JP4419715B2 - Biochip substrate and biochip - Google Patents
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Description
本発明は、生理活性物質を固相基板上に固定化するためのバイオチップに関する。 The present invention relates to a biochip for immobilizing a physiologically active substance on a solid phase substrate.
マイクロアレイを用いて試料検体の情報を得る技術は、生物学、医学において欠くことのできない技術になりつつある。例えばＤＮＡマイクロアレイでは、複雑な生物系においてもゲノム全体の発現パターンの研究が可能となり、遺伝子情報量の爆発的な増加がもたらされている。
マイクロアレイのシグナル検出において、マイクロアレイ用基板のバックグランドはＳ／Ｎ比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば、非特許文献１）。Ｓ／Ｎ比とは、ラベル化された試料検体から得られたシグナル量（シグナル）をラベル化された試料検体から得られたシグナル物質以外の部位から発生したシグナル量（ノイズ）で除した値のことをいい、Ｓ／Ｎ比が高いと検出感度が高くなる。
Techniques for obtaining sample specimen information using microarrays are becoming indispensable techniques in biology and medicine. For example, DNA microarrays enable the study of the expression pattern of the entire genome even in complex biological systems, resulting in an explosive increase in the amount of gene information.
In the microarray signal detection, the background of the microarray substrate causes a decrease in the S / N ratio, thereby reducing the detection accuracy (for example, Non-Patent Document 1). The S / N ratio is a value obtained by dividing the signal amount (signal) obtained from the labeled sample specimen by the signal amount (noise) generated from a site other than the signal substance obtained from the labeled sample specimen. This means that when the S / N ratio is high, the detection sensitivity becomes high.
マイクロアレイ上の物質を検出する手段として蛍光物質を用いる場合、マイクロアレイ固相基板の自己蛍光量がバックグランドとなり、基板の自己蛍光が高いと、Ｓ／Ｎ比が低下する問題がある。また、バックグラウンドにムラが生じた場合、その基板から得られたデータの再現性・信頼性に支障をきたす。
ゆえに、マイクロアレイ基板の材料には低蛍光性のものを使用することが多い。また、基板表面には核酸を効率良く固定化するための化学的修飾が施されることが通常であり、アルデヒド基やアミノ基を導入したものが多用されている。これらの官能基に由来する蛍光を低減することは、マイクロアレイを用いたアッセイの精度向上の観点から重要となってくる。マイクロアレイ用基板はガラスもしくはプラスチック製であることが多いが、通常これらの材料表面は化学的に不活性であることから、核酸を固定化するためには表面修飾を施す必要がある。表面修飾としては、アルデヒド基、アミノ基などの活性な官能基を導入する場合が多い。アミノ基を導入した基板では、基板全体が正電荷を帯びているため、負電荷をもつ核酸分子を静電的相互作用により固定化することができる。また、アルデヒド基を導入した基板では、固定化する核酸分子にアミノ基を予め導入しておくことにより、共有結合形成による強固な固定化が可能であることから、特に塩基数が数十個以下のオリゴＤＮＡ固定化用基板として広く用いられている（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３）。
When a fluorescent substance is used as a means for detecting substances on the microarray, the amount of autofluorescence of the microarray solid phase substrate becomes the background, and if the substrate has high autofluorescence, there is a problem that the S / N ratio decreases. In addition, when the background is uneven, the reproducibility and reliability of the data obtained from the substrate is hindered.
Therefore, a material having a low fluorescence is often used as a material for the microarray substrate. In addition, chemical modification for efficiently immobilizing nucleic acid is usually performed on the substrate surface, and aldehyde groups or amino groups are often used. Reducing the fluorescence derived from these functional groups is important from the viewpoint of improving the accuracy of assays using microarrays. The substrate for microarray is often made of glass or plastic, but usually the surface of these materials is chemically inactive. Therefore, surface modification is required to immobilize nucleic acids. As surface modification, active functional groups such as aldehyde groups and amino groups are often introduced. In a substrate into which an amino group has been introduced, the entire substrate is positively charged, so that a negatively charged nucleic acid molecule can be immobilized by electrostatic interaction. In addition, with an aldehyde group-introduced substrate, an amino group is introduced in advance into the nucleic acid molecule to be immobilized, so that it can be firmly immobilized by covalent bond formation. Are widely used as oligo DNA immobilization substrates (for example, Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3).
基板表面へのアミノ基の導入方法として、アミノアルキルシランによる処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティング、ポリ‐Ｌ−リジンなどのコーティングが挙げられる。
また、基板表面に結合されたグラフトポリマーを介してＤＮＡを固定化する方法などがある（例えば特許文献４、特許文献５）。特許文献５には、カルボキシル基を持つモノマーを構成成分とするポリマーを表面に担持した固相担体を使用し、ＤＮＡ断片を固定化する方法が開示されている。
しかしながら、上述の方法では、検出対象物質の物理的吸着（非特異的吸着）を抑制することは困難であるため、バックグランドが上昇してしまい、Ｓ／Ｎ比の低下を招く。そこで、検出対象物質の基板への物理的吸着（非特異的吸着）を抑制することのできる基板の開発が求められていた。
Examples of the method for introducing amino groups onto the substrate surface include treatment with aminoalkylsilane, plasma treatment in a nitrogen atmosphere, coating with amino group-containing polymer, and coating with poly-L-lysine.
In addition, there is a method of immobilizing DNA through a graft polymer bonded to the substrate surface (for example, Patent Document 4 and Patent Document 5). Patent Document 5 discloses a method for immobilizing a DNA fragment using a solid phase carrier having a polymer having a carboxyl group-containing monomer as a constituent component on the surface.
However, in the above-described method, it is difficult to suppress physical adsorption (nonspecific adsorption) of the detection target substance, so that the background increases and the S / N ratio decreases. Therefore, development of a substrate capable of suppressing physical adsorption (nonspecific adsorption) of the detection target substance to the substrate has been demanded.
Ｓ／Ｎ比の向上についてより詳細に述べる。基板表面に生理活性物質を固定化後、基板表面の官能基が活性な状態のままであると、検出対象物質の非特異的な結合が起こるため、官能基の不活性化処理（ブロッキング）を行う必要がある（非特許文献２および非特許文献３参照）。ブロッキングの方法としては、検出反応に影響しない物質を吸着させて官能基を遮蔽する方法と、触媒などの作用により官能基を他の不活性な官能基に変換する方法がある。しかし、ブロッキング処理は官能基を不活性化するだけであり、検出対象物質の物理的吸着（非特異的吸着）を抑制することはできない。検査対象物質の非特異的吸着が起こると、バックグランドが上昇し、またバックグランドにムラが生じてしまい、シグナルの検出精度、すなわちＳ／Ｎ比が低くなる。 The improvement of the S / N ratio will be described in more detail. After immobilizing a physiologically active substance on the substrate surface, if the functional group on the substrate surface remains in an active state, non-specific binding of the substance to be detected occurs. This must be done (see Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3). As a blocking method, there are a method of blocking a functional group by adsorbing a substance that does not affect the detection reaction, and a method of converting a functional group into another inactive functional group by the action of a catalyst or the like. However, the blocking treatment only inactivates the functional group and cannot suppress physical adsorption (nonspecific adsorption) of the detection target substance. When non-specific adsorption of the test target substance occurs, the background increases and the background becomes uneven, and the signal detection accuracy, that is, the S / N ratio is lowered.
また、Ｓ／Ｎ比の向上は、ラベル化された試料検体から得られたシグナル量を向上することによって達成できる。シグナル量に大きな影響を及ぼす要素の一つとして、基板表面への生理活性物質の固定化効率、すなわち、基板の生理活性物質の固定化能力が挙げられる。よって、基板の生理活性物質の固定化能を高ければ、Ｓ／Ｎ比をより向上することができる。
上述したように、非特異的な吸着を最小限に抑えることによりバックグランドを減少し、かつ、基板生理活性物質の固定化能を高めることによりシグナル量を向上することは、高いＳ／Ｎ比を実現できるバイオチップとして非常に有用である。
Further, the improvement of the S / N ratio can be achieved by improving the signal amount obtained from the labeled sample specimen. One factor that greatly affects the signal amount is the immobilization efficiency of the physiologically active substance on the substrate surface, that is, the ability to immobilize the physiologically active substance on the substrate. Accordingly, if the ability to immobilize the physiologically active substance on the substrate is high, the S / N ratio can be further improved.
As described above, reducing the background by minimizing non-specific adsorption and improving the amount of signal by increasing the immobilization ability of the substrate physiologically active substance has a high S / N ratio. It is very useful as a biochip capable of realizing
本発明の目的は、検出対象物質の非特異的な吸着・結合量が少なく、かつ、生理活性物質の固定化能の高いバイオチップ用基板を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a biochip substrate having a small amount of non-specific adsorption / binding of a substance to be detected and a high ability to immobilize a physiologically active substance.
（１）基板表面に生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、アミノ基と反応する官能基およびホスホリルコリン基を有するポリマーを表面に塗布し、次いで多官能性のアミノ基を有する化合物を反応させてなることを特徴とするバイオチップ用基板、
（２）アミノ基と反応する官能基が、アルデヒド基、活性エステル基、および酸無水物基から選ばれる少なくとも一つの官能基である（１）記載のバイオチップ用基板、
（３）アミノ基と反応する官能基が、ｐ-ニトロフェニルエステル基またはＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル基である（２）記載のバイオチップ用基板、
（４）多官能性のアミノ基を有する化合物の分子骨格が炭化水素鎖またはエチレングリコール鎖で構成されている（１）〜（３）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（５）多官能性のアミノ基を有する化合物が、アミノ基以外の分子骨格中に窒素原子を少なくとも１つ有する化合物である（１）〜（４）いずれか記載バイオチップ用基板、
（６）ポリマーがブチルメタクリレート基を含む共重合体である（１）〜（５）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（７）ホスホリルコリン基が２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（１）〜（６）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（８）固相基板がプラスチック製である（１）〜（７）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（９）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（８）のバイオチップ用基板、
（１０）固相基板がガラス製である（１）〜（７）いずれか記載のバイオチップ用基板、
（１１）（１）〜（１０）いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質が固定化されたバイオチップであって、生理活性物質が核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびそれらの類似物の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体であるバイオチップ、
である。
(1) A biochip substrate for immobilizing a physiologically active substance on a substrate surface, wherein a polymer having a functional group that reacts with an amino group and a phosphorylcholine group is applied to the surface, and then a compound having a polyfunctional amino group A biochip substrate characterized by reacting
(2) The biochip substrate according to (1), wherein the functional group that reacts with an amino group is at least one functional group selected from an aldehyde group, an active ester group, and an acid anhydride group,
(3) The biochip substrate according to (2), wherein the functional group that reacts with an amino group is a p-nitrophenyl ester group or an N-hydroxysuccinimide ester group,
(4) The biochip substrate according to any one of (1) to (3), wherein the molecular skeleton of the compound having a polyfunctional amino group is composed of a hydrocarbon chain or an ethylene glycol chain,
(5) The biochip substrate according to any one of (1) to (4), wherein the compound having a polyfunctional amino group is a compound having at least one nitrogen atom in a molecular skeleton other than the amino group.
(6) The biochip substrate according to any one of (1) to (5), wherein the polymer is a copolymer containing a butyl methacrylate group,
(7) The biochip substrate according to any one of (1) to (6), wherein the phosphorylcholine group is a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine group,
(8) The biochip substrate according to any one of (1) to (7), wherein the solid phase substrate is made of plastic.
(9) The biochip substrate according to (8), wherein the plastic is a saturated cyclic polyolefin,
(10) The biochip substrate according to any one of (1) to (7), wherein the solid phase substrate is made of glass,
(11) A biochip in which a bioactive substance is immobilized on the biochip substrate according to any one of (1) to (10), wherein the bioactive substance is a nucleic acid, a peptide nucleic acid, an aptamer, an oligopeptide, a sugar chain, And a biochip that is a complex including at least one selected from among these and the like, or including at least one of these,
It is.
本発明によれば、検出対象物質の非特異的な吸着・結合量が少なく、かつ、生理活性物質の固定化能の高いバイオチップ用基板を得ることができる。 According to the present invention, it is possible to obtain a biochip substrate with a small amount of non-specific adsorption / binding of a substance to be detected and a high ability to immobilize a physiologically active substance.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のバイオチップ用基板は、基板表面にアミノ基およびホスホリルコリン基を有することを特徴とする。
アミノ基およびホスホリルコリン基の導入方法としては、アミノ基およびまたはホスホリルコリン基を有するポリマーが表面に塗布されることにより導入されていることが好ましく、アミノ基とホスホリルコリン基が同一のポリマーであるかまたはアミノ基を有するポリマーとホスホリルコリン基を有するポリマーが各々別のポリマーであることがより好ましい。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The biochip substrate of the present invention is characterized by having an amino group and a phosphorylcholine group on the substrate surface.
As a method for introducing an amino group and a phosphorylcholine group, it is preferable that the polymer having an amino group and / or a phosphorylcholine group is introduced on the surface, and the amino group and the phosphorylcholine group are the same polymer or an amino group. More preferably, the polymer having a group and the polymer having a phosphorylcholine group are different from each other.
また、アミノ基と反応する官能基およびホスホリルコリン基を有するポリマーを表面に塗布することにより、アミノ基と反応する官能基およびホスホリルコリン基を基板表面に導入し、次いで多官能性のアミノ基を有する化合物を反応させることによりアミノ基を導入することもできる。アミノ基と反応する官能基としては、アルデヒド基、活性エステル基、酸無水物などが挙げられるが、活性エステル基であることが好ましい。 Also, a compound having a functional group that reacts with an amino group and a phosphorylcholine group is applied to the surface by introducing a functional group that reacts with the amino group and a phosphorylcholine group onto the substrate surface, and then a compound that has a polyfunctional amino group An amino group can also be introduced by reacting. Examples of the functional group that reacts with an amino group include an aldehyde group, an active ester group, and an acid anhydride, and an active ester group is preferable.
ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（例えばIshihara K, Tsuji T, Kurosaki T, Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28(2), pp.225-232, (1994)４など）。
ホスホリルコリン基は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン 、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン 、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン 、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン 、アリルホスホリルコリン 、ブテニルホスホリルコリン 、ヘキセニルホスホリルコリン 、オクテニルホスホリルコリン 、デセニルホスホリルコリン等が挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
A polymer having a phosphorylcholine group is a polymer having a structure similar to a biological membrane (phospholipid bilayer membrane), and has an effect of suppressing adsorption of a physiologically active substance (for example, Ishihara K, Tsuji T, Kurosaki T Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28 (2), pp.225-232, (1994) 4).
Examples of the phosphorylcholine group include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-methacryloyloxyethoxyethylphosphorylcholine, 6-methacryloyloxyhexylphosphorylcholine, 10-methacryloyloxyethoxynonylphosphorylcholine, allylphosphorylcholine, butenylphosphorylcholine, hexenylphosphorylcholine, octenylphosphorylcholine, Although senyl phosphorylcholine etc. are mentioned, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is preferable.
基板表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性などの観点から、基板表面とポリマーとの疎水効果によって結合していることが好ましい。 The bond between the substrate surface and the polymer may be any bond mode such as covalent bond, electrostatic interaction, hydrogen bond, or bond by hydrophobic effect, but from the viewpoint of simplicity of surface treatment, the substrate surface It is preferable that the polymer and the polymer are bonded by a hydrophobic effect.
また、本発明に使用するポリマーは、ホスホリルコリン基及び活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む共重合体が好ましい。 Moreover, the polymer used for this invention may contain other groups other than a phosphorylcholine group and an active ester group, and the copolymer containing a butylmethacrylate group is preferable.
本発明に使用する活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル基などが好ましく挙げられるるが、ｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより好ましい。 Examples of the active ester group used in the present invention include p-nitrophenyl ester group, N-hydroxysuccinimide ester group, succinimide ester group, phthalimide ester group, 5-norbornene-2,3-dicarboximide ester Preferred examples include groups such as p-nitrophenyl ester groups and N-hydroxysuccinimide ester groups.
本発明に使用する多官能性のアミノ基を有する化合物は、一分子中に２個以上のアミノ基を有していればどのような骨格であってもよいが、紫外および可視領域において蛍光を発しない骨格であることが好ましい。より好ましくは、骨格の一部が炭化水素鎖およびエチレングリコール鎖で構成されていることである。また、骨格の一部に窒素原子を少なくとも１つ有する化合物であることがより好ましい。窒素原子の存在により表面が正電荷をより帯びやすくなっているため、生理活性物質がより固定化されやすくなる。 The compound having a polyfunctional amino group used in the present invention may have any skeleton as long as it has two or more amino groups in one molecule. However, the compound has fluorescence in the ultraviolet and visible regions. A skeleton that does not emit is preferable. More preferably, a part of the skeleton is composed of a hydrocarbon chain and an ethylene glycol chain. Further, a compound having at least one nitrogen atom in a part of the skeleton is more preferable. Since the surface is more positively charged due to the presence of nitrogen atoms, the physiologically active substance is more easily immobilized.
骨格の一部が炭化水素鎖またはエチレングリコール鎖で構成されている化合物として、例えば、エチレンジアミン、N、N−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミン、１、４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、エチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、ジエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、ポリエチレンイミン等が挙げられ、このうち骨格の一部に窒素原子を少なくとも１つ有する物質としては、N、N−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミン、１、４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジンが挙げられる。 Examples of compounds in which a part of the skeleton is composed of a hydrocarbon chain or an ethylene glycol chain include, for example, ethylenediamine, N, N-bis (3-aminopropyl) methylamine, and 1,4-bis (3-aminopropyl) piperazine , Ethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether, diethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether, polyethyleneimine, and the like. Among these, N, N as the substance having at least one nitrogen atom in a part of the skeleton -Bis (3-aminopropyl) methylamine, 1,4-bis (3-aminopropyl) piperazine.
本発明に使用するバイオチップ用基板の固相基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。 As the material for the solid phase substrate of the biochip substrate used in the present invention, glass, plastic, metal or the like can be used. However, from the viewpoint of ease of surface treatment and mass productivity, plastic is preferable, and thermoplastic resin is used. More preferred. As the thermoplastic resin, those that generate a small amount of fluorescence are preferred, for example, linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene, cyclic polyolefins, fluorine-containing resins, etc. are preferably used, and heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, It is more preferable to use a saturated cyclic polyolefin that is particularly excellent in moldability. Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin.
また、本発明における固相基板として、固相基板が実質的に不透明に、或いは、少なくとも検出する蛍光のピーク波長、或いは、少なくとも照射する励起光のピーク波長で不透明にされている基板を使用することもできる。特開２００３−１３０８７４号では、プラスチック基板を不透明にする手段として、黒色顔料を添加する方法が挙げられている。プラスチックに顔料を含有させる方法については、マスターパウダーやドライカラー、マスターバッチなどいろいろなタイプがあるが、特に経済性、取り扱い性等の点で優れているマスターバッチを用いることが好ましい。マスターバッチとは、基材樹脂を主成分とし、この基材樹脂に顔料や添加剤等を練り込んだものであり、通常ナチュラル樹脂により10〜100倍に希釈して使用される。これにより、基板に用いられているプラスチックが受ける励起光の侵入を阻止し、励起光により発する蛍光を検出器に届かないように材料を改質している。 Also, as the solid phase substrate in the present invention, a substrate in which the solid phase substrate is substantially opaque, or at least at the peak wavelength of fluorescence to be detected, or at least at the peak wavelength of excitation light to be irradiated is used. You can also. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-130874 mentions a method of adding a black pigment as means for making a plastic substrate opaque. There are various types of methods for incorporating the pigment into the plastic, such as master powder, dry color, and masterbatch, but it is particularly preferable to use a masterbatch that is excellent in terms of economy and handling. The master batch is a base resin mainly composed of a base resin, and a pigment, an additive and the like are kneaded into the base resin, and is usually diluted 10 to 100 times with a natural resin. This prevents the penetration of excitation light received by the plastic used for the substrate and modifies the material so that the fluorescence emitted by the excitation light does not reach the detector.
本発明のバイオチップ用基板を用いて生理活性物質を固定化することができる。本発明で用いる生理活性物質としては、核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびこれらの類似物の中から選ばれる少なくとも１つであるか、またはこれらの中から少なくとも１つを含む複合体を挙げることができるがこれらに限定されない。 A bioactive substance can be immobilized using the biochip substrate of the present invention. The physiologically active substance used in the present invention is at least one selected from nucleic acids, peptide nucleic acids, aptamers, oligopeptides, sugar chains, and the like, or includes at least one of these. Examples include, but are not limited to, composites.
生理活性物質の固定化は、固相基板表面のアミノ基の正電荷と負電荷をもつ生理活性物質との静電的相互作用、固相基板表面のアミノ基と生理活性物質に含まれる官能基と間の化学結合、または、固相基板表面と生理活性物質との物理的吸着、水素結合などによるものであることが好ましい。固定化される生理活性物質は、本来の生理活性を実質的に保っていることが好ましい。ここで本来の生理活性とは、たとえば核酸の場合はハイブリダイゼーション現象、抗体の場合は抗原認識能といったものである。基板上に固定化された生理活性物質と、別途調製した生理活性物質（検体）を反応させ、その反応を定量化することにより検体の情報を得ることができる。定量化の手段として一般的に用いられている方法は、検体を蛍光標識しておき、その蛍光量を読み取る方法である。 The immobilization of the physiologically active substance is based on the electrostatic interaction between the positively and negatively charged physiologically active substance on the surface of the solid phase substrate, the amino group on the solid phase substrate surface and the functional group contained in the physiologically active substance. It is preferably due to a chemical bond between the solid phase substrate, physical adsorption between the solid substrate surface and the physiologically active substance, hydrogen bonding, or the like. It is preferable that the physiologically active substance to be immobilized substantially maintains the original physiological activity. Here, the original physiological activity is, for example, a hybridization phenomenon in the case of a nucleic acid and an antigen recognition ability in the case of an antibody. Information on the specimen can be obtained by reacting a physiologically active substance immobilized on the substrate with a physiologically active substance (specimen) separately prepared and quantifying the reaction. A method generally used as a means of quantification is a method in which a specimen is fluorescently labeled and the amount of fluorescence is read.
本発明のバイオチップ用基板は蛍光発生量が低く抑えられているため、定量に蛍光標識を利用するバイオチップの基板として好適に用いることができる。また、蛍光標識を用いないバイオチップの基板としても用いることができる。 Since the biochip substrate of the present invention has a low fluorescence generation amount, it can be suitably used as a biochip substrate that uses a fluorescent label for quantification. It can also be used as a biochip substrate that does not use fluorescent labels.
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではない。
（アミノ基導入基板の作製）
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
前記基板にN、N−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミンの２体積％水溶液に3時間浸漬し、純水で洗浄後、８０℃、２時間真空乾燥することにより、基板表面にホスホリルコリン基およびアミノ基が導入されたバイオチップ用基板を作成した。
The present invention is specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to the scope of the examples.
(Production of amino group introduction substrate)
Example 1
A saturated cyclic polyolefin resin was processed into a slide glass shape to prepare a solid phase substrate. By immersing the solid phase substrate in a 0.5 wt% ethanol solution of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbonyloxyethyl methacrylate copolymer, phosphorylcholine groups and active ester groups are formed on the substrate surface. Introduced polymer material.
The substrate was immersed in a 2% by volume aqueous solution of N, N-bis (3-aminopropyl) methylamine for 3 hours, washed with pure water, and then vacuum-dried at 80 ° C. for 2 hours, whereby phosphorylcholine groups and A biochip substrate into which an amino group was introduced was prepared.
（実施例２）
スライドガラス（ＴｅｌｅＣｈｅｍ社製）に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
前記基板にN、N−ビス（３−アミノプロピル）メチルアミンの２体積％水溶液に3時間浸漬し、純水で洗浄後、８０℃、２時間真空乾燥することにより、基板表面にホスホリルコリン基およびアミノ基が導入されたバイオチップ用基板を作成した。
(Example 2)
By immersing in a 0.5% by weight ethanol solution of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbonyloxyethyl methacrylate copolymer in a slide glass (manufactured by TeleChem), phosphorylcholine groups and activity on the substrate surface A polymer material having an ester group was introduced.
The substrate was immersed in a 2% by volume aqueous solution of N, N-bis (3-aminopropyl) methylamine for 3 hours, washed with pure water, and then vacuum-dried at 80 ° C. for 2 hours, whereby phosphorylcholine groups and A biochip substrate into which an amino group was introduced was prepared.
（実施例３）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
前記基板にエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテルの２体積％水溶液に3時間浸漬し、純水で洗浄後、８０℃、２時間真空乾燥することにより、基板表面にホスホリルコリン基およびアミノ基が導入されたバイオチップ用基板を作成した。
(Example 3)
A saturated cyclic polyolefin resin was processed into a slide glass shape to prepare a solid phase substrate. By immersing the solid phase substrate in a 0.5 wt% ethanol solution of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbonyloxyethyl methacrylate copolymer, phosphorylcholine groups and active ester groups are formed on the substrate surface. Introduced polymer material.
The substrate is immersed in a 2% by volume aqueous solution of ethylene glycol bis (3-aminopropyl) ether for 3 hours, washed with pure water, and then vacuum dried at 80 ° C. for 2 hours, whereby phosphorylcholine groups and amino groups are formed on the substrate surface. An introduced biochip substrate was prepared.
（実施例４）
カーボンブラック４０重量％に対しポリスチレン６０重量％を配合し、高濃度に黒色顔料を含有するペレットを作製。このペレットを飽和環状ポリオレフィン樹脂に対し、３．７５重量％に配合することによりカーボンブラックを１．５重量％含有する飽和環状ポリオレフィン樹脂を作製した。この樹脂を用いて、スライドガラス状の基板を作製した。
前記基板を実施例１と同様な方法により、基板表面にホスホリルコリン基およびアミノ基が導入されたバイオチップ用基板を作成した。
Example 4
Blending 60% by weight of polystyrene with 40% by weight of carbon black to produce pellets containing black pigment at a high concentration. A saturated cyclic polyolefin resin containing 1.5% by weight of carbon black was prepared by blending this pellet with 3.75% by weight of the saturated cyclic polyolefin resin. A slide glass-like substrate was produced using this resin.
A biochip substrate was prepared by introducing phosphorylcholine groups and amino groups into the substrate surface by the same method as in Example 1.
（実施例５）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−アミノオキシエチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基およびアミノ基が導入されたバイオチップ用基板を作成した。
(Example 5)
A saturated cyclic polyolefin resin was processed into a slide glass shape to prepare a solid phase substrate. For biochips in which phosphorylcholine groups and amino groups are introduced on the substrate surface by immersing the solid phase substrate in a 0.5 wt% ethanol solution of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-aminooxyethyl methacrylate copolymer A substrate was created.
（比較例１）
飽和環状ポリオレフィン製の基板を親水化処理したのち、１％アミノアルキルシラン溶液に浸漬し、熱処理を施すことにより基板表面にアミノ基が導入されたバイオチップ用基板を作成した。
(Comparative Example 1)
The substrate made of saturated cyclic polyolefin was hydrophilized and then immersed in a 1% aminoalkylsilane solution and subjected to heat treatment to prepare a biochip substrate having amino groups introduced on the substrate surface.
（比較例２）
ＴｅｌｅＣｈｅｍ社製アミノ基導入ガラス基板を用いた。
(Comparative Example 2)
An amino group-introduced glass substrate manufactured by TeleChem was used.
（比較例３）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状に加工して固相基板を作成した。固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基および活性エステル基が導入されたバイオチップ用基板を作成した。
(Comparative Example 3)
A saturated cyclic polyolefin resin was processed into a slide glass shape to prepare a solid phase substrate. A solid phase substrate is immersed in a 0.5 wt% ethanol solution of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbonyloxyethyl methacrylate copolymer to introduce phosphorylcholine groups and active ester groups on the substrate surface. A biochip substrate was prepared.
（ＰＣＲ産物の調整）
長鎖ＤＮＡおよび蛍光標識長鎖ＤＮＡの調整は、ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（タカラバイオ社製）を使用して、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを用いた。プライマーとして、オリゴヌクレオチド（シグマジェノシス社製）（配列１：ＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号１）、配列２：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴ（配列番号２））を使用し、ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎｌｉｖｅｒ）（タカラバイオ社製）を鋳型として、βアクチン遺伝子のＤＮＡ断片（５０２ｂｐ）を増幅した。
ＰＣＲ反応液の組成は、２００μＭ ｄＮＴＰ、ＴａｋａｒａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）、２ｍＭＭｇＣｌ2、Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒであり、ＰＣＲ反応は、プレ変性：９０℃、３０秒；１サイクル、熱変性：９０℃、３０秒、アニーリング：６０℃、３０秒、伸長：７２℃、４５秒；３０サイクル、伸長：７２℃、３分；１サイクルで行なった。この断片をアガロースゲル電気泳動により増幅されていることを確認後、マイクロコン１００（ミリポア社製）を用いて、ＰＣＲ増幅産物を精製、濃縮した。
蛍光標識長鎖ＤＮＡの調整は、Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の方法で行なった。
(Preparation of PCR products)
For the preparation of the long DNA and the fluorescently labeled long DNA, DNA amplified by PCR using PCR Thermal Cycler 480 (manufactured by Takara Bio Inc.) was used. An oligonucleotide (manufactured by Sigma Genosys) (sequence 1: TCGTGCGGTGACATTAAGGAGAAGC (SEQ ID NO: 1), sequence 2: CTAGAAAGCATTGGCGGTGGACGAT (SEQ ID NO: 2))) was used as a primer, and a cDNA library (Humanliver) (manufactured by Takara Bio Inc.) was used. As a template, a DNA fragment (502 bp) of β-actin gene was amplified.
The composition of the PCR reaction solution was 200 μM dNTP, TakaraExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.), 2 mM MgCl 2 , Ex Taq Buffer. The PCR reaction was pre-denaturation: 90 ° C., 30 seconds; Second, annealing: 60 ° C., 30 seconds, elongation: 72 ° C., 45 seconds; 30 cycles, elongation: 72 ° C., 3 minutes; 1 cycle. After confirming that this fragment was amplified by agarose gel electrophoresis, the PCR amplification product was purified and concentrated using Microcon 100 (Millipore).
The fluorescence-labeled long-chain DNA was prepared by the same method as described above using a Cy3-labeled oligonucleotide.
（ＤＮＡの固定化、ハイブリダイゼーション）
上記で得られた長鎖ＤＮＡを所定の水溶液を用いて、所定濃度に溶解し、９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて実施例１〜５、比較例１〜３で作製した基板にそれぞれ点着した。
点着後、８０℃で１時間熱処理、ＵＶを照射（１２０ｍＪ）することにより長鎖ＤＮＡを固定化し、０．１％ＳＤＳで洗浄を行なった。その後、２×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム緩衝液）、０．１％ＳＤＳの水溶液を調整し、ホットプレート上で沸騰させた後、基板を１分間浸漬し、次いで純水中に１分間浸漬した。
前基板を５×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ水溶液中に５０℃で1時間浸すことで、ＤＮＡが点着されていない部分のブロッキングを行なった。次いで、水で洗浄した後、ハイブリダイゼーション反応を５０℃で１６時間行なった。ハイブリダイゼーション溶液として、上記で得られた蛍光標識長鎖ＤＮＡを所定の濃度に溶解した、５×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳを用いた。
ハイブリダイゼーション終了後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で４２℃、１０分浸漬した。その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分浸漬し、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの順に洗浄を行なった。次いで、基板を遠心することにより乾燥した。
(DNA immobilization, hybridization)
The long-chain DNA obtained above was dissolved in a predetermined concentration using a predetermined aqueous solution, dispensed into a 96-well plate, and Examples 1-5 and Comparative Examples 1- 1 using a micropin type microarray spotter. Each of the substrates prepared in 3 was spotted.
After spotting, the long DNA was immobilized by heat treatment at 80 ° C. for 1 hour and irradiation with UV (120 mJ), followed by washing with 0.1% SDS. Thereafter, an aqueous solution of 2 × SSC (sodium citrate buffer) and 0.1% SDS was prepared and boiled on a hot plate, and then the substrate was immersed for 1 minute and then immersed in pure water for 1 minute.
The front substrate was immersed in 5 × SSC, 0.3% SDS, 0.1 mg / ml BSA aqueous solution at 50 ° C. for 1 hour to block the portion where the DNA was not spotted. Subsequently, after washing with water, a hybridization reaction was performed at 50 ° C. for 16 hours. As the hybridization solution, 5 × SSC, 0.3% SDS in which the fluorescently labeled long-chain DNA obtained above was dissolved at a predetermined concentration was used.
After completion of hybridization, the cells were immersed in 0.2 × SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. for 10 minutes. Then, it was immersed in 0.2 × SSC and 0.1% SDS at room temperature for 10 minutes and washed in the order of 2 × SSC, 1 × SSC, and 0.1 × SSC. The substrate was then dried by centrifuging.
（蛍光スキャナによるスポットの蛍光強度の数値化）
マイクロアレイ用スキャナ「ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いて、上記で得られた各基板のスポットの蛍光を検出した。このときの測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度６０％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
スポットの蛍光強度の数値化は、スキャナに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いて行なった。
(Numericalization of fluorescent intensity of spots by fluorescent scanner)
Using the microarray scanner “ScanArray Lite” (manufactured by Packard Biochip Technology), the fluorescence of the spots of each substrate obtained above was detected. The measurement conditions at this time were laser output 90%, PMT sensitivity 60%, excitation wavelength 550 nm, measurement wavelength 570 nm, and resolution 50 μm.
Quantification of the fluorescence intensity of the spot was performed using analysis software “QuantArray” attached to the scanner.
実施例１〜５、比較例１〜３の基板で得られた、蛍光シグナル値、蛍光バックグランド値、Ｓ／Ｎ比、ＣＶ値を表１に示す。ＣＶ値は、９６スポットの各蛍光量の平均値を９６スポットの各蛍光量の標準偏差で除した値であり、シグナルのバラツキを表すものである。
実施例１〜５では、比較例１〜３と比較して、蛍光バックグランド値が低く、かつ、蛍光シグナル値の大幅な増加が認められ、Ｓ／Ｎ比が高い結果となった。ＣＶ値も良好な値を示した。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。
Table 1 shows fluorescence signal values, fluorescence background values, S / N ratios, and CV values obtained with the substrates of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 3. The CV value is a value obtained by dividing the average value of each fluorescence amount of 96 spots by the standard deviation of each fluorescence amount of 96 spots, and represents a variation in signal.
In Examples 1 to 5, compared to Comparative Examples 1 to 3, the fluorescence background value was low, and a significant increase in the fluorescence signal value was observed, resulting in a high S / N ratio. The CV value was also good. This result supported the effect of the present invention.
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