KR102266991B1 - Primer set for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides - Google Patents

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Abstract

본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 김치 등의 발효식품 등에서 발견되는 유산균인 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치 내 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.The present invention relates to a marker for specific detection and selection of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides and an analysis method using the same, and Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, a lactic acid bacteria found in fermented foods such as kimchi, etc. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides can be quantitatively and qualitatively analyzed through a primer set capable of specifically detecting Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. , It is possible to monitor the density change of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides in Kimchi.

Description

류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스 판별용 프라이머 세트{Primer set for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides}A primer set for discriminating Leuconostoc mesenteroides subspecies Mesenteroides {Primer set for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides}

본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스 특이 검출 및 선발을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for the specific detection and selection of Leukonostok mecenteroides subspecies mecenteroides and a discrimination method using the same.

젖산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품·김치류·양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 젖산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실러스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.Lactic acid bacteria are bacteria that produce lactic acid by decomposing sugars such as glucose. Also called lactic acid bacteria, the property of inhibiting the growth of pathogens and harmful bacteria by lactic acid produced by lactic acid fermentation is used in the production of foods such as dairy products, kimchi, brewed foods, etc. are doing In addition, lactic acid bacteria inhabit the intestines of mammals to prevent abnormal fermentation by various bacteria, and thus are also used as intestinal agents. The lactic acid bacteria are Gram-positive bacteria, have facultative anaerobic or anaerobic properties, and several types are known in the genera Lactobacillus and Streptococcus.

김치는 유산균(젖산균)에 의하여 발효되는 한국 전통 식품으로, 김치에서 분류된 젖산균(유산균)으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)등이 있다.Kimchi is a traditional Korean food fermented by lactic acid bacteria, and the lactic acid bacteria classified in kimchi include Leuconostoc mesenteroides , Leuconostoc dextranicum , Lactobacillus. Brevis ( Lactobacillus brevis ), Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Pediococcus pentosacus ( Pediococcus pentosacues ), Lactobacillus fermentum ( Lactobacillus fermentum ), Lactobacillus paracasei , and the like.

일반적으로 김치가 발효되면서 발효 초기에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)를 포함한 류코노스톡들이 우세하게 증식하여 초기의 산 생성을 주도하여 김치 발효에 관여하며, 점차 pH가 감소함에 따라 처음에 왕성했던 류코노스톡 균주의 수도 감소하게 된다. 반면, 발효 후기에는 산에 내성적인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 등의 락토바실러스 균들이 활발하게 활동하여 락토바실러스 균의 수가 점차 증가하면서 김치가 시어지게 된다. In general, as kimchi is fermented, leuconostoc including leuconostoc mesenteroides proliferates predominantly at the initial stage of fermentation, leading to the initial acid production, and is involved in kimchi fermentation. The number of leuconostock strains that were active will also decrease. On the other hand, in the late fermentation period, acid- resistant Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) and Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ), such as Lactobacillus bacteria are actively active, and the number of Lactobacillus bacteria gradually increases and the kimchi becomes sour.

종래 유산균을 분석하기 위해 김치와 같은 발효물 내에 존재하는 유산균을 유산균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 그러나, 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 김치에 존재하여 발효에 중요한 역할을 하는 미생물이 시료의 준비과정이나 배양과정에서 사멸될 수 있으며, 미생물이 배양이 된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있었다. 또한, 유산균이 함유된 제품에서 유전적으로 비슷한 성질을 가지는 류코노스톡 균주를 분리 및 동정하기 위해서는 많은 시간과 비용이 필요하였다.Conventionally, in order to analyze lactic acid bacteria, the shape or number of colonies formed by smearing and culturing lactic acid bacteria present in fermented products such as kimchi under culture conditions specific to lactic acid bacteria has been confirmed. However, smear culture can measure only the number of microorganisms that can survive in artificial culture conditions, so microorganisms that are present in actual kimchi and play an important role in fermentation may be killed during sample preparation or culturing. Even if cultured, it takes some time for the strain to form colonies, and there are disadvantages of low specificity and sensitivity. In addition, it took a lot of time and money to isolate and identify leuconostok strains having genetically similar properties from products containing lactic acid bacteria.

이에 따라, 유전적 성질이 비슷한 류코노스톡 균주들을 정확하고 간단하게 동정할 수 있는 새로운 기술 개발의 필요성이 존재하였다.Accordingly, there was a need for the development of a new technology that can accurately and simply identify leukonostok strains with similar genetic properties.

대한민국공개특허 제10-2010-0126236호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2010-0126236

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다. One object of the present invention is to provide a primer set for identifying Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides comprising a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides comprising a primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a kit for determining Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides containing the composition.

본 발명의 또 다른 목적은, 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 판별방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to amplify a target sequence by using the DNA isolated from the sample as a template and performing an amplification reaction using the primer set of claim 1; And to provide a method for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides comprising the step of detecting the amplification product obtained from the amplification step.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 프라이머 세트를 제공한다. As an aspect for achieving the above object, the present invention provides a primer for identifying Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides comprising a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 provides a set.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and is a starting point for template strand copying. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as Primers are capable of initiating DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in appropriate buffers and temperatures.

본 발명의 용어 "프라이머 세트(a pair of primers)"란 판별 대상 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트를 이루어 반응하여 PCR 산물을 합성한다. 이때, 상기 정방향과 역방향 프라이머 세트가 결정되면 이로부터 합성되는 PCR 생성물의 크기를 예측할 수 있다.As used herein, the term "primer set (a pair of primers)" refers to nucleotide sequences for amplifying a gene to be discriminated by using PCR, and a forward primer and a reverse primer are set to react with one gene to be diagnosed, resulting in a PCR product to synthesize In this case, when the forward and reverse primer sets are determined, the size of a PCR product synthesized therefrom can be predicted.

상기 프라이머들은 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 LysR family transcriptional regulator(등록번호: GenBank accession protein ID AET30235.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession CP003101.3, 위치 820593-821507)를 증폭할 수 있다. The primers are a gene encoding a LysR family transcriptional regulator (registration number: GenBank accession protein ID AET30235.1) of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (GenBank accession CP003101.3, position 820593). -821507) can be amplified.

구체적으로, 상기 프라이머 세트는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 LysR family transcriptional regulator(등록번호: GenBank accession protein ID AET30235.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession CP003101.3)의 위치 820593번 내지 821507번 중에서 821291번에서 821472번에 해당하는 182bp(서열번호 3)의 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머 세트일 수 있다.Specifically, the primer set is a gene encoding a LysR family transcriptional regulator (registration number: GenBank accession protein ID AET30235.1) of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (GenBank accession CP003101. 3) may be a primer set for amplifying a nucleic acid fragment of 182bp (SEQ ID NO: 3) corresponding to positions 821291 to 821472 among positions 820593 to 821507.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 조성물을 제공한다.As another aspect, the present invention provides a composition for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides comprising a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함한다. Leuconostoc mesenteroides subspecies mesenteroides of the present invention ( Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ) The composition for discrimination comprises a primer set consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.

본 발명의 용어 "프라이머", "프라이머 세트(a pair of primers)" 에 대한 설명은 전술한 바와 같다. The description of the terms "primer" and "a pair of primers" of the present invention is the same as described above.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 키트를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a kit for identifying Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides comprising the composition.

본 발명의 판별용 키트는 PCR 분석 또는 multiplex-PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 상기 각 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.The kit for discrimination of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing PCR analysis or multiplex-PCR analysis. The kit contains, in addition to each primer set specific for each polynucleotide, a test tube or other suitable container, reaction buffer (with varying pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase , DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. In addition, identification criteria for components or known species necessary for electrophoresis that can confirm whether or not the PCR product is amplified may be additionally included in the kit of the present invention.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 판별방법을 제공한다.In another aspect, the present invention includes the steps of amplifying a target sequence by using the DNA isolated from the sample as a template and performing an amplification reaction using the primer set of claim 1 ; And it provides a method for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides comprising the step of detecting the amplification product obtained from the amplification step.

상기 시료는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 키트를 포함한 유산균 또는 유산균을 포함한 발효식품, 유제품 등 식품으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로 막걸리, 김치 또는 김치 국물을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The sample may be selected from the group consisting of foods such as lactic acid bacteria or fermented foods containing lactic acid bacteria, dairy products, etc., including Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides). Kimchi or kimchi broth may be used, but not limited thereto.

본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 LysR family transcriptional regulator 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론(cloned) DNA를 포함한다. 상기 DNA는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8:297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil(Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasy®Blood & Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany)를 이용할 수 있다.In the discrimination method of the present invention, the DNA of the LysR family transcriptional regulator gene of the Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides includes genomic DNA and cloned DNA. The DNA can be obtained by SDS extraction (Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8:297-303, 1990), CTAB separation (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) or a commercially available DNA extraction kit, for example, Fast DNA spin kit for soil (Mp Biomedicals) or genomic DNA extraction kit (DNeasy ® Blood & Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany) is available.

상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 LysR family transcriptional regulator 단백질(아미노산)을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.Using the isolated DNA as a template, and using the primer set according to the present invention, the target of the gene encoding the LysR family transcriptional regulator protein (amino acid) of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides The sequence can be amplified.

본 명세서에 사용된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP), Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응, 또는 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 출원 제09/854,317호에 기술되어 있다.As used herein, the term “amplification reaction” refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule. Various amplification reactions have been reported in the art, including polymerase chain reaction (PCR) (U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (Sambrook et al., Molecular). Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), Miller, HI (WO 89/06700) and the method of Davey, C. et al. (EP 329,822), ligase chain reaction (LCR) ), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) (WO 88/10315), self sustained sequence replication (WO 88/10315) sequence replication) (20) (WO90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences (US Pat. No. 6,410,276), consensus sequence primed polymerase chain reaction CPPCR) (U.S. Pat. No. 4,437,975), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) (U.S. Pat. Nos. 5,413,909 and 5,861,245), nucleic acid sequence based amplification NASBA) (US Pat. Nos. 5,130,238, 5,409,818, 5,554,517, and 6,063,603), strand displacement amplification, ring-mediated loop mediated isothermal amplification; LAMP), an amplification reaction through Qβ replicase, or a transcription-based amplification system, and the like. Other amplification methods that can be used are described in US Pat. Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and US Patent Application Serial No. 09/854,317.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 증폭 반응으로 실시간(Real time) PCR을 수행한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술로, PCR 생산물의 증가가 타겟 주형의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. According to an embodiment of the present invention, real-time PCR is performed as an amplification reaction. Real-time PCR is a technology that monitors and analyzes the increase in PCR amplification products in real time. During the exponential phase in which the increase in the PCR product is proportional to the initial amount of the target template, the amount of fluorescence emission is recorded in each cycle for PCR reaction. can be monitored. The higher the starting copy number of the nucleic acid target, the faster the fluorescence increase is observed and the lower the CT value (threshold cycle). A marked increase in fluorescence above the reference value measured between 3-15 cycles indicates detection of accumulated PCR product.

종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.Compared to conventional PCR methods, real-time PCR has the following advantages: (a) conventional PCR is measured in a plateau, whereas real-time PCR can obtain data during the exponential growth phase have; (b) the increase in reporter fluorescence signal is directly proportional to the number of amplicons generated; (c) the digested probe provides permanent record amplification of the amplicon; (d) increase the detection range; (e) requires at least 1,000-fold fewer nucleic acids than conventional PCR methods; (f) detection of amplified DNA without separation via electrophoresis is possible; (g) increased amplification efficiency can be achieved using small amplicon sizes; and (h) a low risk of contamination.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.When the amount of PCR amplification product reaches an amount detectable by fluorescence, an amplification curve begins to occur, the signal rises exponentially, and reaches a stagnant state. As the initial amount of DNA increases, the number of cycles at which the amount of amplification product reaches a detectable amount decreases, so the amplification curve appears faster. Therefore, when a real-time PCR reaction is performed using a standard sample diluted stepwise, amplification curves arranged at equal intervals in the order of the initial DNA amount are obtained. Here, if a threshold is set at an appropriate point, a CT value at the intersection of the threshold and the amplification curve is calculated.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법)와 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.In real-time PCR, PCR amplification products are detected through fluorescence. The detection method is largely divided into an interchelating method (SYBR Green I method) and a method using a fluorescently labeled probe (TaqMan probe method). Since the interchelating method detects all double-stranded DNA, there is no need to prepare a probe for each gene, so a reaction system can be constructed at a low cost. The method using a fluorescently labeled probe is expensive, but has high detection specificity, so that even similar sequences can be discriminated and detected.

상기 실시간 PCR에 의한 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 LysR family transcriptional regulator 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양은 50 fg(femtogram) 내지 5 ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 50 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.The minimum amount of DNA for the detection of the LysR family transcriptional regulator gene of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides by the real-time PCR is preferably 50 fg (femtogram) to 5 ng (nanogram), and , since detection is possible even with at least 50 fg, the detection sensitivity is very high.

본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.In the discrimination method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. In one embodiment, the labeling material may be a material emitting fluorescence, phosphorescence, or radioactivity, but is not limited thereto. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer during amplification of the target sequence, the target sequence may be labeled with a detectable fluorescent labeling material. In addition, when a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution for labeling using a radioactive material, the amplification product is synthesized and radioactivity is incorporated into the amplification product, so that the amplification product can be radioactively labeled. The primer sets used to amplify the target sequence are as described above.

본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법의 하나로서, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 젤 전기영동 또는 아가로스 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.In the discrimination method of the present invention, the detection of the amplification product may be performed through gel electrophoresis, capillary electrophoresis, DNA chip, radiometric measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one of the methods for detecting the amplification product, gel electrophoresis may be performed, and acrylamide gel electrophoresis or agarose gel electrophoresis may be used depending on the size of the amplification product. In addition, capillary electrophoresis can be performed. Capillary electrophoresis may use, for example, an ABi Sequencer. In addition, in the fluorescence measurement method, when PCR is performed by labeling the 5'-end of the primer with Cy-5 or Cy-3, the target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling material, and the labeled fluorescence is measured using a fluorometer. can do. In addition, the radioactive measurement method includes adding a radioactive isotope such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution during PCR to label the amplification product, and then a radioactive measuring instrument, for example, a Geiger counter or liquid scintillation. The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 LysR family transcriptional regulator 아미노산을 코딩하는 유전자에 특이적인 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 Leuconostoc 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 종만을 특이적으로 검출하였다(도 2 참조). 또한, 게놈 DNA와 클론 DNA는 각각 50 fg 및 1.43 × 103(copies/μl), 세포 현탁액에서는 1.93Х 104 (CFU/mL)에서도 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 검을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).According to an embodiment of the present invention, the primer and SEQ ID NO: 1 specific for the gene encoding the LysR family transcriptional regulator amino acid of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides of the present invention the second primer was detected while they did not detect strains of other species of genus Leuconostoc, flow Pocono stock mesen teroyi a specific species of des subspecies mesen teroyi des (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) (cf. Fig. 2). In addition, genomic DNA and clone DNA were obtained at 50 fg and 1.43 × 10 3 (copies/μl), respectively, and at 1.93Х 10 4 (CFU/mL) in cell suspension, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ) It was confirmed that the gum can be stably quantitatively detected (see Table 2).

또한, 본 발명의 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 검출에 특이적이고 민감성이 높다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트는 실시간 PCR 방법을 통해 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 정량, 정성 분석과 김치 내에서 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 의 밀도 변화를 신속, 정확하게 판단할 수 있다.In addition, the primer of SEQ ID NO: 1 and the primer of SEQ ID NO: 2 of the present invention are specific and highly sensitive to detection of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. Therefore, the primer set of the present invention using real-time PCR method teroyi flow Pocono stock mesen des subspecies mesen teroyi Death in the quantitative and qualitative analysis and Kimchi (Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides) flow Pocono stock mesen teroyi des subspecies mesen teroyi des (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ) can quickly and accurately determine the density change.

본 발명은 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 유산균인 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치 내 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다. The present invention provides a primer set capable of specifically detecting Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides , a lactic acid bacterium found in kimchi and fermented foods, etc. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides. Des ( Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ) can be quantitatively and qualitatively analyzed, and changes in the density of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides in kimchi can be monitored.

도 1은 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) J18의 LysR family transcriptional regulator 유전자의 Blastn 검색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Leumm182F/R 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다. M은 사이즈 마커(1 kb DNA plus ladder; Gibco BRL)이고, 레인 1 내지 10은 Leuconostoc mesenteroides strain이며, 레인 11 내지 20, 27은 표 1에 나열된 바와 같은 류코노스톡(Leuconostoc) 속에 속하는 다른 균주, 레인 21 내지 26, 28, 29는 Weissella species 및 Lactobacillus species에 속하는 균주들을 포함한다. 레인 30은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 3은 표 1에 기재된 29종의 미생물을 대상으로, 종-특이적인 Leumm182F/R 프라이머 세트를 이용한 Leuconostoc mesenteroides 유래의 LysR family transcriptional regulator 유전자의 실시간 PCR 결과이다. 도 3에서 멜팅-피크는 약 81.0℃의 융점(Tm)에서 증폭된 산물을 나타낸다. 레인 30은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 4는 표준 희석 계열에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸 것이다. 표준 곡선은 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 표준 희석의 교차점으로 알려진 threshold cycles(Ct)로부터 생성된다. 모든 곡선은 R2>0.99인 것으로 입증되었다. (a) 게놈 DNA, (b) 클론 DNA, (c) 세균 세포 현탁액.
도 5는 4 ℃에서 발효된 2 종류의 포기 김치 및 백김치에서 분리된 총 DNA에서 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
도 6은 15 및 25 ℃에서 발효된 2 종류의 포기 김치 및 백김치에서 분리된 총 DNA에서 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.1 shows the Blastn search results of the LysR family transcriptional regulator gene of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides).
2 shows the results of PCR amplification using the Leumm182F/R primer set. M is a size marker (1 kb DNA plus ladder; Gibco BRL), lanes 1 to 10 are Leuconostoc mesenteroides strain, and lanes 11 to 20 and 27 are other strains belonging to the genus Leuconostoc as listed in Table 1, Lanes 21 to 26, 28 and 29 contain strains belonging to Weissella species and Lactobacillus species. Lane 30 represents water as a negative control.
3 is a real-time PCR result of the LysR family transcriptional regulator gene derived from Leuconostoc mesenteroides using the species-specific Leumm182F/R primer set for 29 kinds of microorganisms listed in Table 1. The melting-peak in FIG. 3 represents the amplified product at a melting point (Tm) of about 81.0°C. Lane 30 represents water as a negative control.
4 shows the sensitivity of real-time PCR in a standard dilution series. Standard curves are generated from threshold cycles (Ct) known as intersections of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides standard dilutions. All curves demonstrated that R 2 >0.99. (a) genomic DNA, (b) clonal DNA, (c) bacterial cell suspension.
Figure 5 shows the change of real-time PCR Ct value for the quantification of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides in total DNA isolated from two types of fermented kimchi and white kimchi at 4 ° C. did it
6 is a change in real-time PCR Ct value for the quantification of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides in total DNA isolated from two types of fermented kimchi and white kimchi at 15 and 25 ° C. will show

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can easily carry out the present invention. However, the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.

<실시예 1> 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(<Example 1> Leukonostok mecenteroides subspecies mecenteroides ( Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp.subsp. mesenteroides mesenteroides )에 특이적인 프라이머 제작) specific primer production

(1) Bacterial strain과 배양 조건(1) Bacterial strain and culture conditions

본 발명에서 사용된 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC), Korean Collection for Type Cultures (KCTC)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다. Leuconostoc 균주들은 MRS배지로 22~30℃에서 각각 하루 또는 이틀 배양하였다. Other microorganisms, including Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides , used in the present invention are the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCM TM ) of Belgium and Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC) and Korean Collection for Type Cultures (KCTC), and their sources are summarized in Table 1. Leuconostoc strains were cultured in MRS medium for one or two days at 22~30℃, respectively.

No.No. Scientific Name
(Objective synonym)Scientific Name
(Objective synonym) SourceSource Biological originBiological origin 1One Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides KACC 12312KACC 12312 TT Fermenting olivesFermenting olives 22 Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides LMG 18967LMG 18967 SilageSilage 33 Leuconostoc mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides LMG 26308LMG 26308 PlantPlant 44 Leuconostoc mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides KACC 15744KACC 15744 MejuMeju 55 Leuconostoc mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides KACC 17095KACC 17095 Cabbage KimchiCabbage Kimchi 66 Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides LMG 25878LMG 25878 Dairy productDairy product 77 Leuconostoc mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides LMG 27188LMG 27188 Sourdoughsourdough 88 Leuconostoc mesenteroides
subsp. dextranicum Leuconostoc mesenteroides
subsp. dextranicum KACC 12315T KACC 12315 T N.DN.D. 99 Leuconostoc mesenteroides
subsp. cremoris Leuconostoc mesenteroides
subsp. cremoris KACC 12313T KACC 12313 T Hansen’s dried starter powerHansen’s dried starter power 1010 Leuconostoc suionicum
(Leuconostoc mesenteroides subsp. suionicum) Leuconostoc suionicum
(Leuconostoc mesenteroides subsp . suionicum) KACC 17730T KACC 17730 T N.DN.D. 1111 Leuconostoc pseudomesenteroidesLeuconostoc pseudomesenteroides KCTC 3652KCTC 3652 TT Cane juiceCane juice 1212 Leuconostoc citreumLeuconostoc citreum KACC 11860KACC 11860 TT Honeydew of rye earHoneydew of rye ear 1313 Leuconostoc lactisLeuconostoc lactis KACC 12305KACC 12305 TT MilkMilk 1414 Leuconostoc miyukkimchiiLeuconostoc miyukkimchii KACC 15353KACC 15353 TT Brown seaweed kimchiBrown seaweed kimchi 1515 Leuconostoc carnosumLeuconostoc carnosum KACC 12255KACC 12255 TT Vacuum-packed meatsvacuum-packed meats 1616 Leuconostoc inhaeLeuconostoc inhae KACC 12281T KACC 12281 T KimchiKimchi 1717 Leuconostoc gelidum
subsp. gelidum Leuconostoc gelidum
subsp. gelidum KACC 12256T KACC 12256 T Vacuum-packaged beefVacuum-packaged beef 1818 Leuconostoc gascomitatumLeuconostoc gascomitatum KACC 13854T KACC 13854 T Modified-atmosphere packaged, tomato-marinated broiler meat stripsModified-atmosphere packaged, tomato-marinated broiler meat strips 1919 Leuconostoc holzapfeliiLeuconostoc holzapfelii LMG 23990LMG 23990 TT Ethiopia coffee fermentationEthiopia coffee fermentation 2020 Leuconostoc fallaxLeuconostoc fallax KACC 12303T KACC 12303 T SauerkrautSauerkraut 2121 Weissella confusaWeissella confusa KACC 11841T KACC 11841 T Sugar cane
(Saccharum officinarum)sugar cane
(Saccharum officinarum) 2222 Weissella soliWeissella soli KACC 11848T KACC 11848 T Garden soilgarden soil 2323 Weissella viridescensWeissella viridescens KACC 11850T KACC 11850 T Cured meat productsCured meat products 2424 Weissella cibariaWeissella cibaria KACC 11862T KACC 11862 T Chili bo (Malaysian food)Chili bo (Malaysian food) 2525 Weissella halotoleransWeissella halotolerans KACC 11843T KACC 11843 T SausageSausage 2626 Lactobacillus curvatus subsp. curvatus Lactobacillus curvatus subsp. curvatus KACC 12415T KACC 12415 T MilkMilk 2727 Leuconostoc kimchiiLeuconostoc kimchii KACC 12383T KACC 12383 T Fermented vegetable(Kimchi)Fermented vegetable (Kimchi) 2828 Lactobacillus plantarumLactobacillus plantarum LMG 6907T LMG 6907 T Pickled cabbagePickled cabbage 2929 Lactobacillus sakeiLactobacillus sakei KACC 12414T KACC 12414 T Stater of sake(Moto)Stater of sake (Moto)

KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea; KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea;

LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM), Belgium; LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCM ™ ), Belgium;

KCTC, Korean Collection for Type Cultures, Republic of KoreaKCTC, Korean Collection for Type Cultures, Republic of Korea

T Type strain. T Type strain.

N.D., Not determined.N.D., Not determined.

(2) 총 DNA의 추출(2) extraction of total DNA

배양된 균주의 총 DNA는 Qiagen (Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트 (DNeasy® Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.Total DNA of the cultured strain was extracted using a genomic DNA extraction kit (DNeasy ® Blood & Tissue Kit) from Qiagen (Hilden, Germany).

(3) 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석(3) Analysis using blastn program to search for specific nucleotide sequence information

류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides의 유전체 정보 (GenBank accession CP003101.3: 위치 820593-821507, protein ID AET30235.1) 중 LysR family transcriptional regulator 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 primer를 제작하였다. Leuconostoc mesenteroides subspecies mesenteroides ( Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ) specifically Leuconostoc mesenteroides subsp. registered in Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov/) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) for the production of primer sets for detection. Among the genome information of mesenteroides (GenBank accession CP003101.3: position 820593-821507, protein ID AET30235.1), the specificity of the LysR family transcriptional regulator gene was confirmed through blastn and blastx programs, and primers were prepared.

(4) 특이 프라이머 제작(4) Preparation of specific primers

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides에서 182bp 크기의 단편을 증폭하는 Leumm182F와 Leumm182R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다. Leuconostoc mesenteroides subsp. Leumm182F and Leumm182R primer sets for amplifying 182bp fragments in mesenteroides were prepared. The sequence of the primer is as follows.

Figure 112019120306073-pat00001
Leumm182F 프라이머 : 5'-AGC CGA ACT AGG AAC AAT GAA-3' 21mer (서열번호 1)
Figure 112019120306073-pat00001
Leumm182F primer: 5'-AGC CGA ACT AGG AAC AAT GAA-3' 21mer (SEQ ID NO: 1)

Figure 112019120306073-pat00002
Leumm182R 프라이머 : 5'-ATA AAA CTG GCT GGG CTC TC-3' 20mer (서열번호 2)
Figure 112019120306073-pat00002
Leumm182R primer: 5'-ATA AAA CTG GCT GGG CTC TC-3' 20mer (SEQ ID NO: 2)

<실시예 2> PCR 증폭 반응<Example 2> PCR amplification reaction

PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 10X Hot Taq buffer, dNTP 각각 10mM, 프라이머 각각 10pM, IncloneTM Hot Taq DNA polymerase 1.25unit (Inclone biotech, korea)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25μl의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 genomic DNA 양은 약 25ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 54℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 10μl의 PCR 산물을 LoadingStar로 (DYNEBIO, Republic of Korea) 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 확인하였다.PCR amplification reaction was performed using a PTC-200 TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass), and each reaction was 10X Hot Taq buffer, 10 mM each dNTP, 10pM each primer, 1.25unit of IncloneTM Hot Taq DNA polymerase (Inclone biotech, korea) in a PCR mixture containing a total amount of 25 μl. The amount of genomic DNA of some microorganisms added to the PCR mixture was about 25ng. The reaction was denatured at 95° C. for 5 minutes, repeated 35 times at 95° C. 60 seconds, 54° C. 30 seconds, and 72° C. 60 seconds, followed by reaction at 72° C. for 10 minutes. After the amplification reaction, 10 μl of the PCR product was stained with LoadingStar (DYNEBIO, Republic of Korea), electrophoresed on agarose gel at a concentration of 1.5%, and confirmed with a UV transilluminator.

특이성 확인을 위해 LysR family transcriptional regulator 유전자로 제작된 Leumm182F (5'-AGC CGA ACT AGG AAC AAT GAA-3') (서열번호 1: 21mer)와 Leumm182R (5'-ATA AAA CTG GCT GGG CTC TC-3') (서열번호 2: 20mer) 프라이머가 사용되었다.To confirm specificity, Leumm182F (5'-AGC CGA ACT AGG AAC AAT GAA-3') (SEQ ID NO: 1: 21mer) and Leumm182R (5'-ATA AAA CTG GCT GGG CTC TC-3) were made with the LysR family transcriptional regulator gene. ') (SEQ ID NO: 2: 20mer) primer was used.

<실시예 3> 실시간(Real-time) PCR 특이성 분석<Example 3> Real-time PCR specificity analysis

Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB greenTM premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 Leumm182F/R 프라이머 각각 10pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20μl의 양으로 수행하였다. Real-time PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 genomic DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 54℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.Real-time PCR amplification reaction was performed using the CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA), and each reaction was performed using TB green TM premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) (2x) ( TAKARA Bio, Inc., Japan) and Leumm182F/R primers each containing 10 pM of Real-time PCR mixture was performed in a total amount of 20 μl. The amount of genomic DNA of microorganisms added to the real-time PCR mixture was about 5ng. The reaction is denatured at 95°C for 30 seconds, repeated 40 times at 95°C 5 seconds, 54°C 30 seconds, and then reacted at 95°C for 15 seconds, then 0.5°C every 5 seconds to 65-95°C for melting curve and melting peak increased.

<실시예 4> 실시간(Real-time) PCR 민감도 분석<Example 4> Real-time PCR sensitivity analysis

Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB greenTM premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 Leumm182F/R 프라이머 각각 10pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20μl의 양으로 수행하였다. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KACC12312T genomic DNA와 cloned DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석하였고, 미생물 현탁액은 O.D 600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 Real-time PCR 혼합액에 첨가하였다. Real-time PCR 증폭반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 54℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다 (표 2).Real-time PCR amplification reaction was performed using the CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA), and each reaction was performed using TB green TM premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) (2x) ( TAKARA Bio, Inc., Japan) and Leumm182F/R primers each containing 10 pM of Real-time PCR mixture was performed in a total amount of 20 μl. Leuconostoc mesenteroides subsp. The amounts of mesenteroides KACC12312 T genomic DNA and cloned DNA were diluted 10-fold from about 5 ng, and the microbial suspension was adjusted to 0.1 at OD 600, diluted 10-fold and added to the Real-time PCR mixture. Real-time PCR amplification reaction is denatured at 95°C for 30 seconds, repeated 40 times at 95°C for 5 seconds and 54°C for 30 seconds, then reacted at 95°C for 15 seconds, and then 5 to 65-95°C for melting curve and melting peak increased by 0.5°C per second (Table 2).

표 2는 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KACC 12312T의 클론 DNA, 게놈 DNA 및 세포 현탁액을 10배씩 단계적으로 희석하여 실시간 PCR 분석을 진행한 평균 Ct end-point fluorescence을 나타내며, 도 4는 표준 희석 계열(standard dilution series)에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸다. Table 2 shows that Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides KACC 12312 T shows the average Ct end-point fluorescence obtained by serially diluting the clonal DNA, genomic DNA and cell suspension of 10 times by 10 times and performing real-time PCR analysis. FIG. 4 shows the results of real-time PCR in a standard dilution series. indicates sensitivity.

Cloned DNACloned DNA Genomic DNAGenomic DNA Cell suspensioncell suspension Plasmid copies/μlPlasmid copies/μl Ct ± SD a
(n = 3)Ct ± SD a
( n = 3) Weight/μl reaction mixWeight/μl reaction mix Ct ± SD
(n = 3)Ct ± SD
( n = 3) CFU/ml reaction mixCFU/ml reaction mix Ct ± SD
(n = 3)Ct ± SD
( n = 3) 1.43 × 109 1.43 × 10 9 14.35 ± 0.1214.35 ± 0.12 5 ng5 ng 17.38 ± 0.1317.38 ± 0.13 1.93 × 108 1.93 × 10 8 17.89 ± 0.0917.89 ± 0.09 1.43 × 108 1.43 × 10 8 17.61 ± 0.0717.61 ± 0.07 500 pg500 pg 21.11 ± 0.1721.11 ± 0.17 1.93 × 107 1.93 × 10 7 21.53 ± 0.0821.53 ± 0.08 1.43 × 107 1.43 × 10 7 21.13 ± 0.0721.13 ± 0.07 50 pg50 pg 24.38 ± 0.1524.38 ± 0.15 1.93 × 106 1.93 × 10 6 24.97 ± 0.0124.97 ± 0.01 1.43 × 106 1.43 × 10 6 23.88 ± 0.2223.88 ± 0.22 5 pg5 pg 28.13 ± 0.0528.13 ± 0.05 1.93 × 105 1.93 × 10 5 28.53 ± 0.2428.53 ± 0.24 1.43 × 105 1.43 × 10 5 27.15 ± 0.0327.15 ± 0.03 500 fg500 fg 31.60 ± 0.2231.60 ± 0.22 1.93 × 104 1.93 × 10 4 31.65 ± 0.3731.65 ± 0.37 1.43 × 104 1.43 × 10 4 30.47 ± 0.2030.47 ± 0.20 50 fg50 fg 35.24 ± 0.2535.24 ± 0.25 1.93 × 103 1.93 × 10 3 N.D.N.D. 1.43 × 103 1.43 × 10 3 34.00 ± 0.4134.00 ± 0.41 5 fg5 fg N.D. b ND b 1.93 × 102 1.93 × 10 2 N.D.N.D.

a SD, Three reactions standard deviation. a SD, Three reactions standard deviation.

b N.D., Not detected. b ND, Not detected.

<실시예 5> 김치 시료를 이용한 실시간(real-time) PCR 증폭<Example 5> Real-time PCR amplification using kimchi samples

김치 시료부터의 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides의 real-time PCR을 이용하여 정량분석을 위하여 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃와 25℃에서 발효, 보관하였고 실험을 위해 김치 국물 30ml 씩 4℃의 경우 일주일간격으로, 15℃와 25℃의 경우 하루간격으로 채취하였으며 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈 (Daehan, Korea)를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다. 거즈로 거른 김치 국물 1ml을 1.5ml 튜브에 담고 13,000rpm으로 10분간 원심분리한 다음 아래에 수집된 pellet을 이용하여 MPbio(OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 total DNA를 추출한 후 real-time PCR을 실시하였다. Real-time PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB greenTM premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) (2x), primer는 각각 5pM을 함유하는 SYBR-Green PCR 혼합액으로 총 20μl의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 김치 시료의 total DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 54℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 5초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 melting 커브와 melting 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 도 5, 6과 같이 정리하였다. Leuconostoc mesenteroides subsp from kimchi samples. For quantitative analysis using real-time PCR of mesenteroides, we purchased kimchi and white kimchi that were sold on the market for about a day from the date of manufacture, put them in an airtight container, fermented them at 4℃, 15℃, and 25℃, respectively 30ml of kimchi broth was collected every week at 4℃ and every day at 15℃ and 25℃. To remove large particles such as red pepper powder, sterilized gauze (Daehan, Korea) was folded in four layers for pretreatment. The kimchi broth that came out after squeezing was used. After putting 1 ml of gauze-filtered kimchi broth in a 1.5 ml tube, centrifuging at 13,000 rpm for 10 minutes, and using the pellet collected below, total DNA was extracted using MPbio (OH, USA)'s Fast DNA ® spin kit for soil. Then, real-time PCR was performed. Real-time PCR amplification reaction was performed using CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA), and each reaction was TB green TM premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus) (2x), Primers were performed in a total amount of 20 μl with a SYBR-Green PCR mixture containing 5 pM each. The total DNA amount of the kimchi sample added to the PCR mixture was about 5 ng. The reaction is denatured at 95°C for 30 seconds, repeated 40 times at 95°C for 5 seconds and 54°C for 30 seconds, then reacted at 95°C for 15 seconds, reacted at 65°C for 5 seconds at 0.5°C intervals, and then increased to 95°C A melting curve and a melting peak were performed while As a result, a specific curve and a peak were identified, respectively, and the density change was summarized as shown in FIGS. 5 and 6 .

<실험예 1> 분석 균주별 PCR 증폭 반응<Experimental Example 1> PCR amplification reaction for each strain analyzed

표 1의 균주들에 적용하여 서열번호 1과 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides에 해당하는 레인 1-5번의 5개 균주들에서만 182bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다(도 2).As a result of performing PCR using the primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2 applied to the strains of Table 1, Leuconostoc mesenteroides subsp. It was confirmed that the nucleic acid fragment of the 182bp size was specifically amplified only in the 5 strains of lanes 1-5 corresponding to mesenteroides (FIG. 2).

Leuconostoc mesenteroides 종의 또 다른 아종에 해당하는 레인 8과 9의 균주에서는 182bp 크기의 DNA 단편이 증폭되지 않는 것을 확인하였다. In lanes 8 and 9 corresponding to another subspecies of the species Leuconostoc mesenteroides. It was confirmed that the 182bp DNA fragment was not amplified in the strain.

따라서 서열번호 1과 2의 Leumm182F/R 프라이머 세트가 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides만을 특이적으로 증폭함을 검증하였다(도 2). Therefore, the Leumm182F / R primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2 is Leuconostoc mesenteroides subsp. It was verified that only mesenteroides were specifically amplified (FIG. 2).

<실험예 2> 실시간 PCR 특이성 분석 결과<Experimental Example 2> Real-time PCR specificity analysis result

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides에서만 특정 온도 (81.0℃)에서 melting peak를 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 3, Leuconostoc mesenteroides subsp. Only mesenteroides were able to confirm the melting peak at a specific temperature (81.0 ℃).

<실험예 3> 실시간 PCR 민감도 분석 결과<Experimental Example 3> Real-time PCR sensitivity analysis result

도 4의 standard curve의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며 genomic DNA는 50 fg, cloned DNA는 1.43 × 103 copies/μl, bacterial cell suspension에서는 1.93 × 104 CFU/ml 에서도 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. As the R 2 value and E value of the standard curve of FIG. 4 are in the appropriate range, it can be identified as valid data, genomic DNA is 50 fg, cloned DNA is 1.43 × 10 3 copies/μl, bacterial cell suspension is 1.93 × 10 Even at 4 CFU/ml, Leuconostoc mesenteroides subsp. It was confirmed that stable quantitative detection of mesenteroides was possible.

<실험예 4> 김치 총 DNA를 이용한 실시간 PCR 증폭결과<Experimental Example 4> Real-time PCR amplification result using Kimchi total DNA

도 5는 본 발명의 프라이머 Leumm182F와 Leumm182R을 사용하여, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides에 대하여 real-time PCR 기법으로 4℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다. 포기김치의 경우, Ct 값 23.35에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 21.31~23.81 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 백김치의 경우, Ct 값 27.22에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 25.67~27.22 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 5 is using the primers Leumm182F and Leumm182R of the present invention, Leuconostoc mesenteroides subsp. This is the result of observing the density change of mesenteroides by applying real-time PCR technique to kimchi and white kimchi stored at 4℃. In the case of kimchi, it was first detected at a Ct value of 23.35, and from then on, the density was kept constant between the Ct values of 21.31~23.81. In the case of white kimchi, it was first detected at a Ct value of 27.22, and thereafter, the density was kept constant between a Ct value of 25.67~27.22.

도 6은 15℃와 25℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과로, 15℃의 포기김치의 경우, Ct 값 22.70에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 18.41~22.70 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 15℃의 백김치의 경우, Ct 값 22.08에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 21.33~24.11 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 25℃의 포기김치의 경우, Ct 값 23.79에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 18.98~23.79 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 25℃의 백김치의 경우, Ct 값 24.04에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 21.09~24.04 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 6 shows the results of observation of changes in density by applying to kimchi and white kimchi stored at 15°C and 25°C. density was kept constant. In the case of white kimchi at 15°C, it was first detected at a Ct value of 22.08, and thereafter, the density was kept constant between a Ct value of 21.33 to 24.11. In the case of Agi Kimchi at 25°C, it was first detected at a Ct value of 23.79, and thereafter, the density was kept constant between a Ct value of 18.98~23.79. In the case of white kimchi at 25℃, it was first detected at a Ct value of 24.04, and thereafter, the density was kept constant between the Ct values of 21.09~24.04.

김치에서의 온도별 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides의 밀도를 관찰한 결과, 모든 보관온도에서 고춧가루가 없는 백김치보다 고춧가루가 있는 포기김치에서 더 낮은 Ct 값이 검출되었다. Leuconostoc mesenteroides subsp. As a result of observing the density of mesenteroides, lower Ct values were detected in kimchi with red pepper powder than white kimchi without red pepper powder at all storage temperatures.

15℃와 25℃에서 보관된 포기김치에서 처음 Ct 값 22.70과 23.79에서 2일차에 Ct 값 19.80와 18.98로 낮게 검출되었으며 이후부터 Ct 값 18.41~19.30과 18.98~21.31로 두 온도에서 가장 낮은 Ct 값으로 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides가 검출되었다.The first Ct values of 22.70 and 23.79 were detected as low as 19.80 and 18.98 on the second day in Agi Kimchi stored at 15°C and 25°C. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides were detected.

결론적으로, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides의 LysR family transcriptional regulator 유전자의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 Leumm182F/R 프라이머는 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides의 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 김치 내 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.In conclusion, Leuconostoc mesenteroides subsp. The Leumm182F / R primers produced from the specific DNA fragment of the transcriptional regulator LysR family of genes mesenteroides is Leuconostoc mesenteroides subsp. It can be seen that it can be used as a PCR primer for specific detection of mesenteroides , and Leuconostoc mesenteroides subsp. It was confirmed that it can be applied to the qualitative and quantitative analysis of mesenteroides and the monitoring of density changes.

<110> Republic of Korea <120> Primer set for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides <130> DP20190246 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leumm182F primer <400> 1 agccgaacta ggaacaatga a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leumm182R primer <400> 2 ataaaactgg ctgggctctc 20 <210> 3 <211> 182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LysR family transcriptional regulator <400> 3 ataaaactgg ctgggctctc tccactagtt cttgtccagt ttggttcaga taaactttcc 60 gtccttgttt ttcaatcagc gttaattcta aatcgtcttc aaggtctttt aattgctgtg 120 atattgttgc aggactaaca aataaagcct cagcaactcg attcattgtt cctagttcgg 180 ct 182 <110> Republic of Korea <120> Primer set for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides <130> DP20190246 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leumm182F primer <400> 1 agccgaacta ggaacaatga a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leumm182R primer <400> 2 ataaaactgg ctgggctctc 20 <210> 3 <211> 182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LysR family transcriptional regulator <400> 3 ataaaactgg ctgggctctc tccactagtt cttgtccagt ttggttcaga taaactttcc 60 gtccttgttt ttcaatcagc gttaattcta aatcgtcttc aaggtctttt aattgctgtg 120 atattgttgc aggactaaca aataaagcct cagcaactcg attcattgtt cctagttcgg 180 ct 182

Claims (9)

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 프라이머 세트 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스의 LysR 패밀리 전사조절자(family transcriptional regulator) 유전자에 특이적인, 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스 판별용 프라이머 세트 조성물. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 as a primer set composition for discrimination,
The primer set is specific to the LysR family transcriptional regulator gene of the Leukonostok mecenteroides subspecies mecenteroides, Leukonostok mecenteroides subspecies mecenteroides primer set composition for discrimination. 삭제delete 삭제delete 제1항의 조성물을 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) 판별용 키트. Leuconostoc mesenteroides subspecies mesenteroides comprising the composition of claim 1 , mesenteroides ( Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ) Kit for discriminating. 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)의 판별방법.Amplifying the target sequence by using the DNA isolated from the sample as a template and performing an amplification reaction using the primer set composition of claim 1; and
A method for discriminating Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides , comprising the step of detecting the amplification product obtained from the amplification step. 제5항에 있어서,
시료는 막걸리, 김치 또는 김치 국물을 포함하는, 판별방법.6. The method of claim 5,
The sample includes makgeolli, kimchi, or kimchi broth. 제5항에 있어서,
증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응을 포함하는, 판별방법. 6. The method of claim 5,
Amplification reactions include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, strand displacement amplification ( A method of discrimination, including strand displacement amplification or an amplification reaction through Qβ replica. 제7항에 있어서, 중합효소연쇄반응(PCR)은 실시간(real-time) PCR을 포함하는 것인, 판별방법. The method of claim 7, wherein the polymerase chain reaction (PCR) comprises real-time PCR. 제5항에 있어서,
증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 포함하는, 판별방법. 6. The method of claim 5,
The detection method of the amplification product includes gel electrophoresis, capillary electrophoresis, DNA chip, radiometric measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.
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