JP2004275001A - 新規スクリーニング方法 - Google Patents

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亮 藤井
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和宏 大儀
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Abstract

【課題】アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法の提供。
【解決手段】（１）特定の配列で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩および（２）脂肪酸またはエイコサノイドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラット、マウス、サルおよびハムスター由来の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＲ４０）またはその塩、当該ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡおよびそれらの用途、およびヒト由来ＧＰＲ４０を含むＧＰＲ４０の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプター蛋白質は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
ヒト由来のＧＰＲ４０のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている（特許文献１および非特許文献２）。
また、ヒト由来のＧＰＲ４０のリガンドが脂肪酸であることが報告されている（特許文献２）。
【０００４】
【特許文献１】
ＷＯ２０００−２２１２９号
【０００５】
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７，Ｏｃｔ ２０；２３９（２）：５４３−５４７
【０００６】
ＷＯ０２／０５７７８３号
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプター蛋白質の特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標的ともなりうるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を新規に見出し、その遺伝子（例えばｃＤＮＡ）をクローニングすることは、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドや、アゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質はその全てが見出されているわけではなく、現時点でもなお、未知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプター蛋白質が多数存在しており、新たなＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の探索および機能解明が切望されている。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガンドが見出されなくても、該レセプター蛋白質の不活化実験（ノックアウト動物）から該レセプター蛋白質の生理作用を解析することにより、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することも可能である。これら該レセプター蛋白質に対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防／治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の遺伝子変異に基づく、生体での該レセプター蛋白質の機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプター蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプター蛋白質の塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプター蛋白質の遺伝子は、該レセプター蛋白質の機能不全に関与する疾患の予防／治療薬や診断薬に応用することもできる。
本発明は、上記のように有用な新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を提供するものである。すなわち、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体）を含有するポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体）、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを保持する形質転換体、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、リガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩、およびリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）もしくは該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒトＧＰＲ４０のリガンドが脂肪酸またはエイコサノイドであることを見出した。さらに、ラット、マウスおよびハムスター由来のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡをクローニングすることに成功した。さらに、ＧＰＲ４０が膵臓ランゲルハンス島で高発現していること、脂肪酸またはエイコサノイドがＧＰＲ４０に結合することにより細胞内Ｃａ２＋濃度上昇およびｃＡＭＰ生成抑制が起こること、遊離脂肪酸がＭＩＮ６細胞からのインスリン分泌を促進することを見出した。さらに、ヒトＧＰＲ４０のＣ端ペプチドに対するモノクローナル抗体およびマウスＧＰＲ４０に対するｓｉＲＮＡを取得した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（２）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（３）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（４）配列番号：１７で表されるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（５）配列番号：２９で表されるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩、
（６）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
（７）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（８）上記（３）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ、
（９）上記（４）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ、
（１０）上記（５）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ、
（１１）配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（１２）配列番号：１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（１３）配列番号：３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（１４）上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１５）上記（１４）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（１６）上記（１５）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を生成せしめることを特徴とする上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法、
（１７）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１８）上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１９）上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（２０）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２１）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のＣ末端ペプチドまたはその塩を認識するモノクローナル抗体である上記（２０）記載の抗体、
（２２）配列番号：３３で表わされるペプチドまたはその塩を認識するモノクローナル抗体である上記（２０）記載の抗体、
（２３）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記（２０）記載の抗体、
（２４）上記（２０）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（２５）上記（２０）記載の抗体を含有してなる医薬、
（２６）上記（７）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（２７）上記（２６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（２８）上記（２６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（２９）上記（７）記載のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
（３０）配列番号：３４で表わされる塩基配列からなるセンス鎖と配列番号：３５で表わされる塩基配列からなるアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡである上記（２９）記載のｓｉＲＮＡ、
（３１）配列番号：３６で表わされる塩基配列からなるセンス鎖と配列番号：３７で表わされる塩基配列からなるアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡである上記（２９）記載のｓｉＲＮＡ、
（３２）上記（２９）記載のｓｉＲＮＡを含有してなる診断薬、
（３３）上記（２９）記載のｓｉＲＮＡを含有してなる医薬、
（３４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤、
（３５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤、
（３６）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤、
（３７）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる膵β細胞保護剤、
（３８）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膵臓機能調節剤、
（３９）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤、
（４０）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤、
（４１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膵β細胞保護剤、
（４２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、高脂血症、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性または癌の診断薬、
（４３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、高脂血症、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性または癌の診断薬、
（４４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる膵臓機能調節剤、
（４５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤、
（４６）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる膵臓機能調節剤、
（４７）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤、
（４８）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）脂肪酸またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（４９）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）脂肪酸またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５０）上記（４８）記載のスクリーニング方法または上記（４９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、脂肪酸またはその塩と配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（５１）アゴニストである上記（５０）記載の化合物またはその塩、
（５２）アンタゴニストである上記（５０）記載の化合物またはその塩、
（５３）上記（５０）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（５４）脂肪酸またはその塩と配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤、
（５５）上記（５１）記載のアゴニストを含有してなる医薬、
（５６）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤、
（５７）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤、
（５８）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる膵β細胞保護剤、
（５９）上記（５２）記載のアンタゴニストを含有してなる医薬、
（６０）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤、
（６１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（６２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（６３）上記（６１）記載のスクリーニング方法または上記（６２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩、
（６４）上記（６１）記載のスクリーニング方法または上記（６２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩、
（６５）上記（６１）記載のスクリーニング方法または上記（６２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩、
（６６）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤、
（６７）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤、
（６８）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤、
（６９）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる膵β細胞保護剤、
（７０）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤、
（７１）試験化合物を配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ抑制活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
（７２）上記（７１）記載の決定方法で得られるリガンド、
（７３）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
（７４）（１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記（７３）記載のスクリーニング方法、
（７５）（１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする上記（７３）記載のスクリーニング方法、
（７６）（１）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする上記（７３）記載のスクリーニング方法、
（７７）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
（７８）上記（７３）記載のスクリーニング方法または上記（７７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、
（７９）上記（７３）記載のスクリーニング方法または上記（７７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、
（８０）上記（７８）記載のアゴニストを含有してなる医薬、
（８１）上記（７９）記載のアンタゴニストを含有してなる医薬、
（８２）試験化合物が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物である上記（７４）〜（７６）記載のスクリーニング方法、
（８３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
（８４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、▲１▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲２▼インスリン分泌促進薬、▲３▼血糖低下薬または▲４▼膵β細胞保護が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
（８５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（８６）各薬を該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、各薬と該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記（８３）〜（８５）記載の確認方法、
（８７）（１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（２）各薬および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記（８３）〜（８５）記載の確認方法、
（８８）（１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）各薬および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする上記（８３）〜（８５）記載の確認方法、
（８９）（１）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）各薬および▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする上記（８３）〜（８５）記載の確認方法、
（９０）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認するためのキット、
（９１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストである、▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬、
（９２）（１）▲１▼配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、または（および）▲２▼配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩、と
（２）▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬、とを組み合わせてなる医薬、
（９３）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする外来性のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（９４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（９３）記載の動物、
（９５）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（９４）記載の動物、
（９６）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（９７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（９６）記載の胚幹細胞、
（９８）ネオマイシン耐性である上記（９６）記載の胚幹細胞、
（９９）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（９６）記載の胚幹細胞、
（１００）ゲッ歯動物がマウスである上記（９９）記載の胚幹細胞、
（１０１）上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１０２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が該ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１０１）記載の非ヒト哺乳動物、
（１０３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１０１）記載の非ヒト哺乳動物、
（１０４）ゲッ歯動物がマウスである上記（１０３）記載の非ヒト哺乳動物、
（１０５）上記（１０２）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（１）記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１０６）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）エイコサノイドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１０７）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）エイコサノイドを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１０８）上記（１０６）記載のスクリーニング方法または上記（１０７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、エイコサノイドと配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（１０９）アゴニストである上記（１０８）記載の化合物またはその塩、
（１１０）アンタゴニストである上記（１０８）記載の化合物またはその塩、
（１１１）上記（１０８）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１１２）エイコサノイドと配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤、
（１１３）上記（１０９）記載のアゴニストを含有してなる医薬、
（１１４）上記（１１０）記載のアンタゴニストを含有してなる医薬、
（１１５）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
（１１６）（１）▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記（１１５）記載のスクリーニング方法、
（１１７）（１）▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする上記（１１５）記載のスクリーニング方法、
（１１８）（１）▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする上記（１１５）記載のスクリーニング方法、
（１１９）（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
（１２０）上記（１１５）記載のスクリーニング方法または上記（１１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、
（１２１）上記（１１５）記載のスクリーニング方法または上記（１１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、
（１２２）上記（１２０）記載のアゴニストを含有してなる医薬、
（１２３）上記（１２１）記載のアンタゴニストを含有してなる医薬、
（１２４）試験化合物が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物である上記（１１６）〜（１１８）記載のスクリーニング方法、
（１２５）哺乳動物に対して、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膵臓機能調節方法、
（１２６）哺乳動物に対して、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療方法、
（１２７）哺乳動物に対して、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするインスリン分泌促進方法または血糖低下方法、
（１２８）哺乳動物に対して、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膵β細胞保護剤、
（１２９）哺乳動物に対して、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
（５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膵臓機能調節方法、
（１３０）哺乳動物に対して、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
（５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療方法、
（１３１）膵臓機能調節剤を製造するための、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
（１３２）糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤を製造するための、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
（１３３）インスリン分泌促進剤または血糖低下剤を製造するための、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
（１３４）膵β細胞保護剤を製造するための、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
（１３５）膵臓機能調節剤を製造するための、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
（５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用、および
（１３６）肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤を製造するための、
（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
（５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用などを提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、
（１３７）蛋白質が、ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記（１）記載の蛋白質、
（１３８）（ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、ＧＰＲ４０と略記する）、その部分ペプチドまたはその塩と、脂肪酸またはその塩とを接触させた場合と、（ｉｉ）ＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩と、脂肪酸またはその塩および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記（４８）記載のスクリーニング方法、
（１３９）（ｉ）標識した脂肪酸またはその塩をＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｉｉ）標識した脂肪酸またはその塩および試験化合物をＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、標識した脂肪酸またはその塩のＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（４８）記載のスクリーニング方法、
（１４０）（ｉ）標識した脂肪酸またはその塩をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）標識した脂肪酸またはその塩および試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における、標識した脂肪酸またはその塩の該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（４８）記載のスクリーニング方法、
（１４１）（ｉ）標識した脂肪酸またはその塩をＧＰＲ４０を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）標識した脂肪酸またはその塩および試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した脂肪酸またはその塩の該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（４８）記載のスクリーニング方法、
（１４２）（ｉ）標識した脂肪酸またはその塩を、ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合と、（ｉｉ）標識した脂肪酸またはその塩および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合における、標識した脂肪酸またはその塩のＧＰＲ４０に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（４８）記載のスクリーニング方法、
（１４３）（ｉ）ＧＰＲ４０を活性化する化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）ＧＰＲ４０を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記（４８）記載のスクリーニング方法、
（１４４）ＧＰＲ４０を活性化する化合物を、ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合と、ＧＰＲ４０を活性化する化合物および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合における、ＧＰＲ４０を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記（４８）記載のスクリーニング方法、
（１４５）ＧＰＲ４０を活性化する化合物が脂肪酸またはその塩である上記（１４３）または（１４４）記載のスクリーニング方法、
（１４６）ＧＰＲ４０を含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記（４９）記載のスクリーニング用キット、
（１４７）ＧＲＰ４０をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０を含有することを特徴とする上記（４９）記載のスクリーニング用キット、
（１４８）（ｉ）ＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩と、エイコサノイドとを接触させた場合と、（ｉｉ）ＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩と、エイコサノイドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記（１０６）記載のスクリーニング方法、
（１４９）（ｉ）標識したエイコサノイドをＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したエイコサノイドおよび試験化合物をＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、標識したエイコサノイドのＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（１０６）記載のスクリーニング方法、
（１５０）（ｉ）標識したエイコサノイドをＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したエイコサノイドおよび試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における、標識したエイコサノイドの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（１０６）記載のスクリーニング方法、
（１５１）（ｉ）標識したエイコサノイドをＧＰＲ４０を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したエイコサノイドおよび試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したエイコサノイドの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（１０６）記載のスクリーニング方法、
（１５２）（ｉ）標識したエイコサノイドを、ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したエイコサノイドおよび試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合における、標識したエイコサノイドのＧＰＲ４０に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記（１０６）記載のスクリーニング方法、
（１５３）（ｉ）ＧＰＲ４０を活性化する化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）ＧＰＲ４０を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記（１０６）記載のスクリーニング方法、
（１５４）ＧＰＲ４０を活性化する化合物を、ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合と、ＧＰＲ４０を活性化する化合物および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合における、ＧＰＲ４０を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記（１０６）記載のスクリーニング方法、
（１５５）ＧＰＲ４０を活性化する化合物がエイコサノイドである上記（１５３）または（１５４）記載のスクリーニング方法、
（１５６）ＧＰＲ４０を含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記（１０７）記載のスクリーニング用キット、および
（１５７）ＧＲＰ４０をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ４０を含有することを特徴とする上記（１０７）記載のスクリーニング用キットなどを提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＲＰ４０）は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
ＧＰＲ４０は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、膵臓ランゲルハンス島、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。特に、ＧＰＲ４０は膵臓ランゲルハンス島に高発現している。
【００１２】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、ＧＰＲ４０としては、ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
【００１３】
本明細書におけるＧＰＲ４０は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するＧＰＲ４０をはじめとするＧＰＲ４０は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＧＰＲ４０がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のＧＰＲ４０に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＧＰＲ４０には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明のＧＰＲ４０の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス由来ＧＰＲ４０、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するラット由来ＧＰＲ４０、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト由来ＧＰＲ４０、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するカニクイザル由来ＧＰＲ４０、配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列を含有するハムスター由来ＧＰＲ４０などが用いられる。このうちマウス由来ＧＰＲ４０、ラット由来ＧＰＲ４０、カニクイザル由来ＧＰＲ４０およびハムスター由来ＧＰＲ４０は新規な蛋白質である。ヒト由来ＧＰＲ４０は、ＷＯ２０００−２２１２９、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７，Ｏｃｔ ２０；２３９（２）：５４３−５４７に記載されている公知の蛋白質である。
【００１４】
ＧＰＲ４０の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記したＧＰＲ４０の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＧＰＲ４０の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列を有するＧＰＲ４０の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＧＰＲ４０と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のＧＰＲ４０またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のＧＰＲ４０またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１５】
本発明のＧＰＲ４０もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１６】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００１７】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１８】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１９】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００２０】
本発明のＧＰＲ４０の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のＧＰＲ４０を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のＧＰＲ４０を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および Ｍ．Ａ． Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド シンセシス （Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６６年）
ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６５年）
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （１９７５年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 １、 蛋白質の化学ＩＶ、 ２０５、（１９７７年）
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第１４巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２１】
本発明のＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のＧＰＲ４０をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のＧＰＲ４０をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のＧＰＲ４０のｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列からなるＧＰＲ４０と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するマウスＧＰＲ４０をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するマウスＧＰＲ４０をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するマウスＧＰＲ４０をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するカニクイザルＧＰＲ４０をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列を含有するハムスターＧＰＲ４０をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】
本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ＧＰＲ遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＧＰＲ４０をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＧＰＲ４０遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＧＰＲ４０関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧＰＲ４０遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＧＰＲ関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＧＰＲ関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＧＰＲ４０遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。ＧＰＲ４０遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ＧＰＲ４０遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２４】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２５】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば Ｊ． Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ， Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．２４７， １９９２； Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．３９５， １９９２； Ｓ． Ｔ． Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３ などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡは、ＧＰＲ４０をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡである。具体的には、配列番号：３４で表わされる塩基配列からなるセンス鎖と配列番号：３５で表わされる塩基配列からなるアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡ、配列番号：３６で表わされる塩基配列からなるセンス鎖と配列番号：３７で表わされる塩基配列からなるアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡ（図２２）などが用いられる。
ｓｉＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ， ４１１巻， ４９４頁， ２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
ＧＰＲ４０をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ７巻， ２２１頁， ２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部をＧＰＲ４０をコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。ＧＰＲ４０をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。
【００２６】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列からなるＧＰＲ４０と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１８または配列番号：３０で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２７】
本発明のＧＰＲ４０またはその部分ペプチド（以下、本発明のＧＰＲ４０と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のＧＰＲ４０の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のＧＰＲ４０の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２８】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＧＰＲ４０をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のＧＰＲ４０の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２９】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３０】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３１】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００３２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ 細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ， Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３， ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３３】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）， ６， ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３４】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ． Ａ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３５】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ， Ｔ．Ｃ．Ｃ．， ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）， １９５， ７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のＧＰＲ４０を生成せしめることができる。
【００３６】
上記培養物から本発明のＧＰＲ４０を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のＧＰＲ４０を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＧＰＲ４０の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＧＰＲ４０が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＧＰＲ４０の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３７】
かくして得られるＧＰＲ４０が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＧＰＲ４０を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のＧＰＲ４０の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３８】
本発明のＧＰＲ４０に対する抗体は、本発明のＧＰＲ４０を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のＧＰＲ４０に対する抗体は、本発明のＧＰＲ４０を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３９】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のＧＰＲ４０は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプター蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター蛋白質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４１】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４２】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＧＰＲ４０抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のＧＰＲ４０に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
具体的には、本発明のＧＰＲ４０に対する抗体としては、例えば、本発明のＧＰＲ４０のＣ末端ペプチドまたはその塩を認識する抗体（特に、モノクローナル抗体）などが好ましい。より具体的には、ヒトＧＰＲ４０のＣ末端ペプチドである配列番号：３３で表わされるペプチドまたはその塩を認識するモノクローナル抗体などが用いられる。
【００４３】
本発明のＧＰＲ４０のリガンドの１つは脂肪酸またはその塩であり、例えば、食物中や生体内に存在する不飽和脂肪酸や飽和脂肪酸またはそれらの塩が用いられる。なかでも、炭素数が約１０〜３０個の不飽和脂肪酸や飽和脂肪酸またはそれらの塩が好ましく用いられる。具体的には、ファルネシン酸（ｆａｒｎｅｓｏｉｃ ａｃｉｄ）、５．８．１１−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ、５．８．１１．１４−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、α−リノレン酸（α−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、γ−リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＥＰＡ）、エイコサジエン酸（ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサトリエン酸（ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＤＨＡ）、ドコサトリエン酸（ｄｏｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アドレン酸（ａｄｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、またはその塩などが用いられる。
脂肪酸の塩としては、酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、ナトリム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウムなどのアルカリ土類金属）などとの塩が用いられ、とりわけ塩基が好ましい。
以下、本願明細書では、脂肪酸またはその塩を単に「脂肪酸」と略記する。
さらに、本発明のＧＰＲ４０のリガンドの１つはエイコサノイドであり、例えば、（±）１４，１５−ジハイドロキシ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）１４，１５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １４，１５−ＤＨＴ）、（±）５（６）−エポキシ−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）５（６）−ｅｐｏｘｙ−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ５，６−ＥＥＴ）、（±）８（９）−エポキシ−５Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）８（９）−ｅｐｏｘｙ−５Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ８，９−ＥＥＴ）、（±）１１（１２）−エポキシ−５Ｚ，８Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）１１（１２）−ｅｐｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １１，１２−ＥＥＴ）、（±）１４（１５）−エポキシ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）１４（１５）−ｅｐｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １４，１５−ＥＥＴ）などが用いられる。
また、本発明のＧＰＲ４０は、特に膵臓ランゲルハンス島で高発現している。
したがって、本発明のＧＲＰ４０、ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、ＧＰＲ４０に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ（以下、本発明のｓｉＲＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。
【００４４】
（１）本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
ａ）本発明のＧＰＲ４０またはｂ）ＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを、本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内において本発明のＧＰＲ４０が減少しているために、リガンドである脂肪酸またはエイコサノイドの生理作用が期待できない（ＧＰＲ４０の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）本発明のＧＰＲ４０を該患者に投与し該ＧＰＲ４０の量を補充したり、ｂ）（イ）本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＧＰＲ４０の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌促進剤、血糖低下剤、膵β細胞保護剤などとして有用である。
具体的には、本発明のＧＰＲ４０または本発明のＤＮＡは、例えば、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などの予防・治療剤として使用することができる。糖尿病には、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病などが含まれる。
本発明のＧＰＲ４０を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）本発明のＧＰＲ４０またはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）本発明のＧＰＲ４０またはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００４５】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００４６】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のＧＰＲ４０の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡおよびｓｉＲＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のＧＰＲ４０またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のＧＰＲ４０の発現低下が検出された場合は、例えば、本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のＧＰＲ４０の発現過多が検出された場合は、例えば、本発明のＧＰＲ４０の過剰発現に起因する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患としては、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられる。糖尿病には、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病などが含まれる。
本発明のＧＰＲ４０の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などが挙げられる。
【００４８】
（３）本発明のＧＰＲ４０の発現量を変化させる化合物を含有する医薬
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、本発明のＧＰＲ４０の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれる本発明のＧＰＲ４０のｍＲＮＡ量を測定することによる、本発明のＧＰＲ４０の発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＧＰＲ４０のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のＧＰＲ４０のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ｉｉ）本発明のＧＰＲ４０を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明のＧＰＲ４０のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００４９】
本発明のＧＰＲ４０の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれる本発明のＧＰＲ４０のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれる本発明のＧＰＲ４０のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のＧＰＲ４０の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）本発明のＧＰＲ４０の発現量を増加させることにより、ＧＰＲ４０を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を増強させる化合物、（ロ）本発明のＧＰＲ４０の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のＧＰＲ４０のリガンドは、上記のとおり脂肪酸またはエイコサノイドである。したがって、上記スクリーニング方法で得られる本発明のＧＰＲ４０の発現量を変化させる化合物は、本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。
具体的には、本発明のＧＰＲ４０の発現量を増加させ、細胞刺激活性を増強させる化合物は、本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌促進剤、血糖低下剤、膵β細胞保護剤として有用である。
本発明のＧＰＲ４０の発現量を減少させ、細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本発明のＧＰＲ４０の発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤として有用である。
本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患としては、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられる。糖尿病には、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病などが含まれる。
本発明のＧＰＲ４０の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などが挙げられる。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウムなどのアルカリ土類金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
以下、塩としては、同様のものが用いられる。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００５２】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５３】
（４）本発明のＧＰＲ４０の定量法および診断方法
本発明の抗体は、本発明のＧＰＲ４０を特異的に認識することができるので、被検液中のＧＰＲ４０の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＧＰＲ４０とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＧＰＲ４０の割合を測定することを特徴とする被検液中のＧＰＲ４０の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧＰＲ４０の定量法を提供する。
【００５４】
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体がＧＰＲ４０のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がＧＰＲ４０のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、ＧＰＲ４０に対するモノクローナル抗体を用いてＧＰＲ４０の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＧＰＲ４０の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＧＰＲ４０量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００５５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＧＰＲ４０あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のＧＰＲ４０量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００５６】
本発明のサンドイッチ法によるＧＰＲ４０の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、ＧＰＲ４０の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＧＰＲ４０のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のＧＰＲ４０の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」 Ｖｏｌ． ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、 同書 Ｖｏｌ． ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、 同書 Ｖｏｌ． ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、 同書 Ｖｏｌ． ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ ： Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、 同書 Ｖｏｌ． ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、 同書 Ｖｏｌ． １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ ： Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のＧＰＲ４０を感度良く定量することができる。
【００５７】
さらには、本発明の抗体を用いてＧＰＲ４０の濃度を定量することによって、ＧＰＲ４０の濃度の減少が検出された場合、例えば、ＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＧＰＲ４０の濃度の増加が検出された場合には、例えば、ＧＰＲ４０の過剰発現に起因する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患としては、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられる。糖尿病には、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病などが含まれる。
本発明のＧＰＲ４０の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などが挙げられる。
【００５８】
（５）ＧＰＲ４０に対する脂肪酸またはエイコサノイド以外のリガンドの決定方法
脂肪酸またはエイコサノイドがＧＰＲ４０に結合することによって、細胞内Ｃａ２＋の濃度上昇、細胞内ｃＡＭＰ生成の抑制が見られることから、ＧＰＲ４０はこの細胞内シグナルを指標としてＧＰＲ４０に対する脂肪酸またはエイコサノイド以外のリガンドを探索し、または決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ４０を介した細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＧＰＲ４０に対するリガンドの決定方法を提供する。
試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、低分子合成化合物などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などを本発明のレセプター蛋白質に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
【００５９】
具体的には、本発明のリガンド決定方法は、組換え型ＧＲＰ４０の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、ＧＰＲ４０を介する細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を有する化合物またはその塩を決定する方法である。
より具体的には、本発明は、次のような決定方法を提供する。
（１）試験化合物をＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＧＰＲ４０に対するリガンドの決定方法、および
（２）試験化合物をＧＰＲ４０をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合におけるＧＰＲ４０を介する細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＧＰＲ４０に対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、試験化合物がＧＰＲ４０に結合することを確認した後に、上記の試験を行なうことが好ましい。
【００６０】
本発明のリガンド決定方法において、ＧＰＲ４０を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
ＧＰＲ４０を含有する細胞の膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ４０と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
【００６１】
ＧＰＲ４０を含有する細胞やその細胞膜画分中のＧＰＲ４０の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のリガンドを決定方法を実施するためには、ＧＰＲ４０を介する細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＧＰＲ４０を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、Ｃａ２＋、ｃＡＭＰなど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ生成抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
本発明のリガンド決定用キットは、ＧＰＲ４０を含有する細胞またはその細胞膜画分を含有するものである。
このようにして決定されるＧＰＲ４０に対するリガンドは、ＧＰＲ４０に結合してその生理的機能を調節するので、ＧＰＲ４０の機能に関連する疾患の予防・治療剤として用いることができる。
【００６２】
（６）本発明のＧＰＲ４０とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、および本発明のＧＰＲ４０とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬
本発明のＧＰＲ４０を用いるか、または組換え型ＧＰＲ４０の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドである脂肪酸またはエイコサノイドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）ＧＰＲ４０を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のＧＰＲ４０に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のＧＰＲ４０に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合力を減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のＧＰＲ４０とリガンドとを接触させた場合と（ｉｉ）本発明のＧＰＲ４０とリガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、ＧＰＲ４０に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
【００６３】
より具体的には、本発明は、
ａ）標識したリガンドを、本発明のＧＰＲ４０に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＧＰＲ４０に接触させた場合における、標識したリガンドの該ＧＰＲ４０に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）標識したリガンドを、本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）標識したリガンドを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ４０に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＧＰＲ４０に接触させた場合における、標識したリガンドの該ＧＰＲ４０に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００６４】
ｄ）本発明のＧＰＲ４０を活性化する化合物（例えば、本発明のＧＰＲ４０に対するリガンドなど）を本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のＧＰＲ４０を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ４０を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）本発明のＧＰＲ４０を活性化する化合物（例えば、本発明のＧＰＲ４０に対するリガンドなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＧＰＲ４０に接触させた場合と、本発明のＧＰＲ４０を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＧＰＲ４０に接触させた場合における、レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
リガンドとしては、上述した脂肪酸またはエイコサノイドが用いられる。
さらに、リガンドとしては、脂肪酸またはエイコサノイドとＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることもできる。この脂肪酸またはエイコサノイドとＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとして脂肪酸またはエイコサノイドを用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。
脂肪酸またはエイコサノイドとＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩としては、低分子合成化合物が好ましく、新規または公知の何れの化合物であってもよい。特に、ＧＰＲ４０アンタゴニストをスクリーニングする場合には、天然リガンドに代えて、アゴニスト活性を有する低分子合成化合物を用いるのが好ましい。
低分子合成化合物は、天然リガンドに比べて標識が容易であるため、スクリーニングに適している。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のＧＰＲ４０としては、上記した本発明のＧＰＲ４０を含有するものであれば何れのものであってもよいが、本発明のＧＰＲ４０を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のＧＰＲ４０などが適している。
【００６６】
本発明のＧＰＲ４０を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプター蛋白質の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ，Ｐ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．），２６７巻，１９５５５〜１９５５９頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、本発明のＧＰＲ４０を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧＰＲ４０であってもよいし、該ＧＰＲ４０を含有する細胞を用いてもよく、また該ＧＰＲ４０を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法において、本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞としては、該ＧＰＲ４０を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ４０と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＧＰＲ４０を含有する細胞や膜画分中のＧＰＲ４０の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００６８】
リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当なＧＰＲ４０画分と、標識したリガンドが必要である。
ＧＰＲ４０画分としては、天然型のＧＰＲ４０画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＧＰＲ４０画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＧＰＲ４０標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとＧＰＲ４０との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプター蛋白質やリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター蛋白質溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６９】
リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、ＧＰＲ４０を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など、特に細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、Ｃａ２＋、ｃＡＭＰなど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ生成抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧＰＲ４０を発現した細胞が必要である。本発明のＧＰＲ４０を発現した細胞としては、天然型の本発明のＧＰＲ４０を有する細胞株、上記の組換え型ＧＰＲ４０を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
また、試験化合物としては、ＧＰＲ４０の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＧＰＲ４０の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物がアゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ｉｉ）に従えばよい。
（ｉ）前記ａ）〜ｃ）のスクリーニング方法を行い、リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物またはその塩を得た後、該化合物またはその塩が上記した細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。具体的には、上記した本発明のＧＰＲ４０に対するアゴニストのスクリーニング方法を用いて確認することができ、該細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はアゴニストであり、該細胞刺激活性を有しない化合物またはその塩はアンタゴニストである。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させ、上記した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する試験化合物は本発明のＧＰＲ４０に対するアゴニストである。
（ｂ）本発明のＧＰＲ４０を活性化する化合物（例えば、リガンド）を本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のＧＰＲ４０を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞に接触させた場合における細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明のＧＰＲ４０を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る試験化合物は本発明のＧＰＲ４０に対するアンタゴニストである。
より具体的には、実施例３５に記載の評価基準を用いることができる。
【００７０】
リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のＧＰＲ４０、本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞、または本発明のＧＰＲ４０を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）ＧＰＲ４０標品
本発明のＧＰＲ４０を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識リガンド
市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識したリガンド
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
ｄ）リガンド標準液
リガンドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００７１】
２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
【００７２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、リガンドと本発明のＧＰＲ４０との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、本発明のＧＰＲ４０に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のＧＰＲ４０に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型ＧＰＲ４０との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型ＧＰＲ４０との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
また、化合物は、前記したＧＰＲ４０の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて設計された化合物であってもよい。
本発明のＧＰＲ４０に対するアゴニストは、本発明のＧＰＲ４０に対するリガンドである脂肪酸またはエイコサノイドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、脂肪酸またはエイコサノイドが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のＧＰＲ４０に対するアンタゴニストは、本発明のＧＰＲ４０に対するリガンドである脂肪酸またはエイコサノイドが有する生理活性を抑制することができるので、脂肪酸またはエイコサノイドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型ＧＰＲ４０との結合力を増強する化合物は、本発明のＧＰＲ４０に対するリガンドが有する生理活性を増強することができるので、脂肪酸またはエイコサノイドが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型ＧＰＲ４０との結合力を減少させる化合物は、本発明のＧＰＲ４０に対するリガンドが有する生理活性を減少させることができるので、脂肪酸またはエイコサノイドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼ＧＰＲ４０に対するアゴニストまたは▲２▼リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型ＧＰＲ４０との結合力を増強する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などの疾患に対する予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌促進剤、血糖低下剤、膵β細胞保護剤として有用である。糖尿病には、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病などが含まれる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼ＧＰＲ４０に対するアンタゴニストまたは▲２▼リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型ＧＰＲ４０との結合力を減少させる化合物またはその塩は、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などの疾患に対する予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤として有用である。
【００７３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、後述するＧＰＲ４０の発現量を変化させる化合物またはその塩、発現上記疾患に対する他の薬物や、他の糖尿病治療剤、糖尿病性合併症治療剤、高脂血症治療剤、降圧剤、抗肥満剤、利尿剤、化学療法剤、免疫療法剤などの薬剤（以下、併用薬剤と略記することがある）と組み合わせて用いることができる。この際、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩および併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば投与対象がヒトである場合、例えばアゴニスト１重量部に対し、併用薬剤を０．０１〜１００重量部用いればよい。
他の糖尿病治療剤としては、インスリン製剤（例、ウシ、ブタの膵臓から抽出された動物インスリン製剤；大腸菌、イーストを用い、遺伝子工学的に合成したヒトインスリン製剤；インスリン亜鉛；プロタミンインスリン亜鉛；インスリンのフラグメントまたは誘導体（例、ＩＮＳ−１等）など）、インスリン感受性増強剤（例、塩酸ピオグリタゾン、トログリタゾン、ロジグリタゾンまたはそのマレイン酸塩、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＹＭ−４４０、ＧＩ−２６２５７０、ＫＲＰ−２９７、ＦＫ−６１４、ＣＳ−０１１等）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例、ボグリボース、アカルボース、ミグリトール、エミグリテート等）、ビグアナイド剤（例、フェンホルミン、メトホルミン、ブホルミン等）、スルホニルウレア剤（例、トルブタミド、グリベンクラミド、グリクラジド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリクロピラミド、グリメピリド等）やその他のインスリン分泌促進剤（例、レパグリニド、セナグリニド、ミチグリニドまたはそのカルシウム塩水和物、ＧＬＰ−１、ナテグリニド等）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤（例、ＮＶＰ−ＤＰＰ−２７８、ＰＴ−１００、Ｐ３２／９８等）、β３アゴニスト（例、ＣＬ−３１６２４３、ＳＲ−５８６１１−Ａ、ＵＬ−ＴＧ−３０７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ４０１４０等）、アミリンアゴニスト（例、プラムリンチド等）、ホスホチロシンホスファターゼ阻害剤（例、バナジン酸等）、糖新生阻害剤（例、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、グルカゴン拮抗剤等）、ＳＧＬＴ（ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）阻害剤（例、Ｔ−１０９５等）等が挙げられる。
糖尿病性合併症治療剤としては、アルドース還元酵素阻害剤（例、トルレスタット、エパルレスタット、ゼナレスタット、ゾポルレスタット、フィダレスタット（ＳＮＫ−８６０）、ミナルレスタット（ＡＲＩ−５０９）、ＣＴ−１１２等）、神経栄養因子（例、ＮＧＦ、ＮＴ−３、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害薬（例、ＬＹ−３３３５３１等）等）、ＡＧＥ阻害剤（例、ＡＬＴ−９４５、ピマゲジン、ピラトキサチン、Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミド（ＡＬＴ−７６６）、ＥＸＯ−２２６等）、活性酸素消去薬（例、チオクト酸等）、脳血管拡張剤（例、チオプリド等）等が挙げられる。
【００７４】
抗高脂血剤としては、コレステロール合成阻害剤であるスタチン系化合物（例、プラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンまたはそれらの塩（例、ナトリウム塩等）等）、スクアレン合成酵素阻害剤あるいはトリグリセリド低下作用を有するフィブラート系化合物（例、ベザフィブラート、クロフィブラート、シムフィブラート、クリノフィブラート等）等が挙げられる。
降圧剤としては、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（例、カプトプリル、エナラプリル、デラプリル等）、アンジオテンシンＩＩ拮抗剤（例、ロサルタン、カンデサルタン、シレキセチル等）、カルシウム拮抗剤（例、マニジピン、ニフェジピン、アムロジピン、エホニジピン、ニカルジピン等）、クロニジン等が挙げられる。
抗肥満剤としては、例えば中枢性抗肥満薬（例、デキスフェンフルアミン、フェンフルラミン、フェンテルミン、シブトラミン、アンフェプラモン、デキサンフェタミン、マジンドール、フェニルプロパノールアミン、クロベンゾレックス等）、膵リパーゼ阻害薬（例、オルリスタット、ＡＴＬ−９６２等）、β３アゴニスト（例、ＣＬ−３１６２４３、ＳＲ−５８６１１−Ａ、ＵＬ−ＴＧ−３０７、ＡＪ−９６７７、ＡＺ４０１４０等）、ペプチド性食欲抑制薬（例、レプチン、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）等）、コレシストキニンアゴニスト（例、リンチトリプト、ＦＰＬ−１５８４９等）等が挙げられる。
利尿剤としては、例えばキサンチン誘導体（例、サリチル酸ナトリウムテオブロミン、サリチル酸カルシウムテオブロミン等）、チアジド系製剤（例、エチアジド、シクロペンチアジド、トリクロルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ペンフルチジド、ポリチアジド、メチクロチアジド等）、抗アルドステロン製剤（例、スピロノラクトン、トリアムテレン等）、炭酸脱水酵素阻害剤（例、アセタゾラミド等）、クロルベンゼンスルホンアミド系製剤（例、クロルタリドン、メフルシド、インダパミド等）、アゾセミド、イソソルビド、エタクリン酸、ピレタニド、ブメタニド、フロセミド等が挙げられる。
【００７５】
化学療法剤としては、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシドなどが挙げられる。なかでも５−フルオロウラシル誘導体であるフルツロンあるいはネオフルツロンなどが好ましい。
免疫療法剤としては、例えば微生物または細菌成分（例、ムラミルジペプチド誘導体、ピシバニール等）、免疫増強活性のある多糖類（例、レンチナン、シゾフィラン、クレスチン等）、遺伝子工学的手法で得られるサイトカイン（例、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）等）、コロニー刺激因子（例、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン等）などが挙げられ、なかでもＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２などが好ましい。
さらに、動物モデルや臨床で悪液質改善作用が認められている薬剤、すなわち、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例、インドメタシン等）〔キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第４９巻、５９３５〜５９３９頁、１９８９年〕、プロゲステロン誘導体（例、メゲステロールアセテート）〔ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第１２巻、２１３〜２２５頁、１９９４年〕、糖質ステロイド（例、デキサメサゾン等）、メトクロプラミド系薬剤、テトラヒドロカンナビノール系薬剤（文献はいずれも上記と同様）、脂肪代謝改善剤（例、エイコサペンタエン酸等）〔ブリティシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）、第６８巻、３１４〜３１８頁、１９９３年〕、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、あるいは悪液質を誘導する因子であるＴＮＦ−α、ＬＩＦ、ＩＬ−６、オンコスタチンＭに対する抗体なども本発明製剤と併用することができる。
さらに、糖化阻害剤（例、ＡＬＴ−７１１等）、神経再生促進薬（例、Ｙ−１２８、ＶＸ８５３、ｐｒｏｓａｐｔｉｄｅ等）、抗うつ薬（例、デシプラミン、アミトリプチリン、イミプラミン）、抗てんかん薬（例、ラモトリジン）、抗不整脈薬（例、メキシレチン）、アセチルコリン受容体リガンド（例、ＡＢＴ−５９４）、エンドセリン受容体拮抗薬（例、ＡＢＴ−６２７）、モノアミン取り込み阻害薬（例、トラマドル）、麻薬性鎮痛薬（例、モルヒネ）、ＧＡＢＡ受容体作動薬（例、ギャバペンチン）、α２受容体作動薬（例、クロニジン）、局所鎮痛薬（例、カプサイシン）、抗不安薬（例、ベンゾチアゼピン）、ホスホジエステラーゼ阻害薬（例、シルデナフィル）、ドーパミン受容体作動薬（例、アポモルフィン）なども本発明製剤と併用することができる。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７７】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７８】
（７）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
本発明のＧＰＲ４０を用いることによって、各種薬物がＧＰＲ４０を介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
（１）ＧＰＲ４０を用いることを特徴とする、▲１▼膵臓機能調節薬（例、膵臓機能改善薬）、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
（２）ＧＰＲ４０を用いることを特徴とする、▲１▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲２▼インスリン分泌促進薬、▲３▼血糖低下薬または▲４▼膵β細胞保護が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
（３）ＧＰＲ４０を用いることを特徴とする、▲１▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬、▲２▼インスリン分泌抑制薬または▲３▼血糖上昇薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（４）各薬をＧＰＲ４０に接触させた場合における、各薬とＧＰＲ４０との結合量を測定することを特徴とする上記（１）〜（３）記載のスクリーニング方法を提供する。
この確認方法は、前記したリガンドとＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、前記したリガンドとＧＰＲ４０との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がＧＰＲ４０を介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。
【００７９】
（８）細胞膜における本発明のＧＰＲ４０またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する医薬
本発明の抗体は、本発明のＧＰＲ４０を特異的に認識することができるので、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明のＧＰＲ４０を定量することによる、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉ）本発明のＧＰＲ４０を発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明のＧＰＲ４０を定量することによる、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ｉｖ）本発明のＧＰＲ４０を発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００８０】
細胞膜画分に含まれる本発明のＧＰＲ４０の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００ＴＭ、ツイーン２０ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ４０と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のＧＰＲ４０は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ｉｉ）本発明のＧＰＲ４０を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明のＧＰＲ４０を定量することができる。
【００８１】
細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を定量することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明のＧＰＲ４０の確認は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉｉｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を確認することができる。
（ｉｖ）本発明のＧＰＲ４０を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
【００８２】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を増加させることにより、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を増強させる化合物、（ロ）細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物は、本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌促進剤、血糖低下剤、膵β細胞保護剤として有用である。
細胞膜における本発明のＧＰＲ４０の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本発明のＧＰＲ４０の発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤として有用である。
具体的には、本発明のＧＰＲ４０の量を増加する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などの疾患に対する予防・治療剤として使用することができる。糖尿病には、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病などが含まれる。
本発明のＧＰＲ４０の量を減少させる化合物またはその塩は、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などの疾患に対する予防・治療剤として使用することができる。
また、前記した併用薬剤と併用することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００８３】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８４】
（９）本発明のＧＰＲ４０に対する抗体を含有してなる医薬
本発明のＧＰＲ４０に対する抗体の中和活性とは、該ＧＰＲ４０の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該ＧＰＲ４０の関与するシグナル伝達、例えば、該ＧＰＲ４０を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不活性化することができる。
したがって、本発明のＧＰＲ４０に対する中和抗体は、ＧＰＲ４０の過剰発現などに起因する疾患（例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌など）の予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤として用いることができる。
また、前記した併用薬剤と併用することができる。
【００８５】
（１０）本発明のアンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ＧＰＲ４０の過剰発現などに起因する疾患（例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌など）の予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤として用いることができる。
また、前記した併用薬剤と併用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００８６】
（１１）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、***およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００８７】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のＧＰＲ４０を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のＧＰＲ４０の機能を抑制するＧＰＲ４０を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００８８】
本発明のＧＰＲ４０の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
【００８９】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のＧＰＲ４０の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＧＰＲ４０の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００９０】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のＧＰＲ４０の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＧＰＲ４０の機能亢進症や、本発明のＧＰＲ４０が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のＧＰＲ４０の増加症状を有することから、本発明のＧＰＲ４０に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００９１】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のＧＰＲ４０の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＧＰＲ４０の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のＧＰＲ４０の機能不活性型不応症における本発明の異常ＧＰＲ４０による正常ＧＰＲ４０の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のＧＰＲ４０の増加症状を有することから、本発明のＧＰＲ４０またはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＧＰＲ４０組織を分析することによる、本発明のＧＰＲ４０により特異的に発現あるいは活性化するＧＰＲ４０との関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ＧＰＲ４０を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＧＰＲ４０の機能不活性型不応症などを含む、本発明のＧＰＲ４０に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のＧＰＲ４０に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のＧＰＲ４０産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のＧＰＲ４０およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＧＰＲ４０の機能不活性型不応症を含む、本発明のＧＰＲ４０に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のＧＰＲ４０が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００９２】
（１２）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のＧＰＲ４０の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のＧＰＲ４０の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００９３】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００９４】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ及びＭ． Ｈ． Ｋａｕｆｍａｎ， ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ． Ｃ． Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のＧＰＲ４０または本発明のＧＰＲ４０の細胞生物学的検討において有用である。
【００９５】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のＧＰＲ４０のヘテロ発現不全個体であり、本発明のＧＰＲ４０のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のＧＰＲ４０のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００９６】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＧＰＲ４０により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のＧＰＲ４０の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００９７】
（１２ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９８】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＧＰＲ４０の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害など）に対する安全で低毒性な治療・予防剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌促進剤、血糖低下剤、膵β細胞保護剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属；カルシウムなどのアルカリ土類金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のＧＰＲ４０とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に糖尿病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常、糖尿病患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９９】
（１２ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のＧＰＲ４０をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のＧＰＲ４０の発現する組織で、本発明のＧＰＲ４０の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のＧＰＲ４０の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のＧＰＲ４０欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、上記と同様の塩が用いられる。
【０１００】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のＧＰＲ４０の発現を促進し、該ＧＰＲ４０の機能を促進することができるので、例えば、本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患などの予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌促進剤、血糖低下剤、膵β細胞保護剤などの医薬として有用である。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のＧＰＲ４０の発現を阻害し、該ＧＰＲ４０の機能を阻害することができるので、例えば、本発明のＧＰＲ４０の発現過多に関連する疾患などの予防・治療剤、膵臓機能調節剤（例、膵臓機能改善剤）、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤などの医薬として有用である。
本発明のＧＰＲ４０の機能不全に関連する疾患としては、糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられる。糖尿病には、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病などが含まれる。
本発明のＧＰＲ４０の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などが挙げられる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１０１】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のＧＰＲ４０またはその塩とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に糖尿病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常、糖尿病患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のＧＰＲ４０のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのＧＰＲ４０を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のＧＰＲ４０そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１０２】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Figure 2004275001
【０１０３】
Figure 2004275001
【０１０４】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Figure 2004275001
【０１０５】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
本発明のマウス脾臓由来ＧＰＲ４０のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
本発明のマウス脾臓由来ＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
本発明のラット脾臓由来ＧＰＲ４０のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４
本発明のラット脾臓由来ＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：５
本発明のヒト由来ＧＰＲ４０のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６
本発明のヒト由来ＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：７
以下の実施例２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：８
以下の実施例２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：９
以下の実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー３の塩基配列を示す。
配列番号：１０
以下の実施例４におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー４の塩基配列を示す。
配列番号：１１
以下の実施例４におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１２
以下の実施例４におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：１３
以下の実施例４におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１４
以下の実施例４におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１５
以下の実施例４におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：１６
以下の実施例４におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１７
本発明のカニクイザル由来ＧＰＲ４０のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１８
本発明のカニクイザル由来ＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１９
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２０
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２１
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：２２
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２３
以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２４
以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２５
以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：２６
以下の実施例８におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２７
以下の実施例８におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：２８
以下の実施例９におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２９
本発明のハムスター由来ＧＰＲ４０のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３０
本発明のハムスター由来ＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３１
以下の実施例９におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：３２
以下の実施例９におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：３３
本発明のヒト由来ＧＰＲ４０のＣ末端ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３４
ｓｉＲＮＡ ｍ４０ｉ１０３のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号：３５
ｓｉＲＮＡ ｍ４０ｉ１０３のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号：３６
ｓｉＲＮＡ ｍ４０ｉ２５６のセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号：３７
ｓｉＲＮＡ ｍ４０ｉ１０３のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号：３８
以下の実施例２０におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３９
以下の実施例２０におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４０
以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４１
以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
【０１０６】
後述の実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０／Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ−ｍＧＰＲ４０は２００２年３月１８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９６７として、２００２年２月１４日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７６２として寄託されている。
後述の実施例３で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｒＧＰＲ４０は２００２年３月１８日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９６８として、２００２年２月１４日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７６３として寄託されている。
後述の実施例５で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｍｏｎｋｅｙ ＧＰＲ４０は２００２年７月２３日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２５として寄託されている。
後述の実施例９で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡ ｈａｍｓｔａｒＧＰＲ４０は、形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈａｍｓｔｅｒＧＰＲ４０として、２００２年１２月１１日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２５８として寄託されている。
後述の実施例２１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α／ｐＧＴ−ＧＰＲ４０は２００２年１２月１１日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２５９として寄託されている。
【０１０７】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【０１０８】
参考例１ ヒトＧＰＲ４０の発現ベクターの構築
ヒトＧＰＲ４０をコードするＤＮＡ断片は以下のようなＰＣＲ法により取得した。すなわち、５’＞ＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧ＜３’で示されるオリゴＤＮＡ（配列番号：４０）をセンス鎖プライマーとして、５’＞ＣＡＴＣＧＡＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＣＴＴ＜３’で示されるオリゴＤＮＡ（配列番号：４１）をアンチセンス鎖プライマーとして、各々２０ｐｍｏｌ、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）５μｌ、５０×ｄＮＴＰ ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１μｌ、５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１μｌ、鋳型ＤＮＡとしてヒト膵臓ｃＤＮＡ液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１μｌを含む混合液５０μｌを調製し、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標） ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｍｏｄｅｌ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて９６℃、１分、続いて９６℃、３０秒→６１℃、３０秒→７２℃、１２０秒を３５サイクル繰り返し、さらに７２℃、１０分で伸長反応させるプログラムでＰＣＲ反応を行った。反応終了液をアガロースゲル電気泳動することにより単一のプロダクトを得、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングし、遺伝子配列を確認した。ＰＣＲエラーがないクローンについて、制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）、ＣｌａＩ（宝酒造）で二重消化した後、アガロースゲル電気泳動して、単一のプロダクトを切り出した。得られた断片（約１ｋｂ）をｐＡＫＫＯ−１１１ベクターに導入し、ＣＨＯ細胞のトランスフェクション用に用いた。
【０１０９】
【実施例１】ヒト由来ＧＰＲ４０に対する脂肪酸の反応性の確認
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、特に記載が無い限り１０％ 牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むハムＦ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。トランスフェクションを行う前日に１０ｃｍ２あたり４．５ｘ１０５個の細胞を播き、５％ＣＯ２濃度に調整されたＣＯ２培養器にて３７℃で１５時間以上培養した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、試薬添付の方法に準じて操作を行った。培養器に６−ｗｅｌｌプレートを使用する場合は、以下のように行った。まず、１．５ｍｌ容チューブを２本用意し、それぞれにＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μｌ分注した。次に、片方のチューブに発現ベクターを１μｇ、もう片方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を６μｌ添加後、両者を混合し、２０分間室温に静置した。この溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ培地を８００μｌ加えたトランスフェクション用混合液を、あらかじめＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ培地を用いて洗浄したＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加後、ＣＯ２培養器にて６時間培養した。培養後の細胞は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリンスした後、０．０５％ トリプシン・ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥がし、遠心操作にて回収した。得られた細胞の数を測定し、培地２００μｌあたり５ｘ１０４個の細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり２００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。上記トランスフェクション操作にて一過性に受容体を発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞に各種試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施した。まず、細胞に蛍光色素Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）を添加するため、あるいはＦＬＩＰＲアッセイを行う直前に細胞を洗浄するためのアッセイバッファーを作成した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０００ｍｌに１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）２０ｍｌを加えた溶液（以下、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液）に、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１ＮＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらにＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し、この溶液をアッセイバッファーとした。次にＦｌｕｏ−３ＡＭ ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファーに加え、蛍光色素溶液を調製した。トランスフェクション処理を施したＣＨＯ−Ｋ１細胞の培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した後、ＦＬＩＰＲにセットした。また、受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加する試験サンプルはアッセイバッファーを用いて調製し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定した。その結果、ファルネシン酸（ｆａｒｎｅｓｏｉｃ ａｃｉｄ），５．８．１１−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ，５．８．１１．１４−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ，オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ），リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ），リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ），アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ），エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ＥＰＡ），エイコサジエン酸（ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサトリエン酸（ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ＤＨＡ）、ドコサトリエン酸（ｄｏｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アドレン酸（ａｄｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）等を１０−５Ｍ〜１０−６Ｍ加えたときに、ＧＰＲ４０受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞が特異的に応答（細胞内カルシウム濃度の上昇）することが分かった〔図１〜１３〕。コントロールの発現ベクターのみを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞では、このような応答は見られなかった。すなわち、ＧＰＲ４０の内因性リガンドが脂肪酸であることが明らかになった。
【０１１０】
【実施例２】マウス脾臓由来のＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列の決定
マウス脾臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：７）及びプライマー２（配列番号：８）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、▲１▼９８℃・１分の後、▲２▼９８℃・１０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒を４０回の後、▲３▼７２℃・２分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入して、プラスミドを持つクローンをｋａｎａｍｙｃｉｎｅを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇタンパク共役型受容体タンパクをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を得た。このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：１）を含有する新規タンパクをｍＧＰＲ４０と命名した。また形質転換体を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ−ｍＧＰＲ４０と命名した。
【０１１１】
【実施例３】ラット脾臓由来のＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列の決定
ラット脾臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 社）を鋳型として、２個のプライマー、プライマー３（配列番号：９）及びプライマー４（配列番号：１０）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲには Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、▲１▼９６℃・１分、▲２▼９６℃・１０秒、７２℃・２分を５回、▲３▼９６℃・１０秒、７０℃・２分を２５回の後、７２℃・５分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入して、プラスミドを持つクローンをａｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇタンパク共役型受容体タンパクをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４）を得た。このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：３）を含有する新規タンパク質をｒＧＰＲ４０と命名した。また形質転換体を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｒＧＰＲ４０と命名した。
【０１１２】
【実施例４】発現分布
（１）細胞および培地
ＮＩＨ−３Ｔ３およびＢ１０４細胞はＡＴＣＣから購入した。マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６は文献（Ｊｕｎ−ｉｃｈｉ Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１２７， Ｎｏ．１， ｐ１２６−１３２）記載のものを使用した。それぞれの細胞は１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプレコンフルエントになるまで培養した。
（２）ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成
ヒトおよびマウスの組織における発現分布に用いたｃＤＮＡは、ヒトおよびマウスの各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）１μｇからランダムプライマーを用いて逆転写反応した。逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を使用し、添付のプロトコールにしたがって反応させ、エタノール沈殿してＴＥ １００μｌに溶解した。
マウスの細胞由来のｃＤＮＡは、細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡではがし細胞数を測定した後、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ＫＩＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）のマニュアルに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製した。抽出したＲＮＡ １μｇはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマニュアルに従ってランダムを用いてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成後エタノール沈殿してＴＥ １０μｌに溶解した。
（３）ＴａｑＭａｎ を用いた定量
組織由来ｃＤＮＡ（５ｎｇ ＲＮＡ相当）および細胞株由来ｃＤＮＡ（２５ ｎｇ ＲＮＡ相当）に対し、増幅反応試薬ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）、ＧＰＲ４０検出用ＴａｑＭａｎ（商標）Ｐｒｏｂｅ Ｋｉｔ （配列：１１〜１６、アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用い、１５μｌの合計反応液量に調製後反応を行った。各プライマー、プローブの最終濃度はマニュアルに従った。
ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期はＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）のマニュアルに従った。
増幅生成物の定量的ＴａｑＭａｎ解析は、７９００ＨＴ ＳＤＳソフトウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いて行った。コピー数の算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のｃＤＮＡ 断片（ヒトＧＰＲ４０）またはＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ（マウス ＧＰＲ４０）を用いた１０７コピー／ｗｅｌｌから１０２コピー／ｗｅｌｌまでの対数６点におけるＣＴ値から作成した。
ヒト各種組織でのＧＰＲ４０ ｍＲＮＡの発現分布を図１４に、マウス各種細胞でのＧＰＲ４０ｍＲＮＡの発現分布を図１５に示す。ヒト組織では、膵臓、肺、海馬、視床下部、脊髄に相対的に高い発現が認められた。マウスでは膵臓癌由来の細胞に極めて高い発現が認められた。
【０１１３】
【実施例５】カニクイザル由来のＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列の決定
カニクイザルＤＮＡを鋳型として、プライマー（配列番号：１９）及びプライマー２（配列番号：２０）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲには Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＡＫＡＲＡ）を用い、▲１▼９５℃・１分、▲２▼９５℃・１０秒、５８℃・２０秒、７２℃・１分３０秒を４０回の後、７２℃・７分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物を１／ ５０希釈したものを鋳型として、プライマー（配列番号：２１）及びプライマー２（配列番号：２２）を用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行なった。反応後、増幅産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入して、プラスミドを持つクローンをａｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇタンパク共役型受容体タンパクをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１８）を得た。このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：１７）を含有する新規タンパクをｍｏｎｋｅｙ ＧＰＲ４０と命名した。また形質転換体を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ｍｏｎｋｅｙ ＧＰＲ４０と命名した。
【０１１４】
【実施例６】マウスインスリノーマＭＩＮ６細胞における遊離脂肪酸のインスリン分泌促進作用
ＭＩＮ６細胞は特に記載が無い限り１５％ＦＣＳ（Ｔｒａｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．）、５５μＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。９６ウェルプレートに１ウェル当り１０５個のＭＩＮ６細胞を播き、５％ＣＯ２濃度に調整されたＣＯ２培養器にて３７℃で３日間培養した。培地を１０％ＦＣＳ（Ｔｒａｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．）、５．５ｍＭ グルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０（グルコース不含、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換しさらに２４時間培養した。培地を吸引により除去した後、１０％ＦＣＳ（Ｔｒａｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．）、１１ｍＭ グルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０（グルコース不含、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した遊離脂肪酸−牛血清アルブミン（ＢＳＡ）混合液（４：１、モル比）を添加し、５％ＣＯ２濃度に調整されたＣＯ２培養器にて３７℃で９０分間（または６０分間）反応させた。反応後の９６ウェルプレートを１５００ｒｐｍ、５分間遠心した後、培養上清を回収した。この培養上清液中に分泌されたインスリン量をラットインスリンＲＩＡシステム（アマシャムファルマシア）を用いるラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）にて測定した。その結果、パルミチン酸（Ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ） （図１６、図１７）、γ―リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）（図１６）、およびオレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（図１７）などの遊離脂肪酸を３００μＭ〜１０００μＭ加えたときに、ＭＩＮ６細胞によるインスリン分泌が促進することが分かった。すなわち、遊離脂肪酸がマウスインスリノーマＭＩＮ６細胞におけるインスリン分泌を促進させる作用を有することが明らかになった。ＭＩＮ６細胞は、実施例４（図１５）で記載している通りＧＰＲ４０を特異的に非常に多く発現していることから、本反応は、添加した脂肪酸がＧＰＲ４０を介してインスリン分泌を促進するものと判断される。
【０１１５】
【実施例７】ラット膵臓ランゲルハンス島におけるＧＰＲ４０の発現
ラット膵臓からのランゲルハンス島の単離は以下のようにして行った。ウィスターラット（雄性、８週齢）を断頭、脱血した後、ハサミで切除して開腹させ、総胆管の十二指腸側出口をクランプで結束した。次に総胆管の肝臓側に注射針で穴を開け、カニューレを挿入した。あらかじめＨＢＳＳに溶解し、氷冷させておいた１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼ ＸＩ（シグマ、Ｃ−７６５７）溶液の５ｍｌをカニューレより注入した。膵臓を他の組織から切り離し、３７℃水浴中にて３分間振とうした。１０ｍｌのＨＢＳＳを添加して５〜６回ピペッティングした後、１０ｍｌのＨＢＳＳを添加して２回ピペッティングした。２０ｍｌのＨＢＳＳを添加し、４分間静置した後、上清をすて、再度１０ｍｌのＨＢＳＳを添加して２回ピペッティングした。さらに１０ｍｌのＨＢＳＳを添加して２回ピペッティングした後、２０ｍｌのＨＢＳＳを添加し、３分間静置した。上清を捨て、適当量のＨＢＳＳを添加して懸濁したものを底を黒く塗ったシャーレに移した。別のシャーレに１０％ＦＣＳ（Ｔｒａｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．）、５．５ｍＭ グルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０（グルコース不含、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を入れ、底を黒く塗ったシャーレより実体顕微鏡下にて選んだランゲルハンス島をピペットチップを用いてこのシャーレに移した。
膵臓全体および上記で得られたランゲルハンス島をＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）を加えてホモジナイズし、マニュアルにしたがってｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して蒸留水４０μｌに溶解した。ＧＰＲ４０ｍＲＮＡの発現量の定量はＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（ＡＢＩ社）を用いて行った。目的遺伝子の増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＣＡＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴ−３’（配列番号：２３），５’−ＣＡＧＴＴＴＣＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＣＴ−３’（配列番号：２４） およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）ＴＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＣＴＡＧＧＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＡＣ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：２５）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．２２５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを１．２５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を１μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃ ２分、９５℃ １０分の後、９５℃ １５秒、６０℃ １分のサイクルを４０回繰り返した。その結果単離したランゲルハンス島ではＧＰＲ４０が高発現していることが確認された（図１８）。
【０１１６】
【実施例８】カニクイザル膵臓ランゲルハンス島におけるＧＰＲ４０の発現
カニクイザル膵臓からのランゲルハンス島の単離は以下のようにして行った。カニクイザル（雌性、体重３ｋｇ）の両脇および大腿部をメスで切開し、放血した後、ハサミで切除して開腹させ、総胆管の十二指腸側出口および肝臓側出口をクランプで結束した。次に総胆管の肝臓側に注射針で穴を開け、カニューレを挿入した。あらかじめＨＢＳＳに溶解し、氷冷させておいた１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼ Ｖ（シグマ、Ｃ−９２６３）溶液の２５ｍｌをカニューレより注入した。膵臓を他の組織から切り離し、ハサミで５ｍｍ四方程度になるまで細かく切った後、３７℃水浴中にて２０分間振とうした。数十ｍｌのＨＢＳＳの添加とピペッティングを数回繰り返した後、４分間静置し、上清をすてた。沈澱物に再度、あらかじめＨＢＳＳに溶解し、氷冷させておいた１．７ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼ ＸＩ（シグマ、Ｃ−７６５７）溶液の１５ｍｌを添加して３７℃水浴中にて１５分間振とうした。数十ｍｌのＨＢＳＳの添加とピペッティングを繰り返した後、３分間静置し、上清をすてた。沈澱物に適当量のＨＢＳＳを添加し、懸濁したものを底を黒く塗ったシャーレに移した。別のシャーレにＨＢＳＳを入れ、底を黒く塗ったシャーレより実体顕微鏡下にて選んだランゲルハンス島をピペットチップを用いてこのシャーレに移した。
膵臓全体および上記で得られたランゲルハンス島から実施例７と同様の方法でｔｏｔａｌＲＮＡを調製、ｃＤＮＡを合成して、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００によりＧＰＲ４０ ｍＲＮＡの発現量を求めた。ただしサル型のＧＰＲ４０ｍＲＮＡの増幅と検出のため、プライマーとして５’−ＧＣＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴ−３’（配列番号：２６）， ５’−ＧＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＣＧＴＡＧＣＡ−３’（配列番号：２７） およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）ＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：２８）を使用した。その結果、霊長類においてもランゲルハンス島でＧＰＲ４０が高発現していることが確認された（図１９）。
【０１１７】
【実施例９】ハムスター由来のＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列の決定
ハムスター細胞株ＨＩＴ−Ｔ１５ｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１（配列番号：３１）及びプライマー２（配列番号：３２）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲには Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（クローンテック）を用い、▲１▼９５℃・２分、▲２▼９８℃・１０秒、６３℃・２０秒、７２℃・１分を３５回の後、７２℃・７分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入して、プラスミドを持つクローンをａｍｐｉｃｉｌｉｎを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇタンパク共役型受容体タンパクをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：３０）を得た。このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：２９）を含有する新規タンパク質をｈａｍｓｔａｒＧＰＲ４０と命名した。また、形質転換体を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＡ ｈａｍｓｔａｒＧＰＲ４０と命名した。
【０１１８】
【実施例１０】ヒトＧＰＲ４０のＣ端ペプチドを含む免疫原の作製および免疫
ヒトＧＰＲ４０のＣ端ペプチド、Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ（配列番号：３３；公知手法に準じて合成した）とＢＳＡとの複合体を作製し免疫原とした。すなわち、ＢＳＡ ２０ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）２．０ｍｌに溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニミド（ＧＭＢＳ）２．８ｍｇを含むＤＭＳＯ溶液２００μｌと混合し、室温で３０分反応させた。２ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで過剰のＧＭＢＳ試薬を除去した後、マレイミド基の導入されたＢＳＡ５ｍｇと０．１ｍｌの水に溶解させたＣ端ペプチド０．８４ｍｇとを混合し、４℃で１夜反応させた。反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。８週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに、上記、Ｃ端ペプチド−ＢＳＡ複合体、約０．０５ｍｇ／匹をアジュバントとともに皮下免疫した。２週間後さらに２週間後同量の免疫原をアジュバントとともに追加免疫し、その１週間後に採血した。
【０１１９】
【実施例１１】西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化Ｃ端ペプチドの作製
上記のＣ端ペプチド（配列番号：３３）とＨＲＰ（酵素免疫測定法用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の標識体とした。すなわち、ＨＲＰ ２３ｍｇを２．３ｍｌの０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ６．７に溶解させ、ＧＭＢＳ １．６ｍｇを含むＤＭＦ溶液０．２３ｍ１と混合し、室温で３０分間反応させたのち、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ６．５で平衡化させたセファデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして作製したマレイミド基の導入されたＨＲＰ ２．３ｍｇとＣ鎖Ｎ端ペプチド１ｍｇとを混合し、４℃で１日反応させた。反応後、０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ６．５で平衡化させたウルトロゲルＡｃＡ５４（ファルマシア社製）カラムで分画し、ＨＲＰ標識化Ｃ端ペプチドを得た。
【０１２０】
【実施例１２】Ｃ端ペプチドを免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
マウス抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まずヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を０．１ｍｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ 炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに０．１ｍ１ずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）および０．０５％ ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２を０．３ｍ１ずつ分注し、４℃で少なくとも２４時間処理した。
上記、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＥＣ［０．２％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．４％ブロックエース、０．０５％ ＣＨＡＰＳ〔３−〔（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸〕、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ ＮａＮ３を含む０．０２Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０］で希釈したマウス抗血清０．１４ｍｌを加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄したのち、バッファーＣ［１％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍ リン酸緩衝液、ＰＨ７．０］で１０００倍に希釈した上記実施例で作製したＨＲＰ標識Ｃ端ペプチド０．１ｍｌを加え４℃で１日反応させた。次に、該プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ＆ＰＥＲＲＹ ＬＡＢ．フナコシ薬品取り扱い）０．１ｍｌを加え室温で２０分間反応させることにより測定した。反応を１Ｍリン酸０．１ｍｌを加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ．４５０）をプレートリーダー（ＭＴＰ−１２０、コロナ社製またはＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）で測定した。免疫したマウス全てにＣ端ペプチドに対する抗体価の上昇が認められた。
【０１２１】
【実施例１３】抗Ｃ端ペプチドモノクローナル抗体の作製
実施例１２において比較的高い抗体価を示したマウスに対してＢＳＡとして０．０８〜０．１ｍｇのＣ端ペプチド−ＢＳＡを静脈内に投与することにより最終免疫を行なった。最終免疫３日後のマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３．Ａｇ ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー、８１、１（１９７８）〕。細胞融合は、原法〔ネイチャー、２５６、４９５（１９７５）〕に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しない培地で３度洗浄し、脾臓紬砲とＰ３Ｕ１数の比率を６．６：１になるよう混合して、７５０回転で１５分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）６０００（コッホライト社製）を０．３ｍ１加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に徐々にＭＥＭを添加し、合計１５ｍｌのＭＥＭを加えた後７５０回転１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有するＧＩＴメデイウム（和光純薬）（ＧＩＴ−１０％ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍ １当リ２×１０５個になるように浮遊し、９６穴マルチディッシュ（リンブロ社製）に１ウェル０．１ｍｌずつ１９２ウェルに播種した。播種後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。２４時間後ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０−４Ｍ、アミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６×１０−３Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０％ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当リ０．１ｍｌずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始５、８日後に旧液を０．１ｍｌ捨てたあと、０．１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続し、細胞融合後９日目に上清を採取した。
培養上清中の抗体価は、実施例に記載の方法に準じて実施した。すなわち、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルに培養上清０．０７ｍｌおよびバッファーＥＣ０．０７ｍｌを加え４℃で１夜反応させた後、バッファーＣで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識化Ａ鎖Ｎ端ペプチド０．１ｍｌを非標識Ｃ端ペプチド０．００２ｍＭの存在下あるいは非存在下室温で７時間反応させた。該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、実施例１３に記載の方法に従い固相上の酵素活性を測定した。その結果、１６８ウェルの中から特異的な抗体価の認められたウェルを選択し、ハイブリドーマを凍結保存した。さらにウェルのハイブリドーマについては、希釈法によるクローニングに付した。クローニング後、培養上清中の抗体価を同様の方法に従って測定した。
陽性クローンの中から、抗Ｃ端ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択した。
【０１２２】
【実施例１４】モノクローナル抗体の精製
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体をプロテイン−Ａカラムにより精製した。即ち、ハイブリドーマ上清約２５ｍｌを等量の結合緩衝液（３．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ３を含む１．５Ｍ グリシン、ｐＨ９．０）で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイン−Ａ−アガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液（０．０５％ ＮａＮ３を含む０．１Ｍ クエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液はＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して４℃、２日間透析したのち、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）により除菌濾過し４℃あるいは−８０℃で保存した。
【０１２３】
【実施例１５】Ｃ端ペプチドを免疫したウサギの抗血清中の抗体価の測定とポリクローナル抗体の調整
ウサギ抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。抗ウサギイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まずヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を０．１ｍｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ 炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに０．１ｍ１ずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）および０．０５％ ＮａＮ３を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２を０．３ｍ１ずつ分注し、４℃で少なくとも２４時間処理した。上記、抗ウサギイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＥＣ ［０．２％ ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．４％ブロックエース、０．０５％ ＣＨＡＰＳ〔３−〔（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸〕、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ ＮａＮ３を含む０．０２Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０］で希釈したウサギ抗血清０．１４ｍｌを加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄したのち、バッファーＣ［１％ ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０２ Ｍリン酸緩衝液、ＰＨ７．０］で１０００倍に希釈した上記実施例で作製したＨＲＰ標識Ｃ端ペプチド０．１ｍｌを加え４℃で１日反応させた。次に、該プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ＆ＰＥＲＲＹ ＬＡＢ．フナコシ薬品取り扱い）０．１ｍｌを加え室温で２０分間反応させることにより測定した。反応を１Ｍリン酸０．１ｍｌを加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ．４５０）をプレートリーダー（ＭＴＰ−１２０、コロナ社製またはＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）で測定した。免疫したウサギ三匹中二匹にＣ端ペプチドに対する抗体価の上昇が認められた。さらに抗体価の上昇したウサギの血清を採取し、定法に従い抗原精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。
【０１２４】
【実施例１６】細胞内カルシウム濃度変化を指標とした本レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法の設定
ＧＰＲ４０に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索を行うための系を設定するために、アゴニストとして同定されたパルミチン酸を用いて、アッセイ系を設定した。
参考例１で作製したヒトＧＰＲ４０発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトＧＰＲ４０を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０ Ｎｏ．１０４）を３ｘ１０４個／１００μｌの細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。方法を以下に記載した。
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ） ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファー［ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に １Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）を２０ｍｌ添加し、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらに上記のＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し調製する。］に加え、蛍光色素溶液を調製した。細胞プレートの培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した。細胞に添加するパルミチン酸はアッセイバッファーを用いて各々の濃度に希釈し、プレートに分注した。アンタゴニスト測定用に１２μＭγリノレン酸溶液（反応時の終濃度で３μＭ）をプレートに分注し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにてパルミチン酸添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定しアゴニスト作用を、続いてγリノレン酸を添加してアンタゴニスト作用の検討を行った。パルミチン酸はアゴニストであるために、パルミチン酸を用いた実験ではアンタゴニストの評価は成立しないが、アンタゴニスト作用のみもつ化合物を添加した場合には、γリノレン酸の反応を抑制する活性が観測されるはずである。反応開始３０秒後の蛍光強度値の変化を用いた用量反応曲線より、ＥＣ５０値を算出した。
【０１２５】
【実施例１７】脂肪酸添加によるｈＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞でのＭＡＰキナーゼ活性化
参考例１で作製したヒトＧＰＲ４０発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０ ＮＯ．１０４）またはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞を３ｘ１０５／ｗｅｌｌの濃度で６ウェルプレートに撒いて、血清低濃度培地（核酸不含ＭＥＭα培地に０．５％の透析ウシ胎児血清を添加したもの）にて一晩培養し、さらに無血清培地（核酸不含ＭＥＭα培地）に交換して一晩培養した。新しい無血清培地に交換して４時間培養後、１０μＭの各種脂肪酸を添加した。１０分間インキュベーションしたのち、サンプルバッファー（ＴＥＦＣＯ社）で細胞を溶解・抽出しＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離を行った。その後ＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ ｐ４４／４２ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いたウエスタンブロッテイングを行った。その結果、図２０に示す通り、ヒトＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞でのみ、脂肪酸添加後にＭＡＰキナーゼのリン酸化によって示される当該タンパク質の活性化が起こることが分かった。
【０１２６】
【実施例１８】マウスＧＰＲ４０の配列に特異的なｓｉＲＮＡ導入によるマウスＧＰＲ４０−ＧＦＰ融合タンパク質の発現抑制
自体公知の方法にて作製した、マウスＧＰＲ４０とＧＦＰの融合タンパク質発現ＣＨＯ細胞を３ｘ１０４／ｗｅｌｌにて９６ウェルプレートにまいて１日培養した。ＨＶＪ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ（石原産業）を用いて、Ｅｌｂａｓｉｒらの報告（Ｎａｔｕｒｅ ４１１（６８３６），４９４−４９８（２００１））に従って作製した種々の配列のｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）（２．８６ｐｍｏｌ／０．５μｌあるいは８．５７ｐｍｏｌ／１．５μｌの濃度）を細胞に導入後さらに１日培養した。マウスＧＰＲ４０−ＧＦＰの発現量の検出は以下に示す通りのエンザイムイムノアッセイにて行った。培養上清を捨ててＨＢＳＳ（インビトロゲン）にて洗浄後、０．０１％グルタルアルデヒド（和光純薬）で５分間固定し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ（宝酒造）にてブロッキングした。５００倍希釈した抗ＧＦＰモノクローナル抗体３Ｅ６（ニッポンジーン）を添加後室温で２時間インキュベーションした後、洗浄し５００倍希釈したＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ）を添加し、室温で２時間インキュベーションした。洗浄後、ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（フナコシ）を添加し、３０分間インキュベーション後、硫酸を添加して発色反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果、図２１に示す通り、マウスＧＰＲ４０−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞に対し、マウスＧＰＲ４０特異的なｓｉＲＮＡであるｍ４０ｉ１０３（センス鎖は配列番号：３４、アンチセンス鎖は配列番号：３５）、ｍ４０ｉ２５６（センス鎖は配列番号：３６、アンチセンス鎖は配列番号：３７）を添加することによりＧＰＲ４０−ＧＦＰの発現量の低下が認められた。このことからｍ４０ｉ１０３、ｍ４０ｉ２５６がマウスＧＰＲ４０発現を特異的に抑制させることが分かった。ｍ４０ｉ１０３およびｍ４０ｉ２５６の配列を図２２に示す。
【０１２７】
【実施例１９】ヒトＧＰＲ４０を膵臓β細胞特異的に発現するマウス作製用ＤＮＡ断片の構築
ヒトＧＰＲ４０をマウス膵臓β細胞で特異的に発現させるためにマウスインスリンＩＩプロモーターに下流に、ｐｏｌｙ（Ａ）＋付加シグナルを含むヒトＧＰＲ４０遺伝子を導入したＤＮＡ断片を作製した。
マウスゲノムからＰＣＲによってクロ−ニングしたマウスインスリンＩＩプロモ−タ−（ＭｌｕＩ−ＳａｌＩ断片：６７３ｂｐ）の下流に、同じくヒトゲノムからＰＣＲによってクロ−ニングした、開始コドンからｐｏｌｙ（Ａ）＋付加シグナルの下流まで含むヒトＧＰＲ４０遺伝子（ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ断片：２２５６ｂｐ）断片を挿入し、マウスインスリンＩＩプロモ−タ−の制御下にヒトＧＰＲ４０遺伝子を発現する発現ユニットを作製した。このようにして得られた発現ユニットをＭｌｕＩ、ＳｐｅＩの二重消化により２９２８ｂｐ断片を切り出し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵にマイクロインジェクションするＤＮＡ断片とした。
【０１２８】
【実施例２０】マウスＧＰＲ４０遺伝子のクローニング
マウスＧＰＲ４０ ＯＲＦを含む領域を増幅できるプライマ−（配列番号：３８、配列番号：３９）を用いてＰＣＲによってマウス１２９ＳｖＪＢＡＣゲノムライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のスクリ−ニングを行い、３８４コロニ−が混ざった状態の独立な３つのポジティブクロ−ンを得た。この３８４コロニ−が混ざった状態の独立な３つのポジティブクロ−ンを、上記の配列番号：３８および配列番号：３９によるＰＣＲで得られたＤＮＡ断片（１．６ｋｂｐ）をプロ−ブにしてコロニ−ハイブリダイゼーションを行い、最終的に３つのポジティブなシングルクロ−ンを単離した。
このクロ−ンが保持するＢＡＣ ＤＮＡを常法により単離した後、ＧＰＲ４０遺伝子が存在していると思われる領域約２５ｋｂについてシークエンサー（パーキンエルマー社）を用いて塩基配列を決定し、この塩基配列情報をもとにして制限酵素地図を作製した（図２３）。
【０１２９】
【実施例２１】ＧＰＲ４０遺伝子ターゲッティングベクターの構築
マウスＧＰＲ４０遺伝子ターゲッティングベクターの構築は、基本ベクタ−ｐＧＴ−Ｎ−２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）にＧＰＲ４０遺伝子の５’上流側のア−ムとして
【実施例２０】で得られた１１１５１ｂｐ ＢａｍＨＩ断片、３’下流側のア−ムとして３４５８ｂｐ Ｅｃｌ１３６ＩＩ（ＳａｃＩ）断片を導入し、ポジティブセレクションマ−カ−にネオマイシン耐性遺伝子、ネガティブセレクションマ−カ−に単純ヘルペスウイルスチミジンキナ−ゼ遺伝子を持つマウスＧＰＲ４０遺伝子ターゲッティングベクターｐＧＴ−ＧＰＲ４０を構築した（図２３）。これを大腸菌ＤＨ５αに導入して、形質転換体として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＧＴ−ＧＰＲ４０を得た。
【０１３０】
【実施例２２】ヒト由来ＧＰＲ４０に対するエイコサノイドの反応性の確認
参考例１で作製したヒトＧＰＲ４０発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトＧＰＲ４０を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０ Ｎｏ．１０４）は特に記載が無い限り１０％ 透析牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＭα培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。培養細胞は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリンスした後、０．０５％ トリプシン・ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥がし、遠心操作にて回収した。得られた細胞の数を測定し、培地１００μｌあたり３ｘ１０４個の細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。上記ＣＨＯ細胞株に各種試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施した。まず、細胞に蛍光色素Ｆｌｕｏ３−ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）を添加するため、あるいはＦＬＩＰＲアッセイを行う直前に細胞を洗浄するためのアッセイバッファーを作成した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０００ｍｌに１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）２０ｍｌを加えた溶液（以下、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液）に、プロベネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらにＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し、この溶液をアッセイバッファーとした。次にＦｌｕｏ３−ＡＭ ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファーに加え、蛍光色素溶液を調製した。培養ＣＨＯ細胞株の培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した後、ＦＬＩＰＲにセットした。また、ＣＨＯ細胞株に添加する試験サンプルはアッセイバッファーを用いて調製し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定した。その結果、（±）１４，１５−ジハイドロキシ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）１４，１５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １４，１５−ＤＨＴ）、（±）５（６）−エポキシ−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）５（６）−ｅｐｏｘｙ−８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ５，６−ＥＥＴ）、（±）８（９）−エポキシ−５Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）８（９）−ｅｐｏｘｙ−５Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ８，９−ＥＥＴ）、（±）１１（１２）−エポキシ−５Ｚ，８Ｚ，１４Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）１１（１２）−ｅｐｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， １１，１２−ＥＥＴ）、（±）１４（１５）−エポキシ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−エイコサトリエン酸（（±）１４（１５）−ｅｐｏｘｙ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ，１４，１５−ＥＥＴ）を１０−５Ｍ〜１０−６Ｍ加えたときに、ＧＰＲ４０受容体を発現するＣＨＯ細胞株が特異的に応答（細胞内カルシウム濃度の上昇）することが分かった。コントロールの発現ベクターのみを導入したＣＨＯ細胞株（Ｍｏｃｋ細胞株）では、このような応答は見られなかった。従ってＧＰＲ４０は、これらの化合物にも反応することが判明した。
【０１３１】
【実施例２３】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるＧＰＲ４０ｍＲＮＡのｉｓｌｅｔにおける発現分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットを屠殺し、胆管十二指腸開口部を結索したのち胆管から１ｍｇ／ｍｌの冷コラゲナーゼ／ＨＢＳＳを膵臓に注入した。コラゲナーゼの注入された膵臓を切り離してコニカルチューブに移し、３７℃で浸透しながら１０分間インキュベートした。ＨＢＳＳを加え、ピペッティングにより組織をよく分散させたのち、３〜４分の静置によりｉｓｌｅｔを含む組織を沈殿させ、上清を除いた。この操作を２回繰り返した後、ＨＢＳＳに再懸濁し、実体顕微鏡下でｉｓｌｅｔをピックアップした。以上のようにして単離したｉｓｌｅｔをＯ・Ｃ・Ｔコンパウンド中で液体窒素により凍結し、−８０℃で保存した。
ＧＰＲ４０アンチセンス、センスプローブは以下の方法で調製した。まず、プラスミドベクターｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）に自体公知の方法でラット型ＧＰＲ４０ｃＤＮＡを挿入した。このｃＤＮＡを、Ｍ１３プライマー（インビトロジェン社）・Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣ２ポリメラーゼ（クロンテック社）を用いたＰＣＲにて増幅・直鎖化し、エタノール沈殿法により精製した。このｃＤＮＡから、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ＫＩＴ（ＳＰ６／Ｔ７）（ロッシュ社）にてＳＰ６もしくはＴ７によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い（４０μｌスケール）、生成されたＤＩＧラベルリボプローブをさらに４０ｍＭ ＮａＨＣＯ３，６０ｍＭＮａ２ＣＯ３ ｐＨ１０．２により４００ｂｐにアルカリ加水分解した後エタノール沈殿により精製した。精製したプローブは大塚精製水１００μｌに溶解した。ｃＤＮＡの挿入方向から、ＳＰ６により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがアンチセンスプローブ、Ｔ７により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがセンスプローブであった。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには単離ｉｓｌｅｔの新鮮凍結切片を使用した。まず前述した単離ｉｓｌｅｔをクライオスタットＣＭ３０５０（ライカ社）を用いてシランコートスライド上に１６μｍの厚さで薄切した。切片を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにて１０分間固定した後、ＰＢＳにてよく洗い、０．２５％無水酢酸を含む０．１Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ ８．０）による処理（室温・１０分）にてアセチル化を行った。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応には、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０％ホルムアミド，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ，１０％デキストラン硫酸，６００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２５％ ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）でアンチセンスプローブもしくはセンスプローブを１０００倍に希釈し、８５℃で１０分変性した後、切片に加え５０℃で１２時間以上反応させた。引き続き、非特異的にｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎしたプローブを洗浄するため以下の操作を行った。１）２×ＳＳＣ（ＳＳＣ；１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）／５０％ホルムアミド処理（６０℃・３０分 １回）、２）２×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分 １回）、３）０．１×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分 ２回）。以上の操作を行った後、ＤＩＧラベルプローブを検出するための免疫組織化学を行った。まず、ＤＩＧ−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、１．５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１による処理（３７℃・１時間）にて非特異反応のブロッキングを行い、ａｎｔｉ−ＤＩＧ ｆａｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１（１：１０００）を室温で１時間反応させた。ＤＩＧ−１で十分洗浄した後、ＤＩＧ−３（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）でリンスし、０．１８ｍｇ／ｍｌ ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＢＣＩＰ）を含むジメチルホルムアミド、および ０．３４ｍｇ／ｍｌ４−ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）を含む７０％ジメチルホルムアミド、およびｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｈｏｌを、ＤＩＧ−３ １０ｍｌにつきそれぞれ０．３５ｍｌ、０．４５ｍｌ、３％加えた溶液によって、室温にて発色反応を行った。適時に発色をＰＢＳ洗浄により止めた後、インスリン・グルカゴン免疫組織化学の操作に移行した。
まず、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにより非特異反応のブロッキングを行い、ウサギ抗インスリン血清（Ｈ−８６：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，１／２００）および抗グルカゴンモノクローナル抗体（Ｋ７９ｂＢ１０：ＳＩＧＭＡ，１／８０００）を含む０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで１２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１０μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）および１０μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ ５９４−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を含む０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳと室温で２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、９０％グリセロールを含むＰＢＳで封入し、光学顕微鏡、および蛍光顕微鏡で観察した。
ＧＰＲ４０アンチセンスプローブにより、単離ｉｓｌｅｔにおいて陽性シグナルが観察された。陽性シグナルはｉｓｌｅｔ全体に散見された。これらの領域においてセンスプローブによる発色は検出されなかった。一方、蛍光顕微鏡観察では、既知の通りｉｓｌｅｔ周辺部の細胞にグルカゴン免疫陽性シグナル、その他の部分にインスリン免疫陽性シグナルが観察された。ＧＰＲ４０アンチセンスプローブによるシグナルとインスリン・グルカゴンの免疫陽性シグナルを比較すると、ＧＰＲ４０のシグナルはインスリン免疫陽性細胞に観察されたが、グルカゴン免疫陽性細胞ではクリアなＧＰＲ４０のシグナルは観察されなかった。以上の結果から、ｉｓｌｅｔにおいてＧＰＲ４０ｍＲＮＡはβ細胞に特異的に発現している可能性が示唆された。
【０１３２】
【実施例２４】脂肪酸添加によるＭＩＮ６細胞でのＭＡＰキナーゼ活性化
培地は４．５ｇ／ｌのグルコースを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、インビトロゲン社）に１５％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社）、５．５μＭ ２−メルカプトエタノール（インビトロゲン社）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものを用いた。マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６細胞を２ｘ１０５／ｗｅｌｌの濃度で１２ウェルプレートにまいて一晩培養し、翌朝培地を交換してさらに一晩培養した。翌朝、再び培地を交換して３時間培養後、２２ｍＭグルコースを含むＫＲＢＨにて１時間プレインキュベーションを行った。各種脂肪酸は１０μＭの濃度でＫＲＢＨ（２２ｍＭグルコース）に溶かしてＭＩＮ６細胞に添加し、２．５分間（あるいは５分間）インキュベーションした。ＭＡＰＫ阻害剤（ＰＤ９８０５９）は５０μＭの濃度でプレインキュベーション・インキュベーションの際にＫＲＢＨに添加した。サンプルバッファー（ＴＥＦＣＯ社）で細胞を溶解・抽出後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ ｐ４４／４２ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いたウエスタンブロッテイングを行った。その結果、図２４に示す通り、ＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞を用いたＦＬＩＰＲアッセイでアゴニスト活性を有する脂肪酸（レーン２，３，４）を添加したときのみＭＡＰキナーゼのリン酸化によって示される当該タンパク質の活性化が起こること、また、ＰＤ９８０５９を添加することでＭＡＰＫの活性化はほぼ抑えられることが分かった。ＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞同様にアゴニスト活性を示す脂肪酸でＭＩＮ６においてもＭＡＰＫ活性化が起こることから、脂肪酸のＭＩＮ６刺激の少なくとも一部にはＧＰＲ４０が関与していることが強く支持された。
【０１３３】
【実施例２５】各種脂肪酸によるＭＩＮ６からのインスリン分泌促進
フラスコ内で培養したマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６を、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いてはがした後、９６ウェルプレートに撒いて２日間培養した。培地は実施例２４と同じ４．５ｇ／ｌのグルコースを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、インビトロゲン社）に１５％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社）、５．５μＭ ２−メルカプトエタノール（インビトロゲン社）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものを用いた。細胞を改変したＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＫＲＢＨ、１１６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２４ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３）で２回洗浄した後、３７℃５％ＣＯ２条件下で３０分間プレインキュベーションした。上記のＫＲＢＨに２２ｍＭグルコースを添加したバッファーで希釈・調製した脂肪酸を、プレインキュベーション後の細胞に添加し、３７℃５％ＣＯ２条件下で９０分間培養した。培養後、細胞の上清を回収し、凍結保存した。上清中のインスリン含量は市販のインスリンイムノアッセイキット（アマシャムファルマシア社）で測定した。その結果、図２５に示す通り、ＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内カルシウムイオン動員アッセイにおいて顕著な活性を示した脂肪酸である、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、α−リノレン酸（α−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、γ−リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＤＨＡにより有意なインスリン分泌上昇活性が認められた。一方、ＧＰＲ４０にアゴニスト活性を示さないリノール酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅ＝ｌｉｎｏｌｅｉｃ ｍｅｔｈｙｌ）や酪酸（Ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ）は有意なインスリン分泌上昇活性を示さなかった。ＧＰＲ４０アゴニスト活性とインスリン分泌上昇活性がほぼ相関することから、ＧＰＲ４０が脂肪酸によるインスリン分泌上昇作用の少なくとも一部を担っていることが証明された。
【０１３４】
【実施例２６】ＧＰＲ４０を介したインスリン分泌上昇活性のグルコース依存性
実施例２５の方法に基づき、脂肪酸添加時のグルコース濃度の影響について検討した。脂肪酸添加時のＫＲＢＨに添加するグルコース濃度を０、５．５、１１、２２ｍＭに変えて検討した結果、図２６に示す通り、オレイン酸（ｏｌｅｉｃａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）によるインスリン分泌上昇活性は１１ｍＭ以上の高グルコース濃度条件下で顕著であることが分かった。このことから、ＧＰＲ４０にアゴニスト活性を示す脂肪酸によるインスリン分泌上昇作用は、高血糖条件下でのインスリン分泌上昇作用・血糖効果作用が期待された。
【０１３５】
【実施例２７】ｓｉＲＮＡ導入ＭＩＮ６における、脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性の抑制効果
実施例１８においてＧＰＲ４０特異的ｓｉＲＮＡであるｍ４０ｉ１０３がマウスＧＰＲ４０の発現を顕著に抑制させることが確認済である。実施例１８の方法に基づきＨＶＪ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ ＧｅｎｏｍＯＮＥを用いてｍ４０ｉ１０３を導入させたＭＩＮ６細胞におけるインスリン分泌上昇活性について検討した。実施例２５の方法により脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性について調べた結果、図２７に示す通り、ｍ４０ｉ１０３導入ＭＩＮ６ではリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、γ−リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）によるインスリン分泌上昇活性が認められなくなった。一方、ランダム配列ｓｉＲＮＡであるＳｃｒａｍｂｌｅ ＩＩ ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡを導入したＭＩＮ６では上記脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性が保持されていることが示された。この結果から、ＧＰＲ４０が、脂肪酸によるインスリン分泌上昇機構の少なくとも一部を担っていることが確認された。
【０１３６】
【実施例２８】ラット膵臓ランゲルハンス島初代培養における脂肪酸のインスリン分泌活性
８週齢の雄Ｗｉｓｔｅｒ ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ）の膵臓からコラゲナーゼ消化法によりランゲルハンス島を単離した。６匹分のおよそ１０００個の単離ランゲルハンス島をＫＲＢＨ（２．８ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ）で２回洗浄し、そのまま３７℃、３０分間、５％ＣＯ２存在下でプレインキュベーションした。遠沈後、上清を捨て再びＫＲＢＨ（２．８ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ）に１４０個／ｍＬの濃度で均一に懸濁し、９６穴プレートに１００μＬずつ分注した。各種脂肪酸サンプルのリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、γ−リノレン酸（γ−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅ）（それぞれ最終３０μＭもしくは３μＭ）を含むＫＲＢＨ（最終１６．５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ）を１００μＬずつ加え、３７℃、９０分間、５％ＣＯ２存在下でインキュベートした。上清中のインスリン含量は市販のイムノアッセイキット（アマシャム）にて測定した。その結果、図２８に示す通りＧＰＲ４０にアゴニスト活性を示す脂肪酸で処理することによりラット膵臓ランゲルハンス島においてもインスリンの分泌促進活性が確認された。実施例２５〜２７で検討したβ細胞株ＭＩＮ６のみならず正常膵臓ランゲルハンス島においてもＧＰＲ４０がインスリン分泌に関与していることが確認された。
【０１３７】
【実施例２９】ＧＰＲ４０を介したインスリン分泌におけるＣａ２＋イオンの必要性
実施例２５の方法に基づき、細胞外液中のＣａ２＋イオンの必要性について検討した。プレインキュベーションおよびサンプルとのインキュベーションにおいて、Ｃａ２＋イオンを抜き、さらにＣａ２＋イオンをキレートする試薬であるＥＧＴＡを０．１ｍＭ添加した場合の脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性を調べた。その結果、図２９に示す通り、通常のバッファーでは認められるオレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、γ−リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）によるインスリン分泌上昇活性がＣａ２＋イオン不含・０．１ｍＭ ＥＧＴＡ含有バッファーでは認められないことが確かめられた。このことから、脂肪酸によるＧＰＲ４０を介したインスリン分泌上昇活性にはＣａ２＋イオンが不可欠であることが確認された。
【０１３８】
【実施例３０】ＧＰＲ４０を介したインスリン分泌における各種阻害剤の効果
実施例２５の方法に基づき、Ｃａ２＋チャネルブロッカー（ニフェジピン、Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）およびＭＡＰキナーゼ阻害剤（ＰＤ９８０５９）の影響について検討した。プレインキュベーションおよびサンプルとのインキュベーションにおいて、Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ（１０μＭ）或いはＰＤ９８０５９（５０μＭ）を添加した場合の脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性を調べた。その結果、図３０に示す通り、通常のバッファーでは認められるオレイン酸（ｏｌｅｉｃａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）によるインスリン分泌上昇活性がニフェジピン含有バッファーでは認められなかった。これは実施例２９でＣａ２＋イオンを除去した際に得られた結果とも符合し、脂肪酸によるＧＰＲ４０を介したインスリン分泌上昇活性にはＣａ２＋イオンが不可欠であることが再び確認された。また、ＰＤ９８０５９含有バッファーでは通常のバッファーと同様の結果が得られたことから、ＭＡＰキナーゼが活性化されていない状態でも脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性は起こる、つまり、脂肪酸刺激によるＭＡＰキナーゼの活性化は、インスリン分泌上昇活性に必ずしも必要でないことが分かった。ＧＰＲ４０はインスリン分泌のみならず、β細胞の増殖などにも機能を発揮する可能性が考えられた。
【０１３９】
【実施例３１】ＧＰＲ４０を介したインスリン分泌におけるＢＳＡの影響
脂肪酸はアルブミンに結合する性質が知られている。実施例２５の方法に基づき、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が存在した場合の影響について検討した。プレインキュベーションおよびサンプルとのインキュベーションにおいて、バッファー中に０．１％ＢＳＡを添加し、脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性を調べた。その結果、図３１示す通り、通常のバッファーでは認められるオレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）によるインスリン分泌上昇活性が、０．１％ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ含有バッファーではほぼ抑制された。インスリン分泌上昇活性はＢＳＡに結合している脂肪酸よりはむしろ結合していない状態の脂肪酸により引き起こされることが分かった。ＢＳＡに結合するという脂肪酸特有の性質が反応性に反映された結果といえる。
【０１４０】
【実施例３２】ヒト、マウスおよびラット由来ＧＰＲ４０に対する脂肪酸のＥＣ５０値の決定
ＥＣ５０値の決定にはヒト、マウスおよびラット由来ＧＰＲ４０を安定発現したＣＨＯ細胞株を用いた。特に記載が無い限りこれらのＣＨＯ細胞株は１０％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むα−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。
アッセイ前日に、ほぼコンフルエントになるまで培養した細胞を、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリンスした後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ・ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥がし、遠心操作にて回収した。得られた細胞の数を測定し、培地１ｍＬあたり３ｘ１０５個の細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗｅｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔｅｒ）に１穴あたり１００μＬずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。このように調整したＣＨＯ細胞に各種試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施した。
まず、細胞に蛍光色素Ｆｌｕｏ３−ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）を添加するため、あるいはＦＬＩＰＲアッセイを行う直前に細胞を洗浄するためのアッセイバッファーを作成した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０００ｍＬに１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）（ＤＯＪＩＮ）２０ｍＬを加えた溶液（以下、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液）に、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍＬに溶解後、さらにＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍＬを加え混合した溶液１０ｍＬを添加し、この溶液をアッセイバッファーとした。次にＦｌｕｏ３−ＡＭ５０μｇを２１μＬ ＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μＬの牛胎児血清を添加した１０．６ｍＬのアッセイバッファーに加え、蛍光色素溶液を調製した。アッセイ前日にＢｌａｃｋ ｗｅｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにまきなおしたＣＨＯ細胞の培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μＬずつ分注後、ＣＯ２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した後、ＦＬＩＰＲにセットした。また、試験サンプルはアッセイバッファーを用いて調製し、終濃度が３０，１０，３，１，０．３μＭになるように希釈し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定した。そしてそれらの結果より、各脂肪酸での容量反応曲線を作成し、ＥＣ５０値を算出した。その結果を表１に示した。
【表１】
Figure 2004275001
【０１４１】
【実施例３３】ヒトおよびマウスＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞のｃＡＭＰ産生に対する脂肪酸の影響
ヒトおよびマウスＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞を、１×１０５／ｗｅｌｌの濃度で ９６−ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅで２０時間培養した。細胞は１００μｌのＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍＭ ＩＢＭＸ（和光純薬）および０．１ｍＭ Ｒｏ−２０−１７２４（Ｂｉｏｍｏｌ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で２回洗浄後、２μＭのフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、和光純薬）を含むまたは含まないＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒに溶解したＤＨＡ、リノール酸およびγ−リノレン酸（ともにＳＩＧＭＡ）を加えて３７℃で１０分間反応した。反応後、ｃＡＭＰ Ｓｃｒｅｅｎ（ＡＢＩ）の処方に従って細胞を溶解し、細胞内のｃＡＭＰ量を測定した。その結果、フォルスコリンを含まない条件では、各脂肪酸はヒトおよびマウスのＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞に対してｃＡＭＰ産生活性は示さなかった。一方、フォルスコリン存在下では、ヒトＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞に対しては弱いｃＡＭＰ産生抑制活性を示したが、マウスＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞に対しては活性を示さなかった（図３２）。
【０１４２】
【実施例３４】ＭＩＮ６を用いたＦＬＩＰＲアッセイ
フラスコ内で培養したマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６を、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いてはがした後、培地１ｍＬあたり３ｘ１０５個の細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗｅｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ｃｏｓｔｅｒ）に１穴あたり１００μＬずつ分注後、ＣＯ２培養器にて２日間培養した。培地は４．５ｇ／ｌのグルコースを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、インビトロゲン社）に１５％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社）、５．５μＭ ２−メルカプトエタノール（インビトロゲン社）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものを用いた。このように調整したＭＩＮ６細胞に各種脂肪酸（１０μＭ）を添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するための方法は、実施例２４に記載の方法に従った。その結果、ＧＰＲ４０のリガンドであるγ−リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の添加で、ＭＩＮ６の細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇することが確認された。一方、ＧＰＲ４０のリガンドではないリノール酸メチルや酪酸ではこのような活性は見られなかった（図３３）。
【０１４３】
【実施例３５】ＧＰＲ４０に対するアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法の設定およびアゴニスト候補を選択する基準
（１）細胞内カルシウム濃度変化を指標としたＧＰＲ４０に対するアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法の設定
ＧＰＲ４０に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索を行うための系を設定するために、アゴニストとして同定されたパルミチン酸を用いて、アッセイ系を設定した。
参考例１で作製したヒトＧＰＲ４０発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトＧＰＲ４０を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０ Ｎｏ．１０４）を３ｘ１０４個／１００μｌの細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて一晩培養した。細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。方法を以下に記載した。
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファー［ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）を２０ｍｌ添加し、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらに上記のＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し調製する。］に加え、蛍光色素溶液を調製した。細胞プレートの培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ２培養器にて３７℃で１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した。細胞に添加するパルミチン酸はアッセイバッファーを用いて各々の濃度に希釈し、プレートに分注した。アンタゴニスト測定用に１２μＭ γ−リノレン酸溶液（反応時の終濃度で３μＭ）をプレートに分注し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにてパルミチン酸添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定しアゴニスト作用を、続いてγ−リノレン酸を添加してアンタゴニスト作用の検討を行った。パルミチン酸はアゴニストであるために、パルミチン酸を用いた実験ではアンタゴニストの評価は成立しないが、アンタゴニスト作用のみもつ化合物を添加した場合には、後で加えるγ−リノレン酸の反応を抑制する活性が観測される。反応開始３０秒後もしくは４０秒後の蛍光強度値の変化を用いた用量反応曲線より、ＥＣ５０値を算出した。
（２）ＦＬＩＰＲアッセイの結果からアゴニスト候補を選択する基準
アゴニスト候補を選出するための被検体化合物は、予めその濃度が１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）で希釈し、測定時に上記のアッセイバッファーで希釈して使用した。そして、それらの被検体化合物を用いて上記と同様の方法で、参考例１で作製したヒトＧＰＲ４０発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトＧＰＲ４０を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０ Ｎｏ．１０４）、ヒトヒスタミンＨ１受容体発現ベクターを用いて自体公知の方法で作製したヒトヒスタミンＨ１受容体を発現させたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｈ１）、およびＭｏｃｋのＣＨＯ細胞株に対する反応開始３０秒もしくは４０秒後の蛍光強度値を測定した。さらに、３０μＭ γ−リノレン酸のＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０に対する蛍光強度を１００％としたときの相対値を算出し、その値がＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０に対し５０もしくは１００％以上であり、かつヒトヒスタミンＨ１受容体およびＭｏｃｋのＣＨＯ細胞株の両方が２５％以下を満たす被検体化合物をヒトＧＰＲ４０特異的アゴニスト候補とした。
【０１４４】
【実施例３６】マウスＧＰＲ４０の配列に特異的なｓｉＲＮＡ導入によるマウスＧＰＲ４０ｍＲＮＡの発現抑制
ＭＩＮ６細胞を２４ウェルプレートに撒いて一日培養した後、実施例１８の方法に基づきＨＶＪ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＥＣＴＯＲ ＫＩＴ ＧｅｎｏｍＯＮＥを用いてｍ４０ｉ１０３またはランダム配列ｓｉＲＮＡであるＳｃｒａｍｂｌｅ ＩＩ ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡを導入した。２日培養後、同細胞のｔｏｔａｌＲＮＡを実施例７と同様にＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）を用い、付属のマニュアルにしたがって調製した。得られたｔｏｔａｌＲＮＡ １μｇに対し１００ｎｇランダムヘキサマ−をプライマ−として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡを合成後、４０μｌＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解した。マウスＧＰＲ４０およびマウスＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量は実施例４に記載した方法で行った。その結果、図３４に示したように、ｍ４０ｉ１０３を導入させたＭＩＮ６胞では、ランダム配列のｓｉＲＮＡを導入したＭＩＮ６細胞よりＧＰＲ４０ｍＲＮＡの発現が低下していることが明らかとなった。
【０１４５】
【発明の効果】
本発明のＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩、または本発明のＧＰＲ４０もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、糖尿病などの予防・治療剤として有用である。
本発明のＧＰＲ４０、その部分ペプチドまたはその塩とリガンドである脂肪酸とを用いることによって、脂肪酸と本発明のＧＲＰ４０、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。
【０１４６】
【配列表フリーテキスト】
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【０１４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ファルネシン酸（ｆａｒｎｅｓｏｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図２】５．８．１１−ｅｉｃｏｓａｔｒｉｙｎｏｉｃ ａｃｉｄを添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図３】５．８．１１．１４−ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｎｏｉｃ ａｃｉｄを添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図４】リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図５】リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図６】アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図７】エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ＥＰＡ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図８】エイコサジエン酸（ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図９】エイコサトリエン酸（ｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図１０】ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＤＨＡ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図１１】ドコサトリエン酸（ｄｏｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図１２】アドレン酸（ａｄｒｅｎｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図１３】ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度、横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。○はＧＰＲ４０発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、△はコントロールのＣＨＯ−Ｋ１細胞を示す。
【図１４】ヒト各種組織でのＧＰＲ４０ｍＲＮＡの発現分布を示す。横軸はｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｎｇ）当たりのコピー数を示す。
【図１５】マウス各種細胞でのＧＰＲ４０ｍＲＮＡの発現分布を示す。Ｍｉｎ−６はＭＩＮ６細胞を、ＮＩＨ ｌｏｇはＮＩＨ／３Ｔ３の対数増殖期を、ＮｉＨｃｏｎｆはＮＩＨ／３Ｔ３の定常期を、Ｂ１０４ ｌｏｇはがん遺伝子ｎｅｕで形質転換させたＮＩＨ／３Ｔ３の対数増殖期を、Ｂ１０４ ｃｏｎｆはがん遺伝子ｎｅｕで形質転換させたＮＩＨ／３Ｔ３の定常期を、ｍＬｉｖｅｒはマウス肝臓を、ｍＳｐｌｅｅｎマウス脾臓 を示す。横軸は総ＲＮＡ（２５ｎｇ）当たりのコピー数を示す。（＋）は逆転写酵素添加を、（−）は逆転写酵素非添加を示す。
【図１６】ＭＩＮ６細胞をパルミチン酸、γ−リノレン酸またはポジティブコントロールであるグリベンクラミドで９０分間刺激したときのインスリン分泌の変化を調べた結果を示す。横軸は添加した化合物とその濃度（μＭ）を示す。縦軸はインスリン分泌濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図１７】ＭＩＮ６細胞をパルミチン酸、オレイン酸またはポジティブコントロールであるグリベンクラミドで６０分間刺激したときのインスリン分泌の変化を調べた結果を示す。横軸は添加した化合物とその濃度（μＭ）を示す。縦軸はインスリン分泌濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図１８】ラット膵臓およびランゲルハンス島におけるＧＰＲ４０ ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。膵臓全体は２匹の平均値で示した。
【図１９】カニクイザル膵臓およびランゲルハンス島におけるＧＰＲ４０ ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。膵臓全体は２匹の平均値で示した。
【図２０】脂肪酸によるＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０＃１０４でのＭＡＰキナーゼ活性化の検出結果を示す。γ−ｌｉｎｏはγ−リノレン酸を、Ｏｌｅはオレイン酸を、ＤＨＡは４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエン酸を、Ｍｅｔｈｙｌはリノール酸メチルを、Ｃ２は酢酸を示す。ＣＨＯ−ｍｏｃｋはヒトＧＰＲ４０を発現していないＣＨＯ細胞を、ＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０＃１０４はヒトＧＰＲ４０を発現しているＣＨＯ細胞株を示す。ｐ４４はｐ４４ＭＡＰキナーゼのバンドを、ｐ４２はｐ４２ＭＡＰキナーゼのバンドを示す。
【図２１】マウスＧＰＲ４０の配列に特異的なｓｉＲＮＡ導入によるマウスＧＰＲ４０−ＧＦＰ融合タンパク質の発現抑制を調べた結果を示す。ＭｏｃｋはＧＰＲ４０−ＧＦＰを導入していないコントロール細胞を示す。ＮｏＴＦはトランスフェクションを行わなかった細胞、Ｎｏ ｓｉはｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクションを示す。ｍ４０ｉ１０３およびｍ４０ｉ２５６はマウスＧＰＲ４０配列に特異的なｓｉＲＮＡを、ｓｉ ｓｃｒａｍｂｌｅ、ｓｉ ＧＬ２はネガティブコントロールとして添加したＧＰＲ４０の配列とは全く相同性を持たないｓｉＲＮＡを示す。縦軸はＧＰＲ４０の発現量（４５０ｎｍでの吸光度）を示す。Ｎ＝３で行った実験の平均値＋標準偏差で表した。
【図２２】ｍ４０ｉ１０３およびｍ４０ｉ２５６の配列を示す。
【図２３】ＧＰＲ４０遺伝子ターゲッティングベクターの構築図を示す。
【図２４】脂肪酸によるＭＩＮ６でのＭＡＰキナーゼ活性化の検出結果を示す。レーン１はコントロールを、レーン２はオレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）添加、レーン３はリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）添加、レーン４はγ−リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）添加、レーン５はリノール酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅ）添加、レーン６はリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）添加、レーン７はリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）＋ＰＤ９８０５９（５０μＭ）添加を示す。レーン１〜５は２．５分間、レーン６〜７は５分間インキュベートした結果である。各脂肪酸の濃度は１０μＭである。ｐ４４はｐ４４ＭＡＰキナーゼのバンドを、ｐ４２はｐ４２ＭＡＰキナーゼのバンドを示す。
【図２５】２２ｍＭのグルコースを含むＫＲＢＨで調製した各種脂肪酸によるＭＩＮ６からのインスリン分泌促進作用を示す。横軸のＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓは添加した脂肪酸の濃度（μＭ）を示す。Ｂａｓｅは無添加、Ｏｌｅｉｃはオレイン酸添加、Ｌｉｎｏｌｅｉｃはリノール酸添加、α−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃはα−リノレン酸添加、γ−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃはγ−リノレン酸添加、Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃはアラキドン酸添加、ＤＨＡはドコサヘキサエン酸添加、Ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅはリノール酸メチル添加、Ｂｕｔｙｒｉｃは酪酸添加の場合を示す。縦軸はインスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。値は平均＋標準誤差（ｎ＝４）を示す。＊＊はｐ＜０．０１を、＊はｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を示す。
【図２６】脂肪酸によるＭＩＮ６からのインスリン分泌促進活性のグルコース濃度依存性を示す。横軸は添加した脂肪酸（１０μＭ）の種類を示す。Ｂａｓｅは無添加、Ｏｌｅｉｃはオレイン酸添加、Ｌｉｎｏｌｅｉｃはリノール酸添加、Ｍｅｔｈｙｌはリノール酸メチル添加、Ｂｕｔｙｒｉｃは酪酸添加の場合を示す。Ｇｌｃはグルコースを示す。縦軸はインスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。値は平均＋標準誤差（ｎ＝４）を示す。＊＊はｐ＜０．０１を、＊はｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を示す。
【図２７】ｓｉＲＮＡ導入ＭＩＮ６における、脂肪酸によるインスリン分泌上昇活性の抑制効果を示す。横軸は添加した脂肪酸の濃度（μＭ）を示す。Ｂａｓｅは無添加、Ｌｉｎｏｌｅｉｃはリノール酸添加、Ｇａｍｍａ−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃはγ−リノレン酸添加、Ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅはリノール酸メチル添加の場合を示す。縦軸はインスリン分泌量を示し、Ｂａｓｅに対する％値で表した。□カラムはｍ４０ｉ１０３導入、■カラムはＳｃｒａｍｂｌｅ ＩＩ ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡ導入の場合をします。値は平均＋標準誤差（ｎ＝４）を示す。＊＊はｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ ｖｓ Ｂａｓｅ）を示す。
【図２８】脂肪酸によるラット膵臓ランゲルハンス島からのインスリン分泌促進作用を示す。横軸は添加した脂肪酸の濃度（μＭ）を示す。Ｂａｓｅは無添加、Ｌｉｎｏｌｅｉｃはリノール酸、γ−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃはγ−リノレン酸、Ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅはリノール酸メチルを示す。縦軸はｉｓｌｅｔ当たりのインスリン分泌量（ｎｇ）を示す。値はｎ＝３およびｎ＝４で計２回行った実験の総和で、平均＋標準誤差を示す。＊＊はｐ＜０．０１を、＊はｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を示す。
【図２９】脂肪酸によるＭＩＮ６からのインスリン分泌促進におけるＣａ２＋イオンの必要性を調べた結果を示す。横軸は添加した脂肪酸を示す。Ｂａｓｅは無添加、Ｏｌｅｉｃはオレイン酸、Ｌｉｎｏｌｅｉｃはリノール酸、γ−Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃはγ−リノレン酸、Ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅはリノール酸メチルを示す。左の群は２２ｍＭのグルコースを含むＫＲＢＨで調製した脂肪酸（１０μＭ）を添加した場合、ＥＧＴＡ／Ｃａ２＋ｆｒｅｅで示される右の群は２２ｍＭグルコースを含むＫＲＢＨでＣａ２＋イオンを除き０．１ｍＭ ＥＧＴＡを添加したＫＲＢＨで調製した脂肪酸（１０μＭ）を添加した場合を示す。縦軸はインスリン分泌量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。値は平均＋標準誤差（ｎ＝４）を示す。＊＊はｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ ｖｓ Ｂａｓｅ）を示す。
【図３０】脂肪酸によるＭＩＮ６からのインスリン分泌促進における各種阻害剤の効果を示す。横軸は添加した脂肪酸を示す。Ｂａｓｅは無添加、Ｏｌｅｉｃはオレイン酸、Ｌｉｎｏｌｅｉｃはリノール酸、Ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅはリノール酸メチルを示す。Ｎｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ群は２２ｍＭグルコース含有ＫＲＢＨで調製した脂肪酸（１０μＭ）を、Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ群は２２ｍＭグルコース含有ＫＲＢＨにニフェジピン（Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）１０μＭを添加したバッファーで調製した脂肪酸（１０μＭ）を、ＰＤ９８０５９群は２２ｍＭグルコース含有ＫＲＢＨにＰＤ９８０５９（５０μＭ）を添加したバッファーで調製した脂肪酸（１０μＭ）を添加した場合を示す。縦軸はインスリン分泌量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。値は平均＋標準誤差（ｎ＝４）を示す。＊＊はｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ ｖｓ Ｂａｓｅ）を示す。
【図３１】脂肪酸によるＭＩＮ６からのインスリン分泌促進におけるＢＳＡの影響を示す。横軸は添加した脂肪酸（１０μＭ）を示す。Ｂａｓｅは無添加、Ｏｌｅｉｃはオレイン酸、Ｌｉｎｏｌｅｉｃはリノール酸、Ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅはリノール酸メチルを示す。Ｎｏ ＢＳＡはバッファーにＢＳＡを添加しない条件を、０．１％ ＢＳＡは０．１％ ＢＳＡを添加した条件下を示す。縦軸はインスリン分泌量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。値は平均＋標準誤差（ｎ＝４）を示す。＊＊はｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ ｖｓ Ｂａｓｅ）を示す。
【図３２】ヒトＧＰＲ４０発現ＣＨＯ 細胞（ＣＨＯ−ｈＧＰＲ４０；左）およびマウスＧＰＲ４０発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｍＧＰＲ４０；右）のｃＡＭＰ産生に対する各種脂肪酸の影響を示す。横軸のＦＦＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（μＭ）は添加した脂肪酸の濃度を示す。縦軸は９６−ｗｅｌｌプレート１ｗｅｌｌ当りのｃＡＭＰ量（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）を示す。実線は２μＭ フォルスコリン存在下を、点線はフォルスコリン非存在下を示す。●はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、◇はリノール酸、□はγ−リノレン酸をそれぞれ添加した場合を示す。＊はｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）を示す。
【図３３】ＭＩＮ６細胞に各種脂肪酸を添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を調べた結果を示す。縦軸は細胞内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光強度を示す。横軸はサンプル添加後の時間経過を示す。□はγ−リノレン酸（γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、◇はリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、■はリノール酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｌｉｎｏｌａｔｅ）、△はオレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、▲はアラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、●はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、○は酪酸（ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）をそれぞれ添加した場合を示す。
【図３４】マウスＧＰＲ４０の配列に特異的なｓｉＲＮＡ導入によるマウスＧＰＲ４０ｍＲＮＡの発現抑制を示す。横軸のｍ４０ｉ１０３はマウスＧＰＲ４０に特異的なｓｉＲＮＡを、またＳｃｒａｍｂｌｅは対照となるランダム配列ｓｉＲＮＡのＳｃｒａｍｂｌｅ ＩＩ ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡを示す。縦軸のｍＲＮＡの発現量（ＧＲＰ４０／ＧＡＰＤＨ）はＧＰＲ４０の発現量のＧＡＰＤＨに対する相対値（ｎ＝２＋ＳＥＭ）を示す。

Claims (136)

  1. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。
  2. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。
  3. 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。
  4. 配列番号：１７で表されるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。
  5. 配列番号：２９で表されるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩。
  6. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
  7. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  8. 請求項３記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ。
  9. 請求項４記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ。
  10. 請求項５記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ。
  11. 配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
  12. 配列番号：１８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
  13. 配列番号：３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
  14. 請求項７記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  15. 請求項１４記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
  16. 請求項１５記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を生成せしめることを特徴とする請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法。
  17. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
  18. 請求項７記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  19. 請求項７記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
  20. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
  21. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のＣ末端ペプチドまたはその塩を認識するモノクローナル抗体である請求項２０記載の抗体。
  22. 配列番号：３３で表わされるペプチドまたはその塩を認識するモノクローナル抗体である請求項２０記載の抗体。
  23. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である請求項２０記載の抗体。
  24. 請求項２０記載の抗体を含有してなる診断薬。
  25. 請求項２０記載の抗体を含有してなる医薬。
  26. 請求項７記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド。
  27. 請求項２６記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
  28. 請求項２６記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  29. 請求項７記載のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ。
  30. 配列番号：３４で表わされる塩基配列からなるセンス鎖と配列番号：３５で表わされる塩基配列からなるアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡである請求項２９記載のｓｉＲＮＡ。
  31. 配列番号：３６で表わされる塩基配列からなるセンス鎖と配列番号：３７で表わされる塩基配列からなるアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡである請求項２９記載のｓｉＲＮＡ。
  32. 請求項２９記載のｓｉＲＮＡを含有してなる診断薬。
  33. 請求項２９記載のｓｉＲＮＡを含有してなる医薬。
  34. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤。
  35. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤。
  36. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤。
  37. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる膵β細胞保護剤。
  38. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膵臓機能調節剤。
  39. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤。
  40. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤。
  41. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膵β細胞保護剤。
  42. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、高脂血症、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性または癌の診断薬。
  43. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、脂肪毒性または癌の診断薬。
  44. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる膵臓機能調節剤。
  45. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤。
  46. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる膵臓機能調節剤。
  47. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤。
  48. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）脂肪酸またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  49. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）脂肪酸またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  50. 請求項４８記載のスクリーニング方法または請求項４９記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、脂肪酸またはその塩と配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
  51. アゴニストである請求項５０記載の化合物またはその塩。
  52. アンタゴニストである請求項５０記載の化合物またはその塩。
  53. 請求項５０記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  54. 脂肪酸またはその塩と配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤。
  55. 請求項５１記載のアゴニストを含有してなる医薬。
  56. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤。
  57. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤。
  58. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる膵β細胞保護剤。
  59. 請求項５２記載のアンタゴニストを含有してなる医薬。
  60. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤。
  61. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  62. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  63. 請求項６１記載のスクリーニング方法または請求項６２記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩。
  64. 請求項６１記載のスクリーニング方法または請求項６２記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩。
  65. 請求項６１記載のスクリーニング方法または請求項６２記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩。
  66. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤。
  67. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤。
  68. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなるインスリン分泌促進剤または血糖低下剤。
  69. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる膵β細胞保護剤。
  70. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させ、膵臓機能を調節する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤。
  71. 試験化合物を配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ抑制活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。
  72. 請求項７１記載の決定方法で得られるリガンド。
  73. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
  74. （１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする請求項７３記載のスクリーニング方法。
  75. （１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする請求項７３記載のスクリーニング方法。
  76. （１）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする請求項７３記載のスクリーニング方法。
  77. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。
  78. 請求項７３記載のスクリーニング方法または請求項７７記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト。
  79. 請求項７３記載のスクリーニング方法または請求項７７記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト。
  80. 請求項７８記載のアゴニストを含有してなる医薬。
  81. 請求項７９記載のアンタゴニストを含有してなる医薬。
  82. 試験化合物が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物である請求項７４〜７６記載のスクリーニング方法。
  83. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法。
  84. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、▲１▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲２▼インスリン分泌促進薬、▲３▼血糖低下薬または▲４▼膵β細胞保護が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法。
  85. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法。
  86. 各薬を該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、各薬と該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする請求項８３〜８５記載の確認方法。
  87. （１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（２）各薬および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする請求項８３〜８５記載の確認方法。
  88. （１）▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）各薬および▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、▲１▼標識された脂肪酸またはその塩または▲２▼該標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする請求項８３〜８５記載の確認方法。
  89. （１）▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）各薬および▲１▼脂肪酸またはその塩または▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩と脂肪酸またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする請求項８３〜８５記載の確認方法。
  90. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認するためのキット。
  91. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストである、▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬。
  92. （１）▲１▼配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、または（および）▲２▼配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩、と（２）▲１▼膵臓機能調節薬、▲２▼糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療薬、▲３▼インスリン分泌促進薬、▲４▼血糖低下薬、▲５▼膵β細胞保護薬または▲６▼肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療薬、とを組み合わせてなる医薬。
  93. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする外来性のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物。
  94. 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項９３記載の動物。
  95. ゲッ歯動物がマウスまたはラットである請求項９４記載の動物。
  96. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
  97. 該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された請求項９６記載の胚幹細胞。
  98. ネオマイシン耐性である請求項９６記載の胚幹細胞。
  99. 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項９６記載の胚幹細胞。
  100. ゲッ歯動物がマウスである請求項９９記載の胚幹細胞。
  101. 請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。
  102. 該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が該ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる請求項１０１記載の非ヒト哺乳動物。
  103. 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１０１記載の非ヒト哺乳動物。
  104. ゲッ歯動物がマウスである請求項１０３記載の非ヒト哺乳動物。
  105. 請求項１０２記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする請求項１記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  106. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）エイコサノイドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  107. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）エイコサノイドを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  108. 請求項１０６記載のスクリーニング方法または請求項１０７記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、エイコサノイドと配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
  109. アゴニストである請求項１０８記載の化合物またはその塩。
  110. アンタゴニストである請求項１０８記載の化合物またはその塩。
  111. 請求項１０８記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  112. エイコサノイドと配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる膵臓機能調節剤。
  113. 請求項１０９記載のアゴニストを含有してなる医薬。
  114. 請求項１１０記載のアンタゴニストを含有してなる医薬。
  115. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
  116. （１）▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする請求項１１５記載のスクリーニング方法。
  117. （１）▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、▲１▼標識されたエイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる標識された化合物またはその塩と、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分との結合量を測定することを特徴とする請求項１１５記載のスクリーニング方法。
  118. （１）▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（２）試験化合物および▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を、該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、細胞内Ｃａ２＋濃度上昇活性または細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする請求項１１５記載のスクリーニング方法。
  119. （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）▲１▼エイコサノイドまたは▲２▼該レセプター蛋白質またはその塩とエイコサノイドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする、該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。
  120. 請求項１１５記載のスクリーニング方法または請求項１１９記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト。
  121. 請求項１１５記載のスクリーニング方法または請求項１１９記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト。
  122. 請求項１２０記載のアゴニストを含有してなる医薬。
  123. 請求項１２１記載のアンタゴニストを含有してなる医薬。
  124. 試験化合物が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物である請求項１１６〜１１８記載のスクリーニング方法。
  125. 哺乳動物に対して、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膵臓機能調節方法。
  126. 哺乳動物に対して、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療方法。
  127. 哺乳動物に対して、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするインスリン分泌促進方法または血糖低下方法。
  128. 哺乳動物に対して、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膵β細胞保護剤。
  129. 哺乳動物に対して、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
    （５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膵臓機能調節方法。
  130. 哺乳動物に対して、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
    （５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療方法。
  131. 膵臓機能調節剤を製造するための、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用。
  132. 糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良または記憶学習障害の予防・治療剤を製造するための、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用。
  133. インスリン分泌促進剤または血糖低下剤を製造するための、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用。
  134. 膵β細胞保護剤を製造するための、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニスト、または
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用。
  135. 膵臓機能調節剤を製造するための、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
    （５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用。
  136. 肥満、高脂血症、２型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノーマ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性または癌の予防・治療剤を製造するための、
    （１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
    （２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
    （３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、
    （４）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト、または
    （５）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用。
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