JP5344835B2 - Immobilization method, physiologically active substance immobilization carrier and immobilization carrier - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、固定化方法、生理活性物質固定化担体及び固定用担体に関する。 The present invention relates to an immobilization method, a physiologically active substance immobilization carrier, and an immobilization carrier.
診断用チップやタンパク質マイクロアレイなどの固相担体を用いた生化学反応チップは、研究開発分野や臨床分野において有用性が非常に高い。例えばタンパク質マイクロアレイなどではガラス基板上にタンパク質溶液を接触させることによりタンパク質を基板上に固定化し、その固定化タンパク質の生理活性を利用して診断や解析が行われている。この場合、タンパク質が密度高く固定でき、かつ固定化タンパク質と反応させる物質が担体に非特異的に吸着しないことが求められる。 Biochemical reaction chips using solid phase carriers such as diagnostic chips and protein microarrays are very useful in research and development and clinical fields. For example, in a protein microarray or the like, a protein solution is brought into contact with a glass substrate to immobilize the protein on the substrate, and diagnosis and analysis are performed using the physiological activity of the immobilized protein. In this case, it is required that the protein can be immobilized with high density, and the substance to be reacted with the immobilized protein is not adsorbed nonspecifically on the carrier.
このような非特異的な吸着を排除するために、例えば、非特許文献１にはポリリジンコート層やアミノ基層を介してタンパク質を直接吸着固定させる方法や、多段階反応によって形成された活性エステル層を介して共有結合で固定化する方法が記載されている。
また、特許文献１には、基板を、特定のシランカップリング剤を用いることによって直接カルボキシル基化し、それを活性化することによってタンパク質を共有結合させる方法が記載されている。特許文献１で開示されているようなシランカップリング剤を用いた場合には、一般に、基板上にコーティング後、１００℃以上の温度によるベーキング処理で硬化させて、三次元の網状構造層を形成させている。
しかしながら、これらの方法では、タンパク質を安定的に比較的高密度で固定することは可能であるが、固定密度は十分ではなく、かつ固定タンパク質と反応させる物質の非特異的吸着が多くなる。
In order to eliminate such non-specific adsorption, for example, Non-Patent Document 1 discloses a method of directly adsorbing and fixing a protein via a polylysine coat layer or an amino group layer, or an active ester layer formed by a multistage reaction. A method of immobilizing via a covalent bond is described.
Patent Document 1 describes a method in which a substrate is directly carboxylated by using a specific silane coupling agent and a protein is covalently bonded by activating it. When a silane coupling agent as disclosed in Patent Document 1 is used, generally, after coating on a substrate, it is cured by baking at a temperature of 100 ° C. or higher to form a three-dimensional network structure layer. I am letting.
However, these methods can stably immobilize proteins at a relatively high density, but the immobilization density is not sufficient, and nonspecific adsorption of a substance to be reacted with the immobilized protein increases.
本発明は、非特異的吸着が少なく且つ生理活性物質を充分量固定化することができる固定化方法、生理活性物質固定化担体及び固定用担体を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an immobilization method, a physiologically active substance-immobilized carrier and an immobilization carrier that can immobilize a sufficient amount of a physiologically active substance with less nonspecific adsorption.
本発明の固定化方法は、生理活性物質を固相担体に固定化する固定化方法であって、前記固相担体と、下記一般式（Ｉ）で表され、酸無水物官能基を有するシランカップリング剤とを、ベンゼン、トルエン及びキシレンからなる群より選択される少なくとも１つの芳香族炭化水素系溶媒中で接触させること、前記接触後の固相担体を０℃〜６０℃の温度範囲下に保持しながら、前記酸無水物官能基に対する前記生理活性物質の結合処理を行うこと、を含むものである。 The immobilization method of the present invention is an immobilization method for immobilizing a physiologically active substance on a solid phase carrier, the solid phase carrier and a silane having an acid anhydride functional group represented by the following general formula (I) Contacting the coupling agent with at least one aromatic hydrocarbon solvent selected from the group consisting of benzene, toluene and xylene, and subjecting the solid support after the contact to a temperature range of 0 ° C. to 60 ° C. Holding the physiologically active substance with respect to the acid anhydride functional group.
（式Ｉ中、Ｒ１は、３価の直鎖又は分岐の脂肪族基又は芳香族基を表し、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ２０の置換又は非置換の、アルキレン基、アリーレン基、アリールアルキレン基又はアルキルアリーレン基を表し、Ｒ３は、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｘは、アルコキシ基（−ＯＲ４）、ハロゲン原子又はアシロキシ基（−ＯＯＣＲ５）であって、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、ｎは１、２、もしくは３を表し、ｍは（３−ｎ）の整数を表す。） (In Formula I, R 1 represents a trivalent linear or branched aliphatic group or aromatic group, and R 2 represents a C 1 to C 20 substituted or unsubstituted alkylene group, arylene group, aryl group. Represents an alkylene group or an alkylarylene group, R 3 represents a hydrogen atom or a C 1 to C 10 alkyl group, and X represents an alkoxy group (—OR 4 ), a halogen atom or an acyloxy group (—OOCR 5 ). R 4 and R 5 each independently represents a hydrogen atom or a C 1 to C 10 alkyl group, n represents 1, 2, or 3, and m represents an integer of (3-n).)
上記固定化方法では、前記結合処理が、前記生理活性物質を前記酸無水官能基に対して直接接触させ、結合するものであってもよい。
また上記固定化方法では、前記生理活性物質が結合した前記固相担体に対して加水分解処理を行うものであってもよい。
In the above immobilization method, the binding treatment may be performed by bringing the physiologically active substance into direct contact with the acid anhydride functional group for binding.
In the immobilization method, the solid phase carrier to which the physiologically active substance is bound may be hydrolyzed.
上記固定化方法は、前記結合処理後に、前記固相担体の洗浄を行わないものであってもよい。 Upper Symbol immobilization method, after the coupling process, may be one which does not perform washing of the solid phase carrier.
本発明の生理活性物質固定化担体は、上記固定化方法により生理活性物質が固定化されたものである。
本発明の固定用担体は、固相担体と、下記一般式（Ｉ）で表され、酸無水物官能基を有するシランカップリング剤とを、ベンゼン、トルエン及びキシレンからなる群より選択される少なくとも１つの芳香族炭化水素系溶媒中で接触させて得られると共に、上記生理活性物質固定化担体を作製するために使用されるものである。
The physiologically active substance-immobilized carrier of the present invention is obtained by immobilizing a physiologically active substance by the above-described immobilization method.
The immobilization carrier of the present invention comprises at least a solid phase carrier and a silane coupling agent represented by the following general formula (I) having an acid anhydride functional group selected from the group consisting of benzene, toluene and xylene. It is obtained by contacting in one aromatic hydrocarbon solvent and is used for producing the physiologically active substance-immobilized carrier.
本発明によれば、非特異的吸着が少なく且つ生理活性物質を充分量固定化することができる固定化方法、生理活性物質固定化担体及び固定用担体を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an immobilization method, a physiologically active substance-immobilized carrier and an immobilization carrier that can immobilize a sufficient amount of a physiologically active substance with less nonspecific adsorption.
本発明の固定化方法は、生理活性物質を固相担体に固定化する固定化方法であって、前記固相担体と、上記一般式（Ｉ）で表され、酸無水物官能基を有するシランカップリング剤とを接触させること（接触工程）、前記接触後の固相担体を０℃〜６０℃の温度範囲下に保持しながら、前記酸無水物官能基に対する前記生理活性物質の結合処理を行うこと（結合処理）、を含むものである。
本発明では、酸無水物官能基を有する特定のシランカップリング剤を固相担体に接触させた後、０℃〜６０℃の温度範囲下に保持しながら、生理活性物質の結合を行う。即ち、シランカップリング剤を固相担体に固定するために一般的に行われている１００℃以上のベーキング処理を行わずに生理活性物質の結合処理を行う。このようにシランカップリング剤を固相担体へ接触させてもベーキング処理を行わないため、非特異的吸着を著しく抑制すると共に酸無水物に対する生理活性物質の結合処理を行うことによって充分量の生理活性物質を固定することができる。なお特定に理論に拘束されないが、本発明では、ベーキング中の酸無水物と異物との反応による汚れを、ベーキングを行わないことから効果的に低減することによって非特異的吸着を抑制できるものと推論される。
The immobilization method of the present invention is an immobilization method for immobilizing a physiologically active substance on a solid phase carrier, the solid phase carrier and a silane represented by the above general formula (I) and having an acid anhydride functional group Contacting the coupling agent with the coupling agent (contacting step), while maintaining the solid support after the contact within a temperature range of 0 ° C. to 60 ° C., the binding treatment of the physiologically active substance to the acid anhydride functional group To perform (combining process).
In the present invention, a specific silane coupling agent having an acid anhydride functional group is brought into contact with a solid phase carrier, and then a physiologically active substance is bound while being maintained in a temperature range of 0 ° C to 60 ° C. That is, the binding treatment of the physiologically active substance is performed without performing the baking treatment of 100 ° C. or higher, which is generally performed to fix the silane coupling agent to the solid phase carrier. As described above, since the baking treatment is not performed even when the silane coupling agent is brought into contact with the solid phase carrier, non-specific adsorption is remarkably suppressed and a physiologically active substance is bound to the acid anhydride to perform a sufficient amount of physiological treatment. The active substance can be fixed. Although not specifically bound by theory, in the present invention, non-specific adsorption can be suppressed by effectively reducing the contamination due to the reaction between the acid anhydride and the foreign matter during baking from not performing baking. Inferred.
本発明で用いられる固相担体としては、一般に用いられるものであれば特に制限されず、平坦基板、凹凸付き基板、粗面基板、粒子、微粒子、ロッド状粒子、薄膜、繊維、カラム、メッシュ、プローブ先端などの任意の形状を選択することができる。固相担体の材質としては、シランカップリング反応によって金属（ケイ素）−酸素−ケイ素−炭素結合が形成される材質であれば限定はされず、具体的にはガラス、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、インジウムスズ酸化物（ITO）などの酸化物、窒化ケイ素、窒化ガリウム、窒化アルミニウム、窒化インジウムなどの窒化物を単独、またはそれらの複合体として利用することができる。
更に、最表面が前記のシランカップリング反応によって結合を形成可能な材質であれば、固相担体自体はシリコンや各種金属、ポリマーを用いた多層構造体であってもよい。最表面にシランカップリング反応性の材質を形成する方法としては、一般的な表面改質方法に従えば特に限定はされず、具体的には物理蒸着、化学蒸着（CVD）スパッタなどの気相での薄膜形成、ゾルゲル法などによる液相での薄膜形成、表面酸化などによる表面近傍の改質、などが挙げられる。これらのうち担体そのものの安定性の観点からガラス、シリカの担体が好ましく、また加工の容易さからポリマーの表面にシリカ薄膜層を形成させた担体、平滑性の観点からシリコン単結晶面を表面酸化させた担体が好ましい。
The solid phase carrier used in the present invention is not particularly limited as long as it is generally used, and is a flat substrate, a substrate with unevenness, a rough surface substrate, particles, fine particles, rod-shaped particles, thin films, fibers, columns, meshes, An arbitrary shape such as a probe tip can be selected. The material of the solid phase carrier is not limited as long as it is a material in which a metal (silicon) -oxygen-silicon-carbon bond is formed by a silane coupling reaction, and specifically, glass, silica, alumina, titania, zirconia. In addition, oxides such as indium tin oxide (ITO), nitrides such as silicon nitride, gallium nitride, aluminum nitride, and indium nitride can be used alone or as a composite thereof.
Furthermore, as long as the outermost surface is a material capable of forming a bond by the silane coupling reaction, the solid phase carrier itself may be a multilayer structure using silicon, various metals, or a polymer. The method for forming a silane coupling-reactive material on the outermost surface is not particularly limited according to a general surface modification method, and specifically, a vapor phase such as physical vapor deposition or chemical vapor deposition (CVD) sputtering. Thin film formation by sol-gel method, thin film formation in liquid phase by sol-gel method, modification of the vicinity of the surface by surface oxidation or the like. Of these, glass and silica carriers are preferred from the standpoint of stability of the carrier itself. Also, a carrier in which a silica thin film layer is formed on the surface of the polymer for ease of processing, and a silicon single crystal surface is oxidized from the viewpoint of smoothness. Preferred is a supported carrier.
酸無水物官能基を有するシランカップリング剤としては、下記一般式（Ｉ）で表されるシランカップリング剤である。 The silane coupling agent having an acid anhydride functional group is a silane coupling agent represented by the following general formula (I).
一般式（Ｉ）中、Ｒ１は、３価の直鎖又は分岐の脂肪族基又は芳香族基を表し、酸無水物官能基の安定性の観点から好ましくは、以下のいずれかである。 In general formula (I), R 1 represents a trivalent linear or branched aliphatic group or aromatic group, and is preferably any of the following from the viewpoint of the stability of the acid anhydride functional group.
また、中でも、安定性と反応性のバランスから以下の構造がより好ましい。 Among them, the following structure is more preferable from the balance between stability and reactivity.
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ２０の置換又は非置換の、アルキレン基、アリーレン基、アリールアルキレン基又はアルキルアリーレン基を表し、反応効率と反応後の非特異的吸着抑制の観点から好ましくはＣ１〜Ｃ５の直鎖アルキレン基であり、更に好ましくはプロピレン基である。
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、非特異的吸着抑制の観点から好ましくはＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、更に好ましくはメチル基である。
Ｘは、加水分解してヒドロキシとなる官能基であり、アルコキシ基（−ＯＲ４）、ハロゲン原子又はアシロキシ基（−ＯＯＣＲ５）であって、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表す。Ｘにおいて安定性と反応性のバランスの観点から好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、塩素であり、更に好ましくは、メトキシ基かエトキシ基である。
ｎは１、２、もしくは３を表し、ｍは（３−ｎ）の整数を表し、反応後の非特異的吸着抑制の観点から好ましくはｎは３、ｍは０である。
R 2 represents a C 1 -C 20 substituted or unsubstituted alkylene group, arylene group, arylalkylene group or alkylarylene group, and preferably C 1 from the viewpoint of reaction efficiency and suppression of nonspecific adsorption after the reaction. a linear alkylene group -C 5, more preferably from propylene group.
R 3 represents a C 1 -C 10 alkyl group, preferably a C 1 -C 2 alkyl group, more preferably a methyl group, from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption.
X is a functional group that is hydrolyzed to hydroxy, and is an alkoxy group (—OR 4 ), a halogen atom, or an acyloxy group (—OOCR 5 ), and R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom or C It represents an alkyl group having 1 -C 10. X is preferably a methoxy group, an ethoxy group, an isopropoxy group, a butoxy group, or chlorine from the viewpoint of the balance between stability and reactivity, and more preferably a methoxy group or an ethoxy group.
n represents 1, 2, or 3, m represents an integer of (3-n), and n is preferably 3 and m is 0 from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption after the reaction.
このようなシランカップリング剤としては、例えば、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、４−（トリエトキシシリル）ブチルコハク酸無水物、３−（トリメトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、３−（トリエトキシシリル）プロピルグルタル酸無水物、等を挙げることができ、反応性と反応後の非特異的吸着抑制の観点から、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物、が好ましい。 Examples of such silane coupling agents include 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride, 4- (triethoxysilyl) butyl succinic anhydride, 3- (trimethoxysilyl) propyl succinic anhydride, 3- (triethoxysilyl) propyl glutaric anhydride, etc. can be mentioned, and 3- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride is preferred from the viewpoint of reactivity and suppression of nonspecific adsorption after the reaction. .
シランカップリング剤を固相担体に接触させる際には原液そのまま、もしくは適当な溶液の形態で用いればよく、薄く均一に表面修飾する観点から、０．０１質量％〜１０質量％の溶液、更に好ましくは０．１質量％〜２質量％の溶液が選択される。
溶媒の種類としては、極性溶媒及び非極性溶媒のいずれを用いることができる。極性溶媒としては、エタノール、メタノール、水などを挙げることができる。また、非極性溶媒としては、ヘキサン、オクタン、シクロヘキサンなどの脂肪属系炭化水素系、ベンゼン、キシレン、トルエンなどの芳香族系炭化水素系、ジエチルエーテルなどのエーテル系、クロロホルム、塩化メチレンなどの塩素系、その他、酢酸エチルなどのエステル系等を挙げることができる。これらの溶媒については、固相担体の溶媒耐性等に基づいて極性溶媒及び非極性溶媒の中から適宜選択することができ、例えばヘキサン、エタノールなどを適宜選択することができる。
本発明における溶媒としては、ベーキング処理をしなくても脱水縮合を効果的に進行させるためには、非極性溶媒であることが好ましく、中でもトルエン、キシレンが好ましい。
When the silane coupling agent is brought into contact with the solid phase carrier, the raw solution may be used as it is or in the form of an appropriate solution. From the viewpoint of thin and uniform surface modification, a 0.01% by mass to 10% by mass solution, A solution of 0.1% to 2% by weight is preferably selected.
As a kind of solvent, either a polar solvent or a nonpolar solvent can be used. Examples of the polar solvent include ethanol, methanol, water and the like. Nonpolar solvents include aliphatic hydrocarbons such as hexane, octane and cyclohexane, aromatic hydrocarbons such as benzene, xylene and toluene, ethers such as diethyl ether, and chlorines such as chloroform and methylene chloride. And other ester systems such as ethyl acetate. These solvents can be appropriately selected from polar solvents and nonpolar solvents based on the solvent resistance of the solid phase carrier, for example, hexane, ethanol and the like can be appropriately selected.
As the solvent in the present invention, a nonpolar solvent is preferable in order to effectively proceed dehydration condensation without baking, and among these, toluene and xylene are preferable.
接触工程では、固相担体と上記シランカップリング剤との接触処理が行われる。これにより、加水分解によってシラノール基を有するシランカップリング剤と固相担体のヒドロキシ基の間に水素結合が形成され、それに続き脱水縮合が生じることで、強固な結合が形成されると推測される。なお、完全な脱水縮合が進行する必要はなく、完全に脱水縮合が進行しなかった場合においても、目的に応じてそのまま利用することができる。
また、加水分解処理は、予め固相担体と接触させる前にシランカップリング剤の加水分解を行ってもよく、接触工程中に随時加水分解と結合を同時に進行させてもよいが、接触工程中に随時加水分解と結合を同時に進行させる方法がより好ましい。この同時進行処理は単に加水分解前のシランカップリング剤を溶媒に溶解させ固相担体に接触させることで容易に達成される。
In the contact step, a contact treatment between the solid phase carrier and the silane coupling agent is performed. As a result, a hydrogen bond is formed between the silane coupling agent having a silanol group and the hydroxy group of the solid phase carrier by hydrolysis, and it is speculated that a strong bond is formed by subsequent dehydration condensation. . The complete dehydration condensation does not need to proceed, and even when the dehydration condensation does not proceed completely, it can be used as it is depending on the purpose.
In addition, the hydrolysis treatment may be performed by hydrolyzing the silane coupling agent before contacting with the solid phase carrier in advance, and hydrolysis and binding may proceed simultaneously at any time during the contacting step. More preferred is a method in which hydrolysis and bonding proceed simultaneously as needed. This simultaneous processing is easily achieved by simply dissolving the silane coupling agent before hydrolysis in a solvent and bringing it into contact with a solid support.
更に、シランカップリング剤溶液に加水分解用の水分を添加してもよいが、固相担体に吸着した水分や空気中から侵入する水分で充分である場合が多いため、続く脱水縮合反応の効率上昇のために、水分は添加しない方が好ましく、更には溶媒に溶け込んでいる水分はできるだけ除くことが好ましい。 Furthermore, water for hydrolysis may be added to the silane coupling agent solution. However, since the water adsorbed on the solid support or the water entering from the air is often sufficient, the efficiency of the subsequent dehydration condensation reaction In order to increase, it is preferable not to add water, and it is preferable to remove water dissolved in the solvent as much as possible.
このような接触は、固相担体上にシランカップリング剤をそのまま、もしくは溶媒に溶解した溶液を接触させられれば、特に限定はされない。具体的にはシランカップリング剤溶液中に固相担体を浸漬させて適当な時間経過後に溶液から取り出す、浸漬法が挙げられる。この浸漬法では、接触工程中に脱水縮合反応が進行することができるので、溶液から取り出した後に固相担体に吸着したシランカップリング剤を洗い流しても結合したシランカップリング剤のみを残すことができる。この結果、薄く均一な表面修飾を行うことが可能となる。また、固相担体の形状によらず採用可能であるため、汎用性が高い。
また、他の接触方法としてシランカップリング剤をそのまま、もしくは溶媒に溶解した溶液をコーティングする方法が挙げられる。コーティング方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター(1988)、「コーティング技術」技術情報協会(1999)、「水性コーティングの技術」シーエムシー(2001)、「進化する有機薄膜 成膜編」住べテクノリサーチ(2004)、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版(2005)、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作製可能であることから、本発明において平坦な固相担体上にコーティングする方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。スピンコート法の場合には３００ｒｐｍから１００００ｒｐｍで行えばよい。このうち、薄く均一に表面修飾するためには１０００ｒｐｍ以上であることが好ましい。
Such contact is not particularly limited as long as the silane coupling agent can be brought into contact with the solid phase carrier as it is or in a solution dissolved in a solvent. Specific examples include a dipping method in which a solid support is dipped in a silane coupling agent solution and taken out from the solution after an appropriate time has elapsed. In this immersion method, since the dehydration condensation reaction can proceed during the contact step, only the bonded silane coupling agent remains even if the silane coupling agent adsorbed on the solid support after washing out from the solution is washed away. it can. As a result, thin and uniform surface modification can be performed. Moreover, since it can employ | adopt regardless of the shape of a solid-phase carrier, versatility is high.
Another contact method includes a method of coating a solution obtained by dissolving the silane coupling agent as it is or in a solvent. As a coating method, a known method can be used. Specifically, an extrusion coating method, a curtain coating method, a casting method, a screen printing method, a spin coating method, a spray coating method, a slide bead coating method, A slit-and-spin method, a slit coating method, a die coating method, a dip coating method, a knife coating method, a blade coating method, a flow coating method, a roll coating method, a wire bar coating method, a transfer printing method, and the like can be used. For these thin film formation methods, "Progress in coating technology" by Yuji Harasaki, Comprehensive Technology Center (1988), "Coating Technology" Technical Information Association (1999), "Aqueous Coating Technology" CMC (2001), "Evolution" Described in "Organic Thin Film Deposition", Sumibe Techno Research (2004), "Polymer Surface Processing" by Iwamori Satoshi, Gihodo Publishing (2005), etc. Since a coating film with a controlled film thickness can be easily produced, the method for coating on a flat solid support in the present invention is preferably a spray coating method or a spin coating method, and more preferably a spin coating method. In the case of the spin coating method, it may be performed at 300 rpm to 10,000 rpm. Among these, in order to perform surface modification thinly and uniformly, it is preferable that it is 1000 rpm or more.
コーティングによる接触工程は、コーティング工程中における脱水縮合の進行効率が低いため、コーティング後はすぐに洗浄を行わずに生理活性物質結合処理を行うことが好ましい。また、浸漬法においてもコーティング法においても溶媒として極性溶媒を使用する場合、一般的に脱水縮合の効率が低いため、接触工程後は洗浄を行わずに生理活性物質結合処理を行うことが好ましい。ただし、非極性溶媒を用いて１０分以上の接触処理を行う場合、シランカップリング剤反応の均質化の目的において洗浄を行っても良い。 In the contact step by coating, since the progress efficiency of dehydration condensation in the coating step is low, it is preferable to perform the physiologically active substance binding treatment without immediately washing after coating. Further, when a polar solvent is used as a solvent in both the dipping method and the coating method, since the efficiency of dehydration condensation is generally low, it is preferable to perform the physiologically active substance binding treatment without washing after the contacting step. However, when a contact treatment for 10 minutes or more is performed using a nonpolar solvent, washing may be performed for the purpose of homogenizing the silane coupling agent reaction.
接触処理は、固相担体に対して酸無水物官能基が保持される状態になるまで継続すればよいが、経時的な加水分解による酸無水物の分解やシランカップリング剤の多層化による不均一化を防ぐ観点から３時間未満とすることが好ましく、処理効率の観点から２時間未満とすることがより好ましく、１時間以下が更により好ましい。 The contact treatment may be continued until the acid anhydride functional group is retained with respect to the solid phase carrier. However, the contact treatment is not caused by decomposition of the acid anhydride by hydrolysis over time or multilayering of the silane coupling agent. From the viewpoint of preventing homogenization, the time is preferably less than 3 hours, more preferably from less than 2 hours from the viewpoint of processing efficiency, and even more preferably 1 hour or less.
結合工程では、高温環境下で結合処理が行われると、活性状態である酸無水物官能基が周囲環境中の物質と相互作用してしまうため、目的の化学構造が保たれずに非特異的吸着が上昇してしまう。例えば空気中に含まれる有機物が酸無水物官能基と結合することで、固相担体に有機物が汚れとして吸着してしまう。そのため、接触処理後での固相担体を０℃〜６０℃の温度範囲内に保持しながら、酸無水物官能基に対する生理活性物質の結合処理を行う必要があり、更に０℃〜４０℃に保持する方がより好ましい。この時、生理活性物質を結合させる際にのみ本温度領域を保てばよいのではなく、シランカップリング剤の接触後から結合工程まで一貫して本温度領域に保つ必要がある。つまり、シランカップリング反応において一般的に行われるベーキング処理を行ってはならない。
更に、下記に述べるように無水コハク酸官能基に生理活性物質を直接接触させて結合させる場合、酸無水物官能基を高温化に晒すことで分解してしまい、生理活性物質が充分量固定化されないため、この目的からも本温度領域に保つ必要がある。
In the binding process, when the binding treatment is performed in a high-temperature environment, the active acid anhydride functional group interacts with substances in the surrounding environment, so the target chemical structure is not maintained and non-specific Adsorption increases. For example, the organic substance contained in the air is bonded to the acid anhydride functional group, so that the organic substance is adsorbed on the solid support as dirt. Therefore, it is necessary to perform the binding treatment of the physiologically active substance to the acid anhydride functional group while maintaining the solid phase carrier after the contact treatment within the temperature range of 0 ° C to 60 ° C, and further to 0 ° C to 40 ° C. It is more preferable to hold. At this time, it is not necessary to keep this temperature range only when the physiologically active substance is bonded, but it is necessary to keep the temperature range consistently from the contact of the silane coupling agent to the bonding step. That is, the baking process generally performed in a silane coupling reaction must not be performed.
Furthermore, as described below, when a physiologically active substance is directly contacted and bonded to a succinic anhydride functional group, it is decomposed by exposing the acid anhydride functional group to high temperature, and a sufficient amount of the physiologically active substance is immobilized. Therefore, it is necessary to keep this temperature range for this purpose.
生理活性物質の結合は、酸無水物官能基を一度加水分解してカルボキシル基にしてから、更に活性化を行ったカルボキシル基に対して生理活性物質を接触させて固定化することもできる。ただし、非特異的吸着を抑制する観点から、該固相担体表面の活性化処理等を行うことなく、固相担体表面の酸無水物官能基に対して直接生理活性物質を接触させ固定化することが好ましい。本方法により、活性化前後の操作数、時間が大幅に短縮できるため、外乱要因による化学的な状態の変化（吸着など）を抑制できるために、非特異的吸着を大幅に抑制することができる。 The physiologically active substance can be immobilized by hydrolyzing the acid anhydride functional group once to form a carboxyl group, and then bringing the physiologically active substance into contact with the activated carboxyl group. However, from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption, a physiologically active substance is directly contacted and immobilized on the acid anhydride functional group on the surface of the solid phase carrier without performing an activation treatment on the surface of the solid phase carrier. It is preferable. This method can significantly reduce the number of operations before and after activation, and the time can be greatly reduced, so that changes in chemical state (such as adsorption) due to disturbance factors can be suppressed, and nonspecific adsorption can be greatly suppressed. .
本発明でいう「活性化処理」とは、接触処理後の固相担体表面の酸無水物官能基に由来するカルボキシル基に対して活性化剤を反応させて活性状態にする処理をいう。ここで用いられる活性化剤としては、例えば、カルボジイミド及びこれらの誘導体を挙げることができ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）塩酸塩、Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）が挙げられる。更に反応性や反応安定性を向上させるためにコハク酸イミドなどを併用することもでき、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）及び３,４-ジヒドロ-３-ヒドロキシ-４-オキソ-１,２,３-ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等が該当する。 The “activation treatment” as used in the present invention refers to a treatment in which an activator is reacted with a carboxyl group derived from an acid anhydride functional group on the surface of a solid support after the contact treatment to bring it into an active state. Examples of the activator used here include carbodiimide and derivatives thereof such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), 1-ethyl-3- (3- Dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) hydrochloride, N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC). Further, in order to improve reactivity and reaction stability, succinimide and the like can be used in combination, such as N-hydroxysuccinimide (NHS), N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) and 3,4-dihydro. -3-Hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (Dhbt) and the like are applicable.
生理活性物質としては、特に限定されず、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、脂質、ホルモン、サイトカイン、細胞、微生物などの生体由来物質やその複合体、誘導体やそれらの人為的合成物などが挙げられる。また、ビタミン、薬剤、環境ホルモンなどの主に生体外で合成される低分子有機化合物などでもよい。 The physiologically active substance is not particularly limited, and examples thereof include biologically derived substances such as proteins, peptides, nucleic acids, sugar chains, lipids, hormones, cytokines, cells, microorganisms, complexes, derivatives and artificially synthesized products thereof. Can be mentioned. Moreover, low molecular organic compounds synthesized mainly in vitro such as vitamins, drugs, and environmental hormones may also be used.
タンパク質としては抗体、抗体結合タンパク質、酵素、糖鎖認識タンパク質、レセプターなどが挙げられ、自然界に存在しているものの精製物でもよく、人為的に合成されたものでも良く、更には人為的に変異の導入や複合化、断片化されたものでも良い。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤやこれらの誘導体、複合体、断片を使用することができる。具体的に該固相担体を免疫測定用の担体として利用する場合、測定対象物に対する抗体を使用することができる。また、抗体結合タンパク質として、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬなどを使用することができ、これらを介して測定対象に対する抗体を固定化することもできる。
酵素としては、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
糖鎖認識タンパク質としては、ＣｏｎＡやＷＧＡといったレクチンが挙げられる。レセプターとしては、ＧＰＣＲ（G-proein-coupled receptor）、ＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）などが挙げられる。
ペプチドとしては、自然界に存在しているものでもよく、また人工的に合成されたものでもよい。更に自然界に存在しないアミノ酸が導入されたペプチドでもよい。
Examples of proteins include antibodies, antibody-binding proteins, enzymes, sugar chain recognition proteins, receptors, etc., which may be purified products that exist in nature, may be artificially synthesized, and may be artificially mutated. May be introduced, combined, or fragmented. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD and derivatives, complexes and fragments thereof can be used. Specifically, when the solid phase carrier is used as a carrier for immunoassay, an antibody against the measurement object can be used. Moreover, protein G, protein A, protein L etc. can be used as an antibody binding protein, The antibody with respect to a measuring object can also be fix | immobilized through these.
As the enzyme, various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase, desorption enzyme, and synthetic enzyme can be used. Enzymes such as glucose oxidase, cholesterol oxidase, acetylcholinesterase, catecholamine esterase, noradrenaline esterase, and dopamine esterase can be used.
Examples of sugar chain recognition proteins include lectins such as ConA and WGA. Examples of the receptor include GPCR (G-proein-coupled receptor) and EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor).
Peptides may exist in nature or may be artificially synthesized. Furthermore, a peptide introduced with an amino acid that does not exist in nature may be used.
核酸として任意の配列のDNA、RNA、PNA（ペプチド核酸）やこれらの複合体を利用することができ、自然界からの抽出物でも遺伝子工学的に合成したものでも良く、化学的に合成したものでもよい。糖鎖としては任意の配列のオリゴ糖、多糖や単糖を利用することができ、それらの長さや配列が制御されているものでもよく、厳密には制御されていないものでもよい。また、アミノ基、アセチルアミド基、スルホン酸、カルボキシル基誘導体を利用することもでき、更に糖鎖とタンパク質と結合した糖タンパク質を利用することもできる。脂質としてはグリセリドや複合脂質を利用することができる。ホルモンやサイトカインは天然で実際に生産されているものでもよく、またその合成物や誘導体を利用することができる。細胞、微生物としては自然界からの抽出物でも良く、その継代培養物でも良く、リポソームなどを用いた擬似細胞でもよい。
ビタミン、薬剤、環境ホルモンなどの主に生体外で合成される低分子有機化合物としては生体への効果が未知の物でもよく、既にその薬理的な作用機序が解明されているものでもよい。また自然界からの抽出物でも化学的もしくは生化学的な合成物でもよい。
DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid) of any sequence or complex of these can be used as the nucleic acid, and it can be extracted from nature, genetically engineered, or chemically synthesized Good. As the sugar chain, oligosaccharides, polysaccharides and monosaccharides having an arbitrary sequence can be used, and their length and sequence may be controlled, or those not strictly controlled may be used. In addition, amino group, acetylamide group, sulfonic acid, and carboxyl group derivatives can be used, and glycoproteins in which sugar chains and proteins are combined can also be used. As lipids, glycerides and complex lipids can be used. Hormones and cytokines may be those actually produced in nature, and synthetic products and derivatives thereof can be used. The cells and microorganisms may be natural extracts, subcultures thereof, or pseudocells using liposomes.
The low molecular weight organic compounds synthesized mainly in vitro such as vitamins, drugs and environmental hormones may be those whose effects on the living body are unknown, or those whose pharmacological action mechanisms have already been elucidated. Further, it may be an extract from the natural world or a chemical or biochemical compound.
結合処理では、これらの生理活性物質は、適当な水性溶媒に溶解した水溶液（以下、生理活性物質含有溶液）として用いられる。ここで使用可能な水性溶媒としては、生理活性物質の溶媒として用いられる一般的な溶液をそのまま用いることができ、例えば、水、生理食塩水、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＭＥＳ緩衝液（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid）、等を挙げることができる。ただし、結合処理において酸無水物官能基、もしくはその加水分解・活性化された官能基は一般に求核性官能基との反応性が高いため、Ｔｒｉｓ緩衝液（trihydroxymethylaminomethane）などのアミンを有する緩衝液は好ましくない。 In the binding treatment, these physiologically active substances are used as an aqueous solution (hereinafter referred to as a physiologically active substance-containing solution) dissolved in an appropriate aqueous solvent. As the aqueous solvent that can be used here, a general solution used as a solvent for a physiologically active substance can be used as it is, for example, water, physiological saline, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer. HEPES buffer solution (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), MES buffer solution (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid), and the like. However, acid anhydride functional groups or their hydrolyzed / activated functional groups are generally highly reactive with nucleophilic functional groups in the conjugation process, so buffers with amines such as Tris buffer (trihydroxymethylaminomethane) Is not preferred.
生理活性物質は該固相担体表面の荷電と逆の荷電を有する場合に該固相担体表面に濃縮され、その結合効率が上昇する。酸無水物官能基はその一部が分解するとカルボキシル基を有するため、およそｐＨ３以上の溶液が接触している場合その表面は負に帯電していると考えられる。そのため、溶液のｐＨが生理活性物質の等電点より低くかつ３以上である場合、生理活性物質は溶液中で正に帯電して、該担体表面と逆の電荷を有することになるので、その結合効率が高まる。そのため、溶液のｐＨは３以上かつ生理活性物質の等電点未満とすることは、結合量を高めることができる観点から、好ましい。 When the physiologically active substance has a charge opposite to the charge on the surface of the solid phase carrier, it is concentrated on the surface of the solid phase carrier, and its binding efficiency increases. Since a part of the acid anhydride functional group has a carboxyl group when it is decomposed, the surface is considered to be negatively charged when a solution having a pH of about 3 or more is in contact. Therefore, when the pH of the solution is lower than the isoelectric point of the physiologically active substance and 3 or more, the physiologically active substance is positively charged in the solution and has a charge opposite to that of the carrier surface. Increased coupling efficiency. Therefore, it is preferable that the pH of the solution is 3 or more and less than the isoelectric point of the physiologically active substance from the viewpoint of increasing the binding amount.
結合処理後において、非特異的吸着を抑制する観点から加水分解処理を行うことが好ましい。この加水分解処理によって、未反応の酸無水物官能基がカルボキシル基となるので、効果的に非特異的吸着が抑制される。
加水分解処理は、酸無水物官能基を分解してカルボキシル基を生成する従来公知の方法で行うことができ、一般に、２０℃〜１００℃の水溶液を用いて行われる。加水分解反応を完全の完了させるためにアルカリ性もしくは酸性の水溶液を用いることが好ましく、特にｐＨ１０以上のアルカリ水溶液を用いることがより好ましい。具体的には１ｍＭ〜１ＭのＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液などが挙げられる。この場合、反応性が高いため、１０分以内の処理で充分である。
ただし、結合した生理活性物質の活性を保持する観点からはｐＨ５〜９のマイルドな水溶液が好ましく用いられる。具体的には純水、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液などが挙げられる。更に、簡易に操作する観点からは水蒸気雰囲気中に保持する方法も挙げられる。これらのマイルドな方法の場合は１０分以上処理することが好ましい。これにより、酸無水物官能基から二つのカルボキシル基が生成される。加水分解処理が進行したことの指標としては処理後の固相担体の水などに対する接触角を測定する方法が挙げられる。
After the binding treatment, it is preferable to perform a hydrolysis treatment from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption. By this hydrolysis treatment, since the unreacted acid anhydride functional group becomes a carboxyl group, nonspecific adsorption is effectively suppressed.
The hydrolysis treatment can be performed by a conventionally known method of decomposing an acid anhydride functional group to generate a carboxyl group, and is generally performed using an aqueous solution at 20 ° C to 100 ° C. In order to complete the hydrolysis reaction, it is preferable to use an alkaline or acidic aqueous solution, and it is more preferable to use an alkaline aqueous solution having a pH of 10 or more. Specific examples include 1 mM to 1 M NaOH aqueous solution, KOH aqueous solution, and the like. In this case, since the reactivity is high, a treatment within 10 minutes is sufficient.
However, from the viewpoint of maintaining the activity of the bound physiologically active substance, a mild aqueous solution having a pH of 5 to 9 is preferably used. Specific examples include pure water, borate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, and acetate buffer. Furthermore, the method of hold | maintaining in water vapor | steam atmosphere from a viewpoint of operating easily is also mentioned. In the case of these mild methods, the treatment is preferably performed for 10 minutes or more. Thereby, two carboxyl groups are generated from the acid anhydride functional group. As an indicator of the progress of the hydrolysis treatment, there is a method of measuring the contact angle of the treated solid phase carrier with water or the like.
前記生理活性物質固定化担体は、ｐＨが低い場合など、非特異的吸着の抑制能が不十分である場合には、前記担体に生理活性物質に加えてブロッキング剤を固定化することもできる。即ち、本発明の固定化方法は、シランカップリング剤との接触後の固相担体にブロッキング剤を固定化することを含むものであってもよい。ブロッキング剤とは非特異的吸着の抑制対象である物質に対して吸着抑制能を有する物質のことを指し、抑制対象の種類等に基づいて、適切な物質をブロッキング剤として選択することができる。 When the physiologically active substance-immobilized carrier has insufficient ability to suppress nonspecific adsorption, such as when the pH is low, a blocking agent can be immobilized on the carrier in addition to the physiologically active substance. That is, the immobilization method of the present invention may include immobilizing the blocking agent on the solid phase carrier after contact with the silane coupling agent. A blocking agent refers to a substance that has an ability to suppress adsorption with respect to a substance that is a target for suppression of nonspecific adsorption, and an appropriate substance can be selected as a blocking agent based on the type of the target to be suppressed.
ブロッキング剤としては水溶性タンパク質または水溶性高分子などが挙げられ、水溶性タンパク質としては、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等を好ましく挙げることができ、非特異的吸着抑制能の観点からはアルブミンまたはカゼインであることがより好ましい。水溶性高分子としては、ポリエチレングリコール、ホスホリルコリン基含有高分子、多糖、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、双性イオン含有ポリマー、ポリビニルピロリドン等を好ましく挙げることができ、非特異的吸着抑制能の観点からは、ポリエチレングリコール、ホスホリルコリン基含有高分子、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸であることが好ましい。
またこれらの水溶性高分子を用いる場合、前記担体に対する固定化能を向上させるために、担体と結合もしくは吸着する部位を水溶性高分子中に有していてもよい。担体と結合する部位としては酸無水物と結合する構造であれば特に限定はされず、具体的には一級アミンなどのアミンを有する官能基が挙げられる。また、担体に吸着する部位としては、静電相互作用によって担体と吸着する構造が挙げられ、固定化のｐＨにおいて正電荷を有する構造、より具体的にはポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリリジンやその誘導体などが挙げられる。このような構造を有する水溶性高分子としては、株式会社ナオビオテック製のＮａｎｏＢｉｏ Ｂｌｏｃｋｅｒも好ましく利用することができる。
Examples of the blocking agent include water-soluble proteins or water-soluble polymers. Preferred examples of water-soluble proteins include albumin, casein, and gelatin. From the viewpoint of nonspecific adsorption inhibition ability, albumin or casein is preferable. More preferably. Preferred examples of the water-soluble polymer include polyethylene glycol, phosphorylcholine group-containing polymer, polysaccharide, polyvinyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate, polyacrylic acid, polyacrylamide, zwitterion-containing polymer, and polyvinylpyrrolidone. From the viewpoint of specific adsorption inhibiting ability, polyethylene glycol, phosphorylcholine group-containing polymer, dextran, carboxymethyldextran, and dextran sulfate are preferable.
When these water-soluble polymers are used, the water-soluble polymer may have a site that binds or adsorbs to the carrier in order to improve the immobilization ability to the carrier. The site that binds to the carrier is not particularly limited as long as it is a structure that binds to an acid anhydride, and specific examples include a functional group having an amine such as a primary amine. Examples of the site that adsorbs to the carrier include a structure that adsorbs to the carrier by electrostatic interaction. More specifically, a structure having a positive charge at the fixing pH, more specifically polyallylamine, polyethyleneimine, polyvinylamine, polylysine. And derivatives thereof. As a water-soluble polymer having such a structure, NanoBio Blocker manufactured by Naobiotech Co., Ltd. can be preferably used.
前記担体においてブロッキング剤を固定化する部分としては、予め生理活性物質を固定化した同一部分、つまり生理活性物質の固定化処理を行ったが固定化されなかった隙間であってもよく、また担体において生理活性物質の固定化処理を行わなかった部分でもよく、またその両方でもよい。更に、ブロッキング剤の固定化処理を行うタイミングとしては特に限定はされないが、生理活性物質を固定化した直後、加水分解処理後、生理活性物質の固定化と同時などが挙げられる。また、生理活性物質の固定化後にブロッキング剤固定化処理を行うことで加水分解処理も同時に行うことも可能である。 The part for immobilizing the blocking agent in the carrier may be the same part where the physiologically active substance is immobilized in advance, that is, the gap where the physiologically active substance is immobilized but not immobilized. The portion where the physiologically active substance is not immobilized may be used, or both of them may be used. Furthermore, the timing for immobilizing the blocking agent is not particularly limited, and examples include immediately after immobilizing the physiologically active substance, after hydrolysis, and simultaneously with immobilization of the physiologically active substance. Further, the hydrolysis treatment can be performed simultaneously by performing the blocking agent immobilization treatment after immobilization of the physiologically active substance.
上記のようにして得られた生理活性物質固定化担体は、表面に生理活性物質を充分量固定化したものである。担体表面に固定化された生理活性物質の量は、この目的のために通常用いられる方法によって確認することができ、例えば、蛍光物質を用いた蛍光測定方法や、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）、ＬＰＲ（局所プラズモン共鳴）、ＱＣＭ（水晶振動子マイクロバランス）等を挙げることできる。 The physiologically active substance-immobilized carrier obtained as described above is obtained by immobilizing a sufficient amount of physiologically active substance on the surface. The amount of the physiologically active substance immobilized on the surface of the carrier can be confirmed by a method usually used for this purpose. For example, a fluorescence measurement method using a fluorescent substance, SPR (surface plasmon resonance), LPR (Local plasmon resonance), QCM (quartz crystal microbalance) and the like.
本発明の生理活性物質固定化担体は、上記固定化方法によって得られ、表面に高密度に生理活性物質が固定化されたものである。
この生理活性物質固定化担体は、高密度に生理活性物質が固定化されると共に、非特異的吸着が著しく低いので、担体上の生理活性物質に特異的な分子の検出や分析に有用であり、特に、微量な分析や、微細な相互作用の検出など、生理活性物質に対する高い特異性が要求される各種のマイクロアレイや、バイオセンサー等に適している。
The physiologically active substance-immobilized carrier of the present invention is obtained by the above-described immobilization method, and the physiologically active substance is immobilized on the surface at a high density.
This bioactive substance-immobilized carrier is useful for detection and analysis of molecules specific to the bioactive substance on the carrier because the bioactive substance is immobilized at high density and nonspecific adsorption is extremely low. In particular, it is suitable for various microarrays, biosensors, and the like that require high specificity for physiologically active substances, such as trace analysis and detection of fine interactions.
本発明の固定用担体は、上記固相担体と、上記一般式（Ｉ）で表され、酸無水物官能基を有するシランカップリング剤とを接触させて得られ、表面に高密度に酸無水物官能基を有するものである。この固定用担体の表面の酸無水物官能基に所望の生理活性物質を固定化した場合には、高密度に生理活性物質を表面に有することができると共に、非特異的吸着の著しく低い固定化担体を提供することができる。このため、生理活性物質に対して高い特異性が要求される用途の固定化担体を作製するための材料として有用である。 The immobilization carrier of the present invention is obtained by bringing the solid phase carrier into contact with a silane coupling agent represented by the general formula (I) and having an acid anhydride functional group. It has a physical functional group. When a desired physiologically active substance is immobilized on the acid anhydride functional group on the surface of this immobilizing carrier, it is possible to have the physiologically active substance on the surface at a high density and immobilization with extremely low non-specific adsorption. A carrier can be provided. For this reason, it is useful as a material for producing an immobilization carrier for uses requiring high specificity for a physiologically active substance.
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
（１）無水コハク酸化ガラス基板の作製
シランカップリング剤として３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（Ｇｅｌｅｓｔ製）を２ｍｏｌ／ｌで含む脱水キシレン溶液に、洗浄されたガラス基板（松浪硝子工業製白板ガラス）を浸漬させ、室温で１時間反応させた。反応させたガラス基板をキシレン溶液から取り出し脱水キシレンで３回浸漬洗浄を行った後に窒素ガスで乾燥させた。本ガラス基板を無水コハク酸化ガラスと呼ぶ。
[Example 1]
(1) Preparation of Succinic Anhydride Glass Substrate Substrate Washed glass substrate (Matsunami Glass in a dehydrated xylene solution containing 2- (triethoxysilyl) propyl succinic anhydride (manufactured by Gelest) at 2 mol / l as a silane coupling agent Industrial white plate glass) was immersed and allowed to react at room temperature for 1 hour. The reacted glass substrate was taken out from the xylene solution, immersed and washed with dehydrated xylene three times, and then dried with nitrogen gas. This glass substrate is called anhydrous succinic oxide glass.
（２）抗体の固定化と固定化量測定
無水コハク酸化ガラス上に１０ｍＭ、ｐＨ５.０の酢酸バッファーで０.１ｍｇ／ｍｌに調製したＦＩＴＣ標識抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製、以後ＩｇＧ−ＦＩＴＣと呼ぶ）を滴下し、室温、高湿かつ暗環境中で１時間反応させた。抗体溶液を吸引除去し、０.１Ｍ ＮａＯＨ、リン酸バッファー（ＰＢＳ）、純水の順で浸漬洗浄させた後、安定的に固定化されていることを確認するために抗体固定化ガラス基板をｐＨ７.１のＰＢＳ中に３日間保存した。抗体固定化ガラス基板蛍光強度をＦＬＡ−８０００（富士フイルム製）によって測定し（４７３ｎｍ励起／５３０ｎｍ検出）、予め作成しておいた検量線を用いて固定化抗体量を見積もった。
(2) Immobilization of antibody and measurement of immobilized amount FITC-labeled antibody (manufactured by SIGMA-ALDRICH, hereinafter referred to as IgG-FITC) prepared on anhydrous succinic oxide glass to 10 mg, 0.1 mg / ml with acetic acid buffer pH 5.0 ) Was added dropwise and allowed to react for 1 hour at room temperature in a high humidity and dark environment. After removing the antibody solution by suction and immersing and washing in order of 0.1M NaOH, phosphate buffer (PBS), and pure water, the antibody-immobilized glass substrate is removed to confirm that it is stably immobilized. Stored in PBS pH 7.1 for 3 days. The fluorescence intensity of the antibody-immobilized glass substrate was measured by FLA-8000 (manufactured by Fujifilm) (excitation at 473 nm / detection at 530 nm), and the amount of immobilized antibody was estimated using a calibration curve prepared in advance.
（３）抗体の非特異的吸着量測定
無水コハク酸化ガラスを作製し、該ガラス基板を１０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８.５）中に室温で１時間浸漬させて反応させた（以後、酸無水物の加水分解処理と呼ぶ）。加水分解が充分に進行していることの確認として水に対する静止接触角を測定した所、ホウ酸バッファー処理前は３６.７±１.１゜であったのに対して処理後は７.４±１.１°となり加水分解によるカルボキシル基の生成が示唆された。反応後、純水で掛け流し洗いを行った基板に、ＰＢＳで１００ｎＭ（１５μｇ／ｍｌ）に調製した抗体（ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）を滴下し、室温、高湿かつ暗環境中で１時間静置した。抗体溶液を吸引して除去しＰＢＳ、純水の順で浸漬洗浄を行った。自然乾燥させ、基板に非特異的に吸着している抗体量を上記の方法と同様にＦＬＡ−８０００を用いて測定した。
(3) Measurement of non-specific adsorption amount of antibody Anhydrous succinic oxide glass was produced, and the glass substrate was immersed in a 10 mM borate buffer (pH 8.5) for 1 hour at room temperature and reacted (hereinafter referred to as acid anhydride). This is called a hydrolysis treatment. When the static contact angle with water was measured to confirm that the hydrolysis was sufficiently advanced, it was 36.7 ± 1.1 ° before the boric acid buffer treatment, whereas it was 7.4 after the treatment. It was ± 1.1 °, suggesting the formation of carboxyl groups by hydrolysis. After the reaction, an antibody (IgG-FITC) prepared to 100 nM (15 μg / ml) with PBS was dropped onto a substrate washed with pure water and allowed to stand at room temperature in a high humidity and dark environment for 1 hour. . The antibody solution was removed by suction, and immersed and washed in the order of PBS and pure water. The amount of antibody that was naturally dried and nonspecifically adsorbed on the substrate was measured using FLA-8000 in the same manner as described above.
［実施例２］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、それに対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。ただし、シランカップリング剤との反応後キシレンによる洗浄を行わず窒素ガスで乾燥のみを行った。
[Example 2]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and the amount of antibody immobilized thereon and the amount of non-specific adsorption were measured. However, after the reaction with the silane coupling agent, only drying with nitrogen gas was performed without washing with xylene.
［実施例３］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、それに対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。ただし、シランカップリング剤をエタノール溶液とし、洗浄液をエタノールとして作製したものを用いた。
[Example 3]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and the amount of antibody immobilized thereon and the amount of non-specific adsorption were measured. However, a silane coupling agent prepared as an ethanol solution and a cleaning solution as ethanol was used.
［実施例４］
実施例２と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、それに対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。ただし、シランカップリング剤をエタノール溶液として調製したものを用いた。
[Example 4]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 2, and the amount of antibody immobilized thereon and the amount of nonspecific adsorption were measured. However, a silane coupling agent prepared as an ethanol solution was used.
［実施例５］
実施例１と同様にして無水コハク酸化ガラスを作製し、該ガラス基板を１０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８.５）中に室温で１時間浸漬させて加水分解を行った。
本ガラス基板に対してＤＣＣ・ＮＨＳ混合ＤＭＦ溶液（各０.１Ｍ）を室温で１時間接触させて活性化し（以後、活性化処理と呼ぶ）、続いてエタノールで２回浸漬洗浄し窒素ガスで乾燥させた。本活性化ガラス基板に対して実施例１と同様の手法で抗体の固定化量を測定した。
更に同様に活性化処理を行った無水コハク酸化ガラスを１０ｍＭ ＨＣｌ中に１時間室温で浸漬させて活性化エステルを完全に加水分解した（以後、本操作を活性エステルの加水分解処理と呼ぶ。）。本基板を用いて実施例１と同様に抗体の非特異的吸着量を測定した。
[Example 5]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and the glass substrate was immersed in 10 mM borate buffer (pH 8.5) for 1 hour at room temperature for hydrolysis.
DCC / NHS mixed DMF solution (0.1 M each) is brought into contact with this glass substrate for 1 hour at room temperature to activate (hereinafter referred to as activation treatment), and then immersed and washed twice with ethanol and then nitrogen gas. Dried. The amount of antibody immobilized on the activated glass substrate was measured in the same manner as in Example 1.
Further, the activated succinic oxide glass subjected to the activation treatment in the same manner was immersed in 10 mM HCl at room temperature for 1 hour to completely hydrolyze the activated ester (this operation is hereinafter referred to as active ester hydrolysis treatment). . Using this substrate, the nonspecific adsorption amount of the antibody was measured in the same manner as in Example 1.
［実施例６］
実施例５と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、加水分解処理、活性化処理を行い、それに対する抗体の固定化量と加水分解処理後の非特異的吸着量を測定した。ただし、シランカップリング剤をエタノール溶液とし、洗浄液をエタノールとして作製したものを用いた。
[Example 6]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 5, subjected to hydrolysis treatment and activation treatment, and the amount of antibody immobilized thereon and the amount of nonspecific adsorption after the hydrolysis treatment were measured. However, a silane coupling agent prepared as an ethanol solution and a cleaning solution as ethanol was used.
［実施例７］
実施例５と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、加水分解処理、活性化処理を行い、それに対する抗体の固定化量と加水分解処理後の非特異的吸着量を測定した。ただし、ＤＣＣ・ＮＨＳ混合溶液の代わりにＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ製 ０.４Ｍ）とＤｈｂｔ（東京化成工業製 ２.８ｍＭ）混合水溶液を用いた。
[Example 7]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 5, subjected to hydrolysis treatment and activation treatment, and the amount of antibody immobilized thereon and the amount of nonspecific adsorption after the hydrolysis treatment were measured. However, instead of the DCC / NHS mixed solution, an EDC (PIERCE 0.4M) and Dhbt (Tokyo Chemical Industry 2.8 mM) mixed aqueous solution was used.
［実施例８］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、それに対する抗体の固定化量を測定した。ただし、シランカップリング剤をヘキサン溶液とし、洗浄液をヘキサンとして作製したものを用いた。
[Example 8]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and the amount of antibody immobilized thereon was measured. However, a silane coupling agent was used as a hexane solution and a cleaning liquid was used as hexane.
［比較例１］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製した後、１２０℃のオーブンで１時間ベーキング処理を行った。室温に戻した後、実施例１と同様に基板に対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。
[Comparative Example 1]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and then baked in an oven at 120 ° C. for 1 hour. After returning to room temperature, the amount of antibody immobilized on the substrate and the amount of non-specific adsorption were measured in the same manner as in Example 1.
［比較例２］
実施例２と同様に無水コハク酸化ガラスを作製した後、１２０℃のオーブンで１時間ベーキング処理を行った。室温に戻した後、実施例１と同様に基板に対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。
[Comparative Example 2]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 2 and then baked in an oven at 120 ° C. for 1 hour. After returning to room temperature, the amount of antibody immobilized on the substrate and the amount of non-specific adsorption were measured in the same manner as in Example 1.
［比較例３］
実施例３と同様に無水コハク酸化ガラスを作製した後、１２０℃のオーブンで１時間ベーキング処理を行った。室温に戻した後、実施例１と同様に基板に対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。
[Comparative Example 3]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 3 and then baked in an oven at 120 ° C. for 1 hour. After returning to room temperature, the amount of antibody immobilized on the substrate and the amount of non-specific adsorption were measured in the same manner as in Example 1.
［比較例４］
実施例４と同様に無水コハク酸化ガラスを作製した後、１２０℃のオーブンで１時間ベーキング処理を行った。室温に戻した後、実施例１と同様に基板に対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。
[Comparative Example 4]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 4 and then baked in an oven at 120 ° C. for 1 hour. After returning to room temperature, the amount of antibody immobilized on the substrate and the amount of non-specific adsorption were measured in the same manner as in Example 1.
［比較例５］
実施例５と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、加水分解処理、活性化処理を行い、それに対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。ただし、シランカップリング剤反応後、加水分解処理の前に１２０℃のオーブンで１時間ベーキング処理を行った。
[Comparative Example 5]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 5, subjected to hydrolysis treatment and activation treatment, and the amount of antibody immobilized and the amount of nonspecific adsorption thereto were measured. However, after the silane coupling agent reaction, baking treatment was performed in an oven at 120 ° C. for 1 hour before the hydrolysis treatment.
［比較例６］
実施例６と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、加水分解処理、活性化処理を行い、それに対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。ただし、シランカップリング剤反応後、加水分解処理の前に１２０℃のオーブンで１時間ベーキング処理を行った。
[Comparative Example 6]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 6, hydrolyzed and activated, and the amount of antibody immobilized and nonspecifically adsorbed thereto were measured. However, after the silane coupling agent reaction, baking treatment was performed in an oven at 120 ° C. for 1 hour before the hydrolysis treatment.
［比較例７］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製した後、７０℃のオーブンで１時間ベーキング処理を行った。室温に戻した基板に対する抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。
[Comparative Example 7]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and then baked in an oven at 70 ° C. for 1 hour. The amount of antibody immobilized on the substrate returned to room temperature and the amount of non-specific adsorption were measured.
［比較例８］
アルデヒド化ガラス基板（Ｇｅｎｅｔｉｘ製）にＰＢＳで０.１ｍｇ／ｍｌに調製したＦＩＴＣ標識抗体を滴下し、高湿環境中で１時間反応させた。抗体溶液を吸引除去し、０.１Ｍ ＮａＯＨ、リン酸バッファー（ＰＢＳ）、純水の順で浸漬洗浄させた後、ＰＢＳ中に３日間保存した。抗体の固定化量と非特異的吸着量を、ＦＬＡ−８０００を用いて見積もった。
別のアルデヒド化ガラス基板をＢＳＡ（牛血清アルブミン：ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）２％ＰＢＳ溶液に浸漬させて１時間反応させブロッキング処理を行った。ＰＢＳで浸漬洗浄を行った後、自然乾燥させた。本基板を用いて実施例１と同様に基板に対する抗体の非特異的吸着量を測定した。
[Comparative Example 8]
FITC-labeled antibody prepared to 0.1 mg / ml with PBS was dropped onto an aldehyded glass substrate (Genetics), and reacted in a high humidity environment for 1 hour. The antibody solution was removed by suction, immersed and washed in the order of 0.1 M NaOH, phosphate buffer (PBS), and pure water, and then stored in PBS for 3 days. The amount of antibody immobilized and the amount of non-specific adsorption were estimated using FLA-8000.
Another aldehyded glass substrate was immersed in BSA (bovine serum albumin: manufactured by SIGMA-ALDRICH) 2% PBS solution and reacted for 1 hour for blocking treatment. After soaking and washing with PBS, it was naturally dried. Using this substrate, the nonspecific adsorption amount of the antibody to the substrate was measured in the same manner as in Example 1.
［試験例１］
上記の実施例１〜８と比較例１〜８について、抗体の固定化量、非特異的吸着量、抗体固定化量／非特異的吸着量について比較を行った。結果を表１に示す。なお、実施例３、実施例４、実施例６及び実施例８は、本発明の参考例である。
表１に示されるように本発明の実施例では、固定量が高く且つ固定化量／非特異的吸着量が高い（１００を超える）担体を得ることができる。
更に活性化処理を行わずに抗体を直接結合させることによって、より高い固定化量及び固定化量／非特異的吸着量比を実現できることがわかった（実施例１〜４）。
また固定化溶媒としては、非極性溶媒を用いる方が、より有効であることがわかった（実施例１、２、８）。
シランカップリング反応後の洗浄に関しては、洗浄を行わない方がより高い抗体固定化量となることがわかった（実施例２及び４）。
[Test Example 1]
About said Example 1-8 and Comparative Examples 1-8, the antibody immobilization amount, the nonspecific adsorption amount, and the antibody immobilization amount / nonspecific adsorption amount were compared. The results are shown in Table 1. In addition, Example 3, Example 4, Example 6, and Example 8 are reference examples of the present invention.
As shown in Table 1, in the examples of the present invention, a carrier having a high immobilization amount and a high immobilization amount / nonspecific adsorption amount (over 100) can be obtained.
Further, it was found that a higher immobilization amount and an immobilization amount / non-specific adsorption amount ratio can be realized by directly binding an antibody without performing an activation treatment (Examples 1 to 4).
Moreover, it turned out that it is more effective to use a nonpolar solvent as an immobilization solvent (Example 1, 2, 8).
Regarding the washing after the silane coupling reaction, it was found that the antibody immobilization amount was higher without washing (Examples 2 and 4).
［実施例９］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラス基板を作製した。ただし、キシレン溶液中に浸漬させるのではなく、キシレン溶液を滴下後、スピンコーターを用いて１０００ｒｐｍ、３５秒の条件で塗布を行ってから室温（２５℃）で乾燥させた。更に実施例１と同様に抗体の固定化量と非特異的吸着量を測定した。
[Example 9]
An anhydrous succinic oxide glass substrate was produced in the same manner as in Example 1. However, it was not immersed in a xylene solution, but after dropping the xylene solution, it was applied at 1000 rpm for 35 seconds using a spin coater and then dried at room temperature (25 ° C.). Further, in the same manner as in Example 1, the amount of immobilized antibody and the amount of nonspecific adsorption were measured.
［実施例１０］
実施例９と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、それに対する抗体の固定化量を測定した。ただし、シランカップリング剤をエタノール溶液として調製したものを用いた。
[Example 10]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 9, and the amount of antibody immobilized thereon was measured. However, a silane coupling agent prepared as an ethanol solution was used.
［試験例２］
実施例２、実施例４，実施例９、実施例１０の各基板について、抗体の固定化量の比較を行った。結果を表２に示す。なお、実施例４及び実施例１０は、本発明の参考例である。
表２に示されるように、本発明の実施例では、カップリング剤と担体との接触方法が浸漬方法であってもスピンコートであっても固定化量には大きく影響することなく、同様に高い固定化量の基板を提供できることがわかった。
[Test Example 2]
For each of the substrates of Example 2, Example 4, Example 9, and Example 10, the amount of antibody immobilized was compared. The results are shown in Table 2. Examples 4 and 10 are reference examples of the present invention.
As shown in Table 2, in the examples of the present invention, the immobilization amount is not affected greatly regardless of whether the contact method between the coupling agent and the carrier is an immersion method or spin coating. It was found that a high immobilization amount of substrate can be provided.
［実施例１１］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、それに対する抗体の固定化量を測定した。ただし、ＩｇＧ−ＦＩＴＣ固定化用のバッファーとしてｐＨ６.５の酢酸バッファーを用いた。本実施例で使用した抗体の等電点はおよそ６.５程度であった。
[Example 11]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and the amount of antibody immobilized thereon was measured. However, a pH 6.5 acetate buffer was used as a buffer for immobilizing IgG-FITC. The isoelectric point of the antibody used in this example was about 6.5.
［試験例３］
実施例１及び実施例１１について、抗体の固定化量、非特異的吸着量、抗体固定化量／非特異的吸着量比の比較を行った。結果を表３に示す。
表３に示されるように、本発明の実施例では、固定化バッファのｐＨに拘わらず非特定的吸着量が低く、固定化量との比として良好であるが、固定化バッファのｐＨを生理活性物質の等電点未満にすることで、より良好な固定化量と固定化量／非特異的吸着量比のバランスを達成できることが示された。
[Test Example 3]
For Example 1 and Example 11, the antibody immobilization amount, the nonspecific adsorption amount, and the antibody immobilization amount / nonspecific adsorption amount ratio were compared. The results are shown in Table 3.
As shown in Table 3, in the examples of the present invention, the non-specific adsorption amount is low regardless of the pH of the immobilization buffer, and the ratio to the immobilization amount is good. It was shown that a better balance between the immobilization amount and the immobilization amount / non-specific adsorption amount ratio can be achieved by setting it below the isoelectric point of the active substance.
［実施例１２］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、それに対する抗体の固定化量を測定した。ただし、ＰＢＳ中浸漬時間を３日間ではなく、１４日間行った。
[Example 12]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and the amount of antibody immobilized thereon was measured. However, the immersion time in PBS was 14 days instead of 3 days.
［試験例４］
実施例１及び実施例１２について、抗体の固定化量の比較を行った。結果を表４に示す。
表４に示されるように、本発明の実施例では、抗体結合化ガラス基板のＰＢＳへの浸漬を１４日間に延長させても高い固定量が維持されており、固定化能が安定して高いことが示された。
従って、シランカップリング剤反応直後に高温下における脱水処理、いわゆるベーキング処理を行わなくても本発明の方法では修飾表面が安定し、良好な固定化能を有することが示された。
[Test Example 4]
About Example 1 and Example 12, the amount of antibody immobilization was compared. The results are shown in Table 4.
As shown in Table 4, in the examples of the present invention, even when the immersion of the antibody-conjugated glass substrate in PBS was extended to 14 days, a high fixing amount was maintained, and the fixing ability was stably high. It was shown that.
Therefore, it was shown that the modified surface is stable and has a good immobilization ability in the method of the present invention without performing a dehydration treatment at a high temperature immediately after the silane coupling agent reaction, that is, a so-called baking treatment.
［実施例１３］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスに対する抗体の非特異的吸着量を測定した。ただし、酸無水物の加水分解処理のための反応液として２０ｍＭ、ｐＨ６.３のクエン酸バッファーを用いた。
[Example 13]
In the same manner as in Example 1, the nonspecific adsorption amount of the antibody against anhydrous succinylated glass was measured. However, a citrate buffer of 20 mM and pH 6.3 was used as a reaction solution for hydrolysis treatment of acid anhydride.
［実施例１４］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスに対する抗体の非特異的吸着量を測定した。ただし、酸無水物の加水分解処理のための反応液として０.１ＭのＮａＯＨ溶液を用い、反応時間を３０秒間とした。
[Example 14]
In the same manner as in Example 1, the nonspecific adsorption amount of the antibody against anhydrous succinylated glass was measured. However, a 0.1M NaOH solution was used as a reaction solution for the acid anhydride hydrolysis treatment, and the reaction time was 30 seconds.
［実施例１５］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスに対する抗体の非特異的吸着量を測定した。ただし、ホウ酸バッファーを用いた酸無水物の加水分解処理を行わず、室温で１時間静置した後に抗体の非特異的吸着量を測定した。
[Example 15]
In the same manner as in Example 1, the nonspecific adsorption amount of the antibody against anhydrous succinylated glass was measured. However, the non-specific adsorption amount of the antibody was measured after standing for 1 hour at room temperature without hydrolyzing the acid anhydride using a borate buffer.
［試験例５］
実施例１及び実施例１３〜実施例１５について、非特異的吸着量の比較を行った。結果を表５に示す。
表５に示されるように、本発明の実施例では、加水分解処理の種類及び有無に拘わらず非特異的吸着量が少ない担体を得ることができ、特に、加水分解処理を行うことによって非特異的吸着がより少ない担体を得ることができる。
[Test Example 5]
About Example 1 and Examples 13-15, the nonspecific adsorption amount was compared. The results are shown in Table 5.
As shown in Table 5, in the examples of the present invention, a carrier having a small amount of non-specific adsorption can be obtained regardless of the type and presence of hydrolysis treatment. A carrier with less target adsorption can be obtained.
［実施例１６］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスに対する抗体の非特異的吸着量を測定した。ただし、シランカップリング剤の反応時間を１時間ではなく１８時間とした。この時反応後の無水コハク酸化ガラスをホウ酸バッファーもしくは０.１Ｍ ＮａＯＨで酸無水物の加水分解処理を行った後の水の静止接触角はそれぞれ４５.１°、２２.９°であった。このことは、実施例１と比較して、表面修飾がやや劣ることが示唆された。
[Example 16]
In the same manner as in Example 1, the nonspecific adsorption amount of the antibody against anhydrous succinylated glass was measured. However, the reaction time of the silane coupling agent was 18 hours instead of 1 hour. At this time, the static contact angles of water after hydrolyzing the acid anhydride with borate buffer or 0.1 M NaOH were 45.1 ° and 22.9 °, respectively, after the reaction. . This suggested that the surface modification was slightly inferior to that of Example 1.
［試験例６］
実施例１及び実施例１６について、抗体の非特異的吸着量の比較を行った。結果を表６に示す。
表６に示されるように、本発明の実施例では、固定化の時間にかかわらず非特異的吸着が少ない担体を得ることができ、特に、シランカップリング剤と前記固相担体との接触を３時間未満とすることによって、非特異的吸着量をより効果的に低減できることがわかった。
[Test Example 6]
About Example 1 and Example 16, the nonspecific adsorption amount of the antibody was compared. The results are shown in Table 6.
As shown in Table 6, in the examples of the present invention, it is possible to obtain a carrier with less nonspecific adsorption regardless of the immobilization time, and in particular, contact between the silane coupling agent and the solid phase carrier. It was found that the non-specific adsorption amount can be more effectively reduced by setting it to less than 3 hours.
［実施例１７］
実施例１と同様に無水コハク酸化ガラスを作製し、抗体を固定化した。ただし、抗体は抗ＣＲＰモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製）を用いた。Ｃｙ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）で標識を行ったＣＲＰ抗原（オリエンタル酵母製）をＰＢＳで１ｎＭ、１００ｎＭにそれぞれ調製し、抗体を固定化した基板全面に塗布した。室温、多湿、暗環境中で１時間静置して抗原抗体反応を行った。ＰＢＳ、純水の順で浸漬洗浄を行った。抗体固定化部への抗原結合量と抗体非固定化部への非特異的吸着量を、ＦＬＡ−８０００を用いて測定し、（励起６３５ｎｍ／検出６７５ｎｍ）その比（特異的結合量／非特異的吸着量：Ｓ／Ｎ比）を求めた。結果を表７及び図１に示す。
[Example 17]
Anhydrous succinic oxide glass was prepared in the same manner as in Example 1, and the antibody was immobilized. However, an anti-CRP monoclonal antibody (manufactured by Fitzgerald) was used as the antibody. CRP antigen (Oriental Yeast) labeled with Cy5 (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was prepared with PBS to 1 nM and 100 nM, respectively, and applied to the entire substrate on which the antibody was immobilized. The antigen-antibody reaction was performed by allowing to stand for 1 hour in a room temperature, high humidity and dark environment. Immersion washing was performed in the order of PBS and pure water. The amount of antigen binding to the antibody-immobilized part and the amount of non-specific adsorption to the non-immobilized antibody part were measured using FLA-8000 (excitation 635 nm / detection 675 nm) and the ratio (specific binding amount / non-specific) (Adsorption amount: S / N ratio) was determined. The results are shown in Table 7 and FIG.
［比較例９］
比較例８と同様にアルデヒド化ガラスに対して抗ＣＲＰ抗体を固定化し、更に抗体固定化部を含めた基板全面に実施例８と同様にブロッキング処理を行った。更に、実施例２１と同様にＣｙ５化ＣＲＰの結合量と非特異的吸着量を測定し、Ｓ／Ｎ比を求めた。結果を表７及び図２に示す。
[Comparative Example 9]
In the same manner as in Comparative Example 8, the anti-CRP antibody was immobilized on the aldehyded glass, and the entire substrate including the antibody-immobilized portion was subjected to blocking treatment in the same manner as in Example 8. Furthermore, the amount of Cy5-conjugated CRP bound and the amount of nonspecific adsorption were measured in the same manner as in Example 21 to determine the S / N ratio. The results are shown in Table 7 and FIG.
［実施例１８］
実施例１７と同様に抗ＣＲＰ抗体を固定化させた。洗浄後、基板に固定化した抗体とは異なり、かつサンドイッチを形成することのできるＣＲＰ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製 以後２次抗体と呼ぶ）をＦＩＴＣで標識したものを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１００ｎＭ（１５μｇ／ｍｌ）に調製し、各種濃度のＣＲＰ抗原（標識なし）溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳの溶液）と混合した。１時間静置しておいた混合溶液を抗体固定化基板全面に塗布した。室温、多湿、暗環境中で１時間静置して抗原抗体反応を行った。ＰＢＳ、純水の順で浸漬洗浄を行った。抗体固定化部への２次抗体結合量をＦＬＡ−８０００を用いて測定し（励起４７３ｎｍ・検出５３０ｎｍ）、各種抗原濃度条件における量と抗原を含まない条件における量の比（特異的結合量／非特異的吸着量、Ｓ／Ｎ比）を求めた。結果を表７に示す。
[Example 18]
An anti-CRP antibody was immobilized in the same manner as in Example 17. After washing, a CRP antibody (manufactured by Fitzgerald, hereinafter referred to as a secondary antibody), which is different from the antibody immobilized on the substrate and capable of forming a sandwich, is labeled with FITC at 100 nM in PBS containing 1% BSA ( 15 μg / ml) and mixed with various concentrations of CRP antigen (unlabeled) solution (PBS solution containing 1% BSA). The mixed solution that had been allowed to stand for 1 hour was applied to the entire surface of the antibody-immobilized substrate. The antigen-antibody reaction was performed by allowing to stand for 1 hour in a room temperature, high humidity and dark environment. Immersion washing was performed in the order of PBS and pure water. The amount of secondary antibody bound to the antibody immobilization part was measured using FLA-8000 (excitation 473 nm / detection 530 nm), and the ratio of the amount in various antigen concentration conditions to the amount in the condition not containing antigen (specific binding amount / Nonspecific adsorption amount, S / N ratio) was determined. The results are shown in Table 7.
表７に示されるように本発明の生理活性物質固定化担体は、抗原濃度に拘わらず高いＳ／Ｎ比を示すものであり、ガラス上での抗原抗体反応において最も利用されるアルデヒド化ガラスと比べて一桁以上高いＳ／Ｎ比を示した。また二次抗体を使用した場合では抗原濃度１０ｐＭにおいてもＳ／Ｎ比９．５と極めて良好な値を示した。 As shown in Table 7, the physiologically active substance-immobilized carrier of the present invention exhibits a high S / N ratio regardless of the antigen concentration, and is an aldehyded glass most utilized in antigen-antibody reaction on glass. The S / N ratio was higher by one digit or more. When a secondary antibody was used, the S / N ratio was 9.5, which was a very good value even at an antigen concentration of 10 pM.
このように本発明によれば、非特異的吸着量が抑制されると共に生理活性を維持した生理活性物質が充分量固定化された生理活性物質固定化担体、及びそのために有用な固定用担体を得ることができる。 Thus, according to the present invention, a physiologically active substance-immobilized carrier in which a non-specific adsorption amount is suppressed and a physiologically active substance that maintains physiological activity is sufficiently immobilized, and a carrier for immobilization useful therefor are provided. Can be obtained.
Claims (9)
前記固相担体と、下記一般式（Ｉ）で表され、酸無水物官能基を有するシランカップリング剤とを、ベンゼン、トルエン及びキシレンからなる群より選択される少なくとも１つの芳香族炭化水素系溶媒中で接触させること、
前記接触後の固相担体を０℃〜６０℃の温度範囲下に保持しながら、前記酸無水物官能基に対する前記生理活性物質の結合処理を行うこと、
を含む固定化方法。
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、３価の直鎖又は分岐の脂肪族基又は芳香族基を表し、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ２０の置換又は非置換の、アルキレン基、アリーレン基、アリールアルキレン基又はアルキルアリーレン基を表し、Ｒ３は、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｘは、アルコキシ基（−ＯＲ４）、ハロゲン原子又はアシロキシ基（−ＯＯＣＲ５）であって、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、ｎは１、２、もしくは３を表し、ｍは（３−ｎ）の整数を表す。） An immobilization method for immobilizing a physiologically active substance on a solid phase carrier,
At least one aromatic hydrocarbon system selected from the group consisting of benzene, toluene and xylene, wherein the solid phase carrier and the silane coupling agent represented by the following general formula (I) and having an acid anhydride functional group Contacting in a solvent ,
Performing the binding treatment of the physiologically active substance to the acid anhydride functional group while maintaining the solid phase carrier after the contact within a temperature range of 0 ° C. to 60 ° C .;
Immobilization method.
(In formula (I), R 1 represents a trivalent linear or branched aliphatic group or aromatic group, and R 2 represents a C 1 to C 20 substituted or unsubstituted alkylene group or arylene group. Represents an arylalkylene group or an alkylarylene group, R 3 represents a hydrogen atom or a C 1 to C 10 alkyl group, and X represents an alkoxy group (—OR 4 ), a halogen atom or an acyloxy group (—OOCR 5 ). R 4 and R 5 each independently represents a hydrogen atom or a C 1 to C 10 alkyl group, n represents 1, 2, or 3, and m represents an integer of (3-n). )
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、３価の直鎖又は分岐の脂肪族基又は芳香族基を表し、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ２０の置換又は非置換の、アルキレン基、アリーレン基、アリールアルキレン基又はアルキルアリーレン基を表し、Ｒ３は、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、Ｘは、アルコキシ基（−ＯＲ４）、ハロゲン原子又はアシロキシ基（−ＯＯＣＲ５）であって、ただしＲ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を表し、ｎは１、２、もしくは３を表し、ｍは（３−ｎ）の整数を表す。） At least one aromatic hydrocarbon solvent selected from the group consisting of benzene, toluene and xylene , wherein the solid phase carrier and the silane coupling agent represented by the following general formula (I) and having an acid anhydride functional group A carrier for immobilization which is obtained by contacting in the medium and used for producing the carrier for immobilizing a physiologically active substance according to claim 8.
(In formula (I), R 1 represents a trivalent linear or branched aliphatic group or aromatic group, and R 2 represents a C 1 to C 20 substituted or unsubstituted alkylene group or arylene group. Represents an arylalkylene group or an alkylarylene group, R 3 represents a hydrogen atom or a C 1 to C 10 alkyl group, and X represents an alkoxy group (—OR 4 ), a halogen atom or an acyloxy group (—OOCR 5 ). Wherein R 4 and R 5 each independently represents a hydrogen atom or a C 1 to C 10 alkyl group, n represents 1, 2, or 3, and m represents an integer of (3-n). .)
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008076724A JP5344835B2 (en) | 2008-03-24 | 2008-03-24 | Immobilization method, physiologically active substance immobilization carrier and immobilization carrier |
| US12/934,322 US8404621B2 (en) | 2008-03-24 | 2009-03-13 | Method for immobilization, physiologically active substance-immobilized carrier, carrier for immobilization, carrier, and process for producing carrier |
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