CN108201543A - 水溶性富勒烯结构在制备治疗脂肪肝的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水溶性富勒烯结构在制备治疗脂肪肝的药物中的应用，还公开了一种治疗脂肪肝的药物组合物及方法。本发明中治疗脂肪肝的有效成分为水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用盐。本发明的有效成分水溶性富勒烯结构能够减少肝脏内脂肪泡，降低血脂，明显改善肝功能使谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量趋于正常，达到高效治疗脂肪肝的效果；同时有效成分水溶性富勒烯结构还能调节肝脏内氧化还原水平。

Description

水溶性富勒烯结构在制备治疗脂肪肝的药物中的应用
本发明要求北京福纳康生物技术有限公司和中国科学院化学研究所于2016年12月19日向中国专利局提交的、申请号为CN201611180067.3、发明名称为“水溶性富勒烯结构在制备治疗脂肪肝的药物中的应用”的中国专利申请的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本发明中。
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种水溶性富勒烯结构在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。
背景技术
脂肪性肝病(即脂肪肝)是一种可以由多种诱因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，同时也是多种肝脏疾病发展过程中的一种病理过程，是最常见的弥漫性肝病之一。脂肪肝的机制至今尚未完全明确。脂肪肝表现为肝内脂质尤其是甘油三酯蓄积过多，超过肝脏重量的5％；或者在组织学上50％以上的肝实质脂肪化，半数以上的肝细胞内出现空泡。脂肪肝根据发病机理可以分为酒精性脂肪肝、肥胖性脂肪肝、高脂血症性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝、营养失调性脂肪肝、药物性脂肪肝和妊娠脂肪肝等。还可分为胆固醇脂肪肝、磷脂质脂肪肝和中性脂肪脂肪肝，其中最普遍的是中性脂肪在肝脏中非正常堆积形成的脂肪肝。
近年来，随着我国人民生活饮食结构的变化以及医学影像检查技术的提高，各种诱因所致的脂肪肝在我国的诊断率逐年增加。脂肪肝正严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。若脂肪肝没有得到及时的治疗，很可能逐渐发展成脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、末期肝衰竭或肝癌。
富勒烯是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。这类物质指的是由碳原子组成的笼状结构，其含量最多的分子是C60，然后是C70、C84，其次是含量相对较少的C76、C78、C82等。另外由于富勒烯的碳笼内部为空腔结构，因此其内部空腔可内嵌不同原子、离子或原子簇，被称之为内嵌富勒烯，如La@C60，表示La内嵌在C60的笼状结构中，@表示at，形象的表达了内嵌的含义。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。本发明的另一目的在于提供一种治疗脂肪肝的药物组合物及方法。本发明的有效成分水溶性富勒烯结构能够降低肝指数，减少肝脏内脂肪泡和脂肪含量，降低血脂，明显改善肝功能使谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量趋于正常，达到高效治疗脂肪肝的效果；同时有效成分水溶性富勒烯结构还能调节肝脏内氧化还原水平。
为了实现目的，本发明提供了以下技术方案：
一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗脂肪肝的方法，包括向患有脂肪肝的受试者施用有效量的至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯和以上三者的可药用的盐。
本发明还提供了一种治疗脂肪肝的药物组合物，包括至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用盐，所述药物组合物还包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯选自下组的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的内嵌金属富勒烯选自下组的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的内嵌金属富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的内嵌金属富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的内嵌金属富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系内嵌金属富勒烯。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述富勒烯包括一种或多种通式为C2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，例如；C60，C70，C84等。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述内嵌金属富勒烯包括M@C2n、M2@C2n、MA@C2n、M3N@C2n、M2C2@C2n、M2S@C2n、M2O@C2n和MxA3-xN@C2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，30≤n≤60，0≤x≤3，例如：Gd@C82。N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基和水溶性氨基酸残基中的一种或多种。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸残基是指水溶性氨基酸在修饰富勒烯和/或内嵌金属富勒烯时，失去氨基酸分子的一部分后剩余的不完整的氨基酸，即：氨基酸残基是氨基酸分子的一部分，其是不完整的氨基酸。缺少氨基酸分子中的任何一个部分都算是氨基酸残基，如：失去氨基酸中氨基上的氢、失去氨基酸中羧基上的氢或羟基等。可选的，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基和天门氨酸残基中的至少一种。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯的通式为C2a(OH)b(Amino Acid)c，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；30≤a≤60，可选的a为30或35；0<b<50，可选的0<b<30，还可选的b＝13、20、22、24等；0≤c<20，可选的c＝2-15，还可选的c＝6。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的内嵌金属富勒烯的通式为M@C2d(OH)e(Amino Acid)f，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；M选自稀土金属，可选的稀土金属为Gd、La等；30≤d≤60，可选的d为41或30或35；0<e<50,可选的0<e<30，还可选的e＝13、20、22、24等；0≤f<20，可选的f＝2-15，还可选的f＝6。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述亲水性生物小分子包括氨基酸和肽链中的至少一种。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述具有生物相容性的载体材料包括脂质体和细胞膜载体的至少一种。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯是通过对原料富勒烯进行水溶性改性获得的；所述水溶性的内嵌金属富勒烯是通过对原料内嵌金属富勒烯进行水溶性改性获得的。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性改性的方法为以下方法中的任一种：(1)表面修饰亲水基团的方法一般在碱的作用下通过固液或者液液反应实现，具体为将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与双氧水和碱溶液混合并进行反应，再用乙醇洗涤，然后透析，即可得到与原料相应的水溶性羟基衍生物。如果需要获得水溶性氨基化衍生物，将上述步骤中的氢氧化钠替换成氨水即可。(2)物理包覆的方法可以将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和环糊精中的至少一种混合并进行球磨或超声等就可以得到与原料相应的被包覆的水溶性富勒烯结构，如聚乙二醇包覆的富勒烯和/或聚乙二醇包覆的内嵌金属富勒烯，聚乙烯吡咯烷酮包覆的富勒烯和/或聚乙烯吡咯烷酮包覆的内嵌金属富勒烯。(3)当水溶性的富勒烯结构中含氨基酸残基的个数不为0时，包括以下步骤：(a)使用水溶性氨基酸和NaOH/KOH配制水溶性氨基酸碱溶液(可选的，水溶性氨基酸和NaOH/KOH的摩尔比为1:1-10，还可选的为1:2或1:1-8；可选的，水溶性氨基酸碱溶液中NaOH/KOH的质量分数可为10～50％，还可选的为14％或10～30％)；(b)按照氨基酸与原料富勒烯/原料内嵌金属富勒烯摩尔比为1-1000:1，可选的为50-1000：1，100-1000:1，200-1000:1，将氨基酸碱溶液与原料富勒烯/原料内嵌金属富勒烯进行混合；(c)将上述混合物40-80℃反应(可选的，所述反应为搅拌反应1-7小时)，过滤除去未反应的少量固体粉末；(d)滤液透析除去小分子杂质，过滤后，得到的棕黑色溶液即为本发明的氨基酸修饰的水溶性的富勒烯/内嵌金属富勒烯。可选的，透析所使用的透析袋的截留分子量Mw＝3500；可选的，透析后的过滤所使用的微孔滤膜的孔径200-220nm；可选的，透析至透析袋外液体的电导率小于1μs/cm。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天门氨酸中的至少一种。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，水溶性改性的方法(1)中所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，水溶性改性的方法(1)中固液反应包括称取50～200mg C60固体或C70固体或Gd@C82固体，以及3～15ml 20～40％的双氧水，2～10ml 5～20％的碱溶液，在50～100℃的条件下混合反应至固体全部溶解，然后用乙醇洗涤，透析，得到对应的羟基化衍生物，即水溶性富勒烯结构。可选的，透析至透析袋外液体的电导率小于1μs/cm。在此描述中，表现的是各物质之间的比例关系，实际应用中并不受50～200mg、5～15ml和2～10ml具体反应规模的限制，可按照比例进行扩大。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述原料富勒烯包括一种或多种通式为C2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，例如；C60，C70，C84等。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述原料内嵌金属富勒烯包括M@C2n、M2@C2n、MA@C2n、M3N@C2n、M2C2@C2n、M2S@C2n、M2O@C2n和MxA3-xN@C2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，30≤n≤60，0≤x≤3。N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述脂肪肝为肥胖性脂肪肝、高脂血症性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝、酒精性脂肪肝或药物性脂肪肝。
上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述治疗脂肪肝包括：1)使肝脏中游离脂肪酸的含量趋于正常；2)使弥漫性脂肪空泡减少(可以是空泡数量减少或体积减小)；3)改善肝功能，使肝功能指标(肝功能指标包括：谷丙转氨酶，谷草转氨酶)趋于正常；4)降低肝脏重量；5)改善肝脏内的氧化还原水平，使SOD活性，CAT活性和MDA含量恢复正常；6)降低血脂(血脂指标包括：总胆固醇，甘油三酯，高低密度脂)。
上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分制备成药物或药物组合物的方法可采用本领域普通技术人员公知的方法来制备，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。
上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、***胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(water syrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。
上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。
上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，当所述药物或所述药物组合物以液体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-50mg/mL，可选的为0.01-10mg/mL，0.01-20mg/mL，0.01-30mg/mL，0.01-40mg/mL；当所述药物或所述药物组合物以固体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-50mg/g，可选的为0.01-10mg/g，0.01-20mg/g，0.01-30mg/g，0.01-40mg/g。
上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为人或动物，动物可以为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、猴子等。
上述方法在另一种实施方式中，所述有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-500mg/kg/d，可选的为1-100mg/kg/d，1-20mg/kg/d，1-10mg/kg/d，施用疗程可以为5天-30天，根据病情可短期服用或长期服用；有效成分的施用方式可以为口服、静脉注射或腹腔给药。
本发明所用的术语“治疗”包括其通常被接受的含义，该含义包括阻止、预防、抑制、改善以及减缓、停止或逆转所产生症状或预期病变的发展。照此，本发明涵盖治疗性和预防性的施用。
本发明所用的术语“有效成分”、“有效成分水溶性富勒烯结构”或“水溶性富勒烯结构”均指的是水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯和以上三者的可药用的盐中的至少一种。
本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。
本发明所用的术语“原料富勒烯”、不加任何修饰词的“富勒烯”均是指没有经过水溶性改性的富勒烯，即富勒烯本体。
本发明所用的术语“原料内嵌金属富勒烯”、不加任何修饰词的“内嵌金属富勒烯”均是指没有经过水溶性改性的内嵌金属富勒烯，即内嵌金属富勒烯本体。
本发明所用的术语“水溶性的富勒烯”是指富勒烯本体经过水溶性改性后获得的水溶性改性富勒烯。
本发明所用的术语“水溶性的内嵌金属富勒烯”是指内嵌金属富勒烯本体经过水溶性改性后获得的水溶性改性内嵌金属富勒烯。
为了方便计量，本发明中所有关于水溶性富勒烯、水溶性金属富勒烯的具体含量、浓度等定量的限定均是以其对应的富勒烯本体或内嵌金属富勒烯本体的具体含量、浓度等来衡量的，例如：有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-500mg/kg/d是指每1天每1kg的小鼠要施用的有效成分中对应的富勒烯本体碳笼的量为1mg-500mg。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明中使原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯实现水溶性，是为了使其在生物体内随着血液循环输送至肝脏，在肝脏发挥作用，从而改善肝脏的脂质代谢，减少游离脂肪酸，减少肝脏内脂肪泡，降低甘油三酯的含量，明显改善肝功能使谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量趋于正常，达到高效治疗脂肪肝的效果。同时，对脂肪肝的高效治疗也从根本上避免了脂肪肝发展成脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、末期肝衰竭或肝癌等重症的可能性。
2、本发明中有效成分水溶性富勒烯结构进入肝脏后，因其具有良好的清除自由基的效果，可以对肝脏进行“清理”，改善肝脏内的氧化还原水平。
3、本发明中有效成分水溶性富勒烯结构进入体内可以快速代谢，对体内器官不会有毒性。
附图说明
附图1为实施例1制备得到的C70对应的羟基化衍生物的热重分析及微商热重曲线。
附图2为Gd@C82(OH)n材料的电子自旋核磁共振(ESR)图。
附图3为实施例1所得Gd@C82(OH)n材料在生物体内的24h的代谢分布。
附图4为本发明实施例5中各个组的小鼠肝脏H&E染色对比图。
附图5为本发明实施例5中给药2周后小鼠体内的甘油三酯的含量。
附图6为本发明实施例5中给药2周后小鼠体内谷丙转氨酶ALT的含量。
附图7为本发明实施例5中给药2周后小鼠体内谷草转氨酶AST的含量。
附图8为本发明实施例6Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6热重分析及微商热重曲线。
附图9为本发明实施例6Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6的红外光谱图。
附图10为本发明实施例8中治疗后小鼠肝脏占体重比例图，N.S.表示生理盐水，GF表示Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6，即从左到右各组分别为：空白+生理盐水组、空白+GF组、模型组、治疗组-0.375mM、治疗组-0.75mM和治疗组-1.5mM。
附图11为本发明实施例8中治疗后小鼠肝脏HE染色病理切片图。
附图12为本发明实施例8中治疗后小鼠肝脏油红染色切片图。
附图13为本发明实施例8中治疗后小鼠肝脏脂质相对含量图。
附图14为本发明实施例8中治疗后小鼠血清ALT和AST含量图。
附图15为本发明实施例9中各组小鼠肝脏占体重比例柱状图，#表示与A组相比P<0.05，*表示与C组相比P<0.05。
附图16为本发明实施例9中各组小鼠肝脏内脂质含量柱状图，##表示与A组相比P<0.01，*表示与C组相比P<0.05。
附图17为本发明实施例9中各组小鼠肝脏HE染色病理切片。
附图18为本发明实施例9中小鼠血清中ALT和AST含量柱状图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。以下实施例所用原料Gd@C82固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量1141，纯度为99.1％。以下实施例所用原料C60固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量720，纯度99％。以下实施例所用原料C70固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量840，纯度99％。
实施例1、水溶性羟基化富勒烯结构的制备
称取100mg C60固体或100mg C70固体或100mg Gd@C82固体，7ml 30％的双氧水，3ml10％的氢氧化钠溶液，在50℃的条件下反应，至粉末全部溶解，然后用乙醇洗涤，透析，得到对应的羟基化衍生物，即水溶性富勒烯结构。
将其中的3ml 10％氢氧化钠溶液替换成一定量的30％氨水，其他步骤按照上述方法中的进行，得到对应的氨基化衍生物，即水溶性富勒烯结构。
透析后所得的羟基化衍生物或氨基化衍生物中含有较多液体，也可将其进行浓缩获得固体，但无论是否进行浓缩，原料富勒烯/原料内嵌金属富勒烯的水溶性改性已经完成，是否进行浓缩不影响水溶性改性后的富勒烯/内嵌金属富勒烯的使用，只要将其调整至合适的浓度即可。
实施例2、
对上述实施例1制备得到的C70对应的羟基化衍生物(以下简称C70-OH)进行元素分析(Flash EA 1112)，并结合热重和微商热重结果分析其所接羟基数。在元素分析的结果中，所述C70-OH中，C含量为37.85％，H含量为1.51％，N含量<0.3％。从附图1热重分析可知，C70-OH固体粉末中含3.7％的水，约为5个水分子，结合元素分析中H含量与C含量的比值，可推算碳笼表面修饰了24个羟基。所以C70-OH的平均结构式为C70(OH)24·5H2O。
对上述实施例1制备得到的Gd@C82对应的羟基化衍生物(以下简称Gd@C82(OH)n)进行元素分析，C含量为76.6％，H含量为0.89％，N含量小于0.6％。
实施例3、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C82(OH)n清除自由基能力检测
本发明通过电子自旋共振波谱(ESR)来检测水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C82(OH)n清除自由基的能力。
检测方法：采用紫外诱导产生羟基自由基的方法，将50μL质量浓度为39％的双氧水、50μLPBS缓冲溶液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)的二甲基吡啶N-氧化物(DMPO，自由基捕获剂)溶液混合，对照组直接照射紫外，而实验组立即加入20μL的按照实施例1中方法制备的水溶性内嵌金属富勒烯水溶液10μL，并分别用280nm的紫外光照射4min，检测自由基信号。如附图2所示，非平滑线为没有加入按照实施例1方法所得的水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C82(OH)n的空白对照，平滑线为加入Gd@C82(OH)n的实验组样品，与空白对照相比，加入Gd@C82(OH)n样品的信号明显降低，说明加入Gd@C82(OH)n样品的实验组存在的自由基较少，Gd@C82(OH)n有强的清除自由基能力。
实施例4、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C82(OH)n的体内代谢
取浓度为1mM的按照实施例1中的方法制备的Gd@C82(OH)n 200μL通过腹腔注射进入C57小鼠体内，正常饲养24h后解剖，取小鼠器官心，肝，脾，肺，肾，胰腺称重，并用65％的硝酸消解在120℃的条件下过夜，稀释50倍后通过ICP测定钆离子浓度。如附图3中，可以看出水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C82(OH)n在胰腺富集远多于心、肾、肺和脾。
实施例5、水溶性内嵌金属富勒烯Gd@C82(OH)n对脂肪肝的治疗
(1)实验方法
实验用的脂肪肝模型小鼠为db/db小鼠，此小鼠是瘦素受体基因缺陷导致肥胖，然后发展为较严重的脂肪肝的模型。购自南京动物模式中心，引自美国杰克逊实验室。
实验动物分为3组，每组6只。A组取6只db/m无脂肪肝的小鼠作为空白组，其给药治疗为施用与C组所用药物同体积的生理盐水；B组取6只db/db小鼠作为模型组，其给药治疗为施用与C组所用药物同体积的生理盐水；C组取6只db/db小鼠作为Gd@C82(OH)n实验组，其给药治疗为施用按照实施例1的方法制备的Gd@C82(OH)n。A-C组均采用腹腔给药的方式，各组小鼠的周龄进入第10周开始给药，每天给药1次，给药剂量为10mg/kg/d，连续给药两周。
(2)实验结果
本发明通过给药结束后处死小鼠，对小鼠的肝器官进行H&E病理切片，并取其血清进行肝功能指标谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST的检测以及血脂甘油三酯的检测，其检测结果如下。
1)H&E测试
小鼠给药2周后处死，取小鼠的肝脏固定于4％的甲醛中，然后石蜡包埋，切片，染色。如附图4中所示，空白组为正常的小鼠，其肝脏结构正常，无脂肪泡，模型组为具有脂肪肝但只接受了生理盐水治疗的小鼠，图中可以看出小鼠的肝脏中有大量的白色空泡，即脂肪泡，而经过按照实施例1的方法制备的Gd@C82(OH)n治疗的实验组小鼠的肝脏中的脂肪泡明显减少，证明水溶性富勒烯/金属富勒烯组合物对治疗脂肪肝有很好的效果。
2)甘油三酯的含量
小鼠给药2周后，眼眶取血，取全血，血液样品室温静置1h后，3500rpm离心15min，吸取上层血清，通过自动血生化仪测定甘油三酯TG的含量，如附图5所示，模型组相比于空白组甘油三酯TG的量明显升高，这是因为脂肪肝造成的脂肪代谢异常导致的甘油三酯含量增加，而治疗组的结果显示，经按照实施例1的方法制备的Gd@C82(OH)n治疗后的小鼠的甘油三酯含量明显降低，证明其具有治疗脂肪肝，降低血脂的作用。
3)肝功能指标测试
小鼠给药2周后，眼眶取血，取全血，室温静置1h后，3500rpm，15min，吸取上层血清，通过自动血生化仪测定肝功能指标谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST的含量。如附图6和7所示，相比于空白组，模型组的谷丙转氨酶ALT含量明显升高，而经过按照实施例1的方法制备的Gd@C82(OH)n治疗的实验组小鼠的谷丙转氨酶ALT含量明显降低，趋于正常。谷草转氨酶AST也有相应的规律，证明经过Gd@C82(OH)n治疗后小鼠的肝功能明显改善。
上述实施例对患有脂肪肝的db/db小鼠进行了治疗，结果表明水溶性的富勒烯结构能够有效的减少脂肪泡、降低血脂和改善肝功能。
实施例6、水溶性氨基酸修饰的内嵌金属富勒烯结构的制备
把10mg Gd@C82固体加入单口瓶中，加入NaOH质量分数为14％的β-丙氨酸-氢氧化钠溶液(即溶液中溶有丙氨酸和氢氧化钠，其中氢氧化钠的质量分数为14％)，使β-丙氨酸与氢氧化钠的摩尔比具体为1：2；使β-丙氨酸与Gd@C82的摩尔比为1000：1，50℃下剧烈搅拌1.5h，黑色固体逐渐溶解生成棕黑色溶液。过滤除去未反应的少量固体粉末，滤液使用乙醇洗涤，Mw＝3500透析袋透析除去小分子杂质，使用220nm微孔滤膜过滤后得到的棕黑色溶液即为本发明的水溶性氨基酸修饰的内嵌金属富勒烯结构。
实施例7
对实施例6使用Gd@C82制备得到的水溶性氨基酸修饰的内嵌金属富勒烯结构进行元素分析和热重曲线分析，元素分析的结果如下表所示，热重曲线分析如图8所示：
β-丙氨酸修饰的内嵌金属富勒烯结构的元素分析结果
根据热重曲线分析可以得出水溶性氨基酸修饰的内嵌金属富勒烯结构中含10.9％的水，经过计算约为13个H2O分子，再结合元素分析，进一步推测得到该物质的平均分子式为Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6，以下简称为GF。
图9为红外光谱在3300cm-1左右的强的吸收峰归属为O-H的伸缩振动，在1740和1630cm-1处中等的吸收峰归属为C＝O的伸缩振动、N-H的弯曲振动，在1568，1400和1300cm-1处的强峰分别为C＝C的伸缩振动、O-H的弯曲振动以及C-O、C-N的伸缩振动峰。由图9可知，本发明β-丙氨酸修饰的内嵌金属富勒烯结构中含有上述的亲水基团，即其是水溶性的。
实施例8、水溶性氨基酸修饰的内嵌金属富勒烯结构对脂肪肝的治疗
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的显著特征表现为肝脏脂肪变性，即甘油三酯等脂质以脂滴的形式堆积在肝细胞的细胞质中，因此肝脏会变得肥大，质量增加，肝脏占体重比例升高。
(1)治疗实验
本实验采用了ob/ob小鼠，ob/ob小鼠是一种瘦素分泌基因缺陷型肥胖症小鼠，其体内不能正常的产生瘦素(一种蛋白类激素，可以参与体内糖类和脂肪的代谢)，因此缺乏瘦素分泌的ob/ob小鼠会过量摄取食物，相对于瘦素分泌基因未缺陷的正常小鼠，ob/ob小鼠体重明显增加，体型变大，发展为较严重的脂肪肝模型。该小鼠购自南京大学-南京生物医药研究院，引自美国杰克逊实验室。
本实验小鼠分为6组，即：空白+生理盐水组、空白+GF组、模型组、治疗组-0.375mM、治疗组-0.75mM、治疗组-1.5mM，每组6只小鼠。空白+生理盐水组、空白+GF组均为不患有脂肪肝的背景小鼠，空白+生理盐水组、空白+GF组小鼠出生后第6周开始给药，给药时其平均体重为23g；模型组、治疗组-0.375mM、治疗组-0.75mM、治疗组-1.5mM均为ob/ob小鼠，小鼠出生后第6周开始给药，给药时其平均体重均为33g。上述各组中给药的方式按照以下内容进行。
空白+生理盐水组：小鼠每次给药为腹腔注射150μl生理盐水。每天给药一次，持续16天。
空白+GF组：小鼠每次给药为腹腔注射实施例6制备的水溶性金属富勒烯GF配制的1.5mM溶液150μl。每天给药一次，持续16天。
模型组：小鼠每次给药为腹腔注射150μl生理盐水。每天给药一次，持续16天。
治疗组-0.375mM：小鼠每次给药为腹腔注射实施例6制备的水溶性金属富勒烯GF配制的0.375mM溶液150μl。每天给药一次，持续16天。
治疗组-0.75mM：小鼠每次给药为腹腔注射实施例6制备的水溶性金属富勒烯GF配制的0.75mM溶液150μl。每天给药一次，持续16天。
治疗组-1.5mM：小鼠每次给药为腹腔注射实施例6制备的水溶性金属富勒烯GF配制的1.5mM溶液150μl。每天给药一次，持续16天。
(2)肝脏脂肪变性的病理与生理指标
如图10所示(#和##表示与空白对照组有显著性差异，*和**表示与模型组有显著性差异)，模型组ob/ob小鼠的肝指数(肝脏占体重百分比)显著高于不患有脂肪肝的健康背景小鼠，但是使用水溶性金属富勒烯进行治疗后，较高浓度的两个治疗组(0.75mM和1.5mM)肝指数明显下降，接近正常水平，印证了GF对非酒精性脂肪肝起到治疗作用。
病理切片则更加直观的说明GF材料可以改善ob/ob小鼠的肝脏脂肪变性，图11分别是各组小鼠肝组织HE染色病理切片在不同放大倍数下的结果。从中可以发现模型组ob/ob小鼠的肝脏出现大面积的肝细胞肿胀，细胞质疏松，脂质堆积在图中白色空泡处，细胞核被挤压到细胞边缘，基本的肝小叶结构被破坏，仅剩下细胞骨架可见；低浓度治疗组(0.375mM)的改善情况不明显，仅仅在汇管区的肝细胞可以发现有很少的一部分改善，肝组织的其余部分还是被大面积的脂肪空泡占据；中浓度治疗组(0.75mM)则有较明显的改善，从HE染色切片可以发现虽然肝组织内还是分布有较多的脂质空泡，但是肝小叶的结构得到了恢复，与不进行治疗的ob/ob小鼠相比，中浓度治疗组结构完整具有实质的肝细胞大大增加，细胞核大部分也处于正常位置；高浓度治疗组(1.5mM)的肝脏结构恢复更加优于其他治疗组，肝小叶汇管区的肝细胞完全恢复正常，排列整齐，形成有序的肝板和肝血窦结构，只有每个肝小叶远离汇管区的肝细胞仍然会出现一些脂质空泡，与不进行治疗的ob/ob小鼠肝脏相比，肝脏脂肪变性的情况已经得到了很大程度地改善。此外，与不患有脂肪肝的健康小鼠腹腔注射生理盐水的对照组相比，对健康小鼠腹腔注射样品GF的生理盐水溶液在病理上并没有对肝脏产生不良影响。
油红染色会将脂质特异性染色为橘红色，因此肝脏油红染色可以直观的反应出肝脏内脂质存在的情况，图12分别是各组小鼠肝脏油红染色在不同放大倍数下的结果。正常的小鼠肝细胞内不会出现脂滴，因此油红染色后仍呈现蓝紫色，而ob/ob小鼠肝脏的油红染色切片上可以看到大面积橘红色的脂滴，使用GF材料进行治疗后，脂滴优先从包含门静脉、肝动脉和胆管的汇管区周围减少，与HE染色切片显示出的结果一致。对油红染色结果进行光密度分析可以更直观的对比各组之间肝脏内的脂质含量，如图13所示(#和##表示与空白对照组有显著性差异，*和**表示与模型组有显著性差异)，正常小鼠肝脏内不会出现被染成橘红色的脂滴，而ob/ob小鼠使用0.375mM、0.75mM和1.5mM的GF生理盐水溶液腹腔注射16天后，与腹腔注射生理盐水的ob/ob小鼠(即模型组)相比，肝脏内脂质含量分别下降了40％、60％和85％，这证明GF材料通过腹腔注射可以很好的改善脂肪肝的症状，降低肝脏中的脂质含量。
此外，血清中的谷氨酸丙酮酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转氨酶(AST)含量也是反映肝脏功能的一个重要指标。因为ALT和AST主要存在于肝细胞胞浆中，只有在肝细胞受损的情况下才会释放到血液中，并且在血液中能够存在很长一段时间，所以血清中这两种酶的含量可以体现出肝脏受损的程度。如图14所示(#和##表示与空白对照组有显著性差异，*和**表示与模型对照组有显著性差异)，每一组柱状中左边和右边分别表示血清中ALT和AST的含量，可见患有脂肪肝的模型组ob/ob小鼠由于肝细胞受损血清中ALT和AST大幅增加，采用水溶性金属富勒烯GF治疗后血清ALT和AST含量下降，治疗组与模型组相比均具有显著性差异，说明肝细胞的受损伤情况得到了缓解并逐步恢复正常。
实施例9C70-OH对脂肪肝的治疗
1、实验动物
本实验所用的建模小鼠为5周龄的C57BL6/J小鼠，雄性，平均体重23.31g。在C57BL6/J小鼠5周大时使用30％果糖水和标准饲料喂养10周构建模型脂肪肝小鼠，30％果糖水和标准饲料喂养10周后的小鼠的平均体重为30.26g，经确认其全部患有脂肪肝；其余5周龄的C57BL6/J正常小鼠使用灭菌水和标准饲料喂养10周作为对照，灭菌水和标准饲料喂养10周后的正常对照小鼠的平均体重为27.70g。
2、实验分组
实验动物分为4组，每组6只，各组分别为：
A组为正常小鼠+生理盐水组：该组小鼠为不患有脂肪肝的正常小鼠，实验持续3周，每周一、三、五尾静脉注射生理盐水，注射量5ml/kg；
B组为正常小鼠+C70-OH生理盐水溶液组：该组小鼠为不患有脂肪肝的正常小鼠，实验持续3周，每周一、三、五尾静脉注射C70-OH浓度为2.5mg/ml的C70-OH生理盐水溶液，注射量5ml/kg，C70-OH是实施例1中制备得到C70对应的羟基化衍生物；
C组为模型小鼠+生理盐水组：模型小鼠患有脂肪肝，实验持续3周，每周一、三、五尾静脉注射生理盐水，注射量5ml/kg；
D组为模型小鼠+C70-OH生理盐水溶液(2.5mg/ml)组：模型小鼠患有脂肪肝，实验持续3周，每周一、三、五尾静脉注射C70-OH浓度为2.5mg/ml的C70-OH生理盐水溶液，注射量5ml/kg，C70-OH是实施例1中制备得到C70对应的羟基化衍生物。
上述实验持续3周，期间统计体重，最后取材血液、各个器官与组织，分别固定或冻存后留待进一步测试。
3、实验结果
(1)肝指数
脂质堆积在肝脏内使得肝脏质量增加，占体重比例增加，因此肝指数(肝脏质量占体重百分比)可以反映出肝脏内脂肪堆积的情况。如附图15所示，喂食30％果糖溶液的C组小鼠肝脏占体重比例相对于A组显著增加，D组尾静脉注射C70-OH生理盐水溶液后肝指数下降，且D组与C组相比均有显著性差异，说明C70-OH采用尾静脉注射对脂肪肝有一定的治疗效果。
(2)病理切片
分别对各组小鼠的肝组织进行HE染色和油红染色，并用光密度分析对油红染色结果进行半定量分析。如附图16所示，C组中脂质含量增加，与A组正常小鼠肝脏内的脂质含量相比具有很好的显著性差异，并且D组治疗小鼠的肝脏脂质含量显著下降，治疗后小鼠内肝脏堆积得到减少。
附图17为各组小鼠肝脏HE染色病理切片的结果。喂食30％果糖水的小鼠肝脏普遍出现水样变性，肝细胞体积增大，胞质疏松淡染，汇管区损伤较其他区间严重，肝细胞内出现大片空泡。尾静脉注射C70-OH后小鼠肝脏病变程度得到改善。
(3)血清血生化指标
附图18为各组小鼠血清中ALT和AST含量统计图，血清中ALT和AST含量反应出肝细胞受损坏死程度，可见采用30％果糖水喂养的小鼠血清ALT和AST只有轻微的上升，没有显著性差异，D组小鼠的ALT/AST水平下降，与肝指数、病理等结论对应。
综上，尾静脉注射2.5mg/ml浓度的C70-OH生理盐水溶液对果糖诱导的脂肪肝有治疗作用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗脂肪肝的药物中的应用。
2.一种治疗脂肪肝的药物组合物，其特征在于：包括至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用的盐，所述药物组合物还包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述水溶性的富勒烯选自下组中的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯；所述水溶性的内嵌金属富勒烯选自下组中的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的内嵌金属富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的内嵌金属富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的内嵌金属富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系内嵌金属富勒烯。
4.根据权利要求3所述的应用或权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基和水溶性氨基酸残基中的一种或多种；可选的，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基和天门氨酸残基中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的应用或权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：
所述水溶性的富勒烯的通式为C2a(OH)b(Amino Acid)c，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；30≤a≤60，可选的a为30或35；0<b<50，可选的0<b<30，还可选的b＝13、20、22、24等；0≤c<20，可选的c＝2-15，还可选的c＝6；
所述水溶性的内嵌金属富勒烯的通式为M@C2d(OH)e(Amino Acid)f，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；M选自稀土金属，可选的稀土金属为Gd、La等；30≤d≤60，可选的d为41或30或35；0<e<50,可选的0<e<30，还可选的e＝13、20、22、24等；0≤f<20，可选的f＝2-15，还可选的f＝6。
6.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述水溶性的富勒烯是通过对原料富勒烯进行水溶性改性获得的；所述水溶性的内嵌金属富勒烯是通过对原料内嵌金属富勒烯进行水溶性改性获得的。
7.根据权利要求6所述的应用或权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：
所述原料富勒烯包括一种或多种通式为C2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60；
所述原料内嵌金属富勒烯包括M@C2n、M2@C2n、MA@C2n、M3N@C2n、M2C2@C2n、M2S@C2n、M2O@C2n和MxA3-xN@C2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，30≤n≤60；0≤x≤3；N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。
8.根据权利要求6所述的应用或权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述水溶性改性选自以下方法的一种：
(1)表面修饰有羟基的水溶性的富勒烯/内嵌金属富勒烯的制备方法包括：将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与双氧水和碱溶液混合并进行反应，再洗涤透析；
(2)表面修饰有羟基和氨基酸残基的水溶性的富勒烯/内嵌金属富勒烯的制备方法包括：(a)使用水溶性氨基酸和NaOH/KOH配制水溶性氨基酸碱溶液(可选的，水溶性氨基酸和NaOH/KOH的摩尔比为1:1-10，还可选的为1:2或1:1-8；可选的，水溶性氨基酸碱溶液中NaOH/KOH的质量分数可为10～50％，还可选的为14％或10～30％)；(b)按照氨基酸与原料富勒烯/原料内嵌金属富勒烯摩尔比为1-1000:1，可选的为50-1000：1，100-1000:1，200-1000:1，将氨基酸碱溶液与原料富勒烯/原料内嵌金属富勒烯进行混合；(c)将上述混合物40-80℃反应(可选的，所述反应为搅拌反应1-7小时)，过滤除去未反应的少量固体粉末；(d)滤液透析除去小分子杂质，过滤。
9.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述脂肪肝为肥胖性脂肪肝、高脂血症性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝、酒精性脂肪肝或药物性脂肪肝。
10.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：所述治疗脂肪肝包括：1)使肝脏中游离脂肪酸的含量趋于正常；2)使肝脏中弥漫性脂肪空泡减少；3)改善肝功能，使肝功能指标(谷丙转氨酶，谷草转氨酶)趋于正常；4)降低肝脏重量；5)改善肝脏内的氧化还原水平，使SOD活性、CAT活性和MDA含量恢复正常；6)降低血脂。
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