JP4817798B2 - 担体および担体の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体分子を固定化するための担体、および該担体の製造方法に関する。

多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでおり、その解析手段として、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通常、スライドガラス等の担体に多数の核酸分子を整列固定化させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチップに固定化されている核酸分子と相補性を持つ核酸分子試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定化し、検出する方法に利用される。形成されたハイブリッドの検出手段としては、核酸分子試料に予め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている。

ＤＮＡチップ利用技術を実用化するためには、多数の核酸分子を担体表面に整列固定化する技術が必要とされる。核酸分子を担体表面に固定化する方法としては、核酸分子の種類や担体の種類に応じて下記のような方法がある。

固定化する核酸分子がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した担体表面にスポッティングして、ＤＮＡの荷電を利用して担体に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている（例えば、非特許文献１参照）。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。また、基体の表面に表面処理層および核酸分子と共有結合しうる官能基を有する化学修飾層を順次設けてなる担体（例えば、特許文献１〜３参照）や、また、基体上に、核酸分子を静電的に引き寄せるための静電層、および核酸分子と共有結合しうる官能基を有する担体（特許文献４）も報告されている。

ＤＮＡチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、担体表面に充分な量で安定に核酸分子を固定化する技術の開発は、固定化核酸分子と標識した試料核酸分子とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に大きく寄与する。従来の担体における核酸分子の固定化量および核酸分子の結合強度は、必ずしも充分とはいえず、核酸分子の固定化量がより高く核酸分子結合強度がより高い担体の開発が望まれていた。

また、ＤＮＡチップ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロテインチップが開発されている。プロテインチップの原理はＤＮＡチップと同じで、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸などを検出するものである。従来開発されたプロテインチップは、スライドガラスまたはシリコン基体表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定化するものであるが、この方法では、タンパク質の固定化状態が不安定であり、洗浄工程において剥離するといった問題が生じた。従って、核酸分子またはタンパク質等の生体分子を安定かつ高密度に固定化できる担体の開発が望まれている。

この出願の発明に関する先行技術文献情報として次のものがある。
国際公開第00/22108号パンフレット 国際公開第 02/12891号パンフレット 特開2002-82116号公報 特開2004-97173号公報 Geo, Z. et al., Nucleic Acid Research, 22, 5456-5465(1994)

本発明の課題は、生体分子を固定化するための担体であって、該担体上の生体分子を安定かつ高密度に固定化できる担体を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、シリコン基体の表面に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基、あるいは、ＳｉＯ_２層、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体を用いることにより、生体分子を安定かつ高密度に固定化でき、生体分子の高感度な検出が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体。
（２）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体。
（３）ＳｉＯ_２層が、シリコン基体を酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下でベーキングすることにより得られるものである、（１）または（２）記載の担体。
（４）ベーキングが、１００〜１２００℃で１〜４８時間のベーキングである、（３）記載の担体。
（５）静電層が、アミノ基含有化合物を含む（２）〜（４）のいずれかに記載の担体。
（６）ＳｉＯ_２層が形成されたシリコン基体を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入して得られるものである（５）記載の担体。
（７）非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物が正荷電をもつ水溶性高分子である（６）記載の担体。
（８）生体分子が、核酸、糖鎖およびペプチドからなる群から選択される（１）〜（７）のいずれかに記載の担体。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の担体上に生体分子が固定化されてなる、生体分子固定化担体。
（１０）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体の製造方法であって、シリコン基体を、酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下でベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成すること、および生体分子と共有結合しうる官能基を導入することを含む、前記方法。
（１１）シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体の製造方法であって、シリコン基体を、酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下でベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成すること、および非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することを含む、前記方法。
（１２）ベーキングを１００〜１２００℃で１〜４８時間行う、（１０）または（１１）記載の方法。

本発明により、生体分子を安定かつ高密度に固定化できる担体が提供され、生体分子の高感度な検出が可能になる。

本発明は、シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層および生体分子と共有結合しうる官能基、あるいは、ＳｉＯ_２層、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体に関する。本発明において、生体分子には、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、ペプチドおよび糖鎖、並びにこれらの複合体およびこれらとその他の分子との複合体などが包含される。本発明において、ペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が包含されるものとする。担体に固定化する生体分子が、ペプチドである場合、本発明の担体は、通常１〜１０００ｋＤａ、好ましくは１〜２００ｋＤａのペプチドに対し好適に用いられる。また、担体に固定化する生体分子が核酸である場合、本発明の担体は、通常３〜５０００塩基、好ましくは１０〜１０００塩基の核酸に対し好適に用いられる。また、担体に固定化する生体分子が糖鎖である場合、本発明の担体は、通常１〜１００糖、好ましくは１〜３０糖の糖鎖に対し好適に用いられる。本発明の担体は、核酸、特にＤＮＡの固定化に好適に用いられる。

ＳｉＯ_２としては、低温型石英(三方晶系)、高温型石英(六方晶系、いわゆる水晶)、トリディマイト(斜方晶系、六方晶系)、クリストバル石(正方晶系、立方晶系)、高圧変態としてコーサイト(coesite、単斜晶系)、スティショフ石(正方晶系、ルチル構造)など単結晶のもの、および、これらがまたは結晶方位が色々と混ざった多結晶のものなどの結晶質のもの、ならびに非晶質のものがある。ＳｉＯ_２層は、シリコン基体、すなわち結晶質シリコン、好ましくは単結晶シリコンからなる基体を酸化処理に付すことにより形成することができる。シリコン基体は、半導体の分野で通常用いられるような半導体用基板と同様のものを使用できる。したがって、単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。シリコン基体の形状は特に制限されず、板状、糸状、ビーズ状、多孔質状、網状、円筒状などいずれも使用できるが、好ましくは板状である。板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。

シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成する方法としては、半導体分野等で通常用いられる方法を使用できる。例えば、シリコン基体自体を酸化する方法、シリコン基体表面にＳｉＯ_２膜を堆積させる方法が使用できる。シリコンを加熱して酸化する方法は、熱酸化法と称され、乾燥酸素を導入するドライ酸化法、湿った酸素を導入するウェット酸化法、蒸気を導入するスチーム酸化法などがある。具体的には、シリコン基体を、Ｏ_２ガスを導入した真空炉中（Ｈ_２ガス少量導入）、通常１００〜１２００℃で、好ましくは６００〜１０００℃で、１〜４８時間、好ましくは３〜６時間にわたって処理することにより、シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成することができる。この場合の、Ｈ_２ガスに対するＯ_２ガスの比は、通常７５〜１００体積％、好ましくは８０〜１００体積％程度である。また、真空炉における真空度は、通常１０^−４〜１０００Ｐａ、好ましくは０．１〜１０Ｐａである。

あるいは、大気圧下、通常大気下、１００〜１２００℃、好ましくは６００〜８００℃で、１〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間にわたり、ベーキングすることにより、シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成することができる。

大気圧下でベーキングする方法は、簡便であることからコストの面で有利である。また、真空装置を用いる場合、真空引きなどの時間のロスや設置スペースの問題があり、また水素や酸素ガスを混合する場合その爆発限界等の安全性にも細心の注意が必要であるが、大気圧下でのベーキングではその必要性がない点でも有利である。この他、高圧スチーム酸化法、ＨＣｌ酸化法、王水酸化法、陽極酸化法なども使用できる。
ＳｉＯ_２層の厚みは、通常５〜１００００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍである。

本発明の担体は、望ましくは、さらに生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を有する。静電層としては、生体分子を静電的に引き寄せ、生体分子の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる（特開２００４−９７１７３）。

前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ_２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えば、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体や共重合体（例えば、正荷電を有する水溶性高分子、特にポリアリルアミンおよびポリリシン）；４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられ、必要に応じてこれらを複数混合したものでもよい。

静電層は、ＳｉＯ_２層上にあってもなくてもよいが、ある方が効果が大きいため好ましい。静電層は、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体と共有結合させずに形成してもよく、共有結合させて形成してもよい。

静電層を、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基体またはＳｉＯ_２層との親和性、即ち密着性を高める点で、基体上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を蒸着させた後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。

静電層を、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体と共有結合させて形成する場合には、例えば、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基体と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。

また、静電層が施された基体に生体分子と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体を、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。

静電層が施された基体に、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。

ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基体との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。

静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
ＳｉＯ_２層、または前記のように形成した静電層には、生体分子と共有結合しうる官能基を導入するため、化学修飾を施す。

前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、ホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。

官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ^１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ^２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^２は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ^３−ＣＯ−Ｒ^４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^３は水素原子または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ^４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^５は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。

前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる（特開２００１−１３９５３２）。

官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^６は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。

官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ^７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸またはフェノール酸が挙げられる。

官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。

前記のような化合物は、そのカルボキシル基が静電層のアミノ基と縮合してアミド結合を形成する。

官能基としてホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、グルタルアルデヒドが挙げられる。

官能基としてエポキシ基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、多価エポキシ化合物が挙げられる。

前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。

ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を固定化する場合は、アミノ基、エポキシ基、カルボジイミド基、ホルミル基または活性エステル基を導入するのが好ましい。ペプチドを固定化する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートまたは活性エステル基を導入するのが好ましい。金属キレートを導入した担体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、静電層を施した基体に、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。

本発明の担体に生体分子を固定化する方法は、特に制限されない。例えば、生体分子をバッファーに溶解して溶液を作成し、これに本発明の担体を浸漬することによって、担体表面に生体分子を固定化することができる。浸漬は、通常、０〜９８℃、好ましくは４℃〜５０℃で、通常、１分〜２４時間、好ましくは１０分〜１時間行う。この場合、一定時間浸漬した後、担体を洗浄することによって、固定化されていない生体分子を除去することができる。また、スポッターといわれる装置を使用することによって、多種類の生体分子を担体の表面に固定化できる。スポッターを用いる場合には、例えば、スポッターで生体分子溶液を担体上にスポットした後、加熱したオーブン中で一定時間ベーキングを行い、その後洗浄によって固定していない分子を除去する。スポッター装置を用いることにより他種類の生体分子を担体上の異なる位置に固定化できるため一度に多数の試験を実施することができる。

シリコン上にＳｉＯ_２層を有する担体は、半導体分野等で広く用いられているが、本発明者らは、驚くべきことに、シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体を用いることにより、生体分子を安定かつ高密度に固定化することができることを見出した。また、ダイヤモンドライクカーボン層などの表面処理層上に、静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体を用いた場合よりも、高感度での検出が可能であることも見出した。上記のとおり、シリコン上にＳｉＯ_２層を有する基板は広く用いられていることから、本発明の担体は工業的生産においても有利である。

従って、プローブ分子を本発明の担体上に固定化し、これにターゲット分子を相互作用させることにより、生体分子間の相互作用の検出を高感度で実施することができる。生体分子間相互作用としては、例えば、タンパク質間の相互作用、タンパク質とペプチドの相互作用、核酸間の相互作用、タンパク質と核酸の相互作用、タンパク質と化合物との相互作用などが包含される。より具体的には、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、抗原と抗体またはその断片との反応、酵素と基質または阻害剤の結合反応、リガンドとレセプターの結合反応、アビジンとビオチンの結合反応、核酸と転写因子の結合反応、細胞接着因子の結合反応、糖鎖とタンパク質の結合反応、脂肪鎖とタンパク質の結合反応、リン酸基とタンパク質の結合反応、補欠因子とタンパク質の結合反応などが挙げられる。

本発明の担体は、核酸分子、例えば、ＤＮＡの伸長反応に用いることもできる。この場合、まず、担体上にプライマーを固定化して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡ伸長反応によりプライマーにハイブリダイズしたＤＮＡと相補的なＤＮＡを伸長させる。プライマーとしては、長さおよび配列が明らかな一本鎖または二本鎖の核酸分子を使用する。長さは特に限定されないが、好ましくは５〜２００塩基、さらに好ましくは１０〜１００塩基である。

従来の担体では、伸長反応における熱処理によってプライマーが剥離することがあるが、本発明の担体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、プライマーを担体に固定化した状態で伸長反応を進行させることができる。

この伸長反応の時に、標識した核酸を取り込ませ、伸長反応後、標識に由来するシグナルを読みとることによって、プライマーに特定のＤＮＡがハイブリダイズして伸長反応が進行したか否かを検出することができる。従って、試験した試料中に、担体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが含まれているかどうかを判定することができ、研究および医療における有用な検出手段となりうる。

標識としては、核酸分子に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなど）、放射能標識（α−^３２Ｐ、γ−^３２Ｐ、^３５Ｓなど）などが挙げられる。蛍光標識核酸を用いた場合は、伸長反応の後の担体を蛍光撮影することにより、検出することができる。

本発明の担体は、ＤＮＡの増幅反応に用いることもできる。ＰＣＲ反応により増幅させる場合には、例えば、まず、担体上にフォワードプライマーを固定化して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせ、その後酵素反応で相補鎖ＤＮＡを伸長する。更に、アニーリング、ハイブリダイゼーション、伸長反応という工程を連続で行うことによって、いわゆるＰＣＲ反応が進行する。

従来の担体では、ＰＣＲ反応における熱処理によってプライマーが剥離したり、サーマルサイクルの制御がうまくいかないといった問題があったが、本発明の担体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、さらに、反応を容器の中ではなく担体上にプライマーを固定化した状態で行うため、ＰＣＲ反応における温度制御が正確で、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的外のＤＮＡが複製される可能性も低く、効率的にＤＮＡを増幅することができる。

さらに、上記の標識核酸を用いた検出とＰＣＲによる増幅とを組み合わせることにより、担体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが試料中に少量しか含まれていない場合であっても、上記のようにＤＮＡが複製され、結果的に多量のＤＮＡが担体上のプライマーにハイブリダイズし、その相補鎖が伸長されるため、検出感度を増大させることが可能になる。

あるいは、伸長反応に使用する酵素として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを選択し、リバースプライマーを加えることによって、サーマルサイクルを経ることなく定温で、ＤＮＡを担体上で増幅することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に二本鎖領域があった場合その鎖を解離しながら、相補鎖合成を継続できるＤＮＡ合成酵素である。

鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス）等が挙げられる。

本発明の別の態様においては、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを対象とすることにより、間接的ながらＲＮＡも対象となりうる。この場合には、ｍＲＮＡから逆転写反応を利用してｃＤＮＡを得るが、ｃＤＮＡを得ると同時に担体に固定化させることができる。まず、担体の化学修飾部分に逆転写プライマーを結合させる。プライマーとしては、一般にオリゴｄＴプライマー、特定塩基配列に相補的なプライマー、ランダム６塩基プライマーが用いられるが、中でもＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）^＋配列に対応させてＴ（チミン塩基）が１０〜２０個程度連なった配列からなるオリゴｄＴプライマーを用いることが望ましい。

オリゴｄＴプライマーを用いる場合には、鋳型となるＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）部分をアニーリングさせる。これに逆転写酵素を作用させ、鋳型ＲＮＡに対し相補的なｄＮＴＰをプライマーの３’末端に順々に重合させることで、５’から３’の方向にｃＤＮＡを合成する。この逆転写反応のプライマーの結合、アニーリング、逆転写酵素による相補鎖重合は、定法に従い温度制御（サーマルサイクル）行うことによって実施できる。

このように逆転写反応を行うと同時に担体への固定も可能であることから、本発明の方法によればいわゆるＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−ＰＣＲ）を効率よく行うことができ、ｍＲＮＡの定量用としても有用である。

更に、本発明の担体を用い、末端水酸基または末端カルボキシル基に、水素結合でオリゴＤＮＡの末端塩基を固定化し、更に、このオリゴＤＮＡと相補的塩基配列を有するＤＮＡを固定して、ＤＮＡライブラリーチップとして用いることもできる。

（実施例１）オリゴＤＮＡの固定化量の比較
以下の（ａ）〜（ｂ）の担体を製造した。
（ａ）シリコン基体上にＳｉＯ_２層を有する担体Ａ（真空熱酸化）
Ｐ型（１００）、抵抗率：１〜１０Ω・ｃｍのシリコン基体（（株）新陽製）を、Ｏ_２ガスを導入した真空炉中（Ｈ_２ガス少量導入）、約９００℃で処理した。形成されたＳｉＯ_２層の膜厚は１００ｎｍ程度であった。

続いてポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に浸漬することによりアミノ化し（静電層の形成）、続いて、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理し、ＳｉＯ_２層を有するシリコン基体上に、静電層および活性エステル基を導入した。

（ｂ）シリコン基体の表面にＤＬＣ層を有する担体
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）上に、メタンガス９７．５体積％と水素２．５体積％を混合したガス（総流量１００ｓｃｃｍ）を原料として、イオン化蒸着法によって、加速電圧０．５ｋＶ、作動圧８Ｐａでダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気（３０ｓｃｃｍ）でプラズマ法（作動圧３Ｐａ、バイアス０．５ｋＶ）により１０分間アミノ化し、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理した。
（ｃ）ＳｉＯ_２層をＨＦで除去した担体
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）を、（ａ）と同様な手法でＯ_２ガスを導入した真空炉中（Ｈ_２ガス少量導入）、約９００℃で処理した。こうしてＳｉＯ_２層が形成された担体をＨＦ（フッ化水素）に常温で５分間浸漬し、超純水で洗浄後、（ａ）と同様にアミノ化および化学処理した。
（ｄ）シリコン担体
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）を、（ａ）と同様にアミノ化および化学処理した。
（ｅ）ガラス基体の表面にＤＬＣ層を有する担体
スライドガラスからなる基体（コーニング社製液晶用ガラス）上に、メタンガス９７．５体積％と水素２．５体積％を混合したガス（総流量１００ｓｃｃｍ）を原料として、イオン化蒸着法によって、加速電圧０．５ｋＶ、作動圧８Ｐａでダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気（３０ｓｃｃｍ）でプラズマ法（作動圧３Ｐａ、バイアス０．５ｋＶ）により１０分間アミノ化し、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理した。

試験方法：
Ｃｙ３で標識したオリゴＤＮＡ（２２ｍｅｒ）の溶液（５μＭ）を上記（ａ）〜（ｅ）の担体上にスポットし、８０℃で１時間ベーキングし、洗浄液（２×ＳＳＣ/０．２％ＳＤＳ）で１５分間室温にて洗浄し、続いて同じ洗浄液で５分間熱洗浄（９０℃以上）を行うことにより、オリゴＤＮＡを担体上に固定化した。

富士写真フィルム社製ＦＬＡ８０００（ＰＭＴ５０％）を用いてシグナルを検出した。結果を以下の表１に示す。

担体（ａ）（ｂ）と（ｄ）（ｅ）の結果を比較すると、ＳｉＯ_２層を有する担体は、ＳｉＯ_２層を有しない担体やＤＬＣ層を有する担体等と比べて、オリゴＤＮＡの固定化量が多いことがわかる。ＳｉＯ_２層をＨＦで除去した担体（ｃ）は、シグナル強度が減少しており、ＳｉＯ_２層を除去することによりオリゴＤＮＡの固定化量が下がることがわかる。従って、ＳｉＯ_２層が生体分子の固定化量において有効であることが示された。

（実施例２）ベーキング処理によるＳｉＯ₂層の形成
シリコン基体の表面にＳｉＯ_２層を有する担体Ｂ（ベーキング）
シリコン基体（（株）新陽製、前掲）を大気炉（光洋サーモシステム社製）中、４５０℃、６００℃または８００℃で、３時間、１２時間または２０時間ベーキングすることにより、シリコン基体の表面にＳｉＯ_２層を形成した。続いてこれをポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に浸漬することによりアミノ化し、ポリアクリル酸を反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６）に０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した反応液中に３０分間浸漬することにより化学処理した。

これらの担体（ｆ〜ｊ）と実施例１で製造した担体（ａ）に、実施例１と同様にオリゴＤＮＡ（５μＭ）を固定化し、シグナルを検出した。結果を以下の表２に示す。

以上から、ほぼ（ａ）と（ｉ）および（ｊ）とが同様のシグナルであることから、大気圧下のベーキングでも必要なＳｉＯ_２層が形成されていることがわかった。また、その条件については、シリコン基体上にＳｉＯ_２層を形成するときのベーキング温度は、５００℃以上、好ましくは約６００℃で、ベーキング時間は１０時間以上、好ましくは１２時間以上であることが好ましいと考えられる。

（実施例３）ハイブリダイゼーション反応
実施例１で作成したシリコン基体上にＳｉＯ_２層を有する担体（ａ）、およびシリコン基体（（株）新陽製、前掲）を大気炉（光洋サーモシステム社製）中、６００℃で２０時間ベーキングすることで得られたシリコン基体の表面にＳｉＯ_２層を有する担体（ｊ）について、２種類の異なるオリゴＤＮＡを固定化させた後に、ＰＣＲ産物をターゲットに用いたハイブリダイゼーションを行なった。

試験方法：
２種類のオリゴＤＮＡの溶液（５μＭ）を上記（ａ）および（ｊ）の担体上にスポットし、８０℃で１時間ベーキングし、洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で１５分間室温にて洗浄し、続いて同じ洗浄液で５分間熱洗浄（９０℃以上）を行うことにより、オリゴＤＮＡを担体上に固定化した。その後、Ｃｙ５で標識したＰＣＲ産物をターゲットＤＮＡとして、ハイブリダイズ（４５℃、１時間）を行った。その後、洗浄液（２×ＳＳＣ）で洗浄した後に、富士写真フィルム社製ＦＬＡ８０００（ＰＭＴ５０％）を用いてシグナルを検出した。

試験結果：
結果を図１に示す。これより、ターゲットＤＮＡと相補的なプローブＤＮＡ（I）がスポットされた部分では、ハイブリダイズによるＣｙ５側のシグナル確認された。一方で、相補的でないプローブＤＮＡ（II）が固定化された部分では、Ｃｙ５側のシグナルは確認されなかった。これより、真空熱酸化（ａ）および大気圧下での熱酸化（ｊ）のいずれの方法で作成したＳｉＯ_２層においても、ＤＮＡプローブが機能可能に固定化されており、高感度のハイブリダイズシグナルが得られることが示された。

本発明の担体にプローブＤＮＡを固定化し、これにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせた結果を示す。

Claims (3)

1. シリコン基体上に、ＳｉＯ_２層、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層および生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体の製造方法であって、
   シリコン基体を、酸素が存在する条件で、大気圧下または減圧下で１００〜１２００℃の温度で１〜４８時間、ベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成すること、および
   非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、生体分子と共有結合しうる官能基を導入することを含む、前記方法。
2. ６００〜１２００℃で３〜４８時間、ベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ６００〜１２００℃で１２〜４８時間、ベーキングすることによりＳｉＯ_２層を形成することを特徴とする請求項１記載の方法。

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