JP4540856B2 - キメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の新規安定化方法、および安定化された抗EGP−2scFv断片 - Google Patents
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Description
本発明は、キメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を安定化するための方法に関する。さらに、本発明は、安定化された抗EGP−2 scFv断片を提供する。
【0002】
小さな抗体断片は、治療用薬剤、診断用薬剤として、および生化学の研究に使用するために大いに期待されている。このように、これらの断片は、大量に必要とされ、抗体断片、例えばE. coli のペリプラズムにおける、Fv、 一本鎖(single-chain)Fv(scFv)またはFab(Skerra & Pluckthun 1988;Better et al., 1988)は今日、多くの研究室において日常的に使用されている。しかしながら、発現の量は、特にscFvの場合大きく変化する。振盪フラスコ中の培養液LおよびODあたり、機能的で可溶性のタンパク質が数mgまで得られる断片もあるが(Carter et al., 1992, Pluckthun et al. 1996)、他の断片は、しばしばいわゆるインクルジョンボディーにみられる、ほほ全くといっていい程不溶性の物質になり得る。機能的なタンパク質は、骨の折れる時間のかかる再折り畳み過程によって、そのような断片からある程度の量で得られる。未だに、抗体発現レベルに影響を与える因子は少ししかわかっていない。抗体断片の折り畳み効率と安定性、宿主細胞に対する発現したタンパク質のプロテアーゼ不安定性と毒性によって、実際の産生レベルがしばしば重大な制限を受け、発現量を増加させるためのいくつかの試みがなされている。例えば、Knappik & Pluckthun(1995)は、抗体フレームワークにおいて発現量に劇的な影響を及ぼす鍵となる残基を同定した。同様に、Ullrich et al.(1995)は、CDRにおける点変異によってペリプラズム抗体断片の発現量が増加することを見出した。それでもやはり、これらの方策は数少ない抗体に適用されているに過ぎない。
【0003】
Knappik & Pluckthun(1995)の観察は、抗原認識に直接関与しない抗体断片の部分を最適化することによって、組換えFvおよびscFv構築物の折り畳み特性と収量を有意に改善することができることを示している。改善された発現様式が、これら分子の減少した凝集様式の原因である。他の分子については、断片の安定性およびプロテアーゼ耐性も影響するであろう。特定の配列の修飾がこれらの特性をどのように変化させるかについての理解は、なおごく限られており、現在も盛んに研究されている。
【0004】
一本鎖Fv断片(scFv)は、可動性のペプチドリンカーによって連結した重鎖と軽鎖の可変領域からなる組換え抗体断片である12 13。これらの断片は、1価の結合親和性と元のmAbの特異性を保持し、細菌にて効率的に生産される14。scFvは、ハイブリドーマ細胞に由来する目的の結合特性を示すmAbの可変領域のクローニング、または免疫されたもしくはナイーブファージライブラリー15,16に由来する所望の特異性を有するscFv断片を直接選択することによって構築することができる。しばしば、ハイブリドーマからクローニングされたscFvは、低い産生量と低い熱力学的安定性を示し17、インビボでの適用に対する有用性が制限されるのに対し、ファージライブラリーから選択されたscFvはすでに、抗原結合だけでなくscFv形態における安定性と折り畳み特性についても選択を受けている18。
【0005】
治療上の適用については、ヒト抗体または抗体断片は免疫応答、例えばモノクローナル抗体由来のマウス抗体断片に対する応答(HAMA応答)、を回避するのが好ましい。そのような問題を解決するため、ヒト抗体断片をヒト抗体ライブリーのスクリーニングによって得ることができる(EP-A1 0 859 841;Vaughan et al., 1996)。別の解決手段は、CDR領域のヒトフレームワークへのグラフティングにより、非ヒトモノクローナル抗体の特異性を移すことである(EP-B1 0 239 400)。この方法の改善として、前記非ヒト抗体に由来するさらなる残基を導入することによって、改善された結合様式を有するヒト化抗体または抗体断片を製造することができる(EP-B1 0 451 216)。ヒト化の達成に加えてさらに、これらの方法は、CDRが4D5−フレームワーク上でグラフトされているフルオレセイン結合抗体断片4−4−20に関して発現量と熱力学的安定性両方の明らかな改善につながることが示されている18ように、異なった、より良好な挙動を示すscFvのフレームワーク上への所望の結合親和性および特異性を有するscFv断片のCDRのグラフティングによって、最適には及ばない安定性および/または折り畳み収量を有するscFv断片を「修復」することが可能である。4D5フレームワークそのものは、ヒトコンセンサス配列から得られた人工のフレームワークであり、抗c−erbB2(p185Her2−ECD)4D5mAb(HerceptinTM)のヒト化に使用された19。その後の研究によって4D5抗体断片の上記の平均の熱力学的安定性が示された20が、それはこの分子の熱安定性と相関し(WornおよびPluckthun, 1999)ており、scFvのインビボ適用とって明らかに一般的に重要なものである。
【0006】
マウスモノクローナル抗体(mAb)MOC31は、38kDaの膜貫通上皮糖タンパク質−21(EGP−2;GA733−2、Ep−CAMまたはKSAとしても知られる)を認識する。EGP−2は、ヒトの様々な癌において過剰発現し、循環内には入らないので、腫瘍造影や治療のための適当な標的抗原であると考えられている。17−1A、KS1/4およびMOC312、3、4などの抗EGP−2mAbによるいくつかの臨床試験によって、ヒトの癌の活性で受動的な免疫療法についてのこれら抗体の可能性が実証された。細胞−細胞会合における役割は提唱されているが(Simon et al., 1990)、膜貫通糖タンパク質EGP−2の確かな機能は、わかっていない。最近の報告によって、EGP−2はホモフィリックな細胞−細胞接着分子として同定されており5,6、EGP−2は、侵襲性および化学感応性(chemoresponsiveness)の可能性のある修飾因子として同定されている7。EGP−2を標的とした新しい免疫治療の可能性を評価する研究において、mAbMOC31に化学的に融合したエキソトキシン−A(ETA)が大きい腫瘍の成長を遅延させることが見出された8。
【0007】
c−erbB2およびEFG−受容体などの、癌に関連する抗原、並びにEGP−2は、腫瘍の造影や治療のための放射能標識された抗体の標的として役だっている。分子量を小さくし、それによって組織浸透性とそのような抗体ベースの構築物の血清クリアランスを高めることにより、標的効率を改善する努力がなされている。組換え抗体法により得られるFab、(Fab)2、dsFvおよびscFv断片は、これに関して大きな潜在能力を有する9,10けれども、これまで、安定性、分子量および親和性に関する最適な様式は決定されておらず、特定のインビボ系や適用目的によって、異なった抗体−エフェクター融合タンパク質について微調整がなされなければならない11。
【0008】
パンカルシノーマ(pancarcinoma)関連抗原上皮糖タンパク質−2に対する造影および治療剤に基づく新しい抗体断片の開発に関して、マウス抗EGP−2ハイブリドーマMOC31の可変領域が、一本鎖Fv断片形態にクローニングされた16。得られたscFvは、EGP−2に対する期待される結合親和性と特異性を示し、これは他者によって免疫組織染色実験で組織片についても示された30が、細菌のペリプラズムにおける発現は低かった。ヌードマウスにおいてこのscFv断片を用いたインビボターゲティング実験は失敗した。scFvは腫瘍に蓄積するだけでなく、フルオレセインに対する無関係な対照scFvよりもゆっくりとしたクリアランス速度も示した。MOC31 scFvが高分子量の凝集体を形成し、体温(37℃)にて血清中でインキュベーションしたときにその活性を急速に失うことを示すことができた。高度に精製されたscFvの37℃でのPBS中でのインキュベーションにおいて、同様の沈殿と免疫活性の損失が観察できたので、これは、主として、タンパク質加水分解よりもむしろ不十分な熱安定性によるものである。
【0009】
この凝集性で熱に不安定なscFvから,免疫療法の適用に適した分子を得るために、構築物の生物理学的特性を改善しなければならなかった。基本的には、この目的を解決するための手段が2つある:ランダム化と高い温度での改善された機能性についての選択との組み合わせによる、良好な熱安定性に向けたMOC31 scFvのインビトロでの進化35、またはCDRグラフティングによる上記の平均的な生物物理的特性を有するscFv フレームワーク上への抗EGP−2 scFv MOC31の結合特異性の移動18。第1のオプションは、顕著に安定なscFvを達成するために成功裏に使用されており35、第2のオプションは、グラフトにヒトフレームワーク配列を選ぶことによりヒト化を同時に達成することができ、未来の免疫療法剤の可能性のある免疫原性を減少させることができるというさらなる利点を有する。したがって、抗EGP−2 scFvMOC31結合特性を、本質的に生殖細胞配列IGVH 3−66およびIGVK 1−39(IMGT)に対応する、scFv 4D5の人工のヒトコンセンサスフレームワーク上へグラフティングすることにした。ヒト化のためのmAbの相補性決定領域(CDR)のグラフティングは、ヒト化のために100回以上使用されており10、今では標準的な方法と考えられる。4D5フレームワークはCDRアクセプターとして以前に数回成功裏に使用されている21,18,36。
【0010】
グラフト変異体4D5MOC−Aは元の抗体抗体およびscFvと見分けの付かない結合特性を示すので、この方法は成功することがわかった。
【0011】
しかしながら、4D5MOC−Aは、2つの親分子、4D5とMOC31の中間の熱安定性を示すに過ぎない。生体内分布(Biodistribution)データは、scFv MOC31が、37℃で1時間以内にその活性の大部分が損失し、腫瘍において豊富化することに失敗し、グラフト変異体4D5MOC−Aは、わずかに豊富化されたが、37℃で2、3時間安定であることを示した。
【0012】
したがって、本発明の技術的課題は、CDRグラフティング法により形成されたキメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の安定化が可能な方法を提供することである。本発明のさらなる技術的課題は、キメラ抗EGP−2結合scFv断片 4D5MOC−Aを安定化することである。上記の技術的課題は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様によって解決される。したがって、本発明は、増大した安定性につながるキメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の残基を同定し修飾することを可能にする。本発明の解決手段、即ち、CDRグラフティング法により形成されたキメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を安定化するための、VHドメインのフレームワーク領域におけるアミノ酸残基の同定および置換は、従来技術には記載も示唆もされていない。
【0013】
このように、本発明は、抗原に結合することが可能なキメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片(キメラ)を安定化するための方法であって、該キメラは、
i)該抗原に結合することが可能な、ドナー免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片(ドナー)由来の抗原結合ループ、および
ii)アクセプター免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片(アクセプター)由来のフレームワーク領域、および場合により、
iii)抗原結合の改善に必要ならば、該ドナー由来のさらなる残基
を含んでなるVHおよびVLドメインを含んでなり、さらに、
該ドナーおよび該アクセプターのVHドメインが異なるフレームワーク構造サブグループに属し、
該方法が以下の工程
a)該アクセプターおよび該ドナーのVHドメインの構造上の特徴を比較すること;
b)該アクセプターおよび該ドナーに存在する異なるアミノ酸残基が異なるフレームワーク構造サブグループの形成を導くような、VHにおける1またはそれ以上のフレームワークの位置を同定すること;および
c)キメラにおいて、アクセプターにおける該位置に存在する1またはそれ以上の残基を、ドナーにおいて該位置に存在する残基で置換することにより、安定化された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を構築すること、
を含んでなる、
方法に関する。
【0014】
本願に照らして、以下の略語を使用する:
「キメラ」は、「キメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片」の表現の代わりとして、「ドナー」は「ドナー免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片」の代わりとして、および「アクセプター」は「アクセプター免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片」の代わりとして使用する。本発明に照らして、用語「キメラ」は、2つの異なる分子の部分から構成される分子に関する。
【0015】
本発明の免疫グロブリン断片は、Fv、scFv、ジスルフィド結合したFv(Glockshuber et al., 1992;Brinkmann et al., 1993)、Fab、(Fab')2断片、または免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変領域を含んでなる当業者によく知られた他の断片であってよい。特に好ましいのは、scFv断片の形態である。
【0016】
用語「抗原結合ループ」は、主として抗原結合の原因である免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変領域の部分を意味する。Kabat et al.(1979)は、相補性決定領域(CDR)を、抗体の配列において見られる可変性の程度に基づいて抗原結合の原因となっているものとして定義した。後に、Chothiaおよびその同僚は、構造の検討に基づいて抗原結合ループを定義した。Allazikani et al.(1997)は、KabatとChothiaによる定義を精査し比較した。用語「必要ならば、該ドナー由来のさらなる残基」は、抗原結合ループの外側のさらなる残基がアクセプター上でグラフトされている状態を意味する。EP−B1 0 451 216は、そのようなさらなる残基を同定が可能な方法を教示している。
【0017】
本発明の解析には、involves the analysis of contacts between フレームワーク残基間の接触の解析と、水素結合パターンの相違、側鎖のねじれ角、ポリペプチド主鎖のコンフォメーションおよび三次元構造における変化の同定が含まれる。特に好ましいのは、VHドメインのフレームワーク1における残基の解析であり、最も好ましいのは、H6〜H10の位置における異なる残基によって生じる相違、およびさらなるVHドメイン残基および相関する配列との相互作用およびコンフォメーションの違いによるVHドメイン全体のそのような相違の結果の解析である31。H6〜H10の位置の違いは、異なるフレームワーク構造サブグループを特定するために使用することができる。
【0018】
本発明に照らして、Kabat et al.(1979)に従って使用される番号付けの方式を用いた。即ち、番号は、VHまたはVL鎖における残基の配列の順番における実際の位置に対応する必要はないが、抗体配列のKabatデータベースにおける配列に対応する相対的な位置を表示する。「H」は、VHにおける位置を意味し、「L」は、VLにおける位置を意味する。即ち、H6は、VHにおけるKabatにしたがう6番の残基である。
【0019】
好ましい態様では、本発明の方法は、さらに、工程aがVHドメイン構造および/または構造モデルを解析することにより行なわれることを含んでなる。
【0020】
VHドメイン構造についてのデータは、NMR実験、または好ましくは免疫グロブリンまたは免疫免疫グロブリン断片のX線構造から得ることができる。ホモロジーモデルは、入手可能で当業者によく知られた、種々の分子モデリングソフトウェアパーケージを使用して作成することができる。好ましくは、分子モデリングソフトウェアInsight97(Biosym/ MSI, modules Homology, Biopolymer and Discover)を使用する。好ましくは、構造解析および/または構造モデリングに使用するVHドメインの配列同一性は、該ドナーまたはアクセプターの対応するVHドメインに対して高度の配列同一性を示す。好ましくは、この配列同一性は、75%より高く、最も好ましくは80%よりも高い。
【0021】
さらに好ましくは、該1またはそれ以上のフレームワークの位置がH6を含んでなる方法である。
【0022】
さらに好ましくは、該1またはそれ以上のフレームワークの位置がH9を含んでなる方法である。
【0023】
別の態様では、本発明は、該アクセプターがヒト抗c−erbB2 scFv断片4D5(配列番号1)である方法に関する。ヒト抗c−erbB2 scFv断片4D5は、上に記載されている。
【0024】
さらに好ましい態様では、該ドナーは、マウスハイブリドーマMOC31(配列番号2)から得られる抗EGP−2 scFv断片である。マウスハイブリドーマMOC31およびそれから得られる抗EGP−2 scFv断片は、上に記載されており、実施例にも記載されている。
【0025】
本発明のさらに好ましい態様では、VHにおける該1またはそれ以上のフレームワークの位置が、H6,H9,H18,H20,H38,H63,H82およびH109(Kabat et al.(1979)に従う番号付、上記参照)である。
【0026】
さらに好ましい態様では、本発明は、該安定化された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片が抗EGP−2 scFv断片4D5MOC−B(配列番号3)である方法に関する。
【0027】
別の態様では、本発明は、本発明の方法にしたがって安定化された、抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片に関する。
【0028】
最も好ましい態様では、該抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片は、抗EGP−2 scFv断片4D5MOC−B(配列番号3)である。
【0029】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法によって安定化された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変領域を含んでなる、修飾された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリンであって、該修飾が
a)異なった免疫グロブリン断片または完全長免疫グロブリンへの変換、および/または
b)検出または精製タグ、レポーター分子、エフェクター分子、会合領域またはその組み合わせ等のさらなる部分の付加
である、修飾された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに関する。本発明の該修飾された断片は、Fv、scFv、ジスルフィド結合したFv、Fab、(Fab')2断片または他の断片、あるいは該安定化された免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変領域を含んでなり、該安定化された免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の形態とは異なる当業者によく知られたIgG、IgA、IgM等の完全な免疫グロブリンであってよい。
【0030】
特に好ましいのは、有用な治療上の機能を有する部分である。例えば、さらなる部分は、細胞を殺傷することが可能な毒素分子であってよい(Vitetta et al., 1993)。当業者によく知られたそのような毒素の例は数多く存在する。例えば、細菌毒素であるシュードモナスエキソトキシンAおよびジフテリアトキシン、並びに植物毒素であるリシン、アブリン、モデクシン(modeccin)、サポリン、およびゲロニンである。そのような毒素を本発明の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片に融合することによって、その毒素を例えば病的な細胞に標的化することができ、それによって有益な治療効果をもたらすことができる。別法として、さらなる部分は、あるファミリーの細胞に対して特定の効果(この場合、T細胞増殖作用)を有するIL−2(Rosenberg & Lotze, 1986)などのサイトカインであってよい。さらに好ましい態様では、さらなる部分は、その融合タンパク質を生物、例えば細胞またはファージ、の表面に向かわせることができ、それによって免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片パートナーをディスプレイする表面タンパク質の少なくとも1つの部分である。好ましくは、さらなる部分は繊維状バクテリオファージのコートタンパク質の少なくとも1つの部分、最も好ましくはgeneIIIタンパク質の少なくとも1つの部分である。さらなる態様では、さらなる部分によって、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片パートナー対して、検出および/または精製手段が与えられる。例えば、融合タンパク質は、修飾された免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、および検出目的に一般的に使用される酵素、例えばアルカリホスファターゼ(Blake et al., 1984)、を含んでなることができる。検出または精製タグとして使用することができる数多くの他の部分が存在し、それらは当業者によく知られている。また、本発明により、一般的に使用されているc−mycおよびFLAGタグ(Hopp et al., 1988;Knappik & Pluckthun, 1994)などのさらなる部分が提供される。
【0031】
1またはそれ以上の融合したさらなる領域に処理を施すことにより、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片は、本発明の範囲に含まれる、大きな分子に組み立てることができる。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の物理的特性が組み立ての特性を決定するかぎり、本発明はそのような大きな分子の安定性を高める方法を提供する。例えば、ミニ抗体(mini-antibodies)(Pack, 1994)は、それぞれ自己会合する二量体化領域に融合した2つのscFv断片を含んでなる二量体である。特に好ましい二量体化領域には、ロイシンジッパー(Pack & Pluckthun, 1992)またはヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ(Pack et al., 1993)に由来するものが含まれる。
【0032】
本発明の上記の態様のすべては、当業者に知られた分子生物学の標準的な技術を用いて影響を及ぼすことができる。
【0033】
さらに好ましい態様では、該修飾がペンタ−またはヘキサ−ヒスチジンタグの付加である。少なくとも5つのヒスチジン残基を含んでなるペプチド(Hochuli et al., 1988)は、金属イオンに結合することができ、それゆえ、そのペプチドが融合するようなタンパク質の精製に使用することができる(Lindner et al., 1992)。ペンタヒスチジンテールをコードするpIG−6(実施例参照)等のベクターを使用してそのような修飾された免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を製造することができる。さらに、pIG−6は、検出目的のための、N末端のFLAGタグとC末端のc−mycタグを提供する。
【0034】
さらに好ましいのは、該ペンタまたはヘキサヒスチジンタグが99mTc−トリカルボニル部分と複合している修飾された断片である。Hisタグ特異的99mTc標識法は記載されている(Alberto et al., 1998)。99mTc−トリカルボニル三水和物は、ペンタまたはヘキサヒスチジンタグと非常に安定な複合体を形成する。99mTc−トリカルボニル部分を含む修飾された断片は、放射線療法または放射線造影法に使用することができる。
【0035】
最も好ましい態様では、本発明は、本発明の抗EGP−2scFv断片4D5MOC−B(配列番号3)の可変領域を含んでなる修飾された断片に関する。
【0036】
さらに好ましいのは、本発明の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片をコードする核酸配列である。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片のタイプによって、例えばscFv断片をコードするための、一本鎖酸配列、またはFab断片をコードするための、二本鎖核酸配列、またはそれ以上の核酸配列が必要である。好ましくは、該核酸配列はベクター、好ましくは配列決定および/または発現に適したベクターに含まれる。該核酸配列を含んでなる該ベクターは宿主細胞に含まれていてもよい。
【0037】
さらに好ましい態様では、本発明は、本発明の安定化された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の製造方法であって、適当な発現系において抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片をコードする、1またはそれ以上の本発明の核酸配列の発現を含んでなる方法に関する。発現系は適当な宿主において発現させることができる。本明細書において参照される宿主は、外来タンパク質の製造に一般に使用されている数多くのうちのいずれかであってよく、E. coli(Ge et al, 1995)またはBacillus subtilis(Wu et al., 1993)等の細菌、酵母(Horwitz et al., 1988;Ridder et al., 1995)または糸状菌(Nyyssonen et al., 1993) 等の菌類、植物細胞(Hiatt, 1990, Hiatt & Ma, 1993;Whitelam et al., 1994)、昆虫細胞(Potter et al., 1993;Ward et al., 1995)または哺乳動物細胞(Trill et al., 1995)が含まれるがこれらに限られない。発現系は、無細胞翻訳系、好ましくは一対のインビトロ転写/翻訳系における発現であってよい。好ましくは、そのような翻訳は、原核生物の翻訳系において行なわれる。特に好ましいのは、S−30E. coli 翻訳系などのE. coli ベースの翻訳系である。別法として、翻訳を真核生物の翻訳系において行なってもよい。
【0038】
さらに最も好ましい態様では、本発明は、本発明の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、および場合により製薬的に許容し得る担体および/または賦形剤を含有する医薬組成物に関する。
【0039】
さらに好ましい態様では、本発明は、ヒトの癌の処置のための医薬組成物の製造のための、本発明の安定化された免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または本発明の修飾された免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の使用に関する。
【0040】
さらに好ましいのは、ヒトの癌の処置のための医薬組成物の製造のための、本発明の、抗EGP−2 scFv断片 4D5MOC−B、または修飾されたEGP−2-結合免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片の使用である。
【0041】
さらに好ましい態様では、本発明は、本発明の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を含有する診断用組成物に関する。
【0042】
さらに好ましい態様では、本発明は、本発明の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を含有する診断用キットに関する。
【0043】
実施例により本発明を説明する。
実施例(Willuda et al., 1999)
材料および方法
哺乳動物細胞系
S. D. Bernal博士(Dana Farber Cancer Institute, Boston, Mass., USA)の好意により提供されたヒトの小細胞肺癌細胞系SW2、および乳癌細胞系SK−BR−3(#HTB 30, American type culture collection, Rockville, MD)を、10%ウシ胎児血清(Gibco, Grand Island, NY)を添加したRPMI1640(Hyclone, Europe Ltd.)ベースの培地にて維持し、5%CO2雰囲気下で37℃にて培養した。乳癌細胞系SK−OV−3(#HTB 77, American type culture collection, Rockville, MD)は、EGF(10ng/mL)およびインスリン(5ng/mL)を添加したRPMI1640にて培養した。
【0044】
上皮糖タンパク−2(EGP−2)および一本鎖Fv断片
バキュロウイルス発現系(Invitrogen)において発現ベクターpBB4/GA−733−2を使用することにより、ヒトの上皮糖タンパク質−2を、6個のヒスチジンC末端タグを有する組換え可溶性タンパク質(M1−F259)として製造した。抗EGP−2 scFv断片(scFv MOC31)を、以前に記載された再処理を施されたファージディスプレイシステム16を用いることにより、マウスハイブリドーマ細胞系MOC311から単離されたmRNAから組み立てた。ヒト抗−c−erbB2抗体4D5由来の一本鎖Fv断片(Carter et al, )はFab断片から構築されており、数々の実験21,20において以前に使用されている。
【0045】
分子モデリング/グラフトの構築
抗EGP−2 scFv断片のホモロジーモデルは、分子モデリングソフトウェアInsight97(Biosym/ MSI, modules Homology, Biopolymer and Discover)を用いて作成した。VLドメインモデルは、マウスFab断片JEL103のX線構造(22, Brookhaven データベースエントリー1mrc, 1mrd, 1mreおよび1mrf、分解能2.3パーミル〜2.4パーミル、MOC31に対する配列同一性76%)に基づいており、VHドメインモデルは、抗ノイラミニダーゼFab(23,24, pdb エントリー1nca, 1ncb,1nccおよび1ncd、分解能2.5パーミル、同一性85%)の構造および抗コレラトキシンFab TE33(25, pdb エントリー 1tet、分解能2.3パーミル、同一性82%)CDRH3コンフォメーションに基づいている。MOC31領域モデルをヒト化4D5バージョン8のFvの結晶構造の上に重ね合わせた(26, pdb エントリー 1Fvc、分解能2.2パーミル、MOC31に対する同一性VL:55%、VH:50%)。可能性のある抗原接触を、プログラムnaccess(S. HubbardおよびJ. Thornton, 1992, http://sjh.bi.umist.ac.uk/naccess.html)を用いてリガンドの存在下および非存在下での既知の抗体タンパク質複合体の側鎖溶媒接近可能表面を比較することにより同定した。モデルを、ハイブリッドscFv 4D5MOC−Aにおいて生じる、立体障害の可能性、可能性のある抗原接触およびCDRコンフォメーションで間接的な影響を有するも知れない残基についてチェックした。第二の構築物scFv 4D5MOC−Bにおいて、VHのコアにおける8個の鍵となる残基は、MOC31VHフレームワークの構造サブタイプを保存するために、4D5配列に対してこれら残基を変化させるのではなく、MOC31から保持されていた。
【0046】
両方の変異体について設計された配列を逆転写し(GCGパッケージ)、VLについて8つの重複するオリゴヌクレオチド、およびVHの2つの異なる変異体について10個のオリゴヌクレオチドから、VL−リンカー−VHの方向で、断片を遺伝子合成27によって構築した。使用したオリゴヌクレオチドの長さは40bpから78bpの間であった。各領域を別々に製造し、平滑末端をpBluescriptベクター(Stratagene)にクローニングし、次いで配列を決定した。次いで、VLおよびVHドメインを発現ベクターpI66(Ge et al., 1995)にクローニングした。次いで、24マーの非反復リンカーTPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGS28をAflIIおよびBamHI制限部位によってカセット突然変異誘発により導入した。
【0047】
一本鎖Fv断片の発現および精製
c−erbB2結合scFv断片 4D5およびEGP−2結合scFv断片 4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bのペリプラスム発現のために、pIG6ベクターを使用し、一方scFv MOC31の発現にpAK400ベクター16を使用した。大規模な生産のために、E. coli SB536株(Bass et al. 1996)を使用した。5L容の振盪フラスコ中の1%gluおよびアンピシリン(30μg/mL)を含む1LのdYTを、30mLで接種し一晩培養した。培地のOD550nmが0.5になったら、最終濃度1mMのイソプロピル−D−ガラクトピラノシド(IPTG;Boehringer Mannheim)を用い、24℃にて、3〜4時間scFv産生を誘導した。最終のODは4D5、4D5MOC−A 4D5MOC−Bについて5〜6、scFv MOC31については4であった。回収したペレットを−80℃で保存した。
【0048】
精製のため、1Lの培地から得たペレットを20mMのHepes(pH7.0)、30mM NaClに再懸濁し、French Pressure Cell press(SLS instruments Inc., Urbana Illinois, USA)にて2サイクルで溶解させた。得られたリゼートをSS−34ローター中、4℃にて48246gで遠心し、滅菌濾過した。すべての一本鎖Fv断片を、以前に記載されたように(Pluckthun 1996, book chapter)、BIOCAD-System(Perseptive BioSystem-Inc.) にて直列に連結したNi+−DNAカラムおよびHS/M−4.6/100イオン交換カラムを用いて精製した。リゼートをNi+−DNAカラムに載せ、カラムを20mMHepes( pH7.0)、500mM NaCl、および第2段階で20mM Hepes( pH7.0)、40mMイミダゾールで洗浄したのち、結合したタンパク質を200mMイミダゾール( pH7.0)で溶出した。溶出液をHS/M−4.6/100イオン交換カラムに直接載せ、特異的に結合したタンパク質を、20mM Hepes( pH7.0)中の、0〜500mM NaClの塩グラジェントにより溶出した。抗体断片を含む画分を過剰のPBSに対して透析し、10kDaカットオフフィルター(Ultrafree-MC low protein binding, Millipore)を用い、4℃にて4000gで遠心することにより、1mg/mLに濃縮した。抗EGP−2 scFv断片 MOC31については、第3の精製工程として、Superdex75 カラム(Pharmacia)を用いて分離用ゲル濾過を行なうことが必要であったが、最終的な収率は10分の1に落ちた。精製の結果を、還元的条件下で12.5%SDS−PAGEによりチェックした。すべての精製されたscFvの分子量を質量分析によりチェックした。
【0049】
一本鎖Fv断片のHisタグ特異的99mテクネチウム標識
99mTc−トリカルボニル三水和物(Alberto et al., 1998)は、ペンタまたはヘキサヒスチジンタグと非常に安定な複合体を形成し、それにより、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ(IMAC)精製に提示されるHisタグの2通りの利用が可能である。scFv断片(1mg/mL)を1/3量の99mテクニチウム−トリカルボニル(30mCi/mL)および1/3量の0.5M MES( pH6.2)と緩衝液中で混合し、37℃にて30分間インキュベーションした。scFv MOC31を、タンパク質濃度400μg/mLにて30℃にて30分間標識し、沈殿を防いだ。反応混合物を、平衡化したFast desalting column(Pharmacia)を用いて脱塩した。集めた画分の少量をシンチレーションカウンターで測定し、標識されたタンパク質の画分を同定した。
【0050】
ゲル濾過解析
ゲル濾過解析を、Superdex 75 カラムを用いてSmart system(Pharmacia)により行なった。すべての測定は、0.005%Tween−20を含有するPBS緩衝液中で行なった。37℃にて20時間の一晩のインキュベーションの前または後に、scFv断片を、1mg/mLの濃度、15μLの容量で注入した。カラムは、分子量標準としてアルコール脱水素酵素(150kDa)、ウシ血清アルブミン(66kDa)、炭酸脱水酵素(29kDa)およびシトクロームc(12.4kDa)を加えた同じ緩衝液で較正した。
【0051】
結合特異性
異なるscFv断片の結合特異性を、モノクローナル抗体 MOC31との競合によって試験した。50ngの放射能標識したscFv 4D5MOC−Aまたは4D5MOC−Bを、mAb MOC31(10 μg)の有りまたは無し、あるいは無関係な競合物質として同量の抗−c−erbB2モノクローナル抗体と4℃にて30分間プレインキュベーションした後、200μLPBS/1%BSA中の0.5×106のSW2細胞とインキュベーションした。3回の洗浄工程では、細胞を4℃にて1000gで5分間遠心し、上清を捨て、細胞をPBS/1%BSAに再懸濁した。次いで、残存した放射能をシンチレーションカウンターにて測定した。さらなる結合実験では、交差反応性をみるために、両scFv断片(50ng)を、96ウェルマイクロタイタープレートにてコート(500ng/ウェル)した異なる抗原とインキュベーションした。ウェルをPBS/1%BSAで3回洗浄し、放射能を測定した。
【0052】
RIAおよび表面プラスモン共鳴(BIAcore)によるKDの決定
99mTc標識された一本鎖Fv断片の結合親和性を、ラジオイムノアッセイ(RIA)にてSW2細胞に対して測定した。SW2(0.5×106)細胞を、4℃にて、増加する量の一本鎖Fv断片(100pM,30nM)と1時間インキュベーションした。非特異的結合については、細胞の対照試料を100倍過剰の非標識一本鎖Fv断片と4℃にて1時間プレインキュベーションした。一本鎖Fv断片の結合した画分をシンチレーションカウンターにて測定した。得られたそれぞれの数値は、2つの試料の平均を示している。1分あたりのカウント(cpm)を一本鎖Fv断片のナノモル濃度に対してプロットし、非線形回帰関数にあてはめた。
【0053】
反応速度定数は、BIAcore装置を用いて表面プラスモン共鳴(SPR)により測定した。組換え可溶性EGP−2抗原は、350共鳴単位の表面被覆率で、CM−5センサーチップと生じた遊離アミン基によって共有的に対合した。一本鎖Fv断片を増加する濃度(0.1nM〜4μM)で、脱気したPBS/0.005%Tween−20の30μL/分の流速で注入した。会合および解離定数を、BIAevaluation 3.0 ソフトウェア(Pharmacia)を用いて全曲線適合(global curve fit)により、センサグラムから計算した。
【0054】
37℃での放射能標識されたscFvの血清安定性
放射能標識後、免疫活性を残存している一本鎖Fv断片の画分を以前に記載されてように測定した29。異なる数の細胞を含む試料(0.625×106〜10×106)を100μL中、浸透機上で、50ngの放射能標識したscFv断片と4℃にて1時間インキュベーションした。非特異的結合を、PBS/1%BSA中、100倍過剰の非標識scFv断片とプレインキュベーションした細胞の対照試料について測定した。次いで、3回の洗浄工程の後、結合したscFv断片の量をシンチレーションカウンターにて測定した。報告された数値のそれぞれは2つのサンプルの平均を示す。免疫活性の計算については、1分あたりの総カウント(cpm)を結合したタンパク質について測定されたcpm値で割り、次に細胞数の逆数に対してプロットし、線形回帰分析によって適合させた。y切片の逆数のパーセントは、生物活性な一本鎖Fv断片のパーセントを示す。異なる放射能標識した一本鎖Fv断片の血清中での安定性を調べるために、分子を、17μg/mLの最終濃度にて、ヒト血清中で37℃にて一晩(20時間)インキュベーションし、残存した免疫活性をLindmoアッセイにて測定した。
【0055】
インビボキャラクタリゼーション−クリアランスおよび生体分布
血液クリアランス試験は8週齢の、腫瘍が存在しない雌性CD1ヌードマウスを用いて行なった。各マウスに300μCiの99mTc標識されたscFv 4D5MOC−Bをi.v.投与した。注射後、7.5、15、30、60、120、240分後に、血液試料を採取し、およびt1/2 αおよびt1/2 β値を測定された免疫活性から計算した。99mTc標識されたscFv断片 4D5MOC−Bの生体分布試験を、13日齢のSW2異種移植片(40〜80mg)を有する、6週齢のCD1ヌードマウスを用いて行なった。3つの群(4匹/群)のマウスそれぞれに30μgの放射能標識されたscFv(300Ci)を投与した。99mTc標識されたscFv MOC31の生体内分布の解析を、10日齢のSW2異種移植片(10〜40mg)を有する7週齢のブラックヌードマウス(bl6 Uwe株:Bl6??)において行なった。3つの群(3匹/群)のマウスそれぞれに、5μgの99mテクネチウム標識されたscFv MOC31(85Ci)を投与した。抗フルオレセイン結合scFv FITC−E2を非特異的対照抗体として使用した。マウスを注射後、1、4および24時間後に屠殺した。組織および臓器を取り出し、ガンマカウンターを用いて活性を調べた。99mTc標識したscFv 4D5による生体内分布の解析は最近記載された(Waibel et al., 1999)。
【0056】
結果
分子モデリング−グラフトの構造
我々は、標準的なファージディスプレイの方法論16を用いてMOC31のscFv断片を構築し、その機能性を決定し、独立に構築したscFv MOC3130と配列および特性が一致したその抗原EGP−2(表1)に対するかなり高い親和性を実証した。意外にも、このscFvのインビボでの存在は、EGP−2特異性なしでは、対照のscFvとほとんど区別不可能であり、本質的にscFv MOC31は、異種移植された腫瘍に局在しなかった(表2)。したがって、我々は、このタンパク質は十分には安定でなく、最初によく特徴付られた安定なフレームワークをグラフティングすることによって2つのより安定な変異体を設計すること、および、第2に、さらに可変領域のうちの1つの内部におけるいくつかの残基を変化させることとの仮説を立てた。レシピエントフレームワークとして、我々は、それ自身グラフティングの産物である、4D5のヒト化された形態19を選択した。このフレームワークは、本質的に、生殖細胞系IGHV 3−66(IMGT)由来の重鎖可変領域、VH3−18(Vbase)、Locus DP 3−66(DP−86)および生殖細胞系IGKV 1−39(IMGT)由来のκ軽鎖可変領域、VK 1−1(Vbase), locus DP O12からなる。
【0057】
MOC31のホモロジーモデルを構築し、ヒト4D5バージョン8Fv断片(pdbエントリー1Fvc)のX線構造と比較した。可能性のある抗原接触残基をBrookhaven Protein Databaseの抗体−タンパク質抗原複合体の解析により同定した(Figure1A)。Kabat定義よりもむしろこの情報に基づいて、どの残基を4D5フレームワークから選ぶかおよびどの残基をMOC31配列から選択するかを決定した。得られたグラフトは、このように、Kabat et al.(1979)またはChotia(Allazikani et al., 1997を参照)のCDR定義には厳密には従わないが、VLの「アウターループ」(残基L66-L71)のコンフォメーションを決定する2つの残基(L64およびL66)を含んでいる。このループの先端は、いくつかの複合体において抗原と接触することが示され、CDRL1のコンフォメーションに対するこのループの影響は無視できなかった。残基L66は一般にκ軽鎖ではGlyであり、正のΦ角である。この残基がGly以外の残基で置換されれば(4D5のArg)、他のループは異なるコンフォメーションをとり、その領域から離れて折れ曲がる。VHでは、CDR H1に加えて、さらに残基H27−H30を含ませたが、CDR定義(Kabat et al.(1979)に従えばCDR H2の一部であるにもかかわらずCDR2の塩基のいくつかの残基を脱落させ(H62およびH63);Allazikani et al., 1997)、および、時としてCDR4と呼ぶ、VHの「アウターループ」におけるいくつかの残基を含ませ(残基H69、H71、H75−H77)、構築物4D5MOC−Aを得た(Figure1A)。
【0058】
VHドメイン フレームワークのコンフォメーションの解析は、これらがそれらのフレームワークコンフォメーションにしたがって4つの別個のサブグループに分類できることがわかった。数個のコア残基が関与する、関連する配列およびコンフォメーションの違いが分子に見つかっているが31、コンフォメーションの違いは、フレームワーク1(FR1)、特にH7−H10の位置、においてもっとも顕著であった。これらのコンフォメーションの変化は、恐らくGluH6(4D5におけるように)またはGln H6(MOC31におけるように) を完全に隠しドメインのコアにおいて確立する、異なる水素結合パターンによって引き起こされ、残基H9の性質(Pro、Glyまたは他の残基)32によってさらに影響を受ける。SaulおよびPoljak(1993)は関連する構造上の変化によって、領域コアからCDR2のベースへ横切るFR1コンホメーションにおける変化の効果を伝える残基H9、H18、H82、H67およびH63に影響を及ぼし、抗原結合に強力に影響を及ぼすことが可能である。
【0059】
この分類に従えば、MOC31は、4D5とは異なるサブグループに属する。我々は、これらのフレームワークのクラスがどの程度、ループグラフトの機能に影響を及ぼすのか知らなかったので、この問題を実験により試験することにした。4D5MOC−A構築物において、VHドメインフレームワークは4D5サブタイプに変化しているので、4D5MOC−Bは完全にMOC31コアパッキング、並びにコンフォメーションに重要な残基H6およびH9を保持している。これを達成するために、抗EGP−2一本鎖Fv断片配列の8個のさらなるフレームワーク残基(H6, H9, H18, H20, H38, H63, H82およびH109)は、MOC31配列を保持しなければならなかった。これら変化のすべてはscFvの下半分(Figure1)に存在し、H9の位置におけるGlyからProの置換を除いて、ドメインのコア内に隠れている。したがって、これらはこの構築物の免疫原性には影響を及ぼしていないと思われる。
【0060】
AfIII制限部位の導入については、すべての構築物においてVLドメインのC末端配列をEIKRAからELKRAに修飾する必要があった。
【0061】
scFv構築物の発現と精製
scFv4D5については、1Lの培地から、通常1〜2mgの純粋なタンパク質を精製することができ、scFv MOC31については、収量はもっと低かった。scFv MOC31の2工程の精製の後の収量は、純度約70%で200μgに過ぎなかった。skpの同時発現33によって収量は600μgに増大するが、20kDaの分解産物が依然として存在していた。グラフト変異体scFv 4D5MOC−Aを精製して400μgを得ることができ、4D5MOC−Bは純度95%で1mgまで精製することができた。両一本鎖Fv断片は1mg/mLまで濃縮することができ、還元SDS−PAGEで解析した(Figure2)。両分子の質量分析は、scFv 4D5MOC−Aについて29.855Da、scFv 4D5MOC−Bについては29.897Daの期待された分子量を示した。
【0062】
結合特異性
scFv 4D5のフレームワークに対するscFv MOC31の抗EGP−2結合特異性の移動は、EGP−2過剰発現SW2細胞に対する放射能標識したグラフト変異体の結合競合により、両変異体4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bについて成功したことが示された。モノクローナル抗体 MOC31のみがグラフト変異体の結合を阻害することができたにのに対し、無関係な対照抗体は競合しなかった(Figure3A)。c−erbB2またはEFG−受容体(細胞外領域)にてインキュベーションしたとき、グラフトされた分子の交差反応性はみとめられなかった(Figure3B)。
【0063】
KDの決定
特異的な標的抗原に対する長い残留時間での高親和性結合は、腫瘍ターゲティングのための抗体の最も重要な特性の1つであると考えられる。結合親和性がグラフト実験において保存されることを確実にするために、細胞上での放射能標識された一本鎖Fv断片解離定数をラジオイムノアッセイ(RIA)にて測定した。グラフト変異体は、ナノモル濃度の範囲で、元の抗EGP−2 一本鎖Fv断片に匹敵する特異的で類似の結合様式を示した(表1)。
【0064】
さらに、固定化されたEGP−2に対する非標識のscFv断片の結合速度をBIAcore装置(Pharmacia)にて表面プラスモン共鳴により解析した(表1)。オフ−レート(off-rate)の過小評価につながる再結合の効果を最小限にするために、我々は、低密度のコーティングと速い流速を用いた。scFv MOC31は、別の測定結果(半減期33分)30と一致して、半減期が約38分で、その標的に対する安定な結合を示した。scFv 4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bのkoff値は元のscFv MOC31と非常に類似しており(表1)、4D5-フレームワークにおいてscFv MOC31の結合特性の完全な移動が成功したことを示している。
【0065】
ゲル濾過解析および熱凝集の試験
scFvの多くの適用のために、これらの分子を濃縮することおよびこれらを高い温度でインキュベーションすることは重要である。これら分子の生物物理学的挙動はしばしば生体内での適用の限界になる。したがって、我々は、高濃度および高い温度でのscFvの凝集挙動を試験した。4D5、4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bは、限外濾過によって1mg/mLまで濃縮することができたのに対し、MOC31 scFvは、400μg/mLを越える濃度で沈殿した。この濃度では、Superdex 75 カラムを用いたSmart ゲル濾過システム(Pharmacia)による解析用ゲルろ過により、総タンパクの約10%が高分子量の凝集体として溶出した。単量体については予想どおり溶出量1.27mLでほぼ90%のタンパク質が溶出した。しかし、37℃で30分以内に既に約85%のタンパク質が沈殿した。残りの15%の可溶性タンパク質は単量体として溶出した。(データは示さず)。
【0066】
2つのグラフト変異体4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bは、30kDaの分子量に対応して、溶出量1.20mLで溶出し、両一本鎖Fv断片が1mg/mLの濃度で単量体で存在していることを示した。4D5MOC−AはMOC31よりもゆっくりと沈殿したが、37℃でのPBS中での20時間の一晩のインキュベーションおよびその後のゲル濾過は、タンパク質がほとんど溶出しないことを示した(Figure4A)。同じ条件下でインキュベーションすると、4D5MOC−Bは依然として、溶出量1.20mLで対照的なピークとして溶出した(Figure4B)、2つの変異体の間の、固有の(熱)安定性における大きな違いを示した。最も重要なことに、4D5MOC−Bは、それによって、インビボ適用に必要な生物物理学的特性を有することが示された。
【0067】
Hisタグ特異的99mテクニチウム標識
一本鎖Fv断片を、99mTcトリカルボニル三水和物が組換えタンパク質のC末端ペンタまたはヘキサヒスチジンタグに安定に結合する新しい方法を用いて、99mTcで標識した(Waibel et al, 1999)。元のscFv MOC31を除いて、すべてのscFv断片を37℃にて1mg/mLのタンパク濃度で標識することができ、取りこまれた最初の99mTcの30〜40%において生じ、最終の比活性は300〜400mCi/mLであった。凝集性のscFv MOC31については、インキュベーションの温度を30℃に下げなければならず、最大の可能性のあるタンパク質濃度は400μg/mLであり、減少した取り込み量を示した(総Tcの25%、250mCi/mL)。
【0068】
37℃の血清中でのインキュベーション後の免疫活性の測定
我々は、99mTc標識後および37℃でのヒト血清中での20時間のインキュベーション後も依然として活性なscFv分子の画分を測定した(Figure4c)29(Figure4D)。scFv MOC31については、我々は、30℃で標識反応を行なえば67%±5.4のタンパク質がなおも活性であることを見出した。その他の断片は、scFv 4D5MOC−Aについて47.25%±4.9、scFv4D5MOC−Bについて74.5%±8.3、およびscFv 4D5について87.3%± 6.4活性であることを示し、すべて37℃で標識した。血清安定性を試験するため、scFv断片(17μg/mL)をヒト血清中37℃にて20時間インキュベーションし、得られた免疫活性を測定した。scFv MOC31は一晩インキュベーションした後完全に不活性であることがわかったので、より早い時点で測定した。1時間後には既に、活性は6.32%±0.17(最初の免疫活性の9.4%)に落ちた。4時間後には、1.95%±0.175(2.9%)が活性であるに過ぎなかった。対照的に、20時間で、4D5MOC−Aの活性は47.25%±4.9から8.1%±4.7(最初の活性の17.1%)に、scFv 4d5MOC−Bは74.5%±8.3から36%±1.6(48.3%)に、およびscFv 4D5は87.3%±6.4から40.45%±8.75(46.3%)に落ち、ゲル濾過アッセイにおいて異なる熱安定性がみとめられることが確認された。
【0069】
インビボキャラクタリゼーション−クリアランスおよび生体内分布
生体内分布試験をscFv 99mTc標識scFv MOC31、4D5、4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bについて行なった。scFv MOC31については、我々は、1時間、4時間および24時間後に0.92よりも高い腫瘍−血液比を得ることはできなかった(n=3、各時点)。24時間後、腫瘍に対する総投与量は1.24%ID/g組織であったが、血液においても1.34%ID/g血中であり、標識法と比較して血液中で通常認められる3〜5倍低い値と比較して非常に高かった(表2)。対照的に、99mTc標識scFv 4D5の生体内分布は、SK−OV−3細胞に対する24時間後の総投与量1.5%ID/gで腫瘍対血液比が8.3であり(Waibel et al., 1999)、抗c−erbB2 scFcC6.5について同様の結果が報告されている34。4D5MOC−Aについては、我々は、24時間後に、総投与量0.84%ID/gで弱い増加のみを認め、腫瘍対血液比は1.95であった(表3)が、scFv 4D5MOC−BのSW2腫瘍を有するマウスにおけるインビボ適用は、腫瘍に対する24時間後の総投与量1.47%ID/gで5.25の腫瘍対血液比をもたらした。4時間後に測定した腫瘍に対する最大投与量は1.82%ID/gであり、これは抗原に対するscFv 4D5MOC−Bの安定な結合を反映して非常にゆっくりと減少した(表3)。比特異的フルオレセイン対照scFv FITC−E215 については、腫瘍における豊富化はみとめられなかった(表4)。
【0070】
クリアランス試験によってscFv 4D5MOC−Bは、t1/2α=6分であり、t1/2β=228分であり、非常に急速に排出される分子であることがわかった。測定値がt1/2(α)=7.5分であるscFv 4D5との比較で、高い腫瘍対血液比の達成のための前提条件である卓越した排出挙動がループグラフティングにより失われることを示した。
【0071】
考察
インジウム−DTPA標識mAb MOC31が原発腫瘍に局在し、臨床試験において小細胞肺癌患者における転移が報告されているが、他の診断法、例えば例えばコンピュータ断層撮影スキャン4よりも優れているとはいえなかった。mAb MOC31とエンドトキシン−A(ETA)との化学的融合物は、ヌードマウスにおいて大きい腫瘍(120mm3)の成長の遅延をもたらし、標的化抗体の減少が効率を高めるであろうと提議された8。改善された組織浸透性およびもっと小さな抗EGP2scFv断片の速いクリアランス速度がより良好な結果をもたらすか否かまたは正常なEGP−2発現上皮組織に接近し、mAbは150kDaという分子量のために接近できない1その増大した能力がその方法の解決する力を制限するか否かについてなおも試験されている。改善されたscFvは、大きさおよび結合活性の効果を最適化するための、他の組換え分子形態、二量体化および多量体化されたscFv、Fabまたは(Fab)2 11等、のための構築ブロックとして役に立つことができる。それらはまた、治療に基づいた抗体断片の構築において、他のエフェクタ領域と融合することができる。scFv MOC31−ETA融合は、SW2細胞に対し、ETAとのmab MOC31融合物(Zimmermann, 非公開の結果)よりもインビトロで1万倍以上毒性であった。元の修飾されていないscFv MOC31もまたT細胞再ターゲティングのためのCD3特異性を有するディアボディの構築に使用した。この形態では、scFv MOC31は幾分安定化されたようであり、12時間の半減期が報告されているが、収量はscFv MOC31単独の場合と同じくらい低く37、インビボ適用はこれまでのところ報告されていない。
【0072】
モデルリングの過程において、我々はフレームワークテンプレート4D5のVHドメインがループドナー MOC31とは異なる構造のサブクラスに属することに気づいた。単独のループグラフトが失敗した文献36がいくつか存在し、キメラが複数のさらなる復帰突然変異により救済されなければならないので、我々はMOC31の構造のサブクラスおよびコアパッキングが保存されている第2キメラを直接設計した。これには、MOC31VHドメインの表面を付け替えることに本質的に対応するよりも、マウスの配列に対する、主としてコア内に存在する8つのさらなる残基の変化が関与する。これらのさらなる突然変異は抗原親和性には何の効果もなかったが、キメラの安定性に対する有益な効果があった。4D5MOC−Bに対するさらなる突然変異によって、非常によく振舞う4D5scFvと非常によく似た振る舞いをする分子が得られた。このことは、4D5MOC−Bが4D5MOC−Aよりもさらに4D5から配列においてさらに除去されており、全体で残基H6、H7およびH9によって定義され、これらの残基が相互に関係づけられるのでフレームワークを混入しないフレームワーククラスを維持するのに決定的なものであることを示唆している。さらに、4D5MOC−Bは配列ではMOC31に近いが、MOC31はなかでも最も安定性が低い。
【0073】
4D5のVLドメインが非常に安定で、4D5scFvの熱力学的安定性がVHドメイン固有の安定性によって制限されることが最近示された20。この断片に対するMOC31抗原相互作用表面のグラフティングは、中程度の安定性を有するキメラを生じた。これは、グラフトされたループまたはグラフトされたコア残基と不適合なフレームワークコア残基との間の望ましくない相互作用によるのであろう。しかしながら、保存された残基の層によって分離されている2つの(Figure1)、4D5およびMOC31の間で異なる低いコアに存在するそれらのフレームワーク残基とグラフトされたループに由来するコア残基との間の接触が若干存在する。ループグラフトにおいて変化した残基と4D5MOC−Bにおいてさらに変化した残基のグループとの間の主な直接の接触は、Met H48(4D5におけるVal)およびPhe H63(4D5および4D5MOC−AにおけるVal)との間である。元のグラフトにおいて立体的な衝突が存在していたならば、我々は、その状況が、接触残基をより大きな残基で置換することによってさらに難しくなると予想した。したがって、なおさら、ループの安定性を損ねる影響がその領域コアの一般的な安定化によって補償されるようである。4D5MOC−Bにおけるコア突然変異によって達成されたさらなる安定化は、腫瘍部位での効果的な豊富化に非常に重要であった。最も安定な構築物4D5MOC−Bは、1.47%ID/g組織に豊富化され、腫瘍対血液比は5.25であった。凝集性のMOC31はより安定な対照抗体およびキメラよりもいっそうゆっくりと循環から排出された。安定性におけるさらなる増大によってどの程度までさらに総投与量豊富化と腫瘍対血液比を改善することができるかが研究され続けている。
【0074】
この研究において、我々は、目的とする抗体断片の改善のために折り畳みと安定性を操作する方法論が一般的な道具であるということを実証した。我々は、インビボで失敗に終わった、不安定で発現が少ないマウス抗EGP−2 scFvの、同じ特異性を有するよく発現し非常に安定なヒト化抗体断片への変換を例として用いた。EはまたCD1ヌードマウスにおいて異種移植片を示すEGP−2のインビボターゲティングを初めて報告した。処理を施されたscFv 4D5MOC−Bは、scFv MOC31の制限を克服し、EGP−2を発現している癌に対する新しい造影および治療用抗体断片ベースの薬剤の改善のための重要な構築ブロックとなるであろう。我々は、優れた特性を有する新しい抗体断片がそこから選択することができる、大きなライブラリーレパートリーの使用に加えて、組換え分子の折り畳みおよび安定性に対する操作が、すべての適用、および特に腫瘍用の医薬における、それらの幅広い未来の使用ために極めて重要であるということを信じる。相補性決定領域および結合定数が同一である場合でも、生物物理学的特性が腫瘍部位を標的化するscFv断片の能力に強力な影響を及ぼすということを改めて強調しておかなければならない。このことは、抗体断片の生物物理学的特性が、これまで一般的に認識されてきたよりも生物学的なパフォーマンスにとってさらに重要であることを示している。
【表1】
【表2】
【表3】
【0075】
文献
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Vbase:http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/
Ian Tomlinson, [email protected], fax +44 1223 402140
MRC Centre for Protein Engineering, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, U.K.IMGT: http://www.ebi.ac.uk/imgt/
このディスプレイは事前の許可なしで、自由にコピーされ再配布してもよい。但しIMGTを参照し、次のように引用すること:
"IMGT,ザ・インターナショナルImMunoGeneTicsデータベースhttp://imgt.cnusc.fr:8104 (コーディネーター:Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France [email protected]). 参考:Nucleic Acids Research, 25, 206-211 (1997)."
【0076】
配列表
【図面の簡単な説明】
【図1】 scFv MOC31、4D5MOC−A、4D5MOC−Bおよび4D5のVLドメインの配列。MOC31および4D5と一致する配列の位置をグレーの背景に黒字で示し、4D5と一致するがMOC31とは異なる残基を白の背景に黒字で示し、およびMOC31と一致するが4D5とは異なる残基を黒の背景に白字で示す。残基の標識とCDRの定義はKabat(1987)に従う。(B)はドメインコアまたは界面に隠れた残基を、(b)は半ば隠れた残基を示す。(・)および(・)は、PDBデータベースにおけるすべての異なるタンパク−抗体複合体全体に対して、この位置について平均化された、複合体形成による側鎖溶媒接近可能表面の大きな損失(・>40%)または小さな損失(・>1%)が検出された可能性のある抗原接触残基を示す。
【図2】 scFv MOC31、4D5MOC−A、4D5MOC−Bおよび4D5のVHドメインの配列。MOC31および4D5と一致する配列の位置をグレーの背景に黒字で示し、4D5と一致するがMOC31とは異なる残基を白の背景に黒字で示し、およびMOC31と一致するが4D5とは異なる残基を黒の背景に白字で示す。残基の標識とCDRの定義はKabat(1987)に従う。(B)はドメインコアまたは界面に隠れた残基を、(b)は半ば隠れた残基を示す。(・)および(・)は、PDBデータベースにおけるすべての異なるタンパク−抗体複合体全体に対して、この位置について平均化された、複合体形成による側鎖溶媒接近可能表面の大きな損失(・>40%)または小さな損失(・>1%)が検出された可能性のある抗原接触残基を示す。
【図3】 scFv断片 4D5MOC−Bのモデル:(B)MOC31の移された可能性のある抗原接触残基(黒)を有する、VL(グレー)およびVH(白)からなる抗EGP−2 scFv断片 4D5MOC−Bの四次構造。VHのコアにおける8個のさらなる移されたマウス残基を強調した(黒の側鎖)。空間充填モデルを4D5MOC−Bの上面図(C)および下面図(D)で示す。黒玉はマウス由来の、白玉は4D5由来のものであり、ホワイトグレーの玉は4D5とMOC31において同じである。
【図4】 scFv 4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bの精製結果。還元的条件下でのSDS−PAGEは、IMACおよび次いでイオン交換を行った後のscFv 4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bの精製の結果を示している[分子量標準:ホスホリラーゼb(97.4kDa);ウシ血清アルブミン(66kDa);卵白アルブミン(44kDa);炭酸脱水酵素(29kDa);トリプシン阻害剤(21.5kDa);リゾチーム(14.3kDa)]。
【図5】 99mTc−標識された4D5MOC−Aおよび−B(RIA) による結合実験。(A)MOC31を有するSW2肺癌細胞に対する、Tc−標識された4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bの競合RIA。50ngの放射能標識したscFv断片をMOC31(10μg)有りまたは無しで、あるいは無関係な阻害物質として同量の抗c−erbB2モノクローナル抗体とインキュベーションした。(B)異なる抗原に対する(500ng/ウェル)99mTc標識4D5MOC−Aおよび4D5MOC−Bの結合特異性。
【図6】 熱および血清安定性の確認。4D5MOC−A(A)および4D5MOC−B(B)の37℃での一晩のインキュベーション(20時間)の前および後のsuperdex75カラムを用いたゲル濾過。
【図7】 熱および血清安定性の確認。Lindmo−アッセイ29によるヒト血清における37℃での一晩のインキュベーション前(C)および後(D)の99mTc−標識された抗EGP−2 scFv断片の残存免疫活性の測定。
Claims (13)
- 抗原に結合することが可能なキメラ免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片(キメラ)を安定化するための方法であって、該キメラは、
i)該抗原に結合することが可能な、ドナー免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片(ドナー)由来の抗原結合ループ、および
ii)アクセプター免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片(アクセプター)由来のフレームワーク領域、および場合により、
iii)抗原結合の改善に必要ならば、該ドナー由来のさらなる残基
を含んでなるVHおよびVLドメインを含んでなるキメラ抗EGP−2 scFv断片であって、
該キメラにおいて、VHにおけるフレームワーク領域の少なくとも1つの位置に存在する残基を、ドナーにおいて該位置に存在する残基で置換することにより、以下のアミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTKVELKR
からなるVLドメインと、以下のアミノ酸配列:
EVQLVQSGPGLVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSS
からなるVHドメインを構築することを特徴とする方法であって、
該アクセプターがヒト抗c−erbB2 scFc断片4D5(配列番号1)であり、該ドナーがマウス抗EGP−2 scFv断片(配列番号2)である、方法。 - 安定化された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片が抗EGP−2 scFv断片4D5MOC−B(配列番号3)である、請求項1記載の方法。
- 以下のアミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTKVELKR
からなるVLドメインと、以下のアミノ酸配列:
EVQLVQSGPGLVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSS
からなるVHドメインを含んでなる、請求項1または2の方法にしたがって安定化された、抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片。 - 抗EGP−2 scFv断片4D5MOC−B(配列番号3)である、請求項3記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片。
- 請求項3記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変領域を含んでなる、修飾された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片であって、該修飾が
a)Fab、(Fab)2またはdsFvから選択される免疫グロブリン断片または完全長免疫グロブリンへの変換、および/または
b)検出または精製タグ、レポーター分子、エフェクター分子、会合領域またはその組み合わせから選択されるさらなる部分の付加
である、抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片。 - 該修飾がペンタ−またはヘキサ−ヒスチジンタグの付加である、請求項5記載の修飾された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片。
- 該ペンタ−またはヘキサ−ヒスチジンタグが99mTc−トリカルボニル部分と複合している、請求項6記載の修飾された抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片。
- 請求項4記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変領域を含んでなる、請求項5〜7のいずれかに記載の修飾された免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片。
- 請求項3または4に記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片をコードする核酸。
- 請求項3〜8のいずれかに記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、および製薬的に許容し得る担体および/または賦形剤を含有する医薬組成物。
- ヒトの癌の処置のための医薬組成物の製造のための、請求項3〜8のいずれかに記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の使用。
- 請求項3〜8のいずれかに記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を含有する、診断用組成物。
- 請求項3〜8のいずれかに記載の抗原結合免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を含有する診断用キット。
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