JP4896401B2 - ウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、薬品ウルソル酸に関するものであり、具体的にはウルソル酸のナノメートルレベルの凍結乾燥粒子の注射剤とその製造方法に関する。

ウルソル酸は植物体内の有機酸の一種である。近年、国の内外の実験研究から本品が腫瘍や炎症、一部の遺伝子に対し影響を及ぼすことが分っている。

目下、ウルソル酸関連の薬理作用に関する研究はいずれも実験室内での段階にとどまっており、ウルソル酸の製剤は市場に出ていない。近年、中国国内で、ウルソル酸の錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射薬、内服液の国内特許が出願されている。その出願番号は９９１２６８９２−Ｘである。ウルソル酸の水溶性は低く、内服後容易には吸収されない。中国国外のウルソル酸関連の研究もいずれも原料の一般形態についてのものだけであり、そのナノメートルレベルの形態に関する文献はいまだ発表されていない。

本発明の目的は、ナノメートルレベルのウルソル酸凍結乾燥粒子注射剤とその製造方法を提供して、その安全性を高めることにある。

本発明のナノメートルレベルウルソル酸凍結乾燥粒子注射剤の主要な原料は、活性原料ウルソル酸、ウルソル酸ナノ粒子用複合担体、凍結乾燥助材である。

ウルソル酸ナノ粒子用複合担体には大豆レシチンおよびステアリン酸を選択する。

凍結乾燥助材中の賦形薬には、マンニトール、注射用乳糖、注射用ブドウ糖、デキストラン、塩化ナトリウム、グリシンナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、アミノ酢酸のうちから１種を用いる。好ましくは乳糖を用いる。

ウルソル酸の一般製剤と比較すると、ウルソル酸ナノ粒子注射剤は、肝臓への標的指向性と良好な遅延放出効果を備えており、病変部位に集中可能なため、薬物の治療効果が上がり、副作用を減少させる。

その製造方法は、以下のとおりである。医薬用有機溶剤を用いて溶解したウルソル酸に、複合担体の大豆レシチンとステアリン酸を加え、４５〜５５℃に加熱し反応が完成するまで攪拌する。次に蒸留水を加え、賦形薬を加え、３５〜５５℃に加熱して反応が完成するまで攪拌する。その後、細孔ろ過膜でろ過し、ろ液を凍結乾燥して凍結乾燥粒子注射剤を製造する。有機溶剤にはメタノール、アセトンの中から１種または２種を用いる。当該ナノ粒子注射剤は分散度が高い、安定性がよい等の優れた点を備えている。その平均粒径は２０９．５ｎｍ、薬物含量２５．２％であり、当該薬物は肝ガン細胞への抑制作用、殺傷作用を備え、ｐ５３、ｂｃ１−２、Ｔｏｐｏ−ＩＩの発現を低減させる。

活性原料ウルソル酸、ウルソル酸ナノ粒子用複合担体の大豆レシチンおよびステアリン酸、凍結乾燥助剤の乳糖の重量比を０．１〜１０：０．３〜３０：０〜１０：０．１〜２０とする。

図に示すように、処方されたウルソル酸２０００ｍｇを取り、メタノール１０ｍｌを加えて室温で攪拌溶解した後、大豆レシチン３０００ｍｇ、ステアリン酸１０００ｍｇを加えて、４５〜５５℃に加熱する。５０℃の場合１０分攪拌する。蒸留水４０ｍｌと乳糖２０００ｍｇを加え、３５〜５５℃にする。５５℃の場合３０分攪拌する。その後、０．８μの細孔ろ過膜を用いてろ過し、ろ過液を−４５〜−５５℃にする。−５０℃の場合、凍結２〜４時間して完成品となる。

品質検査
本発明で得られたウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の薬物封入率は８８．３％、薬物含量は２５．２％であった。レーザー粒径測定装置で測定した粒径は平均２０９．５ｎｍ、ゼータ電位は−３１．６７ｍＶ、多分散指数（polydispersity）は０．１４９であった。

動物に対する急性毒性試験
１．実験動物：健康な昆明種マウス、体重１８〜２０ｇ、雌雄同数、雌雄同数、同済医科大学動物所提供、合格証番号１９−０５２。

２．供試薬品の調製：（１）ウルソル酸溶液の調製：ウルソル酸（含有量９９．７％）６６６０ｍｇを取り、２０％のプロピレングリコール水溶液１０ｍｌに溶かす。（２）ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の調製：ウルソル酸８３５０ｍｇに相当するサンプル薬品をはかり、１０ｍｌの水に溶かす。薬量を７割ずつ逓増させる。

３．実験方法：実験動物をランダムに５群に分ける。各群１０匹、絶食１４時間後、尾の静脈に０．５ｍｌを一度に注射し、直ちに反応を観察して、動物の死亡を陽性指標とする。各群の死亡数を記録する。Ｂｌｉｓｓ法によりＬＤ５０を算出する。

４．結果：実験から動物の死亡はすべて投与後２日以内に発生したことがわかった。生存している動物を７日間連続で観察した結果、以降の死亡は出現しなかった。動物の死亡は、すべて四肢の麻痺、筋肉の弛緩、最後は呼吸停止での死亡であった。

実験データは表に示した。

以上の結果は、ウルソル酸ナノ粒子注射剤は原薬に比べて毒性が低いことを示している。

薬力学試験
ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の肝ガン細胞への抑制作用研究

１．細胞株
ヒトの肝ガン細胞株ＳＭＭＣ−７７２１は第四軍医大学生物教研室による提供。

２．主な試薬
ＲＰＭＩ−１６４０培地はギブコ社の製品を用いる。説明に従い３回蒸留して得られた水を用いて調製し、ウシ胎児血清１０％（Ｖ／Ｖ）、ペニシリン１０００Ｕ／ｍＬとストレプトマイシン１００Ｕ／ｍＬを添加して０．２２Ｕろ過器で除菌し、４℃の冷蔵庫で保存する。ウシ胎児血清は浙江省金華市清湖犢牛応用研究站の製品を用いる。ＭＴＴ［３−（４，５）−メチルエチルチアゾール−（２，５）−ジメチルプロミドブルーテトラゾリウム］はアメリカのシグマ社製で、リン酸塩緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４，ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬの溶液をつくり、ろ過除菌し、４℃の冷蔵庫で保存する。ＴＵＮＥＬ未端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼキット［Ｔｅｒｍｉ−ｎａｌｄｅｏｘｙｌｎｕｃｕｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）］はアメリカのプロメガ社製を用いる。ＤＩＧ−ｄＵＴＰはドイツのＢＭ社の製品を用いる。Ａｎｔｉ−ＤＩＧ−Ｂｉｏｔｉｎはアメリカのシグマ社の製品を用いる。エトポシドは北京製薬工業研究所実験薬廠の製品を用いる。免疫組織化学法試薬キットは武漢博士徳公司の製品を用い、一次抗体は小ロット包装の輸入品で、ＳＡＢＣ及びＤＡＢキットはともに武漢博士徳公司製である。

３．実験方法
３．１ 実験用薬品の調製：ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤に注射用水を加え完全に溶解した後、加熱煮沸（１００℃３０分）して濃度を１００ｍｇ／ｍＬ（ウルソル酸含有）に調整する。使用前、無菌環境下で培養液で段階希釈して必要な濃度にする。

３．２ 細胞培養：ヒトのガン細胞株ＳＭＭＣ−７７２１をＲＰＭＩ−１６４０完全培養液内で定法によって培養し、３７℃、ＣＯ_２５％のインキュベータに２日〜３日置き、１代継代させる。対数増殖期細胞を取り実験に供する。

３．３ ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のＳＳＭＣ−７７２１に及ぼす作用の観察：対数増殖期のＳＭＭＣ−７７２１細胞を取って定法によって消化し、細胞濃度を１×１０^４／ｍｌに調整し、９６ウエル培養プレートに、各ウエル１００μＬずつ播種する。ＲＰＭＩ−１６４０培養液でウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤液およびエトポシド（ＶＰ１６）を必要な実験濃度にそれぞれ希釈し、細胞播種の２４時間後、９６ウエルプレートに各ウエル１００μＬずつ滴下する。実験群はウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射薬液＋ＳＭＭＣ−７７２１、陽性対照群はＶＰ１６＋ＳＭＭＣ−７７２１、陰性対照群はＣＭ＋ＳＭＭＣ−７７２１である。各群さらに３つのウエルを割り当て、ブランクウエルは２００μＬの完全培養液とする。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで継続培養し、１日、３日、５日、７日後、濃度５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを各ウエル２０μＬずつ加え、４時間インキュベートした後に、各ウエルの上清を慎重に吸い出す。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウエル１５０μＬずつ加え、振とう溶解した後に、４９０ｎｍの波長で各ウエルの吸光度（ＯＤ値）を測定する。薬物濃度を横軸に、細胞増殖抑制率を縦軸にして曲線を描く。
抑制率（Ｅ）＝（１−ＯＤ薬／ＯＤ対）×１００％。

３．４ 薬物のｐ５３、ＴｏｐｏＩＩ、ｂｃ１−２に対する作用：定法によって培養した細胞標本に、２４時間後、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤を濃度１０μｇ／ｍＬにして加え、４８時間および７２時間作用させ、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤を加えないものと対照する。培養終了後、冷ＰＢＳで軽く２回洗浄する。予冷した９５％アルコールで固定し、４℃で保存する。透明なセロファンテープを用いて細胞標本の背面をスライドガラスの上に貼り付け、細胞面は上向きにし、３７℃で乾燥させ、ＰＢＳに５分浸けて洗浄し、０．３％トリトンＸ−１００で１０分処理し、０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳで５分洗浄を２回行い、３％オキシドールに３７℃で３０分浸けて洗浄し、ＰＢＳで５分洗浄を３回行い、二次抗体を加え、３７℃で３０分置いた後、ＰＢＳで５分洗浄を３回し、ＤＡＢ染色液を１５μＬずつ滴下して、５〜１５分発色させる（ＤＡＢ ５ｍｇは１０ｍＬのＰＢＳに溶かし、ろ紙でろ過後、３０％オキシドール１０μＬ〜１５μＬを加える）。顕微鏡観察して、発色したらスライドを蒸留水中に入れ、発色を止める。ｂｃ１−２のスライドは非細胞核発色であり、さらに核の対比染色をする：ヘマトキシリンで１分間染色し、水道水で洗い流し、塩酸アルコールに２〜５分浸けてから水洗いし、希アンモニア水に１５〜２０秒浸けてから水洗いする。すべてのスライドを段階的にアルコール脱水した後、キシレンで１５分透徹し封入する。結果判定：光学顕微鏡観察で、ｐ５３及びＴｏｐｏＩＩは細胞核が黄色から濃いチョコレート色に発色したのを陽性細胞とし、ｂｃ１−２は細胞質が淡黄色を呈するのを陽性細胞とする。低倍率顕微鏡で、バックグラウンドが鮮明で、ＤＡＢ発色対比が最も満足できる３区域を選択し、高倍率顕微鏡に換えて、細胞５００個ごとの陽性細胞の数をそれぞれ計算する。３区域の陽性細胞の平均数を取って陽性率とする。弱陽性（＋）：＜２０％；強陽性（＋＋＋）：＞７０％；中度陽性（＋＋）：両者の間。

４．結果
４．１ ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の肝ガン細胞ＳＭＭＣ−７７２１に対する投与量依存抑制：
ＭＴＴ法によりウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のＳＭＭＣ−７７２１増殖に対する抑制を測定した。ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤はＳＭＭＣ−７７２１細胞の増殖に対してあきらかな抑制・殺傷作用が見られた。ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の投与量の増加にしたがって抑制程度も強まり、両者はプラスの相関関係（ｒ＝０．９７６，ｐ＜０．０１）を示した。統計学処理で曲線を直線に近似させて回帰計算した結果、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のＩＣ５０は４μ／ｍＬを示した。ＩＣ５０（ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤）＜ＩＣ５０（ＶＰ１６）、（ｔ＝−１０．８４，Ｐ＜０．０１）という結果は、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のＳＭＭＣ−７７２１に対する抑制作用があきらかにＶＰ１６より勝っていることを示している。

４．２ ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のＳＭＭＣ−７７２１細胞のｐ５３、ＴｏｐｏＩＩ、ｂｃ１−２発現へ及ぼす影響：
免疫組織化学法でｐ５３、ＴｏｏｐＩＩ、ｂｃ１−２の発現を測定すると（表２）、ＴｏｏｐＩＩ、ｐ５３蛋白は細胞核内のみに存在し細胞質中にはなく、細胞は黄色から濃いチョコレート色に染色した。ｂｃ１−２蛋白は細胞質中で淡黄色に発色し、核内にはなかった。ＳＭＭＣ−７７２１の正常細胞対照染色において３者はいずれも陽性または強い陽性を示したが、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤の細胞に作用する時間を長くするにつれて、３者ともあきらかに低減変化を示した。

５．結論
以上の実験は、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤のヒト肝ガン細胞ＳＭＭＣ−７７２１に対する抑制作用および殺傷作用がエトポシド（ＶＰ１６）をあきらかに上回り、且つ、投与量の増大につれてその抑制強度も増し、両者は正の相関関係を示すことを物語る。さらに行われた研究は、ウルソル酸−大豆レシチンナノ粒子注射剤がｐ５３、ｂｃ１−２、ＴｏｐｏＩＩ発現を抑制し得ることを証明し、それによるガン細胞の増殖抑制作用および殺傷作用の達成を明らかにした。

本発明製剤およびウルソル酸原薬を用いて、腸ガン（ＨＴ−２９）、肺ガン（Ａ５４９）、肝ガン（Ｈｅｐ−Ｇ２）細胞のインビトロ抗癌実験を行い、薬物の作用時間と効果との関係を観察する：薬物の作用時間と抑制率との関係をみる実験では、薬物を作用させて２、３、４日の細胞抑制率をそれぞれ観察した。３種の細胞系に対して原薬の及ぼす作用を観察する過程では、低濃度０．１、０．５、２μｇ／ｍｌにおける抑制作用は弱く、作用時間の延長に伴う抑制率の伸び方はいずれも緩慢であった。高濃度下、１０、５０μｇ／ｍｌにおける抑制作用は強く、時間の延長に伴う抑制率の上がり方も速く、３日目には９５％以上に達した。３種細胞系に対して製剤の及ぼす作用を観察する過程では、低濃度０．１、０．５、２μｇ／ｍｌにおける抑制作用は弱く、作用時間の延長に伴うその抑制率の増大は緩慢だった。１０μｇ／ｍｌの時に抑制作用が強く、時間の延長に伴い抑制率はいずれも増大する傾向にはあるが、Ａ５４９に対する抑制作用は他の２種の細胞に対するより弱かった。５０μｇ／ｍｌの時に抑制作用は作用時間の延長に伴って速やかに増大する傾向を示し、３日目には９５％以上に達した。この結果は、ＨＴ−２９、Ａ５４９、Ｈｅｐ−Ｇ２の３種の細胞系に対して、薬物が最大の作用を発揮するのは４日目であることを示しており、このことは本発明製剤が良好な遅延放出効果を備えていることを物語っている。

ウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤製造のフローチャートを示す。

Claims (4)

1. ウルソル酸と、
   大豆レシチンおよびステアリン酸からなる複合担体と、
   乳糖と、からなることを特徴とするウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤。
2. ウルソル酸を有機溶剤で溶解後、複合担体として大豆レシチンとステアリン酸を加え、４５〜５５℃に加熱して反応が完全になるまで攪拌し、蒸留水を加え、乳糖を加え、３５〜５５℃に加熱して反応が完全になるまで攪拌し、その後、細孔ろ過膜でろ過し、ろ過液を凍結乾燥させることを特徴とするウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法。
3. 前記有機溶剤が、メタノールまたはアセトンの１種または２種であることを特徴とする請求項２に記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法。
4. 凍結乾燥温度が、−４５〜−５５℃であることを特徴とする請求項２または請求項３に記載のウルソル酸−大豆レシチン凍結乾燥ナノ粒子注射剤の製造方法。

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