JP2021052687A

JP2021052687A - モモ果肉色の多様化方法

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Publication number: JP2021052687A
Application number: JP2019180164A
Authority: JP
Inventors: 賢司小田; Kenji Oda; 美由紀北川; Miyuki Kitagawa; 誠介日原; Seisuke Hihara; 悠治郎鵜木; Yujiro Unoki
Original assignee: Okayama Prefectural Government
Current assignee: Okayama Prefectural Government
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2021-04-08

Abstract

【課題】定植前の幼苗段階で簡便かつ高精度でモモの紅肉品種を選抜できるモモ紅肉品種の選抜方法及びモモ紅肉品種の判定キットの提供。【解決手段】モモ紅肉品種の選抜方法であって、ＢＬ遺伝子のプロモーター領域に、特定の配列からなるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとし、前記挿入変異が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定することを特徴とするモモ紅肉品種の選抜方法。【選択図】図１

Description

本発明は、モモ紅肉品種の選抜方法及びモモ紅肉品種の判定キット、並びに所望の果肉色を有するモモの育種に関する。

日本で栽培されているモモはほぼ全て単一の品種（白桃）をもとに育成されてきたため、品種間で形質差が少なく、多様性が著しく乏しい。日本の市場では殆ど目にすることがないが、モモには果肉が赤い品種（紅肉種）が存在する。果肉色は消費者の購買意欲に強く影響する重要形質であり、このような紅肉形質を日本の栽培モモに導入すれば、消費者の多様な嗜好に対応した個性的な品種が育成できると期待される。

非特許文献１には、モモの紅肉特性はアントシアニンの蓄積によるものであることが記載されており、タバコにおいてはＢＬ遺伝子とＮＡＣ１遺伝子とのヘテロダイマーがＭＹＢ１０．１の転写を活性化し、アントシアニン色素沈着を引き起こすとされている。また、ＢＬ遺伝子をサイレンシングすると、モモのアントシアニン色素沈着が減少するとされている。しかしながら、ＢＬ遺伝子のプロモーター領域にトランスポゾン配列の挿入変異があると紅肉形質のモモが得られることは知られておらず、圃場スペースや栽培労力の浪費を抑え、効率的に紅肉品種の育成が可能なマーカー支援選抜の利用が望まれていた。

Hui Zhou et al., The Plant Journal, 2015, Molecular genetics of blood-fleshed peach reveals activation of anthocyanin biosynthesis by NAC transcription factors

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、定植前の幼苗段階で簡便かつ高精度でモモの紅肉品種を選抜できるモモ紅肉品種の選抜方法及びモモ紅肉品種の判定キットを提供することを目的とするものである。

上記課題は、モモ紅肉品種の選抜方法であって、ＢＬ遺伝子のプロモーター領域に、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとし、前記挿入変異が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定することを特徴とするモモ紅肉品種の選抜方法を提供することによって解決される。

このとき、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定することが好適な実施態様であり、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＦ１と、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定し、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記Ｆ１と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種ではないと判定することが好適な実施態様である。

上記課題は、モモのゲノムＤＮＡと複数のプライマーとを含むモモ紅肉品種の選抜キットであって、前記複数のプライマーが、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＦ１、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２、及び前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲであり、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記複数のプライマーを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定し、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記Ｆ１と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種ではないと判定するキットを提供することによっても解決される。

前記モモ紅肉品種の選抜方法に対して、更にＭＹＢ１０．１遺伝子変異及び／又はＣＣＤ４遺伝子変異をＤＮＡマーカーとして前記変異の有無を検出することにより、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することを特徴とするモモ果肉色の調節方法を提供することが好適な実施態様であり、前記モモ紅肉品種の選抜方法で選抜されたモモ紅肉品種と他のモモ品種とを交配させ、更にＭＹＢ１０．１遺伝子変異及び／又はＣＣＤ４遺伝子変異をＤＮＡマーカーとして前記変異の有無を検出することにより、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することを特徴とするモモ果肉色の調節方法を提供することも好適な実施態様である。

本発明により、定植前の幼苗段階で簡便かつ高精度でモモの紅肉品種を選抜できるモモ紅肉品種の選抜方法及びモモ紅肉品種の判定キットを提供することができる。これにより、圃場スペースや栽培労力の浪費を抑えて、紅肉品種を効率的に育成することが可能となる。更に、アントシアニン蓄積に影響するＭＹＢ１０．１変異のＤＮＡマーカーやカロテノイド蓄積に影響するＣＣＤ４変異のＤＮＡマーカーを組み合わせて利用することで、多様な果肉色を有するモモ品種を効率的に育成することが可能となる。

本発明のモモ紅肉品種の選抜方法についての概略を示した図である。モモ２１品種についてＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示した図（上図）、並びにトランスポゾン配列の挿入変異をヘテロに持つ天津桃太郎と白肉品種とのＦ１交配樹１５本についてＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示した図（下図）である。紅肉品種と白肉品種とのＦ１交配樹４本について、それぞれの果肉色を比較した図である。紅肉品種と白肉品種とのＦ１交配樹９本について、果肉のアントシアニン量（紅肉品種である天津水蜜桃を１００とした場合の相対量）とＭＹＢ１０．１の遺伝子型を示した図である。

本発明は、モモ紅肉品種の選抜方法であって、ＢＬ遺伝子のプロモーター領域に、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとし、前記挿入変異が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定することを特徴とするものである。

本発明者らにより、モモが有するＢＬ遺伝子のプロモーター領域に、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異が検出される場合に、紅肉品種と判定できることが確認された。このように、当該トランスポゾン配列の挿入変異が検出される場合に紅肉品種となることの原因は必ずしも明らかではないが、ＢＬ遺伝子の変異により転写因子であるＭＹＢ１０．１の発現が誘導され、その結果、アントシアニン合成酵素遺伝子が誘導されて紅色化すると本発明者らは推察している。後述する実施例からも明らかなように、当該トランスポゾン配列の挿入変異が検出されなかったモモ品種は、いずれも白肉品種又は黄肉品種であった。一方、当該トランスポゾン配列の挿入変異がホモ又はヘテロで存在したモモ品種は、いずれも紅肉品種であった。このように、当該トランスポゾン配列の挿入変異の存在によって紅肉品種が検出されることは驚くべきことである。このことから、当該トランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとして、モモ紅肉品種であると判定するモモ紅肉品種の選抜方法の提供が可能となった。特に、正常型と変異型をヘテロに持つ品種の判定は形質観察だけでは難しく、本発明の意義は大きい。

本発明者らが検討したところ、当該トランスポゾン配列のサイズが６，０００ｂｐを超えていることが明らかとなり、ＢＬ遺伝子のプロモーター領域に一対のプライマーを設計しただけでは、当該トランスポゾン配列の挿入変異があると遺伝子増幅産物が得られない場合があり、紅肉品種の判定が困難となることが確認された。かかる観点から、当該挿入変異内と当該挿入変異外にそれぞれプライマーを少なくとも１つ設計することが本発明の好適な実施態様である。具体的には、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定する方法が好適に採用される。また、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＦ１と、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定し、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記Ｆ１と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種ではないと判定する方法が好適に採用される。このような方法を採用することで、簡便かつ高精度でモモの紅肉品種を選抜することが可能となる。

紅肉品種の赤みの程度はアントシアニンの蓄積によるものである。後述する実施例からも明らかなように、ＭＹＢ１０．１の遺伝子型と果肉のアントシアニン量との間には相関があり、具体的には、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＭＹＢ１０．１変異の目印となる配列番号６で示される挿入変異部位に設計された正方向プライマーＰ３と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＰ２とを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｐ３と前記Ｐ２との間で遺伝子増幅産物が検出される場合に赤みの程度が弱いモモ紅肉品種であると判定する方法が好適に採用される。また、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号６で示される挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＰ１と、前記挿入変異部位に設計された正方向プライマーＰ３と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＰ２とを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｐ３と前記Ｐ２との間で遺伝子増幅産物が検出される場合に赤みの程度が弱いモモ紅肉品種であると判定し、前記Ｐ３と前記Ｐ２との間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記Ｐ１と前記Ｐ２との間で遺伝子増幅産物が検出される場合に赤みの程度が強いモモ紅肉品種であると判定する方法が好適に採用される。したがって、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとするとともに、ＭＹＢ１０．１変異をＤＮＡマーカーとして組み合わせることで、赤みの程度の異なるモモ紅肉品種を選抜することが可能となる。

また、果肉色が白色の白肉品種と果肉色が黄色の黄肉品種は、カロテノイド分解酵素ＣＣＤ４の遺伝子型を調べることにより検出することができる。白肉品種と黄肉品種の具体的な選抜としては、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣＣＤ４変異の目印となる配列番号１１で示されるトランスポゾン様配列の挿入変異部位に設計された正方向プライマーＲＴ−ｆと、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＣＣＤ４−ｒとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記ＲＴ−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間で遺伝子増幅産物のみが検出される場合に黄肉品種であると判定する方法が好適に採用される。また、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１１で示されるトランスポゾン様配列の挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＣＣＤ４−ｆと、前記挿入変異部位に設計された正方向プライマーＲＴ−ｆと、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＣＣＤ４−ｒとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記ＲＴ−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間で遺伝子増幅産物のみが検出される場合に黄肉品種であると判定し、前記ＲＴ−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記ＣＣＤ４−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合、あるいは前記ＲＴ−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間と、前記ＣＣＤ４−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間の両方で遺伝子増幅産物が検出される場合に白肉品種であると判定する方法が好適に採用される。したがって、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとするとともに、ＭＹＢ１０．１変異をＤＮＡマーカーとし、更にＣＣＤ４変異をＤＮＡマーカーとして組み合わせることで、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することが可能となる。このことから、本発明の紅肉品種の選抜方法に対して、更にＭＹＢ１０．１遺伝子変異及び／又はＣＣＤ４遺伝子変異をＤＮＡマーカーとして前記変異の有無を検出することにより、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することを特徴とするモモ果肉色の調節方法を提供することが好適な実施態様であり、本発明の紅肉品種の選抜方法で選抜されたモモ紅肉品種と他のモモ品種とを交配させ、更にＭＹＢ１０．１遺伝子変異及び／又はＣＣＤ４遺伝子変異をＤＮＡマーカーとして前記変異の有無を検出することにより、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することを特徴とするモモ果肉色の調節方法を提供することが好適な実施態様である。

モモのゲノムＤＮＡの抽出方法としては特に限定されず、モモの葉、茎、根、種子等から抽出用バッファー中においてホモジナイズを行う等、公知の方法で抽出することができる。そして、得られたモモのゲノムＤＮＡを鋳型として、上記説明した遺伝子増幅反応に用いることができる。

本発明で用いられるプライマーとしては、当該挿入変異が含まれる遺伝子増幅産物が特異的に増幅されるように設計されていれば特に限定されないが、上記説明したように、当該挿入変異内と当該挿入変異外にそれぞれプライマーを少なくとも１つ設計することが好ましい。それぞれのプライマーの長さとしては特に限定されず、１５〜４５塩基が好ましく、１８〜３５塩基がより好ましい。

前記遺伝子増幅反応としては、公知のＰＣＲ反応を採用することができる。ＰＣＲ反応としては、上記モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーとともにＴａｑポリメラーゼに代表される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて、（１）変性（９４〜９９℃で５秒〜１分間）、（２）アニーリング（５０〜６５℃で５秒〜１分間）、（３）伸長反応（７０〜７４℃で３０秒〜２分間）からなる前記（１）〜（３）の増幅サイクルを１５〜４５回繰り返すことにより、遺伝子増幅産物を好適に得ることができる。前記（１）変性の前に、初期変性反応を９４〜９９℃で１〜５分間行ってもよい。

前記遺伝子増幅産物を検出する方法としては特に限定されず、前記遺伝子増幅産物をアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等を用いた電気泳動等により好適に検出することができる。複数の遺伝子増幅産物を電気泳動等で検出しやすくする観点からは、正常型と変異型に由来する２つの遺伝子増幅産物のサイズが少なくとも９０ｂｐ異なることが好ましい。

本発明により、モモ紅肉品種を選抜することができる。また、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとするとともに、ＭＹＢ１０．１変異をＤＮＡマーカーとして組み合わせることで、赤みの程度の異なるモモ紅肉品種を選抜することができる。そして、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとするとともに、ＭＹＢ１０．１変異をＤＮＡマーカーとし、更にＣＣＤ４変異をＤＮＡマーカーとして組み合わせることで、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することができる。モモを育種する場合、何年にも渡る期間が必要とされているが、本発明の選抜方法によれば、モモの成長段階に関わらず選別することが可能になり、定植前のモモの幼苗に対して適用することが可能となる。果肉色は消費者の購買意欲に強く影響する重要形質であり、消費者の多様な嗜好に対応した個性的な品種の育成が可能となる。したがって、本発明の選抜方法を定植前のモモの幼苗に対して適用させ、選別された品種を定植するモモの育種方法が好適な実施態様である。このように、本発明によりマーカー支援選抜を好適に行うことができ、圃場スペースや栽培労力の浪費を抑えて育種効率を向上させることが可能となる。

本発明の選抜方法をより簡便に実施する観点から、モモのゲノムＤＮＡと複数のプライマーとを含むモモ紅肉品種の選抜キットであって、前記複数のプライマーが、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＦ１、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２、及び前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲであり、モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記複数のプライマーを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定し、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記Ｆ１と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種ではないと判定するキットを好適に提供することができる。

以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。

１．ゲノムＤＮＡ抽出液
若いモモの葉からDNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて、ゲノムＤＮＡ抽出液を得た。

２．遺伝子増幅反応
（１）プライマー
正方向プライマーＦ１：GGTCCACAACTGAGCTACACTAC（配列番号３）
正方向プライマーＦ２：GAAATAGGGTGAGTGAGCAGAG（配列番号４）
逆方向プライマーＲ：TGGTGATGACTGTGGAGTGA（配列番号５）

（２）ＰＣＲ反応液
ＰＣＲ反応液は、10μLの液量で次の組成になるように調製した。
1 x PrimeSTAR GXL Buffer、0.25mM dNTP、1μM プライマー（上記Ｆ１、Ｆ２及びＲの3種類）、0.025 U/μL DNAポリメラーゼ（PrimeSTAR GXL、タカラバイオ（株）製）、3%以下ゲノムDNA抽出液

（３）ＰＣＲ反応条件
ＰＣＲの反応条件は、変性98℃ 10秒、アニーリング58℃ 10秒、伸長反応72℃ 30秒を30サイクルとした。

３．モモ紅肉品種の判定
得られたＰＣＲ産物を、1 x TAE Buffer内においてアガロースゲルで電気泳動し、断片のサイズを確認した。ここで、ＢＬ遺伝子のプロモーター領域に配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異があると、モモの果肉が紅肉になるとの相関が本発明者らにより見出された。しかしながら、当該トランスポゾン配列の外側に正方向プライマーＦ１と逆方向プライマーＲをそれぞれ設計してＰＣＲ反応を行うと、当該トランスポゾン配列のサイズが６，０００ｂｐを超えているため、当該トランスポゾン配列の挿入変異があるとＰＣＲ産物が得られなかった。これに対し、図１に示されるように、当該トランスポゾン配列の下流に正方向プライマーＦ２を設計することによって、当該トランスポゾン配列の挿入変異がヘテロ又はホモに存在すると、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で増幅されたＤＮＡ断片４６２ｂｐが検出される。当該トランスポゾン配列の挿入変異がない場合、前記Ｆ１と前記Ｒとの間で増幅されたＤＮＡ断片５６１ｂｐが検出される。なお、当該トランスポゾン配列の挿入変異がヘテロの場合は、上記４６２ｂｐと５６１ｂｐのＤＮＡ断片の両方が検出される。なお、配列番号２は、当該トランスポゾン配列の挿入変異を含むＢＬ遺伝子プロモーター領域の配列を示す。
（１）紅肉品種の判定
（ａ）トランスポゾン配列の挿入変異に由来する４６２ｂｐのＤＮＡ断片が検出される場合に紅肉品種であると判定する。
（ｂ）あるいは、トランスポゾン配列の挿入変異に由来する４６２ｂｐのＤＮＡ断片と、正常型に由来する５６１ｂｐのＤＮＡ断片の両方が検出される場合に紅肉品種であると判定する。
（ｃ）正常型に由来する５６１ｂｐのＤＮＡ断片のみが検出される場合に紅肉品種ではないと判定する。

紅肉品種である天津水蜜桃と天津桃太郎を含む２１品種について、上記方法に従って得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果と果肉色を図２上部に示す。図２上部に示されるように、果肉色が白色の白肉品種や果肉色が黄色の黄肉品種には前記トランスポゾン配列の挿入変異は一切検出されず、紅肉品種では当該挿入変異がホモ又はヘテロで存在していた。トランスポゾン配列の挿入変異をヘテロに持つ天津桃太郎と白肉品種とのＦ１交配樹１５本を作成し、上記方法に従って得られたPCR産物を電気泳動した結果と果肉色を図２下部に示す。図２下部に示されるように、白肉と紅肉の形質がおよそ１：１の割合で分離し、トランスポゾン配列の挿入の有無は果肉の紅色形質と完全に一致していた。したがって、トランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとして、モモ紅肉品種を選抜することが可能である。

４．果肉のアントシアニン量とＭＹＢ１０．１の遺伝子型
紅肉品種と白肉品種とのＦ１交配樹の果肉色を調査したところ、図３に示されるように、前記交配樹によって果肉の赤みの程度にばらつきが見られた。紅肉品種の赤みの程度はアントシアニンの蓄積によるものである。紅肉品種と白肉品種とのＦ１交配樹９本について、果肉のアントシアニン量（紅肉品種である天津水蜜桃を１００とした場合の相対量）とＭＹＢ１０．１の遺伝子型を調べた。ＭＹＢ１０．１変異に関しては複数箇所の変異が存在するが、具体的には、配列番号６で示される５，２４３ｂｐの挿入変異を目印にして以下の３つの正方向プライマーＰ１、正方向プライマーＰ３及び逆方向プライマーＰ２を用いてＰＣＲ反応を行うことにより、変異型アレルの検出ができる。ＰＣＲ反応は、上記「２．遺伝子増幅反応」に記載された方法と同様に行うことができる。正常型の場合は、前記Ｐ１と前記Ｐ２との間で増幅された６０９ｂｐのＤＮＡ断片が検出され、変異型の場合は、前記Ｐ３と前記Ｐ２との間で増幅された４２６ｂｐのＤＮＡ断片が検出される。なお、配列番号７は、当該挿入変異を含む変異型ＭＹＢ１０．１遺伝子配列を示す。

正方向プライマーＰ１：GGGAAACGATGTAAAGCCAC（配列番号８）
正方向プライマーＰ３：CGGTTTTGGTCTTGCGCTAT（配列番号９）
逆方向プライマーＰ２：CGAATATCAATGCAGCATCGTG（配列番号１０）

図４に示されるように、ＭＹＢ１０．１変異のないものは果肉の赤みの程度が強く、ＭＹＢ１０．１変異をヘテロに持つものは果肉の赤みの程度が弱い傾向にあった。したがって、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとするとともに、ＭＹＢ１０．１変異をＤＮＡマーカーとして組み合わせることで、赤みの程度の異なるモモ紅肉品種を選抜することが可能である。

５．所望の果肉色を有するモモ品種の選抜
また、果肉色が白色の白肉品種と果肉色が黄色の黄肉品種は、カロテノイド分解酵素ＣＣＤ４の遺伝子型を調べることにより検出することができる。ＣＣＤ４変異に関しては複数箇所の変異が存在するが、配列番号１１で示されるトランスポゾン様配列の挿入変異を目印にして以下の３つの正方向プライマーＣＣＤ４−ｆ、正方向プライマーＲＴ−ｆ及び逆方向プライマーＣＣＤ４−ｒを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、前記トランスポゾン様変異の検出ができる。ＰＣＲ反応は、上記「２．遺伝子増幅反応」に記載された方法と同様に行うことができる。正常型の場合は、前記ＣＣＤ４−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間で増幅された５９４ｂｐのＤＮＡ断片が検出され、変異型の場合は、前記ＲＴ−ｆと前記ＣＣＤ４−ｒとの間で増幅された７２９ｂｐのＤＮＡ断片が検出される。ＣＣＤ４変異をホモに持つものは黄肉品種となり、ＣＣＤ４変異を持たないもの、あるいはヘテロに持つものは白肉品種となる。なお、配列番号１２は、当該トランスポゾン様配列の挿入変異を含む変異型ＣＣＤ４遺伝子の部分配列を示す。

正方向プライマーＣＣＤ４−ｆ：ACCACCTGTTTGACGGAGAC（配列番号１３）
正方向プライマーＲＴ−ｆ：TACCTGAGAGCTTCTCGTGC（配列番号１４）
逆方向プライマーＣＣＤ４−ｒ：TGCTCATGAAGAGCTTGCCA（配列番号１５）

このように、配列番号１１で示されるトランスポゾン様配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとすることによって白肉品種と黄肉品種との選抜が可能になる。したがって、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとするとともに、ＭＹＢ１０．１変異をＤＮＡマーカーとし、更にＣＣＤ４変異をＤＮＡマーカーとして組み合わせることで、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することが可能である。

Claims

モモ紅肉品種の選抜方法であって、
ＢＬ遺伝子のプロモーター領域に、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異をＤＮＡマーカーとし、前記挿入変異が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定することを特徴とするモモ紅肉品種の選抜方法。
モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定する請求項１に記載の方法。
モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＦ１と、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２と、前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲとを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定し、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記Ｆ１と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種ではないと判定する請求項１又は２に記載の方法。
モモのゲノムＤＮＡと複数のプライマーとを含むモモ紅肉品種の選抜キットであって、
前記複数のプライマーが、配列番号１で示されるトランスポゾン配列の挿入変異部位の上流に設計された正方向プライマーＦ１、前記トランスポゾン配列領域に設計された正方向プライマーＦ２、及び前記挿入変異部位の下流に設計された逆方向プライマーＲであり、
モモのゲノムＤＮＡを鋳型として、前記複数のプライマーを用いて遺伝子増幅反応することにより、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種であると判定し、前記Ｆ２と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出されず、かつ前記Ｆ１と前記Ｒとの間で遺伝子増幅産物が検出される場合にモモ紅肉品種ではないと判定するキット。
請求項１〜３のいずれか記載の方法に対して、更にＭＹＢ１０．１遺伝子変異及び／又はＣＣＤ４遺伝子変異をＤＮＡマーカーとして前記変異の有無を検出することにより、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することを特徴とするモモ果肉色の調節方法。
請求項１〜３のいずれか記載の方法で選抜されたモモ紅肉品種と他のモモ品種とを交配させ、更にＭＹＢ１０．１遺伝子変異及び／又はＣＣＤ４遺伝子変異をＤＮＡマーカーとして前記変異の有無を検出することにより、所望の果肉色を有するモモ品種を選抜することを特徴とするモモ果肉色の調節方法。