KR101485544B1 - 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 ｊｎｕｒｆ１３ - Google Patents

Abstract

본 발명은 양파 웅성-불임(Male sterility) 선별용 핵산분자 jnurf13 및 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 jnurf13는 CMS-S에 의한 웅성-불임 및 CMS-T에 의한 웅성-불임을 판별할 수 있다.

Description

양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 ｊｎｕｒｆ１３{Nucleic acid Molecule jnurf13 for Selecting Male-Sterility in Onion}

본 발명은 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 ｊｎｕｒｆ１３에 관한 것이다.

식물에서 생존 가능한 화분립을 생산하지 못하는 세포질성 웅성-불임(Cytoplasmic male-sterility; CMS)은 모계 유전의 특성을 갖는다. 작물학적으로 중요한 많은 작물을 포함해, 약 140 종 이상의 식물에서 자연 발생적 CMS가 확인되었고(Laser and Lersten 1972), Jones 및 Clarke(1943)이 양파 F₁ 교잡 육종법에서 CMS의 사용을 최초로 고안한 후, 많은 작물의 F₁ 잡종 종자 생산이 상업적으로 이용되어왔다. CMS는 F₁ 교잡 육종법의 중요성뿐 아니라, 핵과 미토콘드리아 게놈 사이의 상호작용을 연구하는 이상적인 모델로도 사용되어왔다(Schnable and Wise 1998; Budar et al. 2003; Hanson and Bentolila 2004).

식물의 미토콘드리아 게놈은 진핵 세포 내 오랜 내공생으로 인해, 게놈 구조 측면에 동물 대응부로 나누어졌다. 동물의 미토콘드리아 게놈은 작고, 컴팩트하며, 원형인데 반해, 식물의 미토콘드리아는 확장되고 복잡한 게놈을 갖는다(Budar et al. 2003; Knoop 2004; Kubo and Newton 2008). Brassica hirta(Palmer and Herbon 1987)의 208 kb부터 Silene conica(Sloan et al. 2012)의 11,319 kb에 이르기까지 게놈 사이즈는 다양하지만, 식물의 미토콘드리아 게놈의 가장 뚜렷한 특징은 구조의 복잡성이다. 식물의 미토콘드리아 게놈의 형태가 원형인지 선형인지조차 아직 논란이 많다(Backert et al. 1997; Oldenburg and Bendich 2001; Allen at al. 2007). 또한, 식물의 미토콘드리아 게놈은 다양한 서브게놈으로 구성된 여러 부분으로 나뉜 구조로 존재한다고 일반적으로 알려져 있다. 1 kb 사이즈 미만의 짧은 반복서열(Short repeat sequences)은 동적 미토콘드리아 게놈의 배재열을 중계한다고 알려져 있다(Palmer 1988; Small et al. 1989; Albert et al. 1998; Woloszynska and Trojanowski 2009). 각 서브게놈의 카피 수가 다르고, 때때로 카피 수는 아화학량론적 이동(substoichiometric shifting)으로 불리는 기작에 의해 변화한다(Sakai and Imamura 1993; Bellaoui et al. 1998; Janska et al. 1998; Arrieta-Montiel et al. 2001; Kim et al. 2007). 몇몇의 핵 유전자는 세대를 통해 아화학량론적 이동을 억제하고 서브게놈의 특정 화학량론을 유지시킨다고 보고되었다(Abdelnoor et al. 2006; Zaegel et al. 2006; Shedge et al. 2007).

CMS를 유도하는 미토콘드리아 유전자는 상기 언급한 동적 미토콘드리아 게놈의 재배열에 기인한다고 알려져 있다. 많은 CMS-유도 유전자는 확인된 미토콘드리아 유전자 및 일반적으로 미확인 서열의 부분 서열로 구성된 키메릭(chimeric) 유전자이다. 지금까지 분리된 많은 CMS-유도 유전자는 공통적인 특성을 갖지만, 막통과(transmembrane) 도메인의 소지와 같은 CMS 유도의 정확한 기작은 아직 밝혀지지 않았다(Schnable and Wise 1998; Budar et al. 2003; Hanson and Bentolila 2004).

CMS-관련 유전자로 인한 웅성-불임은 흔히 임성회복(Restorer-of-fertility; Rf) 유전자에 의해 억제된다. 피튜니아(Bentolila et al. 2002), 무(Brown et al. 2003; Desloire et al. 2003; Koizuka et al. 2003), 벼(Komori et al. 2004) 및 수수(Klein et al. 2003)에서 PPR(Pentatricopeptide Repeat) 단백질을 코딩하는 몇몇의 Rf 유전자가 분리되었고, 글라이신-풍부 단백질 또는 알져지지 않은 단백질을 코딩하는 다른 Rf 유전자가 분리되었다(Cui et al. 1996; Fujii and Toriyama 2009; Itabashi et al. 2011). PPR 단백질을 코딩하는 Rf 유전자는 다중-단백질 복합체를 형성하여 CMS-유도 유전자를 억제할 것으로 추정된다(Wang et al. 2006; Gillman et al. 2007; Hu et al. 2012).

양파에서 2가지 형태의 CMS 체계가 보고되었다. Jones 및 Emsweller(1936)는 이탈리안 레드(italian red) 품종으로부터 최초로 웅성-불임 양파를 발견하였다. Jones 및 Clarke(1943)은 단일 우성 유전좌위(Ms)에 의해 임성 회복되는 CMS-S로 명명되는 CMS 체계의 웅성-불임을 보여주었다. CMS-T로 명명되는 다른 CMS 체계는 Berninger(1965)에 의해 발견되었고, 하나의 독립 유전자 및 둘의 상보적 유전자가 CMS-T 웅성 불임의 임성 회복에 관련된다고 알려져있다(Schweisguth 1973). 미토콘드리아(Sato 1998; Engelke et al. 2003; Kim et al. 2009) 및 엽록체 게놈(Havey 1995)의 다형성 서열에 기반하여 양파의 세포질 형태를 구별하기 위해 몇몇의 분자 표지가 개발되었다. 다른 세포질 형태의 엽록체 및 미토콘드리아 게놈의 차이는 CMS의 기원을 추측하는데 사용되어 왔다. 이러한 연구는 CMS-S 및 CMS-T 세포질에 의한 웅성-불임이 각각 종간 교잡 및 종내 교잡에 기인한다고 생각된다(Courcel et al. 1989; Holford et al. 1991; Havey 1993; Kim 2013). CMS-T의 경우에, 엽록체 및 미토콘드리아 게놈 서열의 정상 및 CMS-T 세포질 형태 사이의 다형성 서열은 양파에서 CMS 유도에 대한 후보 유전자 중 하나인 orf725 유전자의 존재를 제외하고, 지금까지 발견되지 않았다(Kim and Yoon 2010; Kim 2013).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자(Ms locus, a restorer-of-fertility gene)와 관련된 신규한 분자표지(molecular marder)를 규명하고, 이를 이용하여 양파의 웅성-가임(male-fertility) 또는 웅성-불임(male-sterility)을 판정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자와 밀접하게 연관되고 CMS-S 및 CMS-T에 의한 웅성-불임을 모두 선별할 수 있는 jnurf13을 규명하였고, 상기 jnurf13이 양파의 Ms 유전좌위와 밀접하게 관련되어 있으며, 이를 분자표지로 이용하는 경우, 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임을 간편하게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 jnurf13을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-불임(Male sterility) 선별용 핵산분자 jnurf13을 제공한다.

본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자(Ms locus, a restorer-of-fertility gene)와 관련된 신규한 분자표지(molecular marder)를 규명하고, 이를 이용하여 양파의 웅성-가임(male-fertility) 또는 웅성-불임(male-sterility)을 판정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 양파의 임성회복 유전자와 밀접하게 연관되고 CMS-S 및 CMS-T에 의한 웅성-불임을 모두 선별할 수 있는 jnurf13을 규명하였고, 상기 jnurf13이 양파의 Ms 유전좌위와 밀접하게 관련되어 있으며, 이를 분자표지로 이용하는 경우, 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임을 간편하게 판별할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 80%의 상동성, 보다바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자 jnurf13은 양파의 F₁ 교잡 육종 프로그램에서 개체의 분리(segregation), 즉 웅성-가임 및 웅성-불임의 개체를 분리하는 데 있어서 분자 표지-기반 선별(molecular marker-assisted selection)에 유용한 분자 표지로 이용될 수 있다.

본 발명의 주요한 특징 중 하나는 상기 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 jnurf13은 CMS-S에 의한 웅성-불임뿐만 아니라, CMS-T에 의한 웅성-불임도 선별할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 양파 웅성-불임은 CMS-S에 의한 웅성-불임 또는 CMS-T에 의한 웅성-불임이다.

본 명세서에서, 용어 ‘CMS-S’ 및 ‘CMS-T’는 양파의 웅성-불임을 유도하는 CMS(Cytoplasmic Male Sterility)의 종류로, 상기 CMS는 미토콘드리아 게놈의 재배열에 의해 유도되는 세포질성 웅성 불임이다. 양파에서 2가지 형태의 CMS 체계가 보고되었으며, 상기 ‘CMS-S’는 단일 우성 유전좌위(Ms)에 의해 임성 회복되는 CMS 체계이고, 상기 ‘CMS-T’는 하나의 독립 유전자 및 둘의 상보적 유전자에 의해 임성 회복되는 CMS 체계로 알려져 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법을 제공한다:

(a) 양파의 gDNA(genomic DNA)을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 gDNA 중 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 단계.

본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법은 양파로부터 gDNA를 수득하고, 상기 gDNA 중 본 발명의 분자 표지 jnurf13을 코딩하는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석함으로써 실시된다. 상기 양파가 웅성-불임인 경우의 jnurf13의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열이고, 상기 양파가 웅성-가임인 경우의 jnurf13의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 분석은 PCR(Polymerase Chain Reaction), CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), RFLP(Restriction Fragment Lennth Polymorphism), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), AP-PCR(Arbitrarily primed PCR), PCR-SSCP(Single-strand Conformation Polymorphism), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), ISSR(Inter-simple Sequence Repeat Amplication), STS(Sequence Tagged Site), EST(Expressed sequence tag), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), DNA 시퀀싱, 마이크로어레이(Microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern Blot) 또는 서던 블럿(Southern blot)을 실시하여 분석한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 분석은 PCR 을 실시하여 분석한다.

상기 PCR 방법은 하기 상세하게 설명한다:

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 jnurf13의 뉴클레오타이드 서열을 분석한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 양파 웅성-가임 또는 웅성-불임을 선별한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 양파 웅성-불임 선별용 핵산 분자 jnurf13의 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동하여 형성되는 밴드가 235-245 bp, 238-242 bp 또는 240-242 bp의 단일 밴드를 형성하는 경우에, 이는 MsMs의 동형 우성(homozygous dominant)의 유전자형으로 웅성-가임으로 판정된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 동형 우성의 유전자형은 서열목록 제2서열이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 양파 웅성-불임 선별용 핵산 분자 jnurf13의 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동하여 형성되는 밴드가 235-245 bp, 238-242 bp 또는 240-242 bp 밴드, 및 225-235 bp, 227-232 bp 또는 228-230 bp 밴드의 2종류의 밴드를 형성하는 경우에, 이는 Msms의 이형(heterozygous)의 유전자형으로 웅성-가임으로 판정된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 양파 웅성-불임 선별용 핵산 분자 jnurf13의 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동하여 형성되는 밴드가 225-235 bp, 227-232 bp 또는 228-230 bp의 단일 밴드를 형성하는 경우에, 이는 msms의 동형 열성(homozygous recessive)의 유전자형으로 웅성-불임으로 판정된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 동형 열성의 유전자형은 서열목록 제1서열이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머;를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다.

상술한 본 발명의 양파 웅성-불임 선별용 핵산 분자 jnurf13의 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머가 이용된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 정방향 프라이머는 정?향 프라이머는 서열목록 제3서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제4서열이다.

본 명세서에서 표현“양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트”는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트”는 “양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 양파의 임성회복 유전자(Ms locus, a restorer-of-fertility gene)와 관련된 신규한 유전자 분자 표지인 jnurf13을 제공한다.

(b) 본 발명은 간편한 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법을 제공한다.

(c) 본 발명의 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 jnurf13는 CMS-S에 의한 웅성-불임 및 CMS-T에 의한 웅성-불임을 판별할 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 Ms 유전좌위와 관련된 단순 PCR 표지의 개발을 나타낸다. 도 1a는 분자 표지에 대한 게놈 워킹에 의해 구한 서열 및 분자 표지에 대한 프라이머 위치를 나타낸다. 게놈 워킹을 통해 확인한 상동 서열을 Ms-관련 서열 밑에 나타내었다. 회색 바는 Yang et al.(2013)이 태깅한 프래그먼트를 나타낸다. 검정 바는 미공개 서열을 나타낸다. Ms-관련 서열 및 상동 서열의 뉴클레오타이드 서열 일치율을 각 상동 서열 옆에 나타내었다. 수평 화살표는 프라이머 결합 부위를 가리킨다. 도 1b는 jnurf12 및 jnurf13 표지에 대한 프라이머 쌍으로 증폭된 F₂ 개체의 PCR 산물을 나타낸다. 도 1c는 jnurf12 및 jnurf13 표지에 대한 프라이머 쌍으로 증폭된 계통의 PCR 산물을 나타낸다.
도 2는 jnurf10 및 PSAO 표지 사이의 교차를 포함하는 11 재조합체의 웅성-가임 표현형 및 분자 표지 유전자형을 나타낸다. 동일한 유전자형 또는 표현형을 나타내는 분자 표지 및 Ms 유전좌위를 회색 또는 빈 박스로 나타내었다. A는 동형 우성, H는 이형, B는 동형 열성 및 D는 동형 우성 또는 이형을 나타낸다.
도 3은 다양한 계통에서 Ms 유전좌위 및 관련된 분자 표지 사이의 연관 관계를 나타낸다. 분자 표지의 웅성-가임 및 웅성 불임 표현형 또는 유전자형은 회색 및 빈 박스로 각각 나타낸다.
도 4는 양파 세포질형의 구별을 위해 개발된 4가지 다른 분자 표지를 이용하여 4 F₂ 파퓰레이션의 세포질형을 확인한 결과를 나타낸다. N은 Normal, T는 CMS-T, S는 CMS-S, 1은 ‘020501’파퓰레이션, 2는 ‘020502’파퓰레이션, 3은 ‘020301’파퓰레이션, 4는 ‘020302' 파퓰레이션을 의미한다.
도 5a 및 도 5b는 양파의 2가지 CMS 체계에 대한 새로운 임성 회복의 유전 모델을 나타낸다. 도 5a는 웅성-가임 표현형의 분리에 영향을 주는 3 유전자의 위치를 모식도로 보여준다. 수평선 및 직사각형 박스는 염색체 부위 및 유전자를 각각 가리킨다. 타원은 세포질 내 CMS-유도 유전자를 가리킨다. Ms는 CMS-S의 Rf 유전자이고, Rft는 CMS-T의 Rf 유전자이다. Det는 유해 유전자(detrimental genes)을 의미한다. 도 5b는 3 유전자의 5가지 반수체형 및 웅성-가임 표현형 및 분리 비에 대한 이의 영향을 나타낸다. 우성 및 열성 대립 유전자를 각각 회색 및 빈 박스로 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

식물 재료

이전 연구(Park et al. 2013)에서 분석된 CMS-S 세포질을 갖는 웅성-불임 계통 및 웅성-가임 반수체배가계통의 교배로부터 유래한 4,273의 분리 집단으로부터 인접 분자 표지 및 Ms 유전좌위 사이의 교차를 함유하는 11 재조합체을 선별하였다. 상기 11 재조합체을 Ms 유전자위와 관계된 새로 보고된 분자 표지의 연계 관련성 분석에 사용하였다.

Ms 유전자위 및 9 개의 관련 분자 표지 사이의 연계관련의 정도를 분석하기 위해, 5군데 양파 육종 기관(대한민국)으로부터 수득한 24 계통을 사용하였다. 가능한 먼 관계의 육종을 선별하였다. 또한, Ms 유전자위 및 가장 밀접하게 관련된 분자 표지 사이의 연계관련 정도를 분석하기 위해, CMS-S 및 CMS-T 세포질을 각각 포함하는 104 및 153 육종을 사용하였다. 6 양파 육종 기관으로부터 상기 육종의 조직 샘플은 수집하였다. 육안 시험을 통해 웅성-가임 표현형을 관찰하였고, 세포질 형태는 Kim et al.(2009)이 개발한 분자 표지를 사용하여 확인하였다.

CMS-T 세포질을 갖는 웅성-가임 육종 및 웅성-불임 부모 계통을 교배하여 생긴 4 F₂ 파퓰레이션을 Ms 유전좌위와 관련된 분자 표지의 웅성-불임 표현형 및 유전자형 사이의 연계 관련성을 분석하는데 사용하였다. 각 F₂ 파퓰레이션을 단일 F₁ 식물의 동화수분으로 생산하였다. F₂ 식물의 웅성-불임 표현형을 육안 시험을 통해 감정하였다.

DNA 추출, PCR 증폭 및 게놈 워킹

육종의 잎 또는 화경 조직으로부터 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)법(Doyle and Doyle 1987)을 이용하여 총 게노믹(genomic) DNA를 추출하였다. CMS-T 세포질을 갖는 다수의 F₂ 샘플은 어린 묘목으로부터 게노믹 DNA를 추출하였다.

분자 표지의 프라이머 서열은 표 1에 기재하였다. PCR 증폭은 공지된 방법에 따라 실시하였다. Cp-cytotype 표지의 경우, 해상도를 향상시키기 위해 89-bp 삽입-결실의 인접 서열(Havey, 1995)을 고안하였다. atp6 표지의 유전형을 분석하기 위해, PCR 산물을 ApoⅠ로 3시간동안 37℃에서 제한효소 처리하였다. PCR 산물은 Et-Br 염색하여 1.5% 아가로즈 겔에서 가시화하였다.

표지	프라이머 서열(5’ to 3’)
	정방향	역방향
Jnurf12	TCACCTTTTACTTGCATCTGGTT	CCATTGGTACTTGATGCAAA
jnurf13	TGCAAGCTTGGAACTTACGC	TTGCCAAAGGTTGCAATACA

0.05 ㎍ 주형, 1 ㎕ 10×PCR 완충액, 0.2 ㎕ 정방향 프라이머(10 μM), 0.2 ㎕ 역방향 프라이머(10 μM), 0.2 ㎕ dNTPs(각 10 mM) 및 0.25 U Taq 폴리머라아제(Prime Tag DNA 폴리머라아제; GeNet Bio, 대한민국)를 포함하는 10 ㎕ 반응 혼합물로 본 연구에서 개발된 분자 표지의 PCR 증폭을 실시하였다. 95℃, 4분의 초기 변성 단계, 95℃에서 30초, 65℃에서 30초(1 사이클 당 0.8℃ 감소) 및 72℃에서 1분으로 10 사이클, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 35 사이클 및 72℃에서 10분 동안 최종 신장하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 산물은 Et-Br 염색 후, 9% 폴리아크릴아마이드 겔에서 가시화하였다.

Yang et al.(2013)에 의해 태그된 초기 분획으로부터 확장서열을 얻기 위해, Universal Genome Walker kit(Clontech, 미국)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 게놈 워킹을 실시하였다. Ms 유전좌위에 대한 동종접합 우성 또는 동종접합 열성의 다른 계통으로부터 3 가지 다른 게놈 워킹 라이브러리를 구축하였다.

실험 결과

CMS -S 세포질에 의한 웅성 -불임의 임성 회복을 조절하는 Ms 유전좌위와 밀접한 관련을 갖는 분자 표지의 개발

최근에 Ms 유전좌위와 밀접하게 연결된 약 0.05 cM의 디스턴스를 갖는 분자 표지인 jnur05(Park et al. 2013)를 보고하였고, 분리 파퓰레이션에서 웅성 불임 표현형을 갖는, 완전한 공동 분리를 나타내는 다른 두 분자 표지가 보고되었다(Bang et al. 2013; Yang et al. 2013). Bang et al.에 의해 개발된 분자 표지, ACms.1100은 122 F₂ 분리 파퓰레이션에서 표지 유전자형 및 웅성-불임 표현형의 완전한 공동-분리(co-segregation)를 나타내고, Yang et al.(2013)에 의해 개발된 두가지 SCAR 표지(DNF-566 및 RNS-357)는 322 BC₁F₁ 개체에서 표현형을 공동 분리하였다. 상기 두 보고(Bang at al. 2013; Yang et al. 2013)의 분자 표지는 연계관계에 대하여 어떠한 정보도 제공하지 않았다.

Ms 유전좌위와 밀접하게 관련된 표지의 연계관계를 결정하기 위해, 4,273 분리 파퓰레이션으로부터 선별된 재조합체의 패널을 새로운 표지로 분석하였다. 두가지 SCAR 표지(DNF-566 및 RNS-357)의 경우, 상기 두가지 표지의 우성 특성으로 인해 표지 유전자형은 명확하지 않았다. 신뢰도를 향상시키기 위해, jnurf12에 대한 공동우성 표지를 개발하기 위한 삽입-결실의 인접 서열에 대해 프라이머 쌍(jnurf12-F 및 jnurf12-R)을 디자인하였다(도 1a). 공동우성 표지를 사용하여 F₂ 개체의 Ms 유전자형을 완전하게 구별하였다(도 1b). 재조합체 분석의 결과는 ACms.1100 표지가 jnurf17 및 jnurf06 표지 사이에 위치함을 보여주며, jnurf12 표지는 재조합체에 관계없이 Ms 유전좌위와 밀접하게 관련되며, 이는 jnurf12 표지가 Ms 유전좌위와 0.05 cM 디스턴스에 위치하는 jnurf05 표지보다 더 밀접한 연관성을 나타냄을 의미한다(도 2).

Ms 유전좌위 및 밀접하게 연관된 분자 표지의 연계관련 평가

jnurf12 표지는 Ms 유전좌위와 밀접하게 연관되어 있기 때문에, 상기 표지는 Ms 유전좌위와 연관관련이 있을 것이다. Ms 유전좌위 및 jnurf12 표지의 연계관련 정도를 평가하기 위해, CMS-S 세포질을 갖는 다양한 계통을 5 곳의 양파 육종 기관으로부터 수득하여 9가지 관련 표지를 분석하였다. 그러나, 다양한 계통의 jnurf12 표지를 분석하는 경우에, 계통 의존적인 다수의 밴드 패턴으로 인해 유전자형이 더 복잡해졌다(도 1c). 삽입-결실 인접 부위에 대해 디자인된 다수의 프라이머 쌍으로 PCR 증폭하였지만, 명확한 표지 유전자형을 얻는데 실패하였으며, 이는 양파 게놈 내 다수의 동형 서열이 존재함을 의미한다.

더 높은 신뢰도를 갖는 분자 표지를 개발하기 위해, 다회의 게놈 워킹을 통해 대략 5.5 kb 서열에 인접하는 jnurf12 표지를 수득하였다. 예상했던대로, 게놈 워킹을 통해 95% 이상의 상동성을 나타내는 동형 서열 쌍을 확인하였다. 확장 서열의 5‘ 말단의 12-bp 삽입-결실을 확인하고, jnurf13를 지정하는 공동 우성 표지를 개발하기 위해, 12-bp 삽입-결실의 인접서열에 대한 프라이머 쌍(jnurf13-F 및 jnurf13-R)을 디자인하였다. jnurf13 표지로 F₂ 개체의 유전자형을 명확하게 구별하였고(도 1b), 다양한 계통의 표지 유전자형도 성공적으로 구별하였다(도 1c). jnurf13 표지를 이용하여 24 계통을 분석한 결과, 웅성-가임 표현형은 jnurf05와 같은 다른 관련 표지에서 관찰된 표현형과 표지 유전자형 사이의 불일치 달리, jnurf13 표지의 유전자형과 완전히 일치하였다(도 3).

CMS -T 세포질성 계통의 웅성 -가임 표현형의 예측에 jnurf13 표지의 적용

Ms 유전좌위 및 jnurf13 표지 사이의 연계관련 정도에 대한 추가적인 확인을 위해, 6 곳의 양파 육종 기관으로부터 더 많은 계통을 입수하여 분석하였다. CMS-S 세포질을 갖는 총 104 계통의 표현형은 jnurf13 표지의 유전자형과 완전히 일치하였고, 이는 두 유전좌위 사이의 완전한 연관관계를 의미한다(표 2). 또한, 놀랍게도, CMS-T 세포질을 갖는 153 계통의 웅성-가임 표현형도 jnurf13 표지의 유전자형과 일치하였다. 이러한 결과는 이전에 보고된 CMS-S 및 CMS-T 체계의 웅성-불임 회복의 유전 기작과 상이하여 예상치 못하였다(Schweisguth, 1973).

양파 육종 기관	분석 계통 수	세포질 형태 및 웅성-가임 표현형
		CMS-S		CMS-T
		MF	MS	MF	MS
A	38	20	17	1	0
B	40	13	18	5	4
C	60	10	20	5	25
D	6	0	0	1	5
E	48	4	0	4	40
F	65	0	2	1	62
총	257	47	57	17	136
관련도		100%	100%	100%	100%

상기 표 2의 MF는 male-fertile, MS는 male-sterile의 약자이다. 상기 표 2의 관계도는 표현형과 표지 유전자형의 일치율을 나타낸다.

CMS-T 및 Ms 유전좌위의 임성 회복 사이의 관계를 분석하기 위해, CMS-T 세포질을 갖는 웅성-불임 모계 양파와 웅성-가임 부계 양파를 교배한 4 F₂ 파퓰레이션을 웅성-가임 표현형 및 jnurf13 표지의 유전자형의 분리를 위해 분석하였다. 예상외로, 4 F2 파퓰레이션의 표현형은 jnurf13 표지의 유전자형과 완전히 일치하였다(표 3). 동일한 F2 파퓰레이션의 세포질 형태를 추가적으로 확인하기 위해, 이전에 개발된 4 분자 표지를 이용하여 각 파퓰레이션의 웅성-불임을 분석하였다. 결과는 모든 F₂ 파퓰레이션의 세포질 형태가 CMS-T임을 보여주었다(도 4).

파퓰레이션	웅성-가임 표현형의 분리				jnurf13 표지 유전자형의 분리
	MF	MS	χ 2	p	A	H	B	χ 2	p
020501	30	10	0	1.00	11	19	10	0.15	0.93
020502	30	6	1.33	0.25	10	20	6	1.33	0.51
020301	41	3	7.76	0.0058	10	31	3	9.6	0.0082
020302	33	7	1.2	0.27	7	26	7	3.6	0.17
Total	134	26	6.53	0.011	38	96	26	8.2	0.017

상기 표 3의 MF는 male-fertile, MS는 male-sterile, A는 homozygous dominant, H는 heterozygousm, B는 homozygous recessive의 약자이다.

3 F₂ 파퓰레이션에서 웅성-가임 및 웅성 불임 개체의 분리비는 3:1이나, ‘020301’파퓰레이션에서의 분리비는 3:1의 비를 크게 벗어났다. 일반적으로, 임성 회복의 단일-유전자 유전을 가정하면, 웅성-불임 식물의 수는 예상보다 적었다. 정확한 유전 기작을 평가하기에는 F₂ 개체의 수가 너무 적기 때문에, 동일한 F₁ 식물로부터 생산된 약 193-560 F₂ 묘목의 jnurf13 표지를 분석하였다. ‘020501’ 및 ‘020302’파퓰레이션은 분리비가 3:1이였으나, ‘020502’ 및 ‘020301’파퓰레이션은 3:1 비를 크게 벗어났다(표 4). 대립유전자 또는 접합 분리 왜곡(segregation distortion)에 의한 분리 왜곡인지 Lorieux et al.이 제안한 두 카이-제곱 분석(1995)을 실시하여 확인하였다(표 4). 결과는 ‘020301’ 및 ‘020302’파퓰레이션에서 대립유전자 분리 왜곡이 관찰됨을 보여준다. 특히, 대립유전자 분리 왜곡의 정도는 ‘020301’ 파퓰레이션에서 심하였고, ‘020501’파퓰레이션에서 접합 분리 왜곡이 관찰되었다.

파퓰레이션	식물 개체 수				예상 비의 χ 2 시험		대립 유전자 빈도		대립유전자 SD의 χ 2 시험		접합 SD의 χ 2 시험
	A	H	B	총	χ 2	p	Ms	ms	χ 2	p	χ 2	p
020501	103	205	100	408	0.05	0.97	0.05	0.05	0.04	0.83	0.01	0.99
020502	115	297	118	530	7.76	0.02	0.05	0.05	0.03	0.85	7.73	0.02
020301	70	94	29	193	17.55	0.00	0.61	0.39	17.42	0.00	0.08	0.96
020302	132	219	99	450	5.16	0.08	0.54	0.46	4.84	0.03	0.21	0.90

상기 표 4의 A는 homozygous dominant, H는 heterozygousm, B는 homozygous recessive의 약자이다. 표 4의 Ms 유전좌위의 유전자형은 jnurf13 표지의 유전자형으로 예측하였다.

종합적으로, 상기 결과는 본 연구에서 분석된 계통 및 F₂ 파퓰레이션의 웅성-가임 회복이 CMS-S 세포질에 의한 웅성-불임에 대한 동일한 Rf 유전자 또는 밀접하게 관련된 Rf 유전자에 의해 조절됨을 나타낸다.

검토

CMS -T 세포질에 의한 웅성 -불임의 임성 회복 유전

Berninger(1965)는 최초로 양파에서 CMS-T 세포질에 의한 웅성-불임을 보고하였고, 단 하나의 보고에서 CMS-T 세포질에 의한 웅성-불임의 임성회복의 유전을 설명하였다(Schweisguth 1973). Schweisguth(1973)은 CMS-T 체계에서 웅성-가임 회복은 하나의 독립된 유전자(a) 두개의 보조 유전자(b 및 c)에 의해 조절되고, 이러한 세 유전자는 CMS-S 체계의 Rf 유전자인 Ms 유전좌위와 독립적이라고 제시하였다. 그러나, 본 발명진은 4 F₂ 파퓰레이션 및 CMS-T 세포질을 포함하는 다양한 계통에서 jnurf13 표지를 이용하여 웅성-가임 표현형 및 유전자형을 완전히 공동-분리하였다. juurf13 표지는 CMS-S 체계의 Ms 유전좌위와 연계관련을 갖는다. 또한, 2 F₂ 파퓰레이션에서 웅성-가임 표현형 및 jnurf13 표지 유전자형의 분리 왜곡이 관찰되었다. 이러한 결과에 기초하여, CMS-T 체계의 임성 회복에 대한 유전 기작의 새로운 모델을 제안하였다(도 5a).

첫째로, CMS-T 체계에서 임성 회복은 3 Rf 유전자에 의해 조절되지 않는다. Schweisguth(1973)은 3 유전자 유전 모델로 24 파퓰레이션에서 웅성-가임 표현형의 복잡한 분리를 설명하였다. 그러나, 각 파퓰레이션을 구성하는 개개의 수가 신뢰성을 갖는 유전 기작을 추론하기에 너무 적었다. 파퓰레이션의 샘플 크기는 14에서 44 개체였다. 적은 샘플 크기에도, 웅성-가임 및 웅성-불임 식물의 분리비는 단일 유전자 유전 모델로부터 상당히 벗어났다. 이러한 왜곡된 분리를 설명하기 위해, Schweisguth(1973)은 3 유전자 유전 모델을 제안하였다. 그러나, 이는 복잡한 분리비를 나타내는 세가지 Rf 유전자가 아닌 단일 Rf 유전자에 의해 가능하였다. 본 발명자들은 단일 F₂ 파퓰레이션에서 웅성-가임에 대한 웅성 불임의 비는 거의 10:1임을 관찰하였고, jnurf13 표지가 태깅된 단일 Ms 유전좌위의 유전자형은 왜곡된 표현형 분리와 완전하게 매칭된다는 것은 단일 유전자 유전 모델을 뒷받침한다. 이전에, CMS-S 세포질을 갖는 분리 파퓰레이션에 웅성-가임 표현형의 분리 왜곡이 관찰되었다(Jones and Clarke 1943; Gke et al. 2002; Park et al. 2013). 특히, 거의 3,000 개체를 갖는 분리 파퓰레이션을 이용하여 대립 유전자 분리 왜곡을 평가하였다(Park et al. 2013).

이는 Ms 유전좌위와 연관된 유해 유전자에 의한 분리 왜곡으로 추정된다(도 5a). 본 연구에서처럼, 만일 이러한 유전자의 유해 대립 유전자가 우성 Ms 대립유전자와 관련이 있다면, 예상보다 더 많은 웅성-불임 개체가 나타날 것이나(도 5a의 반수체형 1), 만일 상기 유해 대립 유전자가 열성 Ms 대립유전자와 관련이 있다면, 더 많은 웅성-가임 개체가 관찰될 것이다(도 5b의 반수체형 2). 그러나, 도 5b의 반수체형 3 및 4와 같이, 만일 어떠한 유해 유전자가 Ms 대립유전자와 연관되어있다면, 웅성-가임 표현형의 분리는 단일-유전자 유전 모델에 맞게 된다. 실제로, Schweisguth(1973)에 의해 통계적으로 분석한 24 파퓰레이션 중 18 이상의 분리비는 단일-유전자 유전 모델에 해당하였다. 두 파퓰레이션에서 웅성-불임 개체비가 예상보다 높게 관찰되었으나, 4 파퓰레이션에는 웅성-불임 개체의 수가 상당히 감소하였다.

둘째로, 본 연구의 결과는 CMS-S 체계에서 Ms 유전좌위는 CMS-T 체계의 3 종류 Rf 유전자 중 하나와 일치함을 시사한다. 그러나, CMS-T 체계의 3 종류의 Rf 유전자는 Schweisguth(1973)이 보고한 결과에 따르면, Ms 유전좌위와 일치하지 않는다. 그는 동형 우성 Ms 대립유전자로 구성된 3 웅성-가임 계통이 CMS-S 세포질을 갖는 웅성-불임 개체와 교배하는 경우에, 임성 회복하였으나, 동일한 3 웅성-가임 계통이 CMS-T 세포질을 갖는 웅성-불임 개체와 교배하는 경우에, 임성을 회복하지 못하고, 100% 웅성-불임 자손인 결과를 보여주었다. 만일 CMS-T 체계의 3종류의 유전자중 하나가 Ms 유전자와 일치한다면, 동형 우성 Ms 대립유전자로 구성된 웅성-가임 개체와 교배할 경우에, CMS-T 웅성-불임의 임성이 회복되었을 것이다. 그러므로, 3-유전자 유전 모델에서 3 종류의 Rf 유전자 중 하나, 또는 단일-유전자 유전 모델에서의 단일 Rf 유전자는 Ms 유전좌위와 밀접하게 연관되어있을 것이다.

본 발명자들은 CMS-T 체계에서 웅성-가임 회복의 유전에 대한 새로운 모델을 제시하였다. 그러나, Schweisguth가 사용한 식물 재료를 세포질 형태를 구별하기 위해 사용하는 jnurf13 표지 및 다른 분자 표지를 이용하여 분석할 수 없기 때문에, Schweisguth(1973)에 의한 CMS-T 세포질로 간주되는 세포질 형태는 본 발명에서 사용된 CMS-T 세포질과 다를 수 있는 가능성을 제외할 수 없었다. CMS-T 체계의 정확한 회복 기작뿐 아니라, CMS-S 및 CMS-T 웅성-불임 사이의 관계를 설명하기 위해, 웅성-불임 유도 및 회복과 관련된 유전자의 클로닝과 같은 추가적인 연구가 요구될 것이다.

양파의 Ms 유전좌위와 연계관련 갖는 분자 표지 개발

본 발명진은 Yang et al.에 의해 태깅된 초기 프래그먼트로부터 확장한 서열에 기초하여 Ms 유전좌위와 연계관련에 위치한 분자 표지, jnurf13를 개발하였다. Yang et. al.에 의해 개발된 우성 표지와 비교하여, jnurf13은 대규모 개체의 정확한 분석에 적합한 공동우성 표지이다. 세포질 형태의 구별을 위한 분자 표지와 같이, 상기 jnurf13 표지는 양파 F₁ 교잡육종법에 매우 유용하다(Kim et al. 2009). 양파는 2년생 작물이기 때문에, jnurf13 분자 표지 없이, 자손 시험법을 사용하여 Ms 유전자형을 확인하기 위해서는 최소 4년이 소요된다. 그러나, jnurf13를 사용하면 혈통이 불명확한 양파의 유전자형을 확인하는데 단 하루면 충분하다. 이전에 개발된 분자 표지(Gke et al. 2002; Park et al. 2013)는 다양한 계통에서 Ms 유전좌위 및 연관된 분자 표지 사이의 높은 연관관계로 인해, 불명확한 혈통을 갖는 양파의 Ms 유전좌위를 지노타이핑 하는데 한계를 갖는다.

활용성에 있어서도, jnurf13 표지는 Ms 유전자를 클로닝하는데 발판이 될 것이다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Nucleic acid Molecule jnurf13 for Selecting Male-Sterility in Onion <130> PN130511 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5685 <212> DNA <213> RecessiveMs-linked sequences jnurf13 <400> 1 ctactctgta ttgcaagctt ggaacttacg ctaactcaat tttttgaaaa tacgccattt 60 aaaaatctgt aaacttcctg aattatcagc ttagtgtagt ttagttgttt aatctcagaa 120 tagtatttct ggaatttcac aaaatagaga ttcacttatc catccttata tatttgatat 180 tcatatatga tcgtaatgtt atctgtctcg cagtttactc tgtattgcaa cctttggcaa 240 gtcatatatt ttaactgaaa atatataaat aaaaaattaa tgaaacagta aattatcaac 300 ataatgtagt caattcagtt actttgctta aatacactga aatgttggaa tgtaacaagt 360 aacgtgccat ggatgtaaca aatcaatgca aaacaactga agtttaggcg ttgggggtat 420 gtctacaaat gagttaggaa gggatataat taccatttta aggaatagtt gattgttctc 480 agatatttat gtatctaaca cggctctgat tgaaacaata tcacaattct tctcgtaaat 540 cacaatactt gaacaggata taaaatcatt tatatgggta aaaactgctg atggcactat 600 acaacaagta gaagaagatg ttgcctcgca ctacctcttg atatttgcag atagaaatca 660 tgctggcatg ggatcttcaa gaaattatcc catttcttta ccccagagag tcaatgaagc 720 ttctctcaat gctatcctgg atttttgccg cttccatcaa gtttcaggtc gttctaacaa 780 ggttcgtata tttgtacttt tcaaaaagtt aggacaacaa taaccgttat actctataca 840 gggcataatt tatgtacaat agtaaaagat ccactattat ttgggagggc attaatactg 900 aggaacttac gtcgggtata tactggagat agccatgata ataatgttta gatcatttgt 960 gctttgtcaa aatatcatat ctgctaaccg gacaggcagt atgttcatat gcaagccatg 1020 ttttcctggt attatgcaag ctgcgcatat cagaagttca gaaattgaag ctctttttat 1080 tattctagga gcgaaaatcc ttcaatgaaa attttgttaa aatggacact gaaagattgt 1140 tggaattatc atccgcagct gatgctctgc aaatagcacc tttagttcat ctcacatgta 1200 cagcacttgc tcgtaaaata gaagaaaaat ctcctgaaga ggttcgagaa atatttcatt 1260 tagctgacga tctgacagag gtacatatct cattcatgca atacacagct tctagaagaa 1320 tctttgttca ttgttttgcc tttgggcatt aggaagagaa gctagagcca tttagaaata 1380 tttgcgaccc acggattcga ttgttaaatc gtctgagtgc caagaaaaga aaagagctgg 1440 aggagaaaaa actgtcgaag gtgatgatcc atgtcatttg ttaatttgct gttttttttt 1500 ggaactagac tgttcattat atatcttatc ctttcagaag tctatgttta tatatttatt 1560 cagaatgcag aaactgaaga gagtgcagat gtgggcggtg ataaacgttc agttgatgac 1620 ctcttatcat ttataaatgg agaagatgaa ggtaaaattt tgggatatat catgtaataa 1680 tttatacacg gtgtttgttt ttctgattgc tgcagtttat tactaatata tgctgaaatt 1740 gtctaaatgt ttacagataa aggcaaaaag gttaaaaaga ataaaaagaa aactaaaaga 1800 aggaaagatc caccaaaaga taattctagt gatggcccca aaaatacaca tgaaaaggtt 1860 atttgcctta tccagtgtgc attttgaagc cgtgaaatat ttattttgat gtacttagtt 1920 acattctagg aggctgcttg caatcgaaat gatgatccat cttccactaa tccaagtaca 1980 agttcaatgc tacaagattt ttcaaatatc gagttagatg atgatgatga tgctttcagc 2040 gacttagatt tagaacctga agagaaggaa aaattggaca ggtacacagc attttggcgt 2100 tgtattttat aacaacagta atcaacatta gcttccctta agactttcct ctaattcctc 2160 tgtgtgtgtg tgtaatttct ctgtgtgtgt gttgtttttt gctctgtaaa gccaaccaat 2220 tttttgattt gttactaaaa ctaatatacc tcttccggga tatgcaggga aatcgaagag 2280 tttgcaaaaa gattaaatga tgagtggttg tcaaaaggaa aacagccaaa 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ttcacaatat 4860 tgaatctata tatttaacgt atcggttttg ttcatcatac aatattgtat ttttatcgta 4920 ctattttctt tagattcttt actgaaaatg aatgatatac tcctttctta gttctactaa 4980 gctttacctt ttgatcctat tgcatttctc caattttcta atttctgttc tatcttctct 5040 ttagaggtat caatcaacac aatgaactca gcaaaaattc acaccatggt atctcatctt 5100 ggaaatcctt tattatttca tctaaaatta gcacgagtaa atatgactta aaatcgatcc 5160 gtgatgtaat ctcaccttta tcgaaatttc attagtctct acacacgtag atcgcacttt 5220 aaccttagat ccctcgtaca tatcttgaat tatctttatt agtgttgtaa cgacccgatt 5280 tttttgacgt ccgaaagtcg acatcgatac gtccactgta tccaatgccg cacagtcgaa 5340 tgccgaaaaa ccgaaccgtt agggtttaag aagaagaagt tagaagaaga acagtaacaa 5400 caacaaaatc tcacatttca cagcgaaacg aatataatag ataaatgaat aatctttacc 5460 ctgccattgc ttttacggcc agcctttcga tcgccacgcc ttacggctaa ccaacccctt 5520 aaagaggacg tgcaggggta agagtctcct gctcgccacc aaacaaaaag cgagaacccc 5580 ccatcacgtt tcacaaagat aagcaaggtc agtcgtggga ctggtgtgag atcttaaaaa 5640 cagttatttt cacaaagaga ataaaaacaa atccgctatg ctttg 5685 <210> 2 <211> 5420 <212> DNA <213> Dominant Ms-linked sequences jnurf13 <400> 2 ttattataaa tcatttttgt atttctagca ttttatatta cataaagtga atttttaact 60 gtaattagag ctacacatta ttcttgtata tagttattct tcatgtcact tgatataact 120 gtctaaatat ttaatacaaa ttacgttaca tgtgagtgga atgtgttgag aataataatc 180 tcacattgga aattaacatc tgtggaacct aaatgatcat taatagactc acctttacat 240 tttcaattga ttttatgatc agatttactt ctccagtaac gtataacaag tggcagtctt 300 acaaaaatta acattatata atttttaaaa tttcacatag tagataatca cttatcctta 360 cattgccttg ctaaacagtt gtagaagttt gcctgttatt ttgtgctcta ctctgtattg 420 caagcttgga acttacgcta actcaaattt ttgaaaatac gccatttaaa aatctgtaaa 480 cttcctgaat tatcaactta gtgtagttta gttgtttaat ctcagaatag ttagcattct 540 agtatttctg gaatttcaca aaatagagat tcacttatcc atccttatat atttgatatt 600 catatatgat tataatgtta tctgtcttgc agtttactct gtattgcaac ctttggcaag 660 tcatatactt taactgaaaa tatataaatt aaaaattaat gaaacagtaa attatcaaca 720 taatgtagtc aattcagtta ttttgcttaa atacactgaa atgttggaat gtaacaagta 780 acgtgccata 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cgtaaaatag atgaaaaatc tcctgaagag gttcgagaaa tatttcattt 1680 acctgacgat ctgacagagg tacatatatc attcatgcaa tacacagctt ctagctgaat 1740 ttttattcat tgttttgcct ttgggcatta ggaagagaag ctagagccat tcagaaatat 1800 ttgcgaccca cggattcgat tgttaaatcg tctgaatgcc aagaaaagaa aagagctgga 1860 ggaggaaaaa ctgtcgaagg tgatgatcta tgtcatttgt taatttgctg ttttttttgg 1920 aacaagactg ttcattatat atcttatcct ttcagaagtc tatgtttata tatttattca 1980 gaatgcagaa actgaagaga gtgcagatgt gggcggtgat aaacgttcag ttgatgacct 2040 cttatcattt ataaacggag aagatgaagg taaaactttg ggatatatca tgtaataatt 2100 tatacacggt gtttgttttt ctgattgcta cagtttatta ctaatatatg ctgaaattgt 2160 ctaaatattt acagataaat gcaaaaaggt taaaaagaat aaaaagaaaa ctaaaagaag 2220 gaaagatcca ccaaaagata attctagtga tggctccaaa aatacacatg aaaaggttat 2280 ttgccttatc cagagtgcat tttgaagccg cgaaatattt attttgatgt actttagtta 2340 cattctagga ggctgcttgc aatcgaaatg atgatccatc ttccactaat ccaagtacaa 2400 gttcaatgct acaagatttt gcaaatatcg agttagatga tgatgatgat gctttcagcg 2460 acttagattt 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tttcttcctt tctagtatat gacaccagaa gtgtatataa tacttctttt 3360 ttcgtagttt ctacttcttc atacaatttt attgtcttca tcgttaacgt catcaaccgt 3420 tcatcaaatt ctaaaattac agatttgttt atcttcttct tcttcttcct ttttactttc 3480 aggattgaag cggagatgaa gccaaagagc tcatgtacaa aattagttag tgctgatttt 3540 tcaagcaggg aaggccaatt gacttccata ttgctattct tttgtccctg aattcttgaa 3600 gattttgaca ttgaaatagt ttcacagtaa accaaaattg ggatttttgc tggtaaaaaa 3660 gaaagaaaag cttggtctac actttagtct tttatggtca ccttttactt gcatctggtt 3720 tattttattt tagtttttca gtttttatct aatttgctag gttgtatata tgaaaattaa 3780 aatgctgaaa tagttatata tgaacacacg tacacaaaaa cagaagtcag aacaccaaat 3840 agttatatga aaattaaaat gctgaaatga tacataaatt taataatgca cgtttattat 3900 gggaggaaat ttcagtatct atagaattac tgaaaattga taaaaaattt ccaagtgaat 3960 aaatttggct aaacctgggt aagagtacat cctaacaaat gaaaatcaat tttgtacatg 4020 atttagctgg ctaatattgg taaaatatcg atagcggatc agtatgcaat attgggacaa 4080 tggaagacgt aaatgttttt tgttatcacg ttaactgatt cttctgttta gtaatatgta 4140 tcaatatgaa 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taccctctct ctctcacttt taattctatg taattccaac aatctctctt 5040 accgctctcg ttttttctat aattaactta tttttttgtt tcttttttaa gggccaatat 5100 tctatacaat atcgcaagtc taatgttgta cgataaaatt tcccttctag tttctgttgt 5160 attcttctat cacatagaat gacaataact tatctttatt ttacccaact tatgcttatt 5220 taatttgtta tctctttcta tctcctcatc ctttcataat attgaatcta tatatttaac 5280 gtatcggttt tgttcatcat acaatattgt atgtttatcg tactattttc ttcaaattct 5340 ttactgaaaa tgaatggtat actcctttct tagttctact aagctttacc ccttttggtc 5400 ctattgcact cctcaaattt 5420 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for jnurf13 <400> 3 tgcaagcttg gaacttacgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer for jnurf13 <400> 4 ttgccaaagg ttgcaataca 20

Claims (7)

1. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-불임(Male sterility) 선별용 핵산분자 jnurf13.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 양파 웅성-불임은 CMS-S에 의한 웅성-불임 또는 CMS-T에 의한 웅성-불임인 것을 특징으로 하는 양파 웅성-불임 선별용 핵산분자 jnurf13.
   
3. 다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법:
   (a) 양파의 gDNA(genomic DNA)을 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 gDNA 중 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 단계.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 분석은 PCR(Polymerase Chain Reaction), CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), RFLP(Restriction Fragment Lennth Polymorphism), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), AP-PCR(Arbitrarily primed PCR), PCR-SSCP(Single-strand Conformation Polymorphism), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), ISSR(Inter-simple Sequence Repeat Amplication), STS(Sequence Tagged Site), EST(Expressed sequence tag), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), DNA 시퀀싱, 마이크로어레이(Microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern Blot) 또는 서던 블럿(Southern blot)을 실시하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 분석은 PCR을 실시하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머;를 포함하는 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별용 키트.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열목록 제3서열이고, 상기 역방향 프라이머는 서열목록 제4서열인 것을 특징으로 하는 키트.

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