選別した。トランスジェニックマウス産仔について、8週齢の膵臓からISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて、添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA 1μgを、ランダムプライマーおよびSuperScript II 逆転写酵素(インビトロジェン社製)を用いて、first strand cDNAを合成し、エタノール沈殿後、40μlのTEに溶解した。そのうち、RNAで25 ngに相当するcDNAをTaqMan解析のテンプレートとした。プライマーとして、ヒトGPR40遺伝子の検出には、Forward primer(5'-GCCCGCTTCAGCCTCTCT-3';配列番号:9)、Reverse primer(5'-GAGGCAGCCCACGTAGCA-3';配列番号:10)、および、FAM標識TaqMan primer probe(5'-TCTGCCCTTGGCCATCACAGCCT-3';配列番号:11)のセットを用い、TaqMan解析(TaqMan7700および7700SDSソフトウェア、アプライドバイオシステムズ社製)を実施した。コピー数算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のヒトGPR40 cDNA断片をウエル当り106コピーからウエル当り101コピーの対数6点となるようにして測定したCT値から作成した。
ヒトGPR40遺伝子トランスジェニックマウス各系統の8週齢での膵臓におけるヒトGPR40遺伝子の発現を図1Bに示す。調べたほぼすべての系統でヒトGPR40遺伝子の発現が認められた。14M系、41M系、および23F系を含む複数の系統に比べて、47M系および81M系は高い発現レベルを示した。
上記14M系、41M系、47M系、81M系、および、23F系のトランスジェニックマウス5系統について、ゲノムDNAをサザンハイブリダイゼーション法により解析した。すなわち、5μgのDNAをEcoRIおよびBglIIで切断し、1.0%アガロースゲル電気泳動後、ナイロンフィルターへ移した。このフィルターを、DIG RNAラベリングキット(ロッシュ・ダイアグノスティックス社製)で標識したヒトGPR40遺伝子含有DNA断片のプローブと一晩ハイブリダイズし、2xSSC、0.1%SDSにて室温で2回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1%SDSにて68℃で2回洗浄した。検出にはDIG蛍光検出キット(ロッシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いた。その結果、これら5系統から約2.9 kbpのバンドが確認され、ヒトGPR40遺伝子の導入が確認された。また、導入遺伝子が高コピーで染色体に組み込まれた系統は14M系、47M系および81M系であり、低コピーで染色体に組み込まれた系統は23F系と41M系であることもわかった。ヒトGPR40遺伝子発現量の成績と染色体に組み込まれたコピー数の成績とはおおむね相関しており、高発現系統として47M系を、標準的な発現系として23F系を選択し、以後の解析を行った。上記マウスは、C57BL/6J系統のマウスと交雑することにより、繁殖および維持を行った。
8週齢時から、トランスジェニックマウス47M系、および、23F系を8週間低脂肪食(D12450B、10 kcal% fat、リサーチダイエット社製)または高脂肪食(D12492、60 kcal% fat、リサーチダイエット社製)にて飼育した。16週齢マウスに対して、十二指腸側を結紮し、総胆管へのカニュレーションを行い、1mg/mlコラゲナーゼ溶液(和光純薬社製)をマウス膵臓に注入した。充填された膵臓を切り出して、同コラゲナーゼ溶液中のチューブに入れて37℃ 20分間振とうした。その後、30秒間激しく混和し、10%FBSを含むQuenching buffer溶液(0.001% DNaseI、25mM HEPESを含むHanks Balanced Salt Solution)で20mlにメスアップした。溶液をシャーレに移し、Quenching buffer溶液で2回洗浄後、ラ氏島を顕微鏡下でピペットにより回収し、検体に供する試料とした。各個体から100個程度のラ氏島を単離した。
単離したラ氏島を18ゲージ針にてISOGEN中でホモジナイズし、total RNAを抽出した。次に、RNeasy Micro kit(キアゲン社製)を用いてさらに精製し、最後にDNase処理により混在するDNAを除去した。1μg以下のtotal RNAに対して、First strand cDNA synthesis kit(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用いてプロトコールに従ってcDNA合成を行い、TaqMan解析のテンプレートとした。ヒトGPR40遺伝子の検出には、実施例3に記載したプライマーセットを用いてTaqMan解析を行った。マウスGPR40遺伝子の検出にはAssay on demand (アプライドバイオシステムズ社製)を、内部標準である18SリボソームRNA遺伝子の検出にはTaqman Ribosomal RNA Control Reagents VIC Probeセット(アプライドバイオシステムズ社製)を用いた。コピー数算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のヒトGPR40 cDNA、マウスGPR40 cDNA、またはマウス18SリボソームRNA遺伝子をコードするDNA断片をウエル当り106コピーからウエル当り103コピーの対数4点となるようにして測定したCT値から作成した。
図2Aに示されるように、単離ラ氏島において、導入したヒトGPR40遺伝子は47M系および23F系共に、トランスジェニックマウスにのみ発現しており、その発現量は47Mにおいて高く、膵臓における発現レベルと相関していた(図1B参照)。また、47M系および23F系共に、低脂肪食負荷群のヒトGPR40遺伝子発現量と高脂肪食負荷群のそれとの間に有意な差はなかった。一方、マウス内在性GPR40遺伝子発現量についても、47M系および23F系共に対照マウスとトランスジェニックマウスとの間に有意な差はなく、低脂肪食負荷群におけるマウスGPR40遺伝子発現量と高脂肪食負荷群におけるそれもほぼ同じレベルであった(図2B)。また、ラ氏島におけるヒトGPR40遺伝子発現量はマウス内在性GPR40遺伝子のそれに比べて47M系で70倍、23F系で30倍程度の増大であり、作製されたトランスジェニックマウスが生理的にも十分な作用を有することが期待された。
トランスジェニックマウス47M系と23F系を、通常食(CE-2、12 kcal% fat、日本クレア社製)にて飼育した。体重測定後、眼底よりヘパリン処理済みキャピラリー(ドラモンドサイエンティフィックカンパニー社製)にて採血し、遠心分離により血漿を取得した。血漿成分についてグルコース値は富士ドライケム(富士フイルムメディカル社製)により測定し、インスリン値はモリナガインスリンELISAキット(森永生科学研究所製)により測定した。
耐糖能試験は以下のようにして実施した。即ち、絶食を開始してから16時間後のマウス眼底からヘパリン処理済みキャピラリーにて採血を行い、0分目の試料とした。次に、10%グルコース溶液を体重1kg当り1gとなるよう経口投与し、その7.5分後、15分後、30分後、60分後、および、120分後に眼底からヘパリン処理済みキャピラリーにて採血し、それぞれの時間の試料とした。これらの試料を遠心分離により、血漿成分を単離し、グルコースおよびインスリン値を上記と同様にして測定した。
16週齢時の飽食時および絶食時の体重値は47M系および23F系共に、それぞれの対照マウスとの間に差はなかった(表1)。絶食時の血漿グルコース値はトランスジェニックマウスにおいて低い傾向を示した(表1)。16週齢時の47M系および18週齢時の23F系マウスについて耐糖能試験を実施したところ、47M系および23F系共に、トランスジェニックマウスの血漿グルコース値は対照マウスのそれよりも低い値を示したのに対し、トランスジェニックマウスの血漿インスリン値は高い値を示した(図3)。以上の成績は、トランスジェニックマウスにおいては、インスリン分泌亢進に伴い、耐糖能が良好になったことを示していると考えられる。2系統のトランスジェニックマウスで同様な成績が得られたことから、以後の解析には主に47M系を用いた。
高脂肪食条件下での影響を調べるため、トランスジェニックマウス47M系について、8週齢時から9週間低脂肪食(D12450B、10 kcal% fat、リサーチダイエット社製)、45 kcal% fat含有の高脂肪食(D12451、リサーチダイエット社製)、および、60 kcal% fat含有の高脂肪食(D12492、リサーチダイエット社製)にて飼育後、17週齢時マウスに対して耐糖能試験を実施した。
図4に示されるように、対照マウスにおける耐糖能は、低脂肪食負荷群よりも45 kcal% fat含有の高脂肪食負荷群、および、60 kcal% fat含有の高脂肪食負荷群において悪化しており、高脂肪食効果が明確に現れていた。このとき、対照マウスとトランスジェニックマウス47M系とを比較すると、低脂肪食負荷群、45 kcal% fat含有の高脂肪食負荷群、および、60 kcal% fat含有高脂肪食負荷群共に、トランスジェニックマウスの耐糖能は対照マウスのそれよりも良好であることが判明した。いずれの場合もインスリン分泌はトランスジェニックマウスにおいて亢進傾向にあり、高脂肪食負荷群において顕著であった。このとき、インスリン感受性は対照マウスおよびトランスジェニックマウス間で大きな差はなかった。以上の成績は、トランスジェニックマウスではインスリン分泌亢進を伴って耐糖能が良好になったことを示していると考えられる。また、高脂肪食負荷群ではインスリン分泌亢進が顕著であることから、GPR40遺伝子に基づく結果であることが示唆された。
トランスジェニックマウス47M系由来単離ラ氏島のグルコース刺激に対するインスリン分泌を調べた。通常食で飼育した10から13週齢のマウスから、実施例4で示した方法によりラ氏島を単離した。11mM グルコース、1mM HEPES、および、10%FBSを含むRPMI1640培地 (インビトロジェン社製)で16時間培養後、1 mM グルコースおよび0.2% BSAを含むKrebs Ringer bicarbonate buffer (116 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.17 mM KH2PO4、1.17 mM MgSO4・7H2O、25 mM NaHCO3、2.52 mM CaCl2、24 mM HEPES、0.2% BSA)で30分間培養した。次に、3 mM グルコースまたは16 mM グルコースを含む Krebs Ringer bicarbonate bufferに置換して、1時間培養した。パルミチン酸添加実験の場合には、11mMグルコースを含むKrebs Ringer bicarbonate bufferにパルミチン酸を0.5 mMとなるよう添加して1時間培養した。培養後の培養上清について、モリナガインスリンELISAキット(森永生科学研究所製)によりインスリン量を測定した。一方、培養後のラ氏島はソニケーター(エムエス機器社製)により超音波破砕を行い、Quant-iTTM Picogreen ds DNA Assay kit (モレキュラープローブズ社製)によりDNA量を測定して、インスリン分泌量を補正した。
3 mMグルコース存在下でのインスリン分泌量は対照マウスと47M系において差は認められなかった(図5A)。それに対して、16 mMグルコース存在下においては、47M系のインスリン分泌量は、対照マウスのそれよりも高かった(図5A)。また、GPR40のリガンドのひとつであるパルミチン酸の添加実験において、対照マウスのパルミチン酸添加群のインスリン分泌量は、無添加群のそれよりも1.5倍程度の上昇であったのに対し、トランスジェニックマウスにおいては6倍程度の上昇を示した(図5B)。以上の成績から、トランスジェニックマウス由来ラ氏島における高濃度グルコース刺激時のインスリン分泌量は、対照マウスのそれよりも亢進していること、および、パルミチン酸に対する反応性も対照マウスに比べて高いことが判明した。いずれも、GPR40遺伝子高発現に起因していることが示唆される。
GPR40遺伝子ターゲッティングベクターは特許文献3の実施例21に記載済みである。また、該ベクターで形質転換した大腸菌、Escherichia coli DH5α/pGT-GPR40は、2002年12月11日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8259として寄託されている。
制限酵素NotIで線状化したGPR40遺伝子ターゲッティングベクター20μgをES 細胞 (AB2.2 prime、レキシコン社製)に electroporationにより導入した。選択された G418耐性株 384 クローンについて、PCRにより相同組換え体候補株を選別した。即ち、Primer #1、および、#2 (#1 5'-CAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCA-3'(配列番号:12)はターゲッティングベクター中の Neor 内の配列、#2 5'-GCAGGTCCGAAATGGTCAGGTTTAGCA-3'(配列番号:13)はターゲッティングベクターの3’側アームの外側の配列)、および、LA Taq polymerase (宝酒造社製)を用いて、94℃ 1 min →(98℃ 10sec→70℃ 5min30sec)×35 回→ 72℃ 10 min のPCRを行った。その結果、陽性 7クローンおよび擬陽性 12 クローンの計 19クローンについて、約 5.1kbp のバンドを得た。このうち、陽性 7クローンを含む 10クローンについて、再度、同条件でPCRを行ったところ、No.85, 231, 247, 325, 373, 374、および 391 の 7 クローンが陽性であった。
次に、GPR40遺伝子座への相同組換えの有無を調べるため、サザンハイブリダイゼーションを行った。即ち、ターゲッティングベクターの 3’側アームの外側に存在する1.2kbpの SacI-EcoRI 断片をプローブとして、ES 細胞の DNA を EcoRI 消化した後、サザンハイブリダイゼーションを行った。これにより、wild allele からは 9.7Kbp の、targeted allele からは 4.6kbp のバンドが得られる。また、ターゲッティングベクターの 5’側アームの外側に存在する0.9kbpの SacI-BamHI 断片をプローブとして、ES 細胞の DNA を SacI 消化した後、サザンハイブリダイゼーションを行った。これにより、wild allele からは 14.2Kbpのバンドが得られ、targeted allele からは 17.4kbp のバンドが得られる。
先のPCR判定で陽性であった 7 クローン を含む 9 クローン についてサザンハイブリダイゼーションを実施した。3’側アームについては以下のように行った。それぞれの クローン の DNA と マウスゲノムDNA 2μg をEcoRIで消化した後、0.4% TAEアガロースゲルにて電気泳動を行い、ナイロンフィルターにブロッティングした。3’側アームの外側のEcoRI-SacI 1.2kbp DNA 断片を [α-32P] dCTP(NEG513Z, デュポン社製)を用いてランダムプライム法(Multiprime DNA labeling system RPN.1601Y, アマシャムファルマシアバイオテク社製)によりラベルして、プローブとした。ハイブリダイゼーションはhybridization buffer (0.5M Na+- phosphatebuffer pH.7.2, 7% SDS, 1%BSA, 1mM EDTA)中で 65℃、一晩行った。洗浄は最終的に 0.1×SSC, 0.1% SDS で 20min×2回 洗浄し、 BAS2000(富士フィルム社製)を用いてオートラジオグラムをとった。5’側アームについては、それぞれの クローン の DNA と マウスゲノムDNA 2μg をSacIで消化し、5’側アームの外側のSacI-BamHI 0.9kbp DNA 断片をプローブとして、先と同様にサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、3’側アーム領域で相同組換えが起こった際に観察される 4.6kbp のバンド、および、5’側アーム領域で相同組換えが起こった際に観察される 17.4kbp のバンドの両方が得られたNo.85,231,247,325,373,および、374 の6クローンが相同組換え体の候補株となった。しかしながら、17.4kbp のバンドが各クローンによってヘテロであったため、この領域についてさらに解析した。
ターゲッティングベクターが相同組換え領域以外の染色体上に挿入されていないか、また相同組換え部位にタンデムに挿入されていないか、などを確認するために、5’側アームの外側領域のサザンハイブリダイゼーション解析に用いたメンブレンフィルターをリプローブした後、ターゲッティングベクター内の Neor 領域に相当する1.9kbp のBamHI-EcoRI断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。このとき、相同組換え体が正しく1 コピー挿入された場合には、17.4kbp のバンドが検出される。No.247, 373, および、374 クローンについては複数のバンドが観察されたことから、ターゲッティングベクターが非相同組換えによりゲノム上に挿入されている可能性が考えられた。また、No. 85 クローンについては、バンドは1本のみ得られたが、他のクローンと比較してバンドが濃いことから、相同組換え領域にタンデムに組み込まれた可能性が示唆された。最終的に、17.4kbp のバンド 1本のみが得られたNo. 231および 325 の 2クローンを相同組換え体と判定した。
相同組換えES細胞株No.231をC57BL/6J系統マウス由来胚盤胞に注入した。注入された胚盤胞を偽妊娠マウス卵管に移植して、キメラマウス31匹を得た。ES細胞寄与率50%以上の雄の高キメラ率を示すマウスについて交配を実施し、106 匹のES細胞由来マウスを取得することにより、生殖系列移行を確認した。これらのマウス尾からゲノム DNA を精製し、実施例8に記載したプライマー#1および#2を用いたPCRによる遺伝子型判定を行ったところ、48個体がヘテロ欠損マウスであることが判明した。次に、ヘテロ欠損マウス同士を交配することにより、得られた産仔の遺伝子型判定を以下のようにして行った。尾から調製したDNAを鋳型として、実施例8に記載したプライマー#1およびプライマー#2を用いて、94℃ 1 min →(98℃ 10sec→70℃5min30sec)×25回→ 72℃ 10 minの条件にてPCRを行った。ワイルドマウスの検体からはバンドが検出されず、ヘテロ欠損マウスおよびホモ欠損マウスの検体からは約5.1 kbpのバンドが検出される。同様に、プライマー#3(5'-GCCCGCCCTGCCCGTCTCA-3'(配列番号:14)はマウスGPR40遺伝子の欠損した部分内の配列)およびプライマー#4(5'-AACGTTCGATGCTCACCGCCGTCA-3'(配列番号:15)はターゲッティングベクターの3’側アームの外側の配列)を用いて、94℃ 1 min → (98℃ 10sec → 70℃5min30sec)×30回→ 72℃ 10 min の条件にてPCRを行った。ホモ欠損マウスの検体からはバンドが検出されず、ワイルドマウスおよびヘテロ欠損マウスの検体からは約5.4 kbpのバンドが検出される。上記のようにしてワイルドマウス、ヘテロ欠損マウス、および、ホモ欠損マウスを取得した。以後はホモ欠損マウス同士の交配により維持および繁殖を行い、対照マウスはワイルドマウス同士の交配により維持および繁殖を行い、実験に供した。
GPR40遺伝子ホモ欠損マウス、GPR40遺伝子へテロ欠損マウス、および、対照マウスについて、8週齢の膵臓からISOGENを用いて、添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA 1μgを、ランダムプライマーおよびSuperScript II 逆転写酵素を用いて、添付のプロトコールに従ってfirst strand cDNAを合成し、エタノール沈殿後、40μlのTEに溶解した。そのうち、RNAで25 ngに相当するcDNAをテンプレートとして、TaqMan解析を実施した。マウスGPR40遺伝子の検出には、Forward primer(5'-TTTGCGCTGGGCTTTCC -3';配列番号:16)、Reverse primer(5'-GCTGGGAGTGAGTCGCAGTT -3';配列番号:17)、およびFAM標識TaqMan primer probe(5'-CCATCCGAGGCGCAGTGTCCC -3';配列番号:18)のプライマーセットを用い、アクチン遺伝子の検出には、Forward primer(5'-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA -3';配列番号:19)、Reverse primer(5'-CACAGCCTGGATGGCTACGT -3';配列番号:20)、およびFAM標識TaqMan primer probe(5'-TGAGACCTTCAACACCCCAGCCATG -3';配列番号:21)のプライマーセットを用いた。コピー数の算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のマウスGPR40遺伝子含有プラスミドDNA、またはマウスアクチン遺伝子の一部の合成DNA断片 (シグマジェノシス社製、5'-CCAACCGTGAAAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGCTGTC-3';配列番号:22)をウエル当り106コピーからウエル当り101コピーの対数6点となるようにして測定したCT値から作成した。マウスGPR40遺伝子の発現レベルは、アクチン遺伝子の発現レベルに対する比で表した。
図6に示されるように対照マウスの膵臓においては、マウスGPR40遺伝子発現レベルが明確であったのに対し、GPR40遺伝子へテロ欠損マウス膵臓の発現レベルは対照マウスのそれの約半分に低下しており、さらに、GPR40遺伝子ホモ欠損マウス膵臓での発現は消失していた。上記の成績から、これらマウスの発現レベルは、マウスGPR40遺伝子量と相関していることが判明し、取得されたGPR40遺伝子ホモ欠損マウスは、GPR40遺伝子欠損に伴う表現型が観察されることが期待された。
次に、上記のヘテロ欠損マウスまたはホモ欠損マウスをC57BL/6Jマウスと交配することにより、ヘテロ欠損マウスを取得した(第一世代目)。この交配を5回繰り返して得たヘテロ欠損マウス(第五世代目)同士を交配して、対照マウスおよびホモ欠損マウスを取得した。以後はヘテロ欠損マウス同士の交配、または、対照マウス同士またはホモ欠損マウス同士の交配により、維持繁殖を行ない、実験に供した。
GPR40遺伝子ホモ欠損マウスについて、8週齢時から、8週間低脂肪食(D12450B、10 kcal% fat、リサーチダイエット社製)または高脂肪食(D12492、60 kcal% fat、リサーチダイエット社製)にて飼育した。脂肪食負荷開始後から、体重測定を毎週実施し、場合により血液パラメーターを測定した。即ち、眼底よりヘパリン処理済みキャピラリーにて採血を行い、遠心分離により血漿成分を取得し、実施例5に記載した方法により、血漿グルコース値および血漿インスリン値を測定した。1日当りのカロリー摂取量は以下のようにして測定した。測定開始前日に給餌金網上の餌の重量を測定し、次の日に再度金網上の餌の重量とケージ中に散在した餌の重量を測定することにより摂取した餌の重量を求め、各餌のカロリー量を乗じることにより、1日当りのカロリー摂取量を算出した。
低脂肪食負荷群および高脂肪食負荷群共に、GPR40遺伝子ホモ欠損マウスの体重値は、対照マウスのそれと同等であり(図7AとE)、カロリー摂取量も、対照マウスのそれと差はなかった(図7BとF)。血漿グルコース値および血漿インスリン値は共に、低脂肪食負荷群においても高脂肪食負荷群においても対照マウスとホモ欠損マウスとの間に有意な差は認められなかった(図7CとDとGとH)。以上のことからGPR40遺伝子ホモ欠損マウスの体重、カロリー摂取量、血漿グルコース値、および、血漿インスリン値は対照マウスと大きな差がないと考えられた。
GPR40遺伝子ホモ欠損マウスについて、8週齢から11週間低脂肪食(D12450B、10 kcal% fat、リサーチダイエット社製)または高脂肪食(D12492、60 kcal% fat、リサーチダイエット社製)にて飼育した。19週齢時マウスに対して実施例5と同様に、耐糖能試験を実施した。
低脂肪食群および高脂肪食群共に、耐糖能は対照マウスとホモ欠損マウスとの間で大きな差はなかった。上記の成績から、GPR40遺伝子欠損は耐糖能に影響を及ぼさないと考えられた。
ヒトGPR40遺伝子のみを発現するマウスを作製するため以下のことを行った。即ち、実施例3で取得されたヒトGPR40遺伝子トランスジェニックマウス47M系と実施例9で取得されたGPR40遺伝子ホモ欠損マウスとを交雑することにより、ヒトGPR40遺伝子を保持し、かつ、マウスGPR40遺伝子欠損がヘテロ接合体を示す個体を取得した。上記で得られた雄のトランスジェニックマウスに対しては、雌のGPR40遺伝子ホモ欠損マウスを、雌のトランスジェニックマウスに対しては雄のGPR40遺伝子ホモ欠損マウスを交雑して、ヒトGPR40遺伝子を保持し、かつ、マウスGPR40遺伝子欠損がホモ接合体である交雑マウス(47M TgxKO)を取得した。このとき、GPR40遺伝子欠損がホモ接合体でヒトGPR40遺伝子を持たない対照マウス(NonTgxKO)も同時に取得された。以後は、47M TgxKOとNonTgxKOとを交雑して得たマウスに対してヒトGPR40遺伝子の有無を判定することにより、47M TgxKOおよびNonTgxKOを選別した。ヒトGPR40遺伝子トランスジェニックマウス23F系についても、上記と同様にして、ヒトGPR40遺伝子を保持し、かつマウスGPR40遺伝子欠損がホモ接合体となる交雑マウス(23F TgxKO)とその対照マウス(NonTgxKO)を作製した。47M TgxKOと23F TgxKOマウスはマウスGPR40遺伝子発現が消失し、ヒトGPR40遺伝子のみを発現している性質を有するマウスであると考えられる。
GPR40遺伝子高発現が高血糖および肥満を呈するKKAyマウスに及ぼす影響を調べるため、KKAyマウスの遺伝背景を有するヒトGPR40遺伝子トランスジェニックマウスを作製した。即ち、実施例3で取得されたヒトGPR40遺伝子トランスジェニックマウス47M系とKKAyマウスとを交雑することにより、ヒトGPR40遺伝子を保持し、かつ、毛色からAy遺伝子を有するマウス(47M Tg/KKAy)を取得した。このとき、ヒトGPR40遺伝子を保持するが、Ay遺伝子を有さないマウス(47M Tg/KK)の取得も行った。同様にして、23F Tg/KKAy、および23F Tg/KKも作製した。いずれの場合もNonTg/KKAyおよびNonTg/KKをそれぞれの対照マウスとした。
本出願は、日本国で出願された特願2006-022913を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
Claims (12)
- インスリンIIプロモーターの制御下にある外来性GPR40をコードするDNAを発現可能な状態で保持するトランスジェニックマウスであって、対応する非トランスジェニックマウスと比較して
(1)インスリン分泌能が増大している、および/または
(2)耐糖能が改善されている
ことを特徴とするマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島。 - 外来性GPR40が配列番号:2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項1記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島。
- 請求項1記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島に試験化合物を適用し、GPR40アゴニスト活性またはGPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴とするGPR40アゴニストまたはGPR40アンタゴニストのスクリーニング方法。
- 請求項1記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島に試験化合物を適用し、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能を測定することを特徴とする、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法。
- 外来性GPR40がマウスにとって異種であり、かつ内在性GPR40遺伝子発現不全である請求項1記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島。
- 異種GPR40がヒト由来である請求項5記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島。
- 請求項5記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島に試験化合物を適用し、GPR40アゴニスト活性またはGPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種GPR40アゴニストまたは異種GPR40アンタゴニストのスクリーニング方法。
- 請求項5記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島に試験化合物を適用し、(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能を測定することを特徴とする、異種哺乳動物における(1)インスリン分泌および/または(2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法。
- 請求項1記載のマウスと他の病態モデルマウスとの交配によって生じる病態モデルマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島。
- 請求項1記載のマウスに対する薬剤誘発またはストレス負荷によって生じる病態モデルマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島。
- 請求項9または10記載のマウスまたはそのマウス由来の単離ラ氏島に試験化合物を適用し、病態の改善を検定することを特徴とする該病態を伴う疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法。
- 病態もしくは疾患が、代謝性症候群またはその1以上の症候である請求項11記載の方法。
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