CN111088385A - 一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法，可对自然生长的雌雄异株植物直接进行性别鉴定，避免了使用多个成年雄株和雌株实验杂交产生的后代进行性别鉴定，鉴定周期漫长，方法繁琐。筛选出的雌雄异株植株的性别特异性标记M1和M2，对自然环境下生长早期的雌雄异株植株种群进行性别鉴定，具有简单、准确和高效的特点。
Description
技术领域
本发明属于植物鉴别领域，具体涉及一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法。
背景技术
全世界雌雄异株植株超过15000种。在绝大部分雌雄异株植物幼年期，无法通过形态性状对其性别进行准确鉴定，给这类型植物在林业和农业生产、应用带来很大的阻碍。目前，常规性对雌雄异株植物幼年期进行性别鉴定主要是利用扩增片段长度多态(AmplifiedFragment Length Polymorphism,AFLP)、随机扩增DNA多态性(Random amplification ofpolymorphic DNA，RAPD)、简单重复序列间(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、序列扩增区域(sequence characterized amplified regions，SCAR)、相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP)和简单重复序列(Simple SequenceRepeat，SSR)等技术对植物进行性别特异性分子标记。但这些方法是基于PCR技术进行的，需要极大量的引物或引物对来筛选与性别相关的标记，因此费时又费力并且效率低下。
RAD-seq是一种基于基因组限制性酶切和高通量测序的一种新技术，可以在很短的时间内完成几万甚至几十万个基因组位点的测序。由于许多雌雄异株植物为木本植物，世代周期长或者种子数量少，因此在许多木本植物中进行实验性杂交是不切实际的。即使对于一年生植物，构建作图群体需要花费大量的人力物力和时间，这限制了RAD-seq技术在雌雄异株植物性别鉴定中的应用。
ddRAD-seq建立的文库存有大量的信息。但无人报道是否存在部分信息可用于雌雄异株植物性别的鉴定。根据上述问题，探索可用于鉴别雌雄异株植物性别的信息成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于利用基因组限制性酶切和高通量测序技术，使用改进的双酶切RAD-seq(ddRAD-seq)方法，简单、快速、准确和高效地对幼年期的雌雄异株植株进行性别鉴定。除非特定说明，以下试剂均为市售。
本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，提出性别特异性ddRAD基因座M1和M2。根据本发明的实施例，所述基因座M1和M2的核苷酸序列如下：
M1：
GGAAAATTTCCATGTGATTCAGATCTTGAGAAATATTTAGATCACATGGTTCATATTCCTGTTAGCGAACTCCAGTATTAGATCACATG；
M2：
CGTGGCAATACAATAACAAAAACAGAAAATAATAACAACAGCAATACAGTTTTTACAATAAATCGTTGGGAATTGCTCATATACTAGCCGAC。
本发明第二个方面，提出一种扩增前面所述性别特异性ddRAD基因座M1和M2的引物组。根据本发明的实施例，所述引物组的核苷酸序列如下：
M1
M1-F：GCATTGATAGTGTGGATCATGC；
M1-R：CCATGTGATTCAGATCTTGAGAA；
M2
M2-F：CGCATACGTACGCCACTTAG；
M2-R：CGCAAGCAGCCTAAGGGATCAA。
本发明第三个方面，提出一种检测雌雄异株植物生长早期性别鉴定的试剂盒，包括前面所述引物组。
本发明第四个方面，提出一种载体，包括上述所述性别特异性ddRAD基因座M1和M2。
本发明第五个方面，提出前面所述的性别特异性ddRAD基因座、引物组在制备雌雄异株植物生长早期性别鉴定试剂盒中的应用。
本发明第六个方面，提出一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：
1)提取样本的基因组DNA；
2)以提取的基因组DNA作为模板，使用前面所述的引物组M1-F、M1-R、M2-F和M2-R进行PCR扩增；
3)对所述扩增片段进行分析，以鉴定样本的性别。
根据本发明的实施例，所述雌雄异株植物为海漆属植物。
根据本发明的实施例，所述海漆属植物为海漆。
根据本发明的实施例，所述早期性别鉴定为雌雄异株植物开花前性别鉴定。
根据本发明的实施例，步骤3)所述样本性别鉴定方法：若M1引物在样本中扩增出3个条带，则样本为雄性；若在样本中扩增2个条带，则样本为雌性。
根据本发明的实施例，步骤3)所述样本性别鉴定方法：若M2引物在样本扩增出1个条带，则样本为雄性；若在样本中没有扩增出条带，则样本为雌性。
本发明的有益效果：
本发明可对自然生长的雌雄异株植物直接进行性别鉴定，避免了使用多个成年雄株和雌株实验杂交产生的后代进行性别鉴定，鉴定周期漫长，方法繁琐。筛选出的雌雄异株植株的性别特异性标记，对自然环境下生长早期的雌雄异株植株种群进行性别鉴定，具有简单、准确和高效的特点。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步的描述说明。
实施例1
本发明根据已构建好的ddRAD文库，选取ddRAD基因座(M1和M2)，M1的核苷酸序列：
GGAAAATTTCCATGTGATTCAGATCTTGAGAAATATTTAGATCACATGGTTCATATTCCTGTTAGCGAACTCCAGTATTAGATCACATG(SEQ ID NO.1)；
M2的核苷酸序列：
CGTGGCAATACAATAACAAAAACAGAAAATAATAACAACAGCAATACAGTTTTTACAATAAATCGTTGGGAATTGCTCATATACTAGCCGAC(SEQ ID NO.2)。
根据上述核酸序列设计了分别针对M1和M2的PCR引物；本发明经过大量筛选，分别筛选出灵敏度高和特异性强的引物，序列如下：
M1：
M1-F：GCATTGATAGTGTGGATCATGC(SEQ ID NO.3)；
M1-R：CCATGTGATTCAGATCTTGAGAA(SEQ ID NO.4)；
M2：
M2-F：CGCATACGTACGCCACTTAG(SEQ ID NO.5)；
M2-R：CGCAAGCAGCCTAAGGGATCAA(SEQ ID NO.6)。
实施例3
一种载体，包括实施例1所述ddRAD基因座M1和M2的核苷酸序列。
对比例1
雌雄异株植物红背桂(Excoecaria cochinchinensis)生长早期性别鉴定的方法：
用本发明的M1和M2基因座的引物，分别在雌雄异体的红背桂进行跨物种扩增。
结果：M1在红背桂扩增出条带，但未扩增出雄性特异性条带，雌、雄之间扩增结果差异不明显。M2在红背桂中没有扩增出雄性特异性条带。说明本发明的M1、M2具有较高的特异性。
对比例2
雌雄异株植物云南土沉香(Excoecaria acerifolia)生长早期性别鉴定的方法：
用本发明的M1和M2引物，分别在雌雄异体的云南土沉香进行跨物种扩增。
结果：M1在云南土沉香扩增出条带，但未扩增出雄性特异性条带。M2在云南土沉香中没有扩增出雄性特异性条带。说明本发明的M1、M2具有较高的特异性。
下面对本发明M1和M2基因座进行验证实验。
1.性别特异性ddRAD基因座M1、M2的PCR验证
方法：PCR程序为：94℃初始变性4分钟，然后进行30个变性周期(94℃时45s)，退火(56和62℃时40s)和延伸(72℃时25s)。
结果：经PCR验证，使用M1引物扩增，检测发现M1在20个海漆雄株中可扩增出3个条带，但在20个海漆雌株中仅扩增出2个条带。M2在海漆雄株中可扩增出1个条带，但在海漆雌株中不能扩增出条带。
可知，本发明海漆雌株特异性标记M1和M2是基于PCR的性别鉴定的理想性别特异性标记。其中，M1效果更显著，可以作为鉴定海漆植物性别的首选，因为可以在M1基因座获得具有不同带型的雄性和雌性PCR产物。
2.种苗性别鉴定验证
本发明筛选出的M1分别对100颗海漆的种子和100株苗龄为1个月的海漆幼苗进行性别鉴定。
结果显示，海漆植物的种子雌、雄性别比为49：51，海漆幼苗雌、雄性别比为45：55，性别比没有明显偏离1：1，表明本发明的基因座M1具有很高的准确性，能够鉴别海漆雌雄异株植物的性别。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州普邦园林股份有限公司、
中山大学、广州捷锐生物科技有限公司
<120> 一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaaaatttc catgtgattc agatcttgag aaatatttag atcacatggt tcatattcct 60
gttagcgaac tccagtatta gatcacatg 89
<210> 2
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtggcaata caataacaaa aacagaaaat aataacaaca gcaatacagt ttttacaata 60
aatcgttggg aattgctcat atactagccg ac 92
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcattgatag tgtggatcat gc 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccatgtgatt cagatcttga gaa 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcatacgta cgccacttag 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgcaagcagc ctaagggatc aa 22
Claims (10)
1.性别特异性ddRAD基因座M1和M2，其特征在于，所述基因座M1和M2的核苷酸序列如下：
M1：
GGAAAATTTCCATGTGATTCAGATCTTGAGAAATATTTAGATCACATGGTTCATATTCCTGTTAGCGAACTCCAGTATTAGATCACATG；
M2：
CGTGGCAATACAATAACAAAAACAGAAAATAATAACAACAGCAATACAGTTTTTACAATAAATCGTTGGGAATTGCTCATATACTAGCCGAC。
2.一种扩增权利要求1所述性别特异性ddRAD基因座M1和M2的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：
M1
M1-F：GCATTGATAGTGTGGATCATGC；
M1-R：CCATGTGATTCAGATCTTGAGAA；
M2
M2-F：CGCATACGTACGCCACTTAG；
M2-R：CGCAAGCAGCCTAAGGGATCAA。
3.一种检测雌雄异株植物生长早期性别鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物组。
4.一种载体，其特征在于，包括权利要求1所述性别特异性ddRAD基因座M1和M2。
5.权利要求1～2任一所述的性别特异性ddRAD基因座、引物组在制备雌雄异株植物生长早期性别鉴定试剂盒中的应用。
6.一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样本的基因组DNA；
2)以提取的基因组DNA作为模板，使用权利要求2所述的引物组M1-F、M1-R、M2-F和M2-R进行PCR扩增；
3)对所述PCR扩增条带进行分析，以鉴定样本的性别。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述雌雄异株植物为海漆属植物。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述海漆属植物为海漆。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤3)所述样本性别鉴定方法：若使用M1引物在样本中扩增出3个条带，则样本为雄性；若在样本中扩增2个条带，则样本为雌性。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤3)所述样本性别鉴定方法：若M2引物在样本扩增出1个条带，则样本为雄性；若在样本中没有扩增出条带，则样本为雌性。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200501 |
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