JP4726548B2

JP4726548B2 - Yeast and mold detection primer, yeast and mold detection method, and yeast and mold detection kit

Info

Publication number: JP4726548B2
Application number: JP2005168055A
Authority: JP
Inventors: 秀樹前島; 茂仲野; 敏広山田
Original assignee: Nissin Foods Holdings Co Ltd
Current assignee: Nissin Foods Holdings Co Ltd
Priority date: 2004-07-29
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2025-06-08
Also published as: JP2006061152A

Description

本発明は、酵母及びカビ検出用のプライマーに関する。より詳細には、カビ及び酵母を幅広く検出できるように設計されているプライマーに関する。更に、本発明は、該プライマーを利用した酵母及びカビの検出方法及び酵母及びカビ検出用キットに関する。 The present invention relates to a primer for detecting yeast and mold. More particularly, the present invention relates to a primer designed to detect a wide range of mold and yeast. Furthermore, the present invention relates to a yeast and mold detection method and a yeast and mold detection kit using the primer.

酵母やカビは、自然界に広く分布しており、食品等の原材料や生活環境中に存在している。この酵母及びカビが、食品、医薬品、香粧品等の製品に混入すると、これらの製品の劣化や腐敗を引き起こすことがある。特に近年、食品分野では、低糖化、天然添加物使用、無殺菌又は低温殺菌等を謳った製品が脚光を浴びており、これに伴って酵母及びカビによる変敗が引き起こされる割合が増大してきている（非特許文献１参照）。 Yeast and mold are widely distributed in nature, and are present in raw materials such as food and living environment. When this yeast and mold are mixed in products such as foods, pharmaceuticals, and cosmetics, these products may be deteriorated or spoiled. In recent years, in particular, in the food field, products with low saccharification, use of natural additives, no sterilization, or pasteurization have attracted attention, and this has led to an increase in the rate of deterioration due to yeast and mold. (See Non-Patent Document 1).

そのため、食品、医薬品、香粧品等の製品を生産・管理する上で、酵母やカビの混入の有無を判定することが不可欠となっている。特に、食品の分野では、製造から出荷までの時間の短縮が求められており、迅速にカビや酵母の汚染の検査を実施することが必要とされている。 Therefore, it is indispensable to determine the presence or absence of yeast and mold contamination in the production and management of products such as foods, pharmaceuticals, and cosmetics. In particular, in the field of food, there is a demand for shortening the time from production to shipment, and it is necessary to quickly inspect for mold and yeast contamination.

現在、製品への酵母やカビの混入の有無を検査する方法としては、一般的にプレートを用いた培養法が用いられている。しかしながら、この培養法では、検査に４８時間以上もの時間を要するため、迅速な判定ができないという問題点がある。 Currently, a culture method using a plate is generally used as a method for examining the presence or absence of yeast or mold in a product. However, this culturing method has a problem in that a rapid determination cannot be made because it takes 48 hours or more for the examination.

一方、培養法に比べて迅速に真菌の混入を判定できる方法として、真菌由来ＤＮＡに特異的なＤＮＡ合成プライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅された真菌由来ＤＮＡ断片を検出する方法（以下、ＰＣＲ法と記す）が知られている（非特許文献２、特許文献１及び２）。しかしながら、非特許文献２のＰＣＲ法では、真菌の内、酵母を検出できるが、カビを検出することができないという欠点がある。また、特許文献１や２のＰＣＲ法では、ＤＮＡ合成プライマーが食品成分（特に、大豆、ブドウ、キウイ等の植物成分）に由来するＤＮＡとハイブリダイズしてしまうため、食品成分を含有する製品に対する酵母やカビの混入の判定には適用できないという欠点がある。 On the other hand, as a method that can quickly determine fungal contamination as compared with the culture method, a method of performing PCR using a DNA synthesis primer specific for fungal DNA and detecting an amplified fungal DNA fragment (hereinafter, (Referred to as PCR method) (Non-patent Document 2, Patent Documents 1 and 2). However, the PCR method of Non-Patent Document 2 has a drawback that it can detect yeast among fungi but cannot detect mold. In addition, in the PCR methods of Patent Documents 1 and 2, DNA synthesis primers hybridize with DNA derived from food components (particularly plant components such as soybeans, grapes, kiwis, etc.). There is a drawback that it cannot be applied to the determination of contamination of yeast and mold.

このような従来技術を背景として、迅速且つ精度の高い方法で、酵母やカビを幅広く検出する技術の開発が切望されている。
J. Antibact. Antifung. Agents Vol.27, No. 12, 1999, p.803〜809 Journal of Food Protection, Vol. 67, No. 2, 2004, p.357-364 特開平６−３３９３９９号公報特開平６−３３９４００号公報 Against the background of such conventional technology, development of a technique for widely detecting yeasts and molds by a rapid and highly accurate method is eagerly desired.
J. Antibact. Antifung. Agents Vol.27, No. 12, 1999, p.803-809 Journal of Food Protection, Vol. 67, No. 2, 2004, p.357-364 JP-A-6-339399 JP-A-6-339400

本発明は、迅速且つ精度の高い方法で、食品、医薬品、香粧品等の製品中に存在する酵母やカビを幅広く検出する技術を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique for widely detecting yeasts and molds present in products such as foods, pharmaceuticals and cosmetics by a rapid and highly accurate method.

本発明者等は、上記課題を解決すべく日夜研究を重ねた結果、幅広い酵母やカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできるポリヌクレオチドの塩基配列として、(i)塩基配列（5'-GCCATGCGTGTCTAAGTATAAG-3'）（配列番号１）又はその特定の変異塩基配列、及び(ii)塩基配列(5'-TAGGGGAGAGATTTGAATGAAC-3')（配列番号２）又はその特定の変異塩基配列を見出した。更に、これらのポリヌクレオチドは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズしないこと、及びプライマーとしてＰＣＲに使用し得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。 As a result of repeated researches day and night to solve the above-mentioned problems, the present inventors have determined that (i) a nucleotide sequence (5 ′) as a nucleotide sequence of a polynucleotide that can specifically hybridize to a wide range of yeast and mold 18S rRNA genes. -GCCATGCGTGTCTAAGTATAAG-3 ') (SEQ ID NO: 1) or a specific mutant base sequence thereof, and (ii) a base sequence (5'-TAGGGGAGAGATTTGAATGAAC-3') (SEQ ID NO: 2) or a specific mutant base sequence thereof was found. Furthermore, it has been found that these polynucleotides do not hybridize with plant or animal 18S rRNA genes or bacterial 16S rRNA genes and can be used in PCR as primers. The present invention has been completed by making further improvements based on these findings.

即ち、本発明は、下記に掲げる酵母及びカビ検出用のプライマー、酵母及びカビ検出用のプライマー対、酵母及びカビの検出方法、及び酵母及びカビ検出用キットである：
項１．配列番号１で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第１〜１２位の塩基の３個以下が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなる、酵母及びカビ検出用プライマー。
項２．配列番号２で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第１〜１２位の塩基の３個以下が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなる、酵母及びカビ検出用プライマー。
項３．項１に記載のプライマー及び項２に記載のプライマーからなる、酵母及びカビ検出用のプライマー対。
項４．下記(i)及び(ii)のプライマーからなる項３に記載の酵母及びカビ検出用のプライマー対：
(i)配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー、及び
(ii)配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー。
項５．検出対象となる酵母及びカビが、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、カンディダ・ファマタ（Candida famata）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ジゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）、カンディダ・インターメディア（Candida intermedia）、クラビスポラ・ルジタニエ（Clavispora lusitaniae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・メンブラニファシエンス（Pichia membranifaciens）、ペニシリウム・オブラタム（Penicillium oblatum）、ペニシリウム・サブロサム（Penicillium sabulosum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、フサリウム・クルークウェレンス（Fusarium crookwellense）、ジェオトリカム・カンディダム（Geotrichum candidum）、アルターナリア・アルタネータ（Alternaria alternata）、アウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、クラドストリウム・クラドスポリオイドス（Cladosporium cladosporioides）、ユウロチウム・ハーバリオラム（Eurotium herbariorum）、及びタラロマイセス・バシリスポラス（Talaromyces bacillisporus）よりなる群から選択される少なくとも１種である、項３又は４に記載の酵母及びカビ検出用プライマー対。
項６．検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法であって、
(1)検査対象物に含まれるＤＮＡを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、請求項３乃至５のいずれかに記載のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう工程、及び
(3)増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程、を含有する検出方法。
項７．検査対象物が食品である、項６に記載の判定方法。
項８．項３乃至５のいずれかに記載のプライマー対を含有する、酵母及びカビ検出用キット。 That is, the present invention is the following yeast and mold detection primer, yeast and mold detection primer pair, yeast and mold detection method, and yeast and mold detection kit:
Item 1. From the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which 3 or less of the bases at positions 1 to 12 are substituted and / or 10 or less bases are added to the 5 ′ end side in the base sequence A primer for detecting yeast and mold.
Item 2. From the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a base sequence in which 3 or less of the first to 12th bases are substituted and / or 10 or less bases are added to the 5 ′ end side in the base sequence A primer for detecting yeast and mold.
Item 3. A primer pair for detecting yeast and mold, comprising the primer according to Item 1 and the primer according to Item 2.
Item 4. Item 4. The primer pair for detecting yeast and mold according to item 3, comprising the following primers (i) and (ii):
(i) a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and
(ii) A primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Item 5. Yeasts and molds to be detected is, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), Pichia anomala (Pichia anomala), Candida Famata (Candida famata), Debaryomyces Hansenii (Debaryomyces hansenii), Gigot Saccharomyces Seth Roukishi (Zygosaccharomyces rouxii), Candida intermedia (Candida intermedia), Kurabisupora-Rujitanie (Clavispora lusitaniae), Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces lactis), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), Pichia Men Braniff § tumefaciens (Pichia membranifaciens), Penicillium・ Oburatam (Penicillium oblatum) , Penicillium sabulosum , Aspergillus niger , Fusarium crookwellense ) , Geotrichum candidum , Alternaria alternata , Aureobasidium pullulans , Cladosporium cladosporioides , euro barium rum Item 5. The yeast and mold detection primer pair according to Item 3 or 4, which is at least one selected from the group consisting of Talaromyces bacillisporus .
Item 6. A method for detecting yeast and mold in a test object,
(1) a step of extracting DNA contained in the test object;
(2) the step (1) performing PCR using the extracted DNA as a template and the primer pair according to any one of claims 3 to 5, and
(3) A method for detecting the amplified DNA fragment.
Item 7. Item 7. The determination method according to Item 6, wherein the inspection object is food.
Item 8. Item 6. A kit for detecting yeast and mold, comprising the primer pair according to any one of Items 3 to 5.

本発明において、「酵母及びカビの検出」（「酵母及びカビ検出」や「酵母及びカビを検出」等の表記も同義）とは、酵母とカビが共存している場合であれば酵母とカビの双方を検出することを意味し、また、酵母及びカビの何れか一方が存在している場合には、酵母及びカビの何れか一方を検出することを意味する。 In the present invention, “detection of yeast and mold” (notations such as “detection of yeast and mold” and “detection of yeast and mold”) mean that yeast and mold coexist in the case where the yeast and mold coexist. It means that either one of yeast or mold is detected when either yeast or mold is present.

(I)酵母及びカビ検出用のプライマー及びプライマー対
本発明の酵母及びカビの検出用プライマーは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできるものである。このような特性により、本発明のプライマーは、通常のＰＣＲに供されることにより、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより植物及び動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーである。 (I) Yeast and mold detection primers and primers versus the yeast and mold detection primers of the present invention without hybridizing to plant or animal 18S rRNA genes or bacterial 16S rRNA genes, and yeast and mold 18S rRNA genes Which can specifically hybridize to. Due to such characteristics, the primer of the present invention can detectably amplify yeast and mold 18S rRNA genes when subjected to normal PCR. However, when subjected to PCR under the same conditions, the primer of the present invention can be used for plants and animals. A primer that does not detectably amplify the 18S rRNA gene.

本発明は、このような酵母及びカビ検出用のプライマーとして、以下の塩基配列からなるプライマー（以下、プライマー１と記す）を提供する：
(a)配列番号１で示される塩基配列、又は
(b)配列番号１で示される塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内３個以下の塩基が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列。 The present invention provides a primer comprising the following base sequence (hereinafter referred to as primer 1) as such a yeast and mold detection primer:
(a) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or
(b) In the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or less of the bases at positions 1 to 12 are substituted, and / or 10 or less bases are added to the 5 ′ end. An array.

また、本発明は、上記プライマー１の他に、酵母及びカビ検出用のプライマーとして、以下の塩基配列からなるプライマー（以下、プライマー２と記す）を提供する：
(c)配列番号２で示される塩基配列、又は
(d)配列番号２で示される塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内３個以下の塩基が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列。 In addition to the primer 1 described above, the present invention provides a primer having the following base sequence (hereinafter referred to as primer 2) as a primer for detecting yeast and mold:
(c) the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or
(d) In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 or less of the bases at positions 1 to 12 are substituted, and / or 10 or less bases are added to the 5 ′ end side An array.

当該プライマー１又は２は、それぞれ配列番号１又は２で示される各塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内、３個以下の塩基が置換されていてもよいが、このように塩基が置換される場合、置換される塩基の数は、好ましくは２個以下、更に好ましくは１個である。このような態様で塩基が置換されているものであれば、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズして、プライマーとしての作用を発揮できる。 The primer 1 or 2 may be substituted with 3 or less bases among the bases at positions 1 to 12 in each base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, respectively. When is substituted, the number of substituted bases is preferably 2 or less, more preferably 1. If the base is substituted in this manner, it specifically hybridizes to the 18S rRNA gene of yeast and mold without hybridizing to the 18S rRNA gene of plants or animals or the 16S rRNA gene of bacteria. And can exert an effect as a primer.

また、当該プライマー１又は２は、それぞれ配列番号１又は２で示される各塩基配列の５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよいが、このように塩基が付加される場合、５'末端側に付加される塩基の数は、好ましくは１〜５、更に好ましくは１である。このような態様で塩基が付加されたものであっても、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるプライマーと同様の作用を発揮することが可能である。 The primer 1 or 2 may be a polynucleotide having a base sequence in which 10 or less bases are added to the 5 ′ end of each base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, When bases are added in this way, the number of bases added to the 5 ′ end side is preferably 1 to 5, more preferably 1. Even if a base is added in such a manner, it is possible to exert the same action as the primer consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2.

なお、当該プライマー１又は２は、それぞれ配列番号１又は２で示される塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内、３個以下の塩基が置換されており、更に５’末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。 In addition, the primer 1 or 2 has 3 or less bases substituted among the bases at positions 1 to 12 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, respectively, and further on the 5 ′ end side. It may be a polynucleotide having a base sequence to which 10 or less bases are added.

当該プライマー１として、好ましくは(a)配列番号１で示される塩基配列からなるものである。また、当該プライマー２として、好ましくは(c)配列番号２で示される塩基配列からなるものである。 The primer 1 is preferably composed of (a) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The primer 2 is preferably composed of (c) a base sequence represented by SEQ ID NO: 2.

なお、当該プライマー１又は２には、上記する塩基配列に相補的な塩基配列からなるものも含まれる。 The primer 1 or 2 includes a primer having a base sequence complementary to the above base sequence.

本発明の酵母及びカビの検出用プライマーは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズでき、ＰＣＲに供されることにより酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出可能に増幅できる。 The yeast and mold detection primers of the present invention can specifically hybridize to the yeast and mold 18S rRNA genes without being hybridized with plant or animal 18S rRNA genes or bacterial 16S rRNA genes, and are used for PCR. As a result, yeast and mold 18S rRNA genes can be specifically and detectably amplified.

本発明の酵母及びカビの検出用プライマーは、幅広い酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対してハイブリダイズできるので、その検出対象となる菌については、酵母又はカビに分類されるものであれば特に制限されるものではない。好ましい検出対象の菌の一例として、食品、医薬品又は香粧品に混入して腐敗や劣化の原因となっている酵母やカビを挙げることができる。このような酵母及びカビとしては、好ましくは、子のう菌門（Ascomycota）に属する酵母及びカビが挙げられる。より具体的には、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、カンディダ属（Candida）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、ジゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、クラビスポラ属（Clavispora）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）等の酵母や、ペニシリウム属（Penicillium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、フサリウム属（Fusarium）、ジェオトリカム属（Geotrichum）、アルターナリア属（Alternaria）、アウレオバシディウム属（Aureobasidium）、クラドストリウム属（Cladosporium）、ユウロチウム属（Eurotium）、タラロマイセス属（Talaromyces）等のカビが例示される。 Since the yeast and mold detection primers of the present invention can hybridize to a wide range of yeast and mold 18S rRNA genes, the bacteria to be detected are particularly limited as long as they are classified as yeast or mold. It is not something. Examples of preferable bacteria to be detected include yeasts and molds that are mixed in foods, pharmaceuticals, and cosmetics and cause rot and deterioration. As such yeast and mold, yeast and mold belonging to Ascomycota are preferable. More specifically, the genus Saccharomyces (Saccharomyces), Pichia (Pichia), Candida spp (Candida), Debaryomyces genus (Debaryomyces), Gigot Saccharomyces genus (Zygosaccharomyces), Kurabisupora genus (Clavispora), Kluyveromyces (Kluyveromyces ), Yeast such as Schizosaccharomyces, Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Geotrichum, Alternaria, Aureobasidium Examples include molds such as (Aureobasidium), Cladosporium, Eurotium and Talaromyces.

特に、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーは、植物成分等の食品成分共存下でも、食品成分由来のＤＮＡにハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできる。このような本発明の格別の効果に鑑みれば、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーは、食品に混入して腐敗や劣化の原因となっている酵母及びカビ（以下、食品汚染菌ともいう）の検出に好適に使用できる。 In particular, the yeast and mold detection primer of the present invention specifically hybridizes to the 18S rRNA gene of yeast and mold without hybridizing to DNA derived from the food component even in the presence of food components such as plant components. it can. In view of such a special effect of the present invention, the yeast and mold detection primer of the present invention are mixed with food and cause spoilage and deterioration (hereinafter also referred to as food-contaminating bacteria). ).

本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーの検出対象となる食品汚染菌としては、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、カンディダ・ファマタ（Candida famata）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ジゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）、カンディダ・インターメディア（Candida intermedia）、クラビスポラ・ルジタニエ（Clavispora lusitaniae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・メンブラニファシエンス（Pichia membranifaciens）等の酵母；ペニシリウム・オブラタム（Penicillium oblatum）、ペニシリウム・サブロサム（Penicillium sabulosum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、フサリウム・クルークウェレンス（Fusarium crookwellense）、ジェオトリカム・カンディダム（Geotrichum candidum）、アルターナリア・アルタネータ（Alternaria alternata）、アウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、クラドストリウム・クラドスポリオイドス（Cladosporium cladosporioides）、ユウロチウム・ハーバリオラム（Eurotium herbariorum）、タラロマイセス・バシリスポラス（Talaromyces bacillisporus）等のカビが例示される。 As yeast and food contaminants to be detected in the primer for molds detection of the present invention, specifically, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), Pichia anomala (Pichia anomala), Candida Famata (Candida famata), Debaryomyces Hansenii (Debaryomyces hansenii), Gigot Saccharomyces Seth Roukishi (Zygosaccharomyces rouxii), Candida intermedia (Candida intermedia), Kurabisupora-Rujitanie (Clavispora lusitaniae), Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces lactis), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), yeasts such as Pichia membranifaciens; Penicillium oblatum, Penicillium sabulosum, Aspergillus niger (Aspergis) llus niger, Fusarium crookwellense, Geotrichum candidum, Alternaria alternata, Aureobasidium pullulans, Cladstrium cladosporioids Examples include molds such as (Cladosporium cladosporioides), Eurotium herbariorum, and Talaromyces bacillisporus.

本発明の酵母及びカビ検出用のプライマー（プライマー１及びプライマー２）は、その塩基配列に基づいて、公知の合成方法に従って調製することができる。 The primers for detecting yeast and mold of the present invention (primer 1 and primer 2) can be prepared according to a known synthesis method based on their base sequences.

本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーのプライマー１とプライマー２は、それぞれ別個に酵母及びカビの検出に使用してもよいが、好ましくはこれらを組み合わせて酵母及びカビ検出用のプライマー対として使用することができる。 Primer 1 and primer 2 of the present invention for detecting yeast and mold may be used separately for detecting yeast and mold, but preferably used in combination as a primer pair for detecting yeast and mold. can do.

(II)酵母及びカビの検出方法
また、本発明は、プライマー１及びプライマー２から構成される「酵母及びカビ検出用のプライマー対」を使用して、検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法を提供する。本発明に係る酵母及びカビの検出方法は、下記工程(1)〜(3)を含有することを特徴とするものである。
(1)検査対象物に含まれるＤＮＡを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう工程、及び
(3)増幅されたＤＮＡ断片の有無を検出する工程。 (II) Yeast and Mold Detection Method The present invention also uses the “primer pair for yeast and mold detection” composed of primer 1 and primer 2 to detect yeast and mold in the test object. Provide a method. The method for detecting yeast and mold according to the present invention comprises the following steps (1) to (3).
(1) a step of extracting DNA contained in the test object;
(2) the step (1) a step of performing PCR using the extracted DNA as a template and the above-described primer pair for yeast and mold detection; and
(3) A step of detecting the presence or absence of the amplified DNA fragment.

検査対象物
本判定方法における検査対象物は、酵母及びカビの存在の判定が必要とされるものであれば、その種類については特に制限されない。また、当該検査対象物の形態についても、液状、固形状、半固形状等の何れであってもよい。好ましくは液状又は半固形状の形態のものである。液状又は半固形状の形態のものは酵母及びカビの生育に適しているので、これらの形態の検査対象物における酵母及びカビの存在を判定することは極めて重要である。 The inspection object in the present determination method is not particularly limited as long as it is necessary to determine the presence of yeast and mold. Further, the form of the inspection object may be liquid, solid, semi-solid, or the like. The liquid or semi-solid form is preferred. Since the liquid or semi-solid form is suitable for the growth of yeast and mold, it is very important to determine the presence of yeast and mold in these forms of test objects.

当該検査対象物として、具体的には、食品、医薬品、香粧品、及びこれらの原材料等を挙げることができる。当該食品の具体例としては、乳酸菌飲料、牛乳、乳飲料、果汁飲料、茶類、栄養飲料、炭酸飲料、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、ソース、ゼリー、レトルト食品等が挙げられる。また、当該医薬品の具体例としては、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、流エキス剤、軟膏等が挙げられる。更に、当該香粧品の具体例としては、乳液、クリーム、ローション、オイル等が挙げられる。 Specific examples of the test object include foods, pharmaceuticals, cosmetics, and raw materials thereof. Specific examples of the food include lactic acid bacteria beverages, milk, milk beverages, fruit juice beverages, teas, nutritional beverages, carbonated beverages, soft drinks, fermented milk, yogurt, sauces, jelly, and retort foods. Specific examples of the drug include powders, tablets, granules, capsules, syrups, injections, fluid extracts, and ointments. Furthermore, specific examples of the cosmetics include emulsions, creams, lotions, oils and the like.

酵母及びカビの誤検出を抑制するという観点から、本発明の検出方法における検査対象物には、酵母及びカビを使用して製造された成分が含まれていないものが望ましい。例えば、検査対象物が食品である場合、該食品は、酵母やカビを使用して製造された発酵食品以外の食品であることが望ましい。 From the viewpoint of suppressing erroneous detection of yeast and mold, it is desirable that the test object in the detection method of the present invention does not contain components produced using yeast and mold. For example, when the test object is a food, the food is preferably a food other than a fermented food produced using yeast or mold.

上記検査対象物の中でも、特に食品は、その商品価値が鮮度に大きく作用されるので、品質管理上、迅速で精度の高い方法で酵母及びカビの汚染の有無を判定することが求められている検査対象物である。また、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対は、植物成分等の食品成分共存下でも、食品成分由来のＤＮＡにハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできるので、食品中の酵母及びカビの検出に特に有用である。これらの事項に鑑みれば、本判定方法において、好ましい検査対象物として食品が挙げられる。 Among the above-mentioned inspection objects, especially food, since its commercial value greatly affects the freshness, it is required for quality control to determine the presence or absence of yeast and mold contamination by a quick and accurate method. It is an inspection object. In addition, the above-mentioned primer pair for detecting yeast and mold can specifically hybridize to 18S rRNA gene of yeast and mold without hybridizing to DNA derived from the food component even in the presence of food components such as plant components. Therefore, it is particularly useful for detecting yeast and mold in food. In view of these matters, in the present determination method, food is a preferable test object.

食品の中でも、特に、乳酸菌飲料、発酵乳、ヨーグルト等の食品は、酵母及びカビによる汚染が特に問題となる食品であり、酵母及びカビの混入の検査を迅速且つ高い精度で実施することが強く求められている。本検出方法によれば、これらの食品に対して特に高い精度で酵母及びカビの検出が可能であるので、これらの食品は、特に好ましい検査対象物である。 Among foods, especially foods such as lactic acid bacteria beverages, fermented milk, and yogurt are foods that are particularly problematic for contamination by yeasts and molds, and it is strongly recommended that tests for contamination of yeasts and molds be performed quickly and with high accuracy. It has been demanded. According to this detection method, yeast and mold can be detected with particularly high accuracy for these foods, so these foods are particularly preferred test objects.

工程(1)
工程(1)では、検査対象物に含まれるＤＮＡの抽出を行なう。 Process (1)
In step (1), DNA contained in the test object is extracted.

ＤＮＡの抽出は、検査対象物の種類や形態等に応じて、公知のＤＮＡ抽出方法を適宜採用して実施すればよい。例えば、検査対象物の形態が液状の場合であれば、検査対象物にガラスビーズ液を添加し、８０〜１００℃程度で１〜１５分間程度加熱した後、冷却し、次いでマルチビーズショッカー等で破砕し、その後、市販のDNA抽出キット等でDNA抽出を行なうことにより、ＤＮＡ抽出物を得ることができる。また、例えば、半固体状又は固体状の場合であれば、該検査対象物を水等により液状にした後に、上記ＤＮＡ抽出処理を実施すればよい。 DNA extraction may be carried out by appropriately adopting a known DNA extraction method according to the type and form of the test object. For example, if the form of the test object is liquid, a glass bead solution is added to the test object, heated at about 80 to 100 ° C. for about 1 to 15 minutes, cooled, and then with a multi-bead shocker or the like. A DNA extract can be obtained by crushing and then performing DNA extraction with a commercially available DNA extraction kit or the like. For example, in the case of a semi-solid or solid state, the DNA extraction process may be performed after the test object is made liquid with water or the like.

上記抽出処理により得られたＤＮＡ抽出物に、ＲＮＡやタンパク質等が含まれている場合には、必要に応じて、更にＤＮＡの精製処理を行ってもよい。 If the DNA extract obtained by the extraction process contains RNA, protein, or the like, DNA may be further purified as necessary.

本検出方法において、通常、検査対象物１ｇ当たりに１００ｃｆｕ(colony forming unit)程度以上の酵母及びカビが存在する場合、上記条件でＤＮＡ抽出を行なうことにより検査対象物の酵母及びカビの存在について判定可能な程度のＤＮＡを抽出できる。 In this detection method, usually when about 100 cfu (colony forming unit) or more of yeast and mold exist per 1 g of the test object, the presence of the yeast and mold of the test object is determined by performing DNA extraction under the above conditions. As much DNA as possible can be extracted.

一方、検査対象物中の酵母及びカビが上記菌数よりも少ない場合であれば、ＤＮＡ抽出操作の前に、検査対象物中の酵母及びカビを人為的に増菌させることによって、酵母及びカビの検出に必要とされる量のＤＮＡが抽出可能になる。このように、検査対象物に含まれる酵母及びカビを人為的に増菌させることは、検出感度が高められるだけでなく、検査対象物中の死菌（酵母及びカビ）が検出の精度に及ぼす影響を最小限にするという利点も得られる。 On the other hand, if the number of yeasts and molds in the test object is less than the above-mentioned number of bacteria, the yeast and molds are artificially increased before the DNA extraction operation to increase the yeast and mold. The amount of DNA required for detection of can be extracted. Thus, artificially increasing the yeast and mold contained in the test object not only increases the detection sensitivity, but also killed bacteria (yeast and mold) in the test object affect the detection accuracy. The advantage of minimizing the impact is also obtained.

検査対象物に含まれる酵母及びカビを増菌する方法としては、例えば、検査対象物の所定量を真菌増殖用培地中に入れ、これを酵母及びカビの生育環境条件下で保持する方法が挙げられる。より具体的には、次の方法が例示される。ＹＰＤ培養液のような真菌増殖用液体培地に適量の検査対象物を入れ、２５℃程度で培養する。培養時間は、検査対象物中に存在する酵母及びカビの菌数によっても異なるが、通常１２〜９６時間程度とすればよい。使用した検査対象物中に酵母及びカビが存在している場合、得られた培養液中の酵母及びカビの菌数が増加している。この培養液を上記ＤＮＡ抽出処理に供すればよい。 Examples of the method for increasing the yeast and mold contained in the test object include a method in which a predetermined amount of the test object is placed in a fungal growth medium and this is maintained under the growth environment conditions of the yeast and mold. It is done. More specifically, the following method is exemplified. An appropriate amount of a test object is put in a liquid medium for fungal growth such as YPD culture and cultured at about 25 ° C. Although the culture time varies depending on the number of yeasts and molds present in the test object, it is usually about 12 to 96 hours. When yeast and mold are present in the used test object, the number of yeast and mold in the obtained culture medium is increased. What is necessary is just to use this culture solution for the said DNA extraction process.

検査対象物の種類によっても異なるが、例えば、検査対象物１００ｇ当たり３〜１０ｃｆｕ程度の酵母が含まれている場合であれば、該検査対象物を上記条件で２０時間程度培養することにより、検出必要量のＤＮＡが得られる程度に酵母を増菌させることができる。また、例えば、検査対象物１００ｇ当たりの酵母の菌数が１〜３ｃｆｕ程度の場合であれば、上記条件において、培地に添加する検査対象物の量を増やしたり、培養時間を延長させたりすればよい。 For example, in the case where about 3 to 10 cfu of yeast is contained per 100 g of the test object, the test object is detected by culturing the test object for about 20 hours under the above conditions. Yeast can be enriched to the extent that the required amount of DNA is obtained. For example, if the number of yeast cells per 100 g of the test object is about 1 to 3 cfu, the amount of the test object added to the medium may be increased or the culture time may be extended under the above conditions. Good.

工程(2)
工程(2)では、前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう。当該ＰＣＲの条件は、目的ＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することを限度として特に制限されず、使用する装置等に応じて適宜設定することができる。使用されるＰＣＲ装置としては、例えば、ブロックタイプ、リアルタイムＰＣＲタイプ等の市販の装置が挙げられる。迅速にＤＮＡを増幅するためにはキャピラリータイプのリアルタイムＰＣＲ装置を用いることが好ましい。 Process (2)
In step (2), PCR is carried out using the extracted DNA in step (1) as a template and the above-mentioned primer pair for yeast and mold detection. The PCR conditions are not particularly limited as long as the target DNA fragment is amplified to the extent that it can be detected, and can be appropriately set according to the apparatus to be used. Examples of the PCR apparatus used include commercially available apparatuses such as a block type and a real-time PCR type. In order to rapidly amplify DNA, it is preferable to use a capillary type real-time PCR apparatus.

例えば、リアルタイムＰＣＲ装置を使用する場合であれば、当該ＰＣＲの条件の一例として、以下の条件が例示される：
＜反応液＞例えば、Takara Ex Taq^TMR-PCR Version （Takara Bio社製）に付属のＰＣＲ反応液
＜ＰＣＲサイクル条件＞
２本鎖ＤＮＡの熱変性条件：９５℃で５秒間、
プライマーの一本鎖ＤＮＡへのアニーリング条件：５４℃で１０秒間、
ＤＮＡ伸長条件：７２℃で２０秒間、
サイクル回数：３５サイクル程度。 For example, if a real-time PCR apparatus is used, the following conditions are exemplified as an example of the PCR conditions:
<Reaction solution> For example, PCR reaction solution attached to Takara Ex Taq ^™ R-PCR Version (Takara Bio) <PCR cycle conditions>
Thermal denaturation conditions for double-stranded DNA: 5 seconds at 95 ° C.
Primer annealing conditions to single stranded DNA: 54 ° C. for 10 seconds,
DNA extension conditions: 20 seconds at 72 ° C.
Number of cycles: about 35 cycles.

工程(3)
工程(3)では、増幅されたＤＮＡ断片を検出する。増幅されたＤＮＡ断片を検出する方法は、特に制限されず、公知のＤＮＡ断片検出方法を使用できる。例えば、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーンＩ等の核酸染色剤で核酸染色することにより、ＤＮＡ断片を検出することができる。また、前記工程(2)において、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行なう場合は、該装置の検出システムにより自動的に短時間で増幅されたＤＮＡの有無が確認される。例えば、ＰＣＲ反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合では、サイバーグリーンＩが二本鎖ＤＮＡに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニター可能であり、更に、ＰＣＲ後に融解曲線分析を行なうことによりＰＣＲ産物が目的のＤＮＡ断片であるかどうかを確認できる。判断が困難な場合は、増幅産物の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認すればよい。 Process (3)
In step (3), the amplified DNA fragment is detected. The method for detecting the amplified DNA fragment is not particularly limited, and a known DNA fragment detection method can be used. For example, a DNA fragment can be detected by separating PCR products by agarose gel electrophoresis and staining the nucleic acid with a nucleic acid stain such as ethidium bromide or cyber green I. In the step (2), when PCR is performed using a real-time PCR apparatus, the presence or absence of DNA automatically amplified in a short time is confirmed by the detection system of the apparatus. For example, when Cyber Green I is added to the PCR reaction solution, the amount of amplification product can be monitored for each cycle from the fluorescence value emitted when Cyber Green I binds to double-stranded DNA. By performing curve analysis, it is possible to confirm whether the PCR product is the target DNA fragment. If determination is difficult, the size of the amplified product may be confirmed by agarose gel electrophoresis.

増幅されたＤＮＡ断片が存在する場合、アガロースゲル電気泳動であれば、２５０〜２７０塩基対程度の大きさの位置にバンドが検出される。 When the amplified DNA fragment is present, a band is detected at a position of about 250 to 270 base pairs in the case of agarose gel electrophoresis.

本工程で検出されたＤＮＡ断片の有無を指標として、検査対象物中の酵母及びカビの存在を判定することができる。本工程において、ＤＮＡ断片が検出された場合、検査対象物には酵母及びカビが存在していると判定される。一方、ＤＮＡ断片が検出されなかった場合、検査対象物には酵母及びカビが存在していないと判定される。 With the presence or absence of the DNA fragment detected in this step as an index, the presence of yeast and mold in the test object can be determined. In this step, when a DNA fragment is detected, it is determined that yeast and mold are present in the test object. On the other hand, if no DNA fragment is detected, it is determined that the test object does not contain yeast and mold.

検査対象物中の酵母及びカビを更に精度よく検出する必要がある場合には、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するものであることを確認してもよい。この確認方法としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を常法により決定し、その塩基配列を公知のＤＮＡデータベースの塩基配列と比較する方法が例示される。 When it is necessary to more accurately detect yeast and mold in the test object, it may be confirmed that the PCR-amplified DNA fragment is derived from the 18S rRNA gene of yeast and mold. Examples of this confirmation method include a method in which the base sequence of a PCR-amplified DNA fragment is determined by a conventional method, and the base sequence is compared with the base sequence of a known DNA database.

(III)酵母及びカビ検出用キット
本発明の酵母及びカビ検出用キットは、前記する検査対象物中の酵母及びカビの検出方法に用いられるキットであり、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を含有するものである。本発明の酵母及びカビ検出用キットにおいて、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対は、プライマー１とプライマー２の混合物であってもよく、またこれらのプライマーが別個に収容されていてもよい。当該酵母及びカビ検出用キットには、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対の他に、ＰＣＲやＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を検出するのに必要な試薬類を更に含んでいてもよい。 (III) Yeast and mold detection kit The yeast and mold detection kit of the present invention is a kit used for the method of detecting yeast and mold in the test object described above, and comprises the above-mentioned primer pair for yeast and mold detection. It contains. In the yeast and mold detection kit of the present invention, the primer pair for yeast and mold detection may be a mixture of primer 1 and primer 2, or these primers may be accommodated separately. In addition to the yeast and mold detection primer pair, the yeast and mold detection kit may further contain reagents necessary for detecting PCR and PCR amplified DNA fragments.

本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、幅広い酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできる。本発明のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、植物及び動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないので、酵母及びカビの検出に有用である。 The primers for detecting yeast and mold of the present invention can specifically hybridize to a wide range of yeast and mold 18S rRNA genes without hybridizing to plant or animal 18S rRNA genes or bacterial 16S rRNA genes. The primer of the present invention is useful for the detection of yeast and mold because it is detectably amplified in 18S rRNA genes of yeast and mold by PCR, but does not detectably amplify 18S rRNA genes of plants and animals. is there.

従って、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマー対を使用する、酵母及びカビの検出方法は、酵母及びカビの感染検査の一次スクリーニングとして実用できる。即ち、本発明の検出方法により酵母及びカビの存在が確認された場合には、食品の製造工程や製品に対する適切な措置をより迅速に執ることができる。また、必要に応じて、本発明の酵母及びカビの検出方法に組み合わせて、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行なうことにより、菌種を同定することもできる。 Accordingly, the yeast and mold detection method using the yeast and mold detection primer pair of the present invention can be used as a primary screening for yeast and mold infection tests. That is, when the presence of yeast and mold is confirmed by the detection method of the present invention, it is possible to take appropriate measures for food production processes and products more quickly. If necessary, the bacterial species can also be identified by performing a base sequence analysis of a PCR amplified DNA fragment in combination with the yeast and mold detection method of the present invention.

また、食品中の酵母及びカビの検出において、従来の真菌一般を広く検出できるプライマーを使用する場合は、目的真菌以外の混入生物のＤＮＡや食品由来のＤＮＡまで検出されるが、本発明の酵母及びカビ検出用プライマーを用いることにより、食品汚染酵母及びカビを検出できると共に、食品汚染酵母及びカビ以外の混入生物由来のＤＮＡや食品由来のＤＮＡを実質的に検出せずに、高精度での酵母及びカビの検出が行なえる。 In addition, in the detection of yeast and mold in food, when using primers that can widely detect conventional fungi in general, DNA of contaminated organisms other than the target fungus and food-derived DNA are detected, but the yeast of the present invention And mold-detecting primers can detect food-contaminated yeasts and molds, and can detect DNA contaminated with food other than food-contaminated yeasts and molds or DNA derived from foods with high accuracy. Yeast and mold can be detected.

以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not restrict | limited by these Examples.

実施例１（食品汚染酵母及びカビ、並びにその他生物由来DNAとの反応性の確認）
下記実験により、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマーとのプライマー対（Y18r230）の各生物の由来のＤＮＡに対する反応性を調べた。
１．プライマーの合成
配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマー、及び配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマーをＤＮＡ合成機により調製した。 Example 1 (Confirmation of reactivity with food-contaminated yeast and mold, and other biological DNA)
According to the following experiment, the reactivity of the primer pair (Y18r230) of the DNA primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the DNA primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 to DNA derived from each organism was examined. .
1. Synthesis of Primer A DNA primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a DNA primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 were prepared using a DNA synthesizer.

２．各種菌株、植物、及び動物由来のＤＮＡの調製
酵母及びカビ由来ＤＮＡの調製
表1に示す各菌株をYPD培地を用いて培養した。なお、これらの酵母及びカビ（糸状菌）は、食品汚染の代表的な原因菌である。培養して得られた酵母については、GenTLE Kit（Takara Bio社製）を用いてＤＮＡ抽出を行なった。また、培養して得られた糸状菌については、培養液にガラスビーズ液を添加し、９９℃程度で１〜１５分間程度加熱した後、冷却し、次いでマルチビーズショッカー等で破砕した後、GenTLE Kitを用いてＤＮＡの抽出を行なった。得られた各ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定し、各酵母及びカビ由来のＤＮＡの濃度を１ng/μLに調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。 2. Preparation of DNA from various strains, plants, and animals
Preparation of yeast and mold-derived DNA Each strain shown in Table 1 was cultured using YPD medium. These yeasts and molds (filamentous fungi) are representative causative bacteria for food contamination. About yeast obtained by culture | cultivation, DNA extraction was performed using GenTLE Kit (made by Takara Bio). For filamentous fungi obtained by culturing, glass bead solution is added to the culture solution, heated at about 99 ° C. for about 1 to 15 minutes, cooled, and then crushed with a multi-bead shocker or the like, then GenTLE DNA was extracted using Kit. The amount of DNA in each obtained DNA solution was measured, and the concentration of DNA derived from each yeast and mold was adjusted to 1 ng / μL to obtain a test DNA solution.

細菌由来ＤＮＡの調製
表１に示す各細菌株を、それぞれの細菌に適合する培地で培養した。培養して得られた各細菌について、公知の方法（アルカリＳＤＳ法）を用いてＤＮＡ抽出を行なった。得られた各ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定し、各細菌由来のＤＮＡの濃度を２００pg/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。 Preparation of bacteria-derived DNA Each bacterial strain shown in Table 1 was cultured in a medium compatible with each bacteria. About each bacterium obtained by culture | cultivation, DNA extraction was performed using the well-known method (alkaline SDS method). The amount of DNA in each obtained DNA solution was measured, and the concentration of DNA derived from each bacterium was adjusted to about 200 pg / μL to obtain a test DNA solution.

植物由来ＤＮＡの調製
コスモバイオ社から購入したダイズ、トウモロコシ及びコムギのＤＮＡを用いて、被験ＤＮＡ溶液を調製した。ダイズ及びトウモロコシ由来のＤＮＡについては、ＤＮＡ濃度を３ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。また、コムギ由来のＤＮＡについては、ＤＮＡ濃度を８ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。また、メロン、ミカン、ブドウ、リンゴ及びキウイから、ISOPLANT II kit（ニッポンジーン社製）を用いてＤＮＡ抽出して、抽出されたＤＮＡ濃度をそれぞれ３ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。 Preparation of plant-derived DNA Test DNA solutions were prepared using soybean, corn, and wheat DNA purchased from Cosmo Bio. For DNA derived from soybean and corn, the DNA concentration was adjusted to about 3 ng / μL to prepare a test DNA solution. For the DNA derived from wheat, the DNA concentration was adjusted to about 8 ng / μL to prepare a test DNA solution. In addition, DNA was extracted from melon, tangerine, grape, apple and kiwi using ISOPLANT II kit (manufactured by Nippon Gene), and the extracted DNA concentration was adjusted to about 3 ng / μL, respectively, to obtain a test DNA solution. .

動物由来ＤＮＡの調製
ヒトMCF-7細胞（大日本製薬社製）からDNeasy Tissue Mini Kit(キアゲン社)を用いてヒトＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定し、ＤＮＡの濃度を３ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。ウシ及びニワトリ由来の精製ＤＮＡはCeMines社から購入し、ブタ由来のＤＮＡはGeneScan社から購入した。ウシ、ニワトリ及びブタ由来のＤＮＡを用いて、各ＤＮＡの濃度３ng/μL程度の被験ＤＮＡ溶液を調製した。 Preparation of animal-derived DNA Human DNA was extracted from human MCF-7 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) using DNeasy Tissue Mini Kit (Qiagen). The amount of DNA in the obtained DNA solution was measured, and the concentration of DNA was adjusted to about 3 ng / μL to prepare a test DNA solution. Purified DNA from bovine and chicken was purchased from CeMines, and DNA from pig was purchased from GeneScan. A test DNA solution having a concentration of about 3 ng / μL of each DNA was prepared using DNA derived from bovine, chicken and pig.

３．ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
上記各被験ＤＮＡ溶液１μLをＰＣＲ反応用キットであるTakara Ex Taq^TMR-PCR Version （Takara Bio社、Otsu、Japan）の説明書に従って、総量２０μLのＰＣＲ反応液を調製した。即ち、２μLの10×R-PCR Buffer(Mg²⁺free)、０．１６μLの２５０ｍＭ Mg²⁺Solution for R-PCR、０．４μLのdNTP Mixture(各１０ｍＭ)、０．２μLのTaKara EX Taq^TM R-PCR(5 units/μL)、０．８μLの０．１２５％SYBR^TMGreenI (Fmc Bioproducts社、Rockland、USA)、１ μLのDNAプライマー液（配列番号１のＤＮＡプライマー及び配列番号２のＤＮＡプライマーを各々５μＭ含有）及び１６．４４μLの蒸留水を含む１９μLの溶液に、被験ＤＮＡ溶液１μLを加えて総量２０μLにしたＰＣＲ反応液を調製した。 3. DNA amplification by PCR 1 μL of each test DNA solution was prepared according to the instructions of Takara Ex Taq ^™ R-PCR Version (Takara Bio, Otsu, Japan), which is a PCR reaction kit, to prepare a PCR reaction solution with a total volume of 20 μL. That is, 2 μL of 10 × R-PCR Buffer (Mg ²⁺ free), 0.16 μL of 250 mM Mg ²⁺ Solution for R-PCR, 0.4 μL of dNTP Mixture (each 10 mM), 0.2 μL of TaKara EX Taq ^™ R-PCR (5 units / μL), 0.8 μL of 0.125% SYBR ^™ GreenI (Fmc Bioproducts, Rockland, USA), 1 μL of DNA primer solution (DNA primer of SEQ ID NO: 1 and DNA of SEQ ID NO: 2) A PCR reaction solution was prepared by adding 1 μL of the test DNA solution to a 19 μL solution containing 5 μM of each primer and 16.44 μL of distilled water to make a total volume of 20 μL.

ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、ロシュ・ダイアグノスティックス社のLightCyclerを用いて次のように行った。即ち、初期変性を９５℃で１分間行なった後、９５℃で５秒間、５４℃で１０秒間、及び７２℃で２０秒間の蛍光測定（PCRによる増幅産物の測定）を1サイクルとして、これを３５サイクル行った。次いで、増幅産物の融解曲線分析のために、９７℃で０秒、６０℃で１０秒後、０．２℃/秒の速度で９７℃まで昇温させると同時に連続的に蛍光測定により各温度に対する増幅産物の二本鎖ＤＮＡ量を測定し、最後に４０℃まで降温させた。 Amplification of DNA by PCR was performed as follows using a LightCycler manufactured by Roche Diagnostics. That is, after carrying out initial denaturation at 95 ° C. for 1 minute, fluorescence measurement (measurement of amplification products by PCR) at 95 ° C. for 5 seconds, 54 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds is taken as one cycle. 35 cycles were performed. Then, for melting curve analysis of the amplification product, after raising the temperature to 97 ° C. at a rate of 0.2 ° C./second after 0 second at 97 ° C., 10 seconds at 60 ° C., and simultaneously measuring each temperature by fluorescence measurement The amount of double-stranded DNA in the amplification product was measured, and finally the temperature was lowered to 40 ° C.

ＰＣＲ終了後、融解曲線解析を同ＰＣＲ装置上のソフトウェアで行い、増幅産物のＴｍ値を求めることで特異的な増幅産物の有無を判定した。さらに、Mupidミニゲル泳動槽（ADVANCE社）を用いて１．８％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認することにより、増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。 After completion of PCR, melting curve analysis was performed with software on the PCR device, and the presence or absence of a specific amplification product was determined by determining the Tm value of the amplification product. Furthermore, by performing electrophoresis with 1.8% agarose gel using a Mupid minigel electrophoresis tank (ADVANCE), staining the gel with ethidium bromide solution, and confirming the presence or absence of amplification of the target band, the amplified DNA fragment The presence or absence was confirmed.

４．結果
得られた結果を表1に示す。表中＋は電気泳動によりバンドが検出されたことを示し、マイナスはバンドが検出されなかったことを示す。表１に示す結果から、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いたＰＣＲにより、食品汚染の代表的な原因菌である１９種の酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅できることが判明した。また、他の細菌類や、植物、動物に由来するＤＮＡを増幅しないことも判明した。以上の結果から、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマー対を使用することにより、食品を初めとする検査対象物から、酵母及びカビを分離培養することなく一度のＰＣＲで酵母及びカビの存在を判定可能であることが明らかとなった。 4). Results The results obtained are shown in Table 1. In the table, + indicates that a band was detected by electrophoresis, and minus indicates that no band was detected. From the results shown in Table 1, DNA derived from 19 types of yeast and mold 18S rRNA genes, which are typical causative bacteria of food contamination, by PCR using a set of the primer of SEQ ID NO: 1 and the primer of SEQ ID NO: 2. It was found that the fragments could be specifically amplified. It has also been found that DNA derived from other bacteria, plants and animals is not amplified. From the above results, by using the yeast and mold detection primer pair of the present invention, the presence of yeast and mold from a test object such as food can be performed in a single PCR without separating and culturing yeast and mold. It became clear that it was possible to judge.

参考試験例１
特許文献１に開示されているプライマー対（B2F：5'-ACTTTCGATGGTAGGATAG-3'、及びB4R：5'-TGATCGTCTTCGATCCCCTA-3'）（以下、「プライマー対（B2FB4R）」と記す）によるカビ由来ＤＮＡ及び植物由来ＤＮＡの検出の可否について、検討するため、下記の試験を行った。 Reference test example 1
Mold-derived DNA by the primer pair (B2F: 5′-ACTTTCGATGGTAGGATAG-3 ′ and B4R: 5′-TGATCGTCTTCGATCCCCTA-3 ′) (hereinafter referred to as “primer pair (B2FB4R)”) disclosed in Patent Document 1 In order to examine whether or not plant-derived DNA can be detected, the following test was performed.

上記実施例と同様の方法で、Saccharomyces cerevisiae(NBRC 0282)、Aspergillus niger（ATCC 9642）、Glycine max（ダイズ）、Zea mays（トウモロコシ）、Triticum aestivum（コムギ）、Malus sp.（リンゴ）、Vitis sp.（ブドウ）、及びActinidia sp.(キウイ)由来のＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡとプライマー対（B2FB4R）を用いて、上記実施例１と同様の方法で、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行い、増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。 In the same manner as in the above example, Saccharomyces cerevisiae (NBRC 0282), Aspergillus niger (ATCC 9642), Glycine max (soybean), Zea mays (corn), Triticum aestivum (wheat), Malus sp. (Apple), Vitis sp (Grape) and Actinidia sp. (Kiwi) -derived DNA were prepared. Using these DNAs and a primer pair (B2FB4R), DNA amplification by PCR was performed in the same manner as in Example 1 above, and the presence or absence of amplified DNA fragments was confirmed.

得られたアガロースゲルによる電気泳動パターンを図１に示す。また、参考のために、実施例１において、同一のＤＮＡを使用した場合のアガロースゲルによる電気泳動パターンについても、図１に併せて示す。この結果、特許文献１のプライマー対（B2FB4R）では、植物由来のＤＮＡ（増幅産物は約680bp）を検出してしまうため、食品中の酵母やカビの検出には不適であることが確認された。 The electrophoresis pattern by the obtained agarose gel is shown in FIG. For reference, an electrophoresis pattern by an agarose gel when the same DNA is used in Example 1 is also shown in FIG. As a result, it was confirmed that the primer pair (B2FB4R) in Patent Document 1 detects plant-derived DNA (amplification product is about 680 bp) and is therefore unsuitable for detecting yeast and mold in food. .

実施例２（食品中の酵母及びカビ由来18S rRNA遺伝子の検出）
酵母及びカビに汚染されていないことを前もって確認済みの市販の乳酸菌飲料に、指標菌として酵母Clavispora lusitaniae NBRC 10059株と、糸状菌Talaromyces bacillisporus NBRC 8397株を、それぞれ食品１mL当たり1×10¹, 1×10², 1×10³, 1×10⁴cfu程度となるように添加したもの、及び無添加のものを調製した。 Example 2 (Detection of 18S rRNA gene derived from yeast and mold in food)
Commercially available lactic acid bacteria beverages that have been confirmed not to be contaminated with yeast and mold, yeast Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain and filamentous fungus Talaromyces bacillisporus NBRC 8397 strain as indicator bacteria, 1 × 10 ¹ , 1 The one added to about × 10 ² , 1 × 10 ³ , 1 × 10 ⁴ cfu and the one without addition were prepared.

Clavispora lusitaniae NBRC 10059株を添加したサンプルはGenTLE Kit（Takara Bio社製）を用いてＤＮＡ抽出を行なった。一方、Talaromyces bacillisporus NBRC 8397株を添加したサンプルには、ガラスビーズ液を添加し、９９℃程度で１〜１５分程度加熱した後、冷却し、次いでマルチビーズショッカー等で破砕した後、GenTLE Kitを用いてＤＮＡ抽出を行なった。得られた各種ＤＮＡ溶液４μLを試料とし、実施例１と同様の方法でＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルによる電気泳動パターンを図２に示す。 The sample to which Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain was added was subjected to DNA extraction using GenTLE Kit (Takara Bio). On the other hand, to the sample to which Talaromyces bacillisporus NBRC 8397 was added, a glass bead solution was added, heated at about 99 ° C. for about 1 to 15 minutes, cooled, then crushed with a multi-bead shocker, etc. DNA extraction was performed. PCR was performed in the same manner as in Example 1 using 4 μL of the obtained various DNA solutions as samples, and the presence or absence of PCR amplified DNA fragments was confirmed. The electrophoresis pattern by agarose gel is shown in FIG.

図２の（Ａ）には、Clavispora lusitaniae NBRC 10059株を用いて試験した結果を示す。図２(Ａ)のレーン１及び９はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３はClavispora lusitaniae NBRC 10059株の精製ＤＮＡ２００pgを使用したPositive controlである。レーン４は、酵母又はカビを添加しなかったサンプルである。またレーン５、６、７及び８は、乳酸菌飲料にClavispora lusitaniae NBRC 10059株をそれぞれ1×10¹, 1×10², 1×10³, 1×10⁴cfu添加したサンプルである。 FIG. 2A shows the results of testing using Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain. Lanes 1 and 9 in FIG. 2A are DNA markers (φ × 174 Hae III digest, manufactured by TaKaRa Bio). Lane 2 is a negative control with no template DNA added, and lane 3 is a positive control using 200 pg of purified DNA of Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain. Lane 4 is a sample to which yeast or mold was not added. Lanes 5, 6, 7 and 8 are samples obtained by adding 1 × 10 ¹ , 1 × 10 ² , 1 × 10 ³ and 1 × 10 ⁴ cfu of Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain to the lactic acid bacteria beverage, respectively.

また、図２の（Ｂ）には、Talaromyces bacillisporus NBRC 8397株を用いて試験した結果を示す。図２(Ｂ)のレーン１及び９はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３はTalaromyces bacillisporus NBRC 8397株の精製ＤＮＡ２００pgを使用したPositive controlである。レーン４は、酵母又はカビを添加しなかったサンプルである。またレーン５、６、７及び８は、乳酸菌飲料にTalaromyces bacillisporus NBRC 8397株をそれぞれ1×10¹, 1×10², 1×10³, 1×10⁴cfu添加したサンプルである。 FIG. 2 (B) shows the results of testing using Talaromyces bacillisporus NBRC 8397 strain. Lanes 1 and 9 in FIG. 2 (B) are DNA markers (φ × 174 Hae III digest, manufactured by TaKaRa Bio). Lane 2 is a negative control with no template DNA added, and lane 3 is a positive control using 200 pg of purified DNA from Talaromyces bacillisporus NBRC 8397 strain. Lane 4 is a sample to which yeast or mold was not added. Lanes 5, 6, 7 and 8 are samples obtained by adding 1 × 10 ¹ , 1 × 10 ² , 1 × 10 ³ and 1 × 10 ⁴ cfu of Talaromyces bacillisporus NBRC 8397 strain to a lactic acid bacteria beverage, respectively.

図２（Ａ）から明らかなように、乳酸菌飲料１mL当たり１００cfu程度の酵母が存在する場合、前記ＰＣＲ条件で、該酵母由来のＤＮＡを検出できた。また、図１（Ｂ）から分かるように、乳酸菌飲料１ｍＬ当たり１００cfu程度糸状菌が存在する場合、前記ＰＣＲ条件で、該糸状菌由来のＤＮＡを検出可能であった。 As apparent from FIG. 2 (A), when yeast of about 100 cfu per mL of lactic acid bacteria beverage was present, DNA derived from the yeast could be detected under the PCR conditions. In addition, as can be seen from FIG. 1 (B), when filamentous fungi were present at about 100 cfu per mL of lactic acid bacteria beverage, DNA derived from the filamentous fungi could be detected under the PCR conditions.

実施例３（食品中に微量に存在する酵母由来18S rRNA遺伝子の検出）
酵母及びカビに汚染されていないことを前もって確認済みの市販の乳酸菌飲料と発酵乳に代表的な食品汚染酵母であるClavispora lusitaniae NBRC 10059株を指標菌として、各々食品３００ｍｌ当たり４、７０、４８０cfu程度となるように添加したもの及び、無添加のものを調製した。それぞれ食品重量と等量（３００ｍｌ）のＹＰＤ液体培地（クロラムフェニコール１００μg / mL入り）を加え、２５℃で２０時間、振蘯培養した。 Example 3 (Detection of yeast-derived 18S rRNA gene present in trace amounts in food)
About 4, 70, 480 cfu per 300 ml of food, using commercially available lactic acid bacteria beverages that have been confirmed not to be contaminated with yeast and mold and Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain, which is a typical food-contaminated yeast, as fermented milk. What was added so that it might become, and what was not added were prepared. Each YPD liquid medium (with chloramphenicol 100 μg / mL) was added in an amount (300 ml) equal to the weight of the food, and cultured with shaking at 25 ° C. for 20 hours.

得られた培養液を１．３mL採取し、８０００×ｇで１分間遠心した後、上清を除き、沈殿物を回収した。得られた沈殿物から、GenTLE Kit（Takara Bio社製）を用いＤＮＡ抽出を行なった。得られたＤＮＡ溶液４μLを試料とし、実施例１と同様の方法でＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルによる電気泳動パターンを図３に示す。 After 1.3 mL of the obtained culture broth was collected and centrifuged at 8000 × g for 1 minute, the supernatant was removed and the precipitate was recovered. From the resulting precipitate, DNA extraction was performed using GenTLE Kit (Takara Bio). PCR was performed in the same manner as in Example 1 using 4 μL of the obtained DNA solution as a sample, and the presence or absence of a PCR amplified DNA fragment was confirmed. The electrophoresis pattern by agarose gel is shown in FIG.

図３(A)に乳酸菌飲料の場合の電気泳動パターンを示す。図３(A)のレーン１及び８はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３は酵母を添加せずに２０時間培養したサンプルである。またレーン４はClavispora lusitaniaeNBRC 10059株の精製ＤＮＡを２００pg加えたもの（Positive control）である。レーン５、６及び７は乳酸菌飲料に酵母を添加して２０時間培養したサンプルである。 FIG. 3A shows an electrophoresis pattern in the case of a lactic acid bacteria beverage. Lanes 1 and 8 in FIG. 3 (A) are DNA markers (φ × 174 Hae III digest, manufactured by TaKaRa Bio). Lane 2 is a negative control to which no template DNA is added, and lane 3 is a sample cultured for 20 hours without adding yeast. Lane 4 is the one obtained by adding 200 pg of purified DNA of Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain (Positive control). Lanes 5, 6 and 7 are samples obtained by adding yeast to a lactic acid bacteria beverage and culturing for 20 hours.

また、図３(B)に発酵乳の場合の電気泳動パターンを示す。図３（Ｂ）のレーン１及び８はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３は酵母を添加せずに２０時間培養したサンプルである。またレーン４はClavispora lusitaniaeNBRC 10059株の精製ＤＮＡを２００pg加えたもの（Positive control）である。レーン５、６及び７は発酵乳に上記真菌を添加して２０時間培養したサンプルである。 FIG. 3B shows an electrophoresis pattern in the case of fermented milk. Lanes 1 and 8 in FIG. 3B are DNA markers (φ × 174 Hae III digest, manufactured by TaKaRa Bio). Lane 2 is a negative control to which no template DNA is added, and lane 3 is a sample cultured for 20 hours without adding yeast. Lane 4 is the one obtained by adding 200 pg of purified DNA of Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain (Positive control). Lanes 5, 6 and 7 are samples obtained by adding the fungus to fermented milk and culturing for 20 hours.

図３（Ａ）に示すように、市販乳酸菌飲料３００mLあたり４cfu程度以上のClavispora lusitaniae NBRC 10059株（指標菌）が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品中の該真菌を増菌するための培養時間を２０時間以上に設定すれば、前記ＰＣＲ条件によってその真菌ＤＮＡを検出できることが分かった。また、同様に図３（Ｂ）に示すように、発酵乳３００mLあたり４cfu程度以上のClavispora lusitaniae NBRC 10059株（指標菌）が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品中の該真菌を増菌するための培養時間を２０時間以上に設定すれば、前記ＰＣＲによって、その真菌由来ＤＮＡを検出できることが分かった。 As shown in FIG. 3 (A), when there is about 4 cfu or more of Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain (indicator strain) per 300 mL of commercially available lactic acid bacteria beverage, the culture time for increasing the fungus in the food before DNA extraction Was set to 20 hours or longer, it was found that the fungal DNA could be detected by the PCR conditions. Similarly, as shown in FIG. 3 (B), when there is about 4 cfu or more of Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain (indicator) per 300 mL of fermented milk, the fungus in the food before DNA extraction is increased. It was found that the fungal-derived DNA can be detected by the PCR when the culture time is set to 20 hours or longer.

図１は、参考試験例の結果（電気泳動パターン）を示す図である。図１において、左側のレーン番号１−８には、特許文献１のプライマー対（Ｂ２ＦＢ４Ｒ）を使用した場合の結果が示されており、右側のレーン番号１−８には、本発明のプライマー対（Ｙ１８ｒ２３０）を使用した場合の結果が示されている。なお、図中の矢印の約260bp及び約680bpはPCR産物の大きさを示している。FIG. 1 is a diagram showing the results (electrophoresis pattern) of a reference test example. In FIG. 1, lane numbers 1-8 on the left side show the results when the primer pair (B2FB4R) of Patent Document 1 is used, and lane numbers 1-8 on the right side show the primer pair of the present invention. The results when using (Y18r230) are shown. In addition, about 260 bp and about 680 bp of the arrow in a figure have shown the magnitude | size of the PCR product. 図２は、実施例２の結果（電気泳動パターン）を示す図である。（Ａ）は、乳酸菌飲料中に存在する酵母Clavispora lusitaniae NBRC 10059株由来のＤＮＡを検出した結果を示し、（Ｂ）は、乳酸菌飲料中に存在するカビTalaromyces bacillisporus NBRC 8397株由来のＤＮＡを検出した結果を示す。なお、図中の矢印の約260bpはPCR産物の大きさを示している。FIG. 2 is a diagram showing the results (electrophoresis pattern) of Example 2. (A) shows the result of detecting DNA derived from the yeast Clavispora lusitaniae NBRC 10059 strain present in the lactic acid bacteria beverage, and (B) detected the DNA derived from the mold Talaromyces bacillisporus NBRC 8397 present in the lactic acid beverage. Results are shown. In addition, about 260 bp of the arrow in a figure has shown the magnitude | size of PCR product. 図３は、実施例３の結果（電気泳動パターン）を示す図である。（Ａ）は、乳酸菌飲料中に微量に存在する酵母由来のＤＮＡを検出した結果を示し、（Ｂ）は、発酵乳中に微量に存在する酵母由来のＤＮＡを検出した結果を示す。なお、図中の矢印の約260bpはPCR産物の大きさを示している。FIG. 3 shows the results (electrophoresis pattern) of Example 3. (A) shows the result of detecting yeast-derived DNA present in a trace amount in a lactic acid bacteria beverage, and (B) shows the result of detecting yeast-derived DNA present in a trace amount in fermented milk. In addition, about 260 bp of the arrow in a figure has shown the magnitude | size of PCR product.

Claims

配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーからなる、酵母及びカビ検出用プライマー。 A primer for detecting yeast and mold, comprising a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.

検出対象となる酵母及びカビが、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、カンディダ・ファマタ（Candida famata）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ジゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）、カンディダ・インターメディア（Candida intermedia）、クラビスポラ・ルジタニエ（Clavispora lusitaniae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・メンブラニファシエンス（Pichia membranifaciens）、ペニシリウム・オブラタム（Penicillium oblatum）、ペニシリウム・サブロサム（Penicillium sabulosum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、フサリウム・クルークウェレンス（Fusarium crookwellense）、ジェオトリカム・カンディダム（Geotrichum candidum）、アルターナリア・アルタネータ（Alternaria alternata）、アウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、クラドストリウム・クラドスポリオイドス（Cladosporium cladosporioides）、ユウロチウム・ハーバリオラム（Eurotium herbariorum）、及びタラロマイセス・バシリスポラス（Talaromyces bacillisporus）よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の酵母及びカビ検出用プライマー対。 Yeasts and molds to be detected is, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), Pichia anomala (Pichia anomala), Candida Famata (Candida famata), Debaryomyces Hansenii (Debaryomyces hansenii), Gigot Saccharomyces Seth Roukishi (Zygosaccharomyces rouxii), Candida intermedia (Candida intermedia), Kurabisupora-Rujitanie (Clavispora lusitaniae), Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces lactis), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), Pichia Men Braniff § tumefaciens (Pichia membranifaciens), Penicillium・ Oburatam (Penicillium oblatum) , Penicillium sabulosum , Aspergillus niger , Fusarium crookwellense ) , Geotrichum candidum , Alternaria alternata , Aureobasidium pullulans , Cladosporium cladosporioides , euro barium rum And at least one selected from the group consisting of Talaromyces bacillisporus and a primer pair for detecting yeast and mold according to claim 1.

検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法であって、
(1)検査対象物に含まれるＤＮＡを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、請求項１又は２に記載のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう工程、及び
(3)増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程、を含有する検出方法。 A method for detecting yeast and mold in a test object,
(1) a step of extracting DNA contained in the test object;
(2) the step (1) performing PCR using the extracted DNA as a template and using the primer pair according to claim 1 or 2, and
(3) A method for detecting the amplified DNA fragment.

検査対象物が食品である、請求項３に記載の検出方法。 The detection method of Claim 3 whose test object is a foodstuff.

請求項１又は２に記載のプライマー対を含有する、酵母及びカビ検出用キット。 A kit for detecting yeast and mold, comprising the primer pair according to claim 1 or 2.