JP4808363B2 - 新規ポリペプチド及びこれを含む抗hiv剤 - Google Patents
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Description
本発明は、新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを有効成分とする抗HIVウイルス剤等の医薬に関する。
カブトガニ(Tachypleus属、Limulus属並びにCarcinoscopius属)から分離されたエンドトキシン親和性ポリペプチドの抗ウイルス活性(特開平2−167230号及び特表平2−500194号)が見出されて以来、これらの化学修飾、低分子量化及び上記ポリペプチドの構造を一部改変して新規な抗ウイルス性ポリペプチドの合成が試みられている(WO92/04374、特開平5−163298及び特表平8−504837)。最近、新規な低分子量抗ウイルス性ポリペプチドT134及びT140が、細胞毒性が低く、優れた抗HIVウイルス活性を有するポリペプチドであることが見出された(H.Tamamuraら;Biochemical and Biophysical Research Commun.,253,877−882(1998))。しかしながら、これらのT134及びT140も、医薬として用いるには満足できるものではなかった。
したがって、本発明の目的は優れた抗HIVウイルス活性を有し、且つ細胞毒性が低いポリペプチドを提供することである。
本発明者は上記課題の解決に鑑み、鋭意探索を行った。その結果、従来よりCXCR4リガンドに特異的に結合してHIVの感染を阻害することが知られていたT140のアミノ酸配列を基に、一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した新たなポリペプチドが優れた抗HIVウイルス活性を有し、かつ細胞毒性が低いことを見い出して本発明を完成した。
発明の開示
すなわち本発明は下記式(I)
(式中、
A1は、水素原子或いはアルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン若しくはアラニン残基、又はこれらのアミノ酸のN−α置換誘導体残基を表し;
A2は、芳香族アミノ酸残基を表し;
A3、A4及びA6は、独立して、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン又はアラニン残基を表し;
A5は、チロシン、フェニルアラニン、アラニン、ナフチルアラニン又はシトルリン残基を表し;
A7は、カルボキシル基がアミド化されていてもよい、リジン又はアルギニン残基を表し;
Xは、下記式(a):
(式中、
A8及びA12は、独立して、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、又はメチオニン残基を表し;
A9は、芳香族アミノ酸残基を表し、A10は、A3と同一のアミノ酸残基から選択され、A11は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン又はメチオニン残基を表すが、但し、1′位と6′位が共にシステイン残基である場合には、これらは、ジスルフィド結合により連結していても良い)で示されるペプチド残基、或いはD−オルニチル−プロリン、プロリル−D−オルニチン、D−リジル−プロリン、プロリル−D−リジン、D−アルギニル−プロリン、プロリル−D−アルギニン、D−シトルリル−プロリン、D−シトルリル−アラニン、D−アラニル−シトルリン、プロリル−D−シトルリン、グリシル−オルニチン、オルニチル−グリシン、グリシル−リジン、リジル−グリシン、グリシル−アルギニン、アルギニル−グリシン、グリシル−シトルリン、シトルリル−グリシン、D−アラニル−プロリン、及びD−リジル−アラニンからなる群より選択されるペプチド残基であり、該ペプチド残基の構成アミノ酸であるD−アルギニン、L−アルギニン、D−リジン、L−リジン、D−オルニチン又はL−オルニチンの側鎖ω−アミノ基の水素原子はω−アミノアシル基で置換されていてもよく、これらペプチド残基は7位と9位のアミノ酸残基をペプチド結合を介して連結しているペプチド残基を示し;
上記式中、Argはアルギニン残基を示し、Cysはシステイン残基を示し、Tyrはチロシン残基を示し、Citはシトルリン残基を示し、Glyはグリシン残基を示し、4位と12位のシステイン残基はジスルフィド結合により連結していても良く;
但し、上記ポリペプチド又はその塩においては
A1、A3、A4、A5、A6及びA7のいずれかのアミノ酸残基がアラニン若しくはシトルリン残基であるか、又は;
XがD−シトルリン、D−アラニン、シトルリン、若しくはアラニン残基を含むペプチド残基である)で示されるポリペプチド又はその塩に関する。
本発明の式(I)のポリペプチドにおいて、A1は、好ましくはアルギニン、アラニン又はシトルリン残基であり;A2は好ましくはトリプトファン又はナフチルアラニン残基であり;A3は好ましくはアルギニン、アラニン又はシトルリン残基であり;A4は、好ましくは、リジン、アラニン又はシトルリン残基であり;Xは好ましくは、D−リジル−プロリン、D−アラニル−プロリン、D−リジル−アラニン又はD−シトルリル−プロリン残基であり;A5は、好ましくはチロシン又はアラニン残基であり;A6は好ましくはアルギニン、アラニン又はシトルリン残基であり;A7は好ましくはアルギニン残基である。
本発明の最も好ましいポリペプチドの具体例は、A1、A6及びA7がアルギニン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A3がシトルリン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−リジル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基である式(I)のポリペプチド、A1、A3、A6及びA7がアルギニン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−シトルリル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基である式(I)のポリペプチド、A1、A6及びA7がアルギニン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A3がシトルリン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−シトルリル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基である式(I)のポリペプチド、及びA1がシトルリン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A3、A6及びA7がアルギニン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−シトルリル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基である式(I)のポリペプチドである。
本発明の好ましいポリペプチドの他の態様としては、A1、A6及びA7がアルギニン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A3がアラニン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−リジル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基である式(I)のポリペプチド、A1がシトルリン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A3、A6及びA7がアルギニン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−リジル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基である式(I)のポリペプチド、A1、A3及びA7がアルギニン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−リジル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基であり、A6がシトルリン残基である式(I)のポリペプチド、A1及びA3がシトルリン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−リジル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基であり、A6及びA7がアルギニン残基である式(I)のポリペプチド、及びA1、A3及びA7がアルギニン残基であり、A2がナフチルアラニン残基であり、A4がリジン残基であり、XがD−シトルリル−プロリン残基であり、A5がチロシン残基であり、A6がシトルリン残基である式(I)のポリペプチドが例示される。
尚、本発明のポリペプチドにおいてA7のアミノ酸は、ポリペプチドの血清中等生体内における安定性の向上の点から、カルボキシル基がアミド化されていることが好ましい。
本発明のポリペプチドの代表的具体例を、公知のT134及びT140のポリペプチドと合わせて下記表1に示した。
上記式のポリペプチドにおいて各記号は国際的に認められた三文字表示によるアミノ酸残基であり、該三文字の前に「D」を付したD−アミノ酸以外は全てL−アミノ酸を示し、NalはL−3−(2−ナフチル)アラニンを表し、Citは、L−シトルリン〔=2−アミノ−5−ウレイドバレリアン酸〕を表す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の式(I)のポリペプチドは、ポリペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法、液相ペプチド合成法などによって製造することができる。例えば、固相合成法では、A7に対応するアミノ酸のα−アミノ基を9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基等のウレタン型保護基で保護したN−保護アルギニン(又はリジン)のカルボキシル基を、場合によりカルボキシル基と結合し得るスペーサーを介して(すなわち、アルギニン(又はリジン)のカルボキシル基をp−カルボキシメチルベンジルエステルに変換して)、不溶性樹脂に結合させた後、α−アミノ基の保護基を除去し、N−保護システインを結合反応させ、以下同様にアミノ末端方向に順次アミノ基を縮合させることによって製造することができる。すなわち、下記式(I)で示されるアミノ酸配列の12位から1位に対応する保護アミノ酸を固相合成法に従って順次結合し、次いで不溶性樹脂及び各アミノ酸に結合した保護基を脱離させて、直鎖状の前記式(I)の本発明のポリペプチドを得ることができる。更に、得られたポリペプチドは、その4位と12位の2つのシステインは、メルカプト基を介してジスルフィド結合(−S−S−)を形成することができる。
(式中、
A1は、水素原子或いはアルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン若しくはアラニン残基、又はこれらのアミノ酸のN−α置換誘導体残基を表し;
A2は、芳香族アミノ酸残基、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はナフチルアラニン残基を表し;
A3、A4及びA6は、独立して、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン又はアラニン残基を表し;
A5はチロシン、フェニルアラニン、アラニン、ナフチルアラニン又はシトルリン残基を表し;
A7は、カルボキシル基がアミド化されていてもよい、リジン又はアルギニン残基を表し;
Xは、下記式(a):で表されるペプチド残基
(式中、
A8又はA12は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、又はメチオニン残基を表し;
A9は、芳香族アミノ酸残基を表し、A10は、A3と同一のアミノ酸残基から選択され、
A11は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン又はメチオニン残基を示すが、但し、1′位と6′位が共にシステイン残基である場合にはこれらはジスルフィド結合により連結していても良い)で示されるペプチド残基、或いはD−オルニチル−プロリン、プロリル−D−オルニチン、D−リジル−プロリン、プロリル−D−リジン、D−アルギニル−プロリン、プロリル−D−アルギニン、D−シトルリル−プロリン、プロリル−D−シトルリン、D−シトルリル−アラニン、D−アラニル−シトルリン、グリシル−オルニチン、オルニチル−グリシン、グリシル−リジン、リジル−グリシン、グリシル−アルギニン、アルギニル−グリシン、グリシル−シトルリン、シトルリル−グリシン、D−アラニル−プロリン、及びD−リジル−アラニンからなる群より選択されるペプチド残基であり、該ペプチド残基の構成アミノ酸であるD−アルギニン、L−アルギニン、D−リジン、L−リジン、D−オルニチン又はL−オルニチンの側鎖ω−アミノ基の水素原子はω−アミノアシル基で置換されていてもよく、これらペプチド残基は7位と9位のアミノ酸残基をペプチド結合を介して連結しているペプチド残基を示し;
上記式中、Argはアルギニン残基を示し、Cysはシステイン残基を示し、Tyrはチロシン残基を示し、Citはシトルリン残基を示し、Glyはグリシン残基を表し;
上記ポリペプチド又はその塩においては
A1、A3、A4、A5、A6及びA7のいずれかのアミノ酸残基がアラニン又はシトルリン残基であるか、又は;
XがD−シトルリン、D−アラニン、シトルリン、又はアラニン残基を含むペプチド残基である)。
前記のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、C末端のN−保護アルギニン(又はリジン)のカルボキシル基又は場合によりこれに結合しているスペーサー(架橋基)と結合可能であり、且つ、ポリペプチド合成後脱離可能なものであれば如何なるものでもよい。
このような不溶性樹脂としては、例えば、アルコ樹脂(p−ベンジルオキシアルコール樹脂)、ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチルフェノーキシメチル樹脂、Fmoc−NH−SAL樹脂〔(4−(2′,4′−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノエチル)フェノキシリンカー樹脂)、H.Rink,Tetrahedron Lett.,28:3787(1987),0.68mmole/g〕及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの樹脂を用いれば開裂によっていずれも直接目的物を与えるが、収率の点からはアルコ樹脂又はFmoc−NH−SAL樹脂が好ましい。
前述の、場合によりC末端のアミノ酸のカルボキシル基と結合しているスペーサーとしてはカルボキシル基と結合しうる官能基及びカルボキシル基を有するスペーサーが挙げられ、例えばアルギニン(又はリジン)のカルボキシル基をp−カルボキシメチルベンジルエステルに変換しうるものが挙げられるが特に制限はない。
本発明のポリペプチドの合成に用いる保護アミノ酸とは官能基を既知の方法により保護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されている。本発明のポリペプチドを合成する場合には、以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基としてはBoc(t−ブチルオキシカルボニル)又はFmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)が好ましい。アルギニン(Arg)のグアニジノ基の保護基としてはTos(トシル)、NO2(ニトロ)、Mtr(4−メトキシ−2,3,6−トリメトチルベンゼンスルホニル)、Pmc(2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル)又はPbf(2,2,4,6,7−ペンタヒドロキシジヒドロベンゾフラン−6−スルホニル)が好ましい。システイン(Cys)のメルカプト基の保護基としてはBzl(ベンジル)、4−MeOBzl(4−メトキシベンジル)、4−MeBzl(4−メチルベンジル)、Acm(アセタミドメチル)、Trt(トリチル)、Npys(3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル)、t−Bu(t−ブチル)、t−BuS(t−ブチルチオ)が挙げられるが、4−MeBzl、Acm、Npysが好ましい。チロシン(Tyr)の水酸基の保護基としてはBzl、Cl2Bzl(2,6−ジクロロベンジル)、t−Buが挙げられるが、保護しなくてもよい。リジン(Lys)のεアミノ基の保護基としてはZ(ベンジルオキシカルボニル)、2−ClZ(2−クロロベンジルオキシカルボニル)、Boc、Npysが挙げられる。各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適当なものをそれ自体既知の保護基の中から選択することが好ましい。
ペプチド合成に際し、保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)法、DIPCDI(ジイソプロピルカルボジイミド)法〔Tartar,A.ら:J.Org.Chem.44,5000(1979)〕、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイミダゾール法、DCC−HOBt(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)法〔Keonig,W.ら:Chem.Ber.,103,788,2024,2034(1970)〕、ジフェニルホスホリルアジド法等に従って行なうことができるが、DCC法、DCC−HOBt法、DIPCDI−HOBt法、対称酸無水物法が好ましい。これらの縮合反応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒又はこれらの混合溶媒中で行なわれる。α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン、HCl/ジオキサン、ピペリジン/ジメチルホルムアミド等が用いられ、該保護基の種類により適宜選択する。また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度は、E.カイサーらの方法〔Anal,Biochem.,34,595(1970)〕(ニンヒドリン反応法)により調べることができる。
上記のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを得ることができる。
不溶性樹脂としてアミノメチル樹脂誘導体を用いた場合には、例えば適当な溶媒中においてアンモニアで処理することにより該樹脂から保護ポリペプチドを脱離させることができる。次いで、フッ化水素で処理することにより、前記式で示される、全ての保護基が脱離したポリペプチドアミドが得られる。不溶性樹脂としてベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチルフェノキシメチル樹脂、DMBHA樹脂〔Funakoshi.S.ら;J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,1988,382〕を用いた場合には、フッ化水素、TFMSA(トリフルオロメタンスルホン酸)〔Academic Press発行、E.Gross編集、Yajima,H.;“The Peptides”vol 5,P65(1983)〕、TMSOTf(トリメチルシリルトリフラート)〔Fujii,N.ら;J.Chem.Soc.,Che.Commun.,1987、274〕又はTMSBr(トリメチルシリルブロミド)〔Fujii、Nら;Chem.Pharm.Bull.,35,3880(1987)〕などで処理することにより、該樹脂及び保護基を同時に脱離させることができる。
次いで、所望により、2−メルカプトエタノール、DTT(ジチオスレイトール)などで還元することによりシステインのメルカプト基を還元型とした後、酸化処理することによりジスルフィド結合を形成させ、環状ポリペプチドを得ることができる。
この際の酸化処理は、既知の方法を用いることができ、通常、大気中の酸素やフェリシアン酸塩(例えば、フェリシアン化カリウム)のような酸化剤を用いる。
尚、上記ポリペプチドが樹脂に結合した状態で、抗HIV物質を結合させ、本発明のポリペプチドと抗HIV物質の複合体とすることができる。上記抗HIV物質としては、例えば、逆転写酵素阻害剤やHIVプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。
上記逆転写酵素阻害剤としては、HIVの逆転写酵素の活性を阻害する物質であって、ヌクレオシド系及び非ヌクレオシド系の物質が挙げられる。ヌクレオシド系の該阻害剤としては、ピリミジン塩基、プリン塩基、イミダゾール塩基又はトリアゾール塩基のいずれかの塩基と、少なくとも一つの水酸基を有するフラノース又はそのアシクロ体とから構成されるヌクレオシド又はその類縁体が好ましく、例えば、AZT(CAS REGISTRY NUMBERS:30516−87−1:ジドブジン(zidovudine))、ddI(CAS REGISTRY NUMBERS:69655−05−6:ジダノシン(didanosine))、ddC(CAS REGISTRY NUMBERS:7481−89−2:ザルシタビン(zalcitabine))、2′,3′−ジデヒドロ−2′,3′−ジデオキシチミジン(CAS REGISTRY NUMBERS:3056−17−5:d4T:スタブジン(stavudine))、3′−チア−2′,3′−ジデオキシシチジン(CAS REGISTRY NUMBERS:134678−17−4:3TC:ラミブジン(lamivudine))、2′−β−フルオロ−ddC、3′−フルオロチミジン(CAS REGISTRY NUMBERS:25526−93−6:FLT)、9−(2−ホスホニル−メトキシエチル)−アデニン(CAS REGISTRY NUMBERS:106941−25−7:PMEA)、6−Cl−ddI、6−Cl−ddC等が挙げられる。
また非ヌクレオシド系の該阻害剤としては例えば、テトラヒドロ−イミダゾ−ベンゾ−ジアゼピン−オンもしくは−チオン(TIBO)誘導体(具体的には、(+)−S−4,5,6,7−テトラヒドロ−5−メチル−6−(3−メチル−2−ブテニル)イミダゾ〔4,5,1−jk〕〔1,4〕ベンゾジアゼピン−2(1H)−チオン)(CAS REGISTRY NUMBERS:167206−29−3:R82913)、
ヒドロキシエトキシ−メチルフェニルチオチミン(HEPT)誘導体、ネビラピン(Nevirapine)(CAS REGISTRY NUMBERS:129618−40−2)、ピリジノン誘導体
等が挙げられる。
これらのうち、上記ポリペプチドとの結合の容易性とDNA中に取り込まれることによる効果的なDNA合成の阻害機序を考慮すると、ヌクレオシド系の逆転写酵素阻害剤が好ましく、ヌクレオシド系のHIV転写酵素阻害剤の中でも、好ましくはすでに臨床においてヒトに投与されているAZT、ddI、ddC、d4T又は3TCであり、より好ましくは、該ポリペプチドと化学的に結合して本発明物質とした際に特に相乗的に抗ウイルス活性が増強されるAZTである。これらのヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤等はHIVがRNAから逆転写によってDNAを合成する際にDNA中に取り込まれ、その結果DNAの合成を阻害するために非天然型ヌクレオシド又はヌクレオシドアナローグであることが好ましい。上記ヌクレオシドアナローグとは、ヌクレオシドと類似の立体構造をもつ非ヌクレオシド化合物を指す。また、これらの逆転写酵素阻害剤は、市販のものあるいは既知の合成法に従って調製したものを使用することが可能である。
また、HIVプロテアーゼ阻害剤としては、HIVのプロテアーゼの活性を阻害する物質であって、該プロテアーゼの基質遷移状態ミミック化合物である阻害剤が好ましい。基質遷移状態ミミックとは、酵素の基質結合部位に結合可能な物質で、酵素基質複合体における基質と類似の立体構造を有する物質を指す。例えば、Ro 31−8959(CAS REGISTRY NUMBERS:127779−20−8:サキナビル(saquinavir))、A−77003(CAS REGISTRY NUMBERS:134878−17−4)、A−80987(CAS REGISTRY NUMBERS:144141−97−9)、KNI−93(CAS REGISTRY NUMBERS:138258−64−7)、KNI−102(CAS REGISTRY NUMBERS:139694−65−8)、KNI−174、KNI−227(CAS REGISTRY NUMBERS:147384−69−8)、KNI−272(CAS REGISTRY NUMBERS:147318−81−8)、L−735527(CAS REGISTRY NUMBERS:150378−17−9:インジナビル(indinavir))、SC−52151(CAS REGISTRY NUMBERS:143224−34−4:テリナビル(Telinavir))、VX−478、ABT−538(CAS REGISTRY NUMBERS:155213−67−5:リトナビル(ritonavir))、DMP−323(CAS REGISTRY NUMBERS:151867−81−1)、U−96988(CAS REGISTRY NUMBERS:149394−65−0)等が挙げられる。より好ましくは高い抗ウイルス活性を有するRo 31−8959、L−735527及びKN−272が好ましいが特に限定はされない。これらHIVプロテアーゼ阻害剤としては、市販のものあるいは既知の合成法に従って調製したものを使用することができる。Ro 31−8959については例えば、J.Med.Chem.36,p2300−2310(1993)に記載の調製法が挙げられる。
上記複合体では、上記ポリペプチドと上記抗HIV活性物質とが化学的に結合しているが、その結合が化学的に形成された結合であれば特に限定はされず、具体的には、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、ジスルフィド結合等が挙げられる。これらのうちエステル結合は、結合した抗HIV活性物質が生体内の標的細胞内に運搬された後、細胞内エステラーゼ等で切断が可能な結合であり抗HIV活性物質の作用点近傍で該抗HIV活性物質を遊離しうるが、標的細胞への運搬途中においては容易に切断されることがない程度の安定性を有する結合である。したがってエステル結合が最も好ましい。
上記複合体の調製方法としては、例えばAZTなどの抗HIV物質とピリジンなどの有機溶媒中で結合させ、ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端と上記抗HIV物質との複合体を調製することも可能である。このような複合体を調製するに当たっては、例えばコハク酸やグルタル酸等のスペーサーをポリペプチドと抗HIV物質との間に使用することができる。その場合は、例えばAZTなどの抗HIV物質にジメチルアミノピリジン存在下で、コハク酸或いはグルタル酸の無水物を用いてこれらのカルボン酸をエステル結合させ、次いでその複合体と、上記樹脂に結合した状態のポリペプチドのN末端部のアミノ酸のα−アミノ基若しくはω−アミノ基とを結合させることができる。本発明のポリペプチドのアミノ末端のアルギニン残基に樹枝状のスペーサー(例えばポリリジンなど)を公知の方法により予め調製しておき、公知の方法(例えばDIPCI−HOBt法)により縮合させて結合させることがも可能である。
尚、上記抗HIV物質の結合と同様の方法により、本発明物質にポリエチレングリコール(米国特許第5342940号等)又はその誘導体、コンドロイチン等のグリコサミノグリカン(米国特許第5310881号、米国特許第4585754号等)、レシチン(米国特許第5109118号、5310958号、5362491号等)等の脂質、各種オリゴ糖を結合したスチレン誘導体ポリマー(Polym.J.,17:567,1985等)等の生体内半減期延長作用物質を結合させることで、本発明物質の生体内での半減期を延長することも可能である。
このようにして得られたポリペプチドは、それ自体既知のポリペプチドの単離精製手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー(ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相)、電気泳動、向流分配等により単離精製することができるが、とりわけ逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が最も効果的である。
また、このようにして得られたポリペプチドは、カブトガニ由来の公知のポリペプチド、T134及びT140と同様に、エンドトキシン結合能、抗菌活性、エンドトキシン感作血球溶血性、抗ウイルス活性を有していると考えられるが、殊にヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対して良好な抗ウイルス活性を示し、その細胞毒性は、従来のT134及びT140に比べて大幅に減少した。
本発明の、式(I)で示されるポリペプチドは、構成するアミノ酸の特徴から塩基性を示すので酸付加により形成した塩の形態としてもよい。例えば、式(I)で示されたポリペプチドは無機酸(塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など、)又は有機カルボン酸(酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸など)若しくは有機スルホン酸(メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸など)との塩を形成する。本発明の式(I)で示されるポリペプチドは、これらの医薬として許容し得る塩として医薬組成物の有効成分として用いることができる。
尚、式(I)のポリペプチドは、CXCR4リガンドに特異的に結合する働きを有しており、その特異性により抗HIVウイルス活性を示すと考えられるが、抗HIVウイルス剤の他にもCXCR4リガンドが関与している疾病であるガン、急性リンパ腫、骨肉腫、異所性骨形成、リウマチなどの治療のための医薬組成物として利用することもできると考えられる。
実施例
<ポリペプチドの製造>
ポリペプチドTC14005の製造
H−Arg−Arg−Nal−Cys−Tyr−Arg−Lys−DCit−Pro−Tyr−Arg−Cit−Cys−Arg−OH(TC14005)
1.TC14005保護ポリペプチド樹脂の合成
最初の14位(式(I)の13位)アルギニンを導入したアルコ樹脂のFmoc−Agr(Pbf)−OH(0.74mg/g)270mg(0.2mmol)からFmoc基を20%ピペリジン/DMFで除去後、アルコ樹脂に対し、13位(式(I)の12位)に相当するFmoc−Cys(Trt)−OH(2.5eq)を加えDMF中、DIPCDI−HOBt法により縮合反応を行った。縮合反応の進行の程度は、Kaiser.Eら(Anal.Biochem.,34:595(1970))のニンヒドリン試験により調べた。
2.12位〜1位アミノ酸の導入
以下同様にして、順次に、Cit、Arg(Pbf)、Tyr(t−Bu)、Pro、D−Cit、Lys(Boc)、Arg(Pbf)、Tyr(t−Bu)、Cys(Trt)、Nal、Arg(Pbf)、Arg(Pbf)残基をDMBHA樹脂に導入して保護基保護化ポリペプチド(I)樹脂を得た。
3.脱保護基、樹脂からのポリペプチドの分離及び精製
保護基保護化ポリペプチド(1)樹脂は、20%ピペリジン/DMF処理によりFmoc基を除去し、次いで該樹脂100mg当り1M−TMSBr−チオアニソール/TFA(トリフルオロ酢酸)系(m−クレゾール(100eq)、エタンジチオール(300eq)が存在するトリフルオロ酢酸10ml)で25℃、2時間反応させた。反応混合物から樹脂を濾別し、トリフルオロ酢酸1mlで2回洗浄し、濾液、洗液を合わせたものに氷冷乾燥エーテル100mlを加え、生じた沈殿物を遠心分離し、残査をデカンテーションにより上澄みから分離した。得られた残査を冷エーテルで洗浄し、4N酢酸10mlに溶解し、830mg(80eq)のジチオスレイトールを加え、その混合溶液を1夜攪拌した。反応溶液を遠心分離し、上澄みをセファデックスG−10(ファルマシア社製:3.7×50cm)で処理し、4N酢酸でゲル濾過し、素通り画分である主溶出部分を集め、凍結乾燥して粉末状の部分精製未環化ポリペプチドTC14005を得た。
4.空気酸化による環化
上述のポリペプチドの1/2量を濃アンモニア水でpH7.5に調整し、通気による空気酸化を行い環化させた。空気酸化終了後、環化されたポリペプチドをダイアオンHP−20樹脂(三菱化学株式会社製)10gに吸着させ、次いで60%アセトニトリル(1N酢酸中)を用いて脱着溶出した。該溶出液を室温下で減圧濃縮してアセトニトリルを除去し、更に凍結乾燥により粉末とした。更に、該粉末を水に溶解し、HPLC(コスモジール5C18ARIIカラム:アセトニトリル傾斜溶出)により精製し単一ピークのポリペプチドを得た。純度は、HPLCにより確認した。
〔α〕D(c.0.1:H2O):+42.73
イオンスプレーマススペクトル(IS−MS):(C90H140N34O19S2)
計算値:2066.43 実測値:2067
(トリプルステージ四重極型質量分析装置APIII(Perkin−Elmer ScieX)
ポリペプチドTC14012の製造
H−Arg−Arg−Nal−Cys−Tyr−Cit−Lys−DCit−Pro−Tyr−Arg−Cit−Cys−Arg−NH2(TC14012)
1.TC14012保護ポリペプチド樹脂の合成
Fmoc−NH−SAL樹脂(0.68mmole/g)1.47g(1mmole)のFmoc基を20%ピペリジン/DMFで除去後、NH−SAL樹脂に対して14位に相当するFmoc−Arg(Pbf)−OH(2.5eq)を加えDIPCDI−HOBtにより縮合反応を行った。
2.13位〜1位アミノ酸の導入
以下同様にして、順次に、Cys(Trt),Cit,Arg(Pbf),Tyr(t−Bu),Pro,D−Cit,Lys(Boc),Cit,Tyr(t−Bu),Cys(Trt),Nal,Arg(Pbf),Arg(Pbf)残基をNH−SAL樹脂に導入して官能基保護化ポリペプチド樹脂を得た。
その後、TC14005の合成の時と同様にして、脱保護基、樹脂からのポリペプチドの分離及び精製を行い、空気酸化によって環化を行ってTC14012を得た。
収量 1.432g(収率59%)
〔α〕D(c0.41:H2O):−60.67
イオンスプレーマススペクトル(IS−MS):(C90H140N34O19S2)
計算値:2066.43 実測値:2065.73
(トリプルステージ四重極型質量分析装置APIII(Perkin−Elmer ScieX)
同様にして、表1に示した本発明の他のポリペプチドを合成し、IS−MSを下記表2に示した。
なお、旋光度として、以下の値を得た。
TC14003:〔α〕D(c.0.1:H2O):0
TC14011:〔α〕D(c.0.1:H2O):−47.61
TC14018:〔α〕D(c.0.1:H2O):−25.51
TC14020:〔α〕D(c.0.1:H2O):−41.74
TN14003:〔α〕D(c.0.1:H2O):−37.09
TN14005:〔α〕D(c.0.1:H2O):−27.58
本発明のポリペプチドTC14003及びTC14005のCDスペクトルを測定した。1cmセルを用いてJ−720spectropolarimeter(JASCO社製)を用い、1nm間隔で5回測定し、5回の平均値を求め、従来のT140のCDスペクトルと一緒に図1に示した。210nm近辺のマイナスピークと197nm近辺の強いプラスピークが観察されたので、これらのペプチドがβ−シート構造を有していることが明らかとなった。
<抗HIV活性及び細胞毒性>
HIV−1に予め感染させたMOLT/HIV−1(IIIB)細胞から得られたHIV−1(IIIB)株を使用した。HIV感染させたMT−4細胞に、本発明のポリペプチドを種々の濃度で添加し、37℃で5日間培養した後の生存細胞数を3′−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリニウムブロミド(MTT)法を用いて決定した。抗HIV活性は、HIV感染によるMT−4細胞死を50%抑制する濃度(EC50値)で表す。本発明のペプチドの細胞毒性は、種々な濃度の本発明のポリペプチドをウイルス非感染MT−4細胞と共に培養し、生存細胞数をMTT法を用いて決定し、50%生存濃度で表した(試験I:CC50値)。更に、ヒト抹消血単球(PBMC)での生存数をトリパンブルー染色法により決定し、50%生存濃度でも表した(試験II:CC50値)。各CC50値とEC50値の比を、選択係数(SI)として表した。公知のポリペプチドT134及びT140、並びに医薬品と使用されている抗HIV化合物:3′−アジド−2′,3′−ジデオキシチミジン(AZT)を対照の抗HIV剤として得た値を表にまとめた。
荷電は、それぞれのペプチドの全陽荷電の数であり;全ての値は、少なくとも3回の測定値の平均値であり;NTは、試験されていないこと示す。
上記の表から、本願の化合物、特にTC14003、TC14005、TC14020、及びTN14005は、公知のT140に比べ、抗HIV活性はほぼ同等であるが、細胞毒性が大幅に低下していることが明らかである。そして、TC14011、TC14012、TC14018、TC14020、及びTN14003は、細胞毒性の低下に加え、更に高い抗HIV活性を有していることが明かである。
<血清中での安定性>
T140、又はTC14012を100nmolでネコ血清(100μL/100μL Water)に溶解し、37℃で保温した。0時間、1時間、2時間、5時間、及び16時間経過後、それぞれ8μLずつ採取し、16%アセトニトリルを使用した逆相HPLCにより解析した。その結果、T140は16時間経過時点で、約70%が分解していたのに対し、TC14012はほとんど分解が観察されなかった(図2)。
このことは本発明のポリペプチドのカルボキシル末端をアミド化することが、血清中でのポリペプチドの安定性を格段に向上することを示している。
配列表フリーテキスト
配列番号1:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号2:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、12Xaa:L−シトルリン
配列番号3:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号4:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号5:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号6:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号7:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号8:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号9:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号10:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、1Xaa:L−シトルリン、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号11:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、6Xaa:L−シトルリン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号12:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、7Xaa:L−シトルリン、8Xaa:D−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号13:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−シトルリン、12Xaa:L−シトルリン
配列番号14:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−Lys、11Xaa:L−シトルリン、12Xaa:L−シトルリン
配列番号15:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、6Xaa:L−シトルリン、8Xaa:L−Lys、12Xaa:L−シトルリン
配列番号16:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、1Xaa:L−シトルリン、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−シトルリン、12Xaa:L−シトルリン
配列番号17:カブトガニのタキプレシンファミリーポリペプチドに基づきデザインしたペプチド、3Xaa:L−3−(2−ナフチル)アラニン、8Xaa:D−シトルリン、11Xaa:L−シトルリン、12Xaa:L−シトルリン
産業上の利用可能性
本発明によれば、低細胞毒性であり、かつ高い抗HIV活性を有する新規ポリペプチドを提供できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のポリペプチドTC14003及びTC14005、並びにT140のCDスペクトルである。
図2は、本発明のポリペプチドTC14012並びにT140の血清中での安定性を示すHPCLチャートである。
Claims (6)
- TC14003、TC14005、TC14020、TN14005及びこれらの塩からなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
- TC14011、TC14012、TC14018、TN14003及びこれらの塩からなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
- TN14003又はその塩である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1から4の何れか1項に記載のペプチド又はその塩に逆転写酵素阻害剤、HIVプロテアーゼ阻害剤、または生体内半減期延長作用物質が結合した複合体。
- 有効成分として、請求項1から4の何れか1項に記載のペプチド又はその塩、或いは請求項5に記載の複合体を含む、医薬。
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