JP6282591B2 - 遺伝子ノックイン非ヒト動物 - Google Patents
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Description
(a)被験物質を、[7]に記載の非ヒト動物に投与する工程と、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、
とを含んで成る方法。
(a)被験物質を、[1]〜[7]のいずれか1つに記載の非ヒト動物に投与する工程と、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物における被験物質の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。
(a)被験物質を、[2]〜[7]のいずれか1つに記載の非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−6受容体の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。
(a)ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体を生産する工程、
(b)前記抗体を、[7]に記載の非ヒト動物に投与する工程、
(c)前記抗体を投与した非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、および
(d)ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の症状を抑制する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。
(a)ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体を生産する工程、
(b)前記抗体を、[2]〜[7]のいずれか1つに記載の非ヒト動物に投与する工程、
(c)前記抗体を投与した非ヒト動物における前記抗体の血中濃度を測定する工程、
、および
(d)所望の血中濃度を有する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。
(a)ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体を生産する工程、
(b)前記抗体を、[2]〜[7]のいずれか1つに記載の非ヒト動物に投与する工程、
(c)前記抗体を投与した非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−6受容体の血中濃度を測定する工程、および
(d)可溶型ヒトインターロイキン−6受容体の血中濃度を低下させる抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。
(1)ノックインベクターの構築
マウスインターロイキン−6遺伝子(Il6ra)のゲノム領域がクローニングされている大腸菌人工染色体(BAC)クローンを用いた。このBAC上のマウスIl6ra遺伝子の標的領域に、ヒトインターロイキン−6受容体遺伝子のコーディング配列(GeneBank#NM000565)、hp7配列、ポリA付加シグナル、loxP配列、ネオマイシン耐性(neo)遺伝子カセットおよびloxPの順に接続したDNA断片を、Red/ETシステム(GeneBridges)を利用して相同組換えにて挿入した。その際、BAC上のマウスIl6ra遺伝子のエクソン1に存在する翻訳開始点とヒトIL6R遺伝子の翻訳開始点を一致させるように挿入し、かつマウスIl6ra遺伝子のエクソン1内部の翻訳開始点以降の塩基配列を40塩基対だけ欠損させた。なお、薬剤耐性遺伝子であるneoにはpgk遺伝子のプロモータが付加されており、ES細胞内ではneo遺伝子が発現する。しかしながら、neo遺伝子は上流に導入したhIL6R遺伝子の発現を抑制する可能性が予測される。そこで、後に、neo遺伝子を除去できるように、neo遺伝子の両側にはloxP配列(ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(配列番号:2))を配置した。Creを作用させると組換えによって、loxP配列の間に挟まれたneo遺伝子が除去される仕組みになっている。次いで、ノックインベクターを線状化可能とするため、BAC上のマウスIl6ra遺伝子の5‘側上流の領域に制限酵素NotI認識配列(GCGGCCGC)をアンピシリン耐性遺伝子とともに挿入した。
ES細胞(129SvEvマウス由来)に上記のhIL6Rノックインベクターをエレクトロポレーションにより導入し、G418による選択培養後に得られた薬剤耐性クローンより、相同組換え体をPCR法によってスクリーニングした。ノックインベクターは、60μgをNotIで直鎖状化し、フェノール/クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させPBSに溶解して用いた。
相同組換えESクローンをトリプシン処理により浮遊させ、ES細胞培地で洗浄した。48時間間隔で5IUのウマ絨毛ゴナドトロピン(eCG)およびヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)を腹腔内投与することにより、過剰***処理を施したC57BL/6J(B6)の雌マウスを同系統の雄マウスと交配した。雌マウスのプラグが確認された日を0.5日とし、妊娠2.5日に子宮および卵管を灌流し、8細胞期から桑実期の胚を回収した。回収した胚を37℃にて一晩培養し、胚盤胞に発生した胚を宿主胚として10〜15個のES細胞を注入した。注入後の胚は、偽妊娠2.5日齢のICR系の受容雌の子宮内に移植し、17日後に産仔を得た。ES細胞の胚盤胞への注入により得られた産仔の毛色での判別により、組換えES細胞(野生色)とホスト胚盤胞由来の細胞(黒色)の混在したキメラマウスが得られた。雄キメラマウスは性成熟後にB6雌マウスと交配し、ノックインアレルの次世代マウスへの伝達を、次世代マウスの尾より抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCR法により確認した。PCRは上述の相同組換えES細胞のスクリーニングの際に利用した方法にて実施した。その結果、2.2kbのシグナルが検出された個体が得られ、これら個体にはノックインアレルが伝達していることが確認された。
ノックインアレルの伝達が確認された個体の繁殖により得た受精卵の前核に組換酵素Cre発現ベクターを顕微注入することによって、neo遺伝子カセットを除去した。すなわち、一過性にCreを発現させることによって、ノックインアレルに配置した2ヶ所のloxP間の組換えが誘導され、neo遺伝子カセットが除去される。Cre発現ベクターの顕微注入後の受精卵は、偽妊娠0.5日のICR系受容雌の卵管内に移植し、19日後に産仔を得た。neo遺伝子カセットの除去の確認は、産仔の離乳後に採取した尾より抽出したゲノムDNAを用いてPCR法によって実施した。
neo遺伝子カセットの除去が確認されたマウスの繁殖により、ノックインアレルをホモ接合体化した個体を得た。ホモ接合体の確認はPCRにて行った。PCR反応はneo遺伝子カセットの除去を確認した際の反応系と同様に実施した。ホモ接合体ではノックインアレルに由来する2.7kbのシグナルは検出されるが、野生型アレル由来の0.8kbのシグナルは検出されないことを指標として、ホモ接合体を確認した(図2)。
−組織RNAを用いたRT−PCR法での確認−
ホモ接合体のノックインマウスおよび野生型マウスの組織RNAを用いてRT−PCR法によりヒトIL6RおよびマウスIl6raの発現を解析した。肝臓、脾臓、胸腺、腎臓、心臓および肺より組織RNAを調製した。各1μgの組織RNAを鋳型として、SuperScript II First Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)により、Oligo dT(20)プライマーを用いて逆転写反応を行なうことによってcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型としてPCRを行なうことによって、ヒトIL6RおよびマウスIl6raを検出した。ヒトIL6Rの検出は、ノックインアレルにおけるhIL6R遺伝子の挿入位置である翻訳開始点よりも上流側の5’非翻訳領域に設定したフォワードプライマー6RIK−s1(5’−CCCGGCTGCGGAGCCGCTCTGC−3’(配列番号:7))およびヒトIL6R特異的なリバースプライマーRLI6−a1(5’−ACAGTGATGCTGGAGGTCCTT−3’(配列番号:8))の組合せを使用して実施した。一方、マウスIl6raの検出は、上述のフォワードプライマー6RIK−s1およびマウスIl6ra特異的なリバースプライマー6RLIcA2(5’−AGCAACACCGTGAACTCCTTTG−3’(配列番号:9))の組合せを使用して実施した。PCR反応液の組成は、サンプル1μl、2×GC緩衝液I 12.5μl、dNTP(2.5mM)4μl、プライマー(各50μM)各0.25μl、LA Taq(TAKARA)0.25μl、および蒸留水6.75μl(全25μl)とした。また、PCR条件は、94℃にて2分間の前加熱、94℃にて30秒間、62℃にて30秒間、72℃にて1分間の増幅サイクル30サイクル、並びに72℃にて5分間の複加熱とした。ヒトIL6Rの増幅産物は880bp、マウスIl6raの増幅産物は846bpに検出されるが、ホモ接合体のhIL6Rノックインマウスの各組織ではヒトIL6Rのみが検出され、マウスIl6raは検出されなかった。また、野生型マウスの各組織からはヒトIL6Rは検出されず、マウスIl6raのみが検出された(図3)。この結果より、デザイン通りにノックインベクターが相同組換えを起こし、マウスIl6raのかわりにヒトIL6Rが発現するマウスが得られたことが確認された。
イソフルラン吸入麻酔下にて開腹し、腹部大静脈より採取した血液より分離した血漿中の可溶型ヒトIL6R濃度を、Quantikin Human IL−6sR Immunoassay Kit(R&D Systems)を用いて測定した。その結果、血漿中可溶型hIL6R濃度は、ホモ型のノックインマウスでは22.1±5.0 ng/ml、ヘテロ型ノックインマウスでは11.5±4.1 ng/mlと定量された。なお、野生型マウスにおいては血漿中に可溶型hIL6Rは検出されなかった(図4)。ホモ型ノックインマウスでは、ヒトにおいて報告されている血中濃度と同等の濃度(Nishimoto N. et. al. (2008) Blood.112:3959−3969)であった。
ホモ型ノックインマウスおよび野生型マウスに、4μg/体重kgとなるようマウスIL6あるいはヒトIL6を腹腔内投与し、その6時間後に採血して、血中の血清アミロイドA(SAA)濃度を、SAA ELISA Kit(Invitrogen)を用いて定量した。なお、投与用IL6の溶媒としては、マウス血漿が0.5%となるようにリン酸緩衝生理食塩液(PBS)に添加した溶液を使用し、溶媒のみを投与する対照群を設けた。その結果、ホモ型ノックインマウスはヒトIL6にのみ反応して血漿SAAレベルの上昇が認められたが、マウスIL6に対する反応性は認められなかった(図5)。一方、野生型マウスはヒトIL6にもマウスIL6にも反応して血漿SAAレベルの上昇が認められた(図5)。マウスIl6raはマウスIL6にもヒトIL6にも結合する一方、ヒトIL6RはヒトIL6に結合するがマウスIL6には結合しないことが知られており、本実験の結果は、この知見に合致するものである。従って、ホモ型ノックインマウスでは、設計通り、マウスIl6raが発現せず、代わりにヒトIL6Rが発現し、かつ機能していることが明らかとなった。
(1)ヒト化キャッスルマン病モデルマウスの樹立
hIL6Rノックインマウスを、H−2Ld ヒトIL6トランスジェニックマウス(Cytokine. 2002,Dec. 21;20(6):304−311)と交配することによりダブルトランスジェニックマウスを作出した。各個体の組織より抽出したゲノムDNAを用いてPCR法により遺伝子型を解析し、ホモ型のhIL6Rノックインアレルを有し、かつhIL6トランスジーンを有する個体を選別した。hIL6Rノックインアレルの検出には上述のPCR反応系を利用した。すなわち、PCR反応液組成はサンプル1μl、2×GC緩衝液I 12.5μl、dNTP(2.5mM)4μl、プライマー(各50μM)各0.25μl、LA Taq(TAKARA)0.25μl、および蒸留水6.75μl(全25μl)とした。また、PCR条件は、94℃にて4分間の前加熱、94℃にて30秒間、62℃にて30秒間、72℃にて3分間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。プライマーはmRLI6_10355(5’−TCTGCAGTAGCCTTCAAAGAGC−3’(配列番号:10))およびmRLI6_11166R(5’−AACCAGACAGTGTCACATTCC−3’(配列番号:11))を使用した。PCR反応により、ノックインアレルは約2.7kbのシグナル、野生型アレルは0.8kbのシグナルとして検出された(図6)。さらに、PCR法によりhIL6トランスジーンの検出を行なった。すなわち、PCR反応液組成は、サンプル1μl、10×Ex緩衝液2.5μl、dNTP(2.5mM)2μl、プライマー(各50μM)各0.1μl、Ex Taq(TAKARA)0.25μl、および蒸留水19.05μl(全25μl)とした。PCR条件は、94℃にて4分間の前加熱、94℃にて30秒間、65℃にて30秒間、72℃にて30秒間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。プライマーは、フォワードプライマーとして「5‘−ACCTCTTCAGAACGAATTGACAAA−3’(配列番号:12))」を、リバースプライマーとして「5‘−AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGT−3’(配列番号:13)」を使用した。hIL6トランスジーンは0.45kbの鎖長に検出された(図6)。ホモ型のhIL6Rノックインアレルを有し、かつhIL6トランスジーンを有するマウスでは、キャッスルマン病様の症状、すなわち全身のリンパ節の腫脹および脾臓の腫大が確認された。以上から、病態の原因がヒトIL6の過剰産生であり、その受容体であるIL6Rもヒト型化されているヒト型化キャッスルマン病モデルマウスが樹立できた。
上述のヒト型化キャッスルマン病モデルマウスを用いてhIL6R中和抗体の薬効評価が可能かどうかの検討を実施した。ヒト化キャッスルマン病モデルマウスへ4週齢時に2mg/bodyのヒト型化抗ヒトIL6Rモノクローナル抗体(トシリズマブ、以下TCZ)を尾静脈内投与し、その翌週より0.1、0.25あるいは0.5mg/bodyのTCZを2回/週の頻度にて4週間、皮下投与した。比較対照として、4週齢時に2mg/bodyのラット抗マウスIl6raモノクローナル抗体(MR16−1)を尾静脈内投与し、その翌週より0.1mg/bodyのMR16−1を2回/週にて4週間皮下投与した。溶媒の生理食塩液を投与する群も設定した。さらにIl6raについて野生型、かつhIL6トランスジーンを有するマウスにも上記と同様の抗体投与を実施した。また、hIL6RノックインマウスあるいはIl6raの野生型マウスで、hIL6トランスジーンを有していないマウスを、病態を発症しない対照群として用い、同様のプロトコールにて生理食塩液の投与のみ実施した。なお、いずれの実験群も5匹の個体を使用した。最終投与の4日後にイソフルラン吸入麻酔下にて開腹し、全採血後に放血することによって安楽死処置し、脾臓を採取した。採取した血液はヘパリン血漿を分離し、−80℃フリーザにて保存した。脾臓は重量測定し、一部をRNA調製用として−80℃に凍結保存して、残りは10%中性緩衝ホルマリン液に浸漬した。
剖検の際に得られた血漿サンプルを用いて抗TCZ抗体タイターを測定した。すなわち、血漿サンプルをビオチン標識TCZ抗体およびSULFO−TAG標識TCZ抗体と混合して一晩インキュベーションした後に、MSD−ストレプトアビジンプレートに添加した。次いで、ECL(enhanced chemiluminescence)基質を添加して化学発光の強度を測定した。その結果、インターロイキン−6受容体が野生型のhIL6トランスジェニックマウスではTCZ投与により、いずれの用量においても極めて高い抗TCZ抗体タイターを呈したのに対し、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスではTCZのいずれの用量においても抗TCZ抗体の産生は極めて抑制されていた(図10)。このことにより、TCZの作用によってインターロイキン−6からのシグナルを遮断することによって抗TCZ抗体の産生を抑制されることが明らかとなった。
(1)ノックインベクターの構築
マウスPou5f1遺伝子のエクソン1に存在する翻訳開始点とネオマイシン耐性(neo)遺伝子の翻訳開始点を一致させるようにネオマイシン耐性(neo)遺伝子を挿入し、かつマウスPou5f1遺伝子のエクソン1内部の翻訳開始点以降の塩基配列を107塩基対だけ欠損させたノックインベクターを構築した。その際、neo遺伝子の終止コドンの直下にhp7配列、ポリA付加シグナルを接続したhp7pAベクターと、hp7配列、ポリA付加シグナルを接続せず、内因性のポリA付加シグナルを利用するコントロールベクターとを構築した。また、ノックインベクターの相同アームとして、Pou5f1遺伝子の上述の翻訳開始点よりも1.7kb上流までのゲノムDNA、およびエクソン1の欠損領域以降の約5kbのゲノムDNAを接続した構造とし、ベクターpMC1DTA(A+T/pau)(Yagi T. et.al.(1993) Anal Biochem. 214:77−86)に挿入した。ノックインベクター上の相同アームの5‘端に制限酵素NotI認識配列(GCGGCCGC)を作製しているので、NotIにて線状化可能である。ベクターの構造を図11Aに示す。
ES細胞(C57BL/6Nマウス由来)に上記のノックインベクターをエレクトロポレーションにより導入し、G418による選択培養を行なった。ノックインベクターはNotIで線状化し、フェノール/クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させPBSに溶解して用いた。なお、ES細胞2×107個に対して、20μgのノックインベクターが導入されるように濃度を調製してエレクトロポレーションを行なった。なお、それぞれのベクターについて、ES細胞へのエレクトロポレーションは、再現性を確認するために、各2回実施した。エレクトロポレーション後にES細胞を播種し、その24時間後より、G418を300μg/mLとなるように培地に添加して選択培養を行なった。
hp7pAベクターに由来するES細胞コロニーをピックアップして、相同組換えの効率を検討した。すなわち、ES細胞を96穴プレートで培養し、1ウェルあたり200μlのPBS溶液で2回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液(10×LA緩衝液II(TAKARA LA Taq用)5μl;5% NP−40 5μl;プロティナーゼK(TAKARA,20mg/ml)4μl;蒸留水36μl)を加えて55℃2時間処理し、続いて95℃にて15分処理することで、プロティナーゼKを失活させてPCRサンプルとした。
<223> hp7配列
配列番号3〜15
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
Claims (17)
- 任意の外来遺伝子をコードするDNAの3’側にhp7配列をコードするDNAおよびポリA付加シグナルをコードするDNAが付加されたDNAを、非ヒト哺乳動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入したことを特徴とする非ヒト哺乳動物。
- 前記外来遺伝子がヒトインターロイキン−6受容体遺伝子である、請求項1に記載の非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子がインターロイキン−6受容体遺伝子である、請求項1〜2のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物。
- 健常なヒトにおける可溶型インターロイキン−6受容体の血中濃度と同等の血中濃度で可溶型ヒトインターロイキン−6受容体を発現する、請求項2〜3のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物。
- 非ヒト哺乳動物がげっ歯類である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物。
- 非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物。
- ヒトインターロイキン−6を過剰発現させた、請求項1〜6のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物。
- 被験物質における、ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の治療効果を評価する方法であって、
(a)被験物質を、請求項7に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程と、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト哺乳動物において、ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、
とを含んで成る方法。 - ヒトインターロイキン−6あるいはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患がキャッスルマン病である、請求項8に記載の方法。
- 被験物質の薬物動態学的特性を評価する方法であって、
(a)被験物質を、請求項1〜7のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程と、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト哺乳動物における被験物質の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。 - 被験物質における、血中から可溶型ヒトインターロイキン−6受容体を除去する活性を評価する方法であって、
(a)被験物質を、請求項2〜7のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト哺乳動物において、可溶型ヒトインターロイキン−6受容体の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。 - 被験物質がヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体である、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の治療効果を有する、ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体の生産方法であって、
(a)ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体を生産する工程、
(b)前記抗体を、請求項7に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程、
(c)前記抗体を投与した非ヒト哺乳動物において、ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、および
(d)ヒトインターロイキン−6またはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患の症状を抑制する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。 - ヒトインターロイキン−6あるいはヒトインターロイキン−6受容体に起因する疾患がキャッスルマン病である、請求項13に記載の方法。
- 所望の薬物動態学的特性を有する、ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体の生産方法であって、
(a)ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体を生産する工程、
(b)前記抗体を、請求項2〜7のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程、
(c)前記抗体を投与した非ヒト哺乳動物における前記抗体の血中濃度を測定する工程、
、および
(d)所望の血中濃度を有する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。 - 血中から可溶型ヒトインターロイキン−6受容体を除去する活性を有する、ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体の生産方法であって、
(a)ヒトインターロイキン−6受容体に対する抗体を生産する工程、
(b)前記抗体を、請求項2〜7のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物に投与する工程、
(c)前記抗体を投与した非ヒト哺乳動物において、可溶型ヒトインターロイキン−6受容体の血中濃度を測定する工程、および
(d)可溶型ヒトインターロイキン−6受容体の血中濃度を低下させる抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。 - (e)選抜された抗体をキメラ化、またはヒト型化する工程をさらに含んで成る、請求項13〜16のいずれか1項に記載の抗体の生産方法。
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