JP4581101B2 - Ｄｎａマーカーを用いるパパイアの性識別方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標とするパパイアの性識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パパイア（Carica papaya）は雄、雌、両性の３つの性表現型を持つ果樹で、果実として商品価値が高いのは両性果実である。沖縄県において栽培されているパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自殖の品種で、その苗には雌と両性とが１対２の割合で存在している。従って、サンライズの苗の性識別においては、雌と両性とを識別することが重要となる。従来、パパイアの性識別は、花が咲くまで形態による判断ができない為、１箇所に複数本仮定植し、花型による性識別により必要な株を残す栽培法により行われてきた。しかしながら、この方法では、種苗会社における育苗コスト（肥料、水、鉢、人件費、土地占有等）や現場での栽培コスト（肥料、水、人件費、計画栽培が困難）がかさむため、育苗段階（開花前）でのパパイアの性識別法の開発が急務となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標とするパパイアの性識別方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、RAPD法によって、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNAマーカーを取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAである。
【０００５】
さらに、本発明は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むパパイアの性識別マーカーである。
さらに、本発明は、上記DNAの一部（例えば17〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表されるもの等）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プライマーである。
【０００６】
さらに、本発明は、上記性識別マーカー増幅用プライマーを構成要素として含む、パパイアの性識別用キットである。
さらに、本発明は、上記DNAの一部（例えば、20〜450merの長さを有するもの）又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブである。
さらに、本発明は、上記性識別マーカー検出用プローブを構成要素として含む、パパイアの性識別用キットである。
【０００７】
さらに、本発明は、被検体パパイアにおける、上記パパイアの性識別マーカーの有無を解析することを特徴とするパパイアの性識別方法である。ここで、パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、ポリメラーゼ連鎖反応により得られる該性識別マーカー由来の増幅産物を検出することにより行われ得る。該ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として被検体パパイア由来のDNAを、プライマーとして上記のいずれかの性識別マーカー増幅用プライマーを用いて行われ得る。また、パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、プローブハイブリダイゼーション反応により得られるハイブリダイズ物を検出することによっても行われ得る。該プローブハイブリダイゼーション反応は、被検体パパイア由来のDNAに、該性識別マーカー検出用プローブをハイブリダイズすることにより行われ得る。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のパパイアの性識別方法は、従来の性識別方法とは異なり、性の違いに伴って生じるパパイア間のDNA配列の差異に基づいて性の識別を行う方法である。より具体的には、性識別マーカーの存在の有無を指標として、被検体パパイアの性を識別する方法である。ここで、「性識別マーカー」とは、特定の性に特異的に見出される塩基配列を有するDNAであって、性の識別に使用することがでDNAをいう。パパイアの性識別マーカーは、以下のようにして分離することができる。
【０００９】
１．性識別マーカーの探索
性識別マーカーの探索は、生物個体間の遺伝的多型を検出する方法、例えば増幅断片多型（random amplified polymorphic DNA；RAPD）法[Williamら:Nucleic Acids Res. 18:6531-6535(1990)]等によって行うことができる。すなわち、まず、パパイアから常法、例えばCTAB法[Murrayら:Nucleic Acids Res. 8:4321-4325 (1980)]等によりDNAを抽出する。この際、抽出に使用する植物組織に限定はないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、DNA抽出を効率良く行うことができるるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素により凍結し、乳鉢内で粉砕することができる。
【００１０】
次に、該パパイアDNAを鋳型として、１種又は２種のランダムな配列からなるプライマー（ランダムプライマーともいう）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（plymerase chain reaction；PCR）を行う。ここで使用することができるランダムプライマーとしては、10〜12merの塩基長のものが挙げられる。本発明においては、ランダムプライマーとして、独自に設計・合成した5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）の塩基配列からなる10 merのプライマーを用いた。PCRの反応条件は、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本鎖DNAの解離）、37〜42℃で１〜２分間（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを30〜40サイクル行う。PCRは、ヒートブロック式のプログラム温度制御装置（例えば、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製））を用いて行うことができる。
【００１１】
PCRの後、PCR増幅産物を検出する。検出方法としては、ゲル電気泳動（例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等）及びそれに続くゲル染色（例えば、エチジウムブロミド染色等）による方法が挙げられるが、これに限定されない。例えば、アガガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロミドでゲルを染色し紫外光下で観察すると、バーコード様のバンドパターンが得られる。このバンドパターンを、雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合、雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合及び両性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合とで比較し、それぞれの性に特異的に見出されるPCR増幅産物をパパイアの性識別マーカーとすることができる。
【００１２】
ところで、パパイア間の交配により子孫に出現する性表現型とその出現割合は表１のとおりである。沖縄県で生産されるパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自殖の品種で、その苗（幼植物ともいう）には表１のように雌と両性が１対２の割合で存在する。よって、サンライズの苗の性識別においては、雌と両性とを識別する方法が所望される。雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合には見られず、両性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ、あるいは両性及び雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ見られるPCR増幅産物は、雌のパパイアから両性又は雄のパパイアを識別するための性識別マーカーとして使用することができる。
【００１３】
【表１】
【００１４】
２．性識別マーカーの塩基配列決定
上記１において得られたパパイアの性識別マーカーの塩基配列は、当該技術分野で周知の塩基配列決定法により決定することができる。すなわち、例えば、上記１におけるPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動後のゲルから性識別マーカーのバンドを抽出し、塩基配列決定用プラスミド（例えば、pT7Blue(NOVAGEN社製)）に連結する。次いで、連結物を大腸菌に形質転換後、コロニーPCR法によって、性識別マーカーの挿入されたプラスミドを含有する大腸菌をスクリーニングする。得られた大腸菌からプラスミドを調製し、ジデオキシ法等の公知の手法によって挿入DNA断片の塩基配列を決定する。本発明において性識別マーカーとして取得されたDNA断片の塩基配列を配列番号１に、その相補鎖の配列を配列番号２に示す。配列番号１及び２で表される塩基配列からなるDNAは、両性及び雄のパパイア中で互いに２本鎖を形成しに存在し、共にパパイアの性識別マーカーとして有用である。
【００１５】
なお、本発明の性識別マーカーは配列番号１及び２に示されるものに限定されるものではなく、雌のパパイアから両性又は雄のパアイアを識別することができるものであれば、配列番号１及び２において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入された「多型物」も本発明の性識別マーカーに含まれる。ここで、「多型物」とは、より詳細には、同じ性のパパイア個体間において、１若しくは数個のレベルで対応する塩基配列間に差異の生じたDNA多型物をいう。
【００１６】
配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含む本発明のDNAは、上記１の方法により調製されるが、その他にも、決定された塩基配列に基づいてプライマーを設計・合成し、このプライマーを用い、パパイアの雄および両性株から抽出したDNAを鋳型としてPCRを行うことにより調製することもできる。
【００１７】
３.本発明の性識別マーカーの解析によるパパイアの性識別
被検パパイア中の本発明の性識別マーカーの有無を解析することにより、当該被検パパイアの性を識別することができる。性識別マーカーの有無の解析は、PCR法及びプローブ法等により行うことができる。
【００１８】
(1) PCR法による性識別マーカーの解析
PCR法による性識別マーカーの解析に基づいたパパイアの性識別は、以下のようにして行うことができる。まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配列の一部を含む性識別マーカー増幅用プライマーを設計・合成する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物中の17〜30mer、好ましくは20〜30mer、最も好ましくは20〜25merの塩基長からなる連続したヌクレオチド鎖をいう。より詳細には、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズし且つプライマーとして機能するヌクレオチド鎖である。ここで、「プライマーとして機能する」とは、PCRの相補鎖合成反応においてDNAポリメラーゼに3'末端OH基を提供し、当該酵素によるヌクレオヂド鎖合成反応を開始させるように機能することをいう。プライマーの合成は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られる公知の方法を用いることができるが、より簡便には、DNAシンセサイザー(例えばApplied Biosystem社製)を用いて行うことができる。
【００１９】
より詳細には、PCR法による性識別マーカーの解析には、性識別マーカーの一部又は全部の領域を増幅し得るような5’側プライマーと3’側プライマーとからなる性識別マーカー増幅用プライマーのペアが必要である。例えば、性識別マーカー増幅用プライマーの5’側プライマーとしては、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）や5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）が挙げられる。
また、3’側プライマーとしては、5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）、5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3' （配列番号７）が挙げられるが、当業者であれば配列番号１又は２の塩基配列に基づいて、他の適切な配列を容易に設計・合成することができ、これらのプライマーに限定されない。なお、配列番号１における上記各プライマーの対応位置を図１に示す。図１中において、矢印の向きは配列の向きを示す。これらのプライマーは、5’側プライマーと3’側プライマーとを適当に組み合わせて、性識別マーカー領域を増幅用のプライマーペアとして使用することができるが、その適当な組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。すなわち、5’側プライマーが、3’側プライマーよりも上流（5’から3’への向きにおいて）に存在するようにプライマーペアを選択することが必須の条件となる。このようなプライマーの組み合わせとしては、好ましくは、配列番号４と配列番号６、配列番号４と配列番号７、配列番号５と配列番号６、配列番号５と配列番号７の組み合わせが挙げられるが、プライマーの組み合わせは任意である。
【００２０】
配列番号４〜７のプライマーを用いてパパイア幼植物の性識別を行うことができる。より詳細には、「雌×雄」、「雌×両性」、「雄×雄」及び「両性×両性」の交配組み合わせにより得られる、雌、両性及び雄のパパイア幼植物の中から両性及び雄を識別することができる。
【００２１】
具体的手順を例示すると以下のようになる。すなわち、まず、パパイア幼植物の組織から常法に従ってDNAを抽出する。DNA抽出に用いる植物体の組織は特に限定されないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、核酸抽出を効率良く行うことができるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素を用いて粉砕することができる。DNAの抽出は公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくはCTAB法[Murrayら, Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)]により抽出することができる。
【００２２】
次いで、抽出したDNAを鋳型とし、上記の性識別マーカー領域増幅用のプライマーペアを加えてPCRを行い、目的のDNA断片を増幅させる。PCRの温度条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に決定することができ、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本鎖DNAの解離）、50〜55℃で１〜２分間（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを25〜30サイクル行う。上述の反応の温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置を用いることができる。このような装置の例としては、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を挙げることができる。
【００２３】
最後に、以上のようにして得られる反応混合物から、増幅された核酸を検出する。検出の方法としては、当技術分野で通常用いられる方法を用いることができるが、好ましくは上述したアガロースゲル電気泳動およびそれに続くエチジウムブロミドによるゲル染色を行う方法を用いることができる。これにより、雄および両性の被検体パパイアにのみPCR増幅断片が検出されるが、雌には検出されない。PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイア中には本発明の性識別マーカーが存在し、当該被検体パパイアは雌ではないと評価することができる。PCR増幅断片が検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００２４】
さらに、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定されている場合には、PCR増幅断片の有無により被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。同様に「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００２５】
(2) プローブ法による性識別マーカーの解析
プローブ法による性識別マーカーの解析に基づいたパパイアの性識別は、以下のようにして行うことができる。まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配列の一部又は全部を含む性識別マーカー検出用プローブを調製する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物中の20〜450mer、好ましくは50〜450mer、最も好ましくは100〜450merの塩基長からなる連続したヌクレオチド鎖をいう。当該ヌクレオチド鎖の塩基配列は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列であり得る。例えば、配列番号1に示される塩基配列に対して1以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500 (1982)]によって、当業者であれば容易に調製することができる。
【００２６】
性識別マーカー検出用プローブは、クローン化された配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むプラスミドから、適当な制限酵素で所望のDNA断片を切り出したり、該プラスミド又は両性若しくは雄パパイアから調製したDNAを鋳型とするPCRによって調製することができる。配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個の塩基がが置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500(1982)]によって、当業者であれば容易に調製することができる。なお、プローブDNA断片の標識は、放射性標識（例えば、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ）、非放射性標識（例えばビオチン、ディゴキシゲニン）等によって行うことができ、具体的には、プローブDNAの5'末端のリン酸をホスファターゼで除去後、ポリヌクレオチドキナーゼで[γ-32Ｐ]ATPのγ-リン酸基を前記DNAの5'末端に転移する方法や、[32Ｐ]、[35Ｓ]、[3Ｈ]、ビオチン等で標識されたヌクレオチド基質を、ニックトランスレーション法等によってプローブDNAの合成とともに取り込ませる方法等が挙げられる。より簡便には、32ＰによるプローブDNAの標識は、rediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）などの市販のキットを用いて行うことができる。
【００２７】
具体的手順として、サザンハイブリダイゼーションを利用する方法を例示すると以下のようになる。すなわち、まずパパイアよりDNAを上記と同様の方法により抽出し、適当な制限酵素で消化する。使用する制限酵素は特に限定しないが、好ましくはEcoRＩを用いる。
【００２８】
次いで、制限酵素消化したDNAを上述のとおりアガロースゲル電気泳動し、常法に従いDNAを膜ににブロッティングする。膜は特に限定はしないが、好ましくはHybond N+（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）等のナイロンメンブレンが好ましい。
【００２９】
さらに、ブロッティング後の膜に、常法に従って前記の性識別マーカー検出用プローブをハイブリズさせる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションは65℃で、それぞれ4時間、16時間行う。この条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定することができるので、特に限定しない。ハイブリダイゼーションを終えたナイロンメンブレンを65℃のSSC溶液（0.1％SDS含有）で洗浄する。洗浄の条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定することができるので限定しないが、2×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回、0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回で行うことができる。なお、それぞれの洗浄時間は20分程度で行うことができる。
【００３０】
最後に、洗浄したブロットを用い、オートラジオグラフィーまたはBAS2000（富士写真フイルム株式会社製）により解析することができる。これにより、雄および両性の被検植物にのみバンド（陽性バンド）が検出されるが、雌には検出されない。
【００３１】
PCR法による性識別マーカーの解析の場合と同様に、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定されている場合には、陽性バンドの有無により被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。同様に「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００３２】
４.パパイアの性識別用キット
本発明のパパイアの性識別方法に基づき、当該識別方法の実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットとして供給することが可能である。より具体的には、例えば、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAのDNAの一部（例えば、17〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表されるもの）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プライマー、及び／又は配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAの一部（例えば、20〜450merの長さを有するもの）の一部又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブを必須構成要素とするものが挙げられる。上記キットの構成要素は、必要に応じて変化し得る。例えば、PCR反応又はハイブリダイゼーション反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類が加えられ得る。当該キットを用い、上記３の手順に従ってパパイアの性を識別することが可能である。
【００３３】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 性識別マーカーの探索
（1）パパイアの葉からのDNA抽出
パパイアの葉5gからCTAB法を用いてDNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、サンライズ、ワイマナーロおよび沖縄県農業試験場育種系統等、性既知の合計33個体（雄13個体、雌16、両性4個体）を用いた。
【００３４】
（2）RAPD法による性識別マーカーの探索
上記により抽出したDNA100ngを鋳型とし、発明者らにより設計、合成されたランダムプライマーのIBRC-RP07 5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）を用いてPCRを行った。すなわち、DNA溶液 10μl(10ng/μl)、滅菌蒸留水4μl、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、発明者らにより設計、合成された 10-Mer プライマー1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。反応は、94℃で1分間（DNA変性）、37℃で1分間（プライマーの会合）、72℃で2分間（DNA鎖の伸長）で順次反応させ、これを30サイクル行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観察して増幅断片を検出した。結果を図２及び３に示した。
【００３５】
図２は、性が既知のパパイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）の葉から抽出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ導入種M1のF1である。
【００３６】
また図３は、 性が既知のパパイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）の葉から抽出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36である。
図２及び３の結果から明らかなように、400bpと500bpとの間に雄および両性特異的な増幅断片（性識別マーカー）が検出された。
【００３７】
〔実施例２〕 性識別マーカーの塩基配列決定
（1）性識別マーカーのクローニング
実施例１において検出された性識別マーカーをQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてアガロースゲルより抽出し、プラスミドpT7Blue(NOVAGEN)にクローニングし、大腸菌を形質転換した。
【００３８】
（2）性識別マーカーの塩基配列決定
次に、性識別マーカーを有するクローンを培養し、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて組換えプラスミドを抽出した。抽出した組換えプラスミドを鋳型としてBigDye Terminator Cycle Sequencing,FS キット（PEバイオシステムズジャパン社）を用いて反応を行い、ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer（PEバイオシステムズジャパン社）により塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示した。
【００３９】
〔実施例３〕 PCR法によるパパイアの性識別
得られた性識別マーカーを用い、PCR法によりパパイアの性識別を行った。まず、実施例２において決定された塩基配列に基づいて、性識別マーカー増幅用プライマーを設計および合成した。すなわち、5’側プライマーとして、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）及び5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）を、3’側プライマーとして5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）及び5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3'（配列番号７）を合成した。一方、被検パパイアの葉５ｇを乳鉢に移し、少量の液体窒素を加えて磨砕した後、CTAB法によりDNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、上記の33個体（雄13個体、雌16、両性4個体）、交配親（雌、両性）とそのF1集団（幼植物14個体）を用いた。抽出したDNAを鋳型として、5’側相同プライマーと3’側相補プライマーを用いたPCRにより目的DNA断片を増幅した。すなわち、DNA溶液1μl(10ng/μl)、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、滅菌蒸留水12μl、性識別マーカー5’側相同プライマー1μl(20μM)および3’側相補プライマー1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。プライマーは、配列番号５と配列番号６の組み合わせを使用した。反応は、94℃で1分間（二本鎖DNAの解離）、55℃で1分間（プライマーのアニーリング）、72℃で1分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、これを30サイクル行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観察して増幅断片を検出した。
【００４０】
結果を図４に示した。(1)は性が既知のパパイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ導入種M1のF1である。(2)は性が既知のパパイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36である。(3)は交配親（雌、両性）とそのF1集団（幼植物14個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた両性はサンライズ、雌は沖縄県農業試験場ON-34である。図４から明らかなように、雄および両性の試料にのみ目的の増幅断片が検出された（図４）。なお、F1集団（幼植物14個体）については、開花後に上記の結果と照合した。また、他の組のプライマーを用いた場合でも、同様に良好な識別結果が得られた。以上のことから、PCR法による本発明の性識別マーカーの解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができることが判明した。
【００４１】
〔実施例４〕 プローブ法によるパパイアの性識別
また、得られた性識別マーカーを用いプローブ法により、パパイアの性識別を行った。まず、制限酵素EcoRＩにより消化した雄、雌、両性のDNA10μｇを0.8％アガロースゲル電気泳動後、常法に従いDNAをHybond N+（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）にアルカリブロッティングした。一方、実施例３において得られた増幅断片を32Ｐにより標識した。すなわち、増幅断片20ngをrediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）を用いて32Pにより標識後、ProbeQuantTM G-50 Micro Column（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）により精製したものをプローブとした。次いで、上記により作製したブロットを65℃で4時間プレハイブリダイゼーション後、熱変性させた上記プローブを加えて、65℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。次に、ブロットを65℃の2×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、2回、続いて65℃の0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、2回洗浄した。最後に、洗浄したブロットをBAS2000（富士写真フイルム株式会社製）により解析した。
【００４２】
結果を図５に示した。雄は沖縄県野生種IK7、雌はワイナマーロ、両性はサンライズである。図５から明らかなように、雄および両性の被検植物にのみバンドが検出されるが、雌には検出されなかった。以上のことから、プローブ法による本発明の性識別マーカーの解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができることが判明した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、DNAマーカーを用いてパパイアの性識別を行うことができる。従って、本発明の方法を利用すれば育苗段階でのパパイアの迅速かつ高感度な性識別が可能となる。
【００４４】
【配列表】
【００４５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】パパイア性識別マーカーの全塩基配列における、配列番号４〜７の配列の存在位置を示す概略図である。
【図２】性が既知のパパイア17個体の葉から抽出したDNAを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図３】性が既知のパパイア16個体の葉から抽出したDNAを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図４】PCR法による性識別マーカーの解析に基づくパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】プローブ法による性識別マーカーの解析に基づくパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標とするパパイアの性識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パパイア（Carica papaya）は雄、雌、両性の３つの性表現型を持つ果樹で、果実として商品価値が高いのは両性果実である。沖縄県において栽培されているパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自殖の品種で、その苗には雌と両性とが１対２の割合で存在している。従って、サンライズの苗の性識別においては、雌と両性とを識別することが重要となる。従来、パパイアの性識別は、花が咲くまで形態による判断ができない為、１箇所に複数本仮定植し、花型による性識別により必要な株を残す栽培法により行われてきた。しかしながら、この方法では、種苗会社における育苗コスト（肥料、水、鉢、人件費、土地占有等）や現場での栽培コスト（肥料、水、人件費、計画栽培が困難）がかさむため、育苗段階（開花前）でのパパイアの性識別法の開発が急務となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標とするパパイアの性識別方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、RAPD法によって、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNAマーカーを取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAである。
【０００５】
さらに、本発明は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むパパイアの性識別マーカーである。
さらに、本発明は、上記DNAの一部（例えば17〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表されるもの等）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プライマーである。
【０００６】
さらに、本発明は、上記性識別マーカー増幅用プライマーを構成要素として含む、パパイアの性識別用キットである。
さらに、本発明は、上記DNAの一部（例えば、20〜450merの長さを有するもの）又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブである。
さらに、本発明は、上記性識別マーカー検出用プローブを構成要素として含む、パパイアの性識別用キットである。
【０００７】
さらに、本発明は、被検体パパイアにおける、上記パパイアの性識別マーカーの有無を解析することを特徴とするパパイアの性識別方法である。ここで、パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、ポリメラーゼ連鎖反応により得られる該性識別マーカー由来の増幅産物を検出することにより行われ得る。該ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として被検体パパイア由来のDNAを、プライマーとして上記のいずれかの性識別マーカー増幅用プライマーを用いて行われ得る。また、パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、プローブハイブリダイゼーション反応により得られるハイブリダイズ物を検出することによっても行われ得る。該プローブハイブリダイゼーション反応は、被検体パパイア由来のDNAに、該性識別マーカー検出用プローブをハイブリダイズすることにより行われ得る。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のパパイアの性識別方法は、従来の性識別方法とは異なり、性の違いに伴って生じるパパイア間のDNA配列の差異に基づいて性の識別を行う方法である。より具体的には、性識別マーカーの存在の有無を指標として、被検体パパイアの性を識別する方法である。ここで、「性識別マーカー」とは、特定の性に特異的に見出される塩基配列を有するDNAであって、性の識別に使用することがでDNAをいう。パパイアの性識別マーカーは、以下のようにして分離することができる。
【０００９】
１．性識別マーカーの探索
性識別マーカーの探索は、生物個体間の遺伝的多型を検出する方法、例えば増幅断片多型（random amplified polymorphic DNA；RAPD）法[Williamら:Nucleic Acids Res. 18:6531-6535(1990)]等によって行うことができる。すなわち、まず、パパイアから常法、例えばCTAB法[Murrayら:Nucleic Acids Res. 8:4321-4325 (1980)]等によりDNAを抽出する。この際、抽出に使用する植物組織に限定はないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、DNA抽出を効率良く行うことができるるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素により凍結し、乳鉢内で粉砕することができる。
【００１０】
次に、該パパイアDNAを鋳型として、１種又は２種のランダムな配列からなるプライマー（ランダムプライマーともいう）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（plymerase chain reaction；PCR）を行う。ここで使用することができるランダムプライマーとしては、10〜12merの塩基長のものが挙げられる。本発明においては、ランダムプライマーとして、独自に設計・合成した5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）の塩基配列からなる10 merのプライマーを用いた。PCRの反応条件は、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本鎖DNAの解離）、37〜42℃で１〜２分間（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを30〜40サイクル行う。PCRは、ヒートブロック式のプログラム温度制御装置（例えば、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製））を用いて行うことができる。
【００１１】
PCRの後、PCR増幅産物を検出する。検出方法としては、ゲル電気泳動（例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等）及びそれに続くゲル染色（例えば、エチジウムブロミド染色等）による方法が挙げられるが、これに限定されない。例えば、アガガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロミドでゲルを染色し紫外光下で観察すると、バーコード様のバンドパターンが得られる。このバンドパターンを、雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合、雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合及び両性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合とで比較し、それぞれの性に特異的に見出されるPCR増幅産物をパパイアの性識別マーカーとすることができる。
【００１２】
ところで、パパイア間の交配により子孫に出現する性表現型とその出現割合は表１のとおりである。沖縄県で生産されるパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自殖の品種で、その苗（幼植物ともいう）には表１のように雌と両性が１対２の割合で存在する。よって、サンライズの苗の性識別においては、雌と両性とを識別する方法が所望される。雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合には見られず、両性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ、あるいは両性及び雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ見られるPCR増幅産物は、雌のパパイアから両性又は雄のパパイアを識別するための性識別マーカーとして使用することができる。
【００１３】
【表１】
２．性識別マーカーの塩基配列決定
上記１において得られたパパイアの性識別マーカーの塩基配列は、当該技術分野で周知の塩基配列決定法により決定することができる。すなわち、例えば、上記１におけるPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動後のゲルから性識別マーカーのバンドを抽出し、塩基配列決定用プラスミド（例えば、pT7Blue(NOVAGEN社製)）に連結する。次いで、連結物を大腸菌に形質転換後、コロニーPCR法によって、性識別マーカーの挿入されたプラスミドを含有する大腸菌をスクリーニングする。得られた大腸菌からプラスミドを調製し、ジデオキシ法等の公知の手法によって挿入DNA断片の塩基配列を決定する。本発明において性識別マーカーとして取得されたDNA断片の塩基配列を配列番号１に、その相補鎖の配列を配列番号２に示す。配列番号１及び２で表される塩基配列からなるDNAは、両性及び雄のパパイア中で互いに２本鎖を形成しに存在し、共にパパイアの性識別マーカーとして有用である。
【００１５】
なお、本発明の性識別マーカーは配列番号１及び２に示されるものに限定されるものではなく、雌のパパイアから両性又は雄のパアイアを識別することができるものであれば、配列番号１及び２において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入された「多型物」も本発明の性識別マーカーに含まれる。ここで、「多型物」とは、より詳細には、同じ性のパパイア個体間において、１若しくは数個のレベルで対応する塩基配列間に差異の生じたDNA多型物をいう。
【００１６】
配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含む本発明のDNAは、上記１の方法により調製されるが、その他にも、決定された塩基配列に基づいてプライマーを設計・合成し、このプライマーを用い、パパイアの雄および両性株から抽出したDNAを鋳型としてPCRを行うことにより調製することもできる。
【００１７】
３.本発明の性識別マーカーの解析によるパパイアの性識別
被検パパイア中の本発明の性識別マーカーの有無を解析することにより、当該被検パパイアの性を識別することができる。性識別マーカーの有無の解析は、PCR法及びプローブ法等により行うことができる。
【００１８】
(1) PCR法による性識別マーカーの解析
PCR法による性識別マーカーの解析に基づいたパパイアの性識別は、以下のようにして行うことができる。まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配列の一部を含む性識別マーカー増幅用プライマーを設計・合成する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物中の17〜30mer、好ましくは20〜30mer、最も好ましくは20〜25merの塩基長からなる連続したヌクレオチド鎖をいう。より詳細には、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズし且つプライマーとして機能するヌクレオチド鎖である。ここで、「プライマーとして機能する」とは、PCRの相補鎖合成反応においてDNAポリメラーゼに3'末端OH基を提供し、当該酵素によるヌクレオヂド鎖合成反応を開始させるように機能することをいう。プライマーの合成は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られる公知の方法を用いることができるが、より簡便には、DNAシンセサイザー(例えばApplied Biosystem社製)を用いて行うことができる。
【００１９】
より詳細には、PCR法による性識別マーカーの解析には、性識別マーカーの一部又は全部の領域を増幅し得るような5’側プライマーと3’側プライマーとからなる性識別マーカー増幅用プライマーのペアが必要である。例えば、性識別マーカー増幅用プライマーの5’側プライマーとしては、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）や5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）が挙げられる。
また、3’側プライマーとしては、5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）、5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3' （配列番号７）が挙げられるが、当業者であれば配列番号１又は２の塩基配列に基づいて、他の適切な配列を容易に設計・合成することができ、これらのプライマーに限定されない。なお、配列番号１における上記各プライマーの対応位置を図１に示す。図１中において、矢印の向きは配列の向きを示す。これらのプライマーは、5’側プライマーと3’側プライマーとを適当に組み合わせて、性識別マーカー領域を増幅用のプライマーペアとして使用することができるが、その適当な組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。すなわち、5’側プライマーが、3’側プライマーよりも上流（5’から3’への向きにおいて）に存在するようにプライマーペアを選択することが必須の条件となる。このようなプライマーの組み合わせとしては、好ましくは、配列番号４と配列番号６、配列番号４と配列番号７、配列番号５と配列番号６、配列番号５と配列番号７の組み合わせが挙げられるが、プライマーの組み合わせは任意である。
【００２０】
配列番号４〜７のプライマーを用いてパパイア幼植物の性識別を行うことができる。より詳細には、「雌×雄」、「雌×両性」、「雄×雄」及び「両性×両性」の交配組み合わせにより得られる、雌、両性及び雄のパパイア幼植物の中から両性及び雄を識別することができる。
【００２１】
具体的手順を例示すると以下のようになる。すなわち、まず、パパイア幼植物の組織から常法に従ってDNAを抽出する。DNA抽出に用いる植物体の組織は特に限定されないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、核酸抽出を効率良く行うことができるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素を用いて粉砕することができる。DNAの抽出は公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくはCTAB法[Murrayら, Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)]により抽出することができる。
【００２２】
次いで、抽出したDNAを鋳型とし、上記の性識別マーカー領域増幅用のプライマーペアを加えてPCRを行い、目的のDNA断片を増幅させる。PCRの温度条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に決定することができ、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本鎖DNAの解離）、50〜55℃で１〜２分間（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを25〜30サイクル行う。上述の反応の温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置を用いることができる。このような装置の例としては、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を挙げることができる。
【００２３】
最後に、以上のようにして得られる反応混合物から、増幅された核酸を検出する。検出の方法としては、当技術分野で通常用いられる方法を用いることができるが、好ましくは上述したアガロースゲル電気泳動およびそれに続くエチジウムブロミドによるゲル染色を行う方法を用いることができる。これにより、雄および両性の被検体パパイアにのみPCR増幅断片が検出されるが、雌には検出されない。PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイア中には本発明の性識別マーカーが存在し、当該被検体パパイアは雌ではないと評価することができる。PCR増幅断片が検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００２４】
さらに、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定されている場合には、PCR増幅断片の有無により被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。同様に「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００２５】
(2) プローブ法による性識別マーカーの解析
プローブ法による性識別マーカーの解析に基づいたパパイアの性識別は、以下のようにして行うことができる。まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配列の一部又は全部を含む性識別マーカー検出用プローブを調製する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物中の20〜450mer、好ましくは50〜450mer、最も好ましくは100〜450merの塩基長からなる連続したヌクレオチド鎖をいう。当該ヌクレオチド鎖の塩基配列は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列であり得る。例えば、配列番号1に示される塩基配列に対して1以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500 (1982)]によって、当業者であれば容易に調製することができる。
【００２６】
性識別マーカー検出用プローブは、クローン化された配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むプラスミドから、適当な制限酵素で所望のDNA断片を切り出したり、該プラスミド又は両性若しくは雄パパイアから調製したDNAを鋳型とするPCRによって調製することができる。配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個の塩基がが置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500(1982)]によって、当業者であれば容易に調製することができる。なお、プローブDNA断片の標識は、放射性標識（例えば、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ）、非放射性標識（例えばビオチン、ディゴキシゲニン）等によって行うことができ、具体的には、プローブDNAの5'末端のリン酸をホスファターゼで除去後、ポリヌクレオチドキナーゼで[γ-32Ｐ]ATPのγ-リン酸基を前記DNAの5'末端に転移する方法や、[32Ｐ]、[35Ｓ]、[3Ｈ]、ビオチン等で標識されたヌクレオチド基質を、ニックトランスレーション法等によってプローブDNAの合成とともに取り込ませる方法等が挙げられる。より簡便には、32ＰによるプローブDNAの標識は、rediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）などの市販のキットを用いて行うことができる。
【００２７】
具体的手順として、サザンハイブリダイゼーションを利用する方法を例示すると以下のようになる。すなわち、まずパパイアよりDNAを上記と同様の方法により抽出し、適当な制限酵素で消化する。使用する制限酵素は特に限定しないが、好ましくはEcoRＩを用いる。
【００２８】
次いで、制限酵素消化したDNAを上述のとおりアガロースゲル電気泳動し、常法に従いDNAを膜ににブロッティングする。膜は特に限定はしないが、好ましくはHybond N+（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）等のナイロンメンブレンが好ましい。
【００２９】
さらに、ブロッティング後の膜に、常法に従って前記の性識別マーカー検出用プローブをハイブリズさせる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションは65℃で、それぞれ4時間、16時間行う。この条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定することができるので、特に限定しない。ハイブリダイゼーションを終えたナイロンメンブレンを65℃のSSC溶液（0.1％SDS含有）で洗浄する。洗浄の条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定することができるので限定しないが、2×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回、0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回で行うことができる。なお、それぞれの洗浄時間は20分程度で行うことができる。
【００３０】
最後に、洗浄したブロットを用い、オートラジオグラフィーまたはBAS2000（富士写真フイルム株式会社製）により解析することができる。これにより、雄および両性の被検植物にのみバンド（陽性バンド）が検出されるが、雌には検出されない。
【００３１】
PCR法による性識別マーカーの解析の場合と同様に、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定されている場合には、陽性バンドの有無により被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。同様に「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００３２】
４.パパイアの性識別用キット
本発明のパパイアの性識別方法に基づき、当該識別方法の実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットとして供給することが可能である。より具体的には、例えば、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAのDNAの一部（例えば、17〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表されるもの）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プライマー、及び／又は配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAの一部（例えば、20〜450merの長さを有するもの）の一部又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブを必須構成要素とするものが挙げられる。上記キットの構成要素は、必要に応じて変化し得る。例えば、PCR反応又はハイブリダイゼーション反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類が加えられ得る。当該キットを用い、上記３の手順に従ってパパイアの性を識別することが可能である。
【００３３】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 性識別マーカーの探索
（1）パパイアの葉からのDNA抽出
パパイアの葉5gからCTAB法を用いてDNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、サンライズ、ワイマナーロおよび沖縄県農業試験場育種系統等、性既知の合計33個体（雄13個体、雌16、両性4個体）を用いた。
【００３４】
（2）RAPD法による性識別マーカーの探索
上記により抽出したDNA100ngを鋳型とし、発明者らにより設計、合成されたランダムプライマーのIBRC-RP07 5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）を用いてPCRを行った。すなわち、DNA溶液 10μl(10ng/μl)、滅菌蒸留水4μl、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、発明者らにより設計、合成された 10-Mer プライマー1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。反応は、94℃で1分間（DNA変性）、37℃で1分間（プライマーの会合）、72℃で2分間（DNA鎖の伸長）で順次反応させ、これを30サイクル行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観察して増幅断片を検出した。結果を図２及び３に示した。
【００３５】
図２は、性が既知のパパイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）の葉から抽出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ導入種M1のF1である。
【００３６】
また図３は、 性が既知のパパイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）の葉から抽出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36である。
図２及び３の結果から明らかなように、400bpと500bpとの間に雄および両性特異的な増幅断片（性識別マーカー）が検出された。
【００３７】
〔実施例２〕 性識別マーカーの塩基配列決定
（1）性識別マーカーのクローニング
実施例１において検出された性識別マーカーをQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてアガロースゲルより抽出し、プラスミドpT7Blue(NOVAGEN)にクローニングし、大腸菌を形質転換した。
【００３８】
（2）性識別マーカーの塩基配列決定
次に、性識別マーカーを有するクローンを培養し、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて組換えプラスミドを抽出した。抽出した組換えプラスミドを鋳型としてBigDye Terminator Cycle Sequencing,FS キット（PEバイオシステムズジャパン社）を用いて反応を行い、ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer（PEバイオシステムズジャパン社）により塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示した。
【００３９】
〔実施例３〕 PCR法によるパパイアの性識別
得られた性識別マーカーを用い、PCR法によりパパイアの性識別を行った。まず、実施例２において決定された塩基配列に基づいて、性識別マーカー増幅用プライマーを設計および合成した。すなわち、5’側プライマーとして、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）及び5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）を、3’側プライマーとして5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）及び5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3'（配列番号７）を合成した。一方、被検パパイアの葉５ｇを乳鉢に移し、少量の液体窒素を加えて磨砕した後、CTAB法によりDNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、上記の33個体（雄13個体、雌16、両性4個体）、交配親（雌、両性）とそのF1集団（幼植物14個体）を用いた。抽出したDNAを鋳型として、5’側相同プライマーと3’側相補プライマーを用いたPCRにより目的DNA断片を増幅した。すなわち、DNA溶液1μl(10ng/μl)、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、滅菌蒸留水12μl、性識別マーカー5’側相同プライマー1μl(20μM)および3’側相補プライマー1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。プライマーは、配列番号５と配列番号６の組み合わせを使用した。反応は、94℃で1分間（二本鎖DNAの解離）、55℃で1分間（プライマーのアニーリング）、72℃で1分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、これを30サイクル行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観察して増幅断片を検出した。
【００４０】
結果を図４に示した。(1)は性が既知のパパイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ導入種M1のF1である。(2)は性が既知のパパイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36である。(3)は交配親（雌、両性）とそのF1集団（幼植物14個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた両性はサンライズ、雌は沖縄県農業試験場ON-34である。図４から明らかなように、雄および両性の試料にのみ目的の増幅断片が検出された（図４）。なお、F1集団（幼植物14個体）については、開花後に上記の結果と照合した。また、他の組のプライマーを用いた場合でも、同様に良好な識別結果が得られた。以上のことから、PCR法による本発明の性識別マーカーの解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができることが判明した。
【００４１】
〔実施例４〕 プローブ法によるパパイアの性識別
また、得られた性識別マーカーを用いプローブ法により、パパイアの性識別を行った。まず、制限酵素EcoRＩにより消化した雄、雌、両性のDNA10μｇを0.8％アガロースゲル電気泳動後、常法に従いDNAをHybond N+（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）にアルカリブロッティングした。一方、実施例３において得られた増幅断片を32Ｐにより標識した。すなわち、増幅断片20ngをrediprimeTMII（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）を用いて32Pにより標識後、ProbeQuantTM G-50 Micro Column（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）により精製したものをプローブとした。次いで、上記により作製したブロットを65℃で4時間プレハイブリダイゼーション後、熱変性させた上記プローブを加えて、65℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。次に、ブロットを65℃の2×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、2回、続いて65℃の0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、2回洗浄した。最後に、洗浄したブロットをBAS2000（富士写真フイルム株式会社製）により解析した。
【００４２】
結果を図５に示した。雄は沖縄県野生種IK7、雌はワイナマーロ、両性はサンライズである。図５から明らかなように、雄および両性の被検植物にのみバンドが検出されるが、雌には検出されなかった。以上のことから、プローブ法による本発明の性識別マーカーの解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができることが判明した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、DNAマーカーを用いてパパイアの性識別を行うことができる。従って、本発明の方法を利用すれば育苗段階でのパパイアの迅速かつ高感度な性識別が可能となる。
【００４４】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】パパイア性識別マーカーの全塩基配列における、配列番号４〜７の配列の存在位置を示す概略図である。
【図２】性が既知のパパイア17個体の葉から抽出したDNAを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図３】性が既知のパパイア16個体の葉から抽出したDNAを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図４】PCR法による性識別マーカーの解析に基づくパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】プローブ法による性識別マーカーの解析に基づくパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
Claims (12)
- 配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入された多型物を含むDNA。
- 配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入された多型物を含むパパイアの性識別マーカー。
- 請求項１記載のDNAの一部であって17〜30merの長さを有するものを含むパパイアの性識別マーカー増幅用プライマー。
- DNAの一部が、配列番号４〜７のいずれかで表されるものである請求項３記載のパパイアの性識別マーカー増幅用プライマー。
- 請求項３又は４記載のいずれかの性識別マーカー増幅用プライマーを構成要素として含む、パパイアの性識別用キット。
- 請求項１記載のDNAの一部であって20〜450merの長さを有するもの又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブ。
- 請求項６記載の性識別マーカー検出用プローブを構成要素として含む、パパイアの性識別用キット。
- 被検体パパイアにおける、請求項２記載のパパイアの性識別マーカーの有無を解析することを特徴とするパパイアの性識別方法。
- パパイアの性識別マーカーの有無の解析が、ポリメラーゼ連鎖反応により得られる該性識別マーカー由来の増幅産物を検出することにより行われることを特徴とする請求項８記載のパパイアの性識別方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応が、鋳型として被検体パパイア由来のDNAを、プライマーとして請求項３又は４記載のいずれかの性識別マーカー増幅用プライマーを用いて行われることを特徴とする請求項９記載のパパイアの性識別方法。
- パパイアの性識別マーカーの有無の解析が、プローブハイブリダイゼーション反応により得られるハイブリダイズ物を検出することにより行われることを特徴とする請求項８記載のパパイアの性識別方法。
- プローブハイブリダイゼーション反応が、被検体パパイア由来のDNAに、請求項６記載の性識別マーカー検出用プローブをハイブリダイズすることにより行われることを特徴とする請求項１１記載のパパイアの性識別方法。
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