JPH11285332A - ベータセルリン遺伝子の発現不全動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ＢＴＣ発現不全非ヒト動物およびＢＴＣ遺伝子
転移非ヒト動物の提供。 【解決手段】不活性化ＢＴＣ遺伝子を有することを特徴
とする非ヒト動物胚幹細胞、不活性化ＢＴＣ遺伝子を有
することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物、
外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだ
ＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト動物、ＢＴＣ
の欠損に起因する疾病に予防・治療薬のスクリーニング
方法、ＢＴＣプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法および該スクリ
ーニング方法で得られる化合物またはその塩、および遺
伝治療用医薬に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、不活性化ベータセ
ルリン遺伝子配列を有することを特徴とするトランスジ
ェニック非ヒト動物ならびに当該遺伝子配列を有するそ
の子孫、該遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト
動物胚幹細胞、外来性ベータセルリン遺伝子またはその
変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有することを特徴とす
る非ヒト動物ならびに該ＤＮＡを有するその子孫、外来
性ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を含有
し、動物において発現しうるベクターを含有してなる遺
伝子治療用医薬、ベータセルリンの欠損に起因する疾病
の予防・治療薬のスクリーニング方法、ベータセルリン
プロモーター活性を促進または阻害する化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用
いて得られるベータセルリンプロモーター活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩などに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子工学的技術の発展ならびに分子生
物学の知識の急激な蓄積に伴い、遺伝子を人為的に操作
し、さらに動物個体へ導入することが可能になり〔Gord
on, J.W.ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.)，第77巻，7380-7384頁（198
0）〕、元来その生物に備わっていない外来性の遺伝形
質を人為的に付加、あるいは生物が持っている内在性の
遺伝形質の発現を抑制する方法も開発されるに至り、様
々な形質転換動物が作り出され、形質転換動物として報
告されている。このような形質転換動物は、遺伝子工学
等の技術によって単離されたクローン化された様々な遺
伝子の機能を明らかにする上で、これまで株化細胞や初
代培養細胞など体外培養細胞を用いていたため、得られ
る知見が限られていた遺伝子の機能解析について、個体
レベルでの研究が可能となる点で重要である。特に、ク
ローン化された遺伝子の生物体内での生理学的機能の解
析や遺伝子疾患のモデル系としてこの形質転換動物を利
用した実験や研究が盛んになってきている。

【０００３】遺伝子導入動物は、動物またはこの動物の
先祖の胚芽ラインの中へ初期（通常、単細胞）発育段階
において導入された遺伝子を有している。例えば、
（１）ワグナー（Wagner）等〔プロシーデイングス オ
ブ ナショナル・アカデミー オブ サイエンス（Pro
c. Nat. Acad. Sc. U.S.A.,）第78巻、第5016頁、198
1〕およびスチュワート（Stewart）等〔1982、サイエン
ス（Science）、第217巻、第1046頁〕は、ヒトグロビン
遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（２）コンスタ
ンチーニ（Constantini）等〔ネイチャー（Nature）第2
94巻、第92頁、1981〕およびレーシ（Lacy）等〔セル
（Cell）第34巻、第343頁、1983〕は、ウサギグロビン
遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（３）マックナ
イト（McKnight）等〔セル（Cell）第34巻、第335頁、1
983〕はトランスフェリン遺伝子を含有する遺伝子導入
マウスを、（４）ブリンスター（Brinstar）等〔ネイチ
ャー（Nature）第306巻、第332頁、1983〕は、機能的に
導入された免疫グロブリン遺伝子を含有する遺伝子導入
マウスを、（５）パルミター（Palmiter）等〔ネイチャ
ー（Nature）第300巻、第6ll頁、1982〕は、重金属誘発
性メタロチオネインプロモーター配列に結合されたラッ
ト成長ホルモン遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、
（６）パルミター等〔セル（Cell）第29巻、第701頁、1
982〕は、メタロチオネインプロモーター配列に結合さ
れたチミジンキナーセ遺伝子を含有する遺伝子導入マウ
スを、（７）パルミター等〔サイエンス（Science）第2
22巻、第809頁、1983〕は、メタロチオネインプロモー
ター配列に融合されたヒト成長ホルモン遺伝子を含有す
る遺伝子導入マウスを記載している。

【０００４】胚幹細胞（Embryonic stem cell：以下、
ＥＳ細胞と略記する）は、受精後の初期胚である胚盤胞
の内部に存在する内部細胞塊から樹立され、未分化状態
を保ったまま増殖、培養可能な細胞株である。この細胞
は生体のあらゆる種類の細胞に分化することができる多
分化能を有しており、正常初期胚に注入すると胚体の形
成に参加してキメラ動物を形成することができる〔Evan
s M. J. 及び KaufmanM. H., ネイチャー(Nature)，第2
92巻 154頁 （1981）〕。この性質を利用して、様々な
遺伝子変異動物の作出が試みられてきた。その歴史は１
９８１年のEvans及びKaufmanによるＥＳ細胞の樹立に始
まり、BradleyらによるＥＳキメラマウスの作製〔ネイ
チャー(Nature)， 第309巻, 255頁 (1984)〕により本格
的な研究が開始された。Thomas及びCapecchiがＥＳ細胞
の遺伝子相同組換え〔セル（Cell)，第51巻, 503頁 (19
87)〕に続いて、Kollerらのグループなど３組の研究グ
ループがＥＳ細胞形質のGermline Transmissionに次々
に成功し〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A.)，第86巻，8927頁（1989）〕、
遺伝子欠損マウスの作製とこれを用いた研究が急速に進
展してきた。現在までに樹立が報告されているＥＳ細胞
としては、Evans及びKaufmanのＥＫ細胞〔前記文献〕の
他に、DoetschmanのＥＳ−Ｄ３細胞〔ジャーナル・オブ
・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モ
ルフォロジー（J. Embryol.Exp. Molph.), 第87巻, 27
頁 (1981)〕、RobertsonのＣＣＥ細胞〔ネイチャー(Nat
ure), 第323巻, 445頁 (1986)〕、Ledermann及びBurki
のＢＬ／６III細胞〔エクスペリメンタル・セル・リサ
ーチ（Exp. Cell Res.), 第197巻, 254頁〕等がある
が、これらの大部分が１２９系のマウスより樹立された
ものである。ＥＳ細胞は特定の遺伝子を修飾する遺伝子
ターゲッティング等において利用価値が非常に高いにも
かかわらず、その樹立や未分化状態を保ったままでの継
代維持が困難であるため利用が制限されているというの
が現状である。ＥＳ細胞を用いた動物疾患モデルの作製
を一般化するためには、絶えず良好なＥＳ細胞を樹立、
供給していく体制を確立することが望まれている。

【０００５】このようなＥＳ細胞を用いて作出された遺
伝子発現不全動物としては、（１）Hooper等〔ネイチャ
ー(Nature), 第326巻, 292頁 (1987年)〕及びKnehn等
〔ネイチャー(Nature), 第326巻, 295頁 (1987年)〕の
自然突然変異ＥＳ細胞を用いたＨＰＲＴ遺伝子欠損マウ
ス、（２）Donehower等〔ネイチャー(Nature), 第356
巻, 215頁 (1992年)〕の癌抑制遺伝子の一つであるｐ５
３を欠失したｐ５３欠失マウス、（３）Zijlstra等〔ネ
イチャー(Nature), 第344巻, 742頁 (1990年)〕のβ２
ミクログロブリン遺伝子変異マウス、（４）免疫疾患モ
デルマウスの一つであるSinkai等〔セル（Cell), 第68
巻, 855頁 (1992年)〕のＲＡＧ−２（Ｖ(Ｄ)Ｊ recombi
nation activation gene）変異マウス、（５）Glimcher
等〔サイエンス（Science), 第253巻，1417頁（1991
年）〕及びCosgrove等〔セル（Cell）,第66巻, 1051頁
(1991年)〕のＭＨＣ class II変異マウス、（６）発生
・発育関連疾患モデルマウスの一つとしてMacMahon等
〔セル（Cell），第62巻, 1073頁 (1990年)〕のｉｎｔ
−１遺伝子欠損マウス及び（７）Soriano等〔セル（Cel
l),第64巻, 693頁 (1991年）〕の大理石病様症状を呈す
るｓｒｃ欠損マウスがそれぞれ報告されている。

【０００６】ベータセルリン（以下、ＢＴＣと略記する
場合がある）は、トランスジェニックマウス由来膵臓ベ
ータ腫瘍細胞が産生する蛋白性因子で、その全アミノ酸
配列がｃＤＮＡの解析から明らかにされている〔Shing
ら；サイエンス（Science），259：1604（1993）, Sasa
daら；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Re
s. Commun.），190：1173（1993）〕。ＢＴＣは、当初
マウス３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性をもつ因子とし
て見いだされたが、その後、血管平滑筋細胞、網膜色素
上皮細胞に対しても増殖促進活性を有することが見いだ
された〔Shingら；サイエンス（Science），259：1604
（1993）〕。さらにＢＴＣは、ラット未分化型膵臓癌由
来細胞株ＡＲ４２Ｊを、インシュリンを産生するベータ
細胞に分化させることが報告された〔Mashimaら；ジャ
ーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション
（J. Clin. Invest.），97：1647（1996）〕。天然に存
在するヒトＢＴＣは極めて微量であり、また、これをヒ
トの組織から得る試みは種々の制約によって極めて困難
であった。しかし、遺伝子工学的手法を駆使して、高純
度のヒトＢＴＣが多量に、かつ比較的安価に生産される
ようになった（特開平６−８７８９４）。そして、ＢＴ
Ｃが、創傷、潰瘍や血管奇形の治療、あるいは糖尿病に
おいて認められるアテローム性動脈硬化症、糖尿病性網
膜症のような平滑筋細胞増殖に起因する病気の治療に使
用できる競合剤（例、抗体、偽ペプチド）の作成などに
用いられることが報告されている（特開平４−３５２８
００および特開平６−８７８９４）。しかしながら、外
来性ＢＴＣ遺伝子を導入した非ヒト動物やＢＴＣ遺伝子
の発現が不全な非ヒト動物に関する報告は未だ見当たら
ない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】したがって、ＢＴＣ遺
伝子が不活性化された非ヒト動物胚幹細胞の作製に成功
すれば、ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物を作出するこ
とができる。そして、得られるＢＴＣ遺伝子発現不全非
ヒト動物は、ＢＴＣにより誘導され得る種々の生物活性
を欠失するため、ＢＴＣの生物活性の不活性化を原因と
する疾病のモデルとなり、これらの疾病の原因究明およ
び治療法の検討が可能となる。また、外来性ＢＴＣ遺伝
子を組み込んだＤＮＡを有するＢＴＣ遺伝子導入動物の
作製に成功すれば、正常ＢＴＣ遺伝子導入動物において
は、ＢＴＣの機能の解明、ベータセルリン関連疾患の発
症機序の解明、治療方法の検討、正常ＢＴＣ遺伝子高発
現細胞の供給などが可能になり、一方、変異ＢＴＣ遺伝
子導入動物においては、ＢＴＣ不全症の発症機序の解
明、治療方法の検討、変異ＢＴＣ遺伝子高発現細胞の供
給などが可能になる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、ＢＴＣ遺伝子発現不
全非ヒト動物ならびに外来性ＢＴＣ遺伝子を組み込んだ
ＤＮＡを有するＢＴＣ遺伝子導入動物を作製することに
成功し、さらに研究を行なった結果、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明は、（１）不活性化ベータ
セルリン遺伝子配列を有することを特徴とするトランス
ジェニック非ヒト動物または当該遺伝子配列を有するそ
の子孫、（２）胚形成初期において導入された不活性化
ベータセルリン遺伝子配列を、生殖細胞または体細胞に
有する上記（１）記載の動物、（３）レポーター遺伝子
を導入することにより不活性化されたベータセルリン遺
伝子配列を有し、該レポーター遺伝子がベータセルリン
プロモーターの制御下で発現し得る上記（１）記載の動
物、（４）レポーター遺伝子が大腸菌由来β−ガラクト
シダーゼ遺伝子である上記（３）記載の動物、（５）不
活性化ベータセルリン遺伝子配列を有することを特徴と
する非ヒト動物胚幹細胞、（６）レポーター遺伝子を導
入することにより不活性化されたベータセルリン遺伝子
配列を有する上記（５）記載の胚幹細胞、（７）外来性
ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を組み込ん
だＤＮＡを有することを特徴とする非ヒト動物または該
ＤＮＡを有するその子孫、（８）非ヒト動物が非ヒト哺
乳動物である上記（１）または上記（７）記載の動物ま
たは上記（５）記載の胚幹細胞、（９）非ヒト哺乳動物
がゲッ歯動物である上記（８）記載の動物または胚幹細
胞、（１０）ゲッ歯動物がマウスである上記（９）記載
の動物または胚幹細胞、（１１）上記（１）記載の動物
を用いることを特徴とする、ベータセルリンの欠損に起
因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法、（１
２）上記（３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レ
ポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするベー
タセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合
物またはその塩のスクリーニング方法、（１３）上記
（１２）記載のスクリーニング方法を用いて得られるベ
ータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩、および（１４）外来性ベータセルリ
ン遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、動物において
発現しうるベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬な
どに関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】〔ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動
物〕不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有することを特徴とす
る非ヒト動物ＥＳ細胞とは、非ヒト動物ＥＳ細胞が有す
るＢＴＣ遺伝子に人為的に変異を加えることにより、遺
伝子の発現能を抑制するか、もしくは該遺伝子がコード
しているＢＴＣの活性を実質的に喪失させることによ
り、遺伝子が実質的にＢＴＣの発現能を有さない不活性
化された（以下、本発明のノックアウト遺伝子と称する
ことがある）非ヒト動物のＥＳ細胞をいう。本明細書
中、動物としては、いかなる動物でもよいが、哺乳動物
が好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。非
ヒト動物としては、ＢＴＣ遺伝子を有するヒト以外の動
物ならば、いかなる動物でもよいが、非ヒト哺乳動物が
好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、
ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。非ヒト
哺乳動物のなかでも、病体動物モデル系の作成の面から
個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖
が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系と
して、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系
として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ
１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など（なかでも
好ましくは、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統など、交
雑系として、ＢＤＦ₁系統またはＩＣＲ系統など））ま
たはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが
特に好ましい。ＢＴＣ遺伝子としては、動物から単離、
抽出されたゲノム由来のＢＴＣ遺伝子であってもよく、
あるいは、遺伝子工学的手法を用いてクローニングされ
たＢＴＣｃＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来ＢＴ
Ｃ蛋白質の遺伝子としては、例えば、配列番号：３で表
わされる塩基配列を有する遺伝子〔特開平６−８７８９
４〕などが用いられ、配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列を有するマウス由来ＢＴＣ蛋白質の遺伝子として
は、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列を有す
る遺伝子〔シング（Shing）等；サイエンス（Scienc
e）、第259巻、第1604頁、1993〕などが用いられる。こ
れらの遺伝子は、自体公知の方法、例えば、特開平６−
８７８９４、シング（Shing）等；サイエンス（Scienc
e）第259環、第1604頁、1993などに従って入手すること
ができる。

【００１０】ＢＴＣ遺伝子に人為的に変異を加える方法
としては、例えば、遺伝子工学的手法により該遺伝子配
列の一部又は全部の削除、他遺伝子を挿入または置換さ
せることによって行なうことができる。これらの変異に
より、例えば、コドンの読み取り枠をずらすか、プロモ
ーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本
発明のノックアウト遺伝子を作製することができる。不
活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒ
ト動物胚幹細胞（以下、ＢＴＣ遺伝子不活性化ＥＳ細胞
またはノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例とし
ては、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン
耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはゼオシ
ン耐性遺伝子など、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝
子など）、あるいは、レポーター遺伝子（例えば、ｌａ
ｃＺ（大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ遺伝子）、ルシ
フェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、タウマリン遺伝
子、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）遺伝子な
ど、好ましくは、ｌａｃＺなど）等を挿入することによ
りエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間の
イントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列
（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全な
メッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによっ
て、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配
列を有するＤＮＡ（以下、ターゲッティングベクターと
略記する）を作製する。レポーター遺伝子を挿入してエ
キソンの機能を破壊する場合、該レポーター遺伝子は、
ＢＴＣプロモーターの制御下で発現するように挿入する
ことが好ましい。上記「薬剤耐性遺伝子」とは、抗生物
質などの薬剤耐性に関与する遺伝子を示し、導入される
遺伝子が細胞において発現したか否かを選抜するマーカ
ーとして利用される。また、上記「レポーター遺伝子」
とは、遺伝子発現の指標になる遺伝子群のことを示し、
通常、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子
が利用されることが多く、遺伝的バックグラウンドが
ないもの、遺伝子発現を定量的に行える高感度の方法
があるもの、形質転換細胞への影響が少ないもの、
発現部位の局在性が示されるものなどが好ましく用いら
れる（植物細胞工学、第2巻、第721頁、1990）。また、
上記の「薬剤耐性遺伝子」なども同じ目的で使用される
が、「レポーター遺伝子」は、単に導入される遺伝子が
細胞において発現したかどうかだけではなく、どの組織
でいつ発現したかを調べることができ、しかも定量的に
発現量を精確に調べることができる点において異なるも
のである。さらに、遺伝子を破壊するように構築したＤ
ＮＡ配列を有するＤＮＡを、例えば、相同組換え法によ
り該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について
ＢＴＣ遺伝子上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプロー
ブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはタ
ーゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティ
ングベクター作製に使用したＢＴＣ遺伝子以外の近傍領
域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析
し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することによ
り得ることができる。上記のターゲッティングベクター
としては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢ
Ｒ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３な
ど）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐ
ＴＢ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来のプラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など）、λファージなど
のバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどの
レトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノウイ
ルスベクター、バキュロウイルス、ウシ乳頭腫ウイル
ス、ヘルペスウイルス群からのウイルス、またはエプス
タイン・バー・ウイルスなどの動物ウイルスなどが用い
られる。

【００１１】また、相同組換え法等によりＢＴＣ遺伝子
を不活性化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
EvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したもので
もよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般
的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学
的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で
免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するな
どの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ
／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善
したＢＤＦ₁マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２との
Ｆ₁）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。Ｂ
ＤＦ₁マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫である
という利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持
つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマ
ウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバックク
ロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウス
に代えることが可能である点で有利に用い得る。また、
ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の
胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚(受精後
２．５日目頃の８細胞期胚が好ましい)を採卵し胚盤胞
まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を
取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞を
用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメ
ラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間
を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なう
ことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、
例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝
子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げること
ができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をす
るのに約１０⁶個の細胞数を要していたのに対して、１
コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０〜１００個）で済む
ので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクション
を雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞
の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に
削減できる。

【００１２】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養
器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５
％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養
するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプ
シン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシ
ン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％ト
リプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、
新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などが
とられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なう
が、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が
見受けられた場合は、その培養細胞は放棄することが望
まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至る
まで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮
遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種
々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.
J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第2
92巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）
第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャ
ーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリ
メンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、
本発明のＥＳ細胞を分化させて得られるＢＴＣ遺伝子発
現不全細胞は、インビトロにおけるＢＴＣの細胞生物学
的検討において有用である。また、ＥＳ細胞を保存する
場合には、適当な凍結用培地（例えば、10％ＤＭＳＯ、
10％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ
ＭＥＭ）などを用いて、約−８０℃以下で凍結保存す
る。

【００１３】本発明の不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有す
ることを特徴とする非ヒト動物（以下、遺伝子発現不全
非ヒト動物と称す場合がある）とは、例えば、前記の不
活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒ
ト動物胚幹細胞由来の細胞を用いて遺伝子工学的に作出
されたものであり、例えば、生殖細胞および体細胞に胚
形成初期に該不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を導入された非
ヒト動物である。該非ヒト動物としては、前記と同様の
ものが用いられる。ＢＴＣ遺伝子をノックアウトさせる
には、前記のターゲッティングベクターを非ヒト動物
（例、マウスなど）ＥＳ細胞または非ヒト動物（例、マ
ウスなど）卵細胞に自体公知の方法（例えば、エレクト
ロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン
酸カルシウム法、リポフェクション法、凝集法、パーテ
ィクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など）によっ
て導入し（好ましい導入法としては、ＥＳ細胞に導入す
る場合にはエレクトロポレーション法、卵細胞に導入す
る場合にはマイクロインジェクション法などがあげられ
る）、ターゲッティングベクターの不活性化されたＢＴ
Ｃ遺伝子配列を遺伝子相同組換えにより、非ヒト動物
（例、マウスなど）ＥＳ細胞または非ヒト動物（例、マ
ウスなど）卵細胞の染色体上のＢＴＣ遺伝子と入れ換え
ることにより行うことができる。ＢＴＣ遺伝子がノック
アウトされた細胞は、ＢＴＣ遺伝子上またはその近傍の
ＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーシ
ョン解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配
列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来
のＢＴＣ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライ
マーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができ
る。非ヒト動物ＥＳ細胞を用いた場合は、遺伝子相同組
換えにより、ＢＴＣ遺伝子が不活性化された細胞株をク
ローニングし、その細胞を胚形成の初期の適当な時期、
例えば、８細胞期の非ヒト動物胚または胚盤胞に注入し
（注入法）、またはＢＴＣ遺伝子が不活性化されたＥＳ
細胞塊を２個の８細胞期胚ではさみ込む（集合キメラ
法）ことにより作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ
ト動物の子宮に移植する。作出された動物は正常なＢＴ
Ｃ遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したＢＴＣ遺伝子
座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物であ
る。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したＢＴＣ遺
伝子座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を
交配することにより得られた個体群より、全ての組織が
人為的に変異を加えたＢＴＣ遺伝子座をもつ細胞で構成
された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選
別することにより得られる。このようにして得られた個
体は、通常、ＢＴＣヘテロ発現不全個体であり、ＢＴＣ
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＢ
ＴＣホモ発現不全個体を得ることができる。卵細胞を使
用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェ
クション法で遺伝子溶液を注入することによりターゲッ
ティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニ
ック非ヒト動物を得ることができ、これらのトランスジ
ェニック非ヒト動物を比較することにより、遺伝子相同
組換えによりＢＴＣ遺伝子座に変異のあるものを選択す
ることにより得られる。ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動
物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して
間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と
区別することが可能である。

【００１４】このようにしてＢＴＣ遺伝子がノックアウ
トされている個体は、交配により得られた動物個体も該
遺伝子がノックアウトされていることを確認して通常の
飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、生
殖系列の取得および保持についても常法に従って行うこ
とができる。すなわち、該不活化遺伝子配列の保有する
雌雄の動物を交配することにより、該不活化遺伝子配列
を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得す
ることができる。得られたホモザイゴート動物は、母親
動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になる
ような状態で飼育することにより効率的に得ることがで
きる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することによ
り、該不活化遺伝子配列を有するホモザイゴートおよび
ヘテロザイゴート動物を繁殖継代することができる。こ
のようにして得られた該不活化遺伝子配列を有する動物
の子孫も本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物に含
まれる。このようにＢＴＣ遺伝子が不活性化された非ヒ
ト動物ＥＳ細胞は、ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物を
作出する上で、非常に有用である。また、ＢＴＣ遺伝子
発現不全非動物は、ＢＴＣを欠損に起因する疾病、例え
ば、ＢＴＣにより誘導され得る種々の生物活性の欠失に
基づく、ＢＴＣの生物活性の不活性化に起因する疾病
（例えば、インシュリン依存性糖尿病、動脈硬化症、糖
尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿
病性網膜症、高コレステロール血症、高グリセリド血
症、高脂血症、糖尿病性膵臓機能障害、老人性膵臓機能
低下症、未分化型膵臓癌など）のモデルとなり得るの
で、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用で
ある。すなわち、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非動物
は、該疾病の予防・治療薬のスクリーニングに用いるこ
とができる。

【００１５】本発明のスクリーニング方法において用い
られるＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物としては、前記
と同様のものが挙げられる。試験化合物としては、例え
ば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化
合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織
抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物で
あってもよいし、公知の化合物であってもよい。具体的
には、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物を、試
験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物
の各器官、組織、疾病の症状等の変化を指標として試験
化合物の予防・治療効果を試験することができる。試験
動物（ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物）を試験化合物
で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射
などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質な
どにあわせて適宜選択することができる。また、試験化
合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあ
わせて適宜選択することができる。例えば、糖尿病や糖
尿病関連疾病の予防・治療薬をスクリーニングする場
合、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非動物に糖負荷処置
を行い、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与
し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定
することによりスクリーニングすることができる。

【００１６】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる予防・治療薬は、上記した試験化合物から選ばれた
化合物であり、ＢＴＣ欠損によって引き起こされる疾患
の予防・治療効果を有するので、ＢＴＣの欠損によって
引き起こされる疾病に対する安全で低毒性な治療・予防
薬などの医薬として有用である。また、該化合物から誘
導される化合物も同様に用いることができる。該スクリ
ーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよ
く、該化合物の塩としては、例えば、無機塩基との塩、
有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性
または酸性アミノ酸との塩などの薬学的に許容し得る塩
などがあげられる。無機塩基との塩の好適な例として
は、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金
属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土
類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩な
どがあげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、
例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジ
ン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、
ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘ
キシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ
ベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。無機
酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素
酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。有機酸との
塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン
酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン
酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼン
スルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。塩基性
アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニ
ン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性ア
ミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、
グルタミン酸などとの塩があげられる。

【００１７】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩を上述の治療・予防薬として使
用する場合、常套手段に従って実施することができ、例
えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、
あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液と
の無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経
口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を薬
学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防
腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製
薬実施に要求される単位用量形態で混和することによっ
て製造することができる。これら製剤における有効成分
量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにする
ものである。錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガントゴム、アラビアゴムのような結合剤、結
晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラ
チン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マ
グネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカ
リンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油または
チェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形
態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさら
に油脂のような液状担体を含有することができる。注射
のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活
性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油な
どを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従っ
て処方することができる。

【００１８】注射用の水溶液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物
（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の糖尿
病患者においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、
好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．
０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その
１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法など
によっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人
（６０ｋｇとして）の糖尿病患者においては、一日につ
き約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２
０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を
静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の
場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することが
できる。

【００１９】さらに、本発明は、本発明のＢＴＣ遺伝子
発現不全非ヒト動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とするベータセル
リンプロモーター活性を促進または阻害する化合物また
はその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のス
クリーニング方法において用いられるＢＴＣ遺伝子発現
不全非ヒト動物としては、前記した本発明のＢＴＣ遺伝
子発現不全非ヒト動物の中でも、レポーター遺伝子を導
入することにより不活性化されたＢＴＣ遺伝子配列を有
し、該レポーター遺伝子がＢＴＣプロモーター（ＢＴＣ
遺伝子のプロモーター領域）の制御下で発現し得るもの
が用いられる。試験化合物としては、前記と同様のもの
が挙げられる。レポーター遺伝子としては、前記と同様
のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａ
ｃＺ）が好ましく用いられる。ＢＴＣの構造遺伝子をレ
ポーター遺伝子で置換されたＢＴＣ発現不全非ヒト動物
では、レポーター遺伝子がＢＴＣプロモーターの支配下
に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の
発現をトレースすることにより、ＢＴＣプロモーターの
活性を検出することができる。

【００２０】例えば、ＢＴＣをコードする遺伝子領域の
一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａ
ｃＺ）で置換している場合、本来、ＢＴＣの発現する組
織で、ＢＴＣの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現す
る。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のよ
うなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染
色することにより、簡便にＢＴＣの動物生体内における
発現状態を観察することができる。具体的には、ＢＴＣ
欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドな
どで固定し、ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または
７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織
標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することに
よって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を
観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコード
するｍＲＮＡを検出してもよい。このように、本発明の
ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物は、ＢＴＣプロモータ
ーを促進または阻害不活化する化合物またはその塩をス
クリーニングする上で極めて有用であり、ＢＴＣ発現不
全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の
開発に大きく貢献することができる。

【００２１】上記スクリーニング方法を用いて得られる
化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれ
た化合物であり、ＢＴＣプロモーター活性を促進または
阻害する化合物である。ＢＴＣプロモーター活性を促進
する化合物またはその塩は、ＢＴＣの発現を促進するこ
とができるので、例えば、創傷や糖尿病などの各種疾病
に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として
有用である。一方、ＢＴＣプロモーター活性を阻害する
化合物またはその塩は、ＢＴＣの発現を阻害することが
できるので、例えば、アテローム性動脈硬化症のような
平滑筋細胞増殖に起因する疾病あるいは糖尿病性網膜症
などの各種疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤な
どの医薬として有用である。上記スクリーニング方法を
用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防
剤として使用する場合、前記と同様に実施することがで
きる。

【００２２】〔ベータセルリン遺伝子導入動物〕本発明
の外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込ん
だＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト動物（以
下、ＢＴＣ遺伝子導入動物と略記する）は、未受精卵、
受精卵、***およびその始原細胞を含む生殖細胞などに
対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚形成
初期の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細
胞の段階で、かつ一般に８細胞期以前）に、自体公知の
方法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リ
ポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション
法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法な
ど）により目的とするＢＴＣ遺伝子を導入することによ
って作出することができる。また、該ＢＴＣ遺伝子導入
方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的
とする本発明の外来性ＢＴＣ遺伝子を導入し、細胞培
養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これ
ら細胞を上述の生殖細胞と自体公知の細胞融合法により
融合させることにより本発明のＢＴＣ遺伝子導入動物を
作出することもできる。

【００２３】非ヒト動物としては、前記と同様のものが
用いられる。外来性ＢＴＣ遺伝子とは、非ヒト動物の体
内に存在しているＢＴＣ遺伝子ではなく、いったん動物
から単離・抽出されたＢＴＣ遺伝子、あるいは、遺伝子
工学的手法を用いてクローニングされたＢＴＣｃＤＮＡ
などが用いられる。具体的には、前記した配列番号：３
または配列番号：４で表わされる塩基配列を有する遺伝
子などが用いられる。ＢＴＣ遺伝子の変異遺伝子（以
下、変異ＢＴＣ遺伝子と略記する）としては、元のＢＴ
Ｃ遺伝子の塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が
生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基
への置換などが生じたＢＴＣ遺伝子などが用いられ、ま
た、ＢＴＣ遺伝子の変異遺伝子（以下、変異ＢＴＣ遺伝
子と略記する）も含まれる。該変異ＢＴＣ遺伝子として
は、変異したＢＴＣを発現させるＢＴＣ遺伝子を意味
し、例えば、正常なＢＴＣの機能を抑制するＢＴＣを発
現させるＢＴＣ遺伝子などが用いられる。外来性ＢＴＣ
遺伝子は、対象とする動物と同種あるいは異種のどちら
の動物由来のものであってもよいがヒト由来ＢＴＣ遺伝
子が好ましい。外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝
子を組み込んだＤＮＡとしては、外来性ＢＴＣ遺伝子ま
たはその変異遺伝子を含有するＤＮＡであればいかなる
ものであってもよい。ＢＴＣ遺伝子を対象動物に導入さ
せるにあたっては、該ＢＴＣ遺伝子を動物細胞で発現さ
せうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラ
クトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ヒト
ＢＴＣ遺伝子を導入させる場合、これと相同性が高いＢ
ＴＣ遺伝子を有する各種非ヒト動物（例えば、ウサギ、
イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス
など）由来のＢＴＣ遺伝子を発現させうる各種プロモー
ターの下流に、ヒトＢＴＣ遺伝子を結合したＤＮＡコン
ストラクト（例、ベクターなど）を対象動物の受精卵、
例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションする
ことによってＢＴＣ遺伝子を高発現するＢＴＣ遺伝子導
入動物を作出することができる。

【００２４】ＢＴＣ発現用ベクターとしては、大腸菌由
来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐ
ＵＣ１２，ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド
（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＢ５，ｐＣ１９４など）、酵
母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５な
ど）、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー
白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイ
ルスまたはアデノウイルスベクター、バキュロウイル
ス、ウシ乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス群からのウ
イルス、またはエプスタイン・バー・ウイルスなどの動
物ウイルスなどまたはその誘導体など）などが用いられ
る。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来の
プラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく
用いられる。上記のＢＴＣ遺伝子発現に用いられるプロ
モーターとしては、例えば、ウィルス（例、シミアンウ
ィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィル
ス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスな
ど）に由来するプロモーター、各種動物（ヒト、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マ
ウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来のものとし
ては、アルブミン、インシュリンＩＩ、ウロプラキンＩ
Ｉ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、
筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長
因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲ
ンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク
質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸
抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿
性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉ
ｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リ
ン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィ
ラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタ
ロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ
抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ
−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポ
リペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチ
ン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および
２、ミエリン基礎タンパク質ク、チログロブリン、Ｔｈ
ｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清
アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニ
ンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、
バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。な
かでも、好ましくは、各種動物由来のインシュリンＩＩ
プロモーターなどが用いられる。

【００２５】上記ベクターは、ＢＴＣ遺伝子導入動物に
おいて目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結す
る配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有している
ことが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物
および鳥類由来の各ＢＴＣ遺伝子の配列を用いることが
でき、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミ
ネターなどが用いられる。その他、目的ＢＴＣ遺伝子を
さらに高発現させる目的で遺伝子のスプライシングシグ
ナル、エンハンサー領域、真核細胞の遺伝子のイントロ
ンの一部などをプロモーター領域の５'上流、プロモー
ター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連
結することも目的により可能である。正常なＢＴＣの翻
訳領域は、各種動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モ
ルモット、ハムスター、ラット、マウス、ヒトなど）由
来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡお
よび市販の各種ゲノムライブラリーよりゲノム遺伝子の
全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細
胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製さ
れた相補ＢＴＣ遺伝子を原料として取得することが出来
る。また、外来性変異ＢＴＣ遺伝子は、上記の細胞また
は組織より得られた正常ＢＴＣの翻訳領域を点突然変異
誘発法により変異させることにより作製することができ
る。該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤＮＡコ
ンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および
所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の遺伝
子工学的手法により作製することができる。受精卵細胞
段階におけるＢＴＣ遺伝子の導入は、対象動物の生殖細
胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。
ＢＴＣ遺伝子導入後の作出動物の生殖細胞において、Ｂ
ＴＣ遺伝子が存在することは、作出動物の後代がすべ
て、その生殖細胞および体細胞のすべてにＢＴＣ遺伝子
を保持することを意味する。ＢＴＣ遺伝子を受け継いだ
この種の動物の子孫はその生殖細胞および体細胞のすべ
てにＢＴＣ遺伝子を有する。

【００２６】外来性正常ＢＴＣ遺伝子を導入させた非ヒ
ト動物は、交配によりＢＴＣ遺伝子を安定に保持するこ
とを確認して、該ＢＴＣ遺伝子保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階に
おけるＢＴＣ遺伝子の導入は、対象動物の生殖細胞およ
び体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。Ｂ
ＴＣ遺伝子導入後の作出動物の生殖細胞においてＢＴＣ
遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の子孫が全て
その生殖細胞および体細胞の全てにＢＴＣ遺伝子を過剰
に有することを意味する。ＢＴＣ遺伝子を受け継いだこ
の種の動物の子孫はその生殖細胞および体細胞の全てに
ＢＴＣ遺伝子を過剰に有する。導入ＢＴＣ遺伝子を相同
染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この
雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＢＴ
Ｃ遺伝子を過剰に有するように繁殖継代することができ
る。このようにして得られた子孫も本発明の動物に含ま
れる。正常ＢＴＣ遺伝子を有する非ヒト動物は、正常Ｂ
ＴＣ遺伝子が高発現させられており、内在性の正常ＢＴ
Ｃ遺伝子の機能を促進することにより最終的にＢＴＣ機
能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物と
して利用することができる。例えば、正常ＢＴＣ遺伝子
導入動物を用いて、高ＢＴＣ症や、ＢＴＣ関連疾患（例
えば、創傷、潰瘍、血管奇形、インシュリン依存性糖尿
病、動脈硬化症（例、アテローム性動脈硬化症など）、
糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖
尿病性網膜症、高コレステロール血症、高グリセリド血
症、高脂血症、糖尿病性膵臓機能障害、老人性膵臓機能
低下症、未分化型膵臓癌など）の病態機序の解明および
これらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能であ
る。また、外来性正常ＢＴＣ遺伝子を導入させた動物
は、遊離ＢＴＣの増加症状を有することから、上記ＢＴ
Ｃ関連疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利
用可能である。

【００２７】一方、外来性変異ＢＴＣ遺伝子を有する非
ヒト動物は、交配によりＢＴＣ遺伝子を安定に保持する
ことを確認して該ＢＴＣ遺伝子保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的ＢＴ
Ｃ遺伝子を前述のプラスミドに組み込んで原科として用
いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラ
ク卜は、通常のＢＴＣ遺伝子工学的手法によって作製す
ることができる。受精卵細胞段階における変異ＢＴＣ遺
伝子の導入は、対象動物の生殖細胞および体細胞の全て
に存在するように確保される。ＢＴＣ遺伝子導入後の作
出動物の生殖細胞において変異ＢＴＣ遺伝子が存在する
ことは、作出動物の子孫が全てその生殖細胞および体細
胞の全てに本発明の変異ＢＴＣ遺伝子を有することを意
味する。変異ＢＴＣ遺伝子を受け継いだこの種の動物の
子孫は、その生殖細胞および体細胞の全てに変異ＢＴＣ
遺伝子を有する。導入ＢＴＣ遺伝子を相同染色体の両方
に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を
交配することによりすべての子孫が該変異ＢＴＣ遺伝子
を有するように繁殖継代することができる。変異ＢＴＣ
遺伝子を有する非ヒト動物は、変異ＢＴＣ遺伝子が高発
現させられており、内在性の正常ＢＴＣ遺伝子の機能を
阻害することにより最終的にＢＴＣ機能不全症となるこ
とがあり、その病態モデル動物として利用することがで
き、例えば、変異ＢＴＣ遺伝子導入動物を用いて、ＢＴ
Ｃ機能不全症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方
法の検討を行なうことが可能である。また、具体的な利
用可能性としては、変異ＢＴＣ遺伝子高発現動物は、Ｂ
ＴＣ機能不全症における変異ＢＴＣによる低ＢＴＣ症を
解明するモデルとなる。また、外来変異ＢＴＣ遺伝子を
導入させた動物は、遊離ＢＴＣの増加症状を有すること
から、ＢＴＣ機能不全症（例えば、インシュリン依存性
糖尿病、動脈硬化症（例、アテローム性動脈硬化症な
ど）、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障
害、糖尿病性網膜症、耐糖能異常、高コレステロール血
症、高グリセリド血症、高脂血症、糖尿病性膵臓機能障
害、老人性膵臓機能低下症、未分化型膵臓癌など）に対
する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。

【００２８】また、上記２種類のＢＴＣ遺伝子導入動物
のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 ＢＴＣ遺伝子導入動物の組織中のＢＴＣ遺伝子もしく
はＲＮＡを直接分析するか、またはＢＴＣ遺伝子高発現
組織を分析することによる、ＢＴＣにより特異的に発現
あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解
析、 ＢＴＣ遺伝子を有する組織の細胞を標準組織培養技術
により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組
織からの細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 変異ＢＴＣの単離精製およびその抗体作製などが考え
られる。さらに、ＢＴＣ遺伝子導入動物を用いて、ＢＴ
Ｃ機能不全症を含む、ＢＴＣ関連疾患の臨床症状を調べ
ることができ、また、ＢＴＣ関連疾患モデルの各臓器に
おけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方
法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究お
よび治療に貢献することができる。また、ＢＴＣ遺伝子
導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンな
どのタンパク質分解酵素により、ＢＴＣ遺伝子導入細胞
の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なう
ことが可能である。さらに、ＢＴＣ産生細胞の特定化、
分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシ
グナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなど
ができ、ＢＴＣおよびその作用解明のための有効な研究
材料となる。さらに、ＢＴＣ遺伝子導入動物を用いて、
ＢＴＣ機能不全症を含む、ＢＴＣ関連疾患の治療薬の開
発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用
いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を
提供することが可能となる。また、ＢＴＣ遺伝子導入動
物または外来性ＢＴＣ遺伝子発現ベクターを用いて、Ｂ
ＴＣ関連疾患のＢＴＣ遺伝子治療法を検討、開発するこ
とが可能である。遺伝子治療法を検討する際には、例え
ば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、ＡＡＶベクター、ヘルペスウイルスベクターなどの
ウイルスベクターあるいは、膜融合リポソーム法などが
用いられる。上記の外来性ＢＴＣ遺伝子発現ベクターは
医薬としてＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の遺伝子
治療に用いることができる。具体的には、上記の外来性
ＢＴＣ遺伝子発現ベクターを（１）特表平９−５０１０
４６記載の方法またはそれに準じた方法などにより、
ＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の骨髄細胞に移植す
ることによる方法、（２）特表平９−５０５０８４に記
載またはそれに準じた方法などにより、ＢＴＣ機能不全
症または欠損症患者の筋肉組織、血管系、腸、皮膚、
眼、肺などに投与する方法、または（３）特表平９−５
０５５６１に記載またはそれに準じた方法などにより、
ＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の脳脊髄液に投与す
る方法などを用いることによってＢＴＣ遺伝子を患者の
体内で発現させることを可能たらしめる。また、 ＢＴ
Ｃ機能不全症または欠損症患者の卵細胞に上記の方法に
よりＢＴＣ遺伝子を導入することにより、患者の子孫に
おけるＢＴＣ機能不全症または欠損症を予防することも
可能である。

【００２９】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン

【００３０】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕ヒト由来ＢＴＣのアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：２〕マウス由来ＢＴＣのアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：３〕ヒト由来ＢＴＣをコードするＤＮＡの
塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕マウス由来ＢＴＣをコードするＤＮＡ
の塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕プライマーＲＩ−１の塩基配列を示
す。 〔配列番号：６〕プライマーＲＩ−３の塩基配列を示
す。 〔配列番号：７〕プライマーＲＩ−１Ｃｌａの塩基配列
を示す。 〔配列番号：８〕プライマーＲＩ−３Ｘｈｏの塩基配列
を示す。 〔配列番号：９〕プライマーＮｅｏ２の塩基配列を示
す。 〔配列番号：１０〕プライマーｍＢＴ４０の塩基配列を
示す。 〔配列番号：１１〕プライマーＲＥＬ−１の塩基配列を
示す。 〔配列番号：１２〕プライマーＲＥＬ−２の塩基配列を
示す。 〔配列番号：１３〕プライマーＲＥＬ−１Ｃｌの塩基配
列を示す。 〔配列番号：１４〕プライマーＲＥＬ−２Ｘｈの塩基配
列を示す。 〔配列番号：１５〕プライマーＢＴ１０７ｈの塩基配列
を示す。

【００３１】後述の実施例１で得られたＢＴＣ遺伝子欠
損ＥＳ細胞ＢＢ１５Ｆ１１は、平成９年２月２６日から
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８４２として寄託さ
れている。

【００３２】

【実施例】以下に、本発明を参考例および実施例を示し
てさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限
定されるものではない。

【００３３】

【参考例１】ＥＳ細胞用フィーダー細胞の調製 フィーダーとして用いるＳＴＯ細胞は１０％牛胎仔血清
（ＦＢＳ：Flow）、０.１mＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡ
Ａ：ＧＩＢＣＯ）を含むダルベッコ変法イーグル培地
（ＤＭＥＭ：日水製薬）（以下、ＳＴＯ細胞用培地と称
する）で培養し、コンフルエントになる直前の約７０〜
８０％コンフルエントまで培養した時点で培地に終濃度
１０μg／mlになるようマイトマイシンＣ（協和発酵工
業）を加え３７℃で２．５時間培養した後、１mＭ ＥＤ
ＴＡ含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ
(−)）で２回洗浄し、０．０２５％トリプシンを含む１
mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ(−)処理によりシングルセルサス
ペンジョンとした後培地を加え２００×ｇ ５分間遠心
して細胞を集めた。ＳＴＯ細胞用培地で細胞を２×１０
⁵個／mlの濃度に懸濁し、予め０.１％ゼラチン溶液（シ
グマ社）でコーティングしておいた２４穴リンブロカル
チャープレートあるいは３５mm、６０mm、１００mmのペ
トリディシュ（ファルコン社）にそれぞれ１ml、２ml、
３ml、１０mlの細胞懸濁液を加えて単層のフィーダー細
胞を調製した。

【００３４】

【参考例２】ＥＳ細胞株の樹立 ＢＤＦ₁の雌マウスに５ＩＵの妊馬血清セロトロピン
（ＰＭＳ：帝国臓器製薬）を腹腔内に投与後、４６〜４
８時間後にさらに５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン
（ｈＣＧ：帝国臓器製薬）を腹腔内投与することにより
過***を誘起した。同系の雄マウスと交配後２．５日目
に開腹し、子宮潅流により８細胞期の胚を採取した。該
８細胞期の胚をＬＩＦ（Leukemia Inhibitory Factor：
白血球増殖阻止因子）を含まないＥＳ細胞用培地（ＥＳ
Ｍ：２０％非働化ＦＢＳ（牛胎仔血清：Flow），０.１m
Ｍ ＮＥＡＡ（NE amino acid），１.０mＭ ピルビン酸
ナトリウム(Flow)，０.１mＭ ２−メルカプトエタノー
ル（２−ＭＥ：シグマ社），０.１mＭ ヌクレオシド
（シグマ社）およびリコンビナントマウスＬＩＦ（rmＬ
ＩＦ）（１×１０³Ｕ/ml：ＡＭＲＡＤ）を含むＤＭＥＭ
（日水製薬））中でゼラチン処理した２４穴リンブロカ
ルチャープレートで一晩培養した。胚盤胞まで卵割した
胚をガラスキャピラリーで吸引採取し、予め培地を通常
用いる量の５倍量(５×１０³Ｕ／ml)のＬＩＦを含むＥ
ＳＭに置き換えた参考例１記載のフィーダー細胞上に播
種した。栄養外胚葉が破れて内部細胞塊が大きく成長し
てきた時に、ガラスキャピラリーで内部細胞塊を吸引採
取し、０.０２５％トリプシン含有１mＭ ＥＤＴＡ−Ｐ
ＢＳ(−)のマイクロドロップ内でシングルセルサスペン
ジョンとした後フィーダー細胞上に再び播種した。細胞
塊の細胞数が１００個程度まで増えた時点でＰＣＲ法を
用いて、マウスのＹ染色体上の性決定領域（sex-determ
ining region of the Y-chromosome：Sry）遺伝子を増
幅し、これを検出することにより雄の核型を持つ細胞を
選別した。選別した細胞を２〜３日毎にトリプシン−Ｅ
ＤＴＡ処理によりフィーダー細胞上への播種を行い、順
次培養スケールを大きくして継代し、細胞数が約１０⁶
個／mlまで増えた時点で、Ｇ−バンディング法により染
色体数をカウントして、雄型で染色体数４０（正常値）
のものを選択し、細胞の劣化を防ぐため１０％ＦＢＳ、
１０％ＤＭＳＯ（シグマ社）を含むＤＭＥＭを凍結用培
地として早期に-８０℃で凍結保存した。このようにし
てＥＳ細胞株ＢＤＭ−３およびＢＤＭ−５を取得した。

【００３５】

【参考例３】ターゲティングベクターｐＴＢ１８７５の
構築 既報のマウスＢＴＣ ｃＤＮＡ〔Science 第259巻, 1604
頁 (1993年)〕をプローブとして、マウスゲノム遺伝子
ライブラリー（ＢＡＬＢ／ｃマウス）をスクリーニング
した。スクリーニングはプラークハイブリダイゼーショ
ン法にて行い、１５ｋｂ ＳａｌＩ断片のマウスゲノム
遺伝子を得た。この１５ｋｂ ＳａｌＩ断片はｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ⁺のＳａｌＩ部位にクローニング
し、プラスミドｐＴＢ１８３１とした。１５ｋｂ断片を
ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIで切断し、得られた３ｋ
ｂおよび６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１１８のＥｃ
ｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＴＢ１８３
２およびｐＴＢ１８３３を、また６.５ｋｂおよび３.４
ｋｂ ＨｉｎｄIII断片をｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII部
位にクローニングしてｐＴＢ１８３５およびｐＴＢ１８
３６を取得した。これらマウスＢＴＣゲノムＤＮＡをク
ローニングしたプラスミド（ｐＴＢ１８３１，ｐＴＢ１
８３２，ｐＴＢ１８３３，ｐＴＢ１８３５，ｐＴＢ１８
３６）を用いて、マウスＢＴＣゲノムＤＮＡ １５ｋｂ
断片の主要な制限酵素地図を作製した後、マウスＢＴＣ
ｃＤＮＡをプローブとしたサザンブロット解析、ｃＤ
ＮＡ配列をもとに作製したプライマーを用いたＰＣＲ解
析、および塩基配列解析により、１５ｋｂ ＢＴＣゲノ
ム上のエクソンの位置を決定した。〔図１〕に示すよう
に、この１５ｋｂ ＤＮＡ上には、第３，第４，第５お
よび第６エクソンが存在することが判明した。さらにマ
ウス細胞ＤＮＡを用いた解析から、第３エクソンの上流
１１ｋｂに第２エクソン、そのさらに上流１５ｋｂに第
１エクソンが存在することが判った。

【００３６】上記ｐＴＢ１８３６のマウスＢＴＣゲノム
ＤＮＡの第４エクソンを含む１.２ｋｂ ＨｉｎｄIII−
ＥｃｏＲＶ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ⁺の
マルチクローニング部位のＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，Ｐｓ
ｔＩ切断部位を欠失させたもののＨｉｎｄIIIとＥｃｏ
ＲＶの間にＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により組み込み、プ
ラスミドｐＴＢ１８６４を構築した。一方、プラスミド
ｐＫＪ２から切り出した、ホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ）プロモーターを含む０.５ｋｂ ＥｃｏＲＩ−
ＰｓｔＩ断片（Biochem. Genet., 28 (1990) 299-308）
を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断したプラスミドｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ⁺に連結してｐＴＢ１８６
３を得た。このｐＴＢ１８６３から０.５ｋｂ ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（ＰＧＫプロモーター）を単離し、
プラスミドｐＭＫ〔Brinster, R.L.ら, Cell 第27巻, 2
23頁 (1981年)〕をＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩで切断して得
られた３.０ｋｂ断片（ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含む）と
共に、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１１８に
連結してプラスミドｐＴＢ１８６６を構築した。このｐ
ＴＢ１８６６をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕIIで切断してＰ
ＧＫプロモーターとＨＳＵ−ＴＫ遺伝子を含む２.２ｋ
ｂ断片を単離し、先に構築したｐＴＢ１８６４のマウス
ＢＴＣ遺伝子下流に存在するＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶの
間に挿入して、プラスミドｐＴＢ１８６７を得た〔図
２〕。ｐＴＢ１８６７はＳａｌＩで切断し、プラスミド
ｐＭＣ１ｎｅｏｐｏｌｙＡ（STRATAGENE, VS-2132-01）
から切り出した１.１５ｋｂ ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片
（ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット）をこのＳａｌ
Ｉ部位に組み込んでプラスミドｐＴＢ１８７０を得た。
この時、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIで切断して挿入断片
の方向を確認し、ネオマイシン耐性遺伝子がマウスＢＴ
Ｃ遺伝子に対して逆向きに挿入されているものを選択し
た〔図３〕。

【００３７】プラスミドｐＣＨ１１０（ファルマシア
27-4508-01）をＥｃｏＲＩで切断して得られた１.２ｋ
ｂ断片と、プラスミドｐＭＣ１８７１（ファルマシア
27-4945-01）をＥｃｏＲＩで部分消化して得られた６.
６ｋｂ断片を連結してｐＬａｃＺｐｏｌｙＡを得た。こ
れをＳｍａＩで切断し、ＮｃｏＩリンカーを連結するこ
とによりＮｃｏＩ切断部位を挿入したプラスミドｐＬａ
ｃＺｐｏｌｙＡ／Ｎｅｏを得た。このプラスミドをＨｉ
ｎｄIIIで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断
片で切断末端を平滑化し、ＢｇｌIIリンカーをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ反応により連結したのちＮｃｏＩおよびＢｇ
ｌIIで切断して、ｌａｃＺ遺伝子を含む４.２ｋｂ断片
を単離した。次に、マウスＢＴＣゲノム１５ｋｂ断片を
含むｐＴＢ１８３１を、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩで切断
し、第３エクソンに存在するＮｃｏＩから上流の７.３
ｋｂ断片を単離した。この７.３ｋｂ ＳａｌＩ−Ｎｃｏ
Ｉ断片（マウスＢＴＣゲノム）を前述の４.２ｋｂ Ｎｃ
ｏＩ−ＢｇｌII断片（ｌａｃＺ）と共に、先に構築した
ｐＴＢ１８７０のＳａｌＩとＢａｍＨＩの間に挿入連結
して、ターゲティングベクターｐＴＢ１８７５を構築し
た〔図３〕。

【００３８】

【参考例４】ＢＴＣ遺伝子導入ベクターの構築 ラット尾から常法に従ってゲノムＤＮＡを調製した。こ
のＤＮＡをテンプレートとして、既報のラットインシュ
リンII遺伝子プロモーターの塩基配列（GenBank：Acces
sion No. J00748）をもとに合成したプライマーＲＩ−
１〔５'−ＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＣ
ＣＡＣＴ−３'（配列番号：５）〕およびＲＩ−３〔５'
−ＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧ−
３'（配列番号：６）〕を用いてＰＣＲ法によりインシ
ュリンプロモーター領域０.７５ｋｂを増幅した。さら
に、このＰＣＲ産物をテンプレートとしてプライマーＲ
Ｉ−１Ｃｌａ〔５'−ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡ
ＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡ−３'（配列番号：７）〕およ
びＲＩ−３Ｘｈｏ〔５'−ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴ
ＣＡＣＴＴＡＧＧＧ−３'（配列番号：８）〕を用いて
ＰＣＲを行った。増幅された０.７５ｋｂ ＤＮＡ断片を
単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Novagen 69820−1）
に組み込んで得られたプラスミドｐＴＢ１８８１を用い
てクローニングされた断片の塩基配列を決定し、ラット
インシュリンプロモーターであることを確認した。プラ
スミドｐＴＢ１８８１をＸｈｏＩ−ＣｌａＩで切断して
ラットインシュリンプロモーターである０.７３ｋｂ Ｄ
ＮＡ断片を得た。ヒトＢＴＣ ｃＤＮＡ発現プラスミド
ｐＴＢ１５１５（特開平４−３５２８００）をＸｈｏＩ
−ＨｉｎｄIIIで切断して得られた１.１ｋｂ断片（ｈＢ
ＴＣ ｃＤＮＡ，ＳＶ４０スプライシング部位およびＳ
Ｖ４０ポリＡ付加部位を含む）、およびＨｉｎｄIII−
ＣｌａＩで切断して得られた２.３ｋｂ断片（ｐＢＲ３
２２由来ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む）
を単離し、これらと前述のラットインシュリンプロモー
ター領域を含む０.７３ｋｂ ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応によって連結し、プラスミドｐ
ＴＢ１８８４を得た〔図５〕。このプラスミドｐＴＢ１
８８４をＣｌａＩで切断して得られる１.８ｋｂ断片を
マウス受精卵にマイクロインジェクションすることによ
ってＢＴＣ遺伝子が膵臓β細胞で高発現する導入動物を
作出することができる。

【参考例５】ＢＴＣ遺伝子導入ベクターｐＴＢ１９６９
の構築 ラット尾から調製したDNAをテンプレートとして，既報
のラットエラスターゼＩ遺伝子プロモーターの塩基配列
（GenBank:Accession No.J00730 ）をもとに合成したプ
ライマーＲＥＬ−１［５’−ＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴ
ＴＧＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＣ−３’（配列番号：１
１）］およびＲＥＬ−２［５’−ＧＡＧＴＡＧＡＣＣＡ
ＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号：１
２）］を用いてＰＣＲ法によりエラスターゼIプロモー
ター領域０．７５kbを増幅した。さらに、このＰＣＲ産
物をテンプレートとしてプライマーＲＥＬ−１Ｃｌ
［５’−ＧＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴＧ
ＣＴＣＴＣＣ−３’（配列番号：１３）］およびＲＥＬ
−２Ｘｈ ［５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＣＣＡＣ
ＴＧＣＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号：１４）］を用い
てＰＣＲを行った。 増幅された０．７５kb ＤＮＡ断片
を単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Novagen 69820-
1）に組み込んでプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ／ＲＥＬＰ
−２６を得た。組み込んだ断片の塩基配列を決定し、ラ
ットエラスターゼIプロモーター であることを確認し
た。このプラスミドをプロモーター上流のクローニング
ベクター由来ＳｍａＩ部位で切断後ＢｇｌＩＩリンカー
を付加し、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩで消化してラットエラ
スターゼＩプロモーター０．７５kb ＤＮＡ断片を単離
した。プラスミドｐＴＢ１５６０（プラスミドｐＴＢ１
４９９（特開平4-352800）からヒトＢＴＣ ｃＤＮＡを
含む１．３kb ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を切り出してプラ
スミドｐＵＣ１１９のＳａｌＩ部位にサブクローニング
したもの）をＳｍａＩで切断しＢａｍＨＩリンカーをラ
イゲーションして、ヒトＢＴＣ ｃＤＮＡを含む１．０k
b ＢａｍＨＩ断片を単離した。このＤＮＡ断片を，参考
例４記載のプラスミドｐＴＢ１８８４をＢｇｌＩＩで切
断してＢＴＣ ｃＤＮＡ部分を除いたＤＮＡ断片と結合
させｐＴＢ１９６４を得た。ｐＴＢ１９６４ではｐＴＢ
１８８４に比べてＢＴＣ ｃＤＮＡの３’非翻訳領域が
０．３kb長くBTC遺伝子の本来のpoly A付加シグナルが
含まれている。ｐＴＢ１９６４をＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断して得られた１．４kb断片（ｈＢＴＣ ｃＤ
ＮＡ， ＳＶ４０スプライシング部位およびＳＶ４０ポ
リＡ付加部位を含む）、およびＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩで切断して得られた２．３kb断片（ｐＢＲ３２２由
来oriおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む）を単離
し、これらと前述のラットエラスターゼＩプロモーター
を含む０．７５ｋｂ ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をＴ４
ＤＮＡリガーゼ反応によって連結し，プラスミドｐＴＢ
１９６９を得た[図１０]。

【００３９】

【実施例１】不活性化ＢＴＣ遺伝子導入とＢＴＣ遺伝子
欠損ＥＳ細胞の選別 ほぼコンフルエントまで増殖した参考例２で得られたＥ
Ｓ細胞ＢＤＭ−３（Cytotechnology 15, 1-5 (1996)）
をトリプシン処理により解離し、ＥＳ細胞用培地（ＥＳ
Ｍ：ＤＭＥＭ、２０％ 非働化ＦＢＳ、０.１mＭ 非必
須アミノ酸、１.０mＭ ピルビン酸ナトリウム、０.１m
Ｍ ２−ＭＥ、１×１０³Ｕ／ml rmＬＩＦ）を加えて反
応を止め遠心後、上清を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食
塩液（２１mＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、１３７mＭ Ｎa
Ｃl、５mＭ ＫＣl、０.７mＭ Ｎa₂ＨＰＯ₄、１ｇ／リッ
トル グルコース）で再懸濁し、ＥＳ細胞懸濁液を調製
した。参考例３で得られたプラスミドpＴＢ１８７５か
ら制限酵素ＳalＩで切り出したターゲティングベクター
をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を
行って精製後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液に溶かした。
５×１０⁷個になるよう調製したＥＳ細胞懸濁液（０.５
ml）に終濃度１０μｇ／mlのターゲティングベクターを
加え(ここで、より効率的な遺伝子導入細胞取得のため
には終濃度１００μｇ／mlとなるように加える）、バイ
オラッド（Ｂio−Ｒad ）社のジーンパルサーを用い、
２５０Ｖ ９６０μＦでＥＳ細胞にベクターをエレクト
ロポレーションした。エレクトロポレーション後の細胞
は直径１０cmのペトリディッシュには３×１０⁶個ずつ
播種し、播種後４８時間はＥＳＭで培養し、その後培地
にＧ４１８（２００μｇ／ml：ＧＩＢＣＯ）と１−（２
−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ；０.２μＭ ネ
イチャー 第３４４巻、１７２頁（１９９０年）に準じ
て調製）を加えてＢＴＣ遺伝子欠損ＥＳ細胞の選択培養
を開始した。２日ごとに培地を交換し９日から１１日目
に増殖したコロニーを採取し、順次スケールアップして
培養した。得られたＧ４１８耐性株のＢＴＣ遺伝子欠損
の判定は採取した各細胞の一部よりＤＮＡを抽出し、制
限酵素ＡpaＩで消化した後、マウスゲノムＤＮＡより調
製した２.０ｋｂのＥcoＲＶ−ＳacＩ断片〔図１〕をプ
ローブＡとして用いてサザンハイブリダイゼーション法
により行った。ＢＴＣ遺伝子のノックアウト細胞株では
６.５kbp及び５.２kbpの位置にバンドが検出できた〔図
４〕。これに対して対照である野生株（ＢＤＭ−３）で
は６.５kbpのバンドのみが検出できた。サザンハイブリ
ダイゼーションによる解析の結果、Ｇ４１８とＦＩＡＵ
両方に耐性を示した６８６クローンのうち、１６クロー
ンに変異が導入されている事が確認できた。ＢＴＣゲノ
ムＤＮＡおよびプラスミドｐＴＢ１８７５を用いたター
ゲッティングコンストラクトを〔図１〕に示す。

【００４０】

【実施例２】ＢＴＣ欠損マウスの作出 実施例１で得られたＢＴＣ遺伝子がノックアウトされた
１６クローンのＥＳ細胞株のうち３クローンについてそ
れぞれ、田川らの集合キメラ法〔細胞工学第14巻，946
頁（1995年）〕を行った。すなわち、参考例２に記載の
方法でホルモン剤を投与して過***を誘起し、ＩＣＲ雄
マウスと交配後２.５日目に子宮潅流により採卵したＩ
ＣＲマウス８細胞期胚を、酸性タイロード液（０.８ｇ
ＮａＣｌ，０.０２ｇ ＫＣｌ，０.０２４ｇ ＣａＣｌ₂
・２Ｈ₂Ｏ，０.０１ｇ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ，０.１ｇ
グルコース，０.４ｇ ポリビニルピロリドン：１００ｍ
ｌ，塩酸でｐＨを２.５に調整）のドロップに移して透
明帯を溶解させたのちＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地〔細胞工
学 第13巻，1138頁（1994年）〕で洗浄した。予め直径
６ｃｍペトリディッシュに作った針穴にミネラルオイル
でおおったＢＷＷ（Biggers, Whitten & Whittingham）
培地小ドロップ中にＥＳ細胞塊（１０〜１５個の細胞）
を入れ、ここに２.５日胚を２個ずつ入れて細胞塊と接
着させてＣＯ₂インキュベーターで一晩培養した。この
集合キメラ法によりできた胚盤胞（もしくは桑実胚）を
精管結紮した雄との交配により作製した偽妊娠２.５日
目のＩＣＲマウスを仮親として左右の子宮角へそれぞれ
約１０個の胚を移植した。その結果、ＢＤＭ−３細胞の
寄与率がほぼ１００％および７０％のキメラマウス
（雄）が得られた。

【実施例３】ＢＴＣ欠損マウスの作出−２ 実施例２で得られたキメラマウス（雄）をＩＣＲマウス
（白色，雌）にバックク ロスし，その産仔のコートカ
ラーの判定によりＥＳ細胞の生殖系列への分化能を調べ
た。ＢＤＭ−３細胞の寄与率がほぼ１００％のキメラマ
ウス（Ｑ２）から得られた７５匹の子マウスはすべて黒
色〜野生色を示し、産仔は全てＥＳ細胞由来であった。
７０ ％のキメラマウス（Ｑ１）から得られた１２０匹
の子マウスでは、８０匹がES細胞に 由来する黒色〜野
生色を示した。ＥＳ細胞由来の子マウスの尾から定法に
従ってＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを 鋳型とし
てプライマーNｅｏ２［５’−ＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡ
ＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：９）］
およびプライマーｍＢＴ４０［５’−ＴＡＣＡＣＣＴＧ
ＣＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：
１０）］を用いてＰＣＲを行い産物をアガロースゲルに
て解析した。Ｑ２由来子マウス７５匹のうち３７匹、Ｑ
１由来子マウスのうち、ＥＳ細胞に由来する黒色〜野生
色を示す８０匹のうち３２匹で、１．５ｋｂｐのバンド
の増幅が認められ図６、ＢＴＣ遺伝子に変異（欠損）が
導入されたヘテロ接合体マウスであると考えられた。こ
れらのマウスＤＮＡについて，制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化したのち，実施例１と同様にプローブＡ（２．０ｋｂ
のＥＣｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片図１）を用いてサザンハ
イブリダイゼーションにて解析した。実施例１で得られ
たＢＴＣ遺伝子欠損ＥＳ細胞株ＢＢ１５Ｆ１１と同様に
６．１ｋｂｐおよび４．０ｋｂｐの位置にバンドが検出
され（図６、図７）、ヘテロ接合体マウスであることが
確認された。

【実施例４】ＢＴＣ欠損マウスの性質 実施例３で得られたＢＴＣヘテロ欠損マウスの雌雄を交
配することにより、ほぼ４分の１の確率でＢＴＣホモ欠
損マウスが得られた。図８に実施例３と同様のサザンハ
イブリダイゼーション法による解析結果を示した。ＴＣ
ホモ欠損マウスでは４．０ｋｂｐのバンドのみが検出さ
れた。さらに，マウス腎臓からｍＲＮＡを調製し、ＢＴ
ＣのＯＲＦ領域をプローブとしてノーザンブロット解析
を行った結果を図９に示した。 野生型マウス（ＢＴＣ
＋／＋）では本来のＢＴＣ遺伝子に由来する３ｋｂのバ
ンドが見られ、ヘテロマウス（ＢＴＣ＋／−）では３ｋ
ｂのバンドおよびＢＴＣとｌａｃＺの融合遺伝子に相当
する４．５ｋｂのバンドが、またホモマウス（ＢＴＣ−
／−）ではＢＴＣ／ｌａｃＺ融合遺伝子の４．５ｋｂの
バンドのみが検出された。すなわちＢＴＣホモ欠損マウ
スではＢＴＣ遺伝子が破壊されＢＴＣとｌａｃＺの融合
遺伝子が発現していることがｍＲＮＡレベルで確認され
た。ＢＴＣホモ欠損マウスは外見上特に異常は認められ
ず、出生後の体重の増加もホモ、ヘテロ、野生型群の間
に明らかな差は認められなかった。４週令、６週令、８
週令の各群を用いて絶食後グルコース投与（２ｇ／ｋ
ｇ，ｉｐ）を行い、前後の血糖値を測定したが３群間に
有意の耐糖能の差を認めなかった。４週令および６週令
のホモ欠損マウスを用いて免疫組織化学および電顕によ
る形態学的検討を行った結果、膵島の成熟障害を示唆す
る知見が得られた。（１）生後４週において神経組織に
接した膵島が高頻度に認められた。（２）生後６週にお
いて，膵導管に取り囲まれた膵島や，導管を囲む膵島が
多数認められ、電顕において膵島細胞と膵外分泌細胞や
導管細胞との間に細胞間接着装置が観察された。

【実施例５】ＢＴＣ遺伝子導入動物の作出 参考例５記載のプラスミドｐＴＢ１９６９を制限酵素Ｃ
ｌａＩで切断し、２．２ｋｂ ＤＮＡ断片（ラットエラ
スターゼＩプロモーターによるｈＢＴＣ発現ユニット）
を単離した。このＤＮＡ溶液（１０μg/ml,５ｍM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１mMＥＤＴＡ）をＢ
ＤＦ₁マウスの受精卵にマイクロインジェクション法に
より注入したのち、偽妊娠０．５日目のＩＣＲマウスの
卵管に移植した（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第7
8巻、第5016 頁、1981年）。生まれた子マウス１２１匹
の尾からゲノムＤＮＡを調製し、プライマーＲＥＬ−１
（参考例５に記載）およびプライマーＢＴ１０７ｈ
［５’−ＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣ−
３’（配列番号：１５）］を用いてＰＣＲ法により導入
遺伝子の検定を行った。ＰＣＲの結果、期待される１．
０kbのバンドが増幅された１４匹のマウスについて、そ
のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ消化したのち、ヒトＢＴ
ＣｃＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーシ
ョン法による解析を行った。結果を図１１に示した。１
コピーから１０コピーの導入遺伝子が組み込まれたヒト
ＢＴＣ遺伝子導入マウスが得られた。これらのマウスで
は膵臓ａｃｉｎａｒ細胞でのＢＴＣの特異的発現が期待
される（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．３１３，６００−６０
２，１９８５）。

【００４１】

【発明の効果】本発明のＢＴＣ遺伝子が不活性化された
非ヒト動物胚幹細胞は、ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動
物を作出する上で、非常に有用である。本発明のＢＴＣ
発現不全非ヒト動物は、ＢＴＣにより誘導され得る種々
の生物活性を欠失するため、ＢＴＣの生物活性の不活性
化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、ＢＴＣ欠
損に起因する各種疾病の予防・治療薬にスクリーニング
や、ＢＴＣ関連疾患の原因究明および治療法の検討に有
用である。さらに、ＢＴＣプロモーター活性の促進また
は阻害活性を有する化合物またはその塩のスクリーニン
グに有用である。本発明のＢＴＣ遺伝子導入非ヒト動物
は、高ＢＴＣ症、ＢＴＣ機能不全症などのＢＴＣ関連疾
患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検
討を行なうことができる。また、上記ＢＴＣ関連疾患に
対する治療薬のスクリーニングに使用することができ
る。さらに、外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子
を含有し、動物において発現し得るベクターを含有して
なる遺伝子治療用医薬はＢＴＣ関連疾患の遺伝子治療薬
として有用である。本発明のスクリーニング方法は、Ｂ
ＴＣ欠損に起因する各種疾病の予防・治療薬、またはＢ
ＴＣプロモーター活性の促進または阻害活性を有する化
合物またはその塩を効率良くスクリーニングすることが
できる。

【００４２】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ １ ５
１０ １５ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ ２０ ２５
３０ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ ３５ ４０
４５ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ ５０ ５５
６０ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ
Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ ６５ ７０
７５ ８０

【００４３】

【配列番号：２】 配列の長さ：８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ １ ５
１０ １５ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ ２０ ２５
３０ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ ３５ ４０
４５ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ ５０ ５５
６０ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ
Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ ６５ ７０
７５ ８０

【００４４】

【配列番号：３】 配列の長さ：２４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴ ＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧ ＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴ ＡＡＴ
ＧＧＣＣＴＣＣ ＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡ ＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡ ６０ ＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧ ＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣ ＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧ ＣＧＧ
ＡＡＡＧＧＣＣ ＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧ ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧ １２０ ＣＡＡＴＡＣＡＡＧＣ ＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴ ＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡ ＴＧＣ
ＣＧＣＴＴＣＧ ＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡ ＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣ １８０ ＴＣＣＴＧＴＧＴＣＴ ＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧ ＣＴＡＣＡＴＴＧＧＡ ＧＣＡ
ＡＧＧＴＧＴＧ ＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡ ＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣ ２４０

【００４５】

【配列番号：４】 配列の長さ：２４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ＧＡＴＧＧＧＡＡＣＡ ＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣ ＡＣＣＡＧＡＡＡＣＣ ＡＡＴ
ＧＧＣＴＣＴＣ ＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣ ＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡ ６０ ＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧ ＧＴＡＣＣＡＣＣＣＣ ＴＡＧＡＣＡＧＡＡＡ ＧＴＧ
ＡＡＡＡＣＣＣ ＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧ ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧ １２０ ＣＡＧＴＡＣＡＡＧＣ ＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴ ＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡ ＴＧＣ
ＣＧＣＴＴＣＧ ＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡ ＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣ １８０ ＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴ ＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧ ＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧ ＧＣＴ
ＣＧＧＴＧＴＧ ＡＧＣＧＡＧＴＧＧＡ ＣＣＴＧＴＴＴＴＡＣ ２４０

【００４６】

【配列番号：５】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGAGTCAAGG ATCCCCCAAC CACT 24

【００４７】

【配列番号：６】 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCTGGTCAC TTAGGGCTGG GG 22

【００４８】

【配列番号：７】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAATCGATAG AGTCAAGGAT CCCCCA 26

【００４９】

【配列番号：８】 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTCGAGCT GGTCACTTAG GG 22

【００５０】

【配列番号：９】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACCTGCGTGC AATCCATCTT GTTC ２４

【００５１】

【配列番号：１０】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＡＣＡＣＣＴＧＣＣ ＴＴＣＡＧＧＧＣＴＡ ＡＡＴＧ
24

【００５２】

【配列番号：１１】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCAGACCTG TTTGCTCTCC ATAAC 25

【００５３】

【配列番号：１２】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGTAGACCA CTGCCCCTTG CCATG ２５

【００５４】

【配列番号：１３】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＣＴＣＡＧＴＣＣ ＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴ ＧＣＴＣＴＣＣ
27

【００５５】

【配列番号：１４】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACTCGAGTA GACCACTGCC CCTTG 25

【００５６】

【配列番号：１５】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCAGTGGCA GGGAGCTGGC
２０

【００５７】

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスゲノムＤＮＡおよび参考例３で得られた
プラスミドｐＴＢ１８７５を用いたターゲティングコン
ストラクトを示す。図中、イントロン部分は細実線で、
エクソン部分は太実線で示した。また、ＬａｃＺはβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＮＥＯはネオマイシン耐性
遺伝子を、ＨＳＶ−ＴＫは単純ヘルペスウイルス−チミ
ジンキナーゼ遺伝子を示す。

【図２】参考例３で得られたターゲティングベクターｐ
ＴＢ１８７５の構築図を示す。図中、Ａｐ^ｒはアンピシ
リン耐性遺伝子を、ＨＳＶ−ＴＫは単純ヘルペスウイル
ス−チミジンキナーゼ遺伝子を示す。

【図３】参考例３で得られたターゲティングベクターｐ
ＴＢ１８７５の構築図を示す。図中、Ａｐ^rはアンピシ
リン耐性遺伝子を、ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を、Ｎｅｏ^rはネオマイシン耐性遺伝子を、Ｔｃ^rは
テトラサイクリン耐性遺伝子を示す。

【図４】実施例１で得られたＢＴＣノックアウトＥＳ細
胞株のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。

【図５】参考例４で得られたＢＴＣ遺伝子導入ベクター
ｐＴＢ１８８４の構築図を示す。図中、Ａｐ^rはアンピ
シリン耐性遺伝子を、ＭｕＬＶＬＴＲは、マウス白血病
ウイルス遺伝子−長末端反復配列を、ｈＢＴＣはヒトベ
ータセルリン遺伝子を、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡはＳＶ４０
ポリＡ付加シグナルを示す。

【図６】マウスＢＴＣゲノムＤＮＡおよびターゲティン
グされた変異アレルを示す。図中、イントロン部分は細
実線で、エクソン部分は太実線で示した。また、Ｌａｃ
Ｚはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＮＥＯはネオマイ
シン耐性遺伝子を示す。また、図中に実施例３で用いた
プライマー（Ｎｅｏ２、ｍＢＴ４０）およびプローブＡ
の位置を示す。

【図７】実施例３で得られたＢＴＣ欠損ヘテロ接合体マ
ウスのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気
泳動図を示す。図中、レーン１〜５および７は作出した
ヘテロ接合体マウス各個体、レーン６は野性型マウス、
レーン８はＢＴＣノックアウトＥＳ細胞株（ＢＢ１５Ｆ
１１）を示す。

【図８】実施例４で得られたＢＴＣホモ欠損マウスのサ
ザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動図を
示す。図中、レーン１〜５はホモ欠損マウス、６，７は
ヘテロ欠損マウス、８は野性型マウスの各個体を示す。

【図９】ＢＴＣ欠損マウスの腎臓におけるＢＴＣの発現
をノーザンブロットで解析したの結果を示す図を示す。
図中、＋／＋は野性型、＋／−はヘテロ欠損マウス、−
／−はホモ欠損マウスを示す。

【図１０】参考例５で得られたヒトＢＴＣ遺伝子導入ベ
クターｐＴＢ１９６９のコンストラクトを示す。

【図１１】実施例５で得られたヒトＢＴＣ遺伝子導入マ
ウスのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気
泳動図を示す。図中、レーン１および２は導入ＤＮＡ１
０コピーおよび１コピー、レーン３〜６は作出したＢＴ
Ｃ遺伝子導入マウス各個体を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】不活性化ベータセルリン遺伝子配列を有す
   ることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物また
   は当該遺伝子配列を有するその子孫。
2. 【請求項２】胚形成初期において導入された不活性化ベ
   ータセルリン遺伝子配列を、生殖細胞または体細胞に有
   する請求項１記載の動物。
3. 【請求項３】レポーター遺伝子を導入することにより不
   活性化されたベータセルリン遺伝子配列を有し、該レポ
   ーター遺伝子がベータセルリンプロモーターの制御下で
   発現し得る請求項１記載の動物。
4. 【請求項４】レポーター遺伝子が大腸菌由来β−ガラク
   トシダーゼ遺伝子である請求項３記載の動物。
5. 【請求項５】不活性化ベータセルリン遺伝子配列を有す
   ることを特徴とする非ヒト動物胚幹細胞。
6. 【請求項６】レポーター遺伝子を導入することにより不
   活性化されたベータセルリン遺伝子配列を有する請求項
   ５記載の胚幹細胞。
7. 【請求項７】外来性ベータセルリン遺伝子またはその変
   異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有することを特徴とする
   非ヒト動物または該ＤＮＡを有するその子孫。
8. 【請求項８】非ヒト動物が非ヒト哺乳動物である請求項
   １または請求項７記載の動物または請求項５記載の胚幹
   細胞。
9. 【請求項９】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項
   ９記載の動物または胚幹細胞。
10. 【請求項１０】ゲッ歯動物がマウスである請求項９記載
    の動物または胚幹細胞。
11. 【請求項１１】請求項１記載の動物を用いることを特徴
    とする、ベータセルリンの欠損に起因する疾病の予防・
    治療薬のスクリーニング方法。
12. 【請求項１２】請求項３記載の動物に、試験化合物を投
    与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴と
    するベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害
    する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
13. 【請求項１３】請求項１１記載のスクリーニング方法を
    用いて得られるベータセルリンプロモーター活性を促進
    または阻害する化合物またはその塩。
14. 【請求項１４】外来性ベータセルリン遺伝子またはその
    変異遺伝子を含有し、動物において発現しうるベクター
    を含有してなる遺伝子治療用医薬。