CN109549926A - 一种pH敏感脂质体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种pH敏感脂质体的制备方法，属于制药领域，所述制备方法包括以下步骤：首先称取卵磷脂、胆固醇和Fmoc‑His于玻璃容器中，向玻璃容器中加入乙醇溶解，得混合液；然后向混合液中加入姜黄素无水乙醇溶液，混匀，减压蒸发除去有机溶剂至干成膜；然后加入磷酸缓冲盐溶液溶解，超声3‑5 min使其充分混合，混合均匀后得到黄色浑浊溶液，即为pH敏感脂质体。通过该方法制备的脂质体具有pH敏感性，同时解决了脂溶性药物不易溶于水的难题,同时还可降低被包封药物的毒性。

Description

一种pH敏感脂质体的制备方法
技术领域
本发明属于制药领域，具体地，涉及一种pH敏感脂质体的制备方法。
背景技术
脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。因其具有靶向性、稳定性、缓释型和低毒性等特点而在药物传递体系中发挥着重要的作用。肿瘤区域具有与正常组织相比特殊的微环境，如pH偏低，温度偏高(pH＜6.0，约39-42℃)以及部分酶过度表达等特点，造成脂质体中的药物释放受限，难以发挥药物的治疗作用。pH敏感脂质体结构中的脂质双分子层的稳定性随环境pH变化而变化，同时也可称其为酸敏脂质体。它不仅能够提高脂质体的靶向性，还能够促进药效的充分发挥并提高基因的表达水平。
姜黄素(CUR)是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类化合物,是中药姜黄的主要活性成分。研究表明,CUR是一种安全有效的具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种作用的药物，其中姜黄素在用于预防和***，对多种肿瘤细胞的产生、增殖、转移均具有抑制作用。但是，CUR不溶于水，且水溶液在中性至碱性pH条件下不稳定，其水溶液4℃下存放三天，体外抗癌活性明显下降。因此，针对此脂溶性治疗药物，如何制备性能优异的pH敏感脂质体是抗肿瘤研究领域的重点课题。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的在于提供一种pH敏感脂质体的制备方法。通过该方法制备的脂质体具有pH敏感性，同时解决了脂溶性药物不易溶于水的难题，提高生物利用度，同时还可降低被包封药物的毒性。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种pH敏感脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、称取卵磷脂、胆固醇和Fmoc-His于玻璃容器中，向玻璃容器中加入乙醇溶解，得混合液；
步骤二、向混合液中加入姜黄素无水乙醇溶液，混匀，减压蒸发除去有机溶剂至干成膜；然后加入磷酸缓冲盐溶液溶解，超声3-5min使其充分混合，混合均匀后得到黄色浑浊溶液，即为pH敏感脂质体。
作为对上述方案的进一步优化，在步骤一所述乙醇溶解过程中，采用超声辅助溶解。
作为对上述方案的进一步优化，所述超声的频率为30KHZ，温度为30℃，时间为5min。
作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述CUR无水乙醇溶液中姜黄素的含量为0.05～0.15mg。
作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述减压蒸发的相对压力为-0.01MPa，温度为35-50℃。
作为对上述方案的进一步优化，步骤一所述卵磷脂为大豆卵磷脂。
作为对上述方案的进一步优化，卵磷脂和胆固醇的质量比为3:1～8:1；Fmoc-His的含量为3.5～12.5mg；姜黄素含量为0.1～0.3mg；磷酸缓冲盐溶液的加入量为15～30mL。
作为对上述方案的更进一步优化，所述卵磷脂的质量为0.08g，胆固醇的质量为0.01g；Fmoc-His的含量为12.5mg；姜黄素的含量为0.1mg；磷酸缓冲盐溶液的加入量为30mL。
作为对上述方案的进一步优化，所述磷酸缓冲盐溶液的pH为7.4。
有益效果：
1、通过本发明所述方法制备的pH敏感型的脂质体，脂质体的pH敏感性通过嵌入脂质体中的Fmoc-His的质子化来实现。由于肿瘤细胞环境偏酸性，而Fmoc-His中的咪唑基在pH<6.0的环境下质子化，导致Fmoc-His形状发生变化，最终影响了脂质体的结构变化，于是药物便可从脂质体双分子层中释放出来。
2、本发明所述方法，制备的pH敏感脂质体包封姜黄素，起到安全有效的抗癌、抗炎和抗氧化等功效，采用脂质体技术，解决脂溶性药物不易溶于水的难题，同时还可降低被包封药物的毒性。最后制得的脂质体粒径分布均匀，具有明显的pH敏感释药特点；脂质体比较稳定，不易发生渗漏。制备的脂质体作为药物载体，具有较大的应用前景。
附图说明
图1是Fmoc-His的结构式图；
图2是pH敏感脂质体的粒径分布图；
图3是Fmoc-His为12.5mg时pH敏感及普通脂质体释药性能图；
图4是不同浓度的普通脂质体与pH敏感脂质体对C6细胞的细胞毒性对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
1、实验步骤
采用薄膜分散法制备脂质体：精密称取卵磷脂、胆固醇和Fmoc-His适量于500mL的圆底烧瓶中，加入乙醇10mL溶解(采用超声辅助溶解)，再加入1mL的CUR无水乙醇溶液适量，混匀，45℃减压蒸发除去有机溶剂至干成膜,加入适量的pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，然后超声3-5min,使其充分混合，混合均匀后得到黄色浑浊溶液。
所述超声的频率为30KHZ，温度为30℃；所述减压蒸发的相对压力为-0.01MPa，相当于绝对压强为0，在真空条件下进行，温度为35-50℃，优选为45℃。
所述CUR无水乙醇溶液中CUR的浓度为0.05～0.15mg/mL；所述卵磷脂优选为大豆卵磷脂。
2、研究脂质体制备的最佳原料配比
采用正交试验来寻找最佳配比，以脂质体的包封率作为考察的指标，最终确定最优处方。合理安排和分析众多因素的试验方法，最终选择了三个主要因素进行分析，即卵磷脂与胆固醇比例A，姜黄素用量为B，PBS用量C，每个因素确定三个水平，A因素各水平数依次为3:1，5:1，8:1；B因素的各水平数依次为0.1，0.2，0.3；C因素的各水平数依次为15，20，30，选用L9(33)正交设计表，结果如下表1所示。
表1正交试验设计优化脂质体处方及制备工艺的实验设计与结果
测定结果：随着卵磷脂与胆固醇的比例的增加，包封率增加；即比例的最优水平为8:1。随着姜黄素含量的增加，包封率减小；当姜黄素的含量为0.1mg时，包封率最大，即姜黄素含量的最优水平为0.1mg。随着PBS用量的增加，包封率增加；即PBS的最优水平为30mL。所以得出最优水平组合为A3 B1 C3，即卵磷脂与胆固醇比例为8:1，其中卵磷脂0.08g，胆固醇0.01g；姜黄素含量为0.1mg；PBS用量30mL。
3、处方优化
经上述正交试验确定普通脂质体的最优组合为A3 B1 C3。此时影响pH敏感脂质体包封率的主要因素是加入Fmoc-His的含量。
按前述制备方法,只改变Fmoc-His投量,其余操作相同,制备3份pH敏感的脂质体溶液。以包封率为考察指标,分别考察加入3.5mg，7.5mg，12.5mg的Fmoc-His形成脂质体的包封率,其结果如表2所示：
表2不同含量Fmoc-His脂质体的包封率考察
测定结果：随着Fmoc-His的用量的增加,包封率变化幅度不大，但是稳定性明显增强，又分别对Fmoc-His含量为7.5mg及12.5mg进行体外释药观察pH敏感性，综合考虑确定最佳的处方为：卵磷脂与胆固醇比例为8:1，姜黄素浓度为0.1mg，PBS用量30mL，Fmoc-His含量12.5mg。
4、pH敏感脂质体的粒径分布
在25℃下，将适量新鲜制备所得的脂质体混悬液以二次蒸馏水稀释十倍后经动态光散射光度测仪ZETA-SIZERN anoSeriesNano-ZSZEN3600(MalvernInstrumentsLtd,UK)进行测定，每次测定均重复3次。结果如图2所示。测定结果为：平均粒径为89.99nm(分散系数PDI为0.413)，粒径分布均匀。
5、体外释药试验
精密吸取两份已分离的Fmoc-His脂质体各1mL，分别装入已经处理好的透析袋中，两端扎紧封闭。然后将透析袋分别侵入到装有pH7.4和5.0的10mL PBS缓冲液的烧杯中。烧杯用保鲜膜封口，以免液体挥发，在37℃水浴中以100rpm磁力搅拌，每隔一定时间间隔，取释放介质中10mL，同时加入10mL的新鲜的PBS缓冲液。用荧光光度计测定F值，再计算各时间点姜黄素的累积释放总量。
依照上述的方法，普通脂质体同样做透析介质为pH7.4和5.0的体外释放实验。结果如图3所示。由图3可知，加入12.5mg的Fmoc-His脂质体释放姜黄素与普通脂质体相比较具有的显著pH敏感性，即在pH为5.0的PBS中释放速度及百分率明显高于pH7.4的环境中，尤其在在第30h时，两者累计释放量达到最大量，在110h四者的累计释放量接近相等。最后总结可知Fmoc-His含量为12.5mg时，pH敏感释药更加明显。
6、稳定性实验
在4℃下，将组成不同的几种咪唑脂质体混悬液静置避光保存，并且分别于第0，2，5，7天测定这几种脂质体样品液相应的包封率。以渗漏率为指标评价稳定性。结果如表3所示：
表3：渗透性考察
测定结果：在相同的实验条件下，普通脂质体渗透率大，则Fmoc-His脂质体比较稳定，不易渗漏。
7、脂质体的体外毒性试验
未载药脂质体通过MTT法，选用C6细胞进行体外毒性试验。.C6细胞按6000个/孔的浓度种于96孔板中。经含有10％FBS的DMEM(200μL/孔)培养24h后，换入200μL含有特定浓度脂质体的新鲜培养基继续培养48h。以200μL新鲜培养基置换出孔中溶液后，向每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，培养4h。除去培养基，并在每个孔中加入150μL DMSO。在570nm下，经酶标仪(Bio-Rad,Model 550,USA)测定吸光度值(OD)。相对细胞活性由如下公式计算：细胞活性(％)＝[OD570(样品)/OD570(对照)]×100。其中，OD570(对照)表示不含脂质体的测定值，而OD570(样品)表示含有脂质体的测定值。结果如图4所示。结果可知：当脂质体的浓度达到200μg/mL时，C6细胞的相对存活率都在80％以上，表明制备脂质体的材料卵磷脂和胆固醇及添加的pH敏感材料咪唑对细胞来说，毒性是非常小的，基本可以忽略，符合药物载体低毒的要求，可以作为药物载体。
以上内容应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书的内容为准，对本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、称取卵磷脂、胆固醇和Fmoc-His于玻璃容器中，向玻璃容器中加入乙醇溶解，得混合液；
步骤二、向混合液中加入姜黄素无水乙醇溶液，混匀，减压蒸发除去有机溶剂至干成膜；然后加入磷酸缓冲盐溶液溶解，超声3-5 min使其充分混合，混合均匀后得到黄色浑浊溶液，即为pH敏感脂质体。
2.如权利要求1所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：在步骤一所述乙醇溶解过程中，采用超声辅助溶解。
3.如权利要求2所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：所述超声的频率为30KHZ，温度为30℃，时间为5min。
4.如权利要求1所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：步骤二所述CUR无水乙醇溶液中姜黄素的含量为 0.05~0.15 mg。
5.如权利要求1所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：步骤二所述减压蒸发的相对压力为-0.01MPa，温度为35-50℃。
6.如权利要求1所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：步骤一所述卵磷脂为大豆卵磷脂。
7.如权利要求1所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：卵磷脂和胆固醇的质量比为3:1~8:1；Fmoc-His的含量为3.5~12.5mg；姜黄素含量为0.1~0.3mg；磷酸缓冲盐溶液的加入量为15~30mL。
8.如权利要求7所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：所述卵磷脂的质量为0.08g，胆固醇的质量为0.01g；Fmoc-His的含量为12.5mg；姜黄素的含量为0.1mg；磷酸缓冲盐溶液的加入量为30mL。
9.如权利要求1或7所述的一种pH敏感脂质体的制备方法，其特征在于：所述磷酸缓冲盐溶液的pH为7.4。
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