JP4742650B2 - Carbon nanotube composition, biosensor, and production method thereof - Google Patents
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本発明は、水溶液中で分散性の高いカーボンナノチューブ組成物、および血液、尿、唾液、汗、涙などの生体試料、食品原料や製品、環境中に由来する基質（特定成分）を、高精度で迅速かつ容易に定量するためのバイオセンサに関する。 The present invention provides a highly accurate carbon nanotube composition that is highly dispersible in an aqueous solution, and biological samples such as blood, urine, saliva, sweat, and tears, food materials and products, and substrates (specific components) derived from the environment with high accuracy. It is related with the biosensor for quantifying quickly and easily.
生体試料などに存在する特定成分を、試料の希釈および攪拌などを行うことなく簡易に定量しうるバイオセンサが提案されている。その一例として、特許文献１には、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法によって電極系を形成し、この電極上に酸化還元酵素および電子伝達体（電子受容体）を含有する反応層を形成したバイオセンサが開示されている。
There has been proposed a biosensor capable of easily quantifying a specific component present in a biological sample or the like without diluting or stirring the sample. As an example,
このバイオセンサは、以下のようにして試料中の基質濃度を定量する。まず、試料液をバイオセンサの反応層上に滴下することにより、反応層が溶解し、試料液中の基質と反応層の酸化還元酵素との間で酵素反応が進行する。この酵素反応に伴い、電子伝達体が還元される。一定時間後、センサの電極に電圧を印加して、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値を測定する。この電流値は、基質濃度に直接比例するので、試料液中の基質濃度を定量することができる。 This biosensor quantifies the substrate concentration in a sample as follows. First, by dropping the sample solution onto the reaction layer of the biosensor, the reaction layer is dissolved, and an enzyme reaction proceeds between the substrate in the sample solution and the oxidoreductase in the reaction layer. Along with this enzymatic reaction, the electron carrier is reduced. After a certain time, a voltage is applied to the electrode of the sensor to electrochemically oxidize the reduced electron carrier, and the oxidation current value obtained at this time is measured. Since this current value is directly proportional to the substrate concentration, the substrate concentration in the sample solution can be quantified.
このようなバイオセンサはすでに血液中のグルコース濃度を測定するセンサとして実用化されている。実用化されている血糖値センサの測定感度の下限値は２０ｍｇ／ｄＬであり、血液中に存在するグルコース（８０〜１６０ｍｇ／ｄＬ）を測定するには十分な感度を有している。しかしながら、血液中に存在する他の成分を測定したり、血液以外の試料中の成分を測定する場合には、測定したい成分の存在濃度が低く、既存のバイオセンサでは測定できないという問題がある。 Such a biosensor has already been put into practical use as a sensor for measuring glucose concentration in blood. The lower limit of the measurement sensitivity of a blood glucose level sensor that has been put to practical use is 20 mg / dL, and it has sufficient sensitivity to measure glucose (80 to 160 mg / dL) present in blood. However, when measuring other components present in blood or measuring components in a sample other than blood, there is a problem that the concentration of the component to be measured is low and it cannot be measured by an existing biosensor.
一方、カーボンナノチューブは１９９０年に飯島らにより見出された炭素物質であり（非特許文献１）、グラファイトの１枚面を巻いて筒状にした形状を有している。１層に巻いたものを単層カーボンナノチューブ、２層に巻いたものを２層カーボンナノチューブ、多層に巻いたものを多層カーボンナノチューブという。カーボンナノチューブは、高い機械的強度、高い導電性を有することから、各分野での応用が期待されている。しかしながら、溶媒中、特に水溶液中での分散性が低くその利便性の障害となっている。 On the other hand, a carbon nanotube is a carbon substance discovered by Iijima et al. In 1990 (Non-Patent Document 1), and has a shape in which one sheet of graphite is wound into a cylindrical shape. A single-walled carbon nanotube is a single-walled carbon nanotube, a double-walled carbon nanotube is a double-walled carbon nanotube, and a multi-walled carbon nanotube is a multi-walled carbon nanotube. Since carbon nanotubes have high mechanical strength and high electrical conductivity, they are expected to be applied in various fields. However, the dispersibility in a solvent, particularly in an aqueous solution, is low, which is an obstacle to its convenience.
カーボンナノチューブを用いたバイオセンサとしては、カーボンナノチューブとテフロン（登録商標）のコンポジット、ミネラルオイル中でのカーボンナノチューブペースト、白金ナノ粒子を担持したカーボンナノチューブを電極へと応用したものが報告されている（非特許文献２、３、４）。これらはいずれもカーボンナノチューブを用いない場合よりもバイオセンサの感度を向上できると報告されているが、いずれもカーボンナノチューブの分散性を向上した報告はなく、感度としても実用化されているバイオセンサに比べて著しく低いものであった。
以上の従来技術の問題点に鑑み、本発明は、水溶液中で高い分散性を示すカーボンナノチューブ組成物、該組成物をバイオセンサの電極上へと塗布することにより再現性のよい塗布を可能とし、さらに現在実用化されているバイオセンサの感度を向上し、存在濃度が低く従来のバイオセンサ技術では測定が不可能であった成分の測定ができるバイオセンサの提供を目的とする。 In view of the above-mentioned problems of the prior art, the present invention enables a highly reproducible application by applying a carbon nanotube composition exhibiting high dispersibility in an aqueous solution and the composition onto an electrode of a biosensor. Another object of the present invention is to provide a biosensor that can improve the sensitivity of a biosensor that is currently in practical use and can measure components that have a low concentration and cannot be measured by conventional biosensor technology.
上記課題を解決するため、鋭意検討の結果、カーボンナノチューブが親水性ポリマーの水溶液によく分散すること、その溶液をバイオセンサの電極上に塗布、乾燥させることにより、再現性よく品質の揃ったバイオセンサが作製可能であり、さらにバイオセンサの感度を向上させることが可能であることを見出し、本発明に至った。 In order to solve the above-mentioned problems, as a result of intensive studies, carbon nanotubes are well dispersed in an aqueous solution of a hydrophilic polymer, and the solution is applied to the electrode of the biosensor and dried, so that a biomaterial with high reproducibility and quality can be obtained. The present inventors have found that a sensor can be produced and that the sensitivity of a biosensor can be improved, and the present invention has been achieved.
すなわち、本発明は親水性ポリマーとカーボンナノチューブを含有するカーボンナノチューブ組成物、およびその製造方法、該カーボンナノチューブ組成物を電極に塗布することを特徴とするバイオセンサ、およびその製造方法を提供する。 That is, the present invention provides a carbon nanotube composition containing a hydrophilic polymer and a carbon nanotube, a method for producing the same, a biosensor characterized by applying the carbon nanotube composition to an electrode, and a method for producing the same.
本発明は以下の通りである。 The present invention is as follows.
＜１＞絶縁性の基板、前記基板上に形成された少なくとも作用極と対極を有する電極系、前記電極系上に形成された反応層を有するバイオセンサであって、反応層にスルホン酸基またはカルボキシル基を有する親水性ポリマーと２層カーボンナノチューブを含有するカーボンナノチューブ水溶液を乾燥させることにより得られる固体状カーボンナノチューブ組成物を含有することを特徴とするバイオセンサ。
< 1 > A biosensor having an insulating substrate, an electrode system having at least a working electrode and a counter electrode formed on the substrate, and a reaction layer formed on the electrode system, wherein the reaction layer has a sulfonic acid group or A biosensor comprising a solid carbon nanotube composition obtained by drying a carbon nanotube aqueous solution containing a hydrophilic polymer having a carboxyl group and a double-walled carbon nanotube .
本発明によれば、親水性ポリマーを含んだ水溶液を用いることによりカーボンナノチューブを分散性よく懸濁することができる。またその組成物をバイオセンサの電極上に塗布することにより、再現性よく品質の揃ったバイオセンサが作製可能となり、酵素電極法で測定した場合の対象物質の測定感度を向上させることができる。それにより、これまで低濃度であるため酵素電極法を用いたバイオセンサでは測定が不可能であった試料についても測定が可能となる。 According to the present invention, carbon nanotubes can be suspended with good dispersibility by using an aqueous solution containing a hydrophilic polymer. In addition, by applying the composition onto the electrode of the biosensor, a biosensor with uniform quality can be produced, and the measurement sensitivity of the target substance when measured by the enzyme electrode method can be improved. As a result, it is possible to measure a sample that has been impossible to measure with a biosensor using the enzyme electrode method because of its low concentration.
本発明のカーボンナノチューブ組成物は親水性ポリマーとカーボンナノチューブを含有する組成物であり、液体であっても固体でもよい。好ましくは水溶液として調製し、超音波処理などによりカーボンナノチューブを均一に分散させる。水中ではカーボンナノチューブは超音波処理を行っても分散性が悪く凝集しやすいが、水溶性ポリマーと混合した場合、超音波処理により分散性が向上し、１時間放置しても凝集はみられない。 The carbon nanotube composition of the present invention is a composition containing a hydrophilic polymer and carbon nanotubes, and may be liquid or solid. Preferably, it is prepared as an aqueous solution, and the carbon nanotubes are uniformly dispersed by ultrasonic treatment or the like. In water, carbon nanotubes are poorly dispersible even when subjected to ultrasonic treatment and tend to aggregate, but when mixed with a water-soluble polymer, the dispersibility is improved by ultrasonic treatment and no aggregation is observed even after standing for 1 hour. .
カーボンナノチューブと親水性ポリマーの組成比は特に制限はないが、好ましくはカーボンナノチューブ／親水性ポリマー値として０．００５〜１００（重量比）が好ましく、液体の組成物の場合は、カーボンナノチューブの重量は０．０１〜１ｗ／ｖ％が好ましく、親水性ポリマーは０．０１〜２ｗ／ｖ％が好ましい。 The composition ratio between the carbon nanotube and the hydrophilic polymer is not particularly limited, but preferably 0.005 to 100 (weight ratio) as the carbon nanotube / hydrophilic polymer value. In the case of a liquid composition, the weight of the carbon nanotube Is preferably 0.01 to 1 w / v%, and the hydrophilic polymer is preferably 0.01 to 2 w / v%.
また、必要に応じて該液体を適当な乾燥操作により固体として用いることができる。水溶性ポリマーの水溶液中で分散させることにより、乾燥した後も凝集を避けることが可能となり、再現性のよい塗布されたカーボンナノチューブ組成物を得ることができる。乾燥する際には液体を基板などに塗布してから乾燥するのが好ましく、塗布の方法は液滴の滴下、スクリーン印刷、ディスペンサー印刷などの印刷法が採用できる。乾燥条件としては、どのような温度でも乾燥させることができるが、一般には室温から５０℃の範囲で風乾させることにより固体とすることができる。固体のカーボンナノチューブと親水性ポリマーの組成比も液体の場合と同様、０．００５〜１００（重量比）が好ましい。さらに好ましくは０．１〜５（重量比）である。またバイオセンサの電極に塗布する場合には酵素を含んで乾燥させる場合、酵素の失活を防ぐために０℃〜室温の低温で乾燥させるか、凍結乾燥させることもできる。 If necessary, the liquid can be used as a solid by an appropriate drying operation. By dispersing it in an aqueous solution of a water-soluble polymer, it becomes possible to avoid agglomeration even after drying, and a coated carbon nanotube composition with good reproducibility can be obtained. When drying, it is preferable to apply a liquid to a substrate and then dry, and a coating method such as droplet dropping, screen printing, or dispenser printing can be employed. As drying conditions, it can be dried at any temperature, but in general, it can be solidified by air drying in the range of room temperature to 50 ° C. The composition ratio between the solid carbon nanotubes and the hydrophilic polymer is preferably 0.005 to 100 (weight ratio) as in the case of the liquid. More preferably, it is 0.1-5 (weight ratio). Moreover, when applying to the electrode of a biosensor, when drying including an enzyme, it can be dried at a low temperature of 0 ° C. to room temperature or freeze-dried in order to prevent inactivation of the enzyme.
本発明でカーボンナノチューブ組成物に含まれる親水性ポリマーとしては、カルボキシル基、スルホン酸基のどちらか、または両方を持ったポリマーが用いられる。例としてあげるならば、カラギーナンまたはカルボキシメチルセルロース、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アラビアガムから選ばれる１種または２種以上の組合せである。 The hydrophilic polymer contained in the carbon nanotube composition in the present invention, mosquitoes carboxyl group, either sulfonic acid groups the polymer or with both, is used. For example, one or a combination of two or more selected from carrageenan or carboxymethylcellulose, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, hyaluronic acid and gum arabic.
カーボンナノチューブの製造方法としては、アーク放電法やレーザー蒸発法、化学気相成長法などすでに知られている製造方法を用いることができる。中でも、グラファイト層に欠陥の少ない高品質なカーボンナノチューブを安価に製造する方法として、化学気相成長法が知られており、さらに触媒化学気相成長法では、カーボンナノチューブの層数を、単層、２〜５層に制御して製造できることが知られている。本発明で用いるカーボンナノチューブとしては、いかなる製造方法により製造したカーボンナノチューブでも用いることができる。 As a method for producing carbon nanotubes, known production methods such as an arc discharge method, a laser evaporation method, and a chemical vapor deposition method can be used. Among them, chemical vapor deposition is known as a method for inexpensively producing high-quality carbon nanotubes with few defects in the graphite layer. Furthermore, in catalytic chemical vapor deposition, the number of carbon nanotubes is reduced to a single layer. It is known that it can be produced by controlling to 2 to 5 layers. Carbon nanotubes produced by any production method can be used as the carbon nanotubes used in the present invention.
また本発明に用いるカーボンナノチューブは、２層カーボンナノチューブである。
２層カーボンナノチューブの特性としては高い導電性があげられる。カーボンナノチューブの導電性は本来単層カーボンナノチューブが最も高いとされるが、単層カーボンナノチューブはバンドル構造を形成し束となってしまうため、実際には束の内部にあるカーボンナノチューブが利用されない欠点がある。一方、２層カーボンナノチューブはバンドル構造を組まないため、効率的にカーボンナノチューブが用いられ、結果としてカーボンナノチューブの中で最も高い導電性を示すことができる。
導電性のよいカーボンナノチューブをバイオセンサの電極近傍に塗布することにより、酵素反応により生じた電子を効率的に電極へと伝達することが可能になり、測定時の電流値の増大、すなわち感度の向上が期待できる。その他にも、より低電圧での電流の発生による消費電力の低減、メディエーターが不要になるなどの効果が期待される。
The carbon nanotube used in the present invention is a double- walled carbon nanotube.
A characteristic of the double-walled carbon nanotube is high conductivity. Carbon nanotubes are considered to have the highest conductivity of single-walled carbon nanotubes, but single-walled carbon nanotubes form bundles and form bundles, so the carbon nanotubes inside the bundle are not actually used. There is. On the other hand, since the double-walled carbon nanotube does not form a bundle structure, the carbon nanotube is efficiently used, and as a result, the highest conductivity among the carbon nanotubes can be exhibited.
By applying carbon nanotubes with good conductivity near the electrodes of the biosensor, it becomes possible to efficiently transfer the electrons generated by the enzyme reaction to the electrodes, increasing the current value during measurement, that is, improving the sensitivity. Improvement can be expected. In addition, the effects such as reduction of power consumption due to generation of current at a lower voltage, and elimination of a mediator are expected.
２層カーボンナノチューブはカーボンナノチューブを透過型電子顕微鏡で観察し、任意に選択した１００本のカーボンナノチューブ中、５０本以上が２層カーボンナノチューブであるものが好ましく、その測定方法は、透過型電子顕微鏡で１００万倍で観察し、１５０ｎｍ四方の視野の中で視野面積の１０％以上がカーボンナノチューブで、かつ複数の視野中から任意に抽出した１００本のカーボンナノチューブ中の５０本以上が２層カーボンナノチューブであり、上記測定を１０箇所について行った平均値で評価する。 The double-walled carbon nanotubes are preferably observed by observing the carbon nanotubes with a transmission electron microscope. Of the 100 carbon nanotubes arbitrarily selected, 50 or more are preferably double-walled carbon nanotubes. Observed at 1 million magnifications, 10% or more of the viewing area in a 150 nm square field of view is carbon nanotubes, and 50 or more of 100 carbon nanotubes arbitrarily extracted from multiple fields of view are double-layer carbon It is a nanotube, and the above-mentioned measurement is evaluated with an average value obtained at 10 locations.
さらに好ましくは、カーボンナノチューブを透過型電子顕微鏡で観察し、任意に選択した１００本の２層カーボンナノチューブ中、８０本以上がその外径が１．５から４．０ｎｍの範囲内にあるものである。その測定方法は、透過型電子顕微鏡で１００万倍で観察し、複数の視野中から任意に抽出した１００本の２層カーボンナノチューブの外径を測定し、８０本以上がその外径が１．５から４．０ｎｍの範囲内にあり、上記測定を１０箇所について行った平均値で評価する。 More preferably, carbon nanotubes are observed with a transmission electron microscope, and 80 or more of 100 arbitrarily selected double-walled carbon nanotubes have an outer diameter in the range of 1.5 to 4.0 nm. is there. The measurement method was observed with a transmission electron microscope at a magnification of 1,000,000, and the outer diameters of 100 double-walled carbon nanotubes arbitrarily extracted from a plurality of visual fields were measured. It is in the range of 5 to 4.0 nm, and the above measurement is evaluated with an average value obtained at 10 locations.
さらに好ましくは、下記（１）〜（４）の要件全てを満たしている２層カーボンナノチューブである。
（１） カーボンナノチューブを透過型電子顕微鏡で観察し、任意に選択した１００本のカーボンナノチューブ中、５０本以上が２層カーボンナノチューブであること。
（２）カーボンナノチューブを透過型電子顕微鏡で観察し、任意に選択した２層カーボンナノチューブ中の屈曲部間距離の平均が１００ｎｍ以上であること。
（３） 共鳴ラマン散乱測定により、１５６０〜１６００ｃｍ−１の範囲内で最大のピーク強度をＧ、１３１０〜１３５０ｃｍ−１の範囲内で最大のピーク強度をＤとしたとき、Ｇ／Ｄの比が１０以上であること。
（４） 元素分析による金属含有率が１重量％以下であること。
More preferably, it is a double-walled carbon nanotube that satisfies all the following requirements (1) to (4).
(1) The carbon nanotubes are observed with a transmission electron microscope, and 50 or more of 100 carbon nanotubes arbitrarily selected are double-walled carbon nanotubes.
(2) The carbon nanotubes are observed with a transmission electron microscope, and the average distance between the bent portions in the arbitrarily selected double-walled carbon nanotubes is 100 nm or more.
(3) By resonance Raman scattering measurement, the maximum peak intensity in the range of 1560~1600cm -1 G, when the maximum peak intensity is D within the 1310～1350Cm -1, the ratio of G /
(4) The metal content by elemental analysis is 1% by weight or less.
ここで、２層カーボンナノチューブ中の屈曲部とは、カーボンナノチューブのグラファイト構造中に炭素５員環と７員環が存在することによる屈曲を言い、高分解能透過型電子顕微鏡写真でカーボンナノチューブが折れ曲がって観察される部分のことを言う。本発明で使用する２層カーボンナノチューブは、高分解能透過型電子顕微鏡で観察し、選んだ任意の２層カーボンナノチューブについて屈曲部から屈曲部までの距離の平均を求め、それを１０本以上の２層カーボンナノチューブについて平均した結果が、１００ｎｍ以上であるものが好ましい。屈曲部から屈曲部までの距離が長ければ長いほど、２層カーボンナノチューブの直線性は向上し、導電性が高い２層カーボンナノチューブとなる。屈曲部間距離は長いほど好ましいため、３００ｎｍ以上がより好ましく、５００ｎｍ以上がさらに好ましく、１μｍ以上が最も好ましい。 Here, the bent portion in the double-walled carbon nanotube refers to the bending due to the presence of a 5-membered ring and a 7-membered ring in the graphite structure of the carbon nanotube, and the carbon nanotube is bent in a high-resolution transmission electron micrograph. The part that is observed. The double-walled carbon nanotubes used in the present invention are observed with a high-resolution transmission electron microscope, and the average of the distance from the bent portion to the bent portion is determined for any selected double-walled carbon nanotube. The average of the single-walled carbon nanotubes is preferably 100 nm or more. As the distance from the bent portion to the bent portion is longer, the linearity of the double-walled carbon nanotube is improved and the double-walled carbon nanotube having high conductivity is obtained. Since the distance between the bent portions is preferably as long as possible, it is preferably 300 nm or more, more preferably 500 nm or more, and most preferably 1 μm or more.
また、２層カーボンナノチューブ含有組成物は、ラマン分光法により評価が可能である。ラマンスペクトルにおいて１５９０ｃｍ−１付近に見られるラマンシフトはグラファイト由来のＧバンドと呼ばれ、１３５０ｃｍ−１付近に見られるラマンシフトはアモルファスカーボンやグラファイトの欠陥に由来のＤバンドと呼ばれる。このＧ／Ｄ比が高いほどグラファイト化度が高く、高品質なカーボンナノチューブを意味する。 In addition, the double-walled carbon nanotube-containing composition can be evaluated by Raman spectroscopy. The Raman shift observed in the vicinity of 1590 cm −1 in the Raman spectrum is called a graphite-derived G band, and the Raman shift observed in the vicinity of 1350 cm −1 is called a D band derived from defects in amorphous carbon or graphite. The higher the G / D ratio, the higher the degree of graphitization, which means a higher quality carbon nanotube.
また本発明では、カーボンナノチューブの長さや直径、末端が閉じているか開いているかなどについては特に制限はなく、いかなる状態のものであっても使用可能である。 In the present invention, the length and diameter of the carbon nanotube and whether the end is closed or open are not particularly limited and can be used in any state.
カーボンナノチューブを懸濁する方法としては、さまざまな方法が考えられるが、再現性のよいバイオセンサを作製するには分散性がよいことが望ましい。好適には、超音波処理を行うことが望ましく、その強度や時間については、適宜検討により決定することができる。 Various methods can be considered as a method for suspending the carbon nanotubes, but in order to produce a biosensor with good reproducibility, good dispersibility is desirable. Preferably, it is desirable to perform ultrasonic treatment, and the intensity and time can be determined by appropriate examination.
また、本発明のカーボンナノチューブ組成物は、水溶液中で超音波処理により分散し、１時間静置したとき、分散状態が保持されているものが好ましい。分散状態の保持は目視で行い、均一に分散していれば、分散状態が保持されているものとする。 In addition, the carbon nanotube composition of the present invention is preferably one that is dispersed in an aqueous solution by ultrasonic treatment and kept in a dispersed state when left standing for 1 hour. The dispersion state is maintained visually, and the dispersion state is maintained if the dispersion state is uniformly dispersed.
本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板、基板状に形成された少なくとも作用極と対極を有する電極系、電極系上またはその近傍に形成された反応層またはその近傍に、親水性ポリマーとカーボンナノチューブを含有する組成物を含むことを特徴とする。 The biosensor of the present invention includes an insulating substrate, an electrode system having at least a working electrode and a counter electrode formed in a substrate shape, a reaction layer formed on or in the vicinity of the electrode system, or a hydrophilic polymer and carbon. It contains the composition containing a nanotube, It is characterized by the above-mentioned.
また、本発明に係るバイオセンサはカーボンナノチューブ組成物以外に、電極上に、酵素、さらには必要に応じて電子伝達体などの試薬層を具備し、測定試料中の特定成分を基質として酵素反応を行い、その結果生じた酸化還元電位を電極上で電流として感知するセンサであれば、どのようなセンサでもよい。例をあげるならば、電気絶縁性の基板、その基板上に形成された作用極と対極を有する電極系、およびその電極系を含む試料液供給空間を具備し、さらにその試薬供給空間内に形成された酵素などを含む反応層を具備したバイオセンサが好適に用いられる。 In addition to the carbon nanotube composition, the biosensor according to the present invention includes a reagent layer such as an enzyme on an electrode and, if necessary, an electron carrier, and an enzyme reaction using a specific component in a measurement sample as a substrate. Any sensor may be used as long as the sensor detects the resulting redox potential as a current on the electrode. For example, an electrically insulating substrate, an electrode system having a working electrode and a counter electrode formed on the substrate, and a sample liquid supply space including the electrode system are further formed in the reagent supply space. A biosensor having a reaction layer containing the prepared enzyme or the like is preferably used.
電気絶縁性の基板としては、いかなる材質のものでもよいが、ガラスやポリエチレンテレフタレートなどが好適に用いられる。 As the electrically insulating substrate, any material may be used, but glass, polyethylene terephthalate, or the like is preferably used.
バイオセンサでは、カーボンナノチューブ組成物は反応層またはその近傍に含有されることが好ましい。近傍とは混合されてはいないが、接触することが可能な状態を言い、特に測定物由来の水分などにより溶解したときには、容易に混合されるか、混合されなくとも物質の移動が起こりうる位置関係を言う。 In the biosensor, the carbon nanotube composition is preferably contained in the reaction layer or in the vicinity thereof. Although it is not mixed, it means a state where it can be contacted, especially when it is dissolved by moisture from the measurement object, etc. Say relationship.
カーボンナノチューブ組成物の塗布方法としては、カーボンナノチューブの分散性を保った塗布方法であればいかなる塗布方法でもよく、単独で電極に塗布してもよいし、酵素やメディエーターと混合したものを塗布してもよい。塗布後は適宜乾燥工程を加えることができる。 As a coating method of the carbon nanotube composition, any coating method may be used as long as the carbon nanotubes are dispersible. The carbon nanotube composition may be applied to the electrode alone, or a mixture of an enzyme and a mediator may be applied. May be. After the application, a drying step can be appropriately added.
本発明で用いられる酵素は、血液、尿、唾液、汗、涙などの生体試料、食品原料や製品、環中に由来する基質（特定成分）に対し特異的に作用し、それらを酸化もしくは還元し、その反応によって電子の授受が引き起こされるものであればいかなる酵素でもよい。好ましくはグルコースオキシダ−ゼ、ウリカーゼ、ザルコシンオキシダ−ゼ、乳酸オキシダ−ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダ−ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダ−ゼ、コレステロールデヒドロゲナ−ゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ジアホラーゼ、ウレアーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アスコルビン酸デヒドロゲナーゼを用いることができる。 The enzyme used in the present invention specifically acts on biological samples such as blood, urine, saliva, sweat, and tears, food materials and products, and substrates (specific components) derived from the ring, and oxidizes or reduces them. Any enzyme may be used as long as the reaction causes the transfer of electrons. Preferably glucose oxidase, uricase, sarcosine oxidase, lactate oxidase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, NADH oxidase, diaphorase, Urease, fructose oxidase, fructose dehydrogenase, ascorbate dehydrogenase can be used.
本発明では、グルコースオキシダーゼを使用したグルコース濃度の測定、ウリカーゼを使用した尿酸濃度の測定、およびコレステロールオキシダーゼを使用したコレステロール濃度の測定を例に説明しているが、本発明の効果はこれらの物質濃度の測定に限られるものではなく、使用する上述の酵素から適当に選択することによって種々の物質の濃度を測定することができる。 In the present invention, the measurement of glucose concentration using glucose oxidase, the measurement of uric acid concentration using uricase, and the measurement of cholesterol concentration using cholesterol oxidase are described as examples, but the effects of the present invention are those substances. The concentration of various substances can be measured by selecting appropriately from the above-mentioned enzymes to be used.
例えば、酵素として乳酸オキシダーゼを使用することにより乳酸の濃度を測定することができ、フルクトースデヒドロゲナーゼを使用すればフルクトースの濃度を、アルコールデヒドロゲナーゼとジアホラーゼを併用すればアルコールの濃度を測定することができる。 For example, the concentration of lactic acid can be measured by using lactate oxidase as an enzyme, the concentration of fructose can be measured by using fructose dehydrogenase, and the concentration of alcohol can be measured by using alcohol dehydrogenase and diaphorase in combination.
電極上に塗布する試薬層には電子メディエーターを含ませてもよい。電子メディエーターとしてはフェリシアン化物塩、フェロセンおよびその誘導体、メチレンブルー、ベンゾキノンおよびその誘導体、ナフトキノン、フェナジンメトサルフェート、チオニンなどをあげることができる。特に好ましくは、フェリシアン化カリウムが採用できる。 An electron mediator may be included in the reagent layer applied on the electrode. Examples of electron mediators include ferricyanide salts, ferrocene and derivatives thereof, methylene blue, benzoquinone and derivatives thereof, naphthoquinone, phenazine methosulfate, and thionine. Particularly preferably, potassium ferricyanide can be employed.
カーボンナノチューブを懸濁させる親水性ポリマーの水溶液を作製する際の溶媒は、水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、塩化ナトリウム水溶液などいかなる水溶液を用いてもよい。また親水性ポリマーの溶解が可能であれば、メタノール、エタノール、トルエン、アセトンなどの有機溶媒を水溶液に混合することもできる。 As the solvent for preparing the aqueous solution of the hydrophilic polymer in which the carbon nanotubes are suspended, any aqueous solution such as water, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, acetate buffer, and sodium chloride aqueous solution may be used. Also it is possible dissolution of the hydrophilic polymer, methanol, ethanol, toluene, also the organic solvent such as acetone mixed in water solution.
本発明で用いられる電極の材料としては、一般的に電極として使用されうる導電材料であればいかなるものでもよく、具体的には、炭素、金属、合金、金属および合金の種々の化合物（例えば酸化物、水酸化物、ハロゲン化物、硫化物、窒化物、炭化物）などをあげることができる。好適には白金、パラジウム、金、銀、アルミニウムなどが用いられる。また炭素材料としては、グラファイト、熱分解炭素、グラッシーカーボン、アセチレンブラック、カーボンブラックなどがあげられる。 The material of the electrode used in the present invention may be any conductive material that can be generally used as an electrode. Specifically, carbon, metal, alloy, various compounds of metals and alloys (for example, oxidation) Products, hydroxides, halides, sulfides, nitrides, carbides) and the like. Preferably, platinum, palladium, gold, silver, aluminum or the like is used. Examples of the carbon material include graphite, pyrolytic carbon, glassy carbon, acetylene black, and carbon black.
酸化電流の測定方法としては、作用極と対極のみの２電極方式と、参照電極を加えた３電極方式がある。どちらの方式を用いても本発明における酵素電極を用いた測定は可能である。 As a method for measuring the oxidation current, there are a two-electrode method using only a working electrode and a counter electrode, and a three-electrode method including a reference electrode. Whichever method is used, measurement using the enzyme electrode in the present invention is possible.
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（参考例）
２層カーボンナノチューブの合成は、特願２００４−２９７３１０号実施例３に記載の方法で行った。
(Reference example)
The double-walled carbon nanotubes were synthesized by the method described in Example 3 of Japanese Patent Application No. 2004-297310.
硝酸鉄・９水和物（関東化学社製）０．０３ｇと硝酸コバルト・６水和物（関東化学社製）０．１７ｇとをエタノール（関東化学社製）１５ｍｌに溶解した。この溶液に、ボロシリケート（エヌイーケムキャット製）を１．４ｇ加え、超音波洗浄機で３０分間処理し、６０℃及び１２０℃の恒温下でエタノールを除去して乾燥した。その後空気中、４００℃で１時間加熱し、ボロシリケートに金属塩が担持された固体触媒を得た。 0.03 g of iron nitrate nonahydrate (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) and 0.17 g of cobalt nitrate hexahydrate (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) were dissolved in 15 ml of ethanol (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.). To this solution, 1.4 g of borosilicate (manufactured by NE Chemcat) was added, treated with an ultrasonic cleaner for 30 minutes, ethanol was removed at a constant temperature of 60 ° C. and 120 ° C. and dried. Thereafter, the mixture was heated in air at 400 ° C. for 1 hour to obtain a solid catalyst in which a metal salt was supported on borosilicate.
内径３２ｍｍの石英管の中央部の石英ウール上に、上記で調製した固体触媒１．０ｇをとり、アルゴンガスを６００ｃｃ／分で供給した。石英管を電気炉中に設置して、中心温度を８００℃に加熱した（昇温時間６０分）。８００℃に到達した後、反応管内を真空引きし、１０Ｐａ以下になったことを確認後に、エタノール蒸気を１００Ｐａの圧力になるように２０分間導入した。エタノール蒸気の導入を止めた後に、高純度アセチレンガス（高圧ガス工業製）を５ｃｃ／分で３０分供給し、温度を室温まで冷却し、２層カーボンナノチューブを含有する組成物を取り出した。なお、担体のＸ線回折の結果、ピーク強度の変化率は５％未満であった。 On the quartz wool at the center of a quartz tube having an inner diameter of 32 mm, 1.0 g of the solid catalyst prepared above was taken, and argon gas was supplied at 600 cc / min. The quartz tube was placed in an electric furnace, and the center temperature was heated to 800 ° C. (temperature rising time 60 minutes). After reaching 800 ° C., the inside of the reaction tube was evacuated, and after confirming that the pressure became 10 Pa or less, ethanol vapor was introduced for 20 minutes so that the pressure became 100 Pa. After the introduction of ethanol vapor was stopped, high-purity acetylene gas (manufactured by High Pressure Gas Industry) was supplied at 5 cc / min for 30 minutes, the temperature was cooled to room temperature, and a composition containing double-walled carbon nanotubes was taken out. As a result of X-ray diffraction of the carrier, the rate of change in peak intensity was less than 5%.
このようにして得たカーボンナノチューブを含有する組成物を高分解能透過型電子顕微鏡で観察したところ、カーボンナノチューブはきれいなグラファイト層で構成されており、層数が２層のカーボンナノチューブが８０％以上であった。カーボンナノチューブ以外の炭素不純物（フラーレン、ナノパーティクル、アモルファスカーボン等）はほとんど観察されなかった。またスケールをもとに、その外径を測定したところ、平均２．５ｎｍであり、すべてが１．５から４．０ｎｍの範囲にあった。また、カーボンンナノチューブ中の屈曲部間の距離を測定したところ、ほとんどが５００ｎｍ以上であった。 When the composition containing carbon nanotubes thus obtained was observed with a high-resolution transmission electron microscope, the carbon nanotubes were composed of a clean graphite layer, and the number of carbon nanotubes with two layers was 80% or more. there were. Carbon impurities other than carbon nanotubes (fullerene, nanoparticles, amorphous carbon, etc.) were hardly observed. Moreover, when the outer diameter was measured based on the scale, the average was 2.5 nm, and all were in the range of 1.5 to 4.0 nm. Moreover, when the distance between the bending parts in a carbon nanotube was measured, most were 500 nm or more.
このカーボンナノチューブを含有する組成物を共鳴ラマン分光計（ホリバ ジョバンイボン製 ＩＮＦ−３００）で測定し、１５６０〜１６００ｃｍ−１の範囲内で最大のピーク強度をＧ、１３１０〜１３５０ｃｍ−１の範囲内で最大のピーク強度をＤとしてＧ／Ｄ比を求めた結果、１４と高品質２層カーボンナノチューブであることがわかった。 The compositions containing the carbon nanotube measured by a resonant Raman spectrometer (Horiba Jobin Yvon Ltd. INF-300), a maximum peak intensity in the range of 1560~1600cm -1 G, in the range of 1310～1350Cm -1 As a result of obtaining the G / D ratio with the maximum peak intensity as D, it was found to be 14 and a high-quality double-walled carbon nanotube.
また蛍光Ｘ線を用いた元素分析の結果、金属含有率は鉄が０．１％、コバルトが０．３％であった。 As a result of elemental analysis using fluorescent X-rays, the metal content was 0.1% for iron and 0.3% for cobalt.
（実施例１）
蒸留水または０．２５ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成、Ｃ００４５）、カラギーナン（シグマ、Ｃ１０１３）、ポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社、２４３０５１−５Ｇ）、コンドロイチン硫酸（カルビオケム社、２３０６８７）、ヒアルロン酸（シグマ、５３７４７）、アラビアゴム（三栄薬品貿易、食添用）水溶液中に、０．２ｗ／ｗ％の含有量で懸濁した２層カーボンナノチューブまたは多層カーボンナノチューブ（アルドリッチ社）を加え、３０分間超音波処理することにより、カーボンナノチューブを分散させた。分散溶液を１時間放置した後、観察したところ、ＣＭＣ、カラギーナン、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アラビアゴムの親水性ポリマー水溶液中に分散させたカーボンナノチューブ溶液は目視で均一に分散していたが、蒸留水中で分散させたカーボンナノチューブ溶液では、カーボンナノチューブが沈降していた。この結果から、親水性ポリマーとカーボンナノチューブからなる組成物は水溶液中で分散性が高いことが明らかとなった。
Example 1
Distilled water or 0.25 w / w% carboxymethylcellulose (CMC, Tokyo Kasei, C0045), carrageenan (Sigma, C1013), polystyrene sulfonic acid (Aldrich, 243051-5G), chondroitin sulfate (Calbiochem, 230687), hyaluron A double-walled carbon nanotube or a multi-walled carbon nanotube (Aldrich) suspended in a content of 0.2 w / w% in an aqueous solution of acid (Sigma, 53747), gum arabic (Sanei Pharmaceutical Trade, Inc.), The carbon nanotubes were dispersed by ultrasonic treatment for 30 minutes. When the dispersion solution was allowed to stand for 1 hour and observed, the carbon nanotube solution dispersed in the hydrophilic polymer aqueous solution of CMC, carrageenan, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, and gum arabic was visually dispersed uniformly. However, the carbon nanotubes were precipitated in the carbon nanotube solution dispersed in distilled water. From this result, it became clear that the composition comprising the hydrophilic polymer and the carbon nanotube has high dispersibility in the aqueous solution.
（比較例１）
ガラス上に白金の作用電極およびその周囲に白金の対極が形成されている市販の白金ディスク電極（ＢＡＳ社）に、以下のように酵素層を塗布することによりグルコース測定用のバイオセンサを構築した。すなわち、電極上に０．２５ｗ／ｗ％のＣＭＣ水溶液を８μＬ塗布し３７％、１時間乾燥した後、０．５ｗ／ｗ％ＣＭＣ、０．５ｗ／ｗ％グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、３ｗ／ｗ％フェリシアン化カリウムを含む水溶液を８μＬ塗布しさらに３７％、１時間乾燥することによりグルコース測定用バイオセンサを作製することができる。
(Comparative Example 1)
A biosensor for measuring glucose was constructed by applying an enzyme layer as follows to a commercially available platinum disk electrode (BAS) having a platinum working electrode on the glass and a platinum counter electrode around it. . That is, 8 μL of 0.25 w / w% CMC aqueous solution was applied on the electrode, 37%, dried for 1 hour, 0.5 w / w% CMC, 0.5 w / w% glucose oxidase (GOD), 3 w / w A biosensor for measuring glucose can be produced by applying 8 μL of an aqueous solution containing% potassium ferricyanide and further drying for 37% for 1 hour.
こうして作製したバイオセンサに、試料液としてさまざまな濃度のグルコース水溶液５μＬを加え、３０秒反応させた後に対極を基準として作用極に０．６Ｖの電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。 To the biosensor thus prepared, 5 μL of glucose aqueous solution with various concentrations was added as a sample solution, reacted for 30 seconds, then applied a voltage of 0.6 V to the working electrode with reference to the counter electrode, and measured the current value after 5 seconds. did.
（実施例２）
市販の白金ディスク電極（ＢＡＳ社）の作用極およびその周囲の対極上に、０．２ｗ／ｗ％の含有量で懸濁した２層カーボンナノチューブまたは多層カーボンナノチューブ（アルドリッチ社）を含む０．２５ｗ／ｗ％のＣＭＣ水溶液を８μＬ塗布し３７％、１時間乾燥した後、比較例１と同様にグルコース測定用バイオセンサを構築した。このバイオセンサに種々の濃度のグルコース水溶液５μＬを滴下し、３０秒反応させた後に対極を基準として作用極０．６Ｖの電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。
(Example 2)
0.25 w containing double-walled carbon nanotubes or multi-walled carbon nanotubes (Aldrich) suspended at a content of 0.2 w / w% on the working electrode of a commercially available platinum disk electrode (BAS) and its surrounding counter electrode After applying 8 μL of / w% CMC aqueous solution and drying for 37% for 1 hour, a biosensor for glucose measurement was constructed in the same manner as in Comparative Example 1. To this biosensor, 5 μL of glucose aqueous solution having various concentrations was dropped and reacted for 30 seconds, and then a voltage of a working electrode of 0.6 V was applied with the counter electrode as a reference, and a current value after 5 seconds was measured.
比較例１および実施例２の結果を図１に示す。 The results of Comparative Example 1 and Example 2 are shown in FIG.
図１からわかるように比較例１では、１ｍＭから１０ｍＭのグルコース濃度において、良好な定量性を示したが、１ｍＭ以下のグルコース濃度を測定することは困難であった。一方実施例２では、０．１ｍＭのグルコースをも測定可能であった。 As can be seen from FIG. 1, Comparative Example 1 showed good quantification at a glucose concentration of 1 mM to 10 mM, but it was difficult to measure a glucose concentration of 1 mM or less. On the other hand, in Example 2, 0.1 mM glucose could also be measured.
（実施例３）
比較例１および実施例２で使用したＣＭＣにかえて、カラギーナン、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アラビアゴムをＣＭＣと同様の濃度で使用したバイオセンサを作製し、同様にグルコースを測定した。その結果、カラギーナン、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アラビアゴムのいずれを用いても比較例１同様にグルコース濃度の測定が可能であり、カーボンナノチューブを試薬層に含むことにより、グルコースを含まない試料との検出電流値の差が増大し、実施例２同様、より低濃度のグルコース濃度を測定することが可能であった。その結果を表１にまとめた。
(Example 3)
A biosensor using carrageenan, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, hyaluronic acid and gum arabic at the same concentration as CMC was prepared instead of CMC used in Comparative Example 1 and Example 2, and glucose was measured in the same manner. . As a result, glucose concentration can be measured as in Comparative Example 1 using any of carrageenan, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, and gum arabic, and glucose is contained by including carbon nanotubes in the reagent layer. The difference in the detected current value from the sample without the sample increased, and it was possible to measure a lower glucose concentration as in Example 2. The results are summarized in Table 1.
（比較例２）
市販の白金ディスク電極（ＢＡＳ社）の作用極およびその周囲の対極上に０．２５ｗ／ｗ％のＣＭＣ水溶液を８μＬ塗布し３７％、１時間乾燥した後、０．５ｗ／ｗ％ＣＭＣ、０．５ｗ／ｗ％ウリカーゼ、３ｗ／ｗ％フェリシアン化カリウムを含む水溶液を８μＬ塗布しさらに３７％、１時間乾燥することにより尿酸測定用バイオセンサを作製した。
(Comparative Example 2)
8 μL of a 0.25 w / w% CMC aqueous solution was applied to the working electrode of a commercially available platinum disk electrode (BAS) and the counter electrode around it, dried for 37% for 1 hour, 0.5 w / w% CMC, 0 A biosensor for measuring uric acid was prepared by applying 8 μL of an aqueous solution containing 5 w / w% uricase and 3 w / w% potassium ferricyanide and further drying for 37% for 1 hour.
こうして作製したバイオセンサに、試料液としてさまざまな濃度の尿酸水溶液５μＬを加え、３０秒反応させた後に対極を基準として作用極０．６Ｖの電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。 The biosensor thus prepared was added with 5 μL of a uric acid aqueous solution having various concentrations as a sample solution, reacted for 30 seconds, applied with a voltage of a working electrode of 0.6 V with respect to the counter electrode, and measured a current value after 5 seconds. .
（実施例４）
市販の白金ディスク電極（ＢＡＳ社）の作用極およびその周囲の対極上に、０．２ｗ／ｗ％の含有量で懸濁した２層カーボンナノチューブを含む０．２５ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を８μＬ塗布し３７％、１時間乾燥した後、比較例２と同様に尿酸測定用バイオセンサを構築した。このバイオセンサに種々の濃度の尿酸水溶液５μＬを加え、３０秒反応させた後に対極を基準として作用極０．６Ｖの電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。
Example 4
0.25 w / w% carboxymethylcellulose (CMC) containing double-walled carbon nanotubes suspended at a content of 0.2 w / w% on the working electrode of a commercially available platinum disk electrode (BAS) and the counter electrode around it. ) After applying 8 μL of an aqueous solution and 37% drying for 1 hour, a biosensor for measuring uric acid was constructed in the same manner as in Comparative Example 2. To this biosensor, 5 μL of a uric acid aqueous solution having various concentrations was added and reacted for 30 seconds, and then a voltage of a working electrode of 0.6 V was applied with the counter electrode as a reference, and the current value after 5 seconds was measured.
比較例２および実施例４の結果を図２に示す。 The results of Comparative Example 2 and Example 4 are shown in FIG.
図２から判るように比較例２では、１ｍＭから１０ｍＭの尿酸濃度において、良好な定量性を示したが、１ｍＭ以下の尿酸濃度を測定することは困難であった。一方実施例４では、０．２ｍＭの尿酸をも測定可能であった。 As can be seen from FIG. 2, Comparative Example 2 showed good quantification at a uric acid concentration of 1 mM to 10 mM, but it was difficult to measure a uric acid concentration of 1 mM or less. On the other hand, in Example 4, 0.2 mM uric acid could also be measured.
（比較例３）
ポリエチレンテレフタレート板上にパラジウムを薄膜状に被覆した基板にレーザートリミングで作用極および対極を形成した。その作用極およびその周囲の対極上に作用極を中心として０．２５ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を１．５μＬ塗布し３７％、１時間乾燥した後、０．５ｗ／ｗ％ＣＭＣ、０．５ｗ／ｗ％グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、３ｗ／ｗ％フェリシアン化カリウムを含む水溶液を１．５μＬ塗布しさらに３７％、１時間乾燥することによりグルコース測定用バイオセンサを作製する。
(Comparative Example 3)
A working electrode and a counter electrode were formed by laser trimming on a substrate coated with a thin film of palladium on a polyethylene terephthalate plate. After applying 1.5 μL of 0.25 w / w% carboxymethylcellulose (CMC) aqueous solution on the working electrode and the surrounding counter electrode, centering on the working electrode and drying for 37% for 1 hour, 0.5 w / w% CMC Then, 1.5 μL of an aqueous solution containing 0.5 w / w% glucose oxidase (GOD) and 3 w / w% potassium ferricyanide is applied and further dried for 37% for 1 hour to produce a biosensor for glucose measurement.
（実施例５）
比較例３と同様のパラジウム薄膜で形成した電極上に０．２ｗ／ｗ％の含有量で懸濁した２層カーボンナノチューブを含む０．２５ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を１．５μＬ塗布し３７％、１時間乾燥した後、比較例３と同様にグルコース測定用バイオセンサを構築した。
(Example 5)
1.5 μL of a 0.25 w / w% carboxymethylcellulose (CMC) aqueous solution containing double-walled carbon nanotubes suspended at a content of 0.2 w / w% on an electrode formed of the same palladium thin film as in Comparative Example 3 After coating and drying for 37% for 1 hour, a glucose measuring biosensor was constructed in the same manner as in Comparative Example 3.
比較例３および実施例４で作製したバイオセンサに１ｍＭの濃度のグルコース水溶液を滴下し、３０秒間反応させた後、対極を基準として作用極０．６Ｖの電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。 A 1 mM aqueous glucose solution was dropped onto the biosensors produced in Comparative Example 3 and Example 4, and reacted for 30 seconds. Then, a voltage of a working electrode of 0.6 V was applied with the counter electrode as a reference, and the current after 5 seconds. The value was measured.
その結果、比較例３ではグルコースが含まれない試料との電流値の差が０．２９μＡであったのに対して、実施例５では０．８９μＡの差が得られた。 As a result, in Comparative Example 3, the difference in current value from the sample not containing glucose was 0.29 μA, whereas in Example 5, a difference of 0.89 μA was obtained.
このことから、実施例５で作製したバイオセンサを用いることにより、より低濃度のグルコースを測定することが可能になる。 From this, it is possible to measure glucose at a lower concentration by using the biosensor produced in Example 5.
（比較例４）
特許第２６６９４９７号公報に従って、直径３ｍｍのグラッシーカーボン電極（ＢＡＳ社）の端面を基板電極として、この電極上に平均分子量７０，０００のポリスチレンスルホン酸ナトリウム０．６ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７）１０μＬを滴下し、次いでＧＯＤ０．５ｗ／ｖ％水溶液５μＬを滴下し、最後に平均分子量１００，０００のポリリジン０．６ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７）５μＬを滴下して、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより、グルコース測定用の酵素電極を得た。
(Comparative Example 4)
According to Japanese Patent No. 2669497, a glassy carbon electrode having a diameter of 3 mm (BAS) was used as a substrate electrode, and 10 μL of a 0.6 w / v% sodium polystyrenesulfonate aqueous solution (pH 7) having an average molecular weight of 70,000 was formed on this electrode. Then, 5 μL of GOD 0.5 w / v% aqueous solution is dropped, and finally 5 μL of polylysine 0.6 w / v% aqueous solution (pH 7) having an average molecular weight of 100,000 is dropped, and left at room temperature for 2 hours or more and dried. Thus, an enzyme electrode for measuring glucose was obtained.
（実施例６）
比較例４と同様のグラッシーカーボンの基板電極上に、２層カーボンナノチューブ０．２ｗ／ｖ％を分散させた平均分子量７０，０００のポリスチレンスルホン酸ナトリウム０．６ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７）１０μＬを滴下し、次いで比較例４と同様にＧＯＤ０．５ｗ／ｖ％水溶液５μＬを滴下し、最後に平均分子量１００，０００のポリリジン０．６ｗ／ｖ％水溶液（ｐＨ７）５μＬを滴下して、室温で２時間以上放置、乾燥させることにより、グルコース測定用のカーボンナノチューブを含む酵素電極を得た。
(Example 6)
On the same glassy carbon substrate electrode as in Comparative Example 4, 10 μL of a 0.6 w / v% sodium polystyrenesulfonate aqueous solution (pH 7) having an average molecular weight of 70,000 dispersed with 0.2 w / v% of double-walled carbon nanotubes. In the same manner as in Comparative Example 4, 5 μL of GOD 0.5 w / v% aqueous solution was added dropwise. Finally, 5 μL of polylysine 0.6 w / v% aqueous solution (pH 7) having an average molecular weight of 100,000 was added dropwise at room temperature. The enzyme electrode containing the carbon nanotube for glucose measurement was obtained by allowing it to stand for more than an hour and drying.
比較例４、実施例６で作製した電極を作用極、銀−塩化銀電極を参照極、白金ワイヤを対極とする３電極系を構成し、容積２０ｍＬの試験液（リン酸緩衝液、ｐＨ７）中に挿入した。試験液は空気飽和の状態に保ち、磁気攪拌子で攪拌し、上記定電位電源により、作用極に１ボルト（対銀−塩化銀電極）を印加し、電流を測定した。一定時間ごとに、グルコース０．５ｍＭを加え、そのときの作用極電極の電流値を測定した。試験液中のグルコース濃度と電流値の関係を図３に示す。 A three-electrode system comprising the electrode prepared in Comparative Example 4 and Example 6 as a working electrode, a silver-silver chloride electrode as a reference electrode, and a platinum wire as a counter electrode, and a 20 mL test solution (phosphate buffer, pH 7) Inserted inside. The test solution was kept in an air-saturated state, stirred with a magnetic stirrer, 1 volt (to silver-silver chloride electrode) was applied to the working electrode with the above-mentioned constant potential power source, and the current was measured. At regular intervals, 0.5 mM glucose was added, and the current value of the working electrode at that time was measured. The relationship between the glucose concentration in the test solution and the current value is shown in FIG.
その結果、カーボンナノチューブ修飾のない酵素電極に比べて、カーボンナノチューブ修飾酵素電極では、電流値が５０倍に増加しており、従来技術による酵素電極に比べ著しく感度を向上させることが可能となった。 As a result, the current value of the carbon nanotube-modified enzyme electrode increased by 50 times compared to the enzyme electrode without carbon nanotube modification, and it was possible to significantly improve the sensitivity compared to the enzyme electrode according to the prior art. .
（比較例５）
ポリエチレンテレフタレート板上にパラジウムを薄膜状に被覆した基板にレーザートリミングで作用極および対極を形成した。その作用極およびその周囲の対極上に作用極を中心として０．５ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を１．５μＬ塗布し３７℃、１時間乾燥した後、０．１ｗ／ｗ％ＣＭＣ、２０ｍＭコハク酸、７０ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液１．５μＬを塗布し３７℃、１時間乾燥した後、７ｕｎｉｔｓ／ｍＬコレステロールオキシダーゼを含む水溶液を０．４μＬ塗布し室温乾燥することによりコレステロール測定用バイオセンサを作製する。
(Comparative Example 5)
A working electrode and a counter electrode were formed by laser trimming on a substrate coated with a thin film of palladium on a polyethylene terephthalate plate. After applying 1.5 μL of 0.5 w / w% carboxymethylcellulose (CMC) aqueous solution centering on the working electrode on the working electrode and the surrounding counter electrode and drying at 37 ° C. for 1 hour, 0.1 w / w% CMC Applying 1.5 μL of 20 mM succinic acid and 70 mM potassium ferricyanide aqueous solution, drying at 37 ° C. for 1 hour, applying 0.4 μL of an aqueous solution containing 7 units / mL cholesterol oxidase and drying at room temperature to produce a biosensor for measuring cholesterol To do.
（実施例７）
比較例５と同様のパラジウム薄膜で形成した電極上に０．２ｗ／ｗ％の含有量で懸濁した２層カーボンナノチューブを含む０．２５ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を１．５μＬ塗布し３７％、１時間乾燥した後、比較例５と同様にコレステロール測定用バイオセンサを構築した。
(Example 7)
1.5 μL of 0.25 w / w% carboxymethylcellulose (CMC) aqueous solution containing double-walled carbon nanotubes suspended at a content of 0.2 w / w% on the electrode formed of the same palladium thin film as in Comparative Example 5 After coating and drying for 37% for 1 hour, a biosensor for measuring cholesterol was constructed in the same manner as in Comparative Example 5.
比較例５および実施例７で作製したバイオセンサに２５ｍｇ／ｄＬの濃度のコレステロール水溶液（５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む）を滴下し、３分間反応させた後、対極を基準として作用極０．６Ｖの電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。 A cholesterol aqueous solution (containing 5% Triton-X) having a concentration of 25 mg / dL was dropped onto the biosensors produced in Comparative Example 5 and Example 7, and reacted for 3 minutes. Then, the working electrode was 0.6 V based on the counter electrode. Then, the current value after 5 seconds was measured.
その結果、比較例５ではコレステロールが含まれない試料との電流値の差が０．９μＡであったのに対して、実施例７では３．４μＡの差が得られた。 As a result, in Comparative Example 5, the difference in current value from the sample not containing cholesterol was 0.9 μA, whereas in Example 7, a difference of 3.4 μA was obtained.
このことから、実施例７で作製したバイオセンサを用いることにより、より低濃度のコレステロールを測定することが可能になる。 From this, it becomes possible to measure a lower concentration of cholesterol by using the biosensor produced in Example 7.
本発明によれば、分散性の高いカーボンナノチューブ組成物を得ることができる。本組成物は水溶液中でも分散性に優れるため、バイオセンサを初めとして、電子情報用途などの産業用途に広く応用が可能である。また、該組成物を具備したバイオセンサにより高感度に試料中の物質濃度を測定することが可能となり、もってこれまで測定が不可能であった生体中成分や環境中成分の測定が可能となり、医療、環境、アメニティー用途での実用化が期待される。ただし、応用範囲はこれらに限られるものではない。 According to the present invention, a highly dispersible carbon nanotube composition can be obtained. Since this composition is excellent in dispersibility even in an aqueous solution, it can be widely applied to industrial uses such as biosensors and electronic information. In addition, it is possible to measure the substance concentration in the sample with high sensitivity by the biosensor equipped with the composition, and thus it is possible to measure the components in the living body and the environment that could not be measured so far. Expected to be put to practical use in medical, environmental and amenity applications. However, the application range is not limited to these.
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