JP6402173B2 - Ｈｅｒ３の検出に基づく癌の診断、予後予測、および処置を容易にするためのシステムおよび方法 - Google Patents

Ｈｅｒ３の検出に基づく癌の診断、予後予測、および処置を容易にするためのシステムおよび方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年４月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０９，０８３の利益、および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）の下での優先権を主張し、当該出願の内容はその全体が本明細書に参考として援用される。
発明の分野
本発明は一般に、ＨＥＲ３活性化の検出に基づいて、癌の診断、予後予測および処置を容易にするためのシステムおよび方法に関する。
発明の背景
細胞の増殖、生存および遊走に関連するチロシンキナーゼ受容体スーパーファミリーの特定のメンバーは、ヒト上皮成長因子受容体またはＨＥＲタンパク質ファミリーである。これらのＨＥＲタンパク質としては、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ１としても公知である）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）が挙げられる。これらの個々の各細胞表面受容体の発現レベルは、癌バイオマーカーとして評価（ｅｖａｌｕｔｅｄ）している。
ＨＥＲ２増幅細胞では、受容体ＨＥＲのリガンド誘導性およびリガンド非依存性二量体化および活性化（ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成を含む）の両方が起こることが公知である。二量体化とそれに続いて受容体のトランス活性化およびリン酸化が起こり、リン酸化された受容体に様々な細胞質タンパク質が動員されることにより、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ、ＰＫＣ、ＭＡＰＫおよびＲａｓシグナル伝達経路を含む様々なシグナル伝達カスケードが誘発される。
ＨＥＲ３は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのユニークなメンバーである。ＨＥＲ１およびＨＥＲ２とは異なり、それはホモ二量体を形成することができず、細胞内キナーゼ活性を欠く。それは弱いチロシンキナーゼ活性を有するが、ＨＥＲ３は、不活性な「偽キナーゼ」であると一般に考えられている。しかしながら、ＨＥＲ３のＣ末端領域は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化におけるその重要な役割に関与するＰＩ３ＫのＳＨ２ドメインに結合する６つのコンセンサスホスホチロシン部位を含有する。ＨＥＲ３はまた、他のＥｒｂＢキナーゼが有意に阻害されたとしてもＨＥＲシグナル伝達活性が活性化され得る機構である。Ｓｅｒｇｉｎａ，Ｎ．Ｖら、Ｎａｔｕｒｅ ４４５（７１２６）：４３７−４４１（２００７）。ＨＥＲ３のこのユニークな能力は、いかなる他のＨＥＲタンパク質においても認められていない。最近の研究では、ＨＥＲ３の発現および核から膜への移行は、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２ターゲティング治療に対する耐性の原因であったことが示された。Ｓｅｒｇｉｎａ，Ｎ．Ｖら、Ｎａｔｕｒｅ ４４５（７１２６）：４３７−４４１（２００７）；Ｈｓｉｅｈ，Ａ．Ｃ．ａｎｄ Ｍｏａｓｓｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９７（４）：４５３−４５７（２００７）。
一般的に、乳癌、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫（ＳＣＣＨＮ）、ブドウ膜黒色腫および胃癌、卵巣癌、前立腺癌および膀胱癌などの様々な悪性腫瘍では、ＨＥＲ３のアップレギュレーションが見られる。一般に、Ｊｉａｎｇ，Ｎ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．２０１２：ｉｄ８１７３０４を参照のこと。ヒト乳癌では、ＨＥＲ３ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方がアップレギュレートしている。ヒト乳癌の５０〜７０％では、正常***組織と比較して、ＨＥＲ３タンパク質の過剰発現が報告されており、転移、腫瘍サイズおよび局所再発リスクに関連すると思われる。結腸癌などの腫瘍では、ＨＥＲ３ ｍＲＮＡまたはタンパク質の増加が一般的に見られ、リンパ節転移およびより短い無増悪期間に関連する。ＳＣＣＨＮでは、高ＨＥＲ３発現は、転移の増加および全生存の減少に関連すると思われる。また、ＳＣＣＨＮでは、ＨＥＲ３発現が、ＨＥＲ１阻害剤ゲフィチニブに対する耐性と相関する。これは、ＨＥＲ３発現が発癌において重要な役割を果たし、抗癌治療の合理的な標的であることを示唆している。ＨＥＲ３は、その機能が他のメンバーとヘテロ二量体化に大きく依存するので、過剰発現または突然変異活性化を介して細胞をトランスフォームすることができない。その主な結合パートナーはＨＥＲ２であり、それは、ＨＥＲ２がヒト癌の進行をトランスフォームおよび加速する上で重要な役割を果たす。加えて、ＨＥＲ３はまた、薬物感受性の潜在的なマーカーとして同定されている。一般に、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ａら、ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ６（１）：ｅ１６４４３（２０１１）を参照のこと。
ＨＥＲ１およびＨＥＲ２をターゲティングする薬物治療の開発の進歩にもかかわらず、耐性機構が十分に立証されている。一般に、Ｊｉａｎｇ，Ｎ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．２０１２：ｉｄ８１７３０４を参照のこと。具体的には、相補的なＨＥＲ３シグナル伝達および持続的なＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化は、ＨＥＲターゲティング治療に対する耐性において重要な役割を果たすことに関与している。この耐性の潜在的な機構としては、膜におけるＨＥＲ３発現のアップレギュレート、ＨＥＲ３リガンドヘレグリン発現の増加、および他の受容体チロシンキナーゼ（ｋｎａｓｅ）（例えば、ＭＥＴ）との協調が挙げられる。ＨＥＲ３阻害剤およびパンＥｒｂＢ阻害剤（これらは、ＨＥＲ３および他のファミリーメンバーを同時に阻害する）の両方が開発されており、それらの多数が臨床開発中である。開発中のほとんどのＨＥＲ３阻害剤は、タンパク質の細胞外ドメインをターゲティングする。ＨＥＲ３は酵素触媒活性を欠くので、チロシンキナーゼ阻害剤を使用してその機能を阻害することができない。モノクローナル抗体に加えて、ＨＥＲ３と他のＥｒｂＢファミリーメンバーとの二量体化の阻害は、有効なアプローチである。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の二量体化インターフェイスをターゲティングすることにより、リガンド誘導性ＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体化を妨げる。
ＨＥＲ３ターゲティング治療は、前臨床試験で有望な結果を示しているので、個体が高レベルの活性化ＨＥＲ３を有し、したがって、ＨＥＲ３作用剤の適切な候補であるかを評価することが有用であろう。このようなことを行う有効な方法は開発されていない。この制限を踏まえて、本発明が開発されたことに留意する。
Ｓｅｒｇｉｎａ，Ｎ．Ｖら、Ｎａｔｕｒｅ ４４５（７１２６）：４３７−４４１（２００７） Ｈｓｉｅｈ，Ａ．Ｃ．ａｎｄ Ｍｏａｓｓｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９７（４）：４５３−４５７（２００７） Ｊｉａｎｇ，Ｎ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．２０１２：ｉｄ８１７３０４ Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ａら、ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ６（１）：ｅ１６４４３（２０１１）
一態様では、本発明は、ＨＥＲ３の活性化を検出することによって、癌の診断、予後予測および処置を容易にするためのシステムおよび方法を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍における活性化ＨＥＲ３の量を測定するための方法であって、（ａ）腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、および前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと、全ＨＥＲ３タンパク質との比を決定すること；および（ｃ）（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、および（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つが、前記参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、または（ｏｒ ｏｒ）ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、前記腫瘍が多量の活性化ＨＥＲ３を有することを示すことを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、癌を有する被験体を処置する方法であって、（ａ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定すること；（ｃ）被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有するかを決定すること（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）；ならびに（ｄ）前記被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有する場合、ＨＥＲ３ターゲティング治療を前記被験体に行うことを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、癌を有する被験体のＨＥＲ３作用剤に対する反応性を予測するための方法であって、（ａ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定すること；（ｃ）被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有するかを決定すること（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）；ならびに（ｄ）前記被験体の癌が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする場合、前記被験体は、ＨＥＲ３作用剤に対して反応する可能性がより高いことを示すことを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、データベースと通信する第１のコンピューティングデバイスと；第１のコンピューティングデバイスで実行する第１のアプリケーションであって、複数の被験体に関する複数の臨床検査結果を受信して、前記複数の臨床検査結果を前記データベースに格納するように構成されており、前記複数の臨床検査結果が、被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つを含む第１のアプリケーションと；前記データベースと通信する第２のコンピューティングデバイスと；第２のコンピューティングデバイスで実行する第２のアプリケーションであって、前記複数の被験体からの被験体に関する臨床検査結果について前記データベースをクエリし；前記被験体に関する前記臨床検査結果を前記データベースから受信し；前記被験体に関する前記受信した臨床検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果であって、前記被験体から得られた腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比を含む検査結果を決定し；前記被験体に関する検査結果報告であって、前記腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み、前記被験体に関する前記検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果報告を作成し；前記患者に関する前記検査結果報告を第３のコンピューティングデバイスに送信するように構成された第２のアプリケーションとを含むシステムを含む。
別の態様では、本発明は、データベースにおける複数の臨床検査結果であって、被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つを含む複数の臨床検査結果を受信することと；前記複数の臨床検査結果を前記データベースに格納することと；前記複数の被験体からの被験体に関する臨床検査結果について前記データベースをクエリすることと；前記被験体に関する前記臨床検査結果を前記データベースから受信することと；前記被験体に関する前記受信した臨床検査結果に部分的に基づく検査結果であって、前記被験体から得られた腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比を含む検査結果を決定することと；前記被験体に関する検査結果報告であって、前記腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み、前記被験体に関する前記検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果報告を作成することと；前記被験体に関する前記検査結果報告をコンピューティングデバイスに送信することとを含む方法を含む。
これらの例示的な実施形態は、本発明を限定および規定するためではなく、むしろその理解を助けるための例を提供するために記載されている。本発明のさらなる説明を提供する詳細な説明では、例示的な実施形態が議論されている。本発明の様々な実施形態によって提供される利点は、本明細書を検討することによってさらに理解され得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
腫瘍における活性化ＨＥＲ３の量を測定するための方法であって、
（ａ）腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、および前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；
（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと、全ＨＥＲ３タンパク質との比を決定すること；ならびに
（ｃ）（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、および（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つが、前記参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、前記腫瘍が多量の活性化ＨＥＲ３を有することを示すことを含む、方法。
（項目２）
癌を有する被験体を処置する方法であって、
（ａ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；
（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定すること；
（ｃ）被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有するかを決定すること（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）；ならびに
（ｄ）前記被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有する場合、ＨＥＲ３ターゲティング治療を前記被験体に行うことを含む、方法。
（項目３）
癌を有する被験体のＨＥＲ３ターゲティング治療に対する反応性を予測するための方法であって、
（ａ）前記被験体の癌（ｃｎｃｅｒ）由来の生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；
（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定すること；
（ｃ）被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有するかを決定すること（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）；ならびに
（ｄ）前記被験体の癌が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする場合、前記被験体は、ＨＥＲ３ターゲティング治療に対して反応する可能性がより高いことを示すことを含む、方法。
（項目４）
前記腫瘍が、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌、肺癌、脳癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌または子宮頸癌の少なくとも１つを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記腫瘍が乳癌を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
ＨＥＲ３リン酸化特異的抗体またはＨＥＲ３パンホスホ抗体の使用によって、前記生物学的サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量を検出する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
ＨＥＲ３の１２８９位のチロシン残基でリン酸化されたＨＥＲ３タンパク質に結合するリン酸化特異的抗体を使用することによって、前記腫瘍におけるリン酸化ＨＥＲ３の量を検出する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記腫瘍サンプル中に存在するＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との比、およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも２つを決定することによって、前記腫瘍における活性化ＨＥＲ３の量を検出する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記腫瘍サンプルにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の量を測定することができるアッセイを使用して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を測定する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記被験体由来の前記腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量の測定が、
ａ）前記腫瘍サンプルとＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程；
ｂ）前記ＨＥＲ３抗体組成物とタグ付結合組成物とを接触させる工程であって、前記タグ付結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含み、前記タグ付結合組成物が、前記ＨＥＲ３抗体組成物に特異的に結合する、工程；
ｃ）前記タグ付結合組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ３タンパク質の量を決定する工程を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記被験体由来の前記腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量の測定が、
ａ）前記腫瘍サンプルと、第１の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第１のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第１のＨＥＲ３結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む、工程；
ｂ）前記腫瘍サンプルと、第２の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；
ｃ）前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ３タンパク質の量を決定する工程を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記被験体由来の前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の測定が、
ａ）前記腫瘍サンプルと、切断可能な結合を介して抗体組成物に結合した分子タグを含む抗体組成物とを接触させる工程；
ｂ）前記腫瘍サンプルと切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；
ｃ）前記抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を決定する工程を含み、
ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の測定の場合には、前記抗体組成物がＨＥＲ３に特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ２に特異的に結合するか、または前記抗体組成物がＨＥＲ２に特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合し、
ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の測定の場合には、前記抗体組成物がＨＥＲ３に特異的に結合し、前記切断プローブがＰＩ３Ｋに特異的に結合するか、または前記抗体組成物がＰＩ３Ｋに特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記被験体由来の前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量の測定が、
ａ）前記腫瘍サンプルとＨＥＲ２抗体組成物とを接触させる工程；
ｂ）前記腫瘍サンプルとＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程；
ｃ）前記腫瘍サンプルと、前記ＨＥＲ２抗体組成物または前記ＨＥＲ３抗体組成物のいずれかに結合する第１の結合組成物とを接触させる工程であって、前記第１の結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む、工程；
ｄ）前記腫瘍サンプルと切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記結合組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；
ｅ）前記抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
ｆ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量を決定する工程を含み、
前記抗体結合組成物がＨＥＲ３に特異的に結合する場合には、前記切断プローブがＨＥＲ２に特異的に結合するか、または前記抗体結合組成物がＨＥＲ２に特異的に結合する場合には、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記被験体由来の前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の測定が、ａ）前記腫瘍サンプルと、ＨＥＲ３抗体組成物およびＰＩ３Ｋ抗体結合組成物とを接触させる工程であって、一方の抗体組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含み、他方の抗体組成物が、それに対して有効近接距離内にある場合に前記結合組成物の前記切断可能な結合を切断する切断プローブを含む工程；
ｂ）前記切断可能なリンカーを切断して、前記分子タグを放出させる工程；および
ｃ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を決定する工程を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記被験体由来の前記腫瘍サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量の測定が、
ａ）前記腫瘍サンプルと、第１の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第１のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第１のＨＥＲ３抗体組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む、工程；
ｂ）前記腫瘍サンプルと、第２の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第２のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第２のＨＥＲ３抗体組成物が、それに対して有効近接距離内にある場合に前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する切断誘導部分を含み、前記第２の結合部位がＨＥＲ３リン酸化部位を含む工程；
ｃ）前記第１のＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量を決定する工程を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＨＥＲ３ターゲティング治療が、Ｕ３−１２８９／ＡＭＧ８８８、ＭＭ−１２１／ＳＡＲ２５６２１２、ＭＭ−１１１、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＡＺＤ−８９３１、ＬＪＭ７１６、Ａｖ−２０３およびペルツズマブからなる群より選択される少なくとも１つの薬剤を含む、項目２または３に記載の方法。
（項目１７）
全ＨＥＲ２タンパク質の量を測定すること、および前記被験体がＨＥＲ２陽性癌またはＨＥＲ２陰性癌を有するかを決定することをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目１８）
全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陽性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の下位５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第１のカットオフを下回るか、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陰性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の上位９５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第２のカットオフを上回るか、または全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回るが、前記第２のカットオフを下回るかを決定することをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目１９）
前記被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療を行うことをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回る場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療を行うことをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記ＨＥＲ２ターゲティング治療が、ＢＩＢＷ２９９２、ＨＫＩ−２７２、４Ｄ５、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン、ＡＥＥ−７８８、ラパチニブ、ネラチニブ、ＡＲＲＹ−３８０およびＡＲＲＹ−５４３からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤を含む、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記被験体がＨＥＲ３作用剤で処置されている間、ＨＥＲ３ターゲティング剤に対する反応性が、診断と重大事象の発生との間のより長い疾患時間経過を含む、項目３に記載の方法。
（項目２３）
前記重大事象が、ある病期からより進行期への前記癌の進行、転移性疾患への進行、再発、手術または死亡の少なくとも１つを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
全ＨＥＲ２タンパク質の量を測定すること、および前記被験体がＨＥＲ２陽性癌またはＨＥＲ２陰性癌を有するかを決定することをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目２５）
全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陽性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の下位５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第１のカットオフを下回るか、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陰性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の上位９５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第２のカットオフを上回るか、または全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回るが、前記第２のカットオフを下回るかを決定することをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目２６）
前記被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、前記被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示すことをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回る場合、前記被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示すことをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記ＨＥＲ２ターゲティング治療が、ＢＩＢＷ２９９２、ＨＫＩ−２７２、４Ｄ５、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン、ＡＥＥ−７８８、ラパチニブ、ネラチニブ、ＡＲＲＹ−３８０およびＡＲＲＹ−５４３からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤を含む、項目２６または２７に記載の方法。
本発明は、以下の非限定的な図面を参照することによってより良く理解され得る。
図１は、本発明の特定の実施形態の様々なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットの概略図を示す模式図である。例示的な目的のために、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体を検出するためのアッセイフォーマットを示す；他の標的を検出するために、本明細書に記載されるアッセイを改変し得る。パネルＡおよびＢは光放出フォーマットを示すのに対して、パネルＣは還元（ＤＴＴ）フォーマットを示す。パネルＡは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルの分析を示し、パネルＢは、組織溶解物サンプルの分析を示す。光放出フォーマットでは、光による切断誘導剤の光誘導に応じて、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーを切断するために、反応性一重項酸素の拡散を使用し得る。ＨＥＲ２抗体に結合した切断プローブから、反応性一重項酸素が生成される。還元フォーマットでは、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーの切断を誘導するために、還元剤を使用する。切断後、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離を行って、電気泳動図によって評価し得る。ｘ軸は、切断されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子がキャピラリーから溶出した時点を示し、蛍光強度がｙ軸上に示されている。蛍光ピークｖ１およびｖ２は、２つの異なるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の溶出を示す。「ＨＥＲ３」は、ＨＥＲ３単量体を表す；「ＨＥＲ２」は、ＨＥＲ２単量体を表す；「Ｂ」は、ビオチン分子を表す；「Ｓ」は、ストレプトアビジン分子を表し、「タグ」は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を表し、「ｈｖ」は、光エネルギーを表す。 図１は、本発明の特定の実施形態の様々なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットの概略図を示す模式図である。例示的な目的のために、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体を検出するためのアッセイフォーマットを示す；他の標的を検出するために、本明細書に記載されるアッセイを改変し得る。パネルＡおよびＢは光放出フォーマットを示すのに対して、パネルＣは還元（ＤＴＴ）フォーマットを示す。パネルＡは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルの分析を示し、パネルＢは、組織溶解物サンプルの分析を示す。光放出フォーマットでは、光による切断誘導剤の光誘導に応じて、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーを切断するために、反応性一重項酸素の拡散を使用し得る。ＨＥＲ２抗体に結合した切断プローブから、反応性一重項酸素が生成される。還元フォーマットでは、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーの切断を誘導するために、還元剤を使用する。切断後、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離を行って、電気泳動図によって評価し得る。ｘ軸は、切断されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子がキャピラリーから溶出した時点を示し、蛍光強度がｙ軸上に示されている。蛍光ピークｖ１およびｖ２は、２つの異なるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の溶出を示す。「ＨＥＲ３」は、ＨＥＲ３単量体を表す；「ＨＥＲ２」は、ＨＥＲ２単量体を表す；「Ｂ」は、ビオチン分子を表す；「Ｓ」は、ストレプトアビジン分子を表し、「タグ」は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を表し、「ｈｖ」は、光エネルギーを表す。 図１は、本発明の特定の実施形態の様々なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットの概略図を示す模式図である。例示的な目的のために、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体を検出するためのアッセイフォーマットを示す；他の標的を検出するために、本明細書に記載されるアッセイを改変し得る。パネルＡおよびＢは光放出フォーマットを示すのに対して、パネルＣは還元（ＤＴＴ）フォーマットを示す。パネルＡは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルの分析を示し、パネルＢは、組織溶解物サンプルの分析を示す。光放出フォーマットでは、光による切断誘導剤の光誘導に応じて、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーを切断するために、反応性一重項酸素の拡散を使用し得る。ＨＥＲ２抗体に結合した切断プローブから、反応性一重項酸素が生成される。還元フォーマットでは、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーの切断を誘導するために、還元剤を使用する。切断後、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離を行って、電気泳動図によって評価し得る。ｘ軸は、切断されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子がキャピラリーから溶出した時点を示し、蛍光強度がｙ軸上に示されている。蛍光ピークｖ１およびｖ２は、２つの異なるＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の溶出を示す。「ＨＥＲ３」は、ＨＥＲ３単量体を表す；「ＨＥＲ２」は、ＨＥＲ２単量体を表す；「Ｂ」は、ビオチン分子を表す；「Ｓ」は、ストレプトアビジン分子を表し、「タグ」は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を表し、「ｈｖ」は、光エネルギーを表す。
図２は、本発明の特定の実施形態にしたがって評価した***腫瘍サンプルバッチ間の一貫性を決定するために特定のバイオマーカーを検出するためのＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの結果を示す一連のグラフである。細胞株対照サンプルのデータは各グラフの左側に示されており、***腫瘍サンプルのデータは各グラフの右側に示されている。各サンプルの蛍光強度はｙ軸上に示されており、相対ピーク面積（ＲＰＡ）で測定した。パネルＡおよびＢは、それぞれ全ＨＥＲ２および全ＨＥＲ３のレベルを測定するアッセイからの結果を示す。パネルＣ、ＤおよびＥは、それぞれＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、チロシン１２８９でリン酸化されたＨＥＲ３およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を測定するアッセイからの結果を示す。
図３は、３つの複合コホート由来の１０９０個の乳癌組織標本に関する、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）アッセイによって評価した全ＨＥＲ２測定結果の散布図を示す。ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）アッセイの測定結果は、ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｌａｂの参照方法を使用して決定したＨＥＲ２状態（ＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陰性）（「ｃｅｎｔｒａｌ ＨＥＲ２陽性」および「ｃｅｎｔｒａｌ ＨＥＲ２陰性」と表記）と比較されている。この比較を使用して、サンプルのＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）状態を定義した。
図４は、本発明の特定の実施形態による、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）分析に基づいてサンプルがＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陰性であるかに基づいて分類した、図３で測定したバイオマーカーレベルの分布を示す散布図を示す。
図５は、本発明の特定の実施形態による、図３で測定したマーカー間の統計的関係を示すグラフを示す。パネルＡは、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ２との間の相関関係を示し、パネルＢは、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との間の相関関係を示し、パネルＣは、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体とリン酸化ＨＥＲ３との間の相関関係を示す。
図６は、本発明の特定の実施形態による、図３で測定したマーカー間の統計的関係を示すグラフを示す。パネルＡは、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ２との間の相関関係を示し、パネルＢは、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との相関関係を示す。
図７は、本発明の特定の実施形態による、腫瘍サンプルにおけるバイオマーカーレベルのペアワイズ比較を示す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して、バイオマーカーレベルを測定した。パネルＡは、評価した***腫瘍サンプルのすべてのデータを示す。パネルＢは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）陰性（低ＨＥＲ２）腫瘍サンプルのデータを示す。パネルＢは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）陽性（高ＨＥＲ２）腫瘍サンプルのデータを示す。有意なｐ値（ｐ＜０．０５）を有するスピアマン相関係数は、下線が付されている。
図８は、本発明の特定の実施形態による、腫瘍サンプルのバイオマーカーレベルを示すヒートマップ図を示す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して、バイオマーカーレベルを測定した。パネルＡは、***腫瘍サンプルのすべてのヒートマップである。パネルＢは、２つのヒートマップ（１つは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）陰性（低ＨＥＲ２）腫瘍サンプルに関するものであり（左）、１つは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）陽性（高ＨＥＲ２）腫瘍サンプルに関するものである（右））を示す。各図において、サンプルは、最高ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２レベル（右）から最低（左）に分類されている。サンプル数は、各ヒートマップの下部に沿って示されており、アッセイで分析したバイオマーカーは、各ヒートマップの左側に示されている。最高発現（≧９０パーセンタイル）を示したサンプルは、濃灰色で示されており、低発現（≦１０パーセンタイル）のサンプルは、淡灰色で示されている。中発現（５０パーセンタイル）を示したサンプルは、黒色で示されている。矢印で特定されたサンプルは、最高レベルの活性化ＨＥＲ３を有すると考えられたサンプルである。
図９は、本発明の特定の実施形態による、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって測定した、バイオマーカーレベルによる***腫瘍サンプルの階層的クラスタ分析を示す。パネルＡは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）分析（低ＨＥＲ２）によるＨＥＲ２陰性を特徴とするサンプルの分析を示す。パネルＢは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）分析（高ＨＥＲ２）によるＨＥＲ２陽性を特徴とするサンプルの分析を示す。サンプル番号は、各グラフの下部に示されている。分析したバイオマーカーは、各グラフの左側に示されている：全ＨＥＲ２（Ｈ２Ｔ）；チロシン１２８９でリン酸化（ｐ−ＨＥＲ３）；ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体（Ｈ２３Ｄ）；全ＨＥＲ３（Ｈ３Ｔ）およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体（ＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ）。高レベルの活性化ＨＥＲ３を発現する腫瘍は黒色または濃灰色で示されており、ヒートマップ分析（図８）に示されている高レベルの活性化ＨＥＲ３を発現する腫瘍に対応する。
図１０は、本発明の特定の実施形態の例示的なコンピューティング環境における例示的なコンピューティングデバイスを示すシステム図を示す。
図１１は、本発明の特定の実施形態の臨床報告システムのオペレーションならびにそのためのシステムおよび方法を示すブロック図を示す。
発明の詳細な説明
本発明の実施形態は、ＨＥＲ３活性化の検出に基づいて、癌の診断、予後予測および処置を容易にするためのシステムおよび方法を提供する。特定の実施形態は、癌を有する被験体由来の生物学的サンプルにおける活性化ＨＥＲ３タンパク質の量のレベルを測定することを含む。
定義および略語
特に指示がない限り、本明細書で使用される場合、用語「約」は、該用語により修飾される値を上回るかまたは下回る範囲が１０％を超えない値を指す。例えば、用語「約５μｇ／ｋｇ」は、４．５μｇ／ｋｇ〜５．５μｇ／ｋｇの範囲を意味する。別の例として、「約１時間」は、４８分間〜７２分間の範囲を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「活性化ＨＥＲ３」は、下流シグナル伝達経路を開始させることができる分子形態のＨＥＲ３を指す。例えば、活性化形態のＨＥＲ３としては、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３、およびＰＩ３Ｋと複合体化したＨＥＲ３が挙げられる。例えば、活性化ＨＥＲ３は、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成、ＨＥＲ３のリン酸化、または活性化ＨＥＲ３タンパク質へのＰＩ３Ｋの動員を測定することによって検出され得る。リン酸化ＨＥＲ３は、１２８９位のチロシン残基で、またはいくつかのさらなるチロシン残基の１つもしくはそれよりも多くでリン酸化され得る。加えて、活性化ＨＥＲ３は、活性化ＨＥＲ３タンパク質（すなわち、シグナル伝達経路の下流のタンパク質）と会合する他のタンパク質の動員および／またはリン酸化を検出することによって検出され得る。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、特定の空間的および極性的構成の別の分子に特異的に結合し、したがって前記分子と相補的なものと定義される免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたは組換え抗体であり得、当技術分野で周知の技術、例えば宿主の免疫および血清の回収により（ポリクローナル抗体）、または継代ハイブリッド細胞株を調製し、分泌タンパク質を回収することにより（モノクローナル抗体）、または天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはその突然変異誘発変種（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）をクローニングおよび発現させることにより調製され得る。抗体は、完全免疫グロブリンまたはその断片を含み得、これらの免疫グロブリンとしては、ＩｇＡ；ＩｇＤ；ＩｇＥ；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３；ＩｇＭなどの様々なクラスおよびアイソタイプが挙げられる。その断片としては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられ得る。抗体はまた、単鎖抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または当業者に公知の任意の他の抗体誘導体であって、特定の結合部位に対して特異的な結合活性を保持する抗体誘導体であり得る。加えて、適切な場合は、特定の結合部位に対する結合親和性が維持される限りにおいて、免疫グロブリンまたはその断片の凝集体、ポリマーおよびコンジュゲートが使用され得る。放出可能な分子タグ（下記）を用いるようなアッセイを含め、イムノアッセイに使用される抗体および抗体誘導体を作製および選択する際の指針は、容易に入手可能な教科書およびマニュアル、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｂｅｔｈｅｌｌ，２００１，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，１９９４，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られ得る。
「抗体組成物」は、上に定義した抗体であって、標識または他の化学部分への結合によってさらに改変された抗体を指す。
「抗体結合組成物」は、本明細書では、分子に結合する１つまたはそれを超える抗体または抗原結合断片を含む分子または分子複合体であって、その結合特異性がこのような抗体または抗体結合断片に由来する分子または分子複合体を指すために使用される。抗体結合組成物としては、限定されないが、（ｉ）第１の抗体が標的分子に特異的に結合し、第２の抗体が該第１の抗体の定常領域に特異的に結合する抗体対；標的分子と、ビオチン部分を介して、分子タグまたは光増感剤などの部分により誘導体化されたストレプトアビジンタンパク質とに特異的に結合するビオチン化抗体；（ｉｉ）標的分子に対して特異的であり、デキストランなどのポリマーにコンジュゲートし、ポリマーが、共有結合により直接的に、またはストレプトアビジン−ビオチン結合を介して間接的に、分子タグまたは光増感剤などの部分により誘導体化されている抗体；（ｉｉｉ）標的分子に特異的であり、ビーズ、もしくはマイクロビーズ、または他の固相支持体にコンジュゲートし、ビーズ、もしくはマイクロビーズ、または他の固相支持体が、分子タグもしくは光増感剤、または後者を含有するポリマーなどの部分により直接的または間接的に誘導体化されている抗体が挙げられる。
「抗原決定基」または「エピトープ」は、本明細書では、単一の抗体分子が結合する分子（通常はタンパク質）の表面上の部位を指すために互換的に使用される。一般に、タンパク質は、数個または多くの異なる抗原決定基を有し、異なる特異性を有する抗体と反応する。１つの好ましい抗原決定基は、タンパク質のリン酸化部位である。
本明細書で使用される場合、用語「態様」および「実施形態」は、互換的に使用される。
「結合化合物」は、本明細書では、抗体結合組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは標的タンパク質もしくは標的分子、またはタンパク質複合体などの目的の分析物との安定的な複合体形成物に特異的に結合することができる他の任意の分子実体を指すものとする。一態様では、以下の式により表され得る結合化合物は、結合部分に結合している１つまたはそれを超える分子タグを含む。
「結合部分」は、分子タグを直接的または間接的に結合させ得る任意の分子であって、分析物に特異的に結合することができる分子を指す。結合部分としては、限定されないが、抗体、抗体結合組成物、ペプチド、タンパク質、核酸、ならびに最大約１０００ダルトンの分子量を有する有機分子であって、水素、炭素、酸素、窒素、硫黄、およびリンからなる群より選択される原子を含有する有機分子が挙げられる。好ましくは、結合部分は、抗体または抗体結合組成物である。
本明細書で使用される場合、「癌」および「癌性」は、典型的には、制御不能の細胞増殖を特徴とする生物（哺乳動物を含む）の生理的状態を指すか、または前記生理的状態を表す。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌腫、肺癌、例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌、；消化器癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、および様々な種類の頭頚部癌が挙げられる。
「化学療法剤」は、癌を処置するのに使用される化学物質、主に、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤を意味する。化学療法剤は、それらが抗癌効果を及ぼすように作用する特定のタンパク質標的（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３）を有し得る。化学療法剤としては、本明細書に記載されるパクリタキセルなどの化合物が挙げられる。
本明細書で使用される語句「切断可能な結合」は、切断可能な結合で結合部分に連結されている分子タグの構造を分解せず、その検出特性に影響も与えない条件下で切断され得る化学結合基を指す。
「切断誘導部分」または「切断剤」は、本明細書では、（１）例えば、酸化により切断可能な結合を切断することができる活性種をもたらす基、および（２）例えば、還元によって切断可能な結合を直接切断し得る化合物を指すために互換的に使用される。好ましくは、活性種は、その切断誘導効果がその発生部位の近接距離内においてのみ存在するように、短命の活性を示す化学種である。直接切断可能な結合を切断することができる化学化合物の例は、還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプトエタノールまたは水素化ホウ素ナトリウムである。
本明細書で使用される場合、「切断プローブ」は、切断可能な結合を切断することができる活性種をもたらす基である切断誘導部分と、抗体結合組成物、抗体組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくは非ペプチドリガンド、タンパク質（例えば、ビオチンもしくはストレプトアビジン）、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸）、レクチンまたは標的タンパク質もしくは標的分子に特異的に結合することができるか、もしくは目的の分析物との安定的な複合体形成（例えば、タンパク質複合体）を有することができる他の任意の分子実体とを含む試薬を指す。
「ＦＦＰＥ」または「ホルマリン固定パラフィン包埋」は、固定（特に、従来のホルマリン固定）パラフィン包埋サンプルである一群の細胞またはある量の組織を指す。このようなサンプルは、典型的には、限定されないが、顕微鏡スライドまたは同等の表面にマウントした固定組織の薄切片（例えば、厚さ３〜１０μｍ）の形態で、受容体複合体のアッセイで使用される。このようなサンプルはまた、典型的には、アッセイ測定の一環としてまたはその準備として、従来の再水和手順を受け、場合により抗原回復手順を受ける。いくつかの実施形態では、切片は、正電荷のガラス面上に切断された固定組織の厚さ約５μｍの切片である。
特定の代替実施形態では、本明細書で使用される場合、「〜を上回るかまたはそれと同等の」（すなわち、≧または＞＝）は、「〜を上回る」（＞）を意味し得る。また、特定の代替実施形態では、本明細書で使用される場合、「〜を下回るかまたはそれと同等の」（すなわち、≦または＜＝）は、「〜を下回る」（＜）を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「ハザード比」は、相対リスクの推定値を作成するのに使用される統計的方法を指す。「ハザード比」は、ある群について予測されるハザードと、別の群について予測されるハザードとの比である。例えば、疾患の遠隔再発期間を延長させるためにＨＥＲ３作用剤が有効であるか否かについて、ＨＥＲ３作用剤で処置された患者集団を、ＨＥＲ３作用剤で処置されていない患者集団と対比して評価することができる。次いで、ハザード比を、独立した尺度（例えば、活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比）と比較することができる。ハザード比が１未満となる活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比では、ＨＥＲ３作用剤による処置が有効である可能性が高い。ハザード比が１と区別できない活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比では、ＨＥＲ３作用剤による処置が有効である可能性が低い。
「ＨＥＲ１」、「Ｈｅｒ１」、「Ｈｅｒ−１」、「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」などは、本明細書では、ネイティブなＨＥＲ１、ならびに例えばＣｏｈｅｎら、１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４８３４−４２およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２２８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００５２２８を参照のこと）に記載されているようなその対立遺伝子変異体を指すために互換的に使用される。特に指示がない限り、用語「ＨＥＲ１」、「Ｈｅｒ１」、「Ｈｅｒ−１」、「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」などは、本明細書で使用される場合、ヒトタンパク質を指す。ＨＥＲ１をコードする遺伝子は、本明細書では、「ｅｒｂＢ１」と称される。本明細書で使用される場合、Ｈ１Ｔは、全ＨＥＲ１発現を指すものである。
「Ｈｅｒ−２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」、「ＨＥＲ２」、「Ｈｅｒ２」および「ｎｅｕ」は、本明細書では互換的に使用され、ネイティブなＨｅｒ−２、ならびに例えばＳｅｍｂａら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６４９７−６５０およびＹａｍａｍｏｔｏら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０−２３４およびＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３３６３に記載されているようなその対立遺伝子変異体を指す。特に指示がない限り、用語「Ｈｅｒ−２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」、「ＨＥＲ２」および「Ｈｅｒ２」は、本明細書で使用される場合、ヒトタンパク質を指す。Ｈｅｒ２をコードする遺伝子は、本明細書では、「ｅｒｂＢ２」と称される。本明細書で使用されるＨ２Ｔは、全Ｈｅｒ−２発現を指すものである。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、Ｈ２３ＤまたはＨ２／３と称され得る。
本明細書で使用される場合、「ＨＥＲ２作用剤」または「ＨＥＲ２ターゲティング治療」は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２発現細胞またはＨＥＲ２陽性癌細胞の生物学的活性を阻害し得る化合物を指す。このような生物学的活性としては、限定されないが、二量体化、自己リン酸化、別の受容体のリン酸化または別の受容体によるリン酸化、シグナル伝達などが挙げられる。生物学的活性としては、限定されないが、細胞の生存および細胞の増殖を挙げることができ、ＨＥＲ２作用剤によるこのような活性の阻害は、直接的または間接的な細胞殺傷（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））、タンパク質複合体もしくは複合体形成の破壊、タンパク質輸送の調節、または酵素阻害をもたらし得る。生物学的活性はまた、本出願に記載される患者反応を含み得る。本明細書で使用されるように、ＨＥＲ２作用剤は、ＨＥＲ２と、ＨＥＲ２に結合することができるリガンドとの相互作用を妨害、遮断、低減または調節することができる分子を包含すると認識されよう。ＨＥＲ２作用剤としてはまた、ＨＥＲ２および他の生物学的標的を阻害する二重特異性剤（例えば、二重特異性抗体または二重キナーゼ阻害剤）が挙げられる。例示的なＨＥＲ２ターゲティング剤としては、限定されないが、ＢＩＢＷ２９９２、ＨＫＩ−２７２、４Ｄ５、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン、ＡＥＥ−７８８およびラパチニブが挙げられる。
「Ｈｅｒ−３」、「ＥｒｂＢ３」、「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ３」、「ＨＥＲ３」および「Ｈｅｒ３」は、本明細書では互換的に使用され、ネイティブなＨＥＲ３、ならびに例えばＫｒａｕｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｉｓｓｉｎｇ，Ｗ．，Ｍｉｋｉ，Ｔ．，Ｐｏｐｅｓｃｕ，Ｎ．Ｃ．，ａｎｄ Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９１９３−９１９７、Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｇ．Ｓ．，Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｖ．Ｌ．，Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．，Ｓｈｏｙａｂ，Ｍ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７，４９０５−４０９０およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００５９１５およびＮＭ＿００１９８２に記載されているようなその対立遺伝子変異体を指す。特に指示がない限り、用語「ＨＥＲ３」、「Ｈｅｒ３」、「Ｈｅｒ−３」、「ＥｒｂＢ３」などは、本明細書で使用される場合、ヒトタンパク質を指す。ＨＥＲ３をコードする遺伝子は、本明細書では、「ｅｒｂＢ３」と称される。本明細書で使用されるＨ３Ｔは、全ＨＥＲ３発現を指すものである。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、Ｈ２３ＤまたはＨ２／３と称され得る。
本明細書で使用される場合、「ＨＥＲ３作用剤」または「ＨＥＲ３ターゲティング治療」は、ＨＥＲ３またはＨＥＲ３発現細胞またはＨＥＲ３陽性癌細胞の生物学的活性を阻害し得る化合物を指す。このような生物学的活性としては、限定されないが、二量体化、自己リン酸化、別の受容体のリン酸化または別の受容体によるリン酸化、シグナル伝達などが挙げられる。生物学的活性としては、限定されないが、細胞の生存および細胞の増殖を挙げることができ、ＨＥＲ３作用剤によるこのような活性の阻害は、直接的または間接的な細胞殺傷（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））、タンパク質複合体もしくは複合体形成の破壊、タンパク質輸送の調節、または酵素阻害をもたらし得る。生物学的活性はまた、本出願に記載される患者反応を含み得る。本明細書で使用されるように、ＨＥＲ３作用剤は、ＨＥＲ３と、ＨＥＲ３に結合することができるリガンドとの相互作用を妨害、遮断、低減または調節することができる分子を包含すると認識されよう。ＨＥＲ３作用剤としてはまた、ＨＥＲ３および他の生物学的標的を阻害する二重特異性剤（例えば、二重特異性抗体または二重キナーゼ阻害剤）が挙げられる。例示的なＨＥＲ３作用剤としては、限定されないが、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ１／２またはＰＹＫ２にターゲティングされる大分子（例えば、抗体）または小分子（例えば、小分子キナーゼ阻害剤）が挙げられる。例えば、ＨＥＲ３ターゲティング剤としては、限定されないが、（ＨＥＲ２に結合するが、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成を遮断する）Ｕ３−１２８９／ＡＭＧ８８８、ＭＭ−１２１／ＳＡＲ２５６２１２、ＭＭ−１１１、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＡＺＤ−８９３１、ＬＪＭ７１６、Ａｖ−２０３およびペルツズマブが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体」は、ホスファチジルイノシチド３−キナーゼのｐ８５調節サブユニット（ｐ８５）が結合した活性化ＨＥＲ３を指す。ＨＥＲ３は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を直接活性化し得る主なＨＥＲファミリーメンバーである。一般に、ＨＥＲ３は、別のＨＥＲタンパク質（例えば、ＨＥＲ２）と二量体化すると活性化され、このタンパク質の細胞質ドメインにおけるチロシンがリン酸化される。これらのリン酸化チロシン残基がｐ８５−ＰＩ３Ｋ結合の動員部位として作用して、ＰＩ３Ｋの触媒サブユニット（ｐ１１０−ＰＩ３ＫＣａ）を活性化し、今度はこれが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を介した細胞内シグナル伝達につながる。本明細書で使用されるＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体は、「ＨＥＲ３−ＰＩ３キナーゼ」と称され得る。
本明細書で使用される場合、「ＨＥＲ３陽性」または「活性化ＨＥＲ３」癌、癌細胞、被験体または患者は、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有する癌細胞、被験体または患者を指す。
語句「活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比」は、当業者に利用可能な任意の単一定量法にしたがって、被験体の組織（例えば、腫瘍）由来のサンプルにおける活性化ＨＥＲ３分子の量をＨＥＲ３の総量で割ったものを表す尺度を指す。
「高」は、通常を上回る尺度、標準（例えば、所定尺度またはサブグループ尺度）を上回る尺度、または別のサブグループ尺度を比較的上回る尺度を指す。例えば、高全ＨＥＲ３は、正常細胞／健常細胞で、またはあるいは特定の癌細胞で通常観察されるＨＥＲ３尺度を上回るＨＥＲ３尺度を指す。例えば、高ＨＥＲ３は、特定のサンプル（健常または腫瘍）セットにおける通常の平均的なＨＥＲ３尺度の中央値を上回るＨＥＲ３尺度を意味する。高ＨＥＲ３はまた、所定の尺度（例えば、所定のカットオフ）と同等であるかまたはそれを上回る尺度を指し得る。高ＨＥＲ３はまた、高ＨＥＲ３サブグループが、別のサブグループよりも比較的高レベルのＨＥＲ３を有するＨＥＲ３尺度を指し得る。例えば、限定されないが、本明細書によれば、数学的に決定したポイント（例えば限定されないが、中央値）付近でサンプルを分割して、その尺度が高い（すなわち、中央値よりも高い）サブグループおよびその尺度が低い別のサブグループを作り出すことにより、２つの異なる患者サブグループを作り出すことができる。当業者に既知の任意の方法、例えば、限定されないが、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）を使用して、または任意の標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）法を使用して、ＨＥＲ３を測定することができる。
別の例として、高活性化ＨＥＲ３は、特定の生物学的サンプル（健常細胞／正常細胞または腫瘍サンプル）セットで観察される活性化ＨＥＲ３尺度を上回る活性化ＨＥＲ３尺度を指す。高活性化ＨＥＲ３はまた、所定の尺度（例えば、所定のカットオフ）を上回る尺度を指し得る。高活性化ＨＥＲ３はまた、高活性化ＨＥＲ３サブグループが、別のサブグループよりも比較的高レベルの活性化ＨＥＲ３を有する活性化ＨＥＲ３尺度を指し得る。活性化ＨＥＲ３は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、二量体特異的抗体またはＶｅｒａＴａｇ（登録商標）（Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）などの当技術分野で公知の方法、または当業者に周知の任意の他の方法によって測定され得る。
一部の場合では、「高」発現レベルは、非常に高い発現範囲と、「中程度に高い」発現範囲とを含み得、この場合、中程度に高いとは、通常を上回るが「非常に高い」を下回る発現レベルである。別の例として、高活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比は、活性化ＨＥＲ３の１つまたはそれを超えるサブグループと全ＨＥＲ３との比であって、低比サブグループを上回る尺度を有する比を指し得る。
本明細書で使用される場合、「中程度に高い」、「中間」または「中」は、「低」を上回るが「高」を下回る尺度を指す。例えば、「中」は、全ＨＥＲ３および活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比に関する中範囲の尺度に該当するサブグループの１つまたはそれよりも多くを表すのに使用され得る。
本明細書で使用される場合、「〜する可能性が高い」は、項目、対象、事柄または個人が現れる確率が高いことを指す。したがって、一例では、ＨＥＲ３作用剤（例えば、セツキシマブ）による処置に対して反応する可能性が高い被験体は、参照被験体または被験体群と比べて、ＨＥＲ３作用剤による処置に対して反応する確率が高い。
本明細書で使用される場合、「長い」は、通常を上回る時間尺度、標準（例えば、所定の尺度）を上回る時間尺度、または別のサブグループ尺度よりも比較的長いサブグループ尺度を指す。例えば、患者の寿命に関して、長い無増悪期間は、同じ種類の癌を有する被験体で観察される通常の無増悪期間または平均的な無増悪期間または無増悪期間の中央値よりも長い無増悪期間を指す。無増悪期間が長いか否かは、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。長いとは、例えば、無増悪を含み得る。一実施形態では、「長い」は、疾患において重大事象が起こるのに必要な時間経過の中央値よりも長い時間を指す。
「低」は、通常を下回る尺度、標準（例えば、所定の尺度）を下回る尺度、または別のサブグループ尺度を比較的下回るサブグループ尺度を指す用語である。例えば、低全ＨＥＲ３は、正常細胞／健常細胞で、またはあるいは特定の癌細胞で通常観察されるＨＥＲ３尺度を下回るＨＥＲ３尺度を指す。例えば、低ＨＥＲ３は、特定のサンプル（健常または腫瘍）セットにおける通常の平均的なＨＥＲ３尺度の中央値を下回るＨＥＲ３尺度を意味する。低ＨＥＲ３はまた、所定の尺度（例えば、所定のカットオフ）を下回る尺度を意味し得る。低ＨＥＲ３はまた、低ＨＥＲ３サブグループが、別のサブグループよりも比較的低い尺度を意味し得る。例えば、限定されないが、本明細書によれば、数学的に決定したポイント（例えば限定されないが、中央値）付近でサンプルを分割して、その尺度が高い別のグループと比べてその尺度が低い（すなわち、中央値よりも低い）グループを作り出すことにより、２つの異なる患者サブグループを作り出すことができる。当業者に既知の任意の方法、例えば、限定されないが、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して、または任意の標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）法を使用して、ＨＥＲ３を測定することができる。
別の例として、低活性化ＨＥＲ３は、特定の生物学的サンプル（健常細胞／正常細胞または腫瘍サンプル）セットで観察される通常の活性化ＨＥＲ３尺度を下回る活性化ＨＥＲ３尺度を意味する。低活性化ＨＥＲ３はまた、所定の尺度（例えば、所定のカットオフ）を下回る尺度を意味し得る。低活性化ＨＥＲ３はまた、低活性化ＨＥＲ３サブグループが、別のサブグループよりも比較的小さい尺度を意味し得る。ＨＥＲ３含有二量体（例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲヘテロ二量体）は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、二量体特異的抗体またはＶｅｒａＴａｇ（登録商標）などの当技術分野で公知の方法、または当業者に周知の任意の他の方法によって測定され得る。別の例として、低活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比は、活性化ＨＥＲ３の１つまたはそれを超えるサブグループと全ＨＥＲ３との比であって、中比サブグループまたは高比サブグループを下回る尺度を有する比を指し得る。低活性化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比は、当業者に利用可能な任意の個々の定量方法により決定することができる。低いＨＥＲ３発現値の範囲例は、本明細書に示されている。
本明細書で使用される場合、「分子タグ」は、分離される分子間における１つまたはそれを超える物理的、化学的または光学的差異（限定されないが、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、極性などを含む）に基づき、他の分子と区別することができる分子を指す。一態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットは、電気泳動移動度および光学的検出特性において異なり、電気泳動により分離することができる。別の態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットは、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において異なり得、正相ＨＰＬＣもしくは逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィーまたは類似技術により分離することができる。本明細書に記載されるように、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子は、分子タグの一種である。
本明細書で使用される場合、「最適カットオフ」は、２つの属性カテゴリー間の最良の区別を可能とする特定の属性を示す被験体についての所定の尺度の値を指す。例えば、最適カットオフ値を見出すことにより、２つのカテゴリー（例えば、高Ｈ３Ｔ発現および低Ｈ３Ｔ発現）間の最良の区別が可能になる。予測モデルを最適化するための（例えば限定されないが、モデルの特異性を最大化するための、モデルの感度を最大化するための、転帰の差異を最大化するための、またはハザード比もしくは反応の差異によるｐ値を最小化するための）最適カットオフよりも低い値または高い値を有する被験体を分離するために、最適カットオフを使用する。
「全生存期間」または「ＯＳ」は、処置の開始から死亡または打切までに測定される期間を指す。打切は、試験の終了によってもたらされ得るか、または処置の変更によってもたらされ得る。全生存期間は、例えば、特定の時点（処置の開始から死亡または打切までの期間）で生存している確率（例えば、キャプラン−マイヤープロットで表した場合の確率）を指し得る。
「光増感剤」は、光により活性化されると、酸素分子を一重項酸素に変換する光吸収分子を意味するものとする。
「ＲＥＣＩＳＴ」は、「固形腫瘍の治療効果判定のためのガイドライン（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｕｒｓ）」を表す頭字語を意味するものとし、処置中に、癌患者が改善する場合（「反応」）、同じ状態にとどまる場合（「安定」）、または悪化する場合（「増悪」）を定義する公表規則のセットである。ＲＥＣＩＳＴ基準により定義される反応は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．３，２０００年２月２日において公表されており、ＲＥＣＩＳＴ基準は、他の類似の公表定義および規則のセットを含み得る。当業者であれば、「ＰＲ」、「ＣＲ」、「ＳＤ」、および「ＰＤ」などの本明細書で使用されるＲＥＣＩＳＴ基準に準拠する定義を理解するであろう。
「相対ピーク面積」または「ＲＰＡ」は互換的に使用され、特定のＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の蛍光測定値と、既知の一定濃度の既知の内部蛍光標準の蛍光測定値との比を指すものとする。
本明細書で使用される場合、処置に対する「反応性」、処置に対して「反応する」、ならびにこの動詞の他の形態は、Ｈｅｒ−２作用剤による処置に対する被験体の反応を指す。例として、被験体における腫瘍の増殖が約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超えて遅延する場合、被験体は、Ｈｅｒ−２作用剤による処置に対して反応する。別の例では、被験体における腫瘍が、任意の適切な尺度（例えば、質量または容量）により決定したときに約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれを超えて縮小する場合、被験体は、Ｈｅｒ−２作用剤による処置に対して反応する。別の例では、被験体の予測寿命が、処置が行われない場合に予測される予測寿命より約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれを超えて長い場合、被験体は、Ｈｅｒ２作用剤による処置に対して反応する。別の例では、被験体の無病生存期間、全生存期間、または無増悪期間が長い場合、被験体は、Ｈｅｒ−２作用剤による処置に対して反応する。上記の通り、ＲＥＣＩＳＴ基準を含め、いくつかの方法を使用して、患者が処置に対して反応するかを決定することができる。
用語「サンプル」、「組織サンプル」、「患者サンプル」、「患者の細胞サンプルもしくは組織サンプル」または「試料」はそれぞれ、被験体または患者の組織から得られる同様の細胞のコレクションを指す。組織サンプルの供給源は、新鮮な内臓サンプルもしくは組織サンプル、凍結および／もしくは保存した内臓サンプルもしくは組織サンプル、または生検もしくは吸引物などに由来する固体組織；血液または任意の血液構成成分；脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液などの体液；または被験体の妊娠または発達の任意の時点に由来する細胞であり得る。組織サンプルは、保存剤、抗凝固剤、バッファー、固定剤、栄養物、抗生物質などのような、天然の組織と天然では混合しない化合物を含有し得る。細胞は、従来の方法（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ））により固定することができる。
本明細書で使用される場合、「短い」は、通常よりも短い時間尺度、標準（例えば、所定の尺度）よりも短い時間尺度、または別のサブグループ尺度よりも比較的短いサブグループ尺度を指す。例えば、患者の寿命に関して、短い無増悪期間は、同じ種類の癌を有する被験体で観察される通常の無増悪期間または平均的な無増悪期間または無増悪期間の中央値よりも短い無増悪期間を指す。無増悪期間が短いか否かは、当業者に利用可能な任意の方法により決定することができる。一実施形態では、「短い」は、疾患において重大事象が起こるのに必要な時間経過の中央値よりも短い時間を指す。
本明細書で使用される場合、「重大事象」は、当業者により臨床的に重要であると決定される、患者の疾患における事象を指すものとする。重大事象の例としては、例えば限定されないが、一次診断、死亡、再発、患者の疾患が転移性であるという決定、患者の疾患の再発、または患者の疾患の上記病期のいずれか１つから別の病期への進行が挙げられる。重大事象は、全生存期間（ＯＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）または無増悪期間（ＴＴＰ）を評価するのに使用される任意の臨床的に重要な事象であり得る。いくつかの重大事象は、当業者により決定される通り、ＲＥＣＩＳＴもしくは他の効果決定基準を使用して決定され得る。
本明細書で使用される場合、用語「被験体」および「患者」は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「１または複数の被験体」は、動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザル、ゴリラ、チンパンジーおよびヒト）を含む哺乳動物を指す。
本明細書で使用される場合、「時間経過」は、初期事象と後続事象との間の期間の量を指すものとする。例えば、患者の癌に関して、時間経過は、患者の疾患に関するものであり得、例えば、ＲＥＣＩＳＴ基準または他の反応基準を使用して、疾患の進行における臨床的に重要な事象を判断することにより測定され得る。例えば、初期事象は診断であり得、後続事象は転移であり得る。
「無増悪期間」または「ＴＴＰ」は、処置の開始から癌の増悪または打切までに測定される期間を指す。打切は、試験の終了によってもたらされ得るか、または処置の変更によってもたらされ得る。無増悪期間はまた、例えば、キャプラン−マイヤープロットによるような確率として表され得、この場合、無増悪期間は、特定の期間（処置の開始から増悪または打切までの期間）にわたって無増悪の可能性を表し得る。
「処置する」、「処置」、およびこの語の他の形態は、作用剤を投与して、癌の増殖を阻害し、癌の重量もしくは容積を縮小させ、被験体の予測生存期間および／または腫瘍の無増悪期間を延長させることなどを指す。
「〜する可能性が低い」は、参照に関して、事象、項目、対象、事柄または患者が現れる確率が低いことを指す。したがって、ＨＥＲ３作用剤による処置に対して反応する可能性が低い被験体は、参照被験体または被験体群と比べて、ＨＥＲ３作用剤による処置に対して反応する確率が低い。
「ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）」および「ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ」は、本明細書では互換的に使用され、単一標識フォーマットおよび多重標識フォーマットの両方の単一イムノアッセイおよび多重化イムノアッセイ、このようなアッセイを実施および利用するための材料、方法および技術（限定されないが、これらのアッセイ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｃｓｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）に関連する試薬、分析手順およびソフトウェアを含む）を指す。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイとの関連での標識はＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子と称される検出可能な部分である。このようなアッセイは、本出願において、ならびに米国特許第７，６４８，８２８号および米国特許出願公開第２０１０／０１４３９２７号；米国特許出願公開第２０１０／０２３３７３２号；および米国特許出願公開第２０１０／０２１００３４号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
本明細書で使用される場合、「ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子」または「ｖＴａｇ」は、「ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で使用される抗体に結合される検出可能な部分を指すために使用される。
ＨＥＲ３の分析を含む方法
本発明の態様および実施形態は、ＨＥＲ３活性化の検出に基づいて、癌の診断、予後予測および処置を容易にするためのシステムおよび方法を提供する。特定の実施形態では、前記方法は、癌を有する被験体が、ＨＥＲ３作用剤による処置に対して反応する可能性が高いかを決定すること、ならびに／または癌を有する被験体における疾患の時間経過および／もしくは該疾患の時間経過において重大事象が起こる確率を予測することを含む。特定の実施形態では、前記方法は、活性化ＨＥＲ３を単独で、または本明細書に記載されるＨＥＲ３作用剤による処置の反応性に関連する他のバイオマーカーと組み合わせて検出すること、および被験体が、該ＨＥＲ３作用剤単独による処置、またはＨＥＲ３作用剤を別の薬剤（例えば、ＨＥＲ２作用剤）と組み合わせた処置に対して反応するかを決定することを含む。特定の実施形態では、前記方法は、バイオマーカーとしてまたはバイオマーカーの組み合わせで活性化ＨＥＲ３を測定することおよび、癌を有する被験体における疾患の増悪に関連する時間経過、または該疾患の時間経過において重大事象が起こる確率を予測することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、活性化ＨＥＲ３を測定すること、および被験体に適切な処置（例えば、ＨＥＲ３ターゲティング剤）を決定することを含む。
一態様では、本発明は、腫瘍における活性化ＨＥＲ３の量を測定するための方法であって、（ａ）腫瘍由来のサンプルを提供すること；（ｂ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、および前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；ならびに（ｃ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと、全ＨＥＲ３タンパク質との比を決定することを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍における活性化ＨＥＲ３の量を測定するための方法であって、（ａ）腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、および前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと、全ＨＥＲ３タンパク質との比を決定すること；および（ｃ）（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、および（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つが、前記参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、前記腫瘍が多量の活性化ＨＥＲ３を有することを示すことを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、癌を有する被験体を処置する方法であって、（ａ）（ｉ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定し、（ｉｉ）前記腫瘍サンプルが大量の全ＨＥＲ３タンパク質、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つを含むかを決定することによって、前記被験体の癌が多量の活性化ＨＥＲ３を有するかを決定すること；（ｂ）ＨＥＲ３ターゲティング治療を前記被験体に行うことを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、癌を有する被験体を処置する方法であって、（ａ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定すること；（ｃ）被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有するかを決定すること（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）；ならびに（ｄ）前記被験体の癌が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする場合、ＨＥＲ３ターゲティング治療を前記被験体に行うことを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、癌を有する被験体のＨＥＲ３作用剤に対する反応性を予測するための方法であって、（ａ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；（ｂ）（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つが、前記参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、前記被験体が、前記ＨＥＲ３作用剤に対して反応する可能性がより高いことを示すことを含む方法を提供する。本発明の特定の態様では、ＨＥＲ３作用剤に対する反応性は、被験体がＨＥＲ３作用剤で処置されている間、診断または処置の開始と重大事象の発生との間のより長い疾患時間経過を含む。本発明のいくつかの態様では、重大事象は、ある病期からより進行期への癌の進行、転移性疾患への進行、再発、手術または死亡の少なくとも１つを含む。
別の態様では、本発明は、癌を有する被験体のＨＥＲ３作用剤に対する反応性を予測するための方法であって、（ａ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；（ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定すること；（ｃ）被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有するかを決定すること（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）；ならびに（ｄ）前記被験体の癌が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする場合、前記被験体は、ＨＥＲ３作用剤に対して反応する可能性がより高いことを示すことを含む方法を提供する。本発明のいくつかの態様では、前記方法は、被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して被験体が反応する可能性がより高いことを示すことをさらに含み得る。本発明の特定の態様では、ＨＥＲ３作用剤に対する反応性は、被験体がＨＥＲ３作用剤で処置されている間、診断または処置の開始と重大事象の発生との間のより長い疾患時間経過を含む。本発明のいくつかの態様では、重大事象は、ある病期からより進行期への癌の進行、転移性疾患への進行、再発、手術または死亡の少なくとも１つを含む。
上記各実施形態に関する本発明のさらなる態様および実施形態を以下に記載する。
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、（ｉ）サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つが、参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、腫瘍／癌が多量の活性化ＨＥＲ３を有することを示すことをさらに含み得る。本発明の特定の実施形態では、生物学的サンプルまたは腫瘍サンプル中に存在するＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体からなる群より選択される少なくとも２つのＨＥＲ３実体の量を決定することによって、癌／腫瘍における活性化ＨＥＲ３の量を検出する。
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＥＲ３リン酸化特異的抗体またはＨＥＲ３パンホスホ（ｐａｎ−ｐｈｏｓｐｏ）抗体を使用することによって、生物学的サンプルまたは腫瘍サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量を検出する。特定の実施形態では、ＨＥＲ３の１２８９位のチロシン残基でリン酸化されたＨＥＲ３タンパク質に結合するリン酸化特異的抗体を使用することによって、腫瘍におけるＨＥＲ３リン酸化の量を検出する。
本発明のいくつかの実施形態では、記載される方法に係る癌／腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、脳癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌または子宮頸癌の少なくとも１つを含み得る。一実施形態では、癌は、乳癌である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、乳癌を含み得る。いくつかの実施形態では、癌は、転移性または再発性である。いくつかの実施形態では、癌は、早期癌である。あるいは、ＨＥＲ３作用剤に対して感受性であり得る任意の癌を分析またはモニタリングし得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＥＲ３ターゲティング剤の使用に関する。ＨＥＲ３ターゲティング剤は、当業者に公知の任意のこのような薬剤であり得る。特定の実施形態ではＨＥＲ３ターゲティング剤は、ＨＥＲ３特異的抗体（二重特異性抗体を含む）またはタンパク質キナーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＨＥＲ３ターゲティング剤は、（ＨＥＲ２に結合するが、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成を遮断する）Ｕ３−１２８９／ＡＭＧ８８８、ＭＭ−１２１／ＳＡＲ２５６２１２、ＭＭ−１１１、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＡＺＤ−８９３１、ＬＪＭ７１６、Ａｖ−２０３またはペルツズマブの少なくとも１つである。また、本明細書に記載される方法を使用して、他のＨＥＲ３ターゲティング剤を評価し得る。
本発明の各方法の特定の実施形態では、少なくとも１つの他のバイオマーカーについて、サンプルを分析し得る。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他のバイオマーカーも測定し得る。例えば、いくつかの実施形態では、他のバイオマーカーは、全ＨＥＲ２を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの他のバイオマーカーは、ＰＴＥＮ、ＭＥＴ、ＳＴＫ１１、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＡＫＴ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＩ３ＫＲ１、ＣＣＮＤ１、ＳＴＡＴ５、ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−４からなる群より選択される。
特定の実施形態では、前記方法は、被験体の癌由来の生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３の量を検出することを含み、ここで、全ＨＥＲ３および活性化ＨＥＲ３の量が多い場合、患者はＨＥＲ３作用剤に対して反応する可能性があり、および／または患者は長い時間経過を有する。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、被験体由来の生物学的サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量の相対レベルを、前記被験体がＨＥＲ３作用剤による処置に対して反応する可能性に関する予後予測と相関させるための方法であって、（ａ）前記被験体の癌由来の生物学的サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を検出すること；および（ｂ）前記活性化ＨＥＲ３の量を、前記被験体がＨＥＲ３作用剤による処置に対して反応する可能性に関する予後予測と相関させることを含む方法を含む。
特定の実施形態では、活性化ＨＥＲ３の量が第１のカットオフと同等であるかまたはそれを上回る場合、被験体の予後予測は、ＨＥＲ３作用剤に対して反応する可能性が高いことである。あるいは、活性化ＨＥＲ３の量が第１のカットオフレベルよりも低い場合、被験体の予後予測は、ＨＥＲ３作用剤に対して反応する可能性が低いことである。いくつかの実施形態では、第１のカットオフは、同じ癌を有する被験体の参照集団における活性化Ｈｅｒ３の中央値レベルを含む。特定の実施形態では、参照集団における活性化ＨＥＲ３の中央値レベルは、所定の尺度を含む。いくつかの実施形態では、活性化ＨＥＲ３は、全ＨＥＲ３の尺度＋ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３との比である。
また、特定の実施形態では、所定の尺度は、複数の被験体サンプルを少なくとも２つのサブグループに分けることによって作り出され、第１のサブグループは、生物学的サンプルにおいて低レベルの全ＨＥＲ３分子を有するサンプルを含み、前記低レベルは、閾値レベル（カットオフ）と同等であるかまたはそれを下回る全ＨＥＲ３分子の量を有することを含み；第２のサブグループは、高レベルの全ＨＥＲ３分子を有するサンプルを含み、前記高レベルは、閾値レベル（カットオフ）を上回る活性化ＨＥＲ３分子の量を有することを含む。前記方法の他の実施形態では、所定の尺度は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を検出することによって決定される活性化ＨＥＲ３のレベルに基づいて、高レベル全ＨＥＲ３サブグループを少なくとも２つのサブグループに分けることによって作り出される。いくつかの実施形態では、カットオフは、参照集団における中央値である。
特定の実施形態では、前記方法は、被験体の癌由来の生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３の量を検出することを含み、ここで、全ＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３の量が多い場合、患者はＨＥＲ３作用剤に対して反応する可能性があり、および／または患者は長い時間経過を有する。いくつかの実施形態では、活性化ＨＥＲ３を測定する。
他の実施形態では、本発明は、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有する癌を有する被験体における疾患時間経過を予測するための方法に関する。他の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ３陽性癌を有する被験体における重大事象の確率を予測するための方法に関する。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、癌を有する被験体であって、ＨＥＲ３作用剤で処置されている被験体が重大事象を有する可能性が高いかを予測するための方法であって、（ａ）前記被験体の癌由来の生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３の量を検出する工程；ならびに（ｂ）全ＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３の量を、前記被験体が重大事象を有する可能性と相関させる工程を含む方法を含む。いくつかの実施形態では、重大事象は、癌の診断と、ある病期からより進行期への癌の進行、転移性疾患への進行、再発、手術または死亡の少なくとも１つとの間の時間の減少である。また、特定の実施形態では、前記方法は、重大事象が発生し得る時間経過を予測することをさらに含み得る。特定の実施形態では、時間経過は、患者の疾患過程における重大事象間の時間を決定することによって測定され、前記測定は、患者が長い時間経過を有するかの予測因子である。一態様および実施形態では、重大事象は、一次診断から死亡への進行である。別の態様および実施形態では、重大事象は、一次診断から転移性疾患への進行である。また別の態様および実施形態では、重大事象は、一次診断から再発への進行である。別の態様および実施形態では、重大事象は、転移性疾患から死亡への進行である。別の態様および実施形態では、重大事象は、転移性疾患から再発への進行である。別の態様および実施形態では、重大事象は、再発から死亡への進行である。特定の実施形態では、時間経過は、全生存率、無増悪期間に関して、および／またはＲＥＣＩＳＴもしくは他の反応基準を使用して測定される。
別の実施形態では、本発明は、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有する癌を有する被験体が、ＨＥＲ３作用剤による処置に対して反応する可能性があり、および／または長い疾患時間経過を有するかを決定するための方法を含む。
特定の実施形態では、ＨＥＲ３作用剤を含む併用療法を被験体に行い得る。併用療法は、限定されないが、当業者に公知の任意の化学療法剤の１つまたはそれよりも多くと組み合わせたＨＥＲ３作用剤を含み得る。好ましくは、化学療法剤は、ＨＥＲ３作用剤と異なる作用機構を有する。例えば、化学療法剤は、抗代謝産物（例えば、５−フルオロウラシル（ｆｌｏｕｒｏｕｒｉｃｉｌ）（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、フルダラビンなど）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン；ビンブラスチン；タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル；など）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メルファラン、ビスクロロエチルニトロソ尿素（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）など）、白金剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＪＭ−２１６、ＣＩ−９７３など）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシンなど）、抗生物質製剤（例えば、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、カンプトテシンなど）または当業者に公知の他の任意の他の化学療法剤であり得る。
本発明の医薬組成物、剤形およびキットを含む本発明の様々な実施形態に使用され得る化学療法剤の特定の例としては、限定されないが、シタラビン、メルファラン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、イダルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、シスプラチン、パクリタキセルおよびシクロホスファミドが挙げられる。
使用され得る他の化学療法剤としては、アバレリクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ ｌｉｖｅ、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｅｉｚｕｍａｂ）、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シナカルセト、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、エリオットＢ溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガミシン、ゲフィチニブ、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン（ｍｅｃｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オブリメルセン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロザン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、タルセバ、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンおよびゾレドロネートが挙げられる。
別の態様では、本発明は、ＨＥＲ３活性化癌を有する被験体が、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤による処置に対して反応する可能性が低いか、および／または患者が短い時間経過を有する可能性が高いかを決定するための方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、被験体の癌由来の生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３の量を測定することを含み、ＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３のレベルが高いかまたは非常に高い場合、患者は、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤による処置に対して反応する可能性が低い。
別の態様では、本発明は、ＨＥＲ３陽性癌を有する被験体が、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤による処置に対して反応する可能性が高いかを決定するための方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、被験体の癌由来の生物学的サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を測定することを含み、活性化ＨＥＲ３のレベルが高い場合、患者は、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤による処置に対して反応する可能性が高い。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、ＦＦＰＥ組織を含む。特定の実施形態では、癌は、転移性または再発性である。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ３作用剤に対して感受性であり得る任意の癌をモニタリングし得る。ＨＥＲ３作用剤は、任意のＨＥＲ３作用剤であり得る。特定の実施形態では、ＨＥＲ３作用剤は、本明細書に記載される薬剤の１つである。あるいは、当技術分野で公知の他のさらなる化学療法剤を評価し得る。特定の実施形態では、反応可能性または時間経過は、全生存率、無増悪期間に関して、および／またはＲＥＣＩＳＴ基準を使用して測定される。
ＨＥＲ２ターゲティング剤は、当業者に公知の任意のこのような薬剤であり得る。特定の実施形態では、ＨＥＲ２ターゲティング剤は、ＢＩＢＷ２９９２、ＨＫＩ−２７２、４Ｄ５、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン、ＡＥＥ−７８８またはラパチニブの少なくとも１つであり得る。特定の実施形態では、反応可能性は、全生存率、無増悪期間に関して、および／またはＲＥＣＩＳＴ基準もしくは他の反応基準を使用して測定される。
いくつかの実施形態では、本発明は、生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量を測定すること、および被験体がＨＥＲ２陽性癌またはＨＥＲ２陰性癌を有するかを決定することをさらに含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＥＲ２陰性癌およびＨＥＲ２陽性癌は、（例えば、ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで）免疫組織化学またはインサイチューハイブリダイゼーション分析によって特性評価される。いくつかの実施形態では、本発明は、被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療を行うことをさらに含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示すことをさらに含み得る。
特定の実施形態では、本発明は、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陽性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の下位５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第１のカットオフを下回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性）か、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陰性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の上位９５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第２のカットオフを上回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性）か、または全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回るが、第２のカットオフを下回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性）かを決定することをさらに含み得る。特定の実施形態では、本発明は、腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回る場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療を行うことをさらに含み得る。特定の実施形態では、本発明は、生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回る場合、被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示すことをさらに含み得る。
本明細書で議論されるように、特定の実施形態では、サンプルにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の量を測定および／または定量することができるアッセイを使用して、活性化ＨＥＲ３の量を測定する。サンプルにおける全ＨＥＲ３発現および／または活性化ＨＥＲ３の量を直接測定するのに有用であることが当業者に公知の任意の方法を使用し得る。例えば、ＨＥＲ３発現の量を決定する任意の定量アッセイを使用して、ＨＥＲ３発現または活性化に代表的な細胞または癌によってどの程度のシグナルが生成されるかを決定し得る。このような方法としては、必ずしも限定されないが、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ、生体分子蛍光相補性および近接ライゲーションアッセイが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイで生成されるシグナルを、異なるアッセイから生成されるシグナルと比較して、２つのアッセイ間の対応を決定し得る。
特定の実施形態では、癌を有する被験体由来の生物学的サンプルと、結合化合物であって、切断可能な結合によってそれに結合した分子タグを有する結合化合物、および切断プローブであって、切断誘導部分を有する切断プローブとを接触させ、何の分子タグが放出されたかを検出することによって、前記量を検出する。図１は、本発明の実施形態に係る様々なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットの概略図を提供する。組織切片を固定し、次いで、切断誘導剤を有する第１の抗体、および検出可能な部分（例えば、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子）に連結した第２の抗体に結合させる。例えば、図１Ａに示されているように、第１の抗体をビオチンにコンジュゲートし、第２の抗体をＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子にコンジュゲートする。次いで、ストレプトアビジン官能化増感色素をビオチンコンジュゲート抗体に結合させ得る。切断誘導剤の光誘導を実施して、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の溶液中への切断を誘導する一重項酸素を放出させ得る。次いで、この溶液を回収し、キャピラリー電気泳動によって分析する。いくつかの実施形態では、図１Ｂに示されているように、アッセイをマイクロプレートフォーマットで実施し得る。例えば、サンプルをマイクロプレートのウェルに追加し、次いで、抗体を追加する：ある標的タンパク質に対して特異的な第１の抗体をビオチンにコンジュゲートし、第２の標的タンパク質に対して特異的な第２の抗体をＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子にコンジュゲートする。ストレプトアビジン官能化増感色素でコーティングしたビーズを使用して、ビオチンコンジュゲート抗体を捕捉し得る。切断誘導剤の光誘導を実施して、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の溶液中への切断を誘導する一重項酸素を放出させ得る。次いで、この溶液を各ウェルから回収し、キャピラリー電気泳動によって分析する。いくつかの実施形態では、図１Ｃに示されているように、光増感誘導切断に代えてＤＴＴによって、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の切断を引き起こし得る。
検出アッセイの例は、本明細書および共有の米国特許出願公開第２００９／０１９１５５９号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）（全ＨＥＲ２とＨＥＲ２ホモ二量体の検出が記載されている）に記載されている。同様の戦略を使用して、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ｃＭＥＴ、ｐ−９５などの他のバイオマーカーを測定し得る。例えば、米国特許第７，６４８，８２８号ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１４３９２７号；米国特許出願公開第２０１０／０２３３７３２号；および米国特許出願公開第２０１０／０２１００３４号を参照のこと。
特定の実施形態では、１つまたはそれを超える（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを使用して、ＨＥＲバイオマーカーレベルを測定し得る。例えば、全ＨＥＲ３レベルを測定する場合、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する一次抗体を使用し得る。次いで、二次抗体であって、それに結合したＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を有する二次抗体を使用して、一次抗体に特異的に結合させ得る。このアッセイフォーマットの特定の実施形態では、図１Ｃに示されているように、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を用いて、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を切断し得る。
全ＨＥＲ２、全ＨＥＲ３およびリン酸化ＨＥＲ３の量を測定する場合、２つの一次抗体（両方の一次抗体が標的タンパク質に対して特異的である）を使用し得る。第１の一次抗体は、結合したメチレンブルー色素を有し、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３の細胞内ドメインに結合し得る。第２の一次抗体は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子にコンジュゲートされており、同様にＨＥＲ２またはＨＥＲ３の細胞内ドメインに結合し得る。光増感すると、メチレンブルー色素は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子がごく近接距離内にある場合にこの分子の切断を引き起こす一重項酸素を放出させる。２つの一次抗体は同一であり得るか、またはＨＥＲ分子の２つの異なるエピトープに結合し得る。ＨＥＲ３リン酸化を測定する場合、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子コンジュゲート抗体は、リン酸化エピトープ（例えば、アミノ酸位置１２８９）に結合し得る。
例えば、本発明のいくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量の測定は、ａ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルとＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程；ｂ）前記ＨＥＲ３抗体組成物とタグ付結合組成物とを接触させる工程であって、前記タグ付結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含み、前記タグ付結合組成物が、前記ＨＥＲ３抗体組成物に特異的に結合する工程；ｃ）前記タグ付結合組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；およびｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３タンパク質の量を決定する工程を含み得る。
また、本発明のいくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量の測定は、ａ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと、第１の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第１のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第１のＨＥＲ３結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む工程；ｂ）前記腫瘍サンプルと、第２の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；ｃ）前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；およびｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３タンパク質の量を決定する工程を含み得る。
ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を測定する場合、アッセイフォーマットは、一般に、検出される各タンパク質に結合する２つの一次抗体、および一方または他方の一次抗体に特異的に結合する２つの二次抗体を使用する。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に結合する一次抗体は、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかに特異的に結合し得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を検出する場合、ＨＥＲ３に結合する一次抗体は、細胞内ドメインに特異的に結合する。例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の検出の場合、ＨＥＲ２一次抗体を、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子にコンジュゲートした二次抗体と併せて使用し得、ＨＥＲ３抗体を、光増感剤（例えば、メチレンブルー）にコンジュゲートした二次抗体と併せて使用し得る。あるいは、代替的な構成として、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を、ＨＥＲ３抗体に結合する二次抗体にコンジュゲートし得、光増感剤を、ＨＥＲ２抗体に結合する二次抗体にコンジュゲートし得る。光増感すると、二次抗体が互いにごく近接距離内に位置する場合（例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体が形成した場合）、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子が切断され得る。続いて、例えば電気泳動によって、切断したレポーター分子を次に分離し得る。ＨＥＲ３およびＰＩ３Ｋに結合する一次抗体を使用してＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を検出するために、同じアッセイフォーマットを使用し得る。加えて、本明細書の他の箇所に記載されているように、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を検出するために、改変フォーマットを使用し得る。
ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を検出するための他のアッセイフォーマットでは、分子タグ（例えば、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子）と、切断誘導部分（例えば、光増感剤）を有する切断プローブとを一次抗体に直接コンジュゲートし、二次抗体を使用しない。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に結合する一次抗体は、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかに特異的に結合し得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を検出する場合、ＨＥＲ３に結合する一次抗体は、細胞内ドメインに特異的に結合する。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の測定は、ａ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと、切断可能な結合を介して抗体組成物に結合した分子タグを含む抗体組成物とを接触させる工程；ｂ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；ｃ）前記抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；およびｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を決定する工程を含み得、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の測定の場合には、前記抗体組成物がＨＥＲ３に特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ２に特異的に結合するか、または前記抗体組成物がＨＥＲ２に特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合し、ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の測定の場合には、前記抗体組成物がＨＥＲ３に特異的に結合し、前記切断プローブがＰＩ３Ｋに特異的に結合するか、または前記抗体組成物がＰＩ３Ｋに特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合する。
また、本発明のいくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量の測定は、ａ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルとＨＥＲ２抗体組成物とを接触させる工程；ｂ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルとＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程；ｃ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと、前記ＨＥＲ２抗体組成物または前記ＨＥＲ３抗体組成物のいずれかに結合する第１の結合組成物とを接触させる工程であって、前記第１の結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む工程；ｄ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記結合組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；ｅ）前記抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；およびｆ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量を決定する工程を含み得、前記抗体結合組成物がＨＥＲ３に特異的に結合する場合には、前記切断プローブがＨＥＲ２に特異的に結合するか、または前記抗体結合組成物がＨＥＲ２に特異的に結合する場合には、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合する。
加えて、本発明の他の実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の測定は、ａ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと、ＨＥＲ３抗体組成物およびＰＩ３Ｋ抗体結合組成物とを接触させる工程であって、一方の抗体組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含み、他方の抗体組成物が、それに対して有効近接距離内にある場合に前記結合組成物の前記切断可能な結合を切断する切断プローブを含む工程；ｂ）前記切断可能なリンカーを切断して、前記分子タグを放出させる工程；およびｃ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を決定する工程を含み得る。
また、本発明のいくつかの実施形態では、被験体由来の腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量の測定は、ａ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと、第１の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第１のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第１のＨＥＲ３抗体組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む工程；ｂ）前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルと、第２の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第２のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第２のＨＥＲ３抗体組成物が、それに対して有効近接距離内にある場合に前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する切断誘導部分を含み、前記第２の結合部位がＨＥＲ３リン酸化部位を含む工程；ｃ）前記第１のＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能なリンカーを切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；およびｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは生物学的サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量を決定する工程を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のシステムおよび方法に使用するのに適切なサンプルは、細胞培養物、動物組織、患者生検などを含め、多種多様な供給源に由来し得る。好ましくは、サンプルは、ヒト患者サンプルである。サンプルがそこから採取される供給源に依存し得る、従来の技術を用いるバイオマーカーの分析に応じて、サンプルを調製する。生検および医学的試料については、以下の参考文献：Ｂａｎｃｒｏｆｔ ＪＤ＆Ｓｔｅｖｅｎｓ Ａ，ｅｄｓ．１９７７，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；Ｐｅａｒｓｅ，１９８０，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ．４ｔｈｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにおいて、指針が示されている。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＦＦＰＥサンプルを含む。
患者組織サンプルの例としては、限定されないが、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、脳癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌または子宮頸癌が挙げられる。組織サンプルは、手術による切除、吸引、または生検を含め、様々な手順により得ることができる。組織は、新鮮なものまたは凍結されたものであり得る。一実施形態では、固定され、パラフィンに包埋された組織サンプルに対して本発明のアッセイを実施し、次いで、脱パラフィン工程を実施する。従来の方法により、組織サンプルを固定（すなわち、保存）することができる。例えば、Ｌｅｅ Ｇ．Ｌｕｎａ，ＨＴ（ＡＳＣＰ）Ｅｄ．，１９６０，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｂｌａｋｓｔｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｕｌｒｅｋａ Ｖ．Ｍｉｋｅｌ，Ｅｄ．，１９９４，Ｔｈｅ Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃを参照のこと。当業者であれば、組織を組織学的に染色するか、または他の形で分析する目的により、固定剤の選択が決定されることを認識するであろう。当業者であれば、固定化の長さが、組織サンプルのサイズ、ならびに使用される固定剤に依存することも認識するであろう。
一般に、まず、組織サンプルを固定し、次いで、濃度を上昇させた一連のアルコールにより脱水し、組織サンプルを切片化し得るように、パラフィンまたは他の切片化媒体を浸透させてこれにより包埋する。あるいは、組織を切片化し、得られた切片を固定することもできる。例示目的で、上記に示した参考文献により説明される従来の技術に従う従来の方法により、組織サンプルをパラフィンに包埋および加工することができる。使用され得るパラフィンの例としては、限定されないが、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｂｒｏｌｏｉｄ、およびＴｉｓｓｕｅｍａｙが挙げられる。組織サンプルを包埋したら、従来の技術により、ミクロトームによりサンプルを切片化することができる。切片は、厚さが約３ミクロン〜約１２ミクロンの範囲であり、好ましくは、約５ミクロン〜約１０ミクロンの範囲の厚さである。一態様では、切片が、約１０ｍｍ２〜約１ｃｍ２の面積であり得る。切断したら、数種の標準的な方法により、切片をスライドに付着させることができる。スライド接着剤の例としては、限定されないが、シラン、ゼラチン、およびポリ−Ｌ−リシンが挙げられる。パラフィン包埋切片は、正電荷のスライド、および／またはポリ−Ｌ−リシンコーティングスライドに付着させることができる。
パラフィンを包埋材料として用いた場合は、一般に、バイオマーカーを検出する前に、組織切片を脱パラフィンおよび再水和する。従来の数種の標準的な方法により、組織切片を脱パラフィンすることができる。例えば、上記の参考文献により説明される従来の技術により、キシレンと、段階的に濃度を低下させる一連のアルコールとを用いることができる。あるいは、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標）（ＣＭＳ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）などの市販の非有機の脱パラフィン剤が使用され得る。
従来の細胞溶解法（例えば、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．６）、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、ならびに必要に応じてプロテアーゼ阻害剤ならびに／またはホスファターゼ阻害剤）により、哺乳動物組織培養細胞または新鮮組織もしくは凍結組織を調製することができる。新鮮な哺乳動物組織の場合、サンプル調製はまた、粉砕、ミンチ化、すりつぶし、または超音波処理などの組織脱凝集工程も包含する。
放出可能な分子タグを使用して活性化ＨＥＲ３集団を測定することにより、（１）放出された分子タグをアッセイ混合物から分離することにより、バックグラウンドが大幅に軽減され、感度が大幅に増大すること；ならびに（２）分離および検出を容易にするために特にデザインされた分子タグを用いることにより、同じアッセイにおいて同時に、受容体複合体の複数の成分を容易に測定し得るような、簡便な多重化能がもたらされることを含め、多くの利点がもたらされる。このようなタグを用いるアッセイは、様々な形態を取ることが可能であり、以下の参考文献：米国特許第７，１０５，３０８号；米国特許第６，６２７，４００号；米国特許出願公開第２００２／００１３１２６号；米国特許出願公開第２００３／０１７０９１５号；米国特許出願公開第２００２／０１４６７２６号；米国特許出願公開第２００９／０１９１５５９号、米国特許出願公開第２０１０／０１４３９２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２３３７３２号および米国特許出願公開第２０１０／０２１００３４号；ならびに国際公開第２００４／０１１９００号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。例えば、電気泳動移動度、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、または極性を含め、分離される分子間における、１つまたはそれを超える、物理的、化学的、または光学的差異に基づき分子を区別し得る、多種多様な分離法を用いることができる。一態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、電気泳動移動度および光学的検出特性において異なり、電気泳動により分離される。別の態様では、複数の分子タグまたは分子タグのセットが、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性において異なり得、正相もしくは逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、または気相クロマトグラフィーにより分離される。
結合化合物から放出された後で、分離技術により異なるバンドまたはピークに分離され得る、分子タグのセットが供給される。このようなピークを同定および定量することにより、タンパク質、タンパク質複合体および翻訳後修飾タンパク質の存在および／または量の尺度またはプロファイルがもたらされる。いくつかの実施形態では、セットにおける分子タグは、化学的に多様であり得る。他の実施形態では、分子タグのセットは、化学的に類縁であり得る。例えば、分子タグはすべてペプチドであり得るか、同じ基本的ビルディングブロックまたは単量体の異なる組み合わせからなり得るか、または異なる置換基を有して異なる分離特性を付与する、同じ基本的足場を使用して合成され得る。複数の分子タグの数は、用いられる分離方式、検出用分子タグに使用される標識、結合部分の感度、および切断可能な結合が切断される効率を含め、複数の因子に応じて変化し得る。
組織サンプルに対して直接なされた測定は、サンプルにおける全細胞数、および／またはサンプルにおける特定の細胞亜型の数を表す細胞標的または組織標的についての測定を組み入れることにより、正規化することができる。実質的な割合の正常細胞を含み得る患者サンプル、特に、腫瘍サンプルにおいては、細胞および組織が不均質性であるため、さらなる測定が好ましい場合もあり、さらに必要な場合もある。
上記で言及した通り、異なる結合化合物それぞれが切断可能な結合を介して１つまたはそれを超える分子タグを有する、複数の異なる結合化合物を含有する混合物を供給することができる。結合化合物、切断可能な結合、および分子タグの性質は、多種多様であり得る。結合化合物は、抗体結合組成物、抗体組成物、抗体、ペプチド、細胞表面受容体に対するペプチドリガンドもしくはペプチド以外のリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類似体、レクチン、あるいは、標的タンパク質もしくは標的分子、または活性化ＨＥＲ３などの目的の分析物との安定的な複合体形成物に特異的に結合することができる他の任意の分子実体を含み得る。一態様では、結合化合物を、以下の式：
Ｂ−（Ｌ−Ｅ）ｋ
［式中、Ｂは、結合部分であり；Ｌは、切断可能な結合であり；Ｅは、分子タグである］により表すことができる。ホモジニアスアッセイでは、切断可能な結合Ｌが、易酸化結合であり得、より好ましくは、それが一重項酸素により切断され得る結合である。あるいは、それは、還元による（例えば、ＤＴＴによる）切断に対して感受性の結合であり得る。部分「−（Ｌ−Ｅ）ｋ」は、単一の結合化合物が、切断可能な結合を介して複数の分子タグを結合させ得ることを示す。一態様では、ｋが１を超えるかそれに等しい整数であるが、他の実施形態では、ｋが数百を超え得る（例えば、１００〜５００）か、またはｋが数百を超えて最大数千もの数（例えば、５００〜５０００）である。通常、複数の異なる種類の結合化合物のそれぞれは、異なる分子タグＥを有する。切断可能な結合（例えば、易酸化結合）および分子タグＥは、通常の化学反応によりＢに結合している。
いくつかの実施形態では、Ｂは、ＨＥＲ３における抗原決定基などの標的に特異的に結合する抗体結合組成物または抗体組成物である。ＨＥＲ３エピトープに対して特異的な抗体は、本明細書に記載される実施例で示される。抗体組成物は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である多種多様な市販の抗体から容易に形成することができる。特に、上皮成長因子受容体に対して特異的な抗体は、米国特許第５，６７７，１７１号；米国特許第５，７７２，９９７号；米国特許第５，９６８，５１１号；米国特許第５，４８０，９６８号；米国特許第５，８１１，０９８号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。米国特許第５，５９９，６８１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、タンパク質のリン酸化部位に対して特異的な抗体を開示している。例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＵｐｓｔａｔｅ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）などの販売元もまた、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を提供している。
切断可能な結合Ｌは、放出される分子タグＥの構造を分解しないし、その検出特性に影響を与えることのない条件下で切断され得る、実質的に任意の化学結合基であり得る。特定の実施形態では、ホモジニアスアッセイフォーマットで用いる切断プローブは、切断プローブの直接的近接距離内にある切断可能な結合だけを切断するように、作用距離が短い切断プローブにより作製される切断剤により切断される切断可能な結合Ｌを有する。典型的には、拡散して、切断可能な結合に至り、切断に影響を及ぼす短命の活性種が、このような薬剤によりもたらされるように、反応混合物に物理的または化学的な変化をもたらすことにより、その薬剤を活性化しなければならない。ホモジニアスフォーマットでは、好ましくは、活性化前に、放出可能な分子タグを含む結合化合物の近接距離内に特定の部位をターゲティングする抗体などの結合部分に切断剤を結合させる。
非ホモジニアスフォーマットでは、特異的に結合した結合化合物が、結合しなかった結合化合物から分離されるため、切断可能な結合および切断剤のより広い選択を用いることが可能である。切断可能な結合としては、過酸化水素、一重項酸素などの局所的に作用する反応種との反応を受けやすい結合だけではなく、塩基に不安定な結合、光により切断可能な結合、還元により切断可能な結合、酸化により切断される結合、酸に不安定な結合、および特定のプロテアーゼにより切断可能なペプチド結合などの反応混合物全体に作用する薬剤に対して不安定な結合も挙げられ得る。多くのこのような結合が記載されている参考文献としては、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，１９９１，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ならびに米国特許第５，５６５，３２４号が挙げられる。光切断可能な結合としては、米国特許第５，９８６，０７６号に開示されているものも挙げられる。
いくつかの実施形態では、市販の切断可能な試薬システムを本発明と共に用いることができる。いくつかの実施形態では、切断プローブは、切断可能な結合を直接切断してタグを放出させる化合物を含む。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）などの販売元から入手可能な、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ））などのヘテロ官能性薬剤を使用して、抗体結合組成物と分子タグとの間に、ジスルフィド結合を導入することができる。このような連結により導入されたジスルフィド結合は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプトエタノール、または水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理することにより壊すことができる。ジスルフィド結合を切断する還元剤の典型的な濃度は、約１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲にある。ホモ二官能性ＮＨＳエステルによる架橋試薬、過ヨウ素酸ナトリウム（例えば、生理的ｐＨにおいて４時間にわたる１５ｍＭ過ヨウ素酸塩）による切断を受けやすいｃｉｓ−ジオール類を中央部に含有する酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）（Ｐｉｅｒｃｅ社から入手可能）を使用して、抗体結合組成物と分子タグとの間に、易酸化結合を導入することができる。エステル化されたスペーサー構成要素を含有する結合は、ヒドロキシルアミン、例えば、３７℃で３〜６時間にわたる、ｐＨ８．５の０．１Ｎヒドロキシルアミンなどの強力な求核剤により切断することができる。このようなスペーサーは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能な、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）などのホモ二官能性の架橋剤により導入することができる。塩基に不安定な結合は、スルホン基により導入することができる。切断可能な結合にスルホン基を導入するのに使用され得るホモ二官能性の架橋剤としては、ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、および４，４−ジフルオロ−３，３−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）が挙げられる。切断のための例示的な塩基性条件としては、３７℃で２時間にわたるインキュベーションを伴う、６Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ、および２ｍＭ ＤＴＴを含有するトリス塩基を添加することによりｐＨ１１．６に調整した、０．１Ｍリン酸ナトリウムが挙げられる。
Ｌが易酸化性である場合、Ｌは、チオエーテルまたはそのセレニウム類似体；またはオキソ基に対する二重結合が切断されると分子タグＥが放出される、炭素間の二重結合を含有するオレフィンであり得る。例示的な易酸化結合は、米国特許第６，６２７，４００号および米国特許第５，６２２，９２９号；ならびに米国特許出願公開第２００２／００１３１２６号および米国特許出願公開第２００３／０１７０９１５号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
ガスクロマトグラフィーまたは質量分析により複数の分子タグを分離する場合、本発明における分子タグＥは、以下の参考文献（例えば、Ｚｈａｎｇら、２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：１００２−１０１２；Ｇｉｅｓｅ，１９８３，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２：１６５−１６８；ならびに米国特許第４，６５０，７５０号；米国特許第５，３６０，８１９号；米国特許第５，５１６，９３１号；および米国特許第５，６０２，２７３号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）に記載されている電気泳動タグを含み得る。
好ましくは、分子タグＥは、活性種、とりわけ、一重項酸素に対して安定であり、検出基またはレポーター基を包含する、水溶性の有機化合物である。さもなければ、Ｅは、サイズおよび構造が多種多様に変化し得る。一態様では、Ｅの分子量が、約５０〜約２５００ダルトン、より好ましくは、約５０〜約１５００ダルトンの範囲にある。Ｅは、電気化学シグナル、蛍光シグナル、または発色シグナルを発生させる検出基を含み得る。質量による検出を用いる実施形態では、Ｅは、検出の目的で別個の部分を有し得ない。好ましくは、検出基は、蛍光シグナルを発生させる。
複数の分子タグは、それぞれが、同じ複数タグの他のメンバーに対して、固有の分離特性および／または固有の光学特性を有するように選択される。一態様では、クロマトグラフィーまたは電気泳動における分離特性が、当技術分野における従来の標準的な一連の分離条件（例えば、電圧、カラム圧、カラム種類、移動相、または電気泳動の分離媒体）下における保持時間である。別の態様では、光学特性が、所定の波長または波長バンドにおける発光スペクトル、蛍光寿命、または蛍光強度などの蛍光特性である。好ましくは、蛍光特性は、蛍光強度である。例えば、複数の分子タグのそれぞれは、同じ蛍光発光特性を示し得るが、固有の保持時間により互いとは異なる。他方、複数の分子タグの１つもしくは２つまたはそれより多くは、同一の移動時間または保持時間を有し得るが、分子の分離および蛍光の測定を組み合わせることにより、該複数の分子タグのすべてのメンバーが区別可能であるように、それらは、固有の蛍光特性、例えば、スペクトル分解可能な発光スペクトルを有す。
好ましくは、放出された分子タグは、電気泳動による分離、および検出基による蛍光発光によって検出する。このような実施形態では、分離条件下で、電気泳動図において異なるピークが形成されるように、実質的に同一の蛍光特性を示す分子タグが、異なる電気泳動移動度を有す。好ましくは、本発明による複数の分子タグは、従来のふるい分けマトリックス（ｓｉｅｖｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）が存在する場合も、これが不在の場合も、従来のキャピラリー電気泳動装置により分離する。電気泳動による分離中において、またはその後において、蛍光シグナルおよび分離される化合物の移動時間（または移動距離）を記録することにより、または相対蛍光発光および分子タグの移動順序についてのチャート（例えば、電気泳動図として）を構築することにより、分子タグを検出または同定する。好ましくは、分子タグの存在、不在、および／または量は、米国特許出願公開第２００３／０１７０７３４Ａ１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により開示されている、１つまたはそれを超える標準品を用いることにより測定する。
また、例えば、米国特許第７，２５５，９９９号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、分子量、形状、溶解性、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性などが含まれる、１つまたはそれを超える物理的特性に基づく、クロマトグラフィーによる分離を行うための複数の分子タグもデザインすることができる。クロマトグラフィーによる分離技術は、カラムの種類、固相、移動相などのパラメータに基づき選択され、続いて単回の操作において分離されて異なるピークまたはバンドを形成し得る複数の分子タグが選択される。検出される分子タグの数（すなわち、該複数のサイズ）、アッセイにおいて発生する各分子タグの推定量、多重化アッセイに使用されるセットの候補である分子タグを合成する有用性および容易さ、使用される検出モダリティー、ならびにＨＰＬＣ装置、カラム、および溶媒の入手可能性、頑健性、費用、および操作の容易さを含め、数種の因子により、本発明で用いるのにどのＨＰＬＣ法を選択するかが決定される。一般に、限定量のサンプルを分析するのに適し、最高の解像度による分離をもたらすカラムおよび技術が好ましい。このような選択を行うための指針は、例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、１９８８，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＨＰＬＣ Ｍｅｔｈｏｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍｉｌｌｎｅｒ，１９９９，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈｉ−Ｓａｎ Ｗｕ，１９９９，Ｃｏｌｕｍｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；およびＯｌｉｖｅｒ，１９８９，ＨＰＬＣ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄなどの文献に見られ得る。
一態様では、分子タグＥが、（Ｍ、Ｄ）［表記中、Ｍとは、移動度修飾部分であり、Ｄとは検出部分である］である。「（Ｍ、Ｄ）」という表記を使用して、そのどちらの部分も切断可能な結合Ｌに隣接し得るように、Ｍ部分およびＤ部分の順序づけがなされ得ることを示す。すなわち、「Ｂ−Ｌ−（Ｍ、Ｄ）」は、結合化合物が、２つの形態：「Ｂ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」または「Ｂ−Ｌ−Ｄ−Ｍ」のいずれかであることを示す。
検出部分Ｄは、蛍光標識もしくは蛍光色素、発色標識もしくは発色色素、または電気化学標識であり得る。好ましくは、Ｄは、蛍光色素である。本発明と共に使用される例示的な蛍光色素としては、以下の参考文献：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，８ｔｈｅｄ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；米国特許第６，１９１，２７８号；米国特許第６，３７２，９０７号；米国特許第６，０９６，７２３号；米国特許第５，９４５，５２６号；米国特許第４，９９７，９２８号；および米国特許第４，３１８，８４６号；ならびにＬｅｅら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：２８１６−２８２２に開示されている、水溶性のローダミン色素類、フルオレセイン類、４，７−ジクロロフルオレセイン類、ベンゾキサンテン色素類、およびエネルギー移動色素類が挙げられる。好ましくは、Ｄは、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。
結合化合物のそれぞれを、異なる分子タグにより個別に誘導体化したら、これを他の結合化合物と共にプールして、複数の結合化合物を形成する。通常、組成物には、各異なる種類の結合化合物が同じ比率で存在するが、特定の実施形態またはアッセイの所望性または必要性に応じ、特定の結合化合物の１つまたはサブセットが、より大きいかまたはより小さな比率で存在するように、デザインの選択として、比率を変化させることができる。このようなデザインの選択に影響を及ぼし得る因子としては、限定されないが、特定の標的に対して産生させた抗体の親和性およびアビディティ、標的の相対存在率、分子タグの検出部分の蛍光特性などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、切断誘導部分または切断剤とは、好ましくは酸化により、切断可能な結合を切断することができる活性種を生成させる化学基である。好ましくは、活性種とは、その切断誘導効果が、その発生部位の近接距離内だけにおいて存在するように、短命の活性を示す化学種である。活性種が作り出される近接距離を越えて顕著なバックグラウンドを作り出さないように、活性種を固有の形で短命とするか、またはその発生部位からの短距離を越えて、切断可能な結合と反応することが可能でないように、活性種を効果的に除去するスカベンジャーを用いる。例示的な活性種としては、一重項酸素、過酸化水素、ＮＡＤＨおよびヒドロキシルラジカル、フェノキシラジカル、スーパーオキサイドなどが挙げられる。酸化を引き起こす活性種に対する例示的なクエンチャーとしては、ポリエン類、カロテノイド類、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チロシン、ヒスチジン、およびグルタチオンのアミノ酸−ピロールＮ−コンジュゲートが挙げられる。例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒら、２０００，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１９：２２６−２４１を参照のこと。
切断誘導部分および切断可能な結合を用いるアッセイをデザインする際の１つの考慮点は、受容体複合体に結合したとき、切断誘導部分により生成される活性種が切断可能な結合を効果的に切断することが不可能になる程度に遠く、切断誘導部分および切断可能な結合が、互いから引き離されないようにすることである。一態様では、切断可能な結合が、好ましくは、結合した切断誘導部分の約１０００ｎｍ以内、好ましくは約２０〜２００ｎｍ以内にある。より好ましくは、一重項酸素を発生させる、光増感剤の切断誘導部分の場合は、切断可能な結合が、受容体複合体において光増感剤の約２０〜１００ｎｍ以内にある。本明細書では、切断誘導部分により切断可能な結合が有効に切断され得る（すなわち、検出可能なシグナルを発生させるのに十分な分子タグを切断できる）範囲を、その「有効近接距離」と称する。当業者であれば、特定の光増感剤の有効近接距離が、特定のアッセイデザインの詳細に依存する場合があり、日常的な実験により決定または改変され得ることを認識するであろう。
増感剤とは、反応中間体、または、通常一重項酸素である種を発生させるように誘導され得る化合物である。好ましくは、本発明により使用される増感剤は、光増感剤である。本発明の範囲内に包含される他の増感剤は、熱、光、イオン化放射、または化学的活性化により励起されると、一重項酸素分子を放出する化合物である。このクラスの化合物のうちで最も周知のメンバーとしては、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシド、および５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン−５，１２−エンドペルオキシドなどのエンドペルオキシド類が挙げられる。これらの化合物を加熱するか、またはこれらの化合物が直接的に光を吸収すると、一重項酸素が放出される。さらなる増感剤については、Ｄｉ Ｍａｓｃｉｏら、１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５５：２８７；およびＫａｎｏｆｓｋｙ，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：５９９１−５９９３；Ｐｉｅｒｌｏｔら、２０００，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１９：３−２０により開示されている。
光増感剤は、共有結合または非共有結合により、直接的または間接的にクラス特異的な試薬による結合剤に結合し得る。このような組成物を構築するための指針、特に、結合剤としての抗体についての指針は、例えば、光線力学療法、免疫診断学などの分野の文献において得られる。例示的な指針は、Ｕｌｌｍａｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，５４２６−５４３０；Ｓｔｒｏｎｇら、１９９４，Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４５：２９７−３２０；Ｙａｒｍｕｓｈら、１９９３，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１０：１９７−２５２；ならびに米国特許第５，３４０，７１６号；米国特許第５，５１６，６３６号、米国特許第５，７０９，９９４号および米国特許第６，２５１，５８１号に見られ得る。
光増感剤を光活性化して一重項酸素を発生させるには、多種多様な光源が利用できる。光源が、実用的な時間内で十分な一重項酸素を生成させるのに十分な強度を示す限りにおいて、多色光源および単色光源の両方を用いることができる。照射の距離は、光増感剤の性質、切断可能な結合の性質、照射光源の出力、およびサンプルからの照射光源の距離に依存する。一般に、照射時間は、約マイクロ秒間超〜最長約１０分間であることが可能であり、通常、約１ミリ秒間〜約６０秒間の範囲内である。照射の強度および距離は、光増感剤分子の少なくとも約０．１％、通常、光増感剤分子の少なくとも約３０％、ならびに、好ましくは、光増感剤分子の実質的にすべてを励起するのに十分であるものとする。例示的な光源としては、レーザー、例えば、ヘリウム−ネオンレーザー、アルゴンレーザー、ＹＡＧレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザー、およびルビーレーザー；光ダイオード；水銀灯、ナトリウム灯、およびキセノン灯；ならびに、例えば、タングステン灯およびタングステン／ハロゲン灯および閃光灯などの白熱灯が挙げられる。本発明の方法に使用するのに適切な例示的な光活性化デバイスは、国際公開第０３／０５１６６９号に開示されている。このような実施形態では、光活性化デバイスは、９６ウェルプレートのすべてのウェルを同時に照射することができる、ハウジング内に搭載された発光ダイオード（ＬＥＤ）のアレイである。
本発明に使用され得る光増感剤の例は、上記の特性を有する増感剤、ならびに、米国特許第５，５３６，８３４号；米国特許第５，７６３，６０２号；米国特許第５，５６５，５５２号；米国特許第５，７０９，９９４号；米国特許第５，３４０，７１６号；米国特許第５，５１６，６３６号；米国特許第６，２５１，５８１号；および米国特許第６，００１，６７３号；欧州特許出願公開第０４８４０２７号；Ｍａｒｔｉｎら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８６：６３５−６４５；およびＹａｒｍｕｓｈら、１９９３，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１０：１９７−２５２に開示されている増感剤である。増感剤の場合と同様、特定の実施形態では、固相支持体の表面に共有結合または非共有結合により結合させるか、または固相支持体の本体に組み込むことにより、光増感剤を、固相支持体と会合させることができる。一般に、光増感剤は、必要量の一重項酸素を達成するのに必要な量で、支持体と会合させる。一般に、光増感剤の量は、日常的な方法により、経験的に決定される。
一実施形態では、例えば、米国特許第５，７０９，９９４号；および米国特許第６，３４６，３８４号；ならびに国際公開第０１／８４１５７号に開示されているように、光増感剤を、ラテックス粒子に組み込み、光増感剤ビーズを形成する。あるいは、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９７：３７４１（１９７５）に記載されているように、エステル結合基を提供するために、ローズベンガルなどの光増感剤を、ラテックスにおけるクロロメチル基を介して、０．５ミクロンのラテックスビーズに共有結合させることにより光増感剤ビーズを調製することもできる。ラテックス粒子、光増感剤ビーズを用いる方法は、例えば、真空を適用することにより試薬の除去を可能とするウェルの１つの壁面、例えば、その底面を形成するフィルター膜を有する、従来の９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロタイタープレートなどにおいて実施することができる。結合化合物の特異的な結合に必要とされるバッファーが、一重項酸素の生成または分離に必要とされるバッファーと異なる場合、これにより、バッファーの簡便な交換が可能になる。例えば、抗体結合化合物または抗体組成物の場合、高塩濃度バッファーが必要となる。放出されたタグを電気泳動により分離する場合は、バッファーを、電気泳動に適切な、塩濃度がより低いバッファーに交換することにより、より良好な性能が達成される。
例として、切断プローブは、複数の光増感剤分子により誘導体化された、ハプテン化一次抗体、ならびに二次抗ハプテン結合タンパク質を含み得る。好ましいハプテン化一次抗体は、ビオチン化抗体であり、好ましい二次抗ハプテン結合タンパク質は、抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンのいずれかであり得る。このような一次試薬および二次試薬の他の組み合わせは、当技術分野で周知である。このような試薬の例示的な組み合わせは、Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００２，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲにより教示されている。このような試薬の例示的な組み合わせは、以下に記載される。放出可能なタグ（「ｍＴ１」および「ｍＴ２」）と、ビオチンにより誘導体化された一次抗体とを有するこれらの結合化合物は、膜の受容体二量体の異なるエピトープに特異的に結合する。ビオチン特異的な結合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン）をビオチンに結合させて、複数の光増感剤を結合化合物の有効近接距離内に運ぶ。ビオチン特異的な結合タンパク質はまた、抗ビオチン抗体であり得、従来の結合化学反応（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（前出））により、該タンパク質における遊離アミン基を介して、光増感剤を結合させることもできる。このような使用のための例示的な光増感剤は、欧州特許出願公開第０５１０６８８号に開示されている通りに調製される、メチレンブルーのＮＨＳエステルである。
方法および特定の条件ならびに材料についての以下の一般的な議論は、例示を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。当業者であれば、本明細書に記載される方法を、特に、異なるサンプル、細胞型、および標的複合体を用いることにより、他の適用にどのように適合させ得るかについて理解するであろう。
本発明の方法を実施するには、試験サンプルと、結合化合物と、場合により切断プローブとを含む、アッセイ成分の組み合わせを作製する。一般に、アッセイ成分は、任意の順序で組み合わせることができる。しかしながら、特定の適用では、添加の順序が重要となり得る。例えば、競合的結合について定量的にモニタリングするか、または会合した複合体の安定性をモニタリングしたい場合がある。このような適用では、反応物を段階的に会合させることができる。
各試薬の量は、一般に、経験的に決定することができる。アッセイで使用されるサンプルの量は、存在することが予測される標的複合体の数と、アッセイのシグナルをモニタリングするのに使用される分離および検出の手段とにより決定される。一般に、結合化合物および切断プローブの量は、サンプルにおいて予測される標的分子の量と比べたモル過剰、一般に、少なくとも約１．５モルの過剰、より望ましくは約１０倍以上のモル過剰で供給することができる。特定の適用において、使用される濃度は、結合剤の親和性、および単一の細胞において存在することが予測される標的分子の数に応じて高濃度または低濃度であり得る。細胞表面オリゴマー複合体の形成に対する化合物の効果を決定しようとする場合は、モニタリングされる効果に応じて、プローブを添加する前に、これと同時に、またはこの後において、該化合物を細胞に添加することができる。
アッセイ混合物は、通常、約１０〜２００ｍＭの範囲の濃度のバッファーにより維持される、一般に、生理的ｐＨ（細胞が培養されるｐＨと同等のｐＨ）にある水性媒体において、細胞表面分子へのプローブの結合をもたらす条件下で混合およびインキュベートすることができる。従来のバッファーのほか、必要に応じて、塩、増殖媒体、安定化剤などの他の従来の添加物も用いることができる。一般に、生理的な一定温度を用いる。インキュベーション温度は、一般に、約４℃〜７０℃、通常約１５℃〜４５℃であり、より通常の場合には、約２５℃〜３７℃である。
アッセイ混合物を組み立て、インキュベートして、プローブを細胞表面分子に結合させた後、該混合物を処理して、切断剤を活性化させ、切断剤の有効近接距離内にある結合化合物からタグを切断させ、該細胞表面から対応するタグを溶液に放出させることができる。この処理の性質は、切断剤の作用機構に依存する。例えば、切断剤として光増感剤を用いる場合、切断の活性化は、使用される特定の増感剤に適切な光の波長で、混合物を照射することを含み得る。
次いで、切断後、サンプルを分析して、放出されたタグを区別することができる。複数の結合化合物を用いるアッセイを用いる場合は、一般に、放出されたタグの分離が、それらの検出に先行する。分離および検出のいずれの方法も、アッセイのためにタグをデザインする過程で決定される。好ましい分離方式では電気泳動が用いられ、そこでは、様々なタグが、それらの電気泳動移動度における公知の差異に基づき分離される。
上記で言及した通り、いくつかの実施形態では、アッセイ反応条件が、使用される分離法に干渉し得る場合、分子タグを切断および分離する前に、アッセイ反応バッファーを除去または交換することが必要であり得る。例えば、アッセイ条件としては、電気泳動移動度に基づき分子タグを分離する場合、分離の効能を劣化させる塩濃度（例えば、特異的な結合に必要とされる）が挙げられ得る。したがって、例えば、分子タグを切断する前に、このような高塩濃度のバッファーを除去し、ろ過、吸引、希釈、または他の手段により、電気泳動による分離に適切な別のバッファーで置換することができる。
特定の実施形態では、ＨＥＲ３作用剤を含む併用療法を被験体に行い得る。併用療法は、限定されないが、当業者に公知の任意の化学療法剤の１つまたはそれよりも多くと組み合わせたＨＥＲ３作用剤を含み得る。好ましくは、化学療法剤は、ＨＥＲ３作用剤と異なる作用機構を有する。例えば、化学療法剤は、抗代謝産物（例えば、５−フルオロウラシル（ｆｌｏｕｒｏｕｒｉｃｉｌ）（５−ＦＵ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、フルダラビンなど）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン；ビンブラスチン；タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル；など）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メルファラン、ビスクロロエチルニトロソ尿素（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）など）、白金剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＪＭ−２１６、ＣＩ−９７３など）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシンなど）、抗生物質製剤（例えば、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、カンプトテシンなど）または当業者に公知の他の任意の他の化学療法剤であり得る。
本発明の医薬組成物、剤形およびキットを含む本発明の様々な実施形態に使用され得る化学療法剤の特定の例としては、限定されないが、シタラビン、メルファラン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、イダルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、シスプラチン、パクリタキセルおよびシクロホスファミドが挙げられる。
使用され得る他の化学療法剤としては、アバレリクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ ｌｉｖｅ、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｅｉｚｕｍａｂ）、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シナカルセト、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、エリオットＢ溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガミシン、ゲフィチニブ、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン（ｍｅｃｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オブリメルセン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロザン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タルク、タモキシフェン、タルセバ、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンおよびゾレドロネートが挙げられる。
別の態様では、本発明は、ＨＥＲ３活性化癌を有する被験体が、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤による処置に対して反応する可能性が低いか、および／または患者が短い時間経過を有する可能性が高いかを決定するための方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、被験体の癌由来の生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３の量を測定することを含み、ＨＥＲ３および／または活性化ＨＥＲ３のレベルが高いかまたは非常に高い場合、患者は、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤による処置に対して反応する可能性が低い。
別の態様では、本発明は、ＨＥＲ３陽性癌を有する被験体が、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤による処置に対して反応する可能性が高いかを決定するための方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、被験体の癌由来の生物学的サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を測定することを含み、活性化ＨＥＲ３のレベルが高い場合、患者は、ＨＥＲ３作用剤に加えて少なくとも１つの化学療法剤に対して反応する可能性が高い。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、ＦＦＰＥ組織サンプルを含む。特定の実施形態では、癌は、転移性または再発性である。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ３作用剤に対して感受性であり得る任意の癌をモニタリングし得る。ＨＥＲ３作用剤は、任意のＨＥＲ３作用剤であり得る。特定の実施形態では、ＨＥＲ３作用剤は、本明細書に記載される薬剤の１つである。あるいは、当技術分野で公知の他のさらなる化学療法剤を評価し得る。特定の実施形態では、反応可能性または時間経過は、全生存率、無増悪期間に関して、および／またはＲＥＣＩＳＴ基準を使用して測定される。
活性化ＨＥＲ３の測定を利用する（Ｕｔｌｉｚｉｎｇ）システム
別の態様では、本発明は、データベースと通信する第１のコンピューティングデバイスと；第１のコンピューティングデバイスで実行する第１のアプリケーションであって、複数の被験体に関する複数の臨床検査結果を受信して、前記複数の臨床検査結果を前記データベースに格納するように構成されており、前記複数の臨床検査結果が、被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つを含む第１のアプリケーションと；前記データベースと通信する第２のコンピューティングデバイスと；第２のコンピューティングデバイスで実行する第２のアプリケーションであって、前記複数の被験体からの被験体に関する臨床検査結果について前記データベースをクエリし；前記被験体に関する前記臨床検査結果を前記データベースから受信し；前記被験体に関する前記受信した臨床検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果であって、前記被験体から得られた腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比を含む検査結果を決定し；前記被験体に関する検査結果報告であって、前記腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み、前記被験体に関する前記検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果報告を作成し；前記患者に関する前記検査結果報告を第３のコンピューティングデバイスに送信するように構成された第２のアプリケーションとを含むシステムを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、システム、例えば図１０に示されているシステム１０００を含む。システム１０００は、様々な構成要素を含む。本明細書で使用される場合、用語「構成要素」は広く定義され、任意の適切な装置、または記載されている方法を実施するのに適切な装置の集合体を含む。構成要素は、任意の特定の方法で互いに対して一体的に接続または配置される必要はない。実施形態は、互いに対する構成要素の任意の適切な構成を含む。例えば、構成要素は、同じ空間にある必要はない。しかし、いくつかの実施形態では、構成要素は、インテグラルユニットで互いに接続される。いくつかの実施形態では、同じ構成要素は、複数の機能を実行し得る。
システム１０００は、１つまたはそれを超えるコンピューティングデバイス１００１を含み得る。コンピューティングデバイス１００１の典型的な例は、汎用コンピュータ、プリンタ、プログラムマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、周辺集積回路素子、および本技術の方法を構成する工程を実行することができる他のデバイスまたはデバイス構成を含む。
コンピューティングデバイス１００１は、メモリ１００４を含む。メモリ１００４は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）および読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ならびにリムーバブルメディアデバイス、メモリカード、フラッシュカードなどを含み得る。コンピューティングデバイス１００１は、記憶デバイス１０１４をさらに含み得る。記憶デバイス１０１４は、ハードディスクドライブまたはリムーバブル記憶デバイス、例えばフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、光ディスクドライブなどであり得る。記憶デバイス１０１４はまた、コンピュータプログラムまたは他の命令をコンピューティングデバイス１００１にロードするための他の類似手段であり得る。
コンピューティングデバイス１００１はまた、プロセッサ１００２を含む。プロセッサ１００２は、入力データを処理するために、１つまたはそれを超える記憶素子（例えば、メモリ１００４または記憶デバイス１０１４）に格納された命令セットを実行する。所望により、記憶素子はまた、データまたは他の情報を保持し得る。記憶素子は、処理装置内に存在する情報源または物理メモリ１００４素子の形態であり得る。
コンピューティングデバイス１００１は、典型的には、コンピューティングデバイス１００１の一般的な管理および動作のための実行可能なプログラム命令を提供するオペレーティングシステムを含み、典型的には、サーバのプロセッサによって実行されると、コンピューティングデバイス１００１がその目的の機能を実行することを可能にする命令を格納するコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリなど）を含む。オペレーティングシステムの適切な実行およびコンピューティングデバイス１００１の一般的な機能性は公知であるか、または市販されており、特に本明細書の開示を考慮して、当業者によって容易に実行される。
上記のように、いくつかの実施形態は、コンピュータ実行可能なプログラム命令を実行するように、および／またはメモリ１００４に格納された情報にアクセスするように構成されたプロセッサ１００２を含む。命令は、任意の適切なコンピュータプログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）およびＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．））で書かれたコードから、コンパイラおよび／またはインタープリタによって生成されたプロセッサ固有の命令を含み得る。コンピューティングデバイス１００１による実行のための命令セットは、特定のタスク（例えば、本技術の方法を構成する工程）を実行するようにプロセッサ１００２に命令する様々なコマンドを含み得る。命令セットは、ソフトウェアプログラムの形態であり得る。さらに、ソフトウェアは、本技術のように、別個のプログラムの集合体、より大きなプログラムを有するプログラムモジュール、またはプログラムモジュールの一部の形態であり得る。ソフトウェアはまた、オブジェクト指向プログラミングの形態のモジュールプログラミングを含み得る。処理装置による入力データの処理は、ユーザコマンド、前処理の結果、または別の処理装置によるリクエストに対する応答であり得る。
いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１００１は、シングルプロセッサ１００２を含み得る。他の実施形態では、コンピューティングデバイス１００１は、２つまたはそれを超えるプロセッサを含む。このようなプロセッサ１００２は、マイクロプロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）およびステートマシンを含み得る。このようなプロセッサは、プログラマブル電子デバイス、例えばＰＬＣ、プログラマブルインタラプトコントローラ（ＰＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）、プログラマブル読み取り専用メモリ（ＰＲＯＭ）、電気的プログラマブル読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭまたはＥＥＰＲＯＭ）または他の類似デバイスをさらに含み得る。プロセッサ１００２は、コミュニケーションバス１００６に接続される。コミュニケーションバス１００６は、１つまたはそれを超える他の構成要素、例えばプロセッサ１００２、入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、コントローラ、タッチスクリーンまたはキーパッド）および出力デバイス（例えば、ディスプレイ１００８、プリンタまたはスピーカ）に接続され得る。
コンピューティングデバイス１００１はまた、ネットワークコンポーネント１０１０を含み得る。ネットワークコンポーネント１０１０は、コンピューティングデバイス１００１がＩ／Ｏインターフェイスを介して１つまたはそれを超えるネットワーク１０１６および／または他のデータベース（例えば、データベース１０１８）に接続することを可能にする。単一ネットワーク１０１６として図１０に示されているが、ネットワーク１０１６は、任意の数のネットワークを含み得る。ネットワークコンポーネント１０１０は、ネットワーク１０１６および／またはデータベースへの転送、ならびにこれらからのデータの受信を可能にする。ネットワークコンポーネント１０１０は、モデム、イーサネット（登録商標）カード、またはコンピューティングデバイス１００１がデータベースおよび／またはネットワーク１０１６（例えば、ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮおよびインターネット）に接続することを可能にする任意の類似デバイスを含み得る。ネットワークコンポーネント１０１０は、ネットワークインターフェイスを含み得る。いくつかの実施形態では、ネットワークインターフェイスは、有線通信回線または無線通信回線を介して通信するために構成される。例えば、ネットワークインターフェイス１０１０は、イーサネット（登録商標）、ＩＥＥＥ８０２．１１（Ｗｉ−Ｆｉ）、８０２．１６（Ｗｉ−Ｍａｘ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、赤外線などを介したネットワーク通信を可能にし得る。別の例として、ネットワークインターフェイスは、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＵＭＴＳまたは他のセルラ通信ネットワークなどのネットワーク通信を可能にし得る。いくつかの実施形態では、ネットワークインターフェイス１０１０は、別のデバイスによる、例えばユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、１３９４ファイアワイヤ、シリアル接続もしくはパラレル接続または類似インターフェイスを介したポイントツーポイント接続を可能にし得る。適切なコンピューティングデバイス１００１のいくつかの実施形態は、１つまたはそれを超えるネットワーク通信のための２つまたはそれを超えるネットワークインターフェイス１０１０を含み得る。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイス１０１０に加えて、またはネットワークインターフェイス１０１０に代えてデータベース１０１８を含み得る。
上記のように、システム１０００は、様々なデータストアおよび他のメモリおよび記憶媒体を含み得る。これらは、様々な場所に、例えばコンピューティングデバイス１００１の１つもしくはそれよりも多くに対してローカルな（および／またはその中に存在する）記憶媒体に存在し得るか、またはネットワーク１０１６経由でコンピューティングデバイス１００１のいずれかもしくはすべてから離れた場所にあり得る。実施形態の特定のセットでは、情報は、当業者に周知のストレージエリアネットワーク（ＳＡＮ）内に存在し得る。同様に、コンピュータ、サーバまたは他のネットワークデバイスに起因する機能を実行するための任意の必要なファイルは、必要に応じて、ローカルおよび／またはリモートに格納され得る。
コンピューティングデバイス１００１はまた、コンピュータ可読記憶媒体リーダを含み得る。コンピュータ可読記憶媒体リーダは、コンピュータ可読記憶媒体（リモート記憶デバイス、ローカル記憶デバイス、固定記憶デバイスおよび／またはリムーバブル記憶デバイスが代表的なものである）、ならびにコンピュータ可読情報を一時的および／またはより恒久的に含有、格納、送信および受信するための記憶媒体と接続され得るか、またはこれらを受信するように構成され得る。システム１０００および様々なデバイスはまた、典型的には、多数のソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービス、または少なくとも１つの作業メモリデバイス内に配置された他のエレメント（オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラム、例えばクライアントアプリケーションまたはウェブブラウザを含む）を含む。代替的な実施形態は、上記のものからの多数のバリエーションを有し得ると認識すべきである。例えば、カスタマイズハードウェアも使用され得、および／またはハードウェア、ソフトウェア（アプレットなどのポータブルソフトウェアを含む）もしくはその両方の中で特定のエレメントが実行され得る。さらに、ネットワーク入力／出力デバイスなどの他のコンピューティングデバイス１０２０、１０４０への接続が用いられ得る。
コードまたはコードの一部を含有するための記憶媒体およびコンピュータ可読媒体は、情報（例えば、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータ）を格納および／または送信するための任意の方法または技術で実行される記憶媒体および通信媒体（例えば限定されないが、揮発性および不揮発性のリムーバブルおよび非リムーバブルな媒体）を含む当技術分野で公知のまたは当技術分野で使用される任意の適切な媒体（ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）または他の光ストレージ、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスクストレージまたは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報を格納するのに使用され得る任意の他の媒体であって、システム１０００デバイスによってアクセスされ得る任意の他の媒体を含む）を含み得る。本明細書で提供される開示および教示に基づいて、当業者であれば、様々な実施形態を実施するための他の手段および／または方法を認識するであろう。
コンピュータ可読媒体は、限定されないが、電子記憶デバイス、光記憶デバイス、磁気記憶デバイス、またはコンピュータ可読命令をプロセッサに提供することができる他の記憶デバイスを含み得る。他の例としては、限定されないが、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、コンテントアドレサブルメモリ（ＣＡＭ）、ＤＤＲ、フラッシュメモリ、例えばＮＡＮＤフラッシュまたはＮＯＲフラッシュ、ＡＳＩＣ、構成プロセッサ、光学ストレージ、磁気テープまたは他の磁気ストレージ、またはコンピュータプロセッサが命令を読み取り得る任意の他の媒体が挙げられる。一実施形態では、コンピューティングデバイス１００１は、単一タイプのコンピュータ可読媒体、例えばランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含み得る。他の実施形態では、コンピューティングデバイス１００１は、２つまたはそれを超えるタイプのコンピュータ可読媒体、例えばランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ディスクドライブおよびキャッシュを含み得る。コンピューティングデバイス１００１は、１つまたはそれを超える外部コンピュータ可読媒体、例えば外部ハードディスクドライブまたは外部ＤＶＤドライブと通信し得る。
コンピューティングデバイス１００１は、入力デバイスおよび出力デバイスへの有線接続または無線接続を容易にするのに使用され得るＩ／Ｏコンポーネント１０１２をさらに含み得る。適切なコンピューティングデバイス１００１のいくつかの実施形態では、多数の外部デバイスまたは内部デバイス、例えばマウス、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、オーディオスピーカ、１つもしくはそれを超えるマイクロホン、または任意の他の入力デバイスもしくは出力デバイスを含み得るか、またはこれらと通信し得る。例えば、コンピューティングデバイスは、様々なユーザインターフェイスデバイスおよびディスプレイ１００８と通信し得る。ディスプレイ１００８は、限定されないが、ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＣＲＴなどを含む任意の適切な技術を使用し得る。
システム１０００は、任意の数のコンピューティングデバイス１００１を含み得る。例えば、一実施形態では、システム１０００は、１つのコンピューティングデバイス１００１を含む。図１０に示されている例では、システム１０００は、複数のコンピューティングデバイス１００１、１０２０、１０２４、１０２８、１０３０を含む。コンピューティングデバイスは、同じタイプまたは異なるタイプのものであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１００１は、デスクトップコンピュータを含み得るが、コンピューティングデバイス１０２４は、プリンタを含み得る。さらに、いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、同じ場所または異なる場所にあり得る。例えば、図１０に示されている実施形態では、１つのコンピューティングデバイス１００１は、試験センターにオンサイトで配置され得るが、別のコンピューティングデバイス１０２８は、ヘルスケアプロバイダのオフィスにオフサイトで配置され得る。
システム１０００は、データベース１０１８をさらに含む。１つまたはそれを超えるコンピューティングデバイス１００１は、データベース１０１８と通信する。いくつかの実施形態では、データベースは、例えば、ＭｙＳＱＬデータベースを含み得る。データベース１０１８は、１つまたはそれを超えるコンピューティングデバイス（例えば、コンピューティングデバイス１００１、１０２０または１０２８）によって検索可能であり得るデータを含有し得る。いくつかの実施形態では、データベース１０１８はそれ自体が、コンピューティングデバイス１０３０の一部であり得る。データベース１０１８は、被験体の情報、被験体サンプルの情報、参照集団、癌処置の選択肢、ヘルスケアプロバイダの情報、臨床検査結果および臨床検査報告に関するデータを含み得る。例えば、被験体に関するデータは、被験体の名前、住所、電話番号、被験体の区別番号、被験体が関連するプロバイダ、医療履歴（例えば、疾患状態、例えば癌状態、ＨＥＲ２状態、過去の検査結果を含む）、投薬および／または処置、親戚、ヘルスケアプロバイダ計画、口座残高、アクセス情報、または１もしくはそれを超える被験体に関する他の情報を含み得る。被験体サンプルに関するデータは、被験体の名前、住所、電話番号、被験体の区別番号、採取日、サンプルの種類（例えば、採取の性質、調製方法）、疾患状態（例えば、ＨＥＲ２状態、または他のバイオマーカーの状態を含む癌の種類；他の条件）、ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの結果、サンプルの加工日／分析日、臨床検査結果、被験体が関連するプロバイダ、医療履歴（例えば、疾患状態、例えば癌状態、ＨＥＲ２状態、過去の検査結果を含む）、投薬および／または処置、親戚、ヘルスケアプロバイダ計画、口座残高、アクセス情報、または１もしくはそれを超える被験体に関する他の情報を含み得る。参照集団に関するデータは、参照集団被験体の情報、参照集団被験体サンプルの情報、および臨床試験参加についての情報、参照集団被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の中央値量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の中央値量の少なくとも１つ、参照集団被験体から得られた腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との中央値比を含み得る。個々の各被験体および参照集団全体のデータが含まれ得る。いくつかの実施形態では、参照集団は、被験体と同じ種類の癌を有する被験体を含む。ヘルスケアプロバイダに関するデータは、名前、住所、電話番号、職員、ユーザ名、パスワード、他のセキュリティ情報、アクセスレベル、および１またはそれを超えるプロバイダに関連する他の情報を含み得る。臨床検査結果に関するデータは、複数の被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つを含み得、被験体から得られた腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比も含み得る。検査結果報告に関するデータは、腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み得、被験体に関する検査結果（複数の被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つ、複数の被験体から得られた腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比、ならびに参照集団の情報を含む）に少なくとも部分的に基づくものであり得る。
いくつかの実施形態では、システム１０００は、１つまたはそれを超えるアプリケーションを実行し得る。１つまたはそれを超えるアプリケーションは、任意の数のコンピューティングデバイス（例えば、コンピューティングデバイス１００１、１０２０、１０２４、１０２８または１０３０）で実行され得る。いくつかの実施形態では、システム１０００は、複数の臨床検査結果を受信するように構成されたアプリケーションを実行し得る。いくつかの実施形態では、複数の臨床検査結果は、複数の被験体に関するものであり得る。他の実施形態では、複数の臨床検査結果は、単一の被験体に関するものであり得る。システム１０００は、複数の臨床検査結果をデータベース１０１８に格納し得る。
システム１０００は、１またはそれを超える被験体に関連する臨床検査結果についてデータベース１０１８をクエリするように構成されたアプリケーションを実行し得る。システム１０００は、１またはそれを超える被験体に関する受信した臨床検査結果に少なくとも部分的に基づいて、検査結果を決定し得る。いくつかの実施形態では、検査結果は、被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果は、被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比を含み得る。
いくつかの実施形態では、検査結果に基づいて、システム１０００は、１またはそれを超える被験体に関する検査結果報告を作成し得る。検査結果報告は、例えば、腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み得、１またはそれを超える被験体に関する検査結果に少なくとも部分的に基づくものであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、検査結果報告は、１またはそれを超える被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量、１またはそれを超える被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定されたＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比、ならびに／または被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ３の中央値量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との中央値比を含み得る。いくつかの実施形態では、被験体から得られた腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの比を、被験体の参照集団におけるＨＥＲ３の中央値量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との中央値比と比較することによって、検査結果報告を作成する。いくつかの実施形態では、参照集団は、被験体と同じ種類の癌を有する被験体を含む。
いくつかの実施形態では、検査結果報告は、（ｉ）サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、および（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つが、参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、被験体由来の腫瘍サンプルが多量の活性化ＨＥＲ３を有するという情報を含む。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体由来の腫瘍サンプルが、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする場合、被験体が、ＨＥＲ３ターゲティング治療に対して反応する可能性がより高いという情報を含む（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、ＨＥＲ３ターゲティング薬についての情報を含み得る。
いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体由来のサンプルにおいて測定された全ＨＥＲ２タンパク質の量をさらに含み得る。次いで、検査結果報告は、被験体がＨＥＲ２陽性癌またはＨＥＲ２陰性癌を有するかについての情報を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２陰性癌およびＨＥＲ２陽性癌は、（例えば、ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで）免疫組織化学またはインサイチューハイブリダイゼーション分析によって特性評価されている。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療が適切な治療であろうという情報をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示す情報をさらに含み得る。特定の実施形態では、検査結果報告は、被験体サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陽性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の下位５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第１のカットオフを下回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性）か、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陰性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の上位９５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第２のカットオフを上回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性）か、または全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回るが、第２のカットオフを下回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性）かについての情報をさらに含み得る。特定の実施形態では、検査結果報告は、腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回る場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療が被験体に関して適切な処置であろうという情報をさらに含み得る。特定の実施形態では、検査結果報告は、生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回る場合、被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示す情報をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、ＨＥＲ３ターゲティング薬および／またはＨＥＲ２ターゲティング薬についての情報を含み得る。
いくつかの実施形態では、システム１０００は、検査結果報告を送信し得る。いくつかの実施形態では、システム１０００は、結果報告をコンピューティングデバイス（例えば、コンピューティングデバイス１０２０）に送信し得る。いくつかの実施形態では、システム１０００は、検査結果報告を１またはそれを超える受信者に送信し得る。いくつかの実施形態では、受信者は、被験体またはヘルスケアプロバイダであり得る。いくつかの実施形態では、システムは、電子メール（例えば、被験体のヘルスケアプロバイダに関連する電子メールアカウントに）、ＳＭＳまたはテキストメッセージを介して、検査結果報告を送信し得る。
いくつかの実施形態では、システム１０００は、検査結果報告をデータベース１０１８に格納し得る。さらに、システム１０００は、電子通知をコンピューティングデバイス１０２８に提供し得る。コンピューティングデバイス１０２８は、被験体に関連し得るヘルスケアプロバイダ１０２６に関連し得る。いくつかの実施形態では、電子通知は、電子メール、テキストメッセージまたはプッシュ通知を含み得る。電子通知は、検査報告が、例えば、データベース１０１８からのダウンロードにより利用可能であることを示し得る。
活性化ＨＥＲ３の測定を利用する（Ｕｔｌｉｚｉｎｇ）方法
本発明のさらなる態様は、複数の臨床検査結果であって、被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つを含む複数の臨床検査結果をデータベースに受信することと；前記複数の臨床検査結果を前記データベースに格納することと；前記複数の被験体からの被験体に関する臨床検査結果について前記データベースをクエリすることと；前記被験体に関する前記臨床検査結果を前記データベースから受信することと；前記被験体に関する前記受信した臨床検査結果に部分的に基づく検査結果であって、前記被験体から得られた腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比を含む検査結果を決定することと；前記被験体に関する検査結果報告であって、前記腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み、前記被験体に関する前記検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果報告を作成することと；前記被験体に関する前記検査結果報告をコンピューティングデバイスに送信することとを含む方法を含む。
図１１は、一実施形態にしたがってＨＥＲ３活性化を検出することによって、癌の診断、予後予測および処置を容易にするための方法を実施するための工程のフローチャートである。いくつかの実施形態では、図１１の工程は、プロセッサ、例えば汎用コンピュータのプロセッサ、モバイルデバイスまたはサーバによって実行されるプログラムコードで実行され得る。いくつかの実施形態では、これらの工程は、一群のプロセッサによって実行され得る。いくつかの実施形態では、図１１に示されている１つまたはそれを超える工程は省略され得るか、または異なる順序で実施され得る。同様に、いくつかの実施形態では、図１１に示されていないさらなる工程も実施され得る。図１０に示されているシステム１０００に関して、上記構成要素を参照して、以下の工程を説明する。
プロセッサ１００２が、複数の被験体に関する複数の臨床検査結果を受信すると、方法１１００は、工程１１０２から開始する。いくつかの実施形態では、複数の臨床検査結果は、複数の被験体由来の腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つを含み得る。
プロセッサ１００２が複数の臨床検査結果をデータベース１０１８に格納すると、方法１１００は、工程１１０４から再開する。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、ＬＡＮ、ＷＡＮまたはインターネットを介してデータベース１０１８と通信し得る。他の実施形態では、データベース１０１８は、プロセッサ１００２を収容するコンピューティングデバイス１００１の内部にあり得、プロセッサ１００２は、バス１００６または他のハードウェア構成を介してデータベース１０１８と通信し得る。プロセッサ１００２は、複数の臨床検査結果に関連するデータをデータベース１０１８に送信し得る。
プロセッサ１００２が、複数の被験体からの被験体に関する臨床検査結果についてデータベース１０１８をクエリすると、方法１１００は、工程１１０６から再開する。プロセッサ１００２は、１つまたはそれを超えるコマンドをデータベース１０１８（および／またはデータベース１０１８を収容するコンピューティングデバイス１０３０）に送信することによって、データベースをクエリし得る。データベース１０１８を収容するコンピューティングデバイス１０３０はまた、データベース１０１８から臨床検査結果データを検索するための１つまたはそれを超える工程を実施し得る。さらに、データベース１０１８を収容するコンピューティングデバイス１０３０は、クエリした臨床検査結果データをプロセッサ１００２に送信し得る。
プロセッサ１００２が、データベース１０１８から被験体に関する臨床検査結果を受信すると、方法１１００は、工程１１０８から再開する。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、ＬＡＮ、ＷＡＮまたはインターネット接続を介して臨床検査結果データを受信し得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、臨床検査結果データをメモリ１００４に格納し得る。
プロセッサ１００２が、被験体に関する受信した臨床検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果を決定すると、方法１１００は、工程１１１０から再開する。いくつかの実施形態では、検査結果は、被験体に関連する腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、被験体に関する受信した臨床検査結果に少なくとも部分的に基づく検査結果であって、全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の少なくとも１つを含む検査結果を決定し得、被験体から得られた腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比も含み得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比によって測定される活性化ＨＥＲ３の量についての情報をさらに決定し得る。例えば、いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比を決定し得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２はまた、被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定されたＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比を決定し得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、全ＨＥＲ３の量、および被験体から得られた腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと、被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３タンパク質との比を、被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ３の中央値量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との中央値比と比較し得る。
プロセッサ１００２が、被験体に関する検査結果報告であって、腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含む検査結果報告を作成すると、方法１１００は、工程１１１２から再開する。検査結果報告は、活性化ＨＥＲ３の量についてさらに決定された情報を含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、腫瘍サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を含み得、被験体に関する検査結果に少なくとも部分的に基づくものであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、検査報告は、被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定された全ＨＥＲ３の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量、被験体から得られた腫瘍サンプルにおいて測定されたＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との比、ならびに／または被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ３の中央値量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと全ＨＥＲ３タンパク質との中央値比を含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、（ｉ）サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、および（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つが、参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、被験体由来の腫瘍サンプルが多量の活性化ＨＥＲ３を有するという情報を含む。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体由来の腫瘍サンプルが、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする場合、被験体が、ＨＥＲ３ターゲティング治療に対して反応する可能性がより高いという情報を含む（ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）腫瘍サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ１の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ホモ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含む）。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、ＨＥＲ３ターゲティング薬についての情報を含み得る。
いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体由来のサンプルにおいて測定された全ＨＥＲ２タンパク質の量をさらに含み得る。次いで、検査結果報告は、被験体がＨＥＲ２陽性癌またはＨＥＲ２陰性癌を有するかについての情報を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２陰性癌およびＨＥＲ２陽性癌は、（例えば、ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで）免疫組織化学またはインサイチューハイブリダイゼーション分析によって特性評価されている。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療が適切な治療であろうという情報をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、被験体がＨＥＲ２陽性癌を有する場合、被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示す情報をさらに含み得る。特定の実施形態では、検査結果報告は、被験体サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陽性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の下位５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第１のカットオフを下回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性）か、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陰性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の上位９５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第２のカットオフを上回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性）か、または全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回るが、第２のカットオフを下回る（すなわち、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性）かについての情報をさらに含み得る。特定の実施形態では、検査結果報告は、腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回る場合、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療が被験体に関して適切な処置であろうという情報をさらに含み得る。特定の実施形態では、検査結果報告は、生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が第１のカットオフを上回る場合、被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示す情報をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、検査結果報告は、ＨＥＲ３ターゲティング薬および／またはＨＥＲ２ターゲティング薬についての情報を含み得る。
プロセッサ１００２が、被験体に関する検査結果報告をデータベース１０１８に格納すると、方法１１００は、工程１１１４から再開する。プロセッサ１００２は、検査結果報告に関連するデータをデータベース１０１８に送信し得る。いくつかの実施形態では、ヘルスケアプロバイダ（例えば、患者のヘルスケアプロバイダ）は、格納された検査結果報告にアクセスすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ヘルスケアプロバイダは、データベース１０１８を直接的または間接的にクエリすることができる。
プロセッサ１００２が、電子通知をコンピューティングデバイス１０２８に提供すると、方法１１００は、工程１１１６から再開する。電子通知は、検査報告が、例えば、データベース１０１８からのダウンロードにより利用可能であることを示し得る。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイス１０２８は、ヘルスケアプロバイダ１０２６または被験体に関連し得る。いくつかの実施形態では、電子通知は、電子メール、テキストメッセージまたはプッシュ通知を含み得る。
プロセッサ１００２が、被験体に関する検査結果報告をコンピューティングデバイス１０２０に送信すると、方法１１００は、工程１１１８から再開する。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、検査結果報告を、被験体に関連するコンピューティングデバイス１０２０に送信し得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、検査結果報告を、ヘルスケアプロバイダに関連するコンピューティングデバイス１０２６に送信し得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ１００２は、電子メール（例えば、被験体のヘルスケアプロバイダに関連する電子メールアカウントに）、ＳＭＳまたはテキストメッセージを介して、検査結果報告を送信し得る。
上記事項は本発明の特定の実施形態に関するものであり、本発明の範囲から逸脱せずに多数の変更を行い得ると理解すべきである。以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、以下の実施例は、本発明の範囲に限定を課すものと決して解釈されるべきではない。反対に、当業者であれば、本明細書の説明を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、様々な他の実施形態、改変およびそれら等価物に至り得ることを想到し得ると明確に理解すべきである。
本出願で言及されるすべての発行特許および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の非限定的な実施例を参照することによって、本発明をより良く理解し得る。
実施例１
組織サンプル
５６個の***腫瘍サンプルを評価した：３８個はＡｓｔｅｒａｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）から購入し、１８個はＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａから入手した。ＩＨＣによって決定したところ、これらのサンプルをＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陰性のいずれかと特性評価した。サンプルの大部分は、乳管癌腫である。ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）アッセイを使用して、これらのサンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質を測定し、実施例７に記載されているカットオフを使用して、それらをＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性（ｎ＝２４）、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性（ｎ＝２７）およびＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）境界域（ｅｑｕｉｖｏｃａｌ）（ｎ＝５）と特性評価した。
実施例２
固定、処理およびパラフィン包埋
切除の１５〜３０分以内に、すべての組織（０．３〜１．０ｇｍ）を固定または急速凍結した。供給業者の標準的な操作手順（これは、ＨＥＲ２試験用の***腫瘍組織の調製に関するＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドラインおよび他のＨＥＲ３固定方法と一致する）によって指示されるように、中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ）中で、すべての組織を同様に固定した（すなわち、１０％ＮＢＦ、約２４時間、４℃）。別の研究では、同様の方法で採取および処理した異種移植腫瘍で発現されるリン酸化ＨＥＲの保存が示されている（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、２０１１）。
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｆ１２（５０：５０）、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＱ（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）および２ｍＭ Ｌ−グルタミン）中で、すべての細胞株を５％ＣＯ２、３７℃で維持した。各細胞株について、少なくとも１０個の１５０ｍｍ培養プレート上で、細胞をほぼコンフルエンスまで成長させた。培地を除去した後、冷１×ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、１５ｍＬの１０％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）を各プレートに追加した。細胞を４℃で一晩（＞１６時間）固定した。固定液を除去した後、残留固定液で剥離することによって細胞を回収し、３２００×ｇで１５分間遠心分離した。細胞ペレットをゴム製Ｏリングに移し、ろ紙で包み、処理カセットに配置した。自動Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋプロセッサを脱水およびパラフィン注入処理に使用した。簡潔に言えば、細胞ペレットを漸増濃度のアルコール、Ｃｌｅａｒ−Ｒｉｔｅ清澄剤（キシレン代替物）およびパラフィンに曝露した。処理した後、パラフィン包埋ステーションを使用して、細胞ペレットをブロックに包埋した。細胞ペレットの処理に使用したすべての溶媒は、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。
実施例３
顕微鏡切片作製法
ミクロトーム（ＬＥＩＣＡ）を用いて厚さ５μｍの切片をスライスし、シリアル番号が付された正荷電ガラススライド（ＶＷＲ）上に置いた。スライドを３０分間空気乾燥し、次いで、６０℃の加熱オーブン中で１時間ベークした。すべてのサンプルスライドを今後のアッセイのために４℃で保存した。各サンプルについて、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で１つのスライドを染色し、病理学者が腫瘍内容物について調査した。非腫瘍要素を同定し、微小切断して７０％以上の腫瘍濃縮を得た。
実施例４
抗体コンジュゲート試薬
ＨＥＲ２の細胞内ドメイン、ＨＥＲ３の細胞内ドメイン、およびＨＥＲ３のリン酸化チロシン１２８９に対するモノクローナル抗体を使用した。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する一次抗体ならびに他の試薬は、Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ（ＨＥＲ２ ｃａｔ．＃：ＭＳ−３２５およびＭＳ−５９９、ＨＥＲ３ ｃａｔ．＃：ＭＳ−３１０）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＨＥＲ２ ｃａｔ．＃：２１６５；リン酸化ＨＥＲ３ｐＹ１２８９ ｃａｔ ＃ ４７９１）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＰＩ３Ｋ（Ａｂ６）ｃａｔ＃０５−２１２）；およびＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ヤギ抗マウスＩｇＧ ｃａｔ．＃：１０３０−０１、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧ ｃａｔ．＃：４０５２−０１）から購入した。モノクローナル抗体Ｂ９Ａ１１は、Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ）（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−１０５７４）によるＨＥＲ３に対して生じる独自モノクローナル抗体である。
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子（Ｐｒｏ１１およびＰｒｏ１２５）およびストレプトアビジンコンジュゲートメチレンブルー（「分子ハサミ」）を合成し、例えば、上記にならびに米国特許第７，１０５，３０８号および米国特許第７，２５５，９９９号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているプロトコールにしたがって精製した。製造業者のプロトコールにしたがって、リンカーとしてスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子コンジュゲート抗体およびビオチンコンジュゲート抗体を作製し、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってコンジュゲーション生成物を精製した。特定の実験では、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子またはビオチンを一次抗体にコンジュゲートした。アッセイフォーマットに応じて、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子またはビオチンを、一次抗体に結合する二次抗体にコンジュゲートした。
下記実験において、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ３ｐＹ１２８９およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を測定するためのアッセイでは、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１を使用した。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体を検出するためのアッセイフォーマットでは、非コンジュゲート一次抗ＨＥＲ３マウスモノクローナル抗体（Ｂ９Ａ１１）および非コンジュゲート一次抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル一次抗体を使用した。次いで、それぞれＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１にコンジュゲートした二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ、およびビオチンにコンジュゲートした二次ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧの結合を介して、これらの一次抗体が結合する標的を検出した。ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体を検出するためのアッセイフォーマットは、ビオチンを抗ＨＥＲ３抗体Ｂ９Ａ１１にコンジュゲートすること、およびＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子Ｐｒｏ１１をｐ８５−ＰＩ３Ｋ抗体（Ａｂ６）にコンジュゲートすることを含んでいた。ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体アッセイフォーマットでは、二次抗体を使用しなかった。
実施例５
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイ
様々なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイフォーマットを図１に示す。このアッセイフォーマットは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル（パネルＡ）または組織溶解物サンプル（パネルＢ）を使用するように改変し得る。加えて、光放出フォーマットを使用して（パネルＡおよびＢ）、または還元フォーマットを使用して（例えば、ＤＴＴを使用して）（パネルＣ）、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を、それらが結合している抗体から切断し得る。光放出フォーマットでは、例えば、光による切断誘導剤の光誘導に応じて、拡散性反応性一重項酸素が、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーを切断する（「ｈｖ」）。還元フォーマットでは、還元剤（例えば、ＤＴＴなど）を使用して、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子とＨＥＲ３抗体との間の共有結合リンカーを切断し得る。切断後、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離を実施して、切断されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子（タグ）（これは、電気泳動図で可視化され得る）を分離し得る。得られた電気泳動図のｘ軸は、切断されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子がキャピラリーから溶出した時点（すなわち、電気泳動移動度に基づく）を示しており、蛍光強度はｙ軸上に示されている。複数のタンパク質標的の量または存在を検出するようにＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイをフォーマットする場合、電気泳動図上で各タグを同定および定量し得るように、異なる電気泳動移動度を有するＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子に標的特異的抗体をコンジュゲートし得る。
以下の方法では、生物学的サンプルにおけるバイオマーカーレベルを測定するのに使用され得る一般的なＶｅｒａＴａｇ（登録商標）光放出アッセイを説明する。
一般に、（Ｓｐｅｒｉｎｄｅら、２０１０，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６（１６）：４２２６−４２３５；Ｓｈｉ，Ｙら、２００９，Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１８（１）：１１−２１）に記載されているように、脱パラフィン処理および抗原回復を実施した。一連の溶媒を使用して、ＦＦＰＥサンプルを脱パラフィン処理／再水和した。簡潔に言えば、スライドをキシレン（２×、５分間）、１００％エタノール（２×、５分間）、７０％エタノール（２×、５分間）および脱イオン水（２×、５分間）に逐次に浸漬した。電子レンジ（Ｓｐａｃｅｍａｋｅｒ ＩＩ，ＧＥ）を使用して、２５０ｍＬの１×クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ）を含有するディッシュ中で、再水和サンプルの熱誘導エピトープ回復を実施した：出力１０で３分間、続いて出力３で１０分間。室温で２０分間冷却した後、脱イオン水でスライドを１回すすいだ。試薬をスライド上に保持するために、疎水性のペン（Ｚｙｍｅｄ）を使用して、スライド上の切片周囲に疎水性のサークルを描いた。次いで、１％マウス血清と、１．５％ＢＳＡと、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）１×ＰＢＳ溶液のカクテルとを含有するブロッキング緩衝液を用いて、サンプルを１時間ブロッキングした。
吸引によってブロッキング緩衝液を除去した後、ブロッキング緩衝液中で調製したＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子コンジュゲート抗体およびビオチンコンジュゲート抗体の混合物を追加し、４℃の加湿チャンバー中で、結合反応物を振盪しながら一晩インキュベートした。抗体混合物を吸引し、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の１×ＰＢＳ溶液を含有する緩衝液でサンプルを洗浄し、１×ＰＢＳ中、濃度２．５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンコンジュゲートメチレンブルーを追加した。細胞株および***組織サンプルの両方を使用して、シグナルの特異性およびアッセイのダイナミックレンジに基づいて、抗体およびストレプトアビジン−光増感剤コンジュゲートの濃度をすべて最適化した。室温で１時間インキュベートした後、ストレプトアビジン−メチレンブルー試薬を吸引し、洗浄緩衝液でサンプルを１回洗浄し、続いて、脱イオン水を３回交換した。３ｐＭフルオレセインおよび２つのＣＥ内部マーカー（ＭＦおよびＭＬ）の０．０１×ＰＢＳ溶液を含有するイルミネーションバッファー（Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）をサンプル切片上に追加した。電子アイスキューブ／チラーブロック（Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備える自社製ＬＥＤアレイイルミネータを使用して、光活性化切断によって、結合したＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を約４℃で放出させた。放出されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を含有するＣＥサンプルを、スライド上の組織切片上から採取し、６ｋＶおよび５０秒間、３０℃のＣＥ注入条件下で、ＡＢＩ３１００ ＣＥ機器（２２ｃｍキャピラリーアレイ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、ＣＥサンプル中の放出されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を分離および検出した。
還元（ＤＴＴ）放出アッセイフォーマットは類似するが、以下の一般的な差異がある。吸引によってブロッキング緩衝液を除去した後、バイオマーカー特異的な抗体（例えば、ＨＥＲ３抗体）のブロッキング緩衝液を含有する溶液をスライドに追加し、加湿チャンバー中で穏やかに振盪しながら４℃で一晩放置した。抗体溶液を吸引し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳでサンプルを５分間洗浄し、次いで、ＰＢＳのみで５分間洗浄した。吸引後、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子のブロッキング緩衝液で標識した二次抗体を追加した。加湿チャンバー中で、二次抗体を室温で１．５時間インキュベートした。次に、脱イオン水でスライドをすすぎ、続いて、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳで５分間すすいだ。次いで、スライドをラックにロードし、脱イオン水で６回浸漬した。スライドを遠心分離した後、１．０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３ｐＭフルオレセインおよび２つのＣＥ内部マーカー（ＭＦおよびＭＬ）の０．０１×ＰＢＳ溶液を含有する１００μＬの捕捉緩衝液をサンプル切片上に追加した。ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子の放出を可能にするために、加湿チャンバー中で、スライドを２時間インキュベートした。各スライドの捕捉緩衝液をＣＥ９６ウェルプレートに移し、次いで、ＤＴＴを含有しない捕捉緩衝液で適切に（一般に１０倍）希釈した。６ｋＶおよび５０秒間のＣＥ注入条件下で、ＡＢＩ３１００ ＣＥ機器（２２ｃｍキャピラリーアレイ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、ＣＥサンプル中の放出されたＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子を分離および検出した。
タンパク質特異的抗体を使用する以外は上記と同様に、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して、本明細書に記載されるバイオマーカーを検出し得る。これらのアッセイは、以下の表１に特定されている。これらの各ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイでは、１０％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ）と、１ｍｇ／ｍｌ ｈＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と、１．５％ＢＳＡと、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）１×ＰＢＳ溶液のカクテルとのブロッキング緩衝液を使用した。これらのアッセイに使用したＶｅｒａＴａｇ（登録商標）レポーター分子コンジュゲート抗体およびビオチンコンジュゲート抗体の濃度を表１に示す。
異なるフォーマットのＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイのリードアウトは、ＲＰＡ×ＩＢ×ＢＮＦ／ＴＡである。このリードアウトは、以下のように定義される：ＲＰＡ＝キャピラリー電気泳動によって精製および定量した放出ＶｅｒａＴａｇの蛍光の（回復を補正する）内部標準に対する相対ピーク面積（例えば、フルオレセインのピーク面積）；ＩＢ＝蛍光タグの光活性化および放出中に使用したイリューミネイションバッファーの容量；ＢＮＦ＝各バッチでアッセイし、バッチごとのシグナル変動を正規化するのに使用した、対照細胞株から求めたバッチ正規化係数；ＴＡ＝Ｈ＆Ｅ染色によるアッセイ後の染色および認定病理学者による測定によって決定した、サンプルの腫瘍面積。腫瘍の量に対して蛍光アッセイシグナルを正規化するために、これを使用する。
実施例６
ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイのバッチ一貫性
評価した腫瘍サンプルの数により、腫瘍サンプルのバッチについて、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを実行した。また、各バッチについて、バッチ間の測定結果を正規化するために、対照細胞株を評価した。腫瘍サンプルのバイオマーカー測定結果の散布図を図２に示す。相対ピーク面積（ＲＰＡ）で測定した各サンプルの蛍光強度は、ｙ軸上に示されている。対照細胞株の測定結果は各グラフの左側にあり、腫瘍サンプルの測定結果は各グラフの右側にある。黒丸はシグナルを示し、白丸はバックグラウンドを表す。
図２のパネルＡおよびＢは、それぞれ全ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のレベルを測定するアッセイの結果を示す。図２のパネルＣ、ＤおよびＥは、活性化ＨＥＲ３（具体的には、それぞれＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、チロシン１２８９でリン酸化されたＨＥＲ３（Ｐｈｏｓｐｏ−ＨＥＲ３）およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体）を測定するアッセイの結果を示す。
対照細胞株の測定結果は、バッチごとに一貫性があることが見出されたが、これは、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイの測定結果に関するバッチごとの分析再現性を示している。
実施例７
ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２アッセイを使用した腫瘍の特性評価
Ｈｕａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３４：３０３−３１１（２０１０）に記載されている方法にしたがって、全ＨＥＲ２レベルに基づいて腫瘍サンプルを特性評価するＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）アッセイのために、カットオフを予め確立した。ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、免疫組織化学（ＩＨＣ）および／またはインサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を使用して最新の臨床標準ガイドラインによってＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陰性と以前に特性評価された１，０９０個の乳癌サンプル（すなわち、ＦＩＳＨ陽性、ＩＨＣ３＋スコアまたはＩＨＣ２＋およびＦＩＳＨ＋）について、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）アッセイ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）を使用して、全ＨＥＲ２発現を決定した。このデータは、散布図として図３に示されている。ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性のカットオフは、参照方法によってＨＥＲ２陰性と分類されたサンプル（ＩＨＣ０、ＩＨＣ１＋またはＩＨＣ２＋／ＩＳＨ−またはＩＳＨ−）のＨＥＲ２発現の９５パーセンタイルを上回る（超える）発現と設定した。ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性のカットオフは、参照方法によってＨＥＲ２陽性と分類されたサンプル（ＩＨＣ３＋またはＩＨＣ２＋／ＩＳＨ＋またはＩＳＨ＋）の５パーセンタイルを下回る（未満の）発現と設定した。ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２境界性状態は、ＨＥＲ２陽性サンプルの５パーセンタイルカットオフと、ＨＥＲ２陰性サンプルの９５パーセンタイルカットオフとの間の（すなわち、２つのカットオフの間の）重複部分に該当する発現レベルと設定した。
実施例８
ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性乳癌とＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性乳癌との間では、バイオマーカーレベルが異なる
***腫瘍サンプルにおける異なるバイオマーカーの量を示すグラフを図４に示す。評価したバイオマーカーは、全ＨＥＲ２（Ｈ２Ｔ）、全ＨＥＲ３（Ｈ３Ｔ）、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体（Ｈ２３Ｄ）、チロシン１２８９でリン酸化されたＨＥＲ３（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３）およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体（ＨＥＲ３−ＰＩ３キナーゼ）であった。それぞれ図４のパネルＡ〜Ｅを参照のこと。実施例５に記載されているように、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して、バイオマーカーレベルを測定した。散乱法を使用して、バイオマーカーレベルをプロットした。サンプル数はｘ軸上に示されており、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイのリードアウト（ＲＰＡ×ＩＢ×ＢＮＦ／ＴＡ）はｙ軸上に示されている。マンホイットニー統計分析を実施して、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性癌とＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性癌との間で平均バイオマーカーレベルが異なるかを決定した。高ＨＥＲ２***腫瘍および低ＨＥＲ２***腫瘍では、ＨＥＲ３の分布および中央値レベルは類似しているが、高ＨＥＲ２***腫瘍では、低ＨＥＲ２***腫瘍と比較して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体およびリン酸化ＨＥＲ３として測定した活性化ＨＥＲ３の分布および中央値レベルが有意に大きく、これは、ＨＥＲ３シグナル伝達におけるＨＥＲ２の主要な役割を裏付けている。
実施例９
バイオマーカーレベルの相関関係およびスピアマン相関係数分析
バイオマーカーレベルの統計的分析を行って、各バイオマーカーレベルが、腫瘍サンプルにおける任意の他のバイオマーカーレベルと相関するかを決定した。実施例５に記載されているように、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用して、バイオマーカーレベルを測定した。スピアマン順位相関試験分析を実施して、スピアマン順位相関係数（スピアマン）およびバイオマーカーの各ペアワイズ比較のｐ値を特定した。
図３で測定したマーカー（高対低全ＨＥＲ２）と活性化ＨＥＲ３との間の統計的関係レベルを示すグラフを図５に示す。パネルＡは、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ２との間の相関関係を示す。パネルＢは、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との間の相関関係を示す。パネルＣは、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体とリン酸化ＨＥＲ３との間の相関関係を示す。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ２との間には有意な相関関係があるが、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との間では、相関関係が全ＨＥＲ２の場合よりも大きく（スピアマンｒ＝０．８６４１対０．３５７２）、これは、ＨＥＲ３シグナル伝達におけるＨＥＲ２の主要な役割を裏付けている。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体とリン酸化ＨＥＲ３との間の有意な全体的な相関関係は、２つの異なる方法によって測定した場合に、活性化ＨＥＲ３が所定のサンプルにおいて一貫していることを示している。
図３で測定したマーカー（高全ＨＥＲ２対低全ＨＥＲ２）とリン酸化ＨＥＲ３との間の統計的関係を示すグラフを図６に示す。パネルＡは、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ２との間の相関関係を示す。パネルＢは、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との間の相関関係を示す。いずれの場合においても、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ２との間の全体的な相関関係およびリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との間の全体的な相関関係は有意であるが、リン酸化ＨＥＲ３によって測定したＨＥＲ３の活性化は、全ＨＥＲ３よりも密接に全ＨＥＲ２と相関している（スピアマンｒ＝０．７２９１；ｐ＜０．０００１対０．２８６５；ｐ＜０．０３０７）。この統計分析の結果を要約した表を図７に示す（パネルＡ：すべてのサンプル；パネルＢ：ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性サンプル；パネルＣ：ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性サンプル）。有意なｐ値（ｐ＜０．０５）を有するスピアマン順位相関係数には下線が付されている。
実施例１０
マーカーレベルの相関関係を示すヒートマップ
各癌のサンプルのサブセットが高活性化ＨＥＲ３を有すると同定し得るかを決定するために、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイを使用してバイオマーカーレベルを測定し、ヒートマップ上にプロットした。ＨＥＲ３ターゲティング治療は、ＨＥＲ３活性化によって有意に駆動される癌を処置するのに有効である可能性がより高いので、ＨＥＲ３活性化癌を有する被験体を同定することは、ＨＥＲ３ターゲティング治療に対してより良く反応する被験体を同定するのに役立ち得る。発現パターンを同定するために、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって測定した異なるバイオマーカーのレベルをヒートマップ上にプロットした。
図８は、サンプルのヒートマップを示す。パネルＡは、高ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２状態から低ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２状態に分類した、すべての乳癌腫瘍サンプルのバイオマーカーレベルを示すヒートマップである。パネルＢは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２状態に基づいて腫瘍サンプルを分別した２つのヒートマップを示す。
各腫瘍サンプルのサンプル数は、各ヒートマップの下部に示されており、アッセイで分析したバイオマーカーは、各ヒートマップの左側に示されている。最高発現（≧９０パーセンタイル）を示したサンプルは、濃灰色で示されている；中発現（５０パーセンタイル）のサンプルは黒色で示されており、低発現（≦１０パーセンタイル）のサンプルは淡灰色で示されている。中間の濃淡は、中間の発現レベルを反映する。最高レベルの活性化ＨＥＲ３を有するサンプルは、矢印でマークされている。高レベルのＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ３リン酸化およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体（すなわち、活性化ＨＥＲ３へのＰＩ３Ｋの動員）の少なくとも１つと組み合わせた中全ＨＥＲ３測定結果から高全ＨＥＲ３測定結果の評価に基づいて、サンプルを最高レベルの活性化ＨＥＲ３を有すると分類した。
例えば、図８Ａのサンプル６は、中レベルの全ＨＥＲ２を有するが、非常に高レベルのＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体を有する。受容体の活性化には二量体化が必要であるので、非常に高レベルの二量体化は、ＨＥＲ３受容体の活性化の増加を示す可能性が高い。別の例は図８Ａのサンプル１９であり、中レベルの全ＨＥＲ２を有していたが、非常に高レベルのＨＥＲ３リン酸化１２８９レベルを有していた。１２８９位におけるＨＥＲ３のリン酸化はＨＥＲ３シグナル伝達を活性化するので、高レベルのこのバイオマーカーは、サンプルにおけるＨＥＲ３活性の増加を示すとも考えられた。ＨＥＲ３経路のヒートマッププロファイリングにより、ＨＥＲ２状態のみによる層別化によっては見出されないＨＥＲ３活性化サンプルを同定することができた。全ＨＥＲ２によってランク付けしたヒートマップにより、サンプルのサブセットを同定し、クラスタ分析（実施例１１）にしたがって分類した。リン酸化ＨＥＲ３およびＨＥＲ３−ＰＩ３キナーゼ複合体は、全体的な全ＨＥＲ２レベルと有意に相関するが（図７）、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２低乳癌サンプルのサブグループにおける高レベルのリン酸化ＨＥＲ３およびＨＥＲ３−ＰＩ３キナーゼ複合体は、ＨＥＲ２の増幅以外に、さらなるＨＥＲ３活性化機構も存在し得ることを示唆している。
実施例１１
乳癌サンプルの階層的クラスタ分析
図９は、ＶｅｒａＴａｇ（登録商標）アッセイによって測定したバイオマーカーレベルによる、腫瘍サンプルの階層的クラスタ分析を示す。パネルＡは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陰性乳癌サンプルの分析を示し、パネルＢは、ＨＥＲｍａｒｋ（登録商標）ＨＥＲ２陽性乳癌サンプルの分析を示す。サンプル番号は、グラフの下部に示されている。分析したバイオマーカーは、グラフの左側に沿って示されている：ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体（ＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ）、全ＨＥＲ３（Ｈ３Ｔ）、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体（Ｈ２３Ｄ）、全ＨＥＲ２（Ｈ２Ｔ）、およびチロシン１２８９でリン酸化されたＨＥＲ３（ｐ−ＨＥＲ３）。最高レベルの活性化ＨＥＲ３を発現する腫瘍は、グラフの右側にクラスタリングされている。得られた系統樹により、活性化ＨＥＲ３を有する腫瘍のサブグループ（これらは、Ｈ２Ｔによってランク付けしたヒートマップによって同定されたものと同じである）が同定された。
本出願で言及されるすべての発行特許および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の好ましい実施形態を例証および説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更を行い得ると認識されよう。

Claims (28)

  1. 腫瘍における活性化ＨＥＲ３の量を測定するための方法であって、
    （ａ）腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３の量、および前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；ならびに
    （ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つと、全ＨＥＲ３タンパク質との比を決定することを含み、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回る場合、および（ｉｉ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との比、前記サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との比の少なくとも１つの比が、前記参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体と全ＨＥＲ３との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３と全ＨＥＲ３との中央値比、またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体と全ＨＥＲ３との中央値比の少なくとも１つを上回る場合、前記腫瘍が多量の活性化ＨＥＲ３を有する、方法。
  2. 活性化ＨＥＲ３のレベルを、被験体がＨＥＲ３ターゲティング治療によって処置され得るかどうかの指標として用いる方法であって、
    （ａ）前記被験体由来の腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；ならびに
    （ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定することを含み、ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含み、そして、前記被験体が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とする癌を有することは、前記被験体が、ＨＥＲ３ターゲティング治療によって処置され得ることを示す、方法。
  3. 活性化ＨＥＲ３のレベルを、被験体がＨＥＲ３ターゲティング治療に対して反応する可能性が高いかどうかの指標として用いる方法であって、
    （ａ）前記被験体の癌由来の生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量、およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量を測定すること；ならびに
    （ｂ）ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体、リン酸化ＨＥＲ３またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の少なくとも１つの量と、全ＨＥＲ３の量との比を決定することを含み、ここで、高レベルの活性化ＨＥＲ３は、（ｉ）前記サンプルにおける全ＨＥＲ３の量が、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団の全ＨＥＲ３の中央値量を上回ること、および（ｉｉ）前記サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも１つが、前記被験体と同じ種類の癌を有する被験体の参照集団におけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比、またはＨＥＲ３−ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との中央値比の少なくとも１つを上回ることを含み、そして前記被験体の癌が、高レベルの活性化ＨＥＲ３を有することを特徴とすることは、前記被験体がＨＥＲ３ターゲティング治療に対して反応する可能性がより高いことを示す、方法。
  4. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルが、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌、肺癌、脳癌、子宮内膜癌、膵臓癌、前立腺癌または子宮頸癌の少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルが乳癌を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  6. ＨＥＲ３リン酸化特異的抗体またはＨＥＲ３パンホスホ抗体の使用によって、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量を検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  7. ＨＥＲ３の１２８９位のチロシン残基でリン酸化されたＨＥＲ３タンパク質に結合するリン酸化特異的抗体を使用することによって、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量を検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプル中に存在するＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量と全ＨＥＲ３の量との比、リン酸化ＨＥＲ３の量と全ＨＥＲ３の量との比、およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量と全ＨＥＲ３の量との比の少なくとも２つを決定することによって、前記腫瘍または前記生物学的サンプルにおける活性化ＨＥＲ３の量を検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の量を測定することができるアッセイを使用して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体およびＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を測定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量の測定が、
    ａ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルとＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程；
    ｂ）前記ＨＥＲ３抗体組成物とタグ付結合組成物とを接触させる工程であって、前記タグ付結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含み、前記タグ付結合組成物が、前記ＨＥＲ３抗体組成物に特異的に結合する、工程；
    ｃ）前記タグ付結合組成物の前記切断可能な結合を切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
    ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３タンパク質の量を決定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ３タンパク質の量の測定が、
    ａ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと、第１の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合するＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記ＨＥＲ３抗体組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む、工程；
    ｂ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと、第２の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；
    ｃ）前記ＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
    ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３タンパク質の量を決定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の測定が、
    ａ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと、切断可能な結合を介して抗体組成物に結合した分子タグを含む抗体組成物とを接触させる工程；
    ｂ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；
    ｃ）前記抗体組成物の前記切断可能な結合を切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
    ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体またはＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を決定する工程を含み、
    ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の測定の場合には、前記抗体組成物がＨＥＲ３に特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ２に特異的に結合するか、または前記抗体組成物がＨＥＲ２に特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合し、
    ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の測定の場合には、前記抗体組成物がＨＥＲ３に特異的に結合し、前記切断プローブがＰＩ３Ｋに特異的に結合するか、または前記抗体組成物がＰＩ３Ｋに特異的に結合し、前記切断プローブがＨＥＲ３に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量の測定が、
    ａ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルとＨＥＲ２抗体組成物とを接触させる工程；
    ｂ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルとＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程；
    ｃ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと、前記ＨＥＲ２抗体組成物または前記ＨＥＲ３抗体組成物のいずれかに結合するタグ付結合組成物とを接触させる工程であって、前記タグ付結合組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む、工程；
    ｄ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと切断プローブとを接触させる工程であって、前記切断プローブが、それに対して有効近接距離内にある場合に前記タグ付結合組成物の前記切断可能な結合を切断する工程；
    ｅ）前記タグ付結合組成物の前記切断可能な結合を切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
    ｆ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の量を決定する工程を含み、
    前記タグ付結合組成物が前記ＨＥＲ３抗体組成物に特異的に結合する場合には、前記切断プローブが前記ＨＥＲ２抗体組成物に特異的に結合するか、または前記タグ付結合組成物が前記ＨＥＲ２抗体組成物に特異的に結合する場合には、前記切断プローブが前記ＨＥＲ３抗体組成物に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量の測定が、
    ａ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと、ＨＥＲ３抗体組成物およびＰＩ３Ｋ抗体結合組成物とを接触させる工程であって、一方の抗体組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含み、他方の抗体組成物が、それに対して有効近接距離内にある場合に前記結合組成物の前記切断可能な結合を切断する切断プローブを含む工程；
    ｂ）前記切断可能な結合を切断して、前記分子タグを放出させる工程；および
    ｃ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ複合体の量を決定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量の測定が、
    ａ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと、第１の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第１のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第１のＨＥＲ３抗体組成物が、切断可能な結合を介してそれに結合した分子タグを含む、工程；
    ｂ）前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルと、第２の結合部位でＨＥＲ３タンパク質に特異的に結合する第２のＨＥＲ３抗体組成物とを接触させる工程であって、前記第２のＨＥＲ３抗体組成物が、それに対して有効近接距離内にある場合に前記第１のＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断する切断誘導部分を含み、前記第２の結合部位がＨＥＲ３リン酸化部位を含む工程；
    ｃ）前記第１のＨＥＲ３抗体組成物の前記切断可能な結合を切断し、それにより、前記分子タグを放出させる工程；および
    ｄ）前記放出された分子タグを定量して、前記腫瘍サンプルまたは前記生物学的サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ３の量を決定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ＨＥＲ３ターゲティング治療が、Ｕ３−１２８９／ＡＭＧ８８８、ＭＭ−１２１／ＳＡＲ２５６２１２、ＭＭ−１１１、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、ＡＺＤ−８９３１、ＬＪＭ７１６、Ａｖ−２０３およびペルツズマブからなる群より選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項２または３に記載の方法。
  17. 全ＨＥＲ２タンパク質の量を測定することをさらに含み、前記全ＨＥＲ２タンパク質の量が、前記被験体がＨＥＲ２陽性癌またはＨＥＲ２陰性癌を有するかの指標として用いられる、請求項２に記載の方法。
  18. 全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陽性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の下位５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第１のカットオフを下回るか、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陰性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の上位９５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第２のカットオフを上回るか、または全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回るが、前記第２のカットオフを下回るかを決定することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  19. 前記被験体がＨＥＲ２陽性癌を有することは、前記被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療によって処置され得ることを示す、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記腫瘍サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回ることは、前記被験体がＨＥＲ２ターゲティング治療およびＨＥＲ３ターゲティング治療を含む共治療によって処置され得ることを示す、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記ＨＥＲ２ターゲティング治療が、ＢＩＢＷ２９９２、ＨＫＩ−２７２、４Ｄ５、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン、ＡＥＥ−７８８、ラパチニブ、ネラチニブ、ＡＲＲＹ−３８０およびＡＲＲＹ−５４３からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. ＨＥＲ３ターゲティング剤に対する反応性が、前記被験体がＨＥＲ３作用剤で処置されている間の、診断と重大事象の発生との間のより長い疾患時間経過を含む、請求項３に記載の方法。
  23. 前記重大事象が、ある病期からより進行期への前記癌の進行、転移性疾患への進行、再発、手術または死亡の少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 全ＨＥＲ２タンパク質の量を測定することをさらに含み、前記全ＨＥＲ２タンパク質の量は、前記被験体がＨＥＲ２陽性癌またはＨＥＲ２陰性癌を有するかの指標として用いられる、請求項３に記載の方法。
  25. 全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陽性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の下位５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第１のカットオフを下回るか、全ＨＥＲ２タンパク質の量が、ＨＥＲ２陰性癌の参照集団における全ＨＥＲ２タンパク質発現の上位９５パーセンタイルに対応する全ＨＥＲ２タンパク質のレベルを含む第２のカットオフを上回るか、または全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回るが、前記第２のカットオフを下回るかを決定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  26. 前記被験体がＨＥＲ２陽性癌を有することは、前記被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示す、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記生物学的サンプルにおける全ＨＥＲ２タンパク質の量が前記第１のカットオフを上回ることは、前記被験体が、ＨＥＲ２ターゲティング剤およびＨＥＲ３ターゲティング剤の共治療に対して反応する可能性がより高いことを示す、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記ＨＥＲ２ターゲティング治療が、ＢＩＢＷ２９９２、ＨＫＩ−２７２、４Ｄ５、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ エムタンシン、ＡＥＥ−７８８、ラパチニブ、ネラチニブ、ＡＲＲＹ−３８０およびＡＲＲＹ−５４３からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
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