JP4817798B2 - Carrier and method for producing carrier - Google Patents

Description

本発明は、生体分子を固定化するための担体、および該担体の製造方法に関する。   The present invention relates to a carrier for immobilizing a biomolecule and a method for producing the carrier.

多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでおり、その解析手段として、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通常、スライドガラス等の担体に多数の核酸分子を整列固定化させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチップに固定化されている核酸分子と相補性を持つ核酸分子試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定化し、検出する方法に利用される。形成されたハイブリッドの検出手段としては、核酸分子試料に予め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている。   Technological development for efficiently analyzing all gene functions of various organisms is progressing, and DNA chips are used as the analysis means. A DNA chip is usually in the form of a microarray in which a large number of nucleic acid molecules are aligned and immobilized on a carrier such as a glass slide, and a nucleic acid molecule sample complementary to the nucleic acid molecule immobilized on the DNA chip is hybridized to DNA. It is used for the method of immobilizing on the chip and detecting it. As a means for detecting the formed hybrid, a method using a fluorescent label or a radioactive label previously bound to a nucleic acid molecule sample, a method using an intercalator having a fluorogenic group or a conductive group incorporated into the hybrid, etc. Are known.

ＤＮＡチップ利用技術を実用化するためには、多数の核酸分子を担体表面に整列固定化する技術が必要とされる。核酸分子を担体表面に固定化する方法としては、核酸分子の種類や担体の種類に応じて下記のような方法がある。   In order to put the DNA chip utilization technique into practical use, a technique for aligning and fixing a large number of nucleic acid molecules on the surface of the carrier is required. As a method for immobilizing a nucleic acid molecule on the surface of a carrier, there are the following methods depending on the type of nucleic acid molecule and the type of carrier.

固定化する核酸分子がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した担体表面にスポッティングして、ＤＮＡの荷電を利用して担体に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている（例えば、非特許文献１参照）。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。また、基体の表面に表面処理層および核酸分子と共有結合しうる官能基を有する化学修飾層を順次設けてなる担体（例えば、特許文献１〜３参照）や、また、基体上に、核酸分子を静電的に引き寄せるための静電層、および核酸分子と共有結合しうる官能基を有する担体（特許文献４）も報告されている。   When the nucleic acid molecule to be immobilized is cDNA (complementary DNA synthesized using mRNA as a template) or PCR product (DNA fragment obtained by amplifying cDNA by the PCR method), these are stored in the DNA chip production apparatus. In general, a potter device is used to spot a carrier surface that has been surface-treated with a polycation (polylysine, polyethyleneimine, etc.) and electrostatically bind to the carrier using the charge of DNA. Further, as a method for treating the carrier surface, a method using a silane coupling agent having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group or the like is also used (for example, see Non-Patent Document 1). In this case, since an amino group, an aldehyde group, and the like are introduced to the support surface by a covalent bond, they are stably present on the support surface as compared with the case of using a polycation. Further, a support (for example, see Patent Documents 1 to 3) in which a surface treatment layer and a chemically modified layer having a functional group capable of covalently bonding with a nucleic acid molecule are sequentially provided on the surface of the substrate, or a nucleic acid molecule on the substrate. An electrostatic layer for electrostatically attracting a molecule and a carrier having a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule (Patent Document 4) have also been reported.

ＤＮＡチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、担体表面に充分な量で安定に核酸分子を固定化する技術の開発は、固定化核酸分子と標識した試料核酸分子とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に大きく寄与する。従来の担体における核酸分子の固定化量および核酸分子の結合強度は、必ずしも充分とはいえず、核酸分子の固定化量がより高く核酸分子結合強度がより高い担体の開発が望まれていた。   In DNA chip technology, the detection limit is important. Therefore, the development of a technique for stably immobilizing nucleic acid molecules in a sufficient amount on the surface of the carrier greatly contributes to the improvement of the detection limit of hybridization between the immobilized nucleic acid molecules and the labeled sample nucleic acid molecules. The immobilization amount of nucleic acid molecules and the binding strength of nucleic acid molecules in conventional carriers are not necessarily sufficient, and it has been desired to develop a carrier with a higher immobilization amount of nucleic acid molecules and higher binding strength of nucleic acid molecules.

また、ＤＮＡチップ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロテインチップが開発されている。プロテインチップの原理はＤＮＡチップと同じで、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸などを検出するものである。従来開発されたプロテインチップは、スライドガラスまたはシリコン基体表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定化するものであるが、この方法では、タンパク質の固定化状態が不安定であり、洗浄工程において剥離するといった問題が生じた。従って、核酸分子またはタンパク質等の生体分子を安定かつ高密度に固定化できる担体の開発が望まれている。   Further, protein chips have been developed using DNA chip technology as a tool for protein analysis. The principle of a protein chip is the same as that of a DNA chip. Proteins are immobilized on a slide glass or membrane at a high density, and proteins or nucleic acids that interact with them are detected. Conventionally developed protein chips are those in which a polymer such as polylysine is applied to the surface of a glass slide or silicon substrate, and then the protein is immobilized. However, with this method, the protein immobilization state is unstable. The problem of peeling in the cleaning process occurred. Therefore, development of a carrier that can immobilize biological molecules such as nucleic acid molecules or proteins stably and at high density is desired.

この出願の発明に関する先行技術文献情報として次のものがある。
国際公開第00/22108号パンフレット 国際公開第 02/12891号パンフレット 特開2002-82116号公報 特開2004-97173号公報 Geo, Z. et al., Nucleic Acid Research, 22, 5456-5465(1994) Prior art document information relating to the invention of this application includes the following.
International Publication No. 00/22108 Pamphlet International Publication No. 02/12891 Pamphlet JP 2002-82116 A JP 2004-97173 A Geo, Z. et al., Nucleic Acid Research, 22, 5456-5465 (1994)

本発明の課題は、生体分子を固定化するための担体であって、該担体上の生体分子を安定かつ高密度に固定化できる担体を提供することである。   An object of the present invention is to provide a carrier for immobilizing biomolecules, which can immobilize biomolecules on the carrier stably and at high density.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、シリコン基体の表面に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基、あるいは、ＳｉＯ_２層、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体を用いることにより、生体分子を安定かつ高密度に固定化でき、生体分子の高感度な検出が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the surface of the silicon substrate has a functional group that can be covalently bonded to the SiO ₂ layer and the biomolecule, or the SiO ₂ layer, the electrostatic layer, and the living body. It has been found that by using a carrier having a functional group capable of covalently bonding to a molecule, the biomolecule can be immobilized stably and at a high density, and the biomolecule can be detected with high sensitivity, and the present invention has been completed. It was.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体。
（２）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体。
（３）ＳｉＯ_２層が、シリコン基体を酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下でベーキングすることにより得られるものである、（１）または（２）記載の担体。
（４）ベーキングが、１００〜１２００℃で１〜４８時間のベーキングである、（３）記載の担体。
（５）静電層が、アミノ基含有化合物を含む（２）〜（４）のいずれかに記載の担体。
（６）ＳｉＯ_２層が形成されたシリコン基体を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入して得られるものである（５）記載の担体。
（７）非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物が正荷電をもつ水溶性高分子である（６）記載の担体。
（８）生体分子が、核酸、糖鎖およびペプチドからなる群から選択される（１）〜（７）のいずれかに記載の担体。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の担体上に生体分子が固定化されてなる、生体分子固定化担体。
（１０）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体の製造方法であって、シリコン基体を、酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下でベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成すること、および生体分子と共有結合しうる官能基を導入することを含む、前記方法。
（１１）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体の製造方法であって、シリコン基体を、酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下でベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成すること、および非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することを含む、前記方法。
（１２）ベーキングを１００〜１２００℃で１〜４８時間行う、（１０）または（１１）記載の方法。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A carrier having a functional group capable of being covalently bonded to a SiO ₂ layer and a biomolecule on a silicon substrate.
(2) A carrier having an SiO ₂ layer, an electrostatic layer for electrostatically attracting biomolecules, and a functional group capable of covalently bonding with the biomolecules on a silicon substrate.
(3) The carrier according to (1) or (2), wherein the SiO ₂ layer is obtained by baking a silicon substrate under atmospheric pressure or reduced pressure under conditions where oxygen is present.
(4) The carrier according to (3), wherein the baking is baking at 100 to 1200 ° C. for 1 to 48 hours.
(5) The carrier according to any one of (2) to (4), wherein the electrostatic layer contains an amino group-containing compound.
(6) The silicon substrate on which the SiO ₂ layer is formed is immersed in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, and then a functional group capable of covalent bonding with a biomolecule is introduced. (5) The carrier according to (5).
(7) The carrier according to (6), wherein the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group is a water-soluble polymer having a positive charge.
(8) The carrier according to any one of (1) to (7), wherein the biomolecule is selected from the group consisting of nucleic acids, sugar chains and peptides.
(9) A biomolecule-immobilized carrier obtained by immobilizing a biomolecule on the carrier according to any one of (1) to (8).
(10) A method for producing a carrier having a functional group capable of covalently bonding with a SiO ₂ layer and a biomolecule on a silicon substrate, wherein the silicon substrate is baked under atmospheric pressure or reduced pressure in the presence of oxygen. Forming a SiO ₂ layer by introducing a functional group capable of covalent bonding with a biomolecule.
(11) A method for producing a carrier having a SiO ₂ layer, an electrostatic layer for electrostatically attracting a biomolecule, and a functional group capable of covalently bonding with the biomolecule on a silicon substrate, A biomolecule after being immersed in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group by forming an SiO ₂ layer by baking under atmospheric pressure or under reduced pressure And introducing a functional group capable of covalently bonding with the method.
(12) The method according to (10) or (11), wherein baking is performed at 100 to 1200 ° C. for 1 to 48 hours.

本発明により、生体分子を安定かつ高密度に固定化できる担体が提供され、生体分子の高感度な検出が可能になる。   According to the present invention, a carrier capable of immobilizing biomolecules stably and at high density is provided, and biomolecules can be detected with high sensitivity.

本発明は、シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基、あるいは、ＳｉＯ_２層、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体に関する。本発明において、生体分子には、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、ペプチドおよび糖鎖、並びにこれらの複合体およびこれらとその他の分子との複合体などが包含される。本発明において、ペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が包含されるものとする。担体に固定化する生体分子が、ペプチドである場合、本発明の担体は、通常１〜１０００ｋＤａ、好ましくは１〜２００ｋＤａのペプチドに対し好適に用いられる。また、担体に固定化する生体分子が核酸である場合、本発明の担体は、通常３〜５０００塩基、好ましくは１０〜１０００塩基の核酸に対し好適に用いられる。また、担体に固定化する生体分子が糖鎖である場合、本発明の担体は、通常１〜１００糖、好ましくは１〜３０糖の糖鎖に対し好適に用いられる。本発明の担体は、核酸、特にＤＮＡの固定化に好適に用いられる。 The present invention relates to a carrier having a functional group capable of being covalently bonded to a SiO ₂ layer and a biomolecule on a silicon substrate, or a functional group capable of being covalently bonded to a SiO ₂ layer, an electrostatic layer and a biomolecule. In the present invention, biomolecules include nucleic acids such as DNA and RNA, peptides and sugar chains, complexes thereof, complexes of these with other molecules, and the like. In the present invention, peptides include oligopeptides, polypeptides, and proteins. When the biomolecule immobilized on the carrier is a peptide, the carrier of the present invention is usually suitably used for a peptide of 1 to 1000 kDa, preferably 1 to 200 kDa. When the biomolecule immobilized on the carrier is a nucleic acid, the carrier of the present invention is suitably used for a nucleic acid having usually 3 to 5000 bases, preferably 10 to 1000 bases. When the biomolecule to be immobilized on the carrier is a sugar chain, the carrier of the present invention is suitably used for sugar chains of usually 1 to 100 sugars, preferably 1 to 30 sugars. The carrier of the present invention is suitably used for immobilizing nucleic acids, particularly DNA.

ＳｉＯ_２としては、低温型石英(三方晶系)、高温型石英(六方晶系、いわゆる水晶)、トリディマイト(斜方晶系、六方晶系)、クリストバル石(正方晶系、立方晶系)、高圧変態としてコーサイト(coesite、単斜晶系)、スティショフ石(正方晶系、ルチル構造)など単結晶のもの、および、これらがまたは結晶方位が色々と混ざった多結晶のものなどの結晶質のもの、ならびに非晶質のものがある。ＳｉＯ_２層は、シリコン基体、すなわち結晶質シリコン、好ましくは単結晶シリコンからなる基体を酸化処理に付すことにより形成することができる。シリコン基体は、半導体の分野で通常用いられるような半導体用基板と同様のものを使用できる。したがって、単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。シリコン基体の形状は特に制限されず、板状、糸状、ビーズ状、多孔質状、網状、円筒状などいずれも使用できるが、好ましくは板状である。板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。 As SiO ₂ , low-temperature type quartz (trigonal system), high-temperature type quartz (hexagonal system, so-called quartz), tridymite (orthorhombic system, hexagonal system), cristobalite (tetragonal system, cubic system), Crystalline materials such as single crystals such as coesite (monoclinic system) and stishovite (tetragonal system, rutile structure) as well as polycrystals with various crystal orientations. And amorphous. The SiO ₂ layer can be formed by subjecting a silicon substrate, that is, a substrate made of crystalline silicon, preferably single crystal silicon, to an oxidation treatment. As the silicon substrate, the same substrate as that for a semiconductor usually used in the semiconductor field can be used. Therefore, single-crystal silicon includes those in which the orientation of the crystal axis is slightly changed in some parts (sometimes referred to as mosaic crystals), and disorder on the atomic scale (lattice defects). What is included is also included. The shape of the silicon substrate is not particularly limited, and any of a plate shape, a thread shape, a bead shape, a porous shape, a net shape, a cylindrical shape, and the like can be used, but a plate shape is preferable. When using a plate-shaped material, the width is usually about 0.1 to 100 mm, the length is 0.1 to 100 mm, and the thickness is about 0.01 to 10 mm.

シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成する方法としては、半導体分野等で通常用いられる方法を使用できる。例えば、シリコン基体自体を酸化する方法、シリコン基体表面にＳｉＯ_２膜を堆積させる方法が使用できる。シリコンを加熱して酸化する方法は、熱酸化法と称され、乾燥酸素を導入するドライ酸化法、湿った酸素を導入するウェット酸化法、蒸気を導入するスチーム酸化法などがある。具体的には、シリコン基体を、Ｏ_２ガスを導入した真空炉中（Ｈ_２ガス少量導入）、通常１００〜１２００℃で、好ましくは６００〜１０００℃で、１〜４８時間、好ましくは３〜６時間にわたって処理することにより、シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成することができる。この場合の、Ｈ_２ガスに対するＯ_２ガスの比は、通常７５〜１００体積％、好ましくは８０〜１００体積％程度である。また、真空炉における真空度は、通常１０^−４〜１０００Ｐａ、好ましくは０．１〜１０Ｐａである。 As a method for forming the SiO ₂ layer on the silicon substrate, a method usually used in the semiconductor field or the like can be used. For example, a method of oxidizing the silicon substrate itself or a method of depositing a SiO ₂ film on the surface of the silicon substrate can be used. A method of oxidizing silicon by heating is called a thermal oxidation method, and includes a dry oxidation method that introduces dry oxygen, a wet oxidation method that introduces wet oxygen, and a steam oxidation method that introduces steam. Specifically, the silicon substrate is placed in a vacuum furnace into which O ₂ gas is introduced (a small amount of H ₂ gas is introduced), usually at 100 to 1200 ° C., preferably at 600 to 1000 ° C., for 1 to 48 hours, preferably 3 to 3 hours. By treating for 6 hours, a SiO ₂ layer can be formed on the silicon substrate. In this case, the ratio of _{O 2} gas to _{H 2} gas is usually 75 to 100% by volume, preferably about 80 to 100% by volume. Moreover, the vacuum degree in a vacuum furnace is 10 < ^-4 > -1000Pa normally, Preferably it is 0.1-10Pa.

あるいは、大気圧下、通常大気下、１００〜１２００℃、好ましくは６００〜８００℃で、１〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間にわたり、ベーキングすることにより、シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成することができる。 Alternatively, a SiO ₂ layer is formed on a silicon substrate by baking at 100 to 1200 ° C., preferably 600 to 800 ° C., for 1 to 48 hours, preferably 12 to 24 hours, under atmospheric pressure and normal atmosphere. can do.

大気圧下でベーキングする方法は、簡便であることからコストの面で有利である。また、真空装置を用いる場合、真空引きなどの時間のロスや設置スペースの問題があり、また水素や酸素ガスを混合する場合その爆発限界等の安全性にも細心の注意が必要であるが、大気圧下でのベーキングではその必要性がない点でも有利である。この他、高圧スチーム酸化法、ＨＣｌ酸化法、王水酸化法、陽極酸化法なども使用できる。
ＳｉＯ_２層の厚みは、通常５〜１００００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍである。 The method of baking at atmospheric pressure is advantageous in terms of cost because it is simple. In addition, when using a vacuum device, there is a problem of time loss and installation space such as evacuation, and when hydrogen or oxygen gas is mixed, careful attention is required for safety such as the explosion limit, Baking at atmospheric pressure is also advantageous in that it is not necessary. In addition, a high-pressure steam oxidation method, an HCl oxidation method, a oxyhydration method, an anodization method, and the like can be used.
The thickness of the SiO ₂ layer is usually 5 to 10,000 nm, preferably 10 to 200 nm.

本発明の担体は、望ましくは、さらに生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を有する。静電層としては、生体分子を静電的に引き寄せ、生体分子の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる（特開２００４−９７１７３）。   The carrier of the present invention desirably further comprises an electrostatic layer for electrostatically attracting biomolecules. The electrostatic layer is not particularly limited as long as it attracts biomolecules electrostatically and improves the amount of immobilized biomolecules. For example, a positively charged compound such as an amino group-containing compound is used. It can be formed (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-97173).

前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ_２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えば、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体や共重合体（例えば、正荷電を有する水溶性高分子、特にポリアリルアミンおよびポリリシン）；４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられ、必要に応じてこれらを複数混合したものでもよい。 Examples of the amino group-containing compound include an unsubstituted amino group (—NH ₂ ), or a compound having an amino group (—NHR; R is a substituent) monosubstituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, for example, , Ethylenediamine, hexamethylenediamine, n-propylamine, monomethylamine, dimethylamine, monoethylamine, diethylamine, allylamine, aminoazobenzene, aminoalcohol (eg, ethanolamine), acrinol, aminobenzoic acid, aminoanthraquinone, amino acid (glycine, Alanine, valine, leucine, serine, threonine, cysteine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, proline, cystine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, arginine, hist ), Aniline, or a polymer or copolymer thereof (for example, water-soluble polymers having a positive charge, especially polyallylamine and polylysine); 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene, spermidine And polyamines (polyvalent amines) such as spermine and putrescine, and a mixture of these may be used if necessary.

静電層は、ＳｉＯ_２層上にあってもなくてもよいが、ある方が効果が大きいため好ましい。静電層は、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体と共有結合させずに形成してもよく、共有結合させて形成してもよい。 The electrostatic layer may or may not be on the SiO ₂ layer, but it is preferable to have an electrostatic layer because the effect is great. The electrostatic layer may be formed without being covalently bonded to the silicon substrate having the SiO ₂ layer, or may be formed by being covalently bonded.

静電層を、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基体またはＳｉＯ_２層との親和性、即ち密着性を高める点で、基体上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を蒸着させた後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。 The electrostatic layer, when formed without covalently bound to a silicon substrate having an SiO ₂ layer, the affinity of the electrostatic layer and the substrate or SiO ₂ layer, namely in terms of enhancing the adhesion, on a substrate, It is preferable to introduce a functional group capable of being covalently bonded to a biomolecule after vapor deposition of the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group.

静電層を、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体と共有結合させて形成する場合には、例えば、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基体と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。 The electrostatic layer, when formed by covalently coupling a silicon substrate having an SiO ₂ layer, for example, a silicon substrate having an SiO ₂ layer, chlorinating the surface irradiated with ultraviolet rays with chlorine gas, followed by the amino Among the group-containing compounds, for example, polyallylamine, polylysine, 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene and other polyvalent amines are reacted to form an amino group at the terminal not bonded to the substrate. By introducing, an electrostatic layer can be formed.

また、静電層が施された基体に生体分子と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体を、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。 Further, when a reaction for introducing a functional group capable of covalently bonding with a biomolecule to a substrate on which an electrostatic layer has been applied (for example, introduction of a carboxyl group using a dicarboxylic acid or a polyvalent carboxylic acid) is performed in a solution, It is preferable to introduce a functional group capable of covalently bonding to a biomolecule after the silicon substrate having the SiO ₂ layer is immersed in the solution containing the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group. Examples of the solvent for the solution include water, N-methylpyrrolidone, and ethanol.

静電層が施された基体に、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。   When a carboxyl group is introduced into a substrate on which an electrostatic layer has been applied using dicarboxylic acid or polyvalent carboxylic acid, it is activated with N-hydroxysuccinimide and / or carbodiimide in advance, or the reaction is N -It is preferably carried out in the presence of hydroxysuccinimide and / or carbodiimides.

ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基体との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。 When an electrostatic layer is formed by immersing a silicon substrate having a SiO ₂ layer in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, polyallylamine is used as the amino group-containing compound. In addition, the adhesion to the substrate is excellent, and the amount of biomolecule immobilized is further improved.

静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
ＳｉＯ_２層、または前記のように形成した静電層には、生体分子と共有結合しうる官能基を導入するため、化学修飾を施す。 The thickness of the electrostatic layer is preferably 1 nm to 500 μm.
The SiO ₂ layer or the electrostatic layer formed as described above is chemically modified in order to introduce a functional group capable of covalently bonding with a biomolecule.

前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、ホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。   Examples of the functional group include a carboxyl group, an active ester group, a haloformyl group, a formyl group, a hydroxyl group, a sulfate group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, and an amino group.

官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ^１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ^２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^２は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ^３−ＣＯ−Ｒ^４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^３は水素原子または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ^４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^５は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。 As a compound used for introducing a carboxyl group as a functional group, for example, the formula: X—R ¹ —COOH (wherein X is a halogen atom, R ¹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) For example, chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid; formula: HOOC Dicarboxylic acid represented by —R ² —COOH (wherein R ² represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, Fumaric acid, phthalic acid; polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, butanetetracarboxylic acid and other polyvalent carboxylic acids; formula: R ³ —CO—R ⁴ —COOH (formula In which R ³ represents a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, and R ⁴ represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). A monohalide of a dicarboxylic acid represented by: X—OC—R ⁵ —COOH (wherein X represents a halogen atom, R ⁵ represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), for example, Examples include succinic acid monochloride, malonic acid monochloride; acid anhydrides such as phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride, maleic anhydride, and butanetetracarboxylic anhydride.

前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる（特開２００１−１３９５３２）。   The carboxyl group introduced as described above is cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl)- Active esterification can be performed with a dehydration condensing agent such as carbodiimide) and a compound such as N-hydroxysuccinimide (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-139532).

官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^６は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。 Examples of the compound used for introducing a haloformyl group as a functional group include, for example, the formula: X—OC—R ⁶ —CO—X (wherein X is a halogen atom, R ⁶ is a single bond or a carbon number of 1 to 12). And dicarboxylic acid dihalides such as succinic acid chloride and malonic acid chloride.

官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ^７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸またはフェノール酸が挙げられる。 As a compound used for introducing a hydroxyl group as a functional group, for example, represented by the formula: HO—R ⁷ —COOH (wherein R ⁷ represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). Hydroxy acids or phenolic acids.

官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。   Examples of the compound used for introducing an amino group as a functional group include amino acids.

前記のような化合物は、そのカルボキシル基が静電層のアミノ基と縮合してアミド結合を形成する。   In such a compound, the carboxyl group is condensed with the amino group of the electrostatic layer to form an amide bond.

官能基としてホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、グルタルアルデヒドが挙げられる。   Examples of the compound used for introducing a formyl group as a functional group include glutaraldehyde.

官能基としてエポキシ基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、多価エポキシ化合物が挙げられる。   As a compound used in order to introduce | transduce an epoxy group as a functional group, a polyvalent epoxy compound is mentioned, for example.

前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。   Among the above-mentioned compounds, polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, and butanetetracarboxylic acid can be used for improving hydrophilicity.

ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を固定化する場合は、アミノ基、エポキシ基、カルボジイミド基、ホルミル基または活性エステル基を導入するのが好ましい。ペプチドを固定化する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートまたは活性エステル基を導入するのが好ましい。金属キレートを導入した担体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、静電層を施した基体に、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。   When immobilizing nucleic acids such as DNA and RNA, it is preferable to introduce an amino group, an epoxy group, a carbodiimide group, a formyl group or an active ester group. When immobilizing a peptide, it is preferable to introduce an amino group, a carbodiimide group, an epoxy group, a formyl group, a metal chelate or an active ester group. When a carrier into which a metal chelate is introduced is used, a peptide having a label having an affinity for a metal ion such as a polyhistidine sequence can be immobilized effectively and stably. The introduction of the metal chelate can be carried out, for example, by adding a halocarboxylic acid such as chloroacetic acid to the substrate on which the electrostatic layer is applied and introducing a chelate ligand. Labels such as polyhistidine sequences can be introduced by methods known to those skilled in the art.

本発明の担体に生体分子を固定化する方法は、特に制限されない。例えば、生体分子をバッファーに溶解して溶液を作成し、これに本発明の担体を浸漬することによって、担体表面に生体分子を固定化することができる。浸漬は、通常、０〜９８℃、好ましくは４℃〜５０℃で、通常、１分〜２４時間、好ましくは１０分〜１時間行う。この場合、一定時間浸漬した後、担体を洗浄することによって、固定化されていない生体分子を除去することができる。また、スポッターといわれる装置を使用することによって、多種類の生体分子を担体の表面に固定化できる。スポッターを用いる場合には、例えば、スポッターで生体分子溶液を担体上にスポットした後、加熱したオーブン中で一定時間ベーキングを行い、その後洗浄によって固定していない分子を除去する。スポッター装置を用いることにより他種類の生体分子を担体上の異なる位置に固定化できるため一度に多数の試験を実施することができる。   The method for immobilizing a biomolecule on the carrier of the present invention is not particularly limited. For example, the biomolecule can be immobilized on the surface of the carrier by dissolving the biomolecule in a buffer to prepare a solution and immersing the carrier of the present invention in the solution. The immersion is usually performed at 0 to 98 ° C., preferably 4 to 50 ° C., and usually 1 minute to 24 hours, preferably 10 minutes to 1 hour. In this case, the biomolecules that are not immobilized can be removed by immersing the carrier for a certain period of time and then washing the carrier. Further, by using a device called a spotter, various types of biomolecules can be immobilized on the surface of the carrier. In the case of using a spotter, for example, after spotting a biomolecule solution on a carrier with a spotter, baking is performed in a heated oven for a certain period of time, and then unfixed molecules are removed by washing. By using a spotter device, other types of biomolecules can be immobilized at different positions on the carrier, so that a large number of tests can be performed at once.

シリコン上にＳｉＯ_２層を有する担体は、半導体分野等で広く用いられているが、本発明者らは、驚くべきことに、シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体を用いることにより、生体分子を安定かつ高密度に固定化することができることを見出した。また、ダイヤモンドライクカーボン層などの表面処理層上に、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体を用いた場合よりも、高感度での検出が可能であることも見出した。上記のとおり、シリコン上にＳｉＯ_２層を有する基板は広く用いられていることから、本発明の担体は工業的生産においても有利である。 Carriers having a SiO ₂ layer on silicon are widely used in the semiconductor field, etc., but the inventors surprisingly share the SiO ₂ layer, electrostatic layer and biomolecules on the silicon substrate. It has been found that biomolecules can be stably and densely immobilized by using a carrier having a functional group capable of binding. It was also found that detection can be performed with higher sensitivity than when a carrier having a functional group capable of covalently bonding to an electrostatic layer and a biomolecule is used on a surface treatment layer such as a diamond-like carbon layer. . As described above, since the substrate having the SiO ₂ layer on the silicon is widely used, the carrier of the present invention is advantageous also in industrial production.

従って、プローブ分子を本発明の担体上に固定化し、これにターゲット分子を相互作用させることにより、生体分子間の相互作用の検出を高感度で実施することができる。生体分子間相互作用としては、例えば、タンパク質間の相互作用、タンパク質とペプチドの相互作用、核酸間の相互作用、タンパク質と核酸の相互作用、タンパク質と化合物との相互作用などが包含される。より具体的には、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、抗原と抗体またはその断片との反応、酵素と基質または阻害剤の結合反応、リガンドとレセプターの結合反応、アビジンとビオチンの結合反応、核酸と転写因子の結合反応、細胞接着因子の結合反応、糖鎖とタンパク質の結合反応、脂肪鎖とタンパク質の結合反応、リン酸基とタンパク質の結合反応、補欠因子とタンパク質の結合反応などが挙げられる。   Therefore, by immobilizing the probe molecule on the carrier of the present invention and allowing the target molecule to interact with the probe molecule, the interaction between the biomolecules can be detected with high sensitivity. Examples of the interaction between biomolecules include interaction between proteins, interaction between proteins and peptides, interaction between nucleic acids, interaction between proteins and nucleic acids, interaction between proteins and compounds, and the like. More specifically, hybridization between nucleic acid complementary strands, reaction between antigen and antibody or fragment thereof, binding reaction between enzyme and substrate or inhibitor, binding reaction between ligand and receptor, binding reaction between avidin and biotin, nucleic acid and Examples include transcription factor binding reaction, cell adhesion factor binding reaction, sugar chain-protein binding reaction, fatty chain-protein binding reaction, phosphate group-protein binding reaction, prosthetic factor-protein binding reaction, and the like.

本発明の担体は、核酸分子、例えば、ＤＮＡの伸長反応に用いることもできる。この場合、まず、担体上にプライマーを固定化して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡ伸長反応によりプライマーにハイブリダイズしたＤＮＡと相補的なＤＮＡを伸長させる。プライマーとしては、長さおよび配列が明らかな一本鎖または二本鎖の核酸分子を使用する。長さは特に限定されないが、好ましくは５〜２００塩基、さらに好ましくは１０〜１００塩基である。   The carrier of the present invention can also be used for an elongation reaction of a nucleic acid molecule such as DNA. In this case, first, a primer is immobilized on a carrier, and single-stranded or double-stranded DNA is hybridized. Thereafter, DNA complementary to the DNA hybridized to the primer is extended by a DNA extension reaction. As a primer, a single-stranded or double-stranded nucleic acid molecule having a clear length and sequence is used. Although length is not specifically limited, Preferably it is 5-200 bases, More preferably, it is 10-100 bases.

従来の担体では、伸長反応における熱処理によってプライマーが剥離することがあるが、本発明の担体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、プライマーを担体に固定化した状態で伸長反応を進行させることができる。   In the conventional carrier, the primer may be peeled off by heat treatment in the extension reaction, but in the carrier of the present invention, the primer does not peel off even when heat is applied, and the extension reaction proceeds with the primer immobilized on the carrier. be able to.

この伸長反応の時に、標識した核酸を取り込ませ、伸長反応後、標識に由来するシグナルを読みとることによって、プライマーに特定のＤＮＡがハイブリダイズして伸長反応が進行したか否かを検出することができる。従って、試験した試料中に、担体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが含まれているかどうかを判定することができ、研究および医療における有用な検出手段となりうる。   During this extension reaction, the labeled nucleic acid is incorporated, and after the extension reaction, the signal derived from the label is read to detect whether the extension reaction has progressed by hybridization of specific DNA to the primer. it can. Therefore, it can be determined whether or not the tested sample contains DNA that can hybridize to the primer on the carrier, which can be a useful detection means in research and medicine.

標識としては、核酸分子に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなど）、放射能標識（α−^３２Ｐ、γ−^３２Ｐ、^３５Ｓなど）などが挙げられる。蛍光標識核酸を用いた場合は、伸長反応の後の担体を蛍光撮影することにより、検出することができる。 The label is not particularly limited as long as it can be incorporated into a nucleic acid molecule. For example, fluorescent labels (CyDye such as Cy3 and Cy5, FITC, RITC, rhodamine, Texas red, TET, TAMRA, FAM, HEX, ROX etc.), radioactivity labels (α- ³² P, γ- ³² P, ³⁵ S etc.) and the like. When a fluorescence-labeled nucleic acid is used, it can be detected by fluorescence imaging of the carrier after the extension reaction.

本発明の担体は、ＤＮＡの増幅反応に用いることもできる。ＰＣＲ反応により増幅させる場合には、例えば、まず、担体上にフォワードプライマーを固定化して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせ、その後酵素反応で相補鎖ＤＮＡを伸長する。更に、アニーリング、ハイブリダイゼーション、伸長反応という工程を連続で行うことによって、いわゆるＰＣＲ反応が進行する。   The carrier of the present invention can also be used for DNA amplification reactions. In the case of amplification by PCR reaction, for example, first, a forward primer is immobilized on a carrier, single-stranded or double-stranded DNA is hybridized, and then complementary strand DNA is extended by enzymatic reaction. Furthermore, a so-called PCR reaction proceeds by continuously performing the steps of annealing, hybridization, and extension reaction.

従来の担体では、ＰＣＲ反応における熱処理によってプライマーが剥離したり、サーマルサイクルの制御がうまくいかないといった問題があったが、本発明の担体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、さらに、反応を容器の中ではなく担体上にプライマーを固定化した状態で行うため、ＰＣＲ反応における温度制御が正確で、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的外のＤＮＡが複製される可能性も低く、効率的にＤＮＡを増幅することができる。   In the conventional carrier, there are problems that the primer is peeled off by heat treatment in the PCR reaction and the control of the thermal cycle is not successful, but in the carrier of the present invention, the primer does not peel off even when heat is applied. Since the primer is immobilized on the carrier, not in the container, the temperature control in the PCR reaction is accurate, the accuracy of the sequence of the nucleic acid to be amplified is affected, and the DNA of interest is duplicated. The possibility is low and DNA can be efficiently amplified.

さらに、上記の標識核酸を用いた検出とＰＣＲによる増幅とを組み合わせることにより、担体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが試料中に少量しか含まれていない場合であっても、上記のようにＤＮＡが複製され、結果的に多量のＤＮＡが担体上のプライマーにハイブリダイズし、その相補鎖が伸長されるため、検出感度を増大させることが可能になる。   Furthermore, by combining detection using the above-described labeled nucleic acid and amplification by PCR, as described above, even if the sample contains only a small amount of DNA that can hybridize to the primer on the carrier. Since the DNA is replicated and as a result, a large amount of DNA is hybridized to the primer on the carrier and its complementary strand is extended, the detection sensitivity can be increased.

あるいは、伸長反応に使用する酵素として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを選択し、リバースプライマーを加えることによって、サーマルサイクルを経ることなく定温で、ＤＮＡを担体上で増幅することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に二本鎖領域があった場合その鎖を解離しながら、相補鎖合成を継続できるＤＮＡ合成酵素である。   Alternatively, by selecting a strand displacement type DNA polymerase as an enzyme used for the extension reaction and adding a reverse primer, DNA can be amplified on a carrier at a constant temperature without going through a thermal cycle. A strand displacement type DNA polymerase is a process of synthesizing a complementary DNA strand to a template DNA. If there is a double-stranded region in the extension direction, DNA synthesis that can continue complementary strand synthesis while dissociating the strand. It is an enzyme.

鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス）等が挙げられる。   Although it does not specifically limit as strand displacement type | mold DNA polymerase, For example, BcaBEST DNA polymerase (Takara Bio), Phi29 DNA Polymerase (Amersham bioscience), etc. are mentioned.

本発明の別の態様においては、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを対象とすることにより、間接的ながらＲＮＡも対象となりうる。この場合には、ｍＲＮＡから逆転写反応を利用してｃＤＮＡを得るが、ｃＤＮＡを得ると同時に担体に固定化させることができる。まず、担体の化学修飾部分に逆転写プライマーを結合させる。プライマーとしては、一般にオリゴｄＴプライマー、特定塩基配列に相補的なプライマー、ランダム６塩基プライマーが用いられるが、中でもＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）^＋配列に対応させてＴ（チミン塩基）が１０〜２０個程度連なった配列からなるオリゴｄＴプライマーを用いることが望ましい。 In another embodiment of the present invention, by targeting cDNA synthesized from mRNA, RNA can be targeted indirectly. In this case, cDNA is obtained from mRNA using reverse transcription reaction, and can be immobilized on a carrier simultaneously with obtaining cDNA. First, a reverse transcription primer is bound to the chemically modified portion of the carrier. As the primer, an oligo dT primer, a primer complementary to a specific base sequence, and a random 6 base primer are generally used. Among them, T (thymine base) is associated with the poly (A) ⁺ sequence at the 5 ′ end of RNA. It is desirable to use an oligo dT primer having a sequence of about 10 to 20 sequences.

オリゴｄＴプライマーを用いる場合には、鋳型となるＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）部分をアニーリングさせる。これに逆転写酵素を作用させ、鋳型ＲＮＡに対し相補的なｄＮＴＰをプライマーの３’末端に順々に重合させることで、５’から３’の方向にｃＤＮＡを合成する。この逆転写反応のプライマーの結合、アニーリング、逆転写酵素による相補鎖重合は、定法に従い温度制御（サーマルサイクル）行うことによって実施できる。   When an oligo dT primer is used, the poly (A) portion at the 5 'end of the template RNA is annealed. A reverse transcriptase is allowed to act on this, and dNTPs complementary to the template RNA are sequentially polymerized at the 3 'end of the primer to synthesize cDNA in the 5' to 3 'direction. Primer binding, annealing, and complementary strand polymerization by reverse transcriptase in this reverse transcription reaction can be performed by performing temperature control (thermal cycle) according to a conventional method.

このように逆転写反応を行うと同時に担体への固定も可能であることから、本発明の方法によればいわゆるＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−ＰＣＲ）を効率よく行うことができ、ｍＲＮＡの定量用としても有用である。   Since the reverse transcription reaction can be carried out at the same time as this, the method of the present invention enables so-called RT-PCR (reverse transcript-PCR) to be efficiently performed, and for mRNA quantification. It is also useful.

更に、本発明の担体を用い、末端水酸基または末端カルボキシル基に、水素結合でオリゴＤＮＡの末端塩基を固定化し、更に、このオリゴＤＮＡと相補的塩基配列を有するＤＮＡを固定して、ＤＮＡライブラリーチップとして用いることもできる。   Furthermore, using the carrier of the present invention, the terminal base of the oligo DNA is fixed to the terminal hydroxyl group or terminal carboxyl group by hydrogen bonding, and further, DNA having a complementary base sequence to this oligo DNA is fixed, and the DNA library It can also be used as a chip.

（実施例１）オリゴＤＮＡの固定化量の比較
以下の（ａ）〜（ｂ）の担体を製造した。
（ａ）シリコン基体上にＳｉＯ_２層を有する担体Ａ（真空熱酸化）
Ｐ型（１００）、抵抗率：１〜１０Ω・ｃｍのシリコン基体（（株）新陽製）を、Ｏ_２ガスを導入した真空炉中（Ｈ_２ガス少量導入）、約９００℃で処理した。形成されたＳｉＯ_２層の膜厚は１００ｎｍ程度であった。 (Example 1) Comparison of immobilized amounts of oligo DNA The following carriers (a) to (b) were produced.
(A) Carrier A having a SiO ₂ layer on a silicon substrate (vacuum thermal oxidation)
A silicon substrate having a P-type (100) and a resistivity of 1 to 10 Ω · cm (manufactured by Shinyo Co., Ltd.) was treated at about 900 ° C. in a vacuum furnace into which O ₂ gas was introduced (small amount of H ₂ gas was introduced). The thickness of the formed SiO ₂ layer was about 100 nm.

続いてポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に浸漬することによりアミノ化し（静電層の形成）、続いて、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理し、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体上に、静電層および活性エステル基を導入した。 Subsequently, it is aminated by immersion in an aqueous solution of polyallylamine (0.1 g / l) (formation of an electrostatic layer), followed by reaction with polyacrylic acid, and 0.1M phosphate buffer (PH6) is added to a concentration of 0. On a silicon substrate having a SiO ₂ layer chemically treated by immersion in a reaction solution in which 1M N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide are dissolved for 30 minutes. Into, an electrostatic layer and an active ester group were introduced.

（ｂ）シリコン基体の表面にＤＬＣ層を有する担体
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）上に、メタンガス９７．５体積％と水素２．５体積％を混合したガス（総流量１００ｓｃｃｍ）を原料として、イオン化蒸着法によって、加速電圧０．５ｋＶ、作動圧８Ｐａでダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気（３０ｓｃｃｍ）でプラズマ法（作動圧３Ｐａ、バイアス０．５ｋＶ）により１０分間アミノ化し、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理した。
（ｃ）ＳｉＯ_２層をＨＦで除去した担体
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）を、（ａ）と同様な手法でＯ_２ガスを導入した真空炉中（Ｈ_２ガス少量導入）、約９００℃で処理した。こうしてＳｉＯ_２層が形成された担体をＨＦ（フッ化水素）に常温で５分間浸漬し、超純水で洗浄後、（ａ）と同様にアミノ化および化学処理した。
（ｄ）シリコン担体
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）を、（ａ）と同様にアミノ化および化学処理した。
（ｅ）ガラス基体の表面にＤＬＣ層を有する担体
スライドガラスからなる基体（コーニング社製液晶用ガラス）上に、メタンガス９７．５体積％と水素２．５体積％を混合したガス（総流量１００ｓｃｃｍ）を原料として、イオン化蒸着法によって、加速電圧０．５ｋＶ、作動圧８Ｐａでダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気（３０ｓｃｃｍ）でプラズマ法（作動圧３Ｐａ、バイアス０．５ｋＶ）により１０分間アミノ化し、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理した。 (B) A carrier having a DLC layer on the surface of a silicon substrate A gas (total flow rate of 100 sccm) in which 97.5% by volume of methane gas and 2.5% by volume of hydrogen are mixed on a silicon substrate (manufactured by Shinyo Co., Ltd.). As a raw material, a diamond-like carbon (DLC) layer having a thickness of 10 nm was formed by an ionization vapor deposition method at an acceleration voltage of 0.5 kV and an operating pressure of 8 Pa. Then, it is aminated in an ammonia gas atmosphere (30 sccm) by a plasma method (operating pressure 3 Pa, bias 0.5 kV) for 10 minutes, reacted with polyacrylic acid, and 0.1 M N-phosphate in 0.1 M phosphate buffer (PH6). Chemical treatment was carried out by immersing in a reaction solution in which -ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide were dissolved for 30 minutes.
(C) The carrier from which the SiO ₂ layer was removed with HF A silicon substrate (manufactured by Shinyo Co., Ltd., supra) was introduced into a vacuum furnace in which O ₂ gas was introduced in the same manner as in (a) (a small amount of H ₂ gas was introduced). Processed at about 900 ° C. The carrier thus formed with the SiO ₂ layer was immersed in HF (hydrogen fluoride) at room temperature for 5 minutes, washed with ultrapure water, and then aminated and chemically treated as in (a).
(D) Silicon carrier A silicon substrate (manufactured by Shinyo Co., Ltd., supra) was aminated and chemically treated in the same manner as (a).
(E) A carrier having a DLC layer on the surface of a glass substrate A gas (total flow rate 100 sccm) in which 97.5% by volume of methane gas and 2.5% by volume of hydrogen are mixed on a substrate made of slide glass (glass for liquid crystal manufactured by Corning). ) Was used as a raw material, and a diamond-like carbon (DLC) layer was formed to a thickness of 10 nm by an ionization vapor deposition method at an acceleration voltage of 0.5 kV and an operating pressure of 8 Pa. Then, it is aminated in an ammonia gas atmosphere (30 sccm) by a plasma method (operating pressure 3 Pa, bias 0.5 kV) for 10 minutes, reacted with polyacrylic acid, and 0.1 M N-phosphate in 0.1 M phosphate buffer (PH6). Chemical treatment was carried out by immersing in a reaction solution in which -ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide were dissolved for 30 minutes.

試験方法：
Ｃｙ３で標識したオリゴＤＮＡ（２２ｍｅｒ）の溶液（５μＭ）を上記（ａ）〜（ｅ）の担体上にスポットし、８０℃で１時間ベーキングし、洗浄液（２×ＳＳＣ/０．２％ＳＤＳ）で１５分間室温にて洗浄し、続いて同じ洗浄液で５分間熱洗浄（９０℃以上）を行うことにより、オリゴＤＮＡを担体上に固定化した。 Test method:
A solution (5 μM) of oligo DNA (22mer) labeled with Cy3 was spotted on the carriers (a) to (e) above, baked at 80 ° C. for 1 hour, and washed (2 × SSC / 0.2% SDS). The oligo DNA was immobilized on the carrier by washing at room temperature for 15 minutes followed by thermal washing (at 90 ° C. or higher) for 5 minutes with the same washing solution.

富士写真フィルム社製ＦＬＡ８０００（ＰＭＴ５０％）を用いてシグナルを検出した。結果を以下の表１に示す。   The signal was detected using FLA8000 (PMT 50%) manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd. The results are shown in Table 1 below.

担体（ａ）（ｂ）と（ｄ）（ｅ）の結果を比較すると、ＳｉＯ_２層を有する担体は、ＳｉＯ_２層を有しない担体やＤＬＣ層を有する担体等と比べて、オリゴＤＮＡの固定化量が多いことがわかる。ＳｉＯ_２層をＨＦで除去した担体（ｃ）は、シグナル強度が減少しており、ＳｉＯ_２層を除去することによりオリゴＤＮＡの固定化量が下がることがわかる。従って、ＳｉＯ_２層が生体分子の固定化量において有効であることが示された。 Comparing the results of the carrier (a) (b) and (d) (e), the carrier having a SiO ₂ layer, as compared with a carrier or the like having no carrier or DLC layer SiO ₂ layer, the fixation of the oligo DNA It can be seen that the amount of conversion is large. Carrier to remove the SiO ₂ layer with HF (c), the signal intensity has decreased, it can be seen that the amount of immobilized oligo DNA is reduced by removing the SiO ₂ layer. Therefore, it was shown that the SiO ₂ layer is effective in the amount of immobilized biomolecules.

（実施例２）ベーキング処理によるＳｉＯ₂層の形成
シリコン基体の表面にＳｉＯ_２層を有する担体Ｂ（ベーキング）
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）を大気炉（光洋サーモシステム社製）中、４５０℃、６００℃または８００℃で、３時間、１２時間または２０時間ベーキングすることにより、シリコン基体の表面にＳｉＯ_２層を形成した。続いてこれをポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に浸漬することによりアミノ化し、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理した。 (Example 2) Formation of SiO ₂ layer by baking treatment Carrier B (baking) having a SiO ₂ layer on the surface of a silicon substrate
By baking a silicon substrate (manufactured by Shinyo Co., Ltd., supra) in an atmospheric furnace (manufactured by Koyo Thermo Systems Co., Ltd.) at 450 ° C., 600 ° C. or 800 ° C. for 3 hours, 12 hours or 20 hours, the surface of the silicon substrate An SiO ₂ layer was formed on the substrate. Subsequently, this was aminated by immersing it in an aqueous polyallylamine solution (0.1 g / l), reacted with polyacrylic acid, and 0.1 M N-ethyl-N ′ in 0.1 M phosphate buffer (PH6). Chemical treatment was performed by immersing in a reaction solution in which-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide were dissolved for 30 minutes.

これらの担体（ｆ〜ｊ）と実施例１で製造した担体（ａ）に、実施例１と同様にオリゴＤＮＡ（５μＭ）を固定化し、シグナルを検出した。結果を以下の表２に示す。   In the same manner as in Example 1, oligo DNA (5 μM) was immobilized on these carriers (f to j) and the carrier (a) produced in Example 1, and signals were detected. The results are shown in Table 2 below.

以上から、ほぼ（ａ）と（ｉ）および（ｊ）とが同様のシグナルであることから、大気圧下のベーキングでも必要なＳｉＯ_２層が形成されていることがわかった。また、その条件については、シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成するときのベーキング温度は、５００℃以上、好ましくは約６００℃で、ベーキング時間は１０時間以上、好ましくは１２時間以上であることが好ましいと考えられる。 From the above, since (a), (i), and (j) are substantially the same signals, it was found that a necessary SiO ₂ layer was formed even in baking under atmospheric pressure. Regarding the conditions, the baking temperature when forming the SiO ₂ layer on the silicon substrate is 500 ° C. or more, preferably about 600 ° C., and the baking time is 10 hours or more, preferably 12 hours or more. It is considered preferable.

（実施例３）ハイブリダイゼーション反応
実施例１で作成したシリコン基体上にＳｉＯ_２層を有する担体（ａ）、およびシリコン基体（（株）新陽製、前掲）を大気炉（光洋サーモシステム社製）中、６００℃で２０時間ベーキングすることで得られたシリコン基体の表面にＳｉＯ_２層を有する担体（ｊ）について、２種類の異なるオリゴＤＮＡを固定化させた後に、ＰＣＲ産物をターゲットに用いたハイブリダイゼーションを行なった。 (Example 3) Hybridization reaction The carrier (a) having a SiO ₂ layer on the silicon substrate prepared in Example 1 and the silicon substrate (manufactured by Shinyo Co., Ltd., supra) were used as an atmospheric furnace (manufactured by Koyo Thermo Systems Co., Ltd.). For the carrier (j) having a SiO ₂ layer on the surface of a silicon substrate obtained by baking at 600 ° C. for 20 hours, two different oligo DNAs were immobilized, and then the PCR product was used as a target. Hybridization was performed.

試験方法：
２種類のオリゴＤＮＡの溶液（５μＭ）を上記（ａ）および（ｊ）の担体上にスポットし、８０℃で１時間ベーキングし、洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で１５分間室温にて洗浄し、続いて同じ洗浄液で５分間熱洗浄（９０℃以上）を行うことにより、オリゴＤＮＡを担体上に固定化した。その後、Ｃｙ５で標識したＰＣＲ産物をターゲットＤＮＡとして、ハイブリダイズ（４５℃、１時間）を行った。その後、洗浄液（２×ＳＳＣ）で洗浄した後に、富士写真フィルム社製ＦＬＡ８０００（ＰＭＴ５０％）を用いてシグナルを検出した。 Test method:
Two types of oligo DNA solutions (5 μM) were spotted on the carriers (a) and (j) above, baked at 80 ° C. for 1 hour, and washed with a washing solution (2 × SSC / 0.2% SDS) for 15 minutes at room temperature. Then, the oligo DNA was immobilized on the carrier by performing thermal washing (at 90 ° C. or higher) for 5 minutes with the same washing solution. Thereafter, hybridization (45 ° C., 1 hour) was performed using the PCR product labeled with Cy5 as the target DNA. Thereafter, after washing with a washing solution (2 × SSC), signals were detected using FLA8000 (PMT 50%) manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.

試験結果：
結果を図１に示す。これより、ターゲットＤＮＡと相補的なプローブＤＮＡ（I）がスポットされた部分では、ハイブリダイズによるＣｙ５側のシグナル確認された。一方で、相補的でないプローブＤＮＡ（II）が固定化された部分では、Ｃｙ５側のシグナルは確認されなかった。これより、真空熱酸化（ａ）および大気圧下での熱酸化（ｊ）のいずれの方法で作成したＳｉＯ_２層においても、ＤＮＡプローブが機能可能に固定化されており、高感度のハイブリダイズシグナルが得られることが示された。 Test results:
The results are shown in FIG. From this, the Cy5 side signal due to hybridization was confirmed in the spot where the probe DNA (I) complementary to the target DNA was spotted. On the other hand, no signal on the Cy5 side was confirmed in the portion where the non-complementary probe DNA (II) was immobilized. As a result, the DNA probe is functionally immobilized on the SiO ₂ layer prepared by any one of the vacuum thermal oxidation (a) and the thermal oxidation (j) under atmospheric pressure, and highly sensitive hybridization is achieved. A signal was shown to be obtained.

本発明の担体にプローブＤＮＡを固定化し、これにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせた結果を示す。The result of having immobilized the probe DNA on the carrier of the present invention and hybridizing it with the target DNA is shown.

Claims (3)

シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体の製造方法であって、
シリコン基体を、酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下で１００〜１２００℃の温度で１〜４８時間、ベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成すること、および
非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することを含む、前記方法。 A method for producing a carrier having a SiO ₂ layer, an electrostatic layer for electrostatically attracting a biomolecule and a functional group capable of covalently bonding with the biomolecule on a silicon substrate,
Forming a SiO ₂ layer by baking a silicon substrate at a temperature of 100 to 1200 ° C. for 1 to 48 hours under atmospheric pressure or reduced pressure in the presence of oxygen, and unsubstituted or monosubstituted The method comprising introducing a functional group capable of being covalently bonded to a biomolecule after being immersed in a solution containing a compound having an amino group. ６００〜１２００℃で３〜４８時間、ベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成することを特徴とする請求項１記載の方法。 3-48 hours at 600 to 1200 ° C., The method of claim 1, wherein the forming the SiO ₂ layer by baking. ６００〜１２００℃で１２〜４８時間、ベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成することを特徴とする請求項１記載の方法。 The method according to claim 1 , wherein the SiO ₂ layer is formed by baking at 600 to 1200 ° C. for 12 to 48 hours.

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