CN113376146A - 适于生物分子多重检测的检测颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种适于生物分子多重检测的检测颗粒，包括带有编码功能的微载体，所述微载体连接有检测微粒，所述检测微粒适用于进行光激化学发光检测。本发明首次制备了集编码鉴别、磁分离、光激化学发光检测功能于一体的多功能检测颗粒。首次搭建了用于多功能检测颗粒的成像检测分析装置。提供的适于生物分子多重检测的检测颗粒能够实现高灵敏、快速、免洗的多重检测方法，大大扩展了单反应可以检测的生物分子的数量，且可以做到全流程无需洗涤去除未反应的信号标记分子，简化实验步骤，提高检测效率。该方法适用于蛋白、核酸、小分子的检测。

Description

适于生物分子多重检测的检测颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种适于生物分子多重检测的检测颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
生物分子检测，特别是基于抗原-抗体识别的免疫检测和基于碱基互补配对的核酸检测，在疾病诊断、药物开发、基础生物科学研究等领域发挥着重要的作用。酶联免疫吸附反应(ELISA)技术因其高灵敏度和高特异性的优点，已经成为免疫检测的金标准技术。然而目前ELISA还存在两大挑战。一方面，典型的ELISA检测流程需要反复的分离和洗涤步骤来去除可能带来背景信号的未结合的分子。这使得该分析方法不但复杂、耗时，且多步操作会带来累积错误。所以发展一种便捷、易用的免疫分析方法将更能满足现场快速检测的需求。光激化学发光技术利用光激发后产生的单线态氧在两种微粒间的传递而产生的化学发光信号来检测待分析物，避免了传统ELISA所需的反复洗涤的步骤。但是光激化学发光技术缺乏单反应多重检测的能力。另一方面，往往有多种标志物与一种疾病相关，因此对这些标志物分子进行单反应多重检测能更准确、更灵敏、有效地进行诊断。编码微球技术利用具有唯一编码特征的微球作为反应单元来鉴别特定的靶标分子，能够实现对多重待测物在一个反应管中同时检测，但是和ELISA一样需要多步分离和繁琐的洗涤步骤，难以适应现场快速检测等应用场景的需求。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适于生物分子多重检测的检测颗粒及其制备方法与应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种适于生物分子多重检测的检测颗粒，包括带有编码功能的微载体，所述微载体连接有检测微粒，所述检测微粒适用于进行光激化学发光检测。
本发明第二方面提供一种生物分子检测***，用于同时检测多种生物分子，至少包括多个前述的适于生物分子多重检测的检测颗粒，以及匹配微粒，所述匹配微粒是指与所述检测颗粒中检测微粒匹配的光激化学发光微粒。
本发明第三方面提供一种适于生物分子多重检测的检测颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将带有编码功能的微载体和含有检测微粒的分散液混合，避光反应，得到所述适于生物分子多重检测的检测颗粒。
本发明第四方面提供前述适于生物分子多重检测的检测颗粒或生物分子检测***在生物分子检测中的应用。
本发明第五方面提供一种生物分子检测方法，包括如下步骤：
(1)将适于生物分子多重检测的检测颗粒和待测样本溶液混合，孵育；
(2)加入匹配微粒，孵育；
(3)将步骤(2)得到的混合物置于带有照相或摄像功能的荧光显微镜中进行检测，激发带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号；
(4)分别对带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号进行采集，将带有编码功能的微载体信号激发后获得的图像与光激化学发光信号激发后获得的图像进行匹配。
如上所述，本发明的一种适于生物分子多重检测的检测颗粒及其制备方法与应用，具有以下有益效果：
本发明首次制备了集编码鉴别、磁分离、光激化学发光检测功能于一体的多功能检测颗粒。首次搭建了用于多功能检测颗粒的成像检测分析装置。制备得到的的适于生物分子多重检测的检测颗粒能够实现高灵敏、快速、免洗的多重检测方法，大大扩展了单反应可以检测的生物分子的种类，且可以做到全流程无需洗涤去除未反应的信号标记分子，简化实验步骤，提高检测效率。该方法适用于蛋白、核酸、小分子的检测。
附图说明
图1：本发明实施例中无生物捕获物质的检测颗粒制备过程的示意图。
图1-1：本发明实施例中生物分子检测***与待测分子结合的示意图。
图2：本发明实施例中量子点编码的微载体和无生物捕获物质的检测颗粒的扫描电子显微镜图片。
图3：本发明的原理示意图和实施例中“免洗”策略检测样本的流程示意图。
图4：本发明实施例中“免洗”策略检测多重抗原标准品的标准曲线。
图5：本发明实施例中“洗涤”策略检测多重抗原标准品的标准曲线。
具体实施方式
光激化学发光(LICA)技术的检测***由供体球(DB)和受体球(AB)组成。其中，DB球内掺杂光敏剂，受光激发后能产生单线态氧；AB球内掺杂二甲基噻吩和镧系金属配合物，二甲基噻吩将单线态氧的能量转换成360nm发射光，激发镧系金属配合物产生荧光。在受到680nm激光照射后，DB能激活周围环境中的氧转化为单线态氧，其生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了离子氧的传播直径很小(约为200nm)。当待测分子存在时，其与偶联捕获抗体的AB和偶联检测抗体的DB通过双抗夹心作用形成免疫复合物。此时AB与DB间距小于200nm，AB接受DB产生的单线态氧而被激发出615nm的光信号。而当没有待测分子存在时，AB与DB间距较远而无法激发出AB的光信号。因此利用该原理，LICA可避免传统ELISA过程中所需的反复洗涤步骤。然而当前的LICA技术缺少多重检测的能力。PerkinElmer公司推出了一项AlphaPlexTM***[公开(告)号：US8486719]，利用在AB球内掺杂不同发射波长(615nm、545nm、645nm)的镧系金属配合物用于检测不同的待测分子，实现多重检测。然而这种方法AB球可掺杂的镧系金属配合物种类有限，单反应至多可检测数种不同的待测分子，限制了其多重检测的能力。此外不同的镧系金属配合物的发光效率相差较大，造成对不同待测分子检测结果的偏差。美国专利[申请号：US2013/0210003]在DB球中掺杂不同激发波长的光敏剂，检测时采用不同波长的激发光检测不同的待测分子。与AlphaPlexTM类似，该方法DB球中可掺杂的具有不同激发波长的光敏剂种类也十分有限，同样限制了其多重检测的能力。Simon等人报道了一种双水相***将LICA技术用于多重检测。他们利用在96孔板底部液滴的位置作为编码信息，在不同液滴内装载用于检测不同待测分子的AB和DB球，实现多重检测。但是这种方法液滴的数量，即位置编码的数量受孔板底部面积的限制，因此多重检测的能力受限。而且液滴的制备方法复杂，且待测分子在双水相之间的扩散速率较低，更加限制了该方法的实际应用。
悬浮阵列技术以其灵敏而准确的光学编码鉴别、快速的反应动力学、灵活的检测项目组合、可实现定量分析等特点而最有可能成为未来临床多重指标检测的主流技术。编码微球是悬浮阵列技术的核心，利用具有唯一编码特征的微球作为反应单元来鉴别特定的靶标分子。在编码微球中，荧光编码微球是最主流的编码策略。通常，内部由不同荧光元素标记的功能微球表面连接不同的探针分子，然后特异性结合对应的不同生物靶标，以流式细胞术或荧光成像作为表征手段，实现多指标检测。Luminex公司通过在5.6μm聚苯乙烯微球内部包埋两种发射波长、不同浓度梯度的有机染料，制备了100种荧光编码微球，率先实现了商业化。此后，以量子点作为荧光编码元素，以及基于量子点-有机染料杂合结构的荧光编码微球也被广泛报道。目前基于编码微球的悬浮阵列技术已被广泛应用于核酸、蛋白质等生物分子的多指标检测。然而典型的悬浮阵列检测过程涉及了繁琐的多步洗涤和加样步骤，这将对检测带来不便。因此发展一种免洗、快捷、易用的检测产品对于临床诊断具有很好的应用前景。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以***其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
如图1和图2所示的适于生物分子多重检测的检测颗粒，包括带有编码功能的微载体，所述微载体连接有检测微粒，所述检测微粒适用于进行光激化学发光检测。
所述带有编码功能的微载体可选自荧光编码微载体、拉曼信号编码微载体、光子晶体编码微载体或图案编码微载体中的一种或多种。
所述微载体可以是微球或其他形状的载体。
可以通过所述带有编码功能的微载体的编码来鉴别不同的待测分子。
所述带有编码功能的微载体选自磁性微载体或非磁性微载体。
所述带有编码功能的微载体可带有磁性。有利于微载体在用于检测过程中的分离和纯化，同时简化制备过程，便于日后检测颗粒自动化制备和自动化检测的实现。
所述检测微粒选自适用于光激化学发光检测的供体微粒(DB)或受体微粒(AB)。其中，受体微粒能够发出荧光，供体微粒用于激发受体微粒发光。DB内掺杂光敏剂，受光激发后能产生单线态氧。AB内掺杂化学发光剂和荧光剂，化学发光剂将单线态氧的能量转换成360nm发射光，激发荧光剂产生荧光。其中化学发光剂选自二氧杂环乙烯或二甲基噻吩中的一种或多种。
在受到680nm激光照射后，DB能激活周围环境中的氧转化为单线态氧，其生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了离子氧的传播直径很小(约为200nm)。当待测分子存在时，其与偶联捕获抗体的AB和偶联检测抗体的DB通过双抗夹心作用形成免疫复合物。此时AB与DB间距小于200nm，AB接受DB产生的单线态氧而被激发出光信号。例如可以为615nm，其他的稀土或者荧光分子的光信号，只要与编码载体信号能区分即可。而当没有待测分子存在时，AB与DB间距较远而无法激发出AB的光信号。
在优选的实施方式中，所述光敏剂可选自酞菁、卟啉等大环分子。
在一种实施方式中，所述荧光剂可选自镧系金属配合物。例如可以是铕、铽、钐中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述荧光剂可选自染料，例如可以是9,10-双苯乙炔基蒽和红烯。
所述微载体与检测微粒可经连接体连接或共价连接。
所述连接体选自能和所述检测微粒进行配位的聚合物。
在一种实施方式中，所述连接体选自功能基团为氨基或羧基的聚合物。例如，聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺等。
进一步的，所述适于生物分子多重检测的检测颗粒还包括生物捕获物质，设于所述检测微粒上。
所述生物捕获物质是指可以和待测生物分子特异性结合的物质。
进一步的，所述生物捕获物质可以为生物捕获探针、抗原、抗体、ProtinA、ProtinG或链霉亲和素中的一种或多种，用于检测待测分子。其中，所述待测分子可以是蛋白、小分子抗原或核酸。所述生物捕获探针为可与待测核酸分子特异性结合的分子探针。
所述带有编码功能的微载体选自磁性微载体或非磁性微载体。
如图1-1所示，本发明的生物分子检测***，用于同时检测多种生物分子，至少包括多种前述的适于生物分子多重检测的检测颗粒，以及匹配微粒，所述匹配微粒是指与所述检测颗粒中检测微粒匹配的光激化学发光微粒。
具体是指，当所述适于生物分子多重检测的检测颗粒的检测微粒为供体微粒时，所述匹配微粒为受体微粒；当所述适于生物分子多重检测的检测颗粒的检测微粒为受体微粒时，所述匹配微粒为供体微粒。
所述匹配微粒可以由链霉亲和素修饰。
进一步的，不同待测生物分子对应的不同的编码发光物质对，所述编码发光物质对是指：带有编码功能的微载体的编码物质，及与所述微载体连接的检测微粒对应的光激化学发光物质的组合。
可以通过检测编码发光物质对区分待测生物分子的不同。
如图1-1所示，当一检测微粒与一匹配微粒均能与同一待测分子形成复合物时，则该检测微粒与该匹配微粒构成光激化学发光检测对，该光激化学发光检测对即为该检测微粒对应的光激化学发光检测对。
所述生物分子多重检测***中，与所述微载体连接的检测微粒对应的光激化学发光物质是指：与所述微载体连接的检测微粒对应的光激化学发光检测对中，掺杂的可受光激发产生单线态氧的光敏剂和/或可受光激发产生荧光的荧光剂。
具体的，如图3所示，当进行检测时，匹配微粒与待测生物分子偶联，待测分子与带有生物捕获物质的检测颗粒上的生物捕获物质结合，形成复合物，此时，所形成的复合物中，包括了两部分，一部分是带有编码功能的微载体，一部分是结合有待测分子的光激化学发光检测对。不同的待测生物分子连接的带有编码功能的微载体的编码和光激化学发光检测微粒对上的发光信号至少有一处不同，使得待测生物分子得以区分。其中发光信号为波长和/或强度。进一步的，带有编码功能的微载体的编码发光信号为波长和/或强度，光激化学发光检测微粒对的发光信号为波长，其中光激化学发光检测受体微粒的发光信号为发射波长，光激化学发光检测供体微粒的发光信号为激发波长。
在一种实施方式中，所述生物分子多重检测***中，所述光激化学发光物质包括两种以上发射波长和/或激发波长不同的光激化学发光物质。
进一步的，所述***还包括带有照相或摄像功能的荧光显微镜，所述荧光显微镜至少搭载两种激发光源，一种用于带有编码功能的微载体信号的激发，另一种用于光激化学发光信号的激发。
带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号后经过滤光片组被相机采集。其中检测微粒信号的激发既可采用普通荧光模式，即激发光照射和相机曝光同步进行；也可采用时间分辨荧光模式，即激发光照射一段时间后关掉光源，相机才开始曝光采集信号。这样可以进一步降低由激发光产生的背景噪音。
所述激发光源可以是激光器、氙灯、汞灯或发光二极管(LED)。
所述照相或摄像功能可以通过相机来实现。例如可以为是CCD、EMCCD、CMOS或sCMOS。
所述带有编码功能的微载体的信号为荧光信号，所述光激化学发光物质的信号为光激化学发光信号。
所述***还包括图像处理装置，用于将带有编码功能的微载体信号激发后获得的图像与光激化学发光信号激发后获得的图像进行匹配。对荧光信号和光激化学发光信号在图像中的位置进行统一，使得在获得的复合物中，所述微载体和与所述微载体连接的光激化学发光检测微粒对的位置能够对应，同时获得其发出的信号。
可以通过以下步骤进行图像处理：①图像预处理：对得到的荧光图像和光激化学发光图像进行降噪，将荧光信号或光激化学发光信号和背景信号区分开，并通过全局阈值化识别出信号在图像中的位置。②共定位：对荧光信号和光激化学发光信号在图像中的位置进行统一。③灰度分析：分别读取荧光信号和光激化学发光信号的灰度值。④聚类分析：对图像中不同位置的荧光信号依据灰度值的强弱进行聚类，得出不同分类，以此作为不同待测分子的类别。
本发明的适于生物分子多重检测的检测颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将带有编码功能的微载体和含有检测微粒的分散液混合，避光反应，得到所述适于生物分子多重检测的检测颗粒。
在一种实施方式中，可以将带有编码功能的微载体中滴加到含有检测微粒的分散液中。
所述制备方法还包括如下步骤：在带有编码功能的微载体中加入连接体后再滴加到含有检测微粒的分散液中。
所述制备方法还包括如下步骤：在所述检测微粒表面偶联生物捕获物质。所述生物捕获物质包括但不限于生物捕获探针、抗原、抗体、ProtinA、ProtinG或链霉亲和素中的一种或多种。其中，所述生物捕获探针为可与待测核酸分子特异性结合的分子探针。
所述含有检测微粒的分散液中，分散剂选自MES(2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液)或MEST溶液(含有0.1％Tween的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液)。
前述适于生物分子多重检测的检测颗粒或生物分子检测***可用于生物分子检测。
如图3所示，本发明所述的生物分子检测方法，包括如下步骤：
(1)将适于生物分子多重检测的检测颗粒和待测样本溶液混合，孵育；
(2)加入与所述检测微粒相匹配的光激化学发光检测微粒，孵育；
(3)将步骤(2)得到的混合物置于带有照相或摄像功能的荧光显微镜中进行检测，激发带有编码功能的微载体信号和检测微粒信号；
(4)分别对带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号进行采集，将带有编码功能的微载体信号激发后获得的图像与光激化学发光信号激发后获得的图像进行匹配。
进一步的，所述生物分子多重检测颗粒上包括生物捕获物质。
在一种实施方式中，步骤(1)中，还可以加入生物捕获物质。
检测微粒信号的激发既可采用普通荧光模式，即激发光照射和相机曝光同步进行；也可采用时间分辨荧光模式，即激发光照射一段时间后关掉光源，相机才开始曝光采集信号。这样可以进一步降低由激发光产生的背景噪音。
对荧光信号和光激化学发光信号在图像中的位置进行统一，使得在获得的复合物中，所述微载体和与所述微载体连接的光激化学发光检测微粒对的位置能够对应，同时获得其发出的信号。
可以通过以下步骤进行图像处理：①图像预处理：对得到的荧光图像和光激化学发光图像进行降噪，将荧光信号或光激化学发光信号和背景信号区分开，并通过全局阈值化识别出信号在图像中的位置。②共定位：对荧光信号和光激化学发光信号在图像中的位置进行统一。③灰度分析：分别读取荧光信号和光激化学发光信号的灰度值。④聚类分析：对图像中不同位置的荧光信号依据灰度值的强弱进行聚类，得出不同分类，以此作为不同待测分子的类别。
步骤(4)中，带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号后经过滤光片组被相机或摄像机采集。
步骤(1)或(2)中，孵育后能够采用洗涤或免洗的方式。
步骤(4)中，带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号后经过滤光片组被相机或摄像机采集；
所述微载体选自磁性微载体或非磁性微载体。
在一种实施方式中，步骤(1)中，当选用磁性微载体时，混合后进行孵育，磁分离洗涤。
在一种实施方式中，步骤(1)或(2)中，当选用磁性微载体时，孵育后，磁分离洗涤。
如图3所示，步骤(2)中，所述匹配微粒上修饰有生物捕获物质。
在一种实施方式中，所述生物分子的检测方法为将偶联特异性的生物捕获物质的适于生物分子多重检测的检测颗粒与生物素化的生物捕获物质、待测分子和修饰有链霉亲和素的匹配微粒混合后进行信号检测。
在一种实施方式中，所述生物分子的检测方法为将偶联生物捕获物质的适于生物分子多重检测的检测颗粒与生物捕获物质、待测分子和修饰有生物捕获物质的匹配微粒混合后进行信号检测。
在一种实施方式中，所述生物分子的检测方法为将偶联生物捕获物质的适于生物分子多重检测的检测颗粒、待测分子和修饰有生物捕获物质的匹配微粒混合后进行信号检测。
对于低丰度的待测分子，多步洗涤的步骤，进一步提高检测灵敏度。因此引入多步洗涤步骤还可延缓“hook”效应，从而扩大检测的动态范围。
本发明所述的方法用于非诊断或治疗目的。
实施例1表面装载量子点的编码微载体与表面羧基受体微粒的组装
步骤1：将1.25mg表面装载双色量子点的编码微载体磁分离去上清液，用300μLMEST溶液清洗三次，最后分散于125μLMEST溶液中得到微载体分散液。取0.6mg受体微粒，离心去上清液后超声分散于125μLMEST溶液中，得到受体微粒分散液。
步骤2：将步骤1中的微载体分散液在超声条件下逐滴加入到步受体微粒分散液中，超声混合均匀后，旋转混合0.5h。分别称取5mg碳二亚胺(EDC)和5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入100μL MEST溶液溶解，然后将EDC/NHS溶液加入到EHB和AB的混合溶液中，涡旋混合均匀，避光旋转反应3h。反应后磁分离去上清液，用2.5mM的氢氧化钠(NaOH)清洗三次，用超纯水清洗三次，分散于300μL的超纯水溶液中，即得到具有编码功能的适于生物分子多重检测的检测颗粒。
当采用不同直径的微载体时，微载体与受体微粒的组装方法与上述方法基本相同，仅需根据微载体的表面积变化对受体微粒用量和相关反应物用量稍作调节。
受体微粒为内部掺杂二甲基噻吩和镧系金属配合物的纳米球，采购自PerkinElmer公司，其粒径为200nm，表面基团为羧基或醛基。如图1和图2所示，带有编码功能的微载体(可以参照[Chem.Mater.2017,29,10398.]文献中提到的方法进行制备)表面的氨基与受体微粒表面的羧基或醛基进行共价偶联，得到适于生物分子多重检测的检测颗粒。
实施例2内部填充荧光染料的编码微载体与羧基受体微粒的组装
步骤1：采用直径为5.9μm的介孔聚苯乙烯微球作为微载体，采用FITC、RITC两种荧光染料的不同浓度组合，得到12重内部填充荧光染料的编码微载体。
步骤2：将1.25mg步骤1中得到的双色编码微载体磁分离去上清液，用300μL MEST溶液清洗三次，最后分散于125μLMEST溶液中得到编码微载体分散液。取0.6mg受体微粒，离心去上清液后超声分散于125μLMEST溶液中，得到受体微粒分散液。
步骤3：将步骤2中的微载体分散液在超声条件下逐滴加入到受体微粒分散液中，超声混合均匀后，旋转混合0.5h。分别称取5mg碳二亚胺(EDC)和5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入100μLMEST溶液溶解，然后将EDC/NHS溶液加入到微载体分散液和受体微粒的混合溶液中，涡旋混合均匀，避光旋转反应3h。反应后磁分离去上清液，用2.5mM的氢氧化钠(NaOH)清洗三次，用超纯水清洗三次，分散于300μL的超纯水溶液中，即得到具有编码功能的适于生物分子多重检测的检测颗粒。
当采用不同直径的微载体时，微载体与受体微粒的组装方法与上述方法基本相同，仅需根据微载体的表面积变化对受体微粒用量和相关反应物用量稍作调节。
实施例3微载体与醛基受体微粒的组装
步骤1：将1.25mg表面装载量子点的编码微载体磁分离去上清液，用300μL MEST溶液清洗三次，最后分散于125μL MEST溶液中得到微载体分散液。取0.6mg受体微粒，离心去上清液后超声分散于125μL MEST溶液中，得到受体微粒分散液，并加入15μL的NaCNBH3(25mg/ml)。
步骤2：将步骤1中的微载体分散液在超声条件下逐滴加入到步骤1中的受体微粒分散液中。滴加完毕后，涡旋振荡，并置于37℃恒温箱中在旋转混合仪上避光旋转48h。反应后磁分离去上清液，用2.5mM的氢氧化钠(NaOH)清洗三次，用超纯水清洗三次，分散于300μL的超纯水溶液中，即得到具有编码功能的适于生物分子多重检测的检测颗粒。
当采用不同直径的微载体时，微载体与受体微粒的组装方法与上述方法基本相同，仅需根据微载体的表面积变化对受体微粒用量和相关反应物用量稍作调节。
实施例4羧基受体微粒的检测颗粒表面生物偶联
步骤1：取0.75mg的实施例1中制得的检测颗粒分别置于标记为“0”“1”两个离心管中，“0”为对照管，“1”为试验管。吸取MEST溶液(10mM，pH 5.0)400μL置于每管，再用400μL的MEST溶液洗三遍洗涤三次；
步骤2：羧基活化：吸取配制好的50mg/mL的NHS 200μL和50mg/mL的EDC 200μL置于每管，混匀后放在旋转混合仪上转20min(室温)。磁力架吸附检测颗粒，吸去上清，用400μlMEST溶液洗两遍。
步骤3：于“0”管加400μL MEST溶液，“1”管加400μL0.5mg/mL的捕获抗体溶液，置37℃恒温箱中在旋转混合仪上转2h；
步骤4：磁力架吸附后取出上清，上清保留做BCA蛋白定量测试。检测颗粒加400μL封闭液(含0.3％甘氨酸和0.5％BSA的PBS缓冲液)洗3次，再加400μL的封闭液在4℃冰箱中封闭过夜；
步骤5：封闭完后，磁力架吸附检测颗粒，移液器吸去上清，用400μL储存液(含0.1％BSA的PBS缓冲液)洗三遍，每管加50μl储存液进行储存，并用流式细胞仪计数。
选取7种不同编码的检测颗粒，根据上述生物偶联方法，分别在表面偶联干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-17A(IL-17A)的捕获抗体，得到不同捕获抗体修饰的检测颗粒。
实施例5醛基受体微粒的检测颗粒表面生物偶联
步骤1.取0.75mg的实施例3中制得的检测颗粒分别置于标记为“0”“1”两个离心管中，“0”为对照管，“1”为试验管。吸取MEST溶液(10mM，pH 5.0)400μL置于每管，再用400μL的MEST溶液洗三遍洗涤三次；
步骤2.吸取配制好的15μL的NaCNBH3(25mg/ml)置于每管，混匀后于“0”管加400μLMEST溶液，“1”管加400μL 0.5mg/mL捕获抗体溶液，置37℃恒温箱中在旋转混合仪上旋转反应48h；
步骤3.磁力架吸附的MFHGB后取出上清，上清保留做BCA蛋白定量测试。检测颗粒加400μL封闭液(含0.3％甘氨酸和0.5％BSA的PBS缓冲液)洗3次，再加400μL的封闭液在4℃冰箱中封闭过夜；
步骤4.封闭完后，磁力架吸附检测颗粒，移液器吸去上清，用400μL储存液(含0.1％BSA的PBS缓冲液)洗三遍，每管加50μl储存液进行储存，并用流式细胞仪计数。
选取7种不同编码的检测颗粒，根据上述生物偶联方法，分别在表面偶联干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-17A(IL-17A)的捕获抗体，得到不同捕获抗体修饰的检测颗粒。
实施例6用于多重蛋白检测的“免洗”策略的标准曲线
本发明中的检测颗粒由于具有磁吸附功能，因此可根据实际需求灵活选择“免洗”和“洗涤”两种策略。其中“免洗”策略快速、简便；而“洗涤”策略灵敏度更高，且可延缓“hook”效应，动态范围更宽。
步骤1.制备捕获抗体修饰的检测颗粒溶液：将实施例4中制备的的7种检测颗粒，分别取2000个混合于20μL含0.5％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中；
步骤2.制备抗原标准品溶液：分别将IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-9、IL-10、IL-17A的抗原标准品稀释至104、103、102、10、10-1、10-2、10-3、0ng/mL，并将相同浓度的每种标准品混合；
步骤3.制备生物素修饰的检测抗体溶液：将生物素修饰的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-9、IL-10、IL-17A检测抗体分别稀释至5ug/mL的浓度并混合；
步骤4.制备链霉亲和素修饰的供体微粒溶液：将链霉亲和素修饰的供体微粒稀释至1mg/mL；
步骤5.如图3所示，将步骤1中的捕获抗体修饰的检测颗粒溶液与40μL步骤2中抗原标准品溶液混合，再加入20μL步骤3中的生物素修饰的检测抗体溶液，在37℃下旋转孵育30min。最后加入10μL步骤4中的链霉亲和素修饰的供体微粒溶液溶液，在37℃下旋转孵育60min。将溶液直接置于仪器上成像检测，分别对每个检测颗粒的微载体编码信号和检测微粒信号进行采集和统计。
步骤6.如图4所示，以抗原浓度为横坐标，以检测颗粒的检测微粒信号平均强度为纵坐标，绘制各个抗原的标准曲线。
实施例7用于多重蛋白检测的“洗涤”策略的标准曲线
步骤1.制备捕获抗体修饰的检测颗粒溶液：将实施例4中制备的7种检测颗粒，分别取2000个混合于20μL含0.5％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中；
步骤2.制备抗原标准品溶液：分别将IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-9、IL-10、IL-17A的抗原标准品稀释至104、103、102、10、10-1、10-2、10-3、0ng/mL，并将相同浓度的每种标准品混合；
步骤3.制备生物素修饰的检测抗体溶液：将生物素修饰的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-9、IL-10、IL-17A检测抗体分别稀释至5ug/mL的浓度并混合；
步骤4.制备链霉亲和素修饰的供体微粒溶液：将链霉亲和素修饰的供体微粒稀释至1mg/mL；
步骤5.将步骤1中的捕获抗体修饰的检测颗粒溶液与40μL步骤2中的抗原标准品溶液混合，在37℃下旋转孵育30min后用0.05％Tween-20的PBS缓冲液磁吸附洗涤3次。再加入20μL步骤3中的生物素修饰的检测抗体溶液和60μL的含0.5％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液，在37℃下旋转孵育30min后用0.05％Tween-20的PBS缓冲液磁吸附洗涤3次。最后加入10μL步骤4中的链霉亲和素修饰的供体微粒溶液和60μL的含0.5％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液，在37℃下旋转孵育60min后用0.05％Tween-20的PBS缓冲液磁吸附洗涤3次后重悬于100μL的含0.5％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中。将溶液直接置于仪器上成像检测，分别对每个检测颗粒的微载体编码信号和检测微粒信号进行采集和统计。
步骤6.如图5所示，以抗原浓度为横坐标，以各个检测颗粒的检测微粒信号平均强度为纵坐标，绘制各个抗原的标准曲线。
实施例8临床样本检测：用“免洗”策略检测血样中白细胞分泌的7种抗原
步骤1.制备捕获抗体修饰的检测颗粒溶液：将实施例4中制备的7种检测颗粒，分别取2000个混合于20μL含0.5％BSA和0.05％Tween-20的PBS缓冲液中；
步骤2.样本处理：使用密度梯度离心法提取病人全血中的外周血单个核细胞，并加入96孔板中，每个孔约2.5×105个细胞，然后加入1μg/mL的脂多糖刺激细胞分泌抗原，最后通过离心去除细胞收集上清液；
步骤3.制备生物素修饰的检测抗体溶液：将生物素修饰的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-9、IL-10、IL-17A检测抗体分别稀释至5ug/mL的浓度并混合；
步骤4.制备链霉亲和素修饰的供体微粒溶液：将链霉亲和素修饰的供体微粒稀释至1mg/mL；
5.将步骤1中的捕获抗体修饰的检测颗粒溶液与40μL步骤2中的上清液混合，再加入40μL步骤3中的生物素修饰的检测抗体溶液，在37℃下旋转孵育30min。最后加入10μL步骤4中的链霉亲和素修饰的供体微粒溶液，在37℃下旋转孵育60min。将溶液直接置于仪器上成像检测，分别对每个检测颗粒的微载体编码信号和检测微粒信号进行采集和统计。
6.如表1所示，将每种检测颗粒的检测微粒信号代入图4的标准曲线中，得出样本中对应抗原的浓度。
表1
Figure BDA0002391754130000141
Figure BDA0002391754130000151
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (13)

1.一种适于生物分子多重检测的检测颗粒，包括带有编码功能的微载体，所述微载体连接有检测微粒，所述检测微粒适用于进行光激化学发光检测。
2.根据权利要求1所述的适于生物分子多重检测的检测颗粒，其特征在于：还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述带有编码功能的微载体选自荧光编码微载体、拉曼信号编码微载体、光子晶体编码微载体或图案编码微载体中的一种或多种；
b.所述检测微粒选自适用于光激化学发光检测的供体微粒或受体微粒；
c.所述适于生物分子多重检测的检测颗粒还包括生物捕获物质；
d.所述带有编码功能的微载体选自磁性微载体或非磁性微载体。
3.一种生物分子多重检测***，用于同时检测多种生物分子，至少包括多种权利要求1-2任一所述的适于生物分子多重检测的检测颗粒，以及匹配微粒，所述匹配微粒是指与所述检测颗粒中检测微粒匹配的光激化学发光微粒。
4.根据权利要求3所述的生物分子多重检测***，其特征在于，不同待测生物分子对应的不同的编码发光物质对，所述编码发光物质对是指：带有编码功能的微载体的编码物质，及与所述微载体连接的检测微粒对应的光激化学发光物质的组合。
5.根据权利要求4所述的生物分子多重检测***，其特征在于，所述生物分子多重检测***中，所述光激化学发光物质包括两种以上发射波长和/或激发波长不同的光激化学发光物质。
6.根据权利要求3所述的生物分子检测***，其特征在于，所述***还包括带有照相或摄像功能的荧光显微镜，所述荧光显微镜至少搭载两种激发光源，一种用于带有编码功能的微载体信号的激发，另一种用于光激化学发光信号的激发。
7.根据权利要求6所述的生物分子检测***，其特征在于，所述***还包括图像处理装置，用于将带有编码功能的微载体信号激发后获得的图像与光激化学发光信号激发后获得的图像进行匹配。
8.一种权利要求1-2所述适于生物分子多重检测的检测颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将带有编码功能的微载体和含有检测微粒的分散液混合，避光反应，得到所述适于生物分子多重检测的检测颗粒。
9.根据权利要求8所述的适于生物分子多重检测的检测颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤的一项或多项：
a.将带有编码功能的微载体滴加到含有检测微粒的分散液中；
b.在所述检测微粒表面偶联生物捕获物质。
10.如权利要求1-2任一所述的适于生物分子多重检测的检测颗粒或权利要求3-7所述的生物分子检测***在生物分子检测中的应用。
11.一种生物分子检测方法，包括如下步骤：
(1)将适于生物分子多重检测的检测颗粒、待测样本溶液混合，孵育；
(2)加入匹配微粒，孵育；
(3)将步骤(2)得到的混合物置于带有照相或摄像功能的荧光显微镜中进行检测，激发带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号；
(4)分别对带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号进行采集，将带有编码功能的微载体信号激发后获得的图像与光激化学发光信号激发后获得的图像进行匹配。
12.如权利要求11所述的生物分子检测方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)步骤(1)或(2)中，孵育后能够采用洗涤或免洗的方式；
2)步骤(4)中，带有编码功能的微载体信号和光激化学发光信号经过滤光片组被相机或摄像机采集；
3)所述微载体选自磁性微载体或非磁性微载体；
4)步骤(2)中，所述匹配微粒上修饰有生物捕获物质；
5)步骤(1)中，还加入有生物捕获物质。
13.如权利要求12所述的生物分子检测方法，其特征在于，还包括以下特征的一项或多项：
a.步骤(1)中，当选用磁性微载体时，混合后进行孵育，磁分离洗涤；
b.步骤(1)或(2)中，当选用磁性微载体时，孵育后，磁分离洗涤。
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