JP6722904B2 - Method for detecting bacteria belonging to the genus Bisoclamis - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、耐熱性を有するカビの一種であるビソクラミス（Byssochlamys）属に属する菌を検出するために用いられるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにビソクラミス属に属する菌の検出キット及び検出方法に関する。 The present invention, oligonucleotide and primer pairs used to detect the fungus belonging to Byssochlamys (Byssochlamys) genus, which is a type of mold having heat resistance, as well as detection kit and method for detecting bacteria belonging to Byssochlamys genus.
カビを含む菌類は、自然界に広く分布しており、食品・清涼飲料水などの製造上問題となるような耐熱性を有する菌株や、発ガン性を有する有害なマイコトキシン等を産生する菌株等を含む。特に、１００℃以下で低温殺菌する果実缶詰やジュース、ジャムなどにおいては、耐熱性菌の殺滅が困難である。したがって、原料や製造環境などからの耐熱性菌の混入を防止するとともに、混入の可能性を客観的に評価することにより、これらの菌の管理や制御を行うことが極めて重要となる。 Fungi, including molds, are widely distributed in nature and include heat-resistant strains that cause problems in the production of foods, soft drinks, etc., and strains that produce harmful carcinogenic mycotoxins, etc. Including. In particular, in canned fruits, juices, jams and the like that are pasteurized at 100° C. or lower, it is difficult to kill heat-resistant bacteria. Therefore, it is extremely important to manage and control these bacteria by preventing contamination of the heat-resistant bacteria from raw materials and manufacturing environment and by objectively evaluating the possibility of contamination.
耐熱性菌は、一般的には、ビソクラミス（Byssochlamys）属、ハミゲラ（Hamigera）属、ネオサルトリア（Neosartorya）属、タラロマイセス（Talaromyces）属など、子のう菌に属するものが挙げられる。ビソクラミス属に属する菌のうち、ビソクラミス ファルバ（Byssochlamys fulva）、ビソクラミス ニベア（Byssochlamys nivea）、ビソクラミス ヴァールコサ（Byssochlamys verrucosa）及びビソクラミス ゾレルニア（Byssochlamys zollerniae）等は、実際に果実缶詰やジュース、ジャムなどの酸性食品から検出され、問題となる。特に、ビソクラミス ファルバとビソクラミス ニベアは、耐熱性が高いことが知られている。 Heat bacteria are generally Byssochlamys (Byssochlamys) genus Hamigera (Hamigera) genus Neosartorya (Neosartorya) genus Talaromyces (Talaromyces) genus etc., include those belonging to ascomycetes fungus. Among the bacteria belonging to the Byssochlamys genus, Byssochlamys Faruba (Byssochlamys fulva), Byssochlamys Nivea (Byssochlamys nivea), Byssochlamys Varukosa (Byssochlamys verrucosa) and Byssochlamys Zorerunia (Byssochlamys zollerniae), etc., actually fruit canning and juice, acidic foods such as jam Detected from and becomes a problem. In particular, Visoclamis farba and Visoclamis nivea are known to have high heat resistance.
そこで、特許文献１には、ビソクラミス ニベア及びビソクラミス ファルバの双方を検出可能なオリゴヌクレオチド及びプライマー対等が記載されている。また、特許文献２には、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ラガンクラリエ（Byssochlamys lagunculariae）をそれぞれ種特異的に検出可能な複数のオリゴヌクレオチド及びプライマー対等が記載されている。 Therefore, Patent Document 1 describes an oligonucleotide capable of detecting both Visoclamis nivea and Visoclamis farba, a primer pair, and the like. Further, Patent Document 2, Byssochlamys nivea, Byssochlamys Faruba, Byssochlamys Varukosa and Byssochlamys Ragankurarie (Byssochlamys lagunculariae) each species capable of specifically detecting a plurality of oligonucleotides and primers equal is described.
しかしながら、特許文献１には、実施例に係るプライマー対が、５０ｎｇ／μｌに調整されたＤＮＡ溶液をＤＮＡテンプレートとしたＰＣＲ法に用いられる旨が記載されているが（段落［0045］［0050］）、このプライマー対の検出限界については明記されていない。
また、特許文献２に記載の複数のオリゴヌクレオチドは、上記４種のビソクラミス菌を特異的に検出することができるが、その一方で、１つの検体について、各種の菌について検出処理を行わなければならず、迅速性が問題であった。
そこで、食品衛生管理を徹底するため、酸性食品等から検出され得るビソクラミス属に属する菌を、より迅速かつ精度よく検出できる方法が望まれている。
However, Patent Document 1 describes that the primer pair according to the example is used in a PCR method using a DNA solution adjusted to 50 ng/μl as a DNA template (paragraphs [0045][0050]. ), the detection limit of this primer pair is not specified.
Further, the plurality of oligonucleotides described in Patent Document 2 can specifically detect the above-mentioned four types of Bisoclamis bacteria, but on the other hand, one sample must be subjected to a detection process for various bacteria. However, promptness was a problem.
Therefore, in order to thoroughly manage food hygiene, there is a demand for a method capable of detecting bacteria belonging to the genus Bisoclamis that can be detected in acidic foods and the like more quickly and accurately.
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、ビソクラミス属に属する菌を迅速かつ精度よく検出できるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにビソクラミス属に属する菌の検出キット及び検出方法を提供することにある。 In view of the circumstances as described above, an object of the present invention is to provide an oligonucleotide and a primer pair capable of rapidly and accurately detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis, and a detection kit and a detection method for a bacterium belonging to the genus Bisoclamis. ..
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ビソクラミス属に属する菌であるビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアを特異的に、かつ感度よく検出することが可能なオリゴヌクレオチド、プライマー対、検出キット及び検出方法を見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have conducted extensive studies to achieve the above object. As a result, we found an oligonucleotide, a primer pair, a detection kit and a detection method capable of specifically and sensitively detecting Bisoclamis farva, Bisoclamis nivea, Bisoclamis varcosa and Bisoclamis zorrenia, which are fungi belonging to the genus Visoclamis, and found them. The invention was completed.
すなわち、本発明は、
（１）ビソクラミス（Byssochlamys）属に属する菌の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、
ビソクラミス ファルバ（Byssochlamys fulva）、ビソクラミス ニベア（Byssochlamys nivea）、ビソクラミス ヴァールコサ（Byssochlamys verrucosa）及びビソクラミス ゾレルニア（Byssochlamys zollerniae）のイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド。
（２）（１）に記載のオリゴヌクレオチドであって、
配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、及び配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列のうちの一方の塩基配列で表され、かつビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアの検出が可能なオリゴヌクレオチド。
（３）ビソクラミス属に属する菌の検出に用いられるプライマー対であって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドとからなり、ＰＣＲ法により、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアの検出が可能なプライマー対。
（４）（３）に記載のビソクラミス属に属する菌の検出に用いられるプライマー対であって、
配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（５）ビソクラミス属に属する菌の検出用キットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む
ビソクラミス属に属する菌の検出用キット。
（６）（５）に記載のビソクラミス属に属する菌の検出用キットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対を含む
ビソクラミス属に属する菌の検出用キット。
（７）ビソクラミス属に属する菌の検出方法であって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方のオリゴヌクレオチドを、検体に含まれる核酸にハイブリダイズさせることにより、前記検体に含まれた、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのうちの少なくとも一つを検出することを特徴とする
ビソクラミス属に属する菌の検出方法。
（８）（７）に記載のビソクラミス属に属する菌の検出方法であって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドとをプライマー対としてＰＣＲ法により前記検体のイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域の少なくとも一部を増幅することを特徴とする
ビソクラミス属に属する菌の検出方法、
である。
That is, the present invention is
(1) An oligonucleotide used for detecting a bacterium belonging to the genus Byssochlamys , comprising:
Vysoclamys farva ( Byssochlamys fulva ), Visoclamis nivea ( Byssochlamys nivea ), Visoclamis varcosa ( Byssochlamys verrucosa ), and Vysoclamys zollerniae ( Byssochlamys zollerniae ). A gene encoding an isocitrate lyase that can encode an isocitrate lyase is a gene that encodes a soybean acid lyase.
(2) The oligonucleotide according to (1),
The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, or the nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the nucleotide sequence or its complementary sequence, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Or a complementary sequence thereof, or a base sequence of the base sequence or one of the base sequences in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence or its complementary sequence, and Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Oligonucleotide capable of detecting Visochlamis varkosa and Visochlamis zorellnia.
(3) A primer pair used for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis,
An oligonucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence, and the base sequence of SEQ ID NO: 2, or An oligonucleotide represented by a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence, and the detection of Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Visoclamis varkosa and Visoclamis zorellnia is performed by the PCR method. Possible primer pairs.
(4) A primer pair used for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis according to (3),
A primer pair comprising an oligonucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2.
(5) A kit for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis, comprising:
An oligonucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence, and the base sequence of SEQ ID NO: 2, or A kit for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis containing at least one oligonucleotide of the oligonucleotides represented by the nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence.
(6) A kit for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis according to (5),
An oligonucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence, and the base sequence of SEQ ID NO: 2, or A kit for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis containing a primer pair consisting of an oligonucleotide represented by a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence.
(7) A method for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis, comprising:
An oligonucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence, and the base sequence of SEQ ID NO: 2, or By hybridizing at least one of the oligonucleotides represented by the nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence, to the nucleic acid contained in the sample, A method for detecting a bacterium belonging to the genus Visochlamis, which comprises detecting at least one of Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorrenia contained in the sample.
(8) A method for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis according to (7),
An oligonucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence, and the base sequence of SEQ ID NO: 2, or At least one of the gene regions encoding the isocitrate lyase of the sample by PCR using the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence as a primer pair. A method for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis, characterized by amplifying
Is.
本発明により、ビソクラミス属に属する菌を迅速かつ精度よく検出できるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにビソクラミス属に属する菌の検出キット及び検出方法を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide an oligonucleotide and a primer pair capable of rapidly and accurately detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis, and a kit and a method for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
＜本発明の特徴＞
本発明は、ビソクラミス属に属する菌を迅速かつ精度よく検出できるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにビソクラミス属に属する菌の検出キット及び検出方法を提供するものである。従来は、ビソクラミス属に属する菌を、網羅的に、精度よく検出することが難しかった。そこで、本発明の発明者らは、微生物の一部と植物が保持するイソクエン酸リアーゼ遺伝子に着目することで、ビソクラミス属に属する菌を属のレベルで迅速に識別・同定が可能な技術を見出した。
<Characteristics of the present invention>
The present invention provides an oligonucleotide and a primer pair capable of rapidly and accurately detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis, and a detection kit and a detection method for a bacterium belonging to the genus Bisoclamis. Conventionally, it has been difficult to comprehensively and accurately detect bacteria belonging to the genus Bisoclamis. Therefore, the inventors of the present invention have found a technique capable of rapidly identifying and identifying a bacterium belonging to the genus Bisoclamis at the level of the genus by focusing on the isocitrate lyase gene held by a part of the microorganism and the plant. It was
＜ビソクラミス属＞
ビソクラミス属は、耐熱性を有するカビの一種であって、子のう菌に属する。子のう菌は、子のう胞子という、硬い種子がさらに硬い殻に包まれたような強固な状態で土壌中に広く存在する菌である。ビソクラミス属のカビの中には、９０℃以上でも耐熱性を有するものがいるため、１００℃以下の低温で殺菌することが一般的な果実缶詰やジャム等の果実加工食品、あるいはジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水の製造上、問題となる。
<Visokuramis>
The genus Visoclamis is a type of heat-resistant mold and belongs to ascomycetes. Ascomycetes are ascospores, which are widely present in soil in a solid state where hard seeds are further wrapped in hard shells. Since some molds of the genus Bisoclamis have heat resistance even at 90°C or higher, sterilized at a low temperature of 100°C or lower, fruit processed foods such as canned fruit and jam are generally used, or juice and green tea beverages. It is a problem in the production of soft drinks.
＜ビソクラミス属に属する菌＞
ビソクラミス属に属する菌は、具体的には、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニア、ビソクラミス ラガンクラリエ等が挙げられる。
なお、本発明において、「菌」とは、真菌のことをいうものとする。
また、以下の説明において、「ビソクラミスに属する菌」を単に「ビソクラミス属菌」ともいうものとする。
<Bacteria belonging to the genus Bisoclamis>
Specific examples of the bacterium belonging to the genus Visochlamis include Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorellnia, Visochlamis laganclarie and the like.
In addition, in this invention, a "fungus" shall mean a fungus.
In addition, in the following description, "a bacterium belonging to Bisoclamis" is simply referred to as "Bisoclamis bacterium".
＜ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニア＞
本発明では、ビソクラミス属に属する菌である、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアを検出する技術を提供する。これらの菌は、いずれも果実缶詰やジャム等の果実加工食品、あるいはジュースや緑茶飲料等から検出され、パツリン等のカビ毒を産生して食品のカビ汚染の原因となる。さらに、これらの菌は耐熱性を有しており、特にビソクラミス ファルバ及びビソクラミス ニベアは耐熱性が高く、低温加熱による殺滅が難しい。
このため、これらの菌を網羅的に、かつ精度よく検出することは、食品の安全性を確保する上でもきわめて重要である。
<Visoklamis Farba, Visoklamis Nivea, Visoklamis Varkosa and Visoklamis Zorrenia>
The present invention provides a technique for detecting Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Visoclamis varkosa and Visoclamis zorrenia, which are fungi belonging to the genus Visoclamis. All of these bacteria are detected in processed fruit foods such as canned fruits and jams, juices and green tea beverages, etc., and produce mold venom such as patulin, which causes mold contamination of foods. Furthermore, these bacteria have heat resistance, and in particular Visoclamis farba and Visoclamis nivea have high heat resistance and are difficult to be killed by low temperature heating.
Therefore, comprehensive and accurate detection of these bacteria is extremely important for ensuring food safety.
＜オリゴヌクレオチド＞
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡが１０塩基〜３０塩基、１５塩基〜２５塩基、さらに１８〜２０塩基結合したものをいう。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、ビソクラミス属に属する菌の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアの検出が可能なオリゴヌクレオチドである。より具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドは、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドである。
なお、「ハイブリダイズする」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが目的遺伝子領域内の特定の配列と相補的に結合することをいうものとする。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法のプライマー、ハイブリダイゼーション法の核酸プローブ、固相担体に結合された捕捉プローブ等、分子生物学的な種々の検出方法に用いることができる。また、核酸プローブの一例としては、本発明のオリゴヌクレオチドが基板上に高密度に配置されたＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を挙げることができる。
なお、本発明のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法に用いる場合には、少なくとも一方のプライマーに本発明に係るオリゴヌクレオチドを用いればよく、他方のプライマーを他のオリゴヌクレオチドとすることも可能である。
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、標識化されずに用いられてもよいし、放射性物質や蛍光・発光物質、酵素や酵素基質等の標識物によって標識化して核酸プローブやプライマーとして用いることもできる。
<Oligonucleotide>
The oligonucleotide according to the present invention refers to, for example, DNA in which 10 to 30 bases, 15 to 25 bases, and further 18 to 20 bases are bound. The oligonucleotide according to the present invention is an oligonucleotide used for detecting a bacterium belonging to the genus Visochlamis, and is an oligonucleotide capable of detecting Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorellnia. More specifically, the oligonucleotide of the present invention is an oligonucleotide capable of hybridizing to the gene region encoding the isocitrate lyase of Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa, and Visochlamis zorrenia.
In addition, "hybridize" means that the oligonucleotide of the present invention complementarily binds to a specific sequence in the target gene region.
The oligonucleotide of the present invention can be used in various molecular biological detection methods such as a primer for PCR (polymerase chain reaction), a nucleic acid probe for hybridization, a capture probe bound to a solid phase carrier, and the like. Further, as an example of the nucleic acid probe, a DNA chip (DNA microarray) in which the oligonucleotide of the present invention is densely arranged on a substrate can be mentioned.
When the oligonucleotide of the present invention is used in the PCR method, the oligonucleotide of the present invention may be used for at least one primer, and the other primer may be another oligonucleotide.
The oligonucleotide according to the present invention may be used without being labeled, or may be labeled with a labeling substance such as a radioactive substance, a fluorescent/luminescent substance, an enzyme or an enzyme substrate and used as a nucleic acid probe or a primer.
＜イソクエン酸リアーゼ＞
イソクエン酸リアーゼは、グリオキシル酸回路の反応を触媒する酵素の一つであり、グリオキシル酸回路に特有の酵素である。グリオキシル酸回路は、微生物の一部や植物に見られる代謝回路であり、イソクエン酸からリンゴ酸とコハク酸を生成し、さらにオキサロ酢酸を生成することができる。（"Life and death in a macrophage: role of the glyoxylate cycle in virulence" Eukaryotic Cell, 2002, vol.1 (5) , pp.657-662 参照）
図１は、グリオキシル酸回路の反応を示す図である。同図に示すように、イソクエン酸リアーゼ（Isocitrate Lyase）は、イソクエン酸（Isocitrate）からグリオキシル酸（Glyoxylate）を生成する反応を触媒する。
<Isocitrate lyase>
Isocitrate lyase is one of the enzymes that catalyze the reaction of the glyoxylate cycle, and is an enzyme unique to the glyoxylate cycle. The glyoxylic acid cycle is a metabolic circuit found in some microorganisms and plants, and is capable of producing malic acid and succinic acid from isocitric acid and further producing oxaloacetic acid. (See "Life and death in a macrophage: role of the glyoxylate cycle in virulence" Eukaryotic Cell, 2002, vol.1 (5), pp.657-662)
FIG. 1 is a diagram showing the reaction of the glyoxylic acid cycle. As shown in the figure, isocitrate lyase catalyzes the reaction of producing glyoxylate from isocitrate.
＜イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域＞
イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域は、本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対がハイブリダイズすることが可能な遺伝子領域である。なお以下の説明において、「イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子」を単に「イソクエン酸リアーゼ遺伝子」ともいうものとする。
<Gene region encoding isocitrate lyase>
The gene region encoding isocitrate lyase is a gene region capable of hybridizing with the oligonucleotide and the primer pair according to the present invention. In the following description, the "gene encoding isocitrate lyase" is also simply referred to as "isocitrate lyase gene".
＜オリゴヌクレオチド：塩基配列＞
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、及び配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列のうちの一方の塩基配列で表される。
配列番号１及び２に記載の塩基配列は、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのイソクエン酸リアーゼ遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。
配列番号１，２に記載の塩基配列は、以下のように探索された。
まず、ビソクラミス属に属する菌のイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域と予測される領域をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、シーケンス解析等によりその増幅産物の塩基配列を解析した。続いて、解析された塩基配列がアスペルギルス（Aspergillus）属、フサリウム（Fusarium）属、ニューロスポラ（Neurospora）属等のイソクエン酸リアーゼ遺伝子と比較的高い相同性を示すことを確認し、増幅産物がそれぞれビソクラミス属に属する菌のイソクエン酸リアーゼ遺伝子であると推認した。続いて、解析された塩基配列に基づいて配列番号１，２の塩基配列のプライマーを含む複数のプライマー対を設計し、これらのプライマー対がＰＣＲ法によりビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアを特異的に検出可能か否か検討した。その結果、後述するように、上記プライマー対により上記ビソクラミス属に属する菌が特異的に検出されることが確認され、配列番号１，２に記載の塩基配列を見出した。
<Oligonucleotide: nucleotide sequence>
The oligonucleotide of the present invention comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, or the nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence or its complementary sequence, and SEQ ID NO: It is represented by the base sequence described in 2 or its complementary sequence, or one of the base sequences in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence or its complementary sequence.
The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 are nucleotide sequences complementary to the predetermined nucleotide sequences in the isocitrate lyase genes of Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Visoclamis varcosa and Visoclamis zolernia.
The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 were searched as follows.
First, a region predicted to be an isocitrate lyase gene region of a bacterium belonging to the genus Bisoclamis was amplified by the PCR method, and the base sequence of the amplified product was analyzed by sequence analysis or the like. Subsequently, the analyzed base sequence Aspergillus (Aspergillus) genus Fusarium (Fusarium) genus, confirmed to show a relatively high homology to the isocitrate lyase gene of Neurospora (Neurospora) genus, etc., the amplification product, respectively It was presumed to be the isocitrate lyase gene of a bacterium belonging to the genus Bisoclamis. Subsequently, a plurality of primer pairs including the primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 were designed based on the analyzed nucleotide sequences, and these primer pairs were subjected to PCR by Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Visoclamis varkosa and Visoclamis zorellnia. Was examined whether it could be specifically detected. As a result, as described below, it was confirmed that the above-mentioned primer pair specifically detected the bacteria belonging to the genus Bisoclamis, and the base sequences described in SEQ ID NOS: 1 and 2 were found.
＜相補配列＞
本発明に係る相補配列とは、ある塩基配列の相補鎖となり得る塩基配列をいう。配列番号１及び２に記載の塩基配列の相補配列は、配列番号１及び２に記載の塩基配列と同様に、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることが可能である。
したがって、本発明に係る相補配列は、本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対として用いられ得る。
<Complementary sequence>
The complementary sequence according to the present invention refers to a base sequence that can be a complementary chain of a certain base sequence. The complementary sequences of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are similar to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, specifically in the isocitrate lyase gene region of Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zolernia. It is possible to hybridize.
Therefore, the complementary sequence according to the present invention can be used as the oligonucleotide and primer pair according to the present invention.
＜塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列＞
本発明において「塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、当該塩基配列若しくはその相補配列と実質的に相同な塩基配列をいう。より具体的には、１〜３個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列をいうものとする。
<A base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence or its complementary sequence>
In the present invention, the "base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence or its complementary sequence" refers to a base sequence substantially homologous to the base sequence or its complementary sequence. More specifically, it refers to a base sequence in which 1 to 3 bases are deleted, substituted or added.
＜プライマー対＞
本発明に係るプライマー対は、２本のオリゴヌクレオチドの組み合わせであり、ＰＣＲ法におけるプライマー対として用いられるものである。本発明に係るプライマー対は、ビソクラミス属に属する菌の検出に用いられるプライマー対であって、より具体的には、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアの検出が可能なものである。
本発明に係るプライマー対は、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域の少なくとも一部をＰＣＲ法により増幅することが可能なものである。
すなわち、本発明に係るプライマー対の各プライマーは、イソクエン酸リアーゼ遺伝子領域内の増幅予定領域の、２本鎖ＤＮＡの両鎖の３´側にハイブリダイズすることが可能に構成される。
本発明に係るプライマー対は、典型的には、そのままプライマー対として使用されるが、標識物で標識化して用いることもできる。また、本発明のプライマー対は、例えば、５〜２０μＭ、さらに８〜１２μＭの濃度に調製し、ＰＣＲ法に用いることができる。なお、ＰＣＲ法の詳細については後述する。
<Primer pair>
The primer pair according to the present invention is a combination of two oligonucleotides and is used as a primer pair in the PCR method. The primer pair according to the present invention is a primer pair used for detection of a bacterium belonging to the genus Visochlamis, and more specifically, a primer pair capable of detecting Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorrenia.
The primer pair according to the present invention is capable of amplifying at least a part of the isocitrate lyase gene region of Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorrenia by the PCR method.
That is, each primer of the primer pair according to the present invention is configured to be capable of hybridizing to the 3′ side of both strands of the double-stranded DNA in the amplification amplification region in the isocitrate lyase gene region.
The primer pair according to the present invention is typically used as it is as a primer pair, but it may be labeled with a label before use. Further, the primer pair of the present invention can be prepared in a concentration of, for example, 5 to 20 μM, further 8 to 12 μM, and used in the PCR method. The details of the PCR method will be described later.
＜プライマー対：塩基配列＞
本発明に係るプライマー対は、配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドとからなる。
さらに、本発明に係るプライマー対は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。当該プライマー対により、ビソクラミス属に属する菌を迅速かつより精度よく検出することが可能となり、例えばテンプレートＤＮＡの濃度が１００ｐｇ／μｌ〜１ｎｇ／μｌであっても検出することが可能となる。
<Primer pair: base sequence>
The primer pair according to the present invention comprises an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence, and SEQ ID NO: The oligonucleotide represented by the base sequence described in 2 or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence.
Furthermore, the primer pair according to the present invention may be a primer pair consisting of the oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The primer pair makes it possible to detect a bacterium belonging to the genus Bisoclamis quickly and more accurately, for example, even if the concentration of the template DNA is 100 pg/μl to 1 ng/μl.
＜プライマー対：フォワードプライマー／リバースプライマー＞
本発明に係るプライマー対を用いてＰＣＲ法による増幅反応を行う場合は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
<Primer pair: forward primer/reverse primer>
When an amplification reaction by the PCR method is performed using the primer pair according to the present invention, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or one or several nucleotides in the nucleotide sequence may be deleted, substituted or added. Using the oligonucleotide represented by the base sequence as a forward primer, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence The oligonucleotide can be the reverse primer.
＜検出用キット＞
本発明に係るビソクラミス属に属する菌の検出用キットは、検体に含まれた、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのうちの少なくとも一つを検出することができる。
すなわち、本発明に係る検出キットは、配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方のオリゴヌクレオチドを含む。
本発明の検出用キットは、これらをプライマーや核酸プローブとして含み、ＰＣＲ法に用いるキットや、ハイブリダイゼーション法に用いるキット等、分子生物学的な種々の検出方法に用いるキットとして構成され得る。
具体的に、本発明に係る検出用キットは、配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対を含むものであってもよい。本発明の検出用キットを用いてＰＣＲ法により検体の増幅反応を行うことにより、ビソクラミス属に属する菌を簡便に検出することができる。
<Detection kit>
The kit for detecting a bacterium belonging to the genus Visochlamis according to the present invention can detect at least one of Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorrenia contained in a sample.
That is, the detection kit according to the present invention is represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, or the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence. At least an oligonucleotide and an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof, or a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence. Contains one oligonucleotide.
The detection kit of the present invention contains these as a primer or a nucleic acid probe, and can be configured as a kit used for various detection methods in molecular biology such as a kit used for PCR method and a kit used for hybridization method.
Specifically, the detection kit according to the present invention is an oligo represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence. A primer pair comprising a nucleotide and an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or an nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence. It may be. By carrying out an amplification reaction of a sample by the PCR method using the detection kit of the present invention, a bacterium belonging to the genus Bisoclamis can be easily detected.
＜検出方法＞
本発明に係るビソクラミス属に属する菌の検出方法は、配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方のオリゴヌクレオチドを、検体に含まれる核酸にハイブリダイズさせることにより、前記検体にビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのうちの少なくとも一つが含まれているか否か検出することを特徴とする。
例えば、本発明に係る検出方法は、配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドとをプライマー対としてＰＣＲ法により検体のイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域の少なくとも一部を増幅することを特徴としてもよい。これにより、ビソクラミス属に属する菌を簡便に検出することができる。
<Detection method>
The method for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis according to the present invention is a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence. And an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof, or a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence. By hybridizing at least one of the oligonucleotides to a nucleic acid contained in the sample, it is detected whether or not the sample contains at least one of Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Visoclamis varcosa and Visoclamis zorrenia. It is characterized by
For example, the detection method according to the present invention is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an oligonucleotide represented by a nucleotide sequence in which one or several bases in the nucleotide sequence are deleted, substituted or added, Isocitrate of a sample by PCR using the base sequence described in SEQ ID NO: 2 or the oligonucleotide represented by the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence as a primer pair. It may be characterized in that at least a part of the gene region encoding lyase is amplified. Thereby, a bacterium belonging to the genus Bisoclamis can be easily detected.
＜検出方法：ＰＣＲ法＞
本発明に係るＰＣＲ法は、例えば、テンプレートとしてＤＮＡを用いたＰＣＲ法（以下、通常のＰＣＲ法とする）、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法等を用いることができるが、通常のＰＣＲ法が好ましい。
ＰＣＲ法は、まず、テンプレートの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用反応バッファー、及び滅菌蒸留水等を混合したＰＣＲ増幅用反応液を調製する。次に、サーマルサイクラー等を用いて熱変性反応、アニーリング反応、及び伸長反応を連続して行い、これを所定サイクル繰り返すことにより、ＰＣＲ法による増幅反応を行う。そして、その反応後の反応液中の増幅産物を確認し、所望のＤＮＡ断片が増幅されているか否か確認する。テンプレートの核酸としては、後述する検体から直接核酸を抽出した溶液や、培養した菌から核酸を抽出した溶液を用いることができる。
本発明に係るＰＣＲ法におけるプライマー対は、少なくとも一方のプライマーに本発明に係るオリゴヌクレオチドを用いればよく、他方のプライマーを他のオリゴヌクレオチドとすることも可能である。より好ましくは、プライマー対として、本発明に係るプライマー対を用いることができる。上記反応液に含まれる他の要素も、濃度と量とを適宜決定することができる。ＰＣＲ法における反応条件等も、使用するポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
増幅産物の確認方法も特に限定されず、例えば、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、シーケンス解析による塩基配列を決定する方法等を適用することができる。このうち、アガロースゲル電気泳動法及びキャピラリー電気泳動法が簡便に増幅産物を確認でき、より好ましい。
<Detection method: PCR method>
As the PCR method according to the present invention, for example, a PCR method using DNA as a template (hereinafter, referred to as a normal PCR method), an RT-PCR method, a real-time PCR method, or the like can be used. Method is preferred.
In the PCR method, first, a reaction solution for PCR amplification is prepared by mixing a template nucleic acid (DNA or RNA), a primer pair, a DNA polymerase, dNTP, a reaction buffer for PCR, sterile distilled water and the like. Next, a thermal denaturation reaction, an annealing reaction, and an extension reaction are continuously performed using a thermal cycler or the like, and the amplification reaction by the PCR method is performed by repeating this for a predetermined cycle. Then, the amplification product in the reaction solution after the reaction is confirmed to confirm whether or not the desired DNA fragment is amplified. As the nucleic acid of the template, a solution in which nucleic acid is directly extracted from a sample described later or a solution in which nucleic acid is extracted from cultured bacteria can be used.
For the primer pair in the PCR method according to the present invention, the oligonucleotide according to the present invention may be used for at least one primer, and the other primer may be another oligonucleotide. More preferably, the primer pair according to the present invention can be used as the primer pair. The concentration and amount of the other elements contained in the reaction solution can be appropriately determined. The reaction conditions and the like in the PCR method can also be appropriately determined in consideration of the type of polymerase used and the like.
The method for confirming the amplification product is not particularly limited, and for example, agarose gel electrophoresis method, capillary electrophoresis method, a method of determining the base sequence by sequence analysis, etc. can be applied. Among these, the agarose gel electrophoresis method and the capillary electrophoresis method are more preferable because the amplification product can be easily confirmed.
＜検出方法：検体から抽出された核酸を用いて検出する方法＞
本発明に係る検出方法は、検体から抽出された核酸を用いて、ビソクラミス属に属する菌を検出することができる。すなわち、検体から抽出された核酸に、配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
また、検体からの核酸の抽出方法は特に限定されず、例えば、製造原料等の検体から菌を培養し、培養した菌からＤＮＡ等の核酸を抽出してもよい。あるいは、製造原料等の検体から直接核酸を抽出してもよい。
また、ＰＣＲ法においては、上記抽出された核酸をテンプレートとして用いることができる。当該核酸がＤＮＡの場合、テンプレートＤＮＡの濃度は、１００ｐｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌであってもよく、好ましくは１０ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌであってもよい。
<Detection method: Detection method using nucleic acid extracted from sample>
The detection method according to the present invention can detect a bacterium belonging to the genus Bisoclamis using a nucleic acid extracted from a sample. That is, the nucleic acid extracted from the sample is represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence. At least an oligonucleotide and an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof, or a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence. One oligonucleotide is hybridized.
The method for extracting nucleic acid from a sample is not particularly limited, and for example, bacteria may be cultured from a sample such as a manufacturing raw material, and nucleic acids such as DNA may be extracted from the cultured bacteria. Alternatively, the nucleic acid may be directly extracted from a sample such as a manufacturing raw material.
In the PCR method, the extracted nucleic acid can be used as a template. When the nucleic acid is DNA, the concentration of the template DNA may be 100 pg/μl to 100 ng/μl, preferably 10 ng/μl to 50 ng/μl.
＜検出方法：検体＞
本発明に係る検体としては、ビソクラミス属菌の可能性がある菌株や、ビソクラミス属菌を含んでいる可能性がある製造原料等が挙げられる。製造原料等は、食品の製造原料等が挙げられる。当該食品は、例えば、ビソクラミス属菌による汚染が問題となる、果実缶詰やジャム等の果実加工食品、ジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水等であってもよい。
<Detection method: sample>
Examples of the sample according to the present invention include strains that may be Bissoclamis spp., manufacturing raw materials that may contain Bissoclamis spp. Examples of the manufacturing raw material and the like include food manufacturing raw material and the like. The food may be, for example, fruit processed foods such as canned fruits and jams, soft drinks such as juice and green tea beverages, in which contamination with Visoclamis spp.
＜本発明の作用効果＞
本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対は、ビソクラミス属菌のイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域に特異的にハイブリダイズすることにより、ビソクラミス属菌を属のレベルで識別・同定することができる。これにより、ビソクラミス属菌各々に対して検出を行う手間を省き、検体に、ビソクラミス属菌のうちの少なくとも一種が含まれているか否か、迅速に判定することが可能となる。
また、上述のように、ビソクラミス属菌は、果実加工食品や清涼飲料水から検出される可能性が高く、特にビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベアは、耐熱性が高く殺滅が難しい。したがって、ビソクラミス属菌が検出された場合は、加熱殺菌工程の見直しだけでなく、製造原料の除去や製造環境の見直し等の処置を迅速に行う必要が生じる。本発明によれば、ビソクラミス属菌を迅速に検出することができるため、上記処置の実行を迅速かつ適切に判断することが可能となり、汚染の拡大を防止することができる。
これに加えて、本発明の検出方法は、検出限界に優れている。例えば、ＰＣＲ法では、後述の試験例２に示すように、テンプレートＤＮＡの濃度が１００ｐｇ／μｌ〜１ｎｇ／μｌ程度であっても上記各菌を検出することができる。したがって、製造原料からわずかな量の菌しか採取できなかった場合でも検出可能となり、衛生管理の徹底に貢献することが可能となる。
<Operation and effect of the present invention>
By specifically hybridizing the oligonucleotide and the primer pair according to the present invention to the isocitrate lyase gene region of the bacterium of the genus Bisoclamis, the bacterium of the genus Bisoclamis can be identified and identified at the genus level. Accordingly, it is possible to save the time and effort for detecting each bacterium of the genus Bisoclamis and quickly determine whether or not the sample contains at least one of the bacteria of the genus Bisoclamis.
In addition, as described above, Bisoclamis spp. are likely to be detected in processed fruit foods and soft drinks. In particular, Visoclamis farba and Visoclamis nivea have high heat resistance and are difficult to kill. Therefore, when a bacterium belonging to the genus Bisoclamis is detected, it is necessary to promptly perform not only the review of the heat sterilization process but also the removal of the production raw material and the review of the production environment. According to the present invention, since it is possible to detect Visoclamis spp. rapidly, it becomes possible to quickly and appropriately determine the execution of the above treatment, and it is possible to prevent the spread of contamination.
In addition to this, the detection method of the present invention is excellent in the detection limit. For example, in the PCR method, as shown in Test Example 2 to be described later, each of the above-mentioned bacteria can be detected even if the concentration of the template DNA is about 100 pg/μl to 1 ng/μl. Therefore, even if only a small amount of bacteria can be collected from the manufacturing raw material, it can be detected, which can contribute to thorough hygiene control.
以下、本発明を実施例等に基づき、さらに説明する。 Hereinafter, the present invention will be further described based on Examples and the like.
［プライマー対の作成］
配列番号１及び２の塩基配列を有するＰＣＲ増幅反応用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、イソクエン酸リアーゼ遺伝子をターゲットとして作成したものである。各プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表１に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。このプライマー対を、以下、実施例に係るプライマー対とする。
[Creation of primer pairs]
A primer pair for PCR amplification reaction having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 was prepared. These primers were created by targeting the isocitrate lyase gene. Each primer was synthesized by Operon Biotechnology Co., Ltd. Table 1 shows the base sequences of the prepared primer pairs. Hereinafter, this primer pair will be referred to as a primer pair according to the example.
［試験例１］
試験例１として、実施例に係るプライマー対を用いて、検体である菌からビソクラミス属菌（ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニア）を特異的に検出できるか否か確認した。
[Test Example 1]
As Test Example 1, using the primer pair according to the example, it was confirmed whether or not Bisoclamis spp. (Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorellnia) can be specifically detected from the sample bacteria.
（検体の調製）
まず、検体からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液を調製した。検体としては、表２〜表５に示す菌株を用いた。このうち、表２の１１〜１７番はビソクラミス ファルバに属する菌株である。同表の１８〜２２番はビソクラミス ニベアに属する菌株である。同表の２３番はビソクラミス ラガンクラリエに属する菌株である。同表の２４番は、ビソクラミス属のいずれかの種に属する菌株である。同表の２５番は、ビソクラミス ヴァールコサに属する菌株である。同表の２６番は、ビソクラミス ゾレルニアに属する菌株である。その他の菌株は、ビソクラミス属以外の属に属する菌株である。これらの菌株は、例えば、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）及び独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（NBRC）等から入手した。
各菌株を、ＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）培地等にて、約２５〜３０℃、７〜１０日間培養した。回収した菌株から、ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep（ZYMO RESEARCH製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、殺菌水を用いて１０〜５０ｎｇ／μｌの濃度のＤＮＡ溶液として調製した。
(Preparation of sample)
First, DNA was extracted from a sample to prepare a DNA solution. The strains shown in Tables 2 to 5 were used as the samples. Of these, Nos. 11 to 17 in Table 2 are strains belonging to Visoclamis farba. The numbers 18 to 22 in the table are strains belonging to Visoclamis nivea. The number 23 in the table is a strain belonging to Bisoclamis laganclarie. The number 24 in the table is a strain belonging to any species of the genus Bisoclamis. The number 25 in the table is a strain belonging to Visoclamis varcosa. No. 26 in the table is a strain belonging to Visochlamis zorellnia. The other strains are strains belonging to genera other than Bisoclamis. These strains were obtained from, for example, RIKEN BioResource Center Microorganism Material Development Office (JCM), Incorporated Administrative Agency Product Evaluation Technology Foundation Biotechnology Center (NBRC), etc.
Each strain was cultured in a PDA (Potato Dextrose Agar) medium or the like at about 25 to 30° C. for 7 to 10 days. DNA was extracted from the recovered strain using ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (manufactured by ZYMO RESEARCH) according to the attached protocol. The extracted DNA was prepared as a DNA solution with a concentration of 10 to 50 ng/μl using sterile water.
（ＰＣＲ法による遺伝子増幅）
続いて、調整した１３１種類のＤＮＡ溶液と実施例に係るプライマー対とをそれぞれ用いて、ＰＣＲ法によりビソクラミス属菌の検出を行った。
(Gene amplification by PCR method)
Subsequently, the 131 types of the prepared DNA solutions and the primer pairs according to the examples were used to detect Bisoclamis spp. by the PCR method.
まず、各ＰＣＲ増幅用反応液を調製した。表６に、当該反応液の組成を示す。
ＰＣＲ増幅用反応液は、表６に示すように、8.4 μlの殺菌水（S.D.W）、1 μｌのテンプレートＤＮＡ（Template DNA）、0.3 μlのフォワードプライマー（Primer-F）、0.3 μlのリバースプライマー（Primer-R）、10 μlのQuick Taq（登録商標）をそれぞれ含み、全体で20 μlとなるように調整された。
なお、テンプレートＤＮＡは、「検体の調製」で調製した各ＤＮＡ溶液とした。「Quick Taq（登録商標）」は、「Quick Taq（登録商標） HS DyeMix」（東洋紡株式会社製）であり、ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA Polymerase）、ＰＣＲ用反応バッファー、ｄＮＴＰが予め混合されているＰＣＲ用試薬である。また、フォワードプライマーは配列番号１の塩基配列を有するプライマー、リバースプライマーは配列番号２の塩基配列を有するプライマーとした。なお、各ＰＣＲ増幅用反応液は、テンプレートＤＮＡの塩基配列のみ異なるものとし、その他の組成は同一である。
First, reaction solutions for PCR amplification were prepared. Table 6 shows the composition of the reaction solution.
As shown in Table 6, the PCR amplification reaction solution contained 8.4 μl of sterilized water (SDW), 1 μl of template DNA (Template DNA), 0.3 μl of forward primer (Primer-F), and 0.3 μl of reverse primer ( Primer-R) and 10 μl of Quick Taq (registered trademark), respectively, and adjusted to a total of 20 μl.
The template DNA was each DNA solution prepared in "Preparation of sample". "Quick Taq (registered trademark)" is "Quick Taq (registered trademark) HS DyeMix" (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and PCR in which DNA polymerase (Taq DNA Polymerase), PCR reaction buffer, and dNTP are mixed in advance. It is a reagent. The forward primer was a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer was a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 2. The reaction solutions for PCR amplification differ only in the base sequence of the template DNA, and the other compositions are the same.
次に、調製したＰＣＲ増幅用反応液について、サーマルサイクラーを用い、遺伝子増幅処理を行った。表７に、遺伝子増幅処理の条件を示す。
当該処理の条件は、表７に示すように、（１）９４℃で２分間の熱変性反応、（２）９４℃で３０秒の熱変性反応、（３）６４℃で２０秒のアニーリング反応、（４）６８℃で１５秒の伸長反応、（５）６８℃で５分の伸長反応とし、（２）〜（４）を２５サイクル行った。
Next, the PCR amplification reaction solution thus prepared was subjected to gene amplification treatment using a thermal cycler. Table 7 shows the conditions for gene amplification treatment.
The conditions of the treatment are, as shown in Table 7, (1) thermal denaturation reaction at 94° C. for 2 minutes, (2) thermal denaturation reaction at 94° C. for 30 seconds, and (3) annealing reaction at 64° C. for 20 seconds. , (4) extension reaction at 68° C. for 15 seconds and (5) extension reaction at 68° C. for 5 minutes, and (2) to (4) were performed for 25 cycles.
（ＰＣＲ増幅産物の確認）
続いて、ＰＣＲ増幅用反応液から５〜１０μｌを分取し、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。バッファーは、１×ＴＡＥバッファーを用いた。電気泳動後、アガロースゲルを常法に従って染色し、紫外線（ＵＶ）ライトボックス上にてアガロースゲルを撮像した。撮像された画像に基づいてＰＣＲ増幅産物を確認した。
(Confirmation of PCR amplification product)
Subsequently, 5 to 10 μl was taken from the PCR amplification reaction solution and electrophoresed on an agarose gel having a concentration of 1.3% (1 to 1.5%). As the buffer, 1×TAE buffer was used. After electrophoresis, the agarose gel was stained according to a conventional method, and the agarose gel was imaged on an ultraviolet (UV) light box. The PCR amplification product was confirmed based on the imaged image.
（結果）
図２〜図７は、実施例の電気泳動像である。
図２は、表２の１１〜２６番の菌株の結果、すなわちビソクラミス属菌の結果を示し、図中のレーン番号１〜１６は、それぞれ表２の１１〜２６番に対応する。
図３は、表２及び表３の１〜１０番、２７〜３９番の菌株の結果を示し、図中のレーン番号１〜２３は、それぞれ表２及び表３の１〜１０番、２７〜３９番に対応する。
図４は、表３の４０〜６２番の菌株の結果を示し、図中のレーン番号１〜２３は、それぞれ表３の４０〜６２番に対応する。
図５は、表３及び表４の６３〜８５番の菌株の結果を示し、図中のレーン番号１〜２３は、それぞれ表３及び表４の６３〜８５番に対応する。
図６は、表４及び表５の８６〜１０８番の菌株の結果を示し、図中のレーン番号１〜２３は、それぞれ表４及び表５の８６〜１０８番に対応する。
図７は、表５の１０９〜１３１番の菌株の結果を示し、図中のレーン番号１〜２３は、それぞれ表５の１０９〜１３１番に対応する。
上記各図におけるＭのレーンは、いずれもサイズマーカーを示す。
(result)
2 to 7 are electrophoretic images of Examples.
FIG. 2 shows the results for the strains Nos. 11 to 26 in Table 2, that is, the results for the genus Bisoclamis, and lane numbers 1 to 16 in the figure correspond to Nos. 11 to 26 in Table 2, respectively.
FIG. 3 shows the results of strains 1 to 10 and 27 to 39 in Tables 2 and 3, and lane numbers 1 to 23 in the figure are 1 to 10 and 27 to 27 in Table 2 and Table 3, respectively. Corresponds to number 39.
FIG. 4 shows the results of the strains 40 to 62 in Table 3, and the lane numbers 1 to 23 in the figure correspond to the numbers 40 to 62 in Table 3, respectively.
FIG. 5 shows the results of the strains 63 to 85 in Tables 3 and 4, and the lane numbers 1 to 23 in the figure correspond to the numbers 63 to 85 in Tables 3 and 4, respectively.
FIG. 6 shows the results of the strains 86 to 108 in Tables 4 and 5, and the lane numbers 1 to 23 in the figure correspond to the numbers 86 to 108 in Tables 4 and 5, respectively.
FIG. 7 shows the results of the strains 109 to 131 in Table 5, and lane numbers 1 to 23 in the figure correspond to the 109 to 131 in Table 5, respectively.
The lanes of M in each of the above figures show size markers.
まず、図２に示すように、１３番のレーンを除く全てのレーンにおいて、約２００ｂｐのバンドが確認された。１〜１２、１４〜１６番のレーンに対応する菌株は、表２を参照し、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのいずれかに属する菌株である。このことから、実施例に係るプライマー対が、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアを特異的に検出可能であることが確認された。
一方で、図２に示すように、１３番のレーンにはバンドが確認されなかった。このレーンに対応する菌株は、表２を参照し、ビソクラミス ラガンクラリエに属する菌株であることから、実施例に係るプライマー対は、ビソクラミス ラガンクラリエの少なくとも一部の菌株を検出することは難しいことが確認された。
First, as shown in FIG. 2, a band of about 200 bp was confirmed in all lanes except the 13th lane. The strains corresponding to the lanes 1 to 12 and 14 to 16 are strains belonging to any of Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Visoclamis varkosa and Visoclamis zorrenia, referring to Table 2. From this, it was confirmed that the primer pair according to the example can specifically detect Visoclamis farba, Visoclamis nivea, Visoclamis varcosa and Visoclamis zollernia.
On the other hand, as shown in FIG. 2, no band was confirmed in the 13th lane. Since the strain corresponding to this lane is a strain belonging to Visoclamis laganclarie with reference to Table 2, it was confirmed that it is difficult for the primer pair according to the example to detect at least a part of the strain of Visoclamis laganclarie. It was
一方、図３〜図７に示すように、実施例に係るプライマー対は、ビソクラミス属菌以外の菌株、すなわち、ぺシロマイセス（Paecilomyces）属、ハミゲラ属、タラロマイセス属等に属する菌株を検出できなかった。 On the other hand, as shown in FIGS. 3 to 7, the primer pair according to the example was unable to detect strains other than Bisoclamis spp., that is, strains belonging to the genus Paecilomyces, the genus Hamigella, the genus Talaromyces, and the like. ..
試験例１の結果により、実施例に係るプライマー対は、ビソクラミス属菌、特にビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアを特異的に検出できることが確認された。また、実施例に係るプライマー対は、ビソクラミス属菌以外の菌株を検出することができなかったため、属レベルでビソクラミス属菌を識別及び同定できることが確認された。 From the results of Test Example 1, it was confirmed that the primer pair according to the Example can specifically detect Visochlamis spp., particularly Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorrenia. In addition, since the primer pair according to the example was unable to detect strains other than Bisoclamis sp., it was confirmed that Bisoclamis sp. can be identified and identified at the genus level.
［試験例２］
試験例２として、実施例に係るプライマー対を用いたＰＣＲ法におけるビソクラミス属菌の検出限界を確認するため、検体から濃度の異なるＤＮＡ溶液を作成し、試験を行った。
[Test Example 2]
As Test Example 2, in order to confirm the detection limit of Bisoclamis sp. in the PCR method using the primer pair according to the example, DNA solutions having different concentrations were prepared from the sample and tested.
（検体の調製）
まず、検体からＤＮＡを抽出し、濃度の異なるＤＮＡ溶液を調製した。検体としては、ビソクラミス ファルバ ＮＢＲＣ３１７６７株と、ビソクラミス ニベアＪＣＭ１２８０６株とを用いた。これらの菌株の入手元は、試験例１と同様である。
(Preparation of sample)
First, DNA was extracted from a sample to prepare DNA solutions having different concentrations. As samples, Bisoclamis farva NBRC31767 strain and Bisoclamis nivea JCM12806 strain were used. The sources of these strains are the same as in Test Example 1.
各菌株から、試験例１と同様にＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、表８に示す濃度のＤＮＡ溶液として調製し、それぞれ試料１〜５とした。すなわち、試料１は１０ｎｇ／μｌ、試料２は１ｎｇ／μｌ、試料３は１００ｐｇ／μｌ、試料４は１０ｐｇ／μｌ、試料５は１ｐｇ／μｌである。 DNA was extracted from each strain in the same manner as in Test Example 1. The extracted DNA was prepared as a DNA solution having the concentration shown in Table 8 and used as samples 1 to 5, respectively. That is, the sample 1 is 10 ng/μl, the sample 2 is 1 ng/μl, the sample 3 is 100 pg/μl, the sample 4 is 10 pg/μl, and the sample 5 is 1 pg/μl.
（ＰＣＲ法による遺伝子増幅）
続いて、試料１〜５のＤＮＡ溶液と実施例に係るプライマー対とを用いたＰＣＲ法により、ビソクラミス属菌の検出を行った。本工程は、試験例１と同様であるため、説明を省略する。
(Gene amplification by PCR method)
Then, the bacterium of the genus Bisoclamis was detected by the PCR method using the DNA solutions of Samples 1 to 5 and the primer pair according to the example. This step is the same as in Test Example 1, and therefore its explanation is omitted.
（ＰＣＲ増幅産物の確認）
続いて、ＰＣＲ増幅産物を確認するため、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。本工程も、試験例１と同様であるため、その説明を省略する。
(Confirmation of PCR amplification product)
Subsequently, in order to confirm the PCR amplification product, electrophoresis was performed on an agarose gel having a concentration of 1.3% (1 to 1.5%). This step is also the same as in Test Example 1, and therefore its description is omitted.
（結果）
図８は、試験例２の電気泳動像であり、図８Ａは検体としてビソクラミス ファルバの菌株を用いた結果、図８Ｂは検体としてビソクラミス ニベアの菌株を用いた結果を示す。なお、図８の電気泳動像に付した各レーンの番号と、表８に示す各試料の番号とはそれぞれ対応している。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
(result)
FIG. 8 is an electrophoretic image of Test Example 2. FIG. 8A shows a result using a Visoclamis farba strain as a sample, and FIG. 8B shows a result using a Visoclamis nivea strain as a sample. The number of each lane given to the electrophoretic image of FIG. 8 corresponds to the number of each sample shown in Table 8. Lane M shows size markers.
図８Ａ、図８Ｂにおいて、いずれも、試料のＤＮＡ濃度が薄くなるに従い、バンドの蛍光強度が低下する様子が観察された。これにより、実施例に係るプライマー対が、ビソクラミス ファルバ及びビソクラミス ニベアを特異的に検出可能なことが改めて確認された。加えて、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１０ｎｇ／μｌ，１ｎｇ／μｌの試料１，２のバンドは確認でき、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１００ｐｇ／μｌ〜１ｐｇ／μｌの試料３〜５のバンドは確認することができなかった。このことから、実施例１に係るプライマー対の検出限界は、検体から調製したＤＮＡ濃度にして１００ｐｇ／μｌ〜１ｎｇ／μｌであることが確認された。 8A and 8B, it was observed that the fluorescence intensity of the band decreased as the DNA concentration of the sample decreased. From this, it was confirmed again that the primer pair according to the example can specifically detect Visoclamis farba and Visoclamis nivea. In addition, bands of Samples 1 and 2 having DNA concentrations of 10 ng/μl and 1 ng/μl, respectively, could be confirmed, but bands of Samples 3 to 5 having DNA concentrations of 100 pg/μl to 1 pg/μl, respectively, could not be confirmed. It was From this, it was confirmed that the detection limit of the primer pair according to Example 1 was 100 pg/μl to 1 ng/μl in terms of the DNA concentration prepared from the sample.
試験例２の結果から、実施例に係るプライマー対は、検出限界が低く、検出感度が高いことが確認された。したがって、実施例に係るプライマー対は、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法等の煩雑な処理を行うことなく、環境中に微量に存在するビソクラミス属菌を簡便に検出することができる。 From the results of Test Example 2, it was confirmed that the primer pair according to Example had a low detection limit and a high detection sensitivity. Therefore, the primer pair according to the example can easily detect a bacterium belonging to the genus Visochlamis in a small amount in the environment without performing a complicated process such as the nested PCR method.
Claims (2)
配列番号１に記載の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド、及び配列番号２に記載の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方のオリゴヌクレオチドを、検体に含まれる核酸にハイブリダイズさせ、
前記オリゴヌクレオチドが前記核酸にハイブリダイズした場合に、前記検体に、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのうちの少なくとも一つが含まれていると判定する
ことを特徴とする
ビソクラミス属に属する菌の検出方法。 A detection method for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis at a genus level,
Oligonucleotides represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and at least one of the oligonucleotides of the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, is hybridized to a nucleic acid contained in the specimen,
When the oligonucleotide hybridizes to the nucleic acid, it is determined that the sample contains at least one of Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorrenia. Bacteria detection method.
前記核酸にハイブリダイズさせる工程では、配列番号１に記載の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記載の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドとをプライマー対としてＰＣＲ法により前記検体のイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域における少なくとも一部を増幅し、
前記遺伝子領域の少なくとも一部が増幅された場合に、前記検体に、ビソクラミス ファルバ、ビソクラミス ニベア、ビソクラミス ヴァールコサ及びビソクラミス ゾレルニアのうちの少なくとも一つが含まれていると判定する
ビソクラミス属に属する菌の検出方法。 A method for detecting a bacterium belonging to the genus Bisoclamis according to claim 1,
In the step of hybridizing to said nucleic acid, an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 by the PCR method and the oligonucleotide as a primer pair represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the specimen Amplifying at least a part of the gene region encoding isocitrate lyase,
A method for detecting a bacterium belonging to the genus Visochlamis, which is determined to include at least one of Visochlamis farba, Visochlamis nivea, Visochlamis varkosa and Visochlamis zorrenia, when at least a part of the gene region is amplified. ..
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