JP2006055065A - Nucleic acid detection method using asymmetric pcr, polynucleotide probe, probe-immobilizing carrier for immobilizing the same and kit - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for effectively detecting a nucleic acid represented by a specific base sequence contained in a sample derived from a specimen. <P>SOLUTION: The method for detecting a nucleic acid represented by a specific base sequence in a specimen comprises preparing a sample containing a nucleic acid to be examined from a specimen, using a set of polynucleotides designed to specifically amplify the whole or a part of the nucleic acid represented by the specific base sequence as a primer, carrying out an asymmetric PCR for the sample, adding a polynucleotide probe to a reaction solution used in the asymmetric PCR, carrying out hybridization reaction and detecting presence of an amplified fraction by the presence of hybridization. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、非対称ＰＣＲを用いて特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法、ならびに該方法に使用するためのプライマー、プローブ及びプローブ固定化担体に関する。   The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid represented by a specific base sequence using asymmetric PCR, and a primer, a probe, and a probe-immobilized support for use in the method.

被検体において特定のポリヌクレオチドを検出する場合、該ポリヌクレオチドに含まれる特異的な塩基配列のみをＰＣＲ法などで増幅し、増幅された塩基配列を蛍光等で分析する方法がある。   When a specific polynucleotide is detected in a subject, there is a method in which only a specific base sequence contained in the polynucleotide is amplified by a PCR method or the like, and the amplified base sequence is analyzed by fluorescence or the like.

しかし、ＰＣＲ法では、特異的なポリヌクレオチド鎖とその相補鎖のポリヌクレオチド鎖も増幅されるため、特異的な塩基配列を分析する際に、分析の感度を低下させる問題点があった。また、ＰＣＲ法とハイブリタイゼーションは別の溶液を使うため、特定のポリヌクレオチド鎖を増幅するのに相当の時間を要していた。   However, in the PCR method, a specific polynucleotide chain and a complementary strand of the polynucleotide are also amplified, and thus there is a problem that the sensitivity of analysis is lowered when analyzing a specific base sequence. In addition, since different solutions are used for the PCR method and hybridization, it takes a considerable time to amplify a specific polynucleotide chain.

更に、特定のポリヌクレオチドを検出する場合、試料が極微量の場合、簡便かつ的確な検出法が無い。すなわち特定のポリヌクレオチドの早期検出の観点から評価する限り、従来の培養法や抗体測定法には難点がある。例えばウイルス培養法の場合、日数を要しかつヒト特異的なウイルスであることから手間がかかる。抗体測定について言えば、ＣＦ抗体の場合、急性期から３週間以上経ってから検出が確定するのが通常であり、かつ特異性にも難点がある。また抗体価を測定することに関しても、検出対象が圧倒的に免疫不全状態の患者であることを忘れてはならない。また、感染患者由来の生検組織材料に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるウイルス検出は感度が悪いという難点がある。   Furthermore, when a specific polynucleotide is detected, there is no simple and accurate detection method when the sample is extremely small. That is, as long as evaluation is performed from the viewpoint of early detection of a specific polynucleotide, the conventional culture methods and antibody measurement methods have difficulties. For example, in the case of the virus culture method, it takes time because it takes a long time and is a human-specific virus. As for antibody measurement, in the case of CF antibody, detection is usually confirmed after 3 weeks or more from the acute phase, and there is also a difficulty in specificity. Regarding the measurement of antibody titer, it should be remembered that the detection target is an overwhelmingly immunocompromised patient. In addition, virus detection by in situ hybridization on a biopsy tissue material derived from an infected patient has a drawback of poor sensitivity.

本発明の目的は、被検体由来の試料に含まれる特定の塩基配列で表される核酸を効果的に検出する方法を提供することである。   An object of the present invention is to provide a method for effectively detecting a nucleic acid represented by a specific base sequence contained in a sample derived from a subject.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、非対称ＰＣＲ反応液を用いて、非対称ＰＣＲとハイブリタイセーションを連続して行うことにより、特定の塩基配列で表される核酸を効果的に検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have carried out asymmetric PCR and hybridization continuously using an asymmetric PCR reaction solution, whereby a nucleic acid represented by a specific base sequence is obtained. Has been found to be detected effectively, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）被検体中の特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法であって、被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、該試料に対して、前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を特異的に増幅しうるように設計されたポリヌクレオチドのセットをプライマーとして用いて非対照ＰＣＲを行い、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出することを含む、前記検出方法。
（２）非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯において反応液にポリヌクレオチドプローブを存在させてプローブの伸長反応とハイブリダイズ反応を行う、（１）記載の検出方法。
（３）前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いる、（１）又は（２）記載の検出方法。
（４）前記ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないよう設計される、（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）前記特定の塩基配列が、配列番号１で表されることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の検出方法。
（６）被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いることにより、被検体中にラムダファージが存在するか否かを判別する、（５）記載の検出方法。
（７）配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも２５７〜３１６番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプローブ。
（８）（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法において使用するための、担体上にポリヌクレオチドプローブが固定化されたプローブ固定化担体であって、ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される、前記プローブ固定化担体。
（９）担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体である、（８）記載のプローブ固定化担体。
（１０）（７）に記載のポリヌクレオチドプローブを含む、ラムダファージを検出するためのキット。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for detecting a nucleic acid represented by a specific base sequence in a subject, comprising preparing a sample containing the test nucleic acid from the subject, and using the specific base sequence for the sample. Perform non-control PCR using a set of polynucleotides designed to specifically amplify all or part of the expressed nucleic acid as a primer, and add the polynucleotide probe to the reaction solution used for asymmetric PCR. And detecting the presence or absence of the amplified fragment based on the presence or absence of hybridization.
(2) The detection method according to (1), wherein a polynucleotide probe is present in the reaction solution in at least a part of time during the asymmetric PCR reaction, and the probe extension reaction and the hybridization reaction are performed.
(3) The detection method according to (1) or (2), wherein a polynucleotide that specifically hybridizes to all or part of the nucleic acid represented by the specific base sequence is used as a probe.
(4) Any of (1) to (3), wherein the polynucleotide probe is designed to bind to a specific site of a single-stranded amplified fragment amplified by asymmetric PCR and not to a primer for asymmetric PCR. The detection method of crab.
(5) The detection method according to any one of (1) to (4), wherein the specific base sequence is represented by SEQ ID NO: 1.
(6) By preparing a sample containing a test nucleic acid from a specimen and using a polynucleotide probe that specifically hybridizes to all or part of the nucleic acid specified by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The detection method according to (5), wherein it is determined whether or not lambda phage is present in the subject.
(7) A polynucleotide probe comprising a base sequence comprising at least bases 257 to 316 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof.
(8) A probe-immobilized carrier having a polynucleotide probe immobilized on a carrier for use in the detection method according to any one of (1) to (3), wherein the polynucleotide probe is asymmetric PCR. The probe-immobilized carrier, which is designed to bind to a specific site of a single-stranded amplified fragment amplified by the above and not to a primer for asymmetric PCR.
(9) The support is a solid support having a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid on a substrate and at least one surface layer selected from diamond, soft diamond, a carbon-based material, and carbide. Probe immobilization carrier.
(10) A kit for detecting lambda phage comprising the polynucleotide probe according to (7).

本発明により、特定の塩基配列で表される核酸を短時間で増幅することができ、かつ特定の塩基配列を高感度で検出することができる。   According to the present invention, a nucleic acid represented by a specific base sequence can be amplified in a short time, and a specific base sequence can be detected with high sensitivity.

本発明の一実施形態においては、被検体中の特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法であって、被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、該試料に対して、前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を特異的に増幅しうるように設計されたポリヌクレオチドのセットをプライマーとして用いて非対照ＰＣＲを行い、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出することを含む、前記検出方法に関する。   In one embodiment of the present invention, a method for detecting a nucleic acid represented by a specific base sequence in a test sample, comprising preparing a sample containing the test nucleic acid from the test sample, Non-control PCR is performed using a set of polynucleotides designed to specifically amplify all or part of the nucleic acid represented by the specific base sequence as a primer, and the reaction mixture used in asymmetric PCR The present invention relates to the above detection method, comprising adding a polynucleotide probe to perform a hybridization reaction and detecting the presence or absence of an amplified fragment based on the presence or absence of hybridization.

本発明においてポリヌクレオチドとは、塩基長を限定するものではなく、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの双方を包含するものとする。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれをも包含する。   In the present invention, the term “polynucleotide” does not limit the base length, but encompasses both oligonucleotides and polynucleotides. The polynucleotide includes both DNA and RNA.

特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を増幅しうるプライマーの設計は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。プライマーの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基である。   Design of a primer capable of amplifying all or part of a nucleic acid represented by a specific base sequence can be performed by a method usually used in the art. The length of the primer is usually 10 bases or more, preferably 15 to 30 bases, more preferably 18 to 25 bases.

プライマーの設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーのＴｍは、増幅反応を行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＡｍｐｌｉｆｙなどが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約５０〜７０℃であることが好ましい。   When designing a primer, it is preferable to check the melting temperature (Tm) of the primer. Tm means a temperature at which 50% of an arbitrary nucleic acid strand forms a hybrid with its complementary strand. In order to anneal a template DNA or RNA and a primer to form a double strand, the annealing temperature must be Need to optimize. On the other hand, if this temperature is lowered too much, a non-specific reaction occurs, so it is desirable that the temperature be as high as possible. Therefore, the Tm of the primer to be designed is an important factor in performing the amplification reaction. For confirmation of Tm, known primer design software can be used, and examples of software that can be used in the present invention include Amplify. Also, Tm can be confirmed by calculating by itself without using software. In that case, a calculation formula based on the nearest neighbor method, the Wallance method, the GC% method, or the like can be used. In this invention, it is preferable that average Tm is about 50-70 degreeC.

プライマーとして特異的なアニーリングが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。また、プライマーは、設計時に鋳型として使用する配列に対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合は鋳型配列に対し相同配列となり、リバースプライマーの場合は鋳型配列に対し相補配列となることに留意してプライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの設計は当業者には周知である。   Other conditions that allow specific annealing as a primer include GC content, and such conditions are well known to those skilled in the art. In addition, the primer may be homologous or complementary to the sequence used as a template at the time of design. Generally, the forward primer is a homologous sequence to the template sequence, and the reverse primer is complementary to the template sequence. It is necessary to design the primer in consideration of the sequence. The design of such primers is well known to those skilled in the art.

本発明においては、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも１〜２３番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも４７６〜５００番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーとのプライマーセットであって、一方をフォワードプライマーとし、他方をリバースプライマーとして作製される該プライマーセットを用いるのが好ましい。   In the present invention, a polynucleotide primer comprising a base sequence comprising at least the 1st to 23rd bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, and at least the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 It is preferable to use a primer set with a polynucleotide primer comprising a base sequence containing bases 476 to 500 or a complementary sequence thereof, one of which is a forward primer and the other is a reverse primer.

具体的には、配列番号２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのプライマーセットが挙げられる。   Specifically, the primer set of the forward primer which consists of a base sequence represented by sequence number 2, and the reverse primer which consists of a base sequence represented by sequence number 3 is mentioned.

本発明の検出方法においては、被検体から被検核酸を調製し、該被検核酸に対して上記プライマーを用いて増幅反応を行う。ここで「被検体」は、例えば感染症に感染した患者から、病原菌の種別を判別しようとする動物を意味する。被検体は、特に限定されず、いかなる生物であってもよい。このような被検体としては、植物、動物、菌類、原生生物、原核生物等が挙げられる。特に哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、マウス等挙げられる。また、被検体由来の試料としては、特に限定されないが、血液、汗、尿、唾液、涙、リンパ液、等の体液、培養細胞、細胞破砕物などが挙げられる。   In the detection method of the present invention, a test nucleic acid is prepared from a specimen, and an amplification reaction is performed on the test nucleic acid using the above-described primers. Here, the “subject” means an animal that attempts to determine the type of pathogenic bacteria from, for example, a patient infected with an infectious disease. The subject is not particularly limited and may be any organism. Examples of such specimens include plants, animals, fungi, protists, prokaryotes, and the like. In particular, mammals such as humans, cows and mice can be mentioned. In addition, the sample derived from the subject is not particularly limited, and examples thereof include body fluids such as blood, sweat, urine, saliva, tears, lymph fluid, cultured cells, and cell debris.

被検核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、臭化セチルトリメチルアンモニウムを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法などを利用することができる。またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製した試料又は被検核酸を用いて、以下に示す増幅反応を行う。   The test nucleic acid may be either DNA or RNA. DNA or RNA can be extracted appropriately using a method well known in the art. For example, when DNA is extracted, a method of phenol extraction and ethanol precipitation, a method of using cetyltrimethylammonium bromide, a method of using glass beads, or the like can be used. When RNA is extracted, a guanidine-cesium chloride ultracentrifugation method, a hot phenol method, a guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (AGPC) method, or the like can be used. The amplification reaction shown below is performed using the sample or test nucleic acid prepared as described above.

増幅手法としては、非対称ＰＣＲを用いる。増幅は、増幅断片が検出可能なレベルになるまで行う。非対称ＰＣＲは、通常の対称ＰＣＲでは増幅用の２種類のプライマーをそれぞれ等量用いるのに対し、１本鎖として得たい方のプライマーを、もう一方のプライマーよりも多量に入れてＰＣＲを行う方法である。そうすることにより、ＰＣＲサイクルの始めのうちは２本鎖ばかりが作り出されてくるが、少ない方のプライマーが使い尽くされてくると、以後、１本鎖のＤＮＡが毎回作り出されてくるようになる。２本鎖ＤＮＡをターゲットとして用いた場合、このＤＮＡ同士が相互にアニーリングしてしまい、プローブのポリヌクレオチドとハイブリダイズできなくなってしまうために感度が低くなってしまうという問題点があるが、非対称ＰＣＲにより調製した１本鎖ＤＮＡを用いることにより、このような問題がなく高感度な検出が可能になる。   As an amplification method, asymmetric PCR is used. Amplification is performed until the amplified fragment is at a detectable level. Asymmetric PCR is a method of performing PCR by using a larger amount of the primer to be obtained as a single strand than the other primer, whereas the normal symmetric PCR uses two equal amounts of two primers for amplification. It is. By doing so, only two strands are created at the beginning of the PCR cycle, but once the smaller primer is used up, single-stranded DNA will be created each time. Become. When double-stranded DNA is used as a target, the DNAs anneal to each other and cannot be hybridized with the probe polynucleotide, resulting in low sensitivity. By using the single-stranded DNA prepared by the above method, it is possible to detect with high sensitivity without such problems.

本発明において、非対称ＰＣＲにおける一方のプライマー濃度に対する他方のプライマーの濃度比は、通常１未満、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／２０〜１／３である。   In the present invention, the concentration ratio of the other primer to the one primer concentration in asymmetric PCR is usually less than 1, preferably 1/2 or less, more preferably 1/20 to 1/3.

本発明の識別方法においては、上記プライマーを用いて特異的な増幅反応が起こる条件下で増幅反応を行う。そのような条件は、当業者であれば適宜設定することができる。   In the identification method of the present invention, the amplification reaction is carried out under conditions that cause a specific amplification reaction using the above primers. Such conditions can be appropriately set by those skilled in the art.

増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。 A label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance is allowed to act on dNTP taken in during the amplification reaction, and this label can be detected. As a radioactive isotope, ³² P, ¹²⁵ I, ³⁵ S, or the like can be used. As the fluorescent substance, for example, fluorescein (FITC), sulforhodamine (TR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used. As the luminescent substance, luciferin or the like can be used.

これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。   There are no particular restrictions on the type of the labeled body, the method for introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used. For example, as a method for introducing a label, a random prime method using a radioisotope can be mentioned.

標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅断片は、目的の増幅断片の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより検出できる。例えば、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより検出できる。通常、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸のうち、増幅された断片に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いる。ここで「一部」とは、配列番号１のうち、通常１０塩基以上、好ましくは２０〜１０００塩基、より好ましくは３０〜１００塩基の連続する塩基配列を意味する。   An amplified fragment incorporating the labeled dNTP can be detected by using a polynucleotide that specifically hybridizes to all or a part of the target amplified fragment as a probe. For example, it can be detected by using, as a probe, a polynucleotide that specifically hybridizes to all or part of the nucleic acid identified by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Usually, a polynucleotide that specifically hybridizes to an amplified fragment of the nucleic acid identified by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used as a probe. Here, “part” means a continuous base sequence of SEQ ID NO: 1, usually 10 bases or more, preferably 20 to 1000 bases, more preferably 30 to 100 bases.

例えば、上記ポリヌクレオチドプローブが固定化された担体を用い、当該プローブ固定化担体に被検体由来の試料を接触させ、試料に含まれる増幅断片と担体上に固定化されたプローブとをハイブリダイズさせ、標識を指標として増幅断片の有無を検出することができる。従って、本発明は、上記ポリヌクレオチドプローブが固定化されたプローブ固定化担体をも包含する。   For example, using a carrier on which the polynucleotide probe is immobilized, a sample derived from an analyte is brought into contact with the probe-immobilized carrier, and an amplified fragment contained in the sample is hybridized with a probe immobilized on the carrier. The presence or absence of the amplified fragment can be detected using the label as an index. Therefore, the present invention also includes a probe-immobilized carrier on which the polynucleotide probe is immobilized.

本発明においては、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出する。すなわち、非対称ＰＣＲを実施した反応液をそのまま使用して、該反応液中にポリヌクレオチドを添加したハイブリダイズ反応を行う。好ましくは、非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯において反応液にポリヌクレオチドプローブを存在させてプローブの伸長反応とハイブリダイズ反応を行う。非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯においてとは、少なくとも一部の時間において、非対称ＰＣＲ反応とハイブリダイズ反応が平行して行われることを意味し、より好ましくは非対称ＰＣＲ反応とハイブリダイズを平行して行う。   In the present invention, a polynucleotide probe is added to a reaction solution used in asymmetric PCR to perform a hybridization reaction, and the presence or absence of an amplified fragment is detected based on the presence or absence of hybridization. That is, a reaction solution subjected to asymmetric PCR is used as it is, and a hybridization reaction is performed by adding a polynucleotide to the reaction solution. Preferably, at least a part of the time during the asymmetric PCR reaction, the polynucleotide probe is present in the reaction solution to perform the probe extension reaction and the hybridization reaction. The term “in at least a part of the time period during the asymmetric PCR reaction” means that at least a part of the time, the asymmetric PCR reaction and the hybridization reaction are performed in parallel, and more preferably, the asymmetric PCR reaction and the hybridization reaction are performed. Perform in parallel.

この時、ポリヌクレオチドプローブは、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される。この理由は、非対称ＰＣＲにより多量に増幅され１本鎖として存在する増幅断片を対象とした方がハイブリダイズの効率が格段に向上すること、増幅された１本鎖の相補鎖ができにくいことである。また、非対称ＰＣＲに用いるプライマーと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いると、非対称ＰＣＲ反応液中の未反応プライマーが優先的に増幅断片に結合してしまい充分なプローブとのハイブリダイズ効率が得られないからである。   At this time, the polynucleotide probe is designed to bind to a specific site of a single-stranded amplified fragment amplified by asymmetric PCR and not to a primer for asymmetric PCR. The reason for this is that the efficiency of hybridization is markedly improved when targeting amplified fragments that are amplified in large amounts by asymmetric PCR and present as single strands, and that complementary strands of amplified single strands are difficult to produce. is there. In addition, when an oligonucleotide having the same base sequence as the primer used for asymmetric PCR is used as a probe, the unreacted primer in the asymmetric PCR reaction solution preferentially binds to the amplified fragment, resulting in sufficient hybridization efficiency with the probe. It is because it cannot be obtained.

配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブの設計は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。プローブの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１０〜５０００塩基、より好ましくは２０〜１００塩基である。   The design of a polynucleotide probe that specifically hybridizes to all or part of the nucleic acid identified by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be carried out by a method commonly used in the art. The length of the probe is usually 10 bases or more, preferably 10 to 5000 bases, more preferably 20 to 100 bases.

またプローブの設計の際においても、プローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプローブのＴｍは、ハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプローブ設計用ソフトウエアを利用することができる。本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＡｍｐｌｉｆｙなどが挙げられる。本発明では、平均Ｔｍが約５０〜７０℃であることが好ましい。プローブとして特異的なハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。   It is also preferable to check the melting temperature (Tm) of the probe when designing the probe. In order for the template DNA or RNA and the probe to form a double strand and hybridize, it is necessary to optimize the hybridization temperature. On the other hand, if this temperature is lowered too much, a non-specific reaction occurs, so it is desirable that the temperature be as high as possible. Therefore, the Tm of the probe to be designed is an important factor in performing hybridization. For checking Tm, known probe design software can be used. Examples of software that can be used in the present invention include Amplify. In this invention, it is preferable that average Tm is about 50-70 degreeC. Other conditions that allow specific hybridization as a probe include GC content, and such conditions are well known to those skilled in the art.

本発明において、例えばラムダファージを検出する場合、特に配列番号１で表される塩基配列の全部又は一部でコードされる核酸を検出する場合、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも２５７〜３１６番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプローブを用いるのが好ましい。   In the present invention, for example, when detecting lambda phage, particularly when detecting a nucleic acid encoded by all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, at least 257 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is preferable to use a polynucleotide probe comprising a base sequence containing the 316th base or a complementary sequence thereof.

具体的には、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブが挙げられる。当該ポリヌクレオチドプローブにおいて、配列番号４の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプローブもまた本発明に包含される。このようなプローブは、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも１〜２３番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも４７６〜５００番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプライマーとのプライマーセット、特に、配列番号２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのプライマーセット、によって増幅される断片を検出するのに特に有効である。   Specifically, a polynucleotide probe consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 can be mentioned. In the polynucleotide probe, a probe comprising a base sequence containing all or part of SEQ ID NO: 4 or a base sequence complementary to the base sequence is also encompassed in the present invention. Such a probe includes a polynucleotide primer comprising a base sequence comprising at least the 1st to 23rd bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Primer set with a polynucleotide primer comprising a base sequence comprising at least bases 476 to 500 or a complementary sequence thereof, in particular, a forward primer comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 It is particularly effective for detecting fragments amplified by a primer set with a reverse primer consisting of

ここで「一部」とは、配列番号４のうち、通常１０塩基以上、好ましくは１５〜５００塩基、より好ましくは２０〜１００塩基の連続する塩基配列を意味する。   Here, “part” means a continuous base sequence of SEQ ID NO: 4, usually 10 bases or more, preferably 15 to 500 bases, more preferably 20 to 100 bases.

本発明のポリヌクレオチドプローブには、配列番号４で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部と特異的にハイブリダイズする核酸も包含される。また、ポリヌクレオチドを担体上に固定化するための反応活性基を導入した合成ポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドプローブに包含される。   The polynucleotide probe of the present invention has a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. Also included is a nucleic acid comprising a base sequence having a specific sequence and hybridizing specifically with all or part of the nucleic acid identified by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, a synthetic polynucleotide into which a reactive group for immobilizing a polynucleotide on a carrier is introduced is also included in the polynucleotide probe of the present invention.

ハイブリダイゼーション反応は、プローブが配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸と特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。ストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜４０ｍＭ、好ましくは１５〜２０ｍＭで、温度が５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が１６〜１７ｍＭで温度が６５℃の場合が最も好ましい。   The hybridization reaction needs to be performed under conditions such that the probe specifically binds to the nucleic acid specified by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, stringent conditions. Stringent conditions are well known in the art and are not particularly limited. For example, stringent hybridization conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is 15 to 40 mM, preferably 15 to 20 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C., preferably 60 to 65 ° C. In particular, it is most preferable that the sodium concentration is 16 to 17 mM and the temperature is 65 ° C.

ポリヌクレオチドプローブの担体への固定化は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。固定化するポリヌクレオチドプローブがｃＤＮＡやＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した担体表面にスポッティングして、ＤＮＡの荷電を利用して担体上に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。   Immobilization of the polynucleotide probe to the carrier can be performed by methods known in the art. When the polynucleotide probe to be immobilized is a cDNA or a PCR product (DNA fragment obtained by amplifying cDNA by the PCR method), the polycation (polylysine) is prepared using a spotter device provided in the DNA chip production apparatus. In general, a method of spotting on the surface of a carrier surface-treated with polyethyleneimine or the like and electrostatically bonding the carrier surface using the charge of DNA is used. In addition, a method using a silane coupling agent having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group or the like is also used as a method for treating the carrier surface. In this case, since an amino group, an aldehyde group, and the like are introduced to the support surface by a covalent bond, they are stably present on the support surface as compared with the case of using a polycation.

固定化するポリヌクレオチドプローブが合成ポリヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した担体表面に該ポリヌクレオチドをスポッティグし、共有結合させることができる。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）存在下、アミノ基導入ポリヌクレオチドを反応させる方法、及び該スライドガラスに、アルデヒド基導入ポリヌクレオチドを反応させる方法などがある。   When the polynucleotide probe to be immobilized is a synthetic polynucleotide, a polynucleotide into which a reactive group is introduced can be synthesized, spotted on the surface of the surface-treated carrier, and covalently bonded. For example, a method of reacting an amino group-introduced polynucleotide in the presence of PDC (p-phenylene diisothiocyanate) on a slide glass into which an amino group has been introduced, and a method of reacting an aldehyde group-introduced polynucleotide with the slide glass, etc. is there.

ポリヌクレオチドプローブを固定化する担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使用できる。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物などの貴金属、及びグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれら半導体材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。   As the carrier for immobilizing the polynucleotide probe, those commonly used in the art can be used. For example, noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and conductor materials such as graphite and carbon typified by carbon fiber; single crystal silicon, amorphous Semiconductor materials typified by silicon, silicon carbide, silicon oxide, silicon nitride, etc., composite materials of these semiconductor materials typified by SOI (silicon-on-insulator), etc .; glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, Inorganic materials such as stellite and photosensitive glass; polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl aceta , Acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile / butadiene styrene copolymer, polyphenylene oxide and polysulfone An organic material etc. are mentioned.

本発明においては、ポリヌクレオチドプローブを固定化する担体として、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体が好ましい。   In the present invention, as a carrier for immobilizing a polynucleotide probe, a solid having a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid on a substrate and at least one surface layer selected from diamond, soft diamond, a carbon-based material and carbide. A support is preferred.

上記固体支持体に用いられる基板の材料としては、例えば、シリコーン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ 樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられる。   Examples of the material of the substrate used for the solid support include, for example, silicone, glass, fiber, wood, paper, ceramics, plastic (for example, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), nylon. , Acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methyl pentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin), synthetic diamond, high pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (eg diamond-like carbon) Amorphous carbon; Gold, silver, copper, aluminum, tungsten, molybdenum and other metals; Binder the resin to the metal powder, ceramic powder, etc. Include those those raw materials such as the metal powder or ceramic powder and powder with a press molding machine and sintered at a high temperature; that as mixing, those bound form.

本発明の固体支持体は、基板上に表面層を有する。この表面層により、核酸と共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定化することができる。   The solid support of the present invention has a surface layer on a substrate. By this surface layer, a compound for introducing a functional group capable of covalently bonding with a nucleic acid can be firmly immobilized on the substrate.

表面層は、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種から形成される。ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物としては、例えば、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたもの、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を挙げることができる。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明においては、軟ダイヤモンドを用いるのが好ましい。   The surface layer is formed of at least one selected from diamond, soft diamond, carbon-based material, and carbide. Examples of diamond, soft diamond, carbon-based material, and carbide include synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon, and carbon-based material (for example, graphite, fullerene, and carbon nanotube). ), A mixture thereof, or a laminate thereof, hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, Carbides such as vanadium carbide can be mentioned. Here, the soft diamond is a generic term for an incomplete diamond structure that is a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC), and the mixing ratio is not particularly limited. In the present invention, it is preferable to use soft diamond.

基板が、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成されている場合は、基板上に新たに表面層を形成させる必要はないが、基板がそれ以外の材料で形成されている場合は、表面処理を施すことによりダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成される表面層を形成させる。   When the substrate is made of at least one material selected from diamond, soft diamond, carbon-based material and carbide, it is not necessary to form a new surface layer on the substrate, but the substrate is made of other materials. Is formed, a surface layer is formed by at least one material selected from diamond, soft diamond, carbon-based material and carbide.

表面処理を施した基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。   As an example of the substrate subjected to the surface treatment, a substrate obtained by forming a soft diamond film on a slide glass can be given. Such a substrate is preferably prepared by ionized vapor deposition of diamond-like carbon in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of the remaining methane gas.

表面処理によって形成される表面層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。   The thickness of the surface layer formed by the surface treatment is preferably 1 nm to 100 μm.

基板への表面処理は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。   The surface treatment on the substrate may be performed by a known method such as a microwave plasma CVD (Chemical Vapor Deposition) method, an ECRCVD (Electrical Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposition) method, an ICP (Inductive Coupled EPR method, an ICP (Inductive Coupled EPR method). Cyclotron Resonance (sputtering) method, ion plating method, arc ion plating method, EB (Electron Beam) vapor deposition method, resistance heating vapor deposition method, ionization vapor deposition method, arc vapor deposition method, laser vapor deposition method and the like can be used.

また、前記の基板材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））を形成することにより、表面層としてもよい。   Alternatively, a surface layer may be formed by forming a laminate or a composite of the above substrate materials (for example, a composite of diamond and another substance (for example, a two-phase body)).

基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。   Although the shape and size of the substrate are not particularly limited, examples of the shape include a flat plate shape, a thread shape, a spherical shape, a polygonal shape, and a powder shape. When the flat plate shape is used, the width is usually 0.1. ˜100 mm, length 0.1˜100 mm, thickness 0.01˜10 mm.

また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。   Further, a single layer of Ti, Au, Pt, Nb, Cr, TiC, TiN, or a composite film thereof may be formed on the front surface or the back surface of the substrate as a reflective layer. Since the thickness of the reflective layer needs to be uniform throughout, it is preferably 10 nm or more, more preferably 100 nm or more.

基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳ Ｂ ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のポリヌクレオチドプローブを高密度で固定化できる点で好都合である。   When glass is used as the substrate, the surface thereof is preferably intentionally roughened in the range of 1 nm to 1000 nm with Ra (JIS B 0601). Such a roughened surface is advantageous in that the surface area of the substrate is increased and a large amount of polynucleotide probes can be immobilized at a high density.

本発明の固体支持体には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が設けられていてもよい。   The solid support of the present invention may be provided with an electrostatic layer in order to attract nucleic acid electrostatically.

静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。   The electrostatic layer is not particularly limited as long as it attracts nucleic acid electrostatically and improves the amount of nucleic acid immobilized. For example, the electrostatic layer is formed using a positively charged compound such as an amino group-containing compound. be able to.

前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ_２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。 Examples of the amino group-containing compound include an unsubstituted amino group (—NH ₂ ), or an amino group monosubstituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (—NHR; R is a substituent), for example, Ethylenediamine, hexamethylenediamine, n-propylamine, monomethylamine, dimethylamine, monoethylamine, diethylamine, allylamine, aminoazobenzene, aminoalcohol (eg, ethanolamine), acrinol, aminobenzoic acid, aminoanthraquinone, amino acid (glycine, alanine) , Valine, leucine, serine, threonine, cysteine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, proline, cystine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, arginine, histidine , Aniline, or a polymer thereof (for example, polyallylamine, polylysine) or a copolymer; 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene, spermidine, spermine, putrescine, or other polyamine (polyvalent amine) ).

静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。また、静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と表面層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。   In the case where the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the surface layer, for example, when the surface treatment is performed, the amino group-containing compound is introduced into the film forming apparatus to form a carbon-based film containing an amino group. Form a film. In addition, when the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the surface layer, the above-mentioned non-substituted or mono-substituted is provided on the substrate in order to increase the affinity between the electrostatic layer and the surface layer, that is, the adhesion. It is preferable to introduce a functional group that can be covalently bonded to a nucleic acid after vapor-depositing the compound having an amino group and a carbon compound. The carbon compound used here is not particularly limited as long as it can be supplied as a gas. For example, methane, ethane, and propane which are gases at normal temperature are preferable. As a method of vapor deposition, ionized vapor deposition is preferable, and as conditions for ionized vapor deposition, it is preferable that an operating pressure is 0.1 to 50 Pa and an acceleration voltage is in a range of 200 to 1000 V.

静電層を表面層と共有結合させて形成する場合には、例えば、表面層を有する基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。   In the case where the electrostatic layer is formed by covalent bonding with the surface layer, for example, the substrate having the surface layer is irradiated with ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate the surface, and among the amino group-containing compounds, for example, By reacting a polyvalent amine such as polyallylamine, polylysine, 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, and triamterene, an amino group is introduced at the terminal on the side that is not bonded to the substrate. An electric layer can be formed.

また、静電層が施された基板に核酸と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。   In addition, when a reaction for introducing a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid (for example, introduction of a carboxyl group using dicarboxylic acid or polyvalent carboxylic acid) into a substrate provided with an electrostatic layer in a solution, the substrate Is immersed in a solution containing the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, and then a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid is preferably introduced. Examples of the solvent for the solution include water, N-methylpyrrolidone, and ethanol.

静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。   When a carboxyl group is introduced into a substrate on which an electrostatic layer is applied using dicarboxylic acid or polyvalent carboxylic acid, it is activated with N-hydroxysuccinimide and / or carbodiimide in advance, or the reaction is N -It is preferable to carry out in the presence of hydroxysuccinimide and / or carbodiimides.

基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸の固定化量がより向上する。   When forming an electrostatic layer by immersing the substrate in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, when polyallylamine is used as the amino group-containing compound, the substrate is in close contact with the substrate. This improves the amount of nucleic acid immobilized.

静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。   The thickness of the electrostatic layer is preferably 1 nm to 500 μm.

本発明の固体支持体は、核酸と共有結合しうる官能基を有する。該官能基は、基板表面に化学修飾を施すことにより形成することができる。   The solid support of the present invention has a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid. The functional group can be formed by chemically modifying the substrate surface.

前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。   Examples of the functional group include a carboxyl group, an active ester group, a haloformyl group, a hydroxyl group, a sulfate group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, and an amino group.

官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ^１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ^２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ^３−ＣＯ−Ｒ^４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ^４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。 As a compound used for introducing a carboxyl group as a functional group, for example, the formula: X—R ¹ —COOH (wherein X is a halogen atom, R ¹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) For example, chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid; formula: HOOC Dicarboxylic acid represented by —R ² —COOH (wherein R ² represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, Fumaric acid, phthalic acid; polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, polyvalent carboxylic acid such as butanetetracarboxylic acid; formula: R ³ —CO—R ⁴ —COOH (wherein , R ³ represents a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, and R ⁴ represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). A monohalide of a dicarboxylic acid represented by X—OC—R ⁵ —COOH (wherein X represents a halogen atom, R ⁵ represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), Acid monochloride, malonic acid monochloride; acid anhydrides such as phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride, maleic anhydride, and butanetetracarboxylic anhydride.

前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる。   The carboxyl group introduced as described above is active with a dehydrating condensing agent such as cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide) and a compound such as N-hydroxysuccinimide. Can be esterified.

官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^６は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。 As a compound used for introducing a haloformyl group as a functional group, for example, the formula: X—OC—R ⁶ —CO—X (wherein X is a halogen atom, R ⁶ is a single bond or a carbon number of 1 to 12). And dicarboxylic acid dihalides such as succinic acid chloride and malonic acid chloride.

官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ^７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸又はフェノール酸が挙げられる。 As a compound used for introducing a hydroxyl group as a functional group, for example, represented by the formula: HO—R ⁷ —COOH (wherein R ⁷ represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). Hydroxy acid or phenolic acid.

官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。   Examples of the compound used for introducing an amino group as a functional group include amino acids.

前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。   Among the above-mentioned compounds, polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, and butanetetracarboxylic acid can be used for improving hydrophilicity.

担体として上記のような固体支持体を用いることにより、ポリヌクレオチドプローブを強固に固定化することができるため、検出感度と信頼性の高い検出が可能になる。   By using the solid support as described above as a carrier, the polynucleotide probe can be firmly immobilized, so that detection with high detection sensitivity and reliability is possible.

本発明はまた、上記プローブを含む、被検体においてラムダファージを検出するためのキットに関する。プローブは、上記のような担体上に固定化されていてもよい。   The present invention also relates to a kit for detecting lambda phage in a subject comprising the probe. The probe may be immobilized on the carrier as described above.

本発明のキットは、プライマーを含む場合には、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ＤＮＡ合成酵素、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨなど）、校正用の標準試料などを含んでもよい。また、本発明のキットは、プローブを含む場合には、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレンなどを含んでもよい。   When the kit of the present invention contains a primer, it may further contain a buffer constituting the reaction solution, a dNTP mixture, enzymes (DNA synthase, reverse transcriptase, RNase H, etc.), a standard sample for calibration, and the like. . In addition, when the kit of the present invention includes a probe, it may further include a hybridization buffer, a washing buffer, a microplate, a nylon membrane, and the like.

本発明により、特定の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみが増幅されるため、検出感度が向上し、特定の塩基配列を迅速に検出することが可能になる。この迅速な検出により、特定の塩基配列で表されるウイルスが原因の感染症に対して早期に感染を発見し、治療することが可能となる。例えばラムダファージの特定の塩基配列に適用できる。   According to the present invention, since only a polynucleotide represented by a specific base sequence is amplified, the detection sensitivity is improved, and a specific base sequence can be detected quickly. This rapid detection enables early detection and treatment of an infection caused by a virus represented by a specific nucleotide sequence. For example, it can be applied to a specific base sequence of lambda phage.

実施例１ 固体支持体の作成
３ｍｍ角のシリコン基板にダイヤモンドライクカーボン層をコーティングし、カルボキシル基で修飾後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性エステル化し、固体支持体を作製した。 Example 1 Preparation of Solid Support A 3 mm square silicon substrate was coated with a diamond-like carbon layer, modified with a carboxyl group, and then active esterified with N-hydroxysuccinimide to prepare a solid support.

実施例２ プローブ固定化担体
ラムダファージの５００ｂｐのＤＮＡ（配列番号１）の塩基配列のうち、６０塩基を選択し、プローブを合成した（配列番号４）。
配列番号１：gatgagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcccttcggggccattgtttctctgtggaggagtccatgacgaaagatgaactgattgcccgtctccgctcgctgggtgaacaactgaaccgtgatgtcagcctgacggggacgaaagaagaactggcgctccgtgtggcagagctgaaagaggagcttgatgacacggatgaaactgccggtcaggacacccctctcagccgggaaaatgtgctgaccggacatgaaaatgaggtgggatcagcgcagccggataccgtgattctggatacgtctgaactggtcacggtcgtggcactggtgaagctgcatactgatgcacttcacgccacgcgggatgaacctgtggcatttgtgctgccgggaacggcgtttcgtgtctctgccggtgtggcagccgaaatgacagagcgcggcctggccagaatgcaataacgggaggcgctgtggctgatttcgataacc Example 2 Of the base sequence of 500 bp DNA (SEQ ID NO: 1) of probe-immobilized carrier lambda phage, 60 bases were selected to synthesize a probe (SEQ ID NO: 4).
SEQ ID NO: 1: gatgagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcccttcggggccattgtttctctgtggaggagtccatgacgaaagatgaactgattgcccgtctccgctcgctgggtgaacaactgaaccgtgatgtcagcctgacggggacgaaagaagaactggcgctccgtgtggcagagctgaaagaggagcttgatgacacggatgaaactgccggtcaggacacccctctcagccgggaaaatgtgctgaccgg acatgaaaatgaggtgggatcagcgcagccggataccgtgattctggatacgtctgaact ggtcacggtcgtggcactggtgaagctgcatactgatgcacttcacgccacgcgggatgaacctgtggcatttgtgctgccgggaacggcgtttcgtgtctctgccggtgtggcagccgaaatgacagagcgcggcctggccagaatgcaataacgggaggcgctgtggctgatttcgataacc

配列番号４は、上記配列番号１における下線の箇所に等しい。
配列番号４：acatgaaaatgaggtgggatcagcgcagccggataccgtgattctggatacgtctgaact SEQ ID NO: 4 is equal to the underlined position in SEQ ID NO: 1 above.
Sequence number 4: acatgaaaatgaggtgggatcagcgcagccggataccgtgattctggatacgtctgaact

４μＬのプローブにスポットソリューションを添加し（ＤＮＡ濃度：５μＭ）、スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト社製）で実施例１で製造した固体支持体上にスポットを行った。また、各ＤＮＡについても同様にスポットを行った。８０℃で1時間ベーキングを行った。２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（室温）で１５分間洗浄した後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（９５℃）で５分間洗浄した。続いて、超純水でリンスし、遠心乾燥を行った。   A spot solution was added to 4 μL of the probe (DNA concentration: 5 μM), and spotting was performed on the solid support manufactured in Example 1 with a spotter SPBIO2000 (manufactured by Hitachi Soft). In addition, spotting was similarly performed for each DNA. Baking was performed at 80 ° C. for 1 hour. The plate was washed with 2 × SSC / 0.2% SDS (room temperature) for 15 minutes, and then washed with 2 × SSC / 0.2% SDS (95 ° C.) for 5 minutes. Subsequently, rinsing with ultrapure water and centrifugal drying were performed.

スポット配置を図１に示す。各スポット位置にスポットした試料は以下のとおりである。
（１）リバースプライマー（配列番号３）
（２）６０ｍｅｒ合成ポリヌクレオチドプローブ（配列番号４）
（３）５００ｂｐ ＰＣＲ産物（配列番号１）
（４）ラムダファージゲノムＤＮＡ The spot arrangement is shown in FIG. Samples spotted at each spot position are as follows.
(1) Reverse primer (SEQ ID NO: 3)
(2) 60mer synthetic polynucleotide probe (SEQ ID NO: 4)
(3) 500 bp PCR product (SEQ ID NO: 1)
(4) Lambda phage genomic DNA

実施例３ 非対称ＰＣＲ
ラムダファージゲノムＤＮＡをテンプレートとして、１ｍＭ Ｃｙ５‐ｄＣＴＰを１μＬ添加し非対称ＰＣＲを行い、Ｃｙ５を取り込んだ。非対称ＰＣＲにおいて遺伝子を特異的に増幅するために用いたプライマーは以下のとおりである。なお、Ｒｖはリバースプライマーを、Ｆｗはフォワードプライマーを表す。
Ｆｗ：５’−ggttatcgaaatcagccacagcgcc−３’（配列番号２）
Ｒｖ：５’−gatgagttcgtgtccgtacaact−３’（配列番号３） Example 3 Asymmetric PCR
Using lambda phage genomic DNA as a template, 1 μL of 1 mM Cy5-dCTP was added and asymmetric PCR was performed to incorporate Cy5. Primers used to specifically amplify genes in asymmetric PCR are as follows. Rv represents a reverse primer, and Fw represents a forward primer.
Fw: 5′-ggttatcgaaatcagccacagcgcc-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
Rv: 5′-gatgagttcgtgtccgtacaact-3 ′ (SEQ ID NO: 3)

リバースプライマー濃度はフォワードプライマー濃度の１／１０とし、以下の組成でＰＣＲ溶液を調製した。
テンプレートＤＮＡ（１μｇ/ｍＬラムダファージゲノムＤＮＡ） ０．５μＬ
２０ｐｍｏｌ／μＬフォワードプライマー ０．５μＬ
２０ｐｍｏｌ／μＬリバースプライマー ０．０５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（−ｄＣＴＰ） ５μＬ
１ｍＭ ｄＣＴＰ １μＬ
１ｍＭ Ｃｙ３−ｄＣＴＰ １μＬ
×１０ＰＣＲバッファー ５μＬ
Ｈ_２Ｏ ３７μＬ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ０．２μＬ The reverse primer concentration was 1/10 of the forward primer concentration, and a PCR solution was prepared with the following composition.
Template DNA (1 μg / mL lambda phage genomic DNA) 0.5 μL
20 pmol / μL forward primer 0.5 μL
20 pmol / μL reverse primer 0.05 μL
2.5 mM dNTP (-dCTP) 5 μL
1 mM dCTP 1 μL
1 mM Cy3-dCTP 1 μL
× 10 PCR buffer 5 μL
H ₂ O 37 μL
Taq DNA polymerase 0.2 μL

また、コントロールとして、通常のＰＣＲ反応と同様にリバースプライマーを０．５μＬとしたものも調製した。ＰＣＲ反応は、以下の条件で行い、（１）〜（３）を４０サイクル行った。
９４℃：７分
９４℃：３０秒（１）
５５℃：３０秒（２）
７２℃：３０秒（３）
７２℃：１分
４℃：∞
得られた非対称ＰＣＲ反応液（５０μＬ）をそのままハイブリダイゼーションに用いた。 As a control, a reverse primer of 0.5 μL was prepared in the same manner as in a normal PCR reaction. The PCR reaction was performed under the following conditions, and (1) to (3) were performed for 40 cycles.
94 ° C: 7 minutes 94 ° C: 30 seconds (1)
55 ° C: 30 seconds (2)
72 ° C: 30 seconds (3)
72 ° C: 1 minute 4 ° C: ∞
The obtained asymmetric PCR reaction solution (50 μL) was directly used for hybridization.

実施例４ ハイブリダイゼーション
実施例３で得られた非対称ＰＣＲ反応液と実施例２で製造したプローブ固定化固体支持体をＰＣＲチューブに入れ、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡＢＩ社製）で５０℃、１時間ハイブリダイゼーションを行った。 Example 4 Hybridization The asymmetric PCR reaction solution obtained in Example 3 and the probe-immobilized solid support prepared in Example 2 were placed in a PCR tube and heated at 50 ° C. for 1 hour using a thermal cycler GeneAmp9700 (manufactured by ABI). Hybridization was performed.

反応液中から固体支持体を取り出し、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した。２×ＳＳＣでリンスした後、遠心乾燥を行った。蛍光スキャナーＦＬＡ８０００（富士写真フィルム社製）で蛍光画像をスキャンした。非対称ＰＣＲ産物（非対称ＰＣＲ反応液）をターゲットとした結果を図２左に、対称ＰＣＲ産物をターゲットとした結果を図２右に示す。   The solid support was removed from the reaction solution and washed with 2 × SSC / 0.2% SDS. After rinsing with 2 × SSC, centrifugal drying was performed. The fluorescence image was scanned with a fluorescence scanner FLA8000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.). The results of targeting an asymmetric PCR product (asymmetric PCR reaction solution) are shown on the left of FIG. 2, and the results of targeting a symmetric PCR product are shown on the right of FIG.

図２の結果から、非対称ＰＣＲ産物をターゲット試料とした場合、配列番号４で表される塩基配列をもつ６０ｍｅｒのポリヌクレオチドプローブのスポットで、高感度に検出することができた。   From the results of FIG. 2, when an asymmetric PCR product was used as a target sample, it was possible to detect with high sensitivity at a spot of a 60-mer polynucleotide probe having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.

本発明により、１本鎖ＤＮＡをプローブとし、かつ非対称ＰＣＲ産物をターゲットとしてハイブリダイズを実施することにより、高感度な検出が可能になり、ハイブリダイゼーションの時間を短縮できることが明らかとなった。   According to the present invention, it has been clarified that by performing hybridization using a single-stranded DNA as a probe and an asymmetric PCR product as a target, highly sensitive detection is possible and the hybridization time can be shortened.

実施例５ 非対称ＰＣＲ−ハイブリダイゼーションの連続反応
上記、実施例２で製造したプローブ固定化固体支持体を、実施例３と同様に調製した非対称ＰＣＲ反応液と共にチューブに入れ、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＡＢＩ社製）を用いて、以下の条件で反応を行い、（１）〜（３）を４０サイクル行った。
９４℃：７分
９４℃：３０秒（１）
５５℃：３０秒（２）
７２℃：３０秒（３）
７２℃：１分
９４℃：５分
５０℃：３０分 Example 5 Continuous Reaction of Asymmetric PCR-Hybridization The probe-immobilized solid support produced in Example 2 above was placed in a tube together with the asymmetric PCR reaction solution prepared in the same manner as in Example 3, and the thermal cycler GeneAmp9700 (ABI). The product was reacted under the following conditions, and (1) to (3) were performed 40 cycles.
94 ° C: 7 minutes 94 ° C: 30 seconds (1)
55 ° C: 30 seconds (2)
72 ° C: 30 seconds (3)
72 ° C: 1 minute 94 ° C: 5 minutes 50 ° C: 30 minutes

反応液中から固体支持体を取り出し、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した。２×ＳＳＣでリンスした後、遠心乾燥を行った。蛍光スキャナーＦＬＡ８０００（富士写真フィルム社製）で蛍光画像をスキャンした。結果を図３に示す。   The solid support was removed from the reaction solution and washed with 2 × SSC / 0.2% SDS. After rinsing with 2 × SSC, centrifugal drying was performed. The fluorescence image was scanned with a fluorescence scanner FLA8000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.). The results are shown in FIG.

図３の結果より、配列番号４で表される塩基配列からなる６０ｍｅｒのＤＮＡのスポットでシグナルを検出することができたことから、非対称ＰＣＲ反応液中にプローブを固定化した固体支持体を入れて、非対称ＰＣＲ反応−ハイブリダイズ反応を連続して実施できることが明らかとなった。   From the results shown in FIG. 3, it was possible to detect a signal with a 60-mer DNA spot consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. Therefore, a solid support on which the probe was immobilized was placed in an asymmetric PCR reaction solution. Thus, it was revealed that the asymmetric PCR reaction-hybridization reaction can be carried out continuously.

また、非対称ＰＣＲ反応中に、固定化した６０ｍｅｒのポリヌクレオチドプローブとＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションが同時に行なわれたことが示唆される。このことから、固定化した６０ｍｅｒのＤＮＡをプライマーとして伸長反応が行なわれたと考えられる。   Further, it is suggested that hybridization between the immobilized 60-mer polynucleotide probe and the PCR product was simultaneously performed during the asymmetric PCR reaction. From this, it is considered that the extension reaction was performed using the immobilized 60-mer DNA as a primer.

本発明により、非対称ＰＣＲ反応−ハイブリダイズ反応を同時に行なうことができ、操作工程の省略化および、反応時間の短縮を実現できることが明らかとなった。   According to the present invention, it has been clarified that an asymmetric PCR reaction-hybridization reaction can be carried out at the same time, and the operation steps can be omitted and the reaction time can be shortened.

実施例６ プライマー濃度比の検討
非対称ＰＣＲにおいて目的とする核酸を増幅することができるプライマー濃度比を明らかにするために、非対称ＰＣＲ反応用溶液を以下の組成で調製した。
テンプレートＤＮＡ（５５ｐｇ／μＬ ラムダファージゲノムＤＮＡ） １μＬ
１０×ＰＣＲバッファー ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ
２０μＭ フォワードプライマー ０．５μＬ
リバースプライマー ０．５μＬ
Ｈ_２Ｏ ３８μＬ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ０．２μＬ Example 6 Examination of Primer Concentration Ratio In order to clarify the primer concentration ratio capable of amplifying the target nucleic acid in asymmetric PCR, an asymmetric PCR reaction solution was prepared with the following composition.
Template DNA (55 pg / μL lambda phage genomic DNA) 1 μL
10 × PCR buffer 5 μL
2.5 mM dNTP 5 μL
20μM forward primer 0.5μL
Reverse primer 0.5μL
H ₂ O 38 μL
Taq DNA polymerase 0.2 μL

このときリバースプライマーの濃度は０．２μＭ、１μＭ、２μＭ、１０μＭ、２０μＭに調製した。フォワードプライマー、リバースプライマーの配列を以下に示す。
Ｆｗ：5’-ggttatcgaaatcagccacagcgcc-3’（配列番号２）
Ｒｖ：5’-gatgagttcgtgtccgtacaact-3’（配列番号３）
ＰＣＲ反応は、以下の条件で行い、（１）〜（３）を４０サイクル行った。
９４℃：７分
９４℃：３０秒（１）
５５℃：３０秒（２）
７２℃：３０秒（３）
７２℃：１分
４℃：∞ At this time, the concentration of the reverse primer was adjusted to 0.2 μM, 1 μM, 2 μM, 10 μM, and 20 μM. The sequences of forward primer and reverse primer are shown below.
Fw: 5'-ggttatcgaaatcagccacagcgcc-3 '(SEQ ID NO: 2)
Rv: 5′-gatgagttcgtgtccgtacaact-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
The PCR reaction was performed under the following conditions, and (1) to (3) were performed for 40 cycles.
94 ° C: 7 minutes 94 ° C: 30 seconds (1)
55 ° C: 30 seconds (2)
72 ° C: 30 seconds (3)
72 ° C: 1 minute 4 ° C: ∞

非対称ＰＣＲ反応液に５μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。１．２％のアガロースゲルに１０μＬずつアプライし、１００Ｖで３０分間、電気泳動を行なった。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで５分間、染色を行なった。ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム社製）を用いて４７０ｎｍの励起波長を照射し、蛍光を観察した。結果を図４に示す。このときレーンＭは分子量マーカーｐＨＹ（タカラバイオ）を示しており、レーン１からレーン５はリバースプライマーの濃度をそれぞれ
レーン１ ０．２μＭ
レーン２ １μＭ
レーン３ ２μＭ
レーン４ １０μＭ
レーン５ ２０μＭ
として得られた非対称ＰＣＲ産物（非対称ＰＣＲ反応液）を示している。 5 μL of 10 × loading buffer was added to the asymmetric PCR reaction. 10 μL each was applied to a 1.2% agarose gel and electrophoresed at 100 V for 30 minutes. Staining was performed with SYBR Green I for 5 minutes. Fluorescence was observed by irradiating an excitation wavelength of 470 nm using LAS1000 (Fuji Photo Film). The results are shown in FIG. In this case, lane M shows the molecular weight marker pHY (Takara Bio), and lanes 1 to 5 show the concentration of the reverse primer in lane 1 0.2 μM, respectively.
Lane 2 1 μM
Lane 3 2 μM
Lane 4 10 μM
Lane 5 20 μM
Shows the asymmetric PCR product (asymmetric PCR reaction solution) obtained.

図４の結果から、リバースプライマーの濃度比１／１０以上で、非対称ＰＣＲを用いたＤＮＡの増幅が可能であることがわかった。以上からプライマー濃度比１／１０以上で増幅された非対称ＰＣＲ産物は、基板上のＤＮＡとハイブリダイズさせることで容易に検出できることが明らかとなった。   From the results shown in FIG. 4, it was found that DNA amplification using asymmetric PCR was possible at a reverse primer concentration ratio of 1/10 or more. From the above, it was revealed that an asymmetric PCR product amplified at a primer concentration ratio of 1/10 or more can be easily detected by hybridizing with DNA on a substrate.

実施例２におけるスポット配置を表す。The spot arrangement | positioning in Example 2 is represented. 実施例４でハイブリダイゼーション反応を行った後、蛍光画像をスキャンした結果を表す。The result of having scanned the fluorescence image after performing hybridization reaction in Example 4 is represented. 実施例５で反応を行った後、蛍光画像をスキャンした結果を示す。The result of having performed reaction in Example 5 and scanning the fluorescence image is shown. 実施例６で非対称ＰＣＲ反応を行った後、アガロースゲル電気泳動を行った結果を表す。The result of having performed agarose gel electrophoresis after performing asymmetric PCR reaction in Example 6 is shown.

配列番号２〜４：合成ＤＮＡ SEQ ID NOs: 2-4: Synthetic DNA

Claims (10)

被検体中の特定の塩基配列で表される核酸を検出する方法であって、
被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、該試料に対して、前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部を特異的に増幅しうるように設計されたポリヌクレオチドのセットをプライマーとして用いて非対照ＰＣＲを行い、非対称ＰＣＲで用いる反応液中にポリヌクレオチドプローブを添加してハイブリダイズ反応を行い、ハイブリダイゼーションの有無によって増幅断片の有無を検出することを含む、前記検出方法。 A method for detecting a nucleic acid represented by a specific base sequence in a subject,
A polynucleotide designed to prepare a sample containing a test nucleic acid from a specimen and specifically amplify all or part of the nucleic acid represented by the specific base sequence with respect to the sample. Performing non-control PCR using the set as a primer, adding a polynucleotide probe to a reaction solution used in asymmetric PCR, performing a hybridization reaction, and detecting the presence or absence of an amplified fragment based on the presence or absence of hybridization, Detection method. 非対称ＰＣＲ反応中の少なくとも一部の時間帯において反応液にポリヌクレオチドプローブを存在させてプローブの伸長反応とハイブリダイズ反応を行う、請求項１記載の検出方法。   The detection method according to claim 1, wherein a polynucleotide probe is present in the reaction solution in at least a part of the time during the asymmetric PCR reaction, and the probe extension reaction and the hybridization reaction are performed. 前記特定の塩基配列で表される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして用いる、請求項１又は２記載の検出方法。   The detection method according to claim 1 or 2, wherein a polynucleotide that specifically hybridizes to all or part of the nucleic acid represented by the specific base sequence is used as a probe. 前記ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。   The said polynucleotide probe is designed so that it may couple | bond with the specific site | part of the single stranded amplified fragment amplified by asymmetric PCR, and it may not couple | bond with the primer of asymmetric PCR. Detection method. 前記特定の塩基配列が、配列番号１で表されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の検出方法。   The said specific base sequence is represented by sequence number 1, The detection method of any one of Claims 1-4 characterized by the above-mentioned. 被検体から被検核酸を含有する試料を調製し、配列番号１で表される塩基配列で特定される核酸の全部又は一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いることにより、被検体中にラムダファージが存在するか否かを判別する、請求項５記載の検出方法。   By preparing a sample containing a test nucleic acid from a test sample and using a polynucleotide probe that specifically hybridizes to all or part of the nucleic acid specified by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, The detection method according to claim 5, wherein it is determined whether or not lambda phage is present therein. 配列番号１で表される塩基配列のうち少なくとも２５７〜３１６番の塩基を含む塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドプローブ。   A polynucleotide probe comprising a base sequence comprising at least bases 257 to 316 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof. 請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法において使用するための、担体上にポリヌクレオチドプローブが固定化されたプローブ固定化担体であって、ポリヌクレオチドプローブが、非対称ＰＣＲにより増幅された一本鎖増幅断片の特定部位と結合し、かつ非対称ＰＣＲのプライマーとは結合しないように設計される、前記プローブ固定化担体。   A probe-immobilized carrier in which a polynucleotide probe is immobilized on a carrier for use in the detection method according to any one of claims 1 to 3, wherein the polynucleotide probe is amplified by asymmetric PCR. The probe-immobilized carrier designed to bind to a specific site of a single-stranded amplified fragment and not to bind to a primer for asymmetric PCR. 担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体である、請求項８記載のプローブ固定化担体。   The probe immobilization according to claim 8, wherein the carrier is a solid support having a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid on a substrate and at least one surface layer selected from diamond, soft diamond, a carbon-based material, and carbide. Carrier. 請求項７に記載のポリヌクレオチドプローブを含む、ラムダファージを検出するためのキット。   A kit for detecting lambda phage comprising the polynucleotide probe according to claim 7.

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