PT1171468E - Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado - Google Patents

Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado Download PDF

Info

Publication number
PT1171468E
PT1171468E PT00926853T PT00926853T PT1171468E PT 1171468 E PT1171468 E PT 1171468E PT 00926853 T PT00926853 T PT 00926853T PT 00926853 T PT00926853 T PT 00926853T PT 1171468 E PT1171468 E PT 1171468E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
scfv
fragment
immunoglobulin
binding
antigen
Prior art date
Application number
PT00926853T
Other languages
English (en)
Inventor
Andreas Pluckthun
Annemarie Honegger
Joerg Willuda
Original Assignee
Univ Zuerich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Zuerich filed Critical Univ Zuerich
Publication of PT1171468E publication Critical patent/PT1171468E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6821—Plant heterodimeric toxins, e.g. abrin or modeccin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6821—Plant heterodimeric toxins, e.g. abrin or modeccin
    • A61K47/6823—Double chain ricin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6877—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the antibody being an immunoglobulin containing regions, domains or residues from different species
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1084—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K51/1087—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin comprises domains from different animal species, e.g. chimeric immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

DESCRIÇÃO PROCESSO PARA A ESTABILIZAÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS QUIMÉRICAS OU FRAGMENTOS DE IMUNOGLOBULINAS QUIMÉRICAS E UM FRAGMENTO DE SCFV ANTI-GPE-2
ESTABILIZADO A presente invenção tem por objecto um processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas. Além disso, a presente invenção também tem por objecto um fragmento scFv anti-GPE-2 estabilizado.
Pequenos fragmentos de anticorpos constituem uma excitante promessa para serem utilizados como agentes terapêuticos, como reagentes para diagnóstico, e para a investigação bio-quimicá. Assim, eles são necessários em grandes quantidades e a expressão de fragmentos de anticorpos, por exemplo Fv, Fv de cadeia simples (scFv) ou Fab, no periplasma de E. coli (Skerra & PlUckthun 1988; Better et al., 1988) é agora utilizada por rotina em muitos laboratórios, contudo, os rendimentos da expressão variam largamente, especialmente no caso dos scFvs. Embora alguns fragmentos dêem um rendi-mento até vário.s mg de proteina funcional, solúvel por litro e DO do caldo.de cultura num frasco de cultura com agitação (Cárter et al., 1992, Pluckthun et al. 1996), outros fragmentos podem levar quase exclusivamente a material insolúvel, muitas vezes encontrado nos chamados corpos de inclusão. A proteina funcional pode ser obtida destes últimos com rendimentos modestos, por meio de um processo de redobragem laborioso e consumidor de tempo. Os factores que influenciam os níveis de expressão do anti-corpo são ainda muito mal compreendidos. A eficiência do enovelamento e a esta- 1 bilidade dos fragmentos dos anticorpos, a instabilidade da protease e a toxicidade das proteínas expressas para as células hospedeiras, limita muitas vezes severamente os níveis de produção e têm sido feitas várias tentativas para aumentar os rendimentos de expressão. Por exemplo, Knappik & Pluckthun (1995) identificaram resíduos chave na estrutura do anticorpo que influenciam drasticamente os rendimentos de expressão. Do mesmo modo, Ullrich et al. (1995) verificaram que as mutações pontuais nas RDCs (regiões de determinação da complemen—taridade, CDR na terminologia inglesa) podem aumentar os rendimentos da expressão peri-plásmica dos fragmentos do anticorpo. Apesar disso, estas estratégias são apenas aplicáveis a poucos anticorpos.
As observações feitas por Knappik & Pluckthun (1995) indicam que a optimização dessas partes do fragmento do anticorpo que não estão directamente envolvidas no reconhecimento do antigénio, podem aumentar significativamente as propriedades de enovelamento e os rendimentos de produção das estruturas, recombinantes de Fv e scFv. As causas para um comportamento melhorado da expressão residem num comportamento de diminuição da agregação destas moléculas. Para outras moléculas, a estabilidade do fragmento e a resistência da protease podem também ser afectadas. A compreensão sobre a forma como as modificações específicas da sequência alteram estas propriedades é ainda muito limitada e está hoje em dia em fase de investigação.
Os fragmentos Fv de cadeia simples (scFvs) são fragmentos recombinantes de anticorpos que consistem em domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, ligados por um ligante de péptido flexível 12 13. Estes fragmentos conservam a afinidade da ligação monovalente e a especificidade do Acm (anticorpo mensageiro) progenitor e podem ser produzidos eficientemente em bactérias 14. Os scFvs 2 podem ser preparados por clonagem de domínios variáveis de um Acm que exibe propriedades de ligação interessantes a partir de células de hibridoma ou por selecção directa de fragmentos de scFv com a especificidade desejada a partir de bibliotecas de fagos imunizados ou simples 15,16. Frequentemente os scFvs clonados a partir de hibridomas exibem baixos rendimentos de produção e uma baixa estabilidade termodinâmica que limita a sua utilidade para aplicações in vivo 17, enquanto os scFvs seleccionados das bibliotecas de fagos tinham já sofrido uma selecção não só para a ligação do antigénio, mas também para a estabilidade e as propriedades de enovelamento no formato dos scFv 18.
Para aplicações terapêuticas, os anticorpos humanos ou os fragmentos de anticorpo são preferidos para evitar uma resposta imunitária, por exemplo, contra um fragmento de anticorpo de murino derivado de um anticorpo monoclonal (resposta AHAM). Para- resolver esse problema, podem obter-se fragmentos de anticorpos humanos por rastreamento de bibliotecas de anticorpos humanos (EP-Al 0 859 841; Vaughan 35 et al., 1996). Uma outra solução consiste em transplantar a especificidade de um anticorpo monoclonal nãò humano por meio de um enxerto das regiões RDC numa estrutura humana (EP-Bl 0 239 400). Numa melhoria da referida técnica, os anticorpos humanizados ou os fragmentos de anticorpos com um melhor comportamento"de ligação podem ser produzidos por meio da incorporação adicional de resíduos derivados dos referidos anticorpos não humanos (EP-Bl 0 451 216). Para além de se conseguir uma humanização, estas técnicas permitem "reparar" os fragmentos scFv com uma estabilidade sub-óptima e/ou um rendimento de enovelamento por enxerto das RDCs de um fragmento scFv com as desejadas afinidade de ligação e especificidade na estrutura de um scFv diferente e com um comportamento melhorado, como foi demonstrado para o 3 fragmento do anticorpo 4-4-20 por meio da ligação da fluoresceina cujas RDCs foram enxertadas na estrutura 405, levando a uma clãra melhoria tanto do rendimento da expressão como da estabilidade termodinâmica 18. A própria estrutura 4D5 é uma estrutura artificial que resulta da sequência de consenso humana e foi utilizada para a humanização do Acm de 4D5 anti-c-erbB2 (pl85Her2-ECD) (Herceptin™)19. Estudos mais recentes mostraram a estabilidade termodinâmica média anterior para o fragmento do anticorpo 4D5 20, que correlaciona . a estabilidade térmica desta molécula {Wõrn e Pltickthun, 1999) e é aparentemente de'importância geral para a aplicação in vivo dos scFvs. O anticorpo monoclonal de murino (Acm) MOC31 reconhece a glicoproteina epitelial 2 da transmembrana de 38 kDa1 (GPE-2; também conhecida como GA733-2, Ep-cAM ou KSA). A GPE-2 é olhada como .um antigénio alvo apropriado para a visualização e a terapia de tumores, dado que é fortemente sobre-expressa numa variedade de carcinomas humanos e não se dispersa na circulação. Vários ensaios clinicos com os Acms anti-GPE-2 tais como 17-1A, KSl/4 e MOC31 2,3,4 demonstraram o potencial destes anticorpos para a imunoterapia activa e passiva de carcinomas humanos. A função exacta da glicoproteina GPE-2 da transmembrana não é ainda conhecida, embora tenha sido proposto um papel na associação célula-célula (Simon et al., 1990). Relatórios recentes identificaram a GPE-2 como uma molécula homofilica de adesão de célula-célula 5,e, e a GPE-2 tem sido identificada como um modificador potencial da capacidade invasiva e da sensibilidade a produtos químicos 1. Num estudo que avalia o potencial de novas imunoterapias dirigidas à GPE-2, exotoxina-A (ETA) quimicamente fundida com o Acm MOC31 verificou-se que retardava o crescimento de tumores grandes 8 4
Os antigénios associados a carcinomas tais como os receptores de c-erbB2 e EGF, assim como GPE-2 têm servido como alvos para os anticorpos marcados com rádio para a visualização e a terapia de tumores. Têm sido feitos esforços para melhorar a eficiência pretendida por meio da redução do peso molecular e consequente aumento da penetração nos tecidos e pela purificação do soro dessas estruturas à base do anticorpo. Fab, (Fab)2, dsFv e os fragmentos de scFv, gerados por meio da tecnologia do anticorpo recombinante, têm um grande potencial a. este propósito 9'10, embora até agora não tenham ainda sido determinados os formatos óptimos respeitantes à estabilidade, peso molecular e afinidade que têm ainda de ser aperfeiçoados para as diferentes proteínas de fusão dos efecto-res dos anticorpos consoante o sistema especial in vivo e o objectivo da aplicação 11.
Para o desenvolvimento de novos reagentes terapêuticos e de visualização à base de um novo fragmento de anticorpo, dirigidos à glicoproteina-2 epitelial do. antigénio associado a pan-carcinomas, clonaram-se domínios variáveis de M0C31 do hibridoma de murino anti-GPE-2 hibridoma M0C31 no formato de fragmento Fv de cadeia, simples 16. Embora o scFv resultante exibisse a afinidade de ligação esperada e a especificidade em relação a GPE-2, que também se viu nas secções de tecido em experiências de imuno-histo-coloração feitas por outros 30, ele estava fracamente expresso no periplasma das bactérias. As experiências, in vivor visando ratos pelados utilizando este fragmento de falharam. Estes scFv não só não se acumularam no tumor, mas também mostraram taxas de clearánce mais lentas do que um scFv de controlo irrelevante dirigido contra a fluoresceína. Pode-se demonstrar que o scFv M0C31 formou agregados de elevado peso molecular e rapidamente perdeu a sua actividade quando. 5 incubado em soro à temperatura do corpo (37 °C) . Isto foi devido principalmente a uma ' insuficiente estabilidade térmica mais do que à degradação proteolitica, dado que uma precipitação similar e uma perda de imuno-actividade pode também ser observada após a incubação de scFv altamente purificado em SBF (soro bovino fetal) a 37 "C.
Para passar desta sonda de agregação e de um scFv instável sob o ponto de vista térmico para uma molécula apropriada para uma aplicação imunoterapêutica, as propriedades biofísicas da estrutura têm de ser melhoradas. Basicamente abrem-se duas avenidas para fazer uma abordagem com este objective: Evolução ín-vitro do scFv M0C31 para uma melhor estabilidade térmica combinando aleatoriedade com selecção de uma funcionalidade melhorada a temperatura elevada ou a transferência da especificidade de ligação do scFv anti-GPE-2 M0C31 para uma estrutura de scFv com as propriedades biofísicas médias anteriores por meio de enxerto de RDC 18. Embora a primeira opção tenha sido utilizada com sucesso para se conseguirem scFvs extremamente estáveis 35, a segunda opção tinha a vantagem adicional de que, escolhendo uma' sequência de uma estrutura humana para o enxerto, pode ao mesmo tempo conseguir-se uma humanização, reduzindo assim o potencial de imunogenicidade dos futuros reagentes imuno-terapêuticos. Por isso decidiu-se enxertar o scFv M0C31 anti-GPE-2 ligando-se especificamente na estrutura humana de consenso, artificial do scFv 4D5, correspondendo essencialmente às sequências da linha germinativa IGVH 3-66 e IGVK 1-39 (IMGT) . 0 enxerto das regiões de determinação da complementaridade (RDCs) dos Acms para a humanização já foi utilizado mais de 100 vezes 10 e pode ser agora olhado como uma tecnologia padronizada. A estrutura de 4D5 já foi utilizada antes, várias vezes, com sucesso como um receptor da RDC 21'18'36. 6
Esta estratégia provou ter sucesso, dado que a variante do enxerto 4DSM0C-A exibiu caracteristicas de ligação que não se distinguiram das do anticorpo parental e do scFv.
Contudo, 4DSM0C-A exibiu apenas uma estabilidade térmica intermédia entre a das duas moléculas parentais 4D5 e M0C31. Os dados da biodistribuição indicaram, que o scFv M0C31, que perdeu a maior parte da sua actividade num prazo inferior a 1 hora a 37 °C, falhou no seu enriquecimento no tumor, e a variante do enxerto 4D5MOC-A, estável durante algumas horas a 37 °C enriqueceu apenas ligeiramente.
Assim, o problema técnico subjacente à presente invenção consiste em providenciar um processo que permite a estabilização do fragmento quimérico scFv de ligação de anti-GPE-2 4D5MOC-A. A solução para os problemas técnicos anteriores é conseguida através dos enquadramentos ca-racter.izados nas reivindicações. De acordo com isto, a presente invenção permite identificar e modificar resíduos das imunoglobulinas quiméricas ou de fragmentos de imunoglobulinas quiméricas que levam a um aumento da estabilidade. A abordagem técnica da presente invenção, isto é, a identificação e . permuta dos resíduos de aminoácidos nas regiões da estrutura do domínio VH para estabilizar as imunoglobulinas quiméricas ou os fragmentos de imunoglobulinas quiméricas formados por meio das abordagens dos enxertos das RDC não é providenciada nem sugerida pela técnica anterior.
No contexto do presente pedido de patente, utilizaram-se as seguintes abreviaturas: "Quimera" é utilizado em vez da expressão "imunoglo-bulina quimérica ou fragmento de imunoglobulina quimé- 7 rica", "dador" em vez de " imunoglobulina dadora ou fragmento de imunoglobulina dadora", e "receptor" em vez de "imunoglobulina receptora ou fragmento de imunoglobulina receptora". 0 termo " quimérica " no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula composta por porções de duas moléculas diferentes.
Os fragmentos de imunoglobulina podem ser fragmentos Fv, scFv, Fv ligado por pontes de di-sulfureto (Glockshuber et al., 1992; Brinkmann et al., 1993), Fab, (Fab')2 ou outros fragmentos bem conhecidos dos especialistas na matéria, que compreendem ò domínio variável de uma imunoglobulina ou de um fragmento de imunoglobulina..
Farticularmente preferido é o formato do fragmento scFv. • A expressão "anéis de ligação do antigénio" refere-se às partes do domínio variável das imunoglobulinas ou de fragmentos de imunoglobulinas que são os principais responsáveis pela ligação do antigénio. Kabat et al. (1979) definiram as regiões de determinação da complementaridade (RDÇs) como sendo responsáveis pela ligação do antigénio com base no grau de variabilidade encontrado nas sequências do anticorpo. Mais tarde, Chotia e colaboradores definiram os anéis de ligação do antigénio com base em considerações estruturais. Allazikani et al. (1997) reviram e compararam as definições de acordo com Kabat e Chotia. A expressão "outros resíduos do referido doador se necessário" refere-se à situação de resíduos adicionais fora dos anéis de ligação do-antigénio estarem enxertados no receptor. A patente EP-Bl 0 451 216 ensina processos que permitem identificar esses outros resíduos. 8 A análise envolve a análise dos contactos entre os resíduos da estrutura e a identificação das diferenças nos modelos de ligação ao hidrogénio, ângulos de torção das cadeias laterais, alterações da conformação da cadeia principal do polipéptido e da estrutura terciária. Parti-cularmente preferida é a análise dos resíduos na estrutura 1 do domínio VH, e a mais preferida é a análise das diferenças· causadas pelos diferentes resíduos nas posições H6 a H10, e as consequências dessas diferenças através do domínio VH por meio de interacções com outros resíduos do domínio VH e as sequências correlacionadas e as diferenças de conformação31. As diferenças nas posições H6 a H10 podem ser utilizadas para definir diferentes subgrupos da estrutura de suporte.
No contexto da presente invenção, utilize-se um esquema numerado de acordo com Kabat et al. (1979). Assim, o número não corresponde necessariamente à posição actual na ordem sequencial dos resíduos numa cadeia VH ou VL, mas indica a posição relativa correspondente às sequências na base de dados de Kabat das sequências de anticorpos. "H" refere-se às posições em VH, "L" a posições em VL. Assim, H6 é o resíduo número 6 de acordo com Kabat em VH.
Os dados nas estruturas do domínio VH podem ser obtidos a partir dos estudos de RMN, ou preferencialmente a partir de estruturas de raios X das imunoglobulinas ou de fragmentos de imunoglobulinas. Podem gerar-se modelos de homologia utilizando diferentes pacotes de software de criação de modelos moleculares disponíveis e bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Preferencialmente, utiliza-se o software de criação de modelos moleculares Insight97 (Biosym/ MSI, módulos Homologia, Biopolímero e Descoberta). Preferencialmente, a identidade da sequência dos domínios VH utilizados para a análise da estrutura e/ou a criação de 9 modelos de estrutura mostra um elevado grau de identidade da sequência com o correspondente domínio VH do referido dador ou receptor. Preferencialmente, a referida identidade da sequência é maior do que 75 %, e mais preferencialmente, maior do que 80 %.
As referidas posições da estrutura podem compreender H6 ou H9. A presente invenção tem por objecto um processo, em que o referido receptor é o fragmento humano scFv anti-GPE-2 4D5 (SEQ-ID No:. 1) . O fragmento scFv anti-GPE-2 4D5 já foi descrito aqui antes. O referido dador é o fragmento scfv anti-GPE-2 obtido de MOC31 de hibridoma de murino (SEQ-ID No. 2). O. MOC31 de hibridoma de murino e o fragmento scfv anti-GPE-2 obtido dele está descrito aqui antes e no exemplo.
As referidas posições (uma ou mais) na estrutura em VH são H6, H9, H18, H20, H38, H63, H82 e H109 (numeração de acordo com Kabat et al. (1979), ver antes). A presente invenção tem por objecto um processo, em que a referida imunoglobulina estabilizada de ligação ao antigénio ou o fragmento de imunoglobulina é o fragmento scfv anti-GPE-2 4D5MOC-B (SEQ-ID No. 3).
Noutro enquadramento, a presente invenção tem por objecto uma imunoglobulina de ligação ao antigénio ou um fragmento de imunoglobulina estabilizado de acordo com um processo da presente invenção, em que a referida imunoglobulina de ligação ao antigénio ou o fragmento de imunoglobulina é o fragmento humano scFv anti-GPE-2 4D5 4DSMOC-B (SEQ-ID No. 3) . 10
Descreve-se uma imunoglobulina de ligação ao antigénio ou uma imunoglobulina que compreende o domínio variável de uma imunoglobulina de ligação ao antigénio ou de um fragmento de imunoglobulina estabilizado de acordo com um processo da presente invenção sendo a referida modificação a) a conversão num fragmento diferente de imunoglobulina ou em imunoglobulina completa, e/ou b) a ligação de partes adicionais, tal como marcadores de detecção ou de purificação, moléculas relatoras, moléculas efectoras, domínios de associação ou combinações dos anteriores.
Os referidos fragmentos de imunoglobulina podem ser um fragmento Fv, scFv, Fv ligados por pontes de di-sulfureto, Fab, (Fab')2 ou outros fragmentos, ou uma imunoglobulina completa tal como IgG, IgA, IgM bem conhecidos dos especialistas da matéria, que compreendem do domínio variável da referida imunoglobulina ou fragmento de imunoglobulina estabilizado e que é diferente do formato da imunoglobulina ou do fragmento de imunoglobulina estabilizados.
Particularmente preferidas são as partes que têm uma função terapêutica útil. Por éxemplo, a parte adicional pode ser uma molécula de toxina que é capaz de matar as células (Vitetta et al., 1993). Há numerosos exemplos dessas toxinas, bem conhecidos dos especialistas da matéria, tal como as toxinas bacterianas Pseudomonas exotoxina A, e a toxina da difteria, assim como as toxinas de plantas ricina, abrina, modeocina, saporina, e gelonina. Fundindo essa toxina com uma imunoglobulina ou com um fragmento de imunoglobulina de acordo com a presente invenção, a toxina pode ser direccionada, for exemplo, para células doentes, e 11 assim ter um efeito terapêutico benéfico. Alternativamente, a parte adicional pode ser uma citocina, tal como IL-2 (isoleucina 2) (Rosenberg & Lotze, 1986), que tem um efeito particular (neste caso um efeito proliferativo das células T) numa família de células. Num outro enquadramento preferido, a parte adicional é pelo menos parte de uma proteína de superfície que pode dirigir a proteína de fusão para a superfície de um organismo, por exemplo, uma célula ou um fago, e assim descobre o parceiro da imunoglobulina ou do fragmento da imunoglobulina. Preferencialmente, a parte adicional é pelo menos uma parte de uma proteína de revestimento ou. de bacteriófagos filamentosos, . mais preferencialmente da proteína.do gene III. Noutro enquadramento, a parte adicional pode conferir ao seu parceiro da imunoglobulina ou do fragmento da imunoglobulina um meio de detecçâo e/ou de purificação. Por exemplo, a proteína de fusão pode conter a imunoglobulina Ou o fragmento de imunoglobulina modificados e uma enzima normalmente utilizada para fins de detecçâo, tal como fosfatase alcalina (Bláke et aí., 1984). Há numerosas outras partes que podem ser utilizadas como marcadores de detecçâo ou de purificação, que são bem conhecidos dos especialistas da matéria. A presente invenção também tem por objecto outras partes adicionais tal como os marcadores vulgarmente utilizados c-myc e FLAG (Hopp et al., 1988; Knappik & Plticktun, 1994).
Praticando engenharia em um ou mais dos domínios adicionais fundidos, a imunoglobulina ou o frgamento de imunoglobulina podem agrupar-se formando moléculas maiores. Na medida em que as propriedades físicas da imunoglobulina ou do frgamento de imunoglobulina determinam as caracterís-ticas do conjunto, a presente invenção providencia um meio de aumentar a estabilidade dessas moléculas maiores. Por exemplo, os mini-anticorpos (Pack, 1994) são. dimeros que 12 compreendem,dois fragmentos scFv, cada um deles fundido com um domínio de dimerização de auto-associação. Os domínios de dimerização que são particularmente preferidos incluem os derivados de um ziper de leucina (Pack & Plucktun, 1992} ou um elemento de' hélice-torção-hélice (Pack et al., 1993). A referida modificação poder ser a ligação de um marcador de penta- ou hexa-histidina. Os péptidos .que compreendem pelo menos cinco resíduos de histidina (Hochuli et al. , 1988) são capazes de se ligar a iões metálicos e podem por isso ser utilizados para a purificação" da proteína com a -qual se fundem (.Lindner et al., 1992)·. Os vectores tais como pIG-6 (ver exemplo) que codificam, uma cauda'de penta-histidina podem ser utilizados para produzir essas imunoglobulinas ou fragmentos de imunoglobulinas modificados. Além disso, pIG-Ç.providencia um marcador FLAG de N-Wrminal e um marcador c-myc do terminal C para fins de detecção.
Ainda preferido é um fragmento modificado em que ò referido marcador de penta- ou hexa-histidina forma um complexo com uma parte de 99mTc-tricarbonilo. 0 processo de marcação com 99mTc específico do marcador de His já foi descrito (Alberto et al., 1998). P tri-hidrato de 99mTc-tricarbonilo forma complexos muito estáveis com o marcador de penta- ou hexa-histidina. Os fragmentos modificados que contêm uma parte de 99mTc-tricarbonilo podem ser utilizados para abordagens de radioterapia ou radiovisualização. São ainda preferidas sequências de ácidos nucleicos ou sequências adicionais de ácidos nucleicos que codificam uma imuno-globulina ou um fragmento de imunoglobulina que se liga ao anti-génio, de acordo com a presente invenção. Consoante o tipo de imunoglobulina ou de fragmento de imunoglobulina, é necessária uma única sequência de ácidos 13 nucleicos, por exemplo, para a codificação de um fragmento scFv, ou duas, por exemplo para a codificação de um fragmento Fab, ou são necessárias mais sequências de ácidos nucleicos. Preferencialmente, as referidas sequências de ácidos nucleicos são compostas por um vector, preferencialmente um vector apropriado para a sequenciação e/ou a expressão. 0 referido vector compreende a referida sequência de ácidos nucleicos ou as sequências de ácidos nucleicos podem estar compreendidas numa célula hospedeira.
Num outro enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto um processo para a produção' de uma imunoglobulina ou um fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio, estabilizados de acordo com a presente invenção compreendem a expressão de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção que codificam a referida imuno-globulina ou fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio num sistema de expressão apropriado. 0 sistema de expressão pode ser a expressão num hospedeiro apropriado.. 0 hospedeiro aqui referido pode ser qualquer, um de um certo número normalmente utilizado na produção de proteínas heterólogas, incluindo, mas não se limitando a bactérias, tais como E. coli (Ge et ai, 1995), ou Bacillus subtilis (Wu et al., 1993), fungos, tal como leveduras (Horwitz et al., 1988; Ridder et al., 1995) ou fungos filamentosos (Niissõnen et al., 1993), células . de plantas (Hiatt, 1990, Hiatt & Ma, 1993; Whitelam et al., 1994), células de insectos (Potter et al., 1993; Ward et al., 1995), ou células de mamíferos (Trill et al., 1995). 0 sistema de expressão pode ser a expressão num sistema de tradução isento de células, preferencialmente num sistema acoplado, in vitro de trans-crição/tradução. Preferencialmente, essa tradução realiza-se num sistema de tradução procariótico. Particularmente preferido é um sistema de 14 tradução à base de E. coli tal como um sistema de tradução de E. coli S-30. Alternativamente, a tradução pode ser realizada num sistema de tradução eucariótico.
Num enquadramento ainda mais preferido, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica contendo uma imunoglobulina ou um fragmento de imunoglo-bulina de ligação ao anti-génio de acordo com a presente invenção e, eventualmente, um veiculo e/ou diluente aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.
Ainda num outro enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto a utilização de uma imunoglobulina ou de um fragmento de imunoglobulina estabilizados de acordo com a presente invenção ou de uma imunoglobulina ou um fragmento de imunoglobulina modificados de acordo com a presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica · para o tratamento de carcinomas em seres humanos.
Ainda preferida é a utilização do fragmento scFv anti-GPE-2, 4DSM0C-B, de acordo com a presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de carcinomas em seres humanos.
Ainda num outro enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto uma composição de diagnóstico contendo uma imunoglobulina ou um fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio de acordo com a presente, invenção.
Ainda num outro enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto um kit de diagnóstico contendo uma imunoglobulina ou um fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio de acordo com a presente invenção. 15
Explicações das figuras Figura 1 O alinhamento das sequências dos domínios VL e VH de scFv MOC31, 4DSM0C-A, 4DSMOC-B e 405: (A) As posições de acordo das sequências entre MOC31 e 4D5 estão indicadas pelas letras a negro num fundo cinzento, resíduos que estão de acordo com 4D5 mas que são diferentes de MOC31 nas letras a preto num fundo branco e os resíduos que estão de acordo com M0C31 mas não com 4D5 estão indicados pelas letras brancas num fundo negro. Os marcadores dos resíduos e as definições das RDC estão de- acordo com Kabat (1987). (B) indica resíduos mergulhados no núcleo ou na interface do domínio, (b) resíduos semi-mergulhados. (·) e (*) indi cam resíduos de potencial contacto com o antigénio, ( detectados por uma perda grande (· > 40 %) ou pequena (·> 1 %) das cadeias laterais da superfície acessível do dissolvente aquando da formação do complexo, proporcional para esta posição em relação a todos os complexos de proteína-anticorpo, na base. de dados PDB.. (acrónimo de Protein Data Bank). Modelo do fragmento scFv 4DSM0C-B: (B) Estrutura quaternária do fragmento scFv 4DSMOC-B anti-GPE-2, composto por VL (cinzento) e VH (branco) com resíduos de contacto potencial com o antigénio, transferidos de MOC31 (preto). Os oito resíduos adicionais de murino transferidos para o núcleo de VH estão evidenciados (cadeias laterais negras). Um modelo de preenchimento do espaço mostra 4DSMOC-B na vista de topo (C) e na vista do fundo (D). As bolas negras são de murino e as brancas têm origem em 4D.5, enquanto as bolas' cinzentas são iguais em 4D5 e MOC31. 16
Figura 2 0 resultado da purificação dos scFv 4DSM0C-A e 4D5MOC-B. GPEA-SDS (electroforese em gel de poliacrilaitiida e sulfato de dodecilo e sódio) em condições redutoras mostra o resultado da purificação dos scFv 4D5MOC-A e 4D5MOC-B depois de IMAC e em seguida realizou-se a permuta iónica. [PM (peso molecular) padrão: fosforilase b (97,4 kDa) ; albumina de soro bovino (66 kDa); ovalbumina (44kDa); anidrase carbónica (29 kDa); inibidor de tripsina (21>5 kDa);.lisozima (14.3 kDa)]
Figura 3
Experiências de ligação com 4D5MOC-A e -B marcados com 99mTc (RIE-radioimunoensaio) . (A) Comparação por RIE de 4D5MOC-A e 4D5MOC-B marcados com Tc em células de cancro do pulmão SW2. com MOC31. Cinquenta ng de fragmentos scFv radiomarcados foram incubados com ou sem MOC31 (lOpg) ou com a mesma quantidade de um anticorpo monoclonal anti-cerbB2 como inibidor irrelevante. (B) Especificidade de ligação de 4D5MOC-A e 4D5MOC-B marcados com 99mTc em diferentes antigénios (500 . ng/cavidade)
Figura. 4
Verificação da.estabilidade térmica e do soro
Filtração em gel numa coluna superdex 75 antes e depois da incubação durante a noite (20 h) a 37 °C de 4DSMOC-A (A) e 4D5MOC-B (B). Determinação da imunoactivi-dade remanescente dos fragmentos scFv anti-GPE-2 marcados 17 com 99raTc antes (C) e depois da incubação durante a noite (D) em soro humano a 37 °C por incubação por meio de um ensaio de Lindmo29. 0 exemplo ilustra a presente invenção. EXEMPLO (Willuda et al., 1999)
Material e Processos
Linhas de células de mamíferos
Manteve-se a linha de células de carcinoma do pulmão humano de células pequenas SW2, gentilmente cedida pelo Dr. S. D. Bernal (Dana Farber Câncer Institute, Boston,' Mass., EUA) e a linha de células de cancro da mama SK-BR-3 (#HTB 30, American Type Culture Collection, Rockville, MD) em meio à base de RPMI 1640 (Hycloné, Europe Ltd.) complementado com soro bovino fetal a 10 % (Gibco, Grand Island, NY) e fizeram-se crescer a 37 °C em atmosfera de CO2 a 5 %. A linha de células de cancro, da mama SK-OV-3 (#HTB 77, American Type Culture Collection, Rockville, MD) cresceu em RPM 11640, complementado çom FCE (factor de crescimento epidérmico) (10 ng/ml) e insulina (5 ng/m.l) .
Glicoproteina epitelial 2 (GPE-2) e fragmentos Fv de cadeia simples A glicoproteina epitelial 2 humana foi produzida como uma proteína solúvel recombinante (Ml -' F259) com um marcador de seis histidina do terminal C por meio da utilização do vector de expressão pBB4/GA-733-2 no sistema de expressão de baculovírus (Invitrogen). 0 fragmento scFv anti-GPE-2 (scFv M0C31) foi construído a partir do ARNm isolado a partir da linha de. células de' hibridoma de murino MOC31 1 utilizando um sistema de re-engenharia pelo sistema 18 de "phage display" (técnica para verificar interacções de proteínas através da integração de múltiplos genes de um banco de genes em fagos) descrito antes 16. O fragmento Fv de cadeia simples do anticorpo 4D5 humano anti-c-erbB2 tinha sido preparado a partir do fragmento Fab (Cárter et al,) e tinha sido utilizado em vários estudos anteriores 21,26
Modelo molecular/ Construção do enxerto
Gerou-se um modelo de homologia do fragmento scFv anti-GPE-2 tal como se gerou utilizando o software de criação de.modelos moleculares Xnsight97 (Biosym/ MSI, módulos Homõlogy,. Biopolymer and Discover) . 0 modelo do domínio VL baseou-se nas estruturas vistas ao raio X do fragmento Fab de rato JEL103 (22, Base de Dados de Brookhaven entradas 1 mrc, 1 mrd, 1 mre e 1 mrf, resolução de 2,3 %°-2,4 %°, ideritidade da sequência com M0C31 de 7 6 %), modelo do domínio VH baseou-se na estrutura de uma antineuraminidase Fab (23'24, entradas da pdb Inca, 1 ncb, 1 ncc e 1 ncd, resolução de 2,5 %o, identidade de 85%) e.a conformação de H3 da RDC do Fab anti-coleratoxina TE33 (25, entrada de pdb 1 tet, resolução de 2,3%o, identidade de 82 %). Os modelos do domínio M0C31 sobrepuseram-se à estrutura de cristal do Fv humanizado 4D5 das versões 8 (26, entrada da pdb lfvc, resolução de 2,2 %o, VL: identidade de 55 %, VH: identidade de 50 % com M0C31)'. Os potenciais contactos com o antigénio foram identificados por comparação com a superfície acessível do dissolvente da cadeia lateral dos complexos conhecidos de anticorpo-proteína na presença e na ausência do ligando utilizando o programa naccess (S. Hubbard e J. Tornton, 1992, http://sjh.bi.umist.ac.uk/naccess.html). Verificaram-se os modelos quanto a possíveis conflitos esté-ricos, potenciais· contactos com antigénios e resíduos que podem ter uma influência indirecta nas conformações da RDC, o que resulta no híbrido scFv 4D5MOC-A. . Numa segunda 19 estrutura, scFv 4D5MOC-B, 8 resíduos chave no núcleo de VH estavam retidos na sequência de MOC31 em vez de estarem alterados para a sequência de 4D5 de modo a preservar o subtipo estrutural da estrutura de VH de M0C31.
As sequências desenhadas para ambas as variantes foram novamente traduzidas (pacote GCG) e os fragmentos foram estruturados pela síntese de genes 27 a partir dos oito nucleótidos de sobreposição para o VL e depois para as duas variantes diferentes de VH, na orientação VL -ligante -VH. 0 comprimento dos oligonucleótidos utilizados estava entre 40 pb (pares de bases) e 78 bp. Produziu-se cada domínio separadamente e clonou-se no vector pBluescript com extremidades cegas (Stratagene) e foi em seguida sequenciado. Os domínios VL e VH foram então clonados no vector de expressão plG6 (Ge et al., 1995). Introduziu-se então um ligante não repetitivo de 24-mer TPSHNSHQVHSAGGPTANSGTSGS 28 por meio de mutagénese de cassete por via dos sítios de restrição AflII. e BamHI.
Expires são e purificação dos fragmentos Fv de cadeia simples
Para a expressão periplásmica do fragmento scFV de ligação a c-erbB2 4D5 e os fragmentos scFV de ligação a GPE-2 4D5MOC-A e 4DSMOC-B, utilizou-se o vector plG6, enquanto se utilizou o vector pAK40.0 16 para a expressão do scFv MOC31. Para a produção em larga escala, utilizou-se a estirpe SB536 de E. coli (Bass et al. 1996)< Inoculou-se, durante a noite, um litro de dYT contendo 1 % de glu e ampicilina (30 pg/ml) num frasco de agitação de 5 I com 30 ml de cultura. Quando a cultura atingiu uma DO550nm de 0,5, induziu-se a produção de scFv com uma concentração final de isopropil-D-galactopiranósido (IPTG; Boehringer Mannheim) de. 1 mM durante três ou quatro horas a 24 °C. A DO final foi de cinco - seis para 4D5,, 4D5MOC-A 4D5MOC-B e quatro para o scFv M0C31. Armazenaram-se os peletes recolhidos a -80°C. 20
Para a purificação dos peletes de 1 litro de cultura fez-se uma nova suspensão em Hepes 20 iriM a pH 7,0, NaCl 30 mM e fez-se a lise com. dois ciclos numa prensa francesa de prensagem de células (SLS Instruments Inc., Urbana Illinois, USA) . Centrifugou-se o lisado purificado num rotor SS-34 a 48246 g' a 4 °C e esterilizou-se o filtrado. Todos os fragmentos Fv de cadeia simples foram purificados numa coluna de Ni+-IDA e uma coluna de permuta de iões HS/M-4.6/100, acoplada em linha com um sistema BIOCAD (Perseptive BioSystem-Inc.) tal como já foi descrito previamente (Pliicktun 1996, capitulo do livro) . Depois de se carregar o lisado na coluna de Ni+-IDA,. lavou-se a coluna com Hepes 20 mM a pH 7,0, NaCl 500 mM, e numa segunda etapa com Hepes 20 mM a pH 7,0, imidazole. 40 mM antes da eluição da proteína ligada feita com imidazole 200 mM, a pH 7,0. Carregou-se directamente o produto eluído numa coluna de permuta de iões HS/M-4.6/100, e eluíu-de a proteína especificamente ligada com um gradiente de sal de 0 a 500 mM de NaCl em Hepes 20 mM a pH 7,0. Fez-se a diálise da fracção contendo o fragmento do anticorpo contra um excesso de SBF e concentrou-se até 1 mg/rnl utilizando um. filtro de corte directo de 10 kDa (Ultrafree-MC low proteína binding, Millipore) por centrifugação a 4000 g a 4 °C. Para o fragmento scFV anti-GPE-2 MOC31 foi necessário fazer uma filtração preparativa em gel numa coluna Superdex75 (Pharmacia) como a terceira etapa de purificação que baixou novamente o rendimento final de dez' vezes. 0 resultado da purificação foi . verificado numa GPEA-SDS a 12,5 % em condições redutoras. Os pesos moleculares de todos os s.cFvs purificados foram verificados por espectro-metria dè massa.
Marcação com 99etecnécio específica do marcador de His com os fragmentos Fv de cadeia simples 21 0 tri-hidrato de "“Tc-tricarbonilo (Alberto et al., 1998) forma complexos muito estáveis com o marcador de penta- ou hexa-histidina, fazendo assim uma dupla utilização do marcador His que está presente para a purificação por cromatografia por afinidade do metal imobilizado (CAMI) . Os fragmentos scFv (1 mg/ml) foram misturados com um terço do volume de 99mTecnécio-trícarbonilo (30 mCi/ml) num tampão e um ‘ terço do' volume de MES 0,5 M a pH 6,2 e incubou-se durante trinta minutos a 37 °C. Marcou-se o ScFv MOC31 durante 30 min a 30 °C a uma concentração de proteína de 400 pg/ml para evita a precipitação. Dessalinizou-se a mistura reaccional numa coluna rápida de dessalinização (Pharmacia) equilibrada com SBF. As alíquotas das fracções recolhidas foram medidas num contador de cintilação para identificar as fracções com a proteína marcada.
Filtração analítica em gel
Realizou-se a,filtração analítica em gel com o sistema Smart ' (Pharmacia), utilizando uma coluna Superdex 75. Todas as medições foram· feitas em tampão de SBF contendo Tween-20 a 0,005 %. Os fragmentos scFv foram injectados numa concentração de 1 mg/ml num volume de 15 μΐ antes e depois da incubação durante a noite durante 20 h a 37 °C. Calibrou-se a coluna no mesmo tampão com álcool-desidro-genase (150 kDa), albumina de soro bovino (66 kDa), anidrase carbónica ΐ2 9 kDa) e citocroma c (12,4 kDa) como padrões da massa molecular.
Especificidade da ligação A especificidade da ligação dos diferentes fragmentos scFv foi ensaiada por comparação com o anticorpo monoclonal MOC31. Fez-se a incubação de cinquenta ng de scFv radio-marcado 4D5MOC-A ou 4D5MOC-B com 0,5 x 10e células SW2 em 200 μΐ de SBF/ ASB a 1 % depois da pré-incubação com ou sem o Acm MOC31 (10 Kg) ou com a mesma quantidade de um 22 i anticorpo monoclonal anti-c-erb82 como um concorrente irrelevante durante for 30 min a 4 °C. Em três etapas de lavagem as células foram centrifugadas a 1000 g durante .5 min a 4 °C, eliminou-se o sobrenadante e as células foram novamente suspensas em SBF/ASB a 1 %. Mediu-se a radioacti-vidade remanescente num contador de cintilação. Numa outra experiência de ligação ambos os fragmentos scFv (50 ng) foram incubados com diferentes antigénios, revestiu-se (500 ng/cavidade) numa placa microtítuladora de 96 cavidades, para verificar a reactividade cruzada. Lavaram-se as cavidades três vezes com SBF/ASB a 1 % e determinou-se a radioactividade.
Determinação de Kd por meio de RIE e da ressonância plasmónica de superfície (BIAcore)
Determinou-se a afinidade de ligação dos fragmentos scFv de cadeia simples marcados em células SW2 num ensaio de radioimunoafinidade (RIE}. Incubaram-se ás células SW2 (0,5xl06) com quantidades crescentes de fragmento Fv de cadeia simples (100 pM - 30 nM) durante 1 hora a 4 °C. Para estimar as amostras de controlo de ligações não especificas pré-incubaram-se as células com um excesso de 100 vezes de fragmentos Fv de cadeia simples não marcados durante lha 4 °C. Determinou-se a' fracção ligada. do fragmento Fv de cadeia simples num contador de cintilação.· Cada 'valor obtido representa a média de duas amostras. Desenharam-se' as contagens por minutos (cpm) em função da concentração nanomolar do fragmento Fv de cadeia simples e ajustou-se com a função de regressão não linear.
Determinaram-se as constantes das taxas cinéticas por ressonância plasmónica de superfície (RPS) com um instrumento da BIAcore. O GPE-2-antigénio solúvel, recombinante foi ligado covalentemente a um chip sensor CM-5 por meio de grupos amina livres resultando, numa cobertura da superfí- 23 cie de 350 unidades de ressonância. Injectaram-se fragmento Fv de .cadeia simples com concentrações crescentes (.0,1 nM -4 μΜ) a uma velocidade de ' fluxo de 3 0 μΐ/min de SBF desgaseificado/Tween-20 a 0,005 %. Calcularam-se as constantes das taxas de associação e de dissociação a·partir do sensorgrama por meio do ajustamento de uma curva global utilizando o software BIAevaluation 3.0 (Pharmacia}. .
Estabilidade dos scFv radiomarcados no soro a 37 °C A fracção. ímunoactiva remanescente dos fragmentos Fv de cadeia simples, depois de serem marcadas radioactiva-mente, foi determinada tal como já foi descrito, previamente 25. Fez-se a incubação das amostras contendo quantidades, diferentes de células (0,625xl06 -lOxlO6) em 100 μΐ com cinquenta ng de fragmentos scFv radiomarcados durante lha 4°C num agitador. Determinou-se a ligação não específica, nas amostras de controlo de células pré-incubadas com um excesso de 100 vezes . de fragmentos scFv não marcados em SBF/ASB a 1 %. Após três etapas de lavagem, determinou-se então a quantidades de fragmentos. scFv ligados, num contador de cintilação. Cada valor referido representa a média do resultado de duas amostras. Para o cálculo da imunoactividade, dividiram-se as contagens totais por minuto (cpm.) pelo valor de cpm para a proteína ligada e depois desenharam-se em função do inverso do número de células e ajustou-se por regressão linear. O inverso da intercepção de y em percentagem dá a percentagem dos fragmentos Fv bioactivos de cadeia simples. Para estimar a estabilidade dos diferentes fragmentos Fv de cadeia simples radiomarcados em soro, incubaram-se as moléculas durante a noite (20 h) num. soro humano a 37 °C, numa concentração final de 17 pg/ml e determinou-se a imunoactividade remanescente num.ensaio de Lindmo.
Caracterização i.n vivo - purificação e biodistribuição 24
Realizaram-se estudos de purificação do sangue . çom ratos pelados fêmeas CD1 de oito semanas de idade, isentos' de tumores. Cada rato recebeu i.v. 300 pCi de scFv 4D5MOC-B marcados com 99mTc. Passados 7,5, 15, 30, 60, 120, e 240 minutos após a injecção, recolheram-se amostras de sangue, e calculou-se o valor de t^a e t^B a partir da radio-actividade medida. O estudo de biodistribuição dos fragmentos scFv 4D5MOC-B marcados com 99mTc foi feito em ratos pelados CDl com seis semanas de idade e portadores de xenoenxertos SW2 com 13 dias (40-80 mg). Cada rato dos três grupos, de quarto ratos recebeu 30 pg de scFv (300 pCi) radiomarcados. A análise de biodistribuição dos scFv MOC31 marcados com ."“Tc foi realizada em ratos pelados negros com sete semanas de idade portadorés de xenoenxertos de SW2-com dez dias (10-40 mg). Administrou-se 5 pg de scFv MOC31 (85 pCi). marcado com "“Tecnécio a cada rato dos três grupos de três ratos cada. Utilizou-se. scfv FITC-E2 de ligação a anti-fluoresceina como um anticorpo, de controlo não específico. Os ratos foram mortos 1, 4 e 24 horas após a injecção. Retiraram-se tecidos e órgãos e avaliaram-se quanto à actividade utilizando um contador gama. A análise de biodistribuição com scFv 4D5 mareados com "“Tc foi descrita recentemente (Waibel et al.,' 1999).
Resultados
Modelação molecular - construção do enxerto
Os requerentes produziram fragmentos scFv de MOC31 utilizando a metodologia normalizada de. "phage display" 16, determinaram a sua funcionalidade e demonstraram a afinidade bastante elevada com o seu antigénio PGE-2 . (quadro 1), consistente na sequência e nas propriedades com o scFv MOC31 estruturado independentemente. Surpreendentemente, a localização in vivo deste scFv dificilmente se . distinguia de. um scFv de controlo sem a especificidade de GPE-2 e o 25 scFv M0C31 praticamente não foi localizado num tumor-xenoenxertado (quadro 2). Os requerentes puseram por isso a hipótese desta proteína não ser suficientemente estável e produziram mais duas variantes estáveis, primeiro,, por enxerto dos anéis numa estrutura estável bem caracterizada e a seguir-, mudando mais alguns. resíduos no interior de um dos domínios variáveis. . Como estrutura receptora, os requerentes escolheram a versão humanizada de 4D5 19, ela própria um produto de um exercício de enxertia. Esta estrutura consiste essencialmente num domínio variável de cadeia pesada derivado das linhas germinativas IGHV 3-66 (IMGT), VH 3-18 (Vbase), Locus DP 3-66 (DP-86) e um domínio variável de cadeia leve K and derivado das linhas germinativas . IGKV 1-39 (IMGT), VK 1-1 (Vbase), locus DP 012.
Construiu-se um modelo de homologia de MOC31 e comparou-se por meio de raios X com o fragmento Fv humano 4D5 versão 8 (entrada Ifvc- da pdb). Identificaram-se os resíduos potenciais de contacto com o antigénio por meio de uma análise dos. complexos de anticorpo-antigénio da proteína na Base de Dados de Proteínas de Brookhaven (Fig.l A) . Com base nesta informação, mais do que pelas, definições de Kabat s, decidiu-se quais os . resíduos a retirar da estrutura de 4.D5 e quais os que se deviam retirar da sequência de MOC31. O enxerto resultante não seguiu assim estrita-mente a definição de RDC. dé acordo com Kabat et al. (1979) ou Chotia (ver Allazikani et al., 1997), mas inclui- dois resíduos (L64 e L66) que determinam a conformação do "anel externo" de VL (resíduos L66-L71). Verificou-se que a ponta deste anel contactava com o antigénio em alguns complexos, e não se poderia excluir uma influência deste anel na conformação de Ll da. RDC. O resíduo L66 é normalmente Gli nas cadeias leves K e assume um ângulo Φ positivo. Se este resíduo for substituível por um resíduo não Gli (Arg em 26 4D5), o anel externo assume, uma conformação diferente, inflectindo para fora do dominio. No VH, para além de Hl de RDC, estavam incluídos os resíduos H27 a H30, enquanto alguns resíduos na base d RDC2 estavam omissos (H62 e H63), apesar de fazerem parte de H2 de RDC de acordo com as definições de RDC (Kabat et al. (1979); Allazikani et al., 1997) , e vários resíduos no " anel externo" de VH, algumas vezes referido como uma RDC4, estavam incluídos (resíduos H69, . H71, Η75-Ή77), resultando na estrutura. 4D5MOC-A (Fig.lA). A análise das conformações das estruturas do domínio VH revelou que estas podem ser classificadas, de acordo-com a conformação da sua estrutura, em 4 subgrupos distintos. As diferenças das conformações são mais visíveis na estrutura 1 (FR1), particularmente nas posições H7-H10, embora se encontrem sequências correlacionadas ê diferenças dè conformação por todas:· as moléculas, envolvendo vários resíduos do núcleo 31. Estas alterações das conformações, são .causadas provavelmente pelos .' diferentes modelos de ligações ao. hidrogénio que os Glu H6 (tal. como em 4D5) ou Gin H6 (tal como ' em· ' M0C31) completamente' embebidos estabelecem no núcleo do domínio, è são ainda influenciados pela natureza do resíduo Η9. (Pro, Gli ou outros resíduos), 32. Saul e Poljak (1993) relataram alterações estruturais correlacionadas que afectam os resíduos H9, H.18, H82, H67 e H63 que restabelecem, os efeitos das alterações com conformação FR1 através do núcleo do domínio até à base da RDC2, permitindo assim potencialmente que afectem potencialmente a ligação do antigénío.
De acordo com esta classificação, M0C31 pertence a uma subclasse diferente da de 4D5. Dado que os requerentes não sabem em que medida estas classes de estruturas afectam a funcionalidade de um enxerto do anel, decidiram, ensaiar este aspecto experimentalmente. Embora na estrutura 4D5MOC- 27 i .A a estrutura do domínio VH estivesse alterada para um sub-tipo 4D5, 4DSM0C-B retém completamente o arranjo do núcleo de M0C31 assim como os resíduos H6 e H9 que são críticos para a conformação. Para se conseguir isto, mais oito resíduos adicionais da estrutura da sequência do fragmento Fv de cadeia simples, anti-GPE-2 (H6, H9, H18, H20, H38, H63, H82 e H109) tiveram de reter a sequência de M0C31.
Todas estas alterações estão localizadas na metade inferior do scFv (Fig.l), e com a excepção da substituição de Gli por Pro na posição H9, . estão incluídas no núcleo do domínio. Por isso não se espera que afectem a imunogenecidade da estrutura.
Para a introdução do sítio de restrição Aflli foi necessário modificar a sequência do terminal C do domínio VL em todas as estruturas de EIKRA a ELKRA,. o que não deveria afectar a estrutura do domínio'. .
Expressão and purificação das estruturas de scFv
Para o scFv 4D5 normalmente 1 - 2 mg de proteína pura podem ser purificados a partir de um litro, dê cultura, enquanto para o scFv M0C31 o rendimento era muito menor. Após duas etapas de purificação, o scFv MOC31 originou apenas 200 pg com uma pureza de - cerca; de 70 %. A co- expressão de skp 33 aumentou o rendimento para 600 pg, mas havia ainda uma degradação de 20 kDa presente no produto.. A variante de enxerto do scFv 4D5MOC-A podia ser purificada com um rendimento de 4 00 pg' e 4DSMOC-.B até a 1 mg com uma pureza superior a' 95 %. Ambos os fragmentos Fv de cadeia simples· puderam ser· concentrados até 1 mg/ml e foram analisados por GPEA-SDS em condições redutoras (Fig.2). A espectrometria de massa de ambas as. moléculas mostrou o peso molecular esperado de 29,855 Da para 0 scFv 4D5MOC-A e 29,897 Da para o scFv 4D5MOC-B.
Especificidade da ligação 28 A transferência da especificidade da ligação anti-GPE-2 do scFv M0.C31 para a estrutura do scFv 4D5 mostrou ser um sucesso para ambas as variantes., 4D5MOC-A e 4D5MOC-B, por meio da 'comparação da ligação das ' variantes de enxerto radiomarcadas com a GPE-2 que sobre-expressa as células SW2. Apenas o anticorpo monoclonal M0C3.1 podia inibir a ligação das variantes de enxerto, enquanto um anticorpo de controlo irrelevante não competiu (Fig.3A). Não se verificou uma reactividade cruzada das moléculas enxertadas quandoincubadas em c-erbB2 ou num receptor de FCE (domínio extracelular) (Fig,.3B).
Determinação de KD A ligação dé elevada· afinidade com: um .tempo residual longo no antigénio alvo especifico é olhada como uma das caracteristicas mais importantes dos anticorpos para atingir . os tumore.s. Para. assegurar que a afinidade da ligação foi conservada, na experiência de realização de enxertos, . determinaram-se as constantes de dissociação do fragmento Fv de cadeia simples marcado com rádio nas células num ensaio de radioimunoactividade.(RIA). As. variantes do enxerto mostraram comportamentos de ligação específicos e similares ao fragmento parental Fv.de cadeia simples anti-QPE-2 num intervalo nanomolar (quadro 1). A cinética da ligação dos fragmentos scFv não marcados à GPE-2 imobilizada foi também analisada por ressonância plasmónica de superfície (quadro 1) no instrumento BlAcore (Pharmacia). Para minimizar os efeitos de religação que podiam levar a uma subestimaria das taxas de dissociação, os requerentes utilizaram revestimento de baixa densidade e uma elevada velocidade de fluxo. 0 ScFv M0C31 mostrou uma ligação estável ao seu alvo com um semi-período de vida de cerca de 38 min consistente com uma determinação independente (semi-período de vida de 33 min) 30. Os 29 valores de k0ff . dos scFv 4DSM0C-A e 4DSM0C-B foram muito similares aos do scFv parental MOC31 (quadro 1), indicando que a transferência completa das propriedades de ligação do scFv M0C31 para a estrutura de 4D5 teve sucesso.
Filtração analítica em gel e ensaio de agregação térmica
Para muitas aplicações dos scFvs é crucial concentrar estas moléculas e incubá-las a temperaturas elevadas. 0 comportamento biofísico destas moléculas é muitas vezes o limite para a sua aplicação in vivo. Por isso os requerentes ensaiaram o comportamento de agregação dos scFvs- a concentrações elevadas e a temperaturas elevadas! Embora 4D5, 4DSM0C-A e 4D5MOC-8 possam ser concentrados até 1 mg/ml por ultrafiltração, o. scFv M0C31 precipitou a concentrações acima de 400 pg/ml. A esta concentração, cerca de 10 % da proteína total foi eluída sob a fôrma de agregados com elevado peso na filtração analítica em gel com o sistema de filtração em gel Smart (Pharmacia) numa coluna- Superdex 75. Quase' .90 % da proteína foram eluídos num volume de 1,27 ml como se esperava de espécies monoméricas. Contudo, no prazo de 30 min a 37°C, aproxima-damente 8 5 % da proteína precipitou. Os restantes 15 % de proteína solúvel foram eluídos sob a forma de espécies monoméricas (dados não mostrados). As duas variantes enxertadas 4DSMOC-A e 4D5MOC-B eluíram-se num volume de 1,20 ml, correspondendo a um peso molecular de 30 kDà, indicando que ambos os fragmentos Fv de cadeia simples existem como monómeros a uma concentração de 1 mg/ml. Embora 4D5MQC-A precipitasse mais lentamente do que MOC31, ã incubação durante a noite em SBF a 37°C durante 20 hrs e a subsequente filtração em gel não mostrou praticamente nenhuma proteína eluída (Fig. 4A) . Incubado nas mesmas condições, 4D5MOC-B ainda foi eluído como um pico simétrico num volume de 1,20 ml (Fig.4B), . indicando uma grande diferença na estabilidade (térmica) intrínseca das duas variantes. O 30 mais importante de tudo é que 4D5MOC-B mostrou ter as propriedades biofísicas requeridas para a sua aplicação in vivo.
Marcação com 99mtecnécio especifica do marcador de His
Os fragmentos Fv de cadeia simples foram marcados com 99mTc, utilizando um novo processo no qual o tri-hidrato de 99mTc-tricarbonilo está ligado de forma estável ao marcador de penta- o hexa-histidina do terminal C das proteínas recombinantes (Waibel et al, 1999). Todos os fragmentos scfv, excepto o scFv M0C31 original, podiam ser marcados a 37 °C e a uma concentração de proteína de 1. mg/ml, resultando em 30 - 40 % do 99ltlTc inicralmente incorporado, dando, uma actividade específica final de 300-400 mCi/ml. Para o scFv M0C31 da sonda de agregação, a temperatura de incubação tinha de se baixar para 30 °C e a concentração máxima possível de proteína foi de 400 pig/ml, resultando num menor rendimento.de incorporação (25 % do Tc total, 250 mCi/ml).
Determinação da imunoactividade após a incubação em soro a 37°C
Os requerentes determinaram a fracção de moléculas- de scFv ainda activa depois da marcação com 99rtlT.ç (Fig. 4C) 29 e depois da incubação dos fragmentos marcados em soro humano durante 20 h a 37°C {Fig. 4D) . Para o scFv MOC31, .encontrou-se 67 % ± 5,4 da proteína ainda activa quando a reacção de marcação foi, realizada a 30 °C, Os outros fragmentos mostraram-se 47,25 % ± 4,9 activos para scFv 4D5MOC-A, 74,5% ± 8,3 para o scFv 4DSM0C-B e 87,3 % ± 6,4 para o scFv 4D5, todos marcados a 37 °C. Para ensaiar a estabilidade em soro,, os fragmentos scFv (17 pg/ml) foram incubados em soro .humano a 37°C durante 20 horas e determinou-se a imunoactividade remanescente. Verificou-se que o ScFv M0C31 estava completamente inactivo depois· de. 31 uma incubação durante a noite, e por isso fizeram-se medições mais cedo. Já passada 1 h, a- actividade caiu para 6,32 %. ± 0,17 (9,4 % da imunoaçtividade inicial). Passadas 4 h, apenas 1,95 % ± 0,175 (2,9 %) permaneceu activo. Pelo contrário, a actividade de 4DSMOC-A caiu de 47,25 % ± 4,9 para 8,1% ± 4,7 (17,1% do valor inicial) durante 20 h, a de scFv 4d5MOC-B de 74,5 % + 8,3 para 36 % ± 1,6 (48,3 %) e a do scFv 4D5 de 87,3 %.± 6,4 para 40,45 % ± 8,75 (46,3 %), confirmando as estabilidades térmicas encontradas no ensaio de filtração.
Caracterização ±n vivo - purificação e biodistribuição
Realizaram-se então estudos de biodistribuição para os scFv marcados com 99raTc os scFvs MOC31, 405, 4DSM0C-A e 4DSM0C-B. Para o scFv MOC31 os requerentes foram incapazes de obter uma relação tumor/sangue superior a 0,92 depois de 1 h, 4 h e 24 h (n=3, em cada momento) . Passadas 24 h a dose total no tumor foi de 1*24 % ID/g tecido,· mas' também 1,34' %. ID/g no sangue, que era muito alta em comparação com os valores 3-5 vezes inferiores encontrados rio sangue passadas 24 h com esse processo de marcação (quadro 2). Pelo contrário, a biodistribuição . do scFv 4D5 marcado com 99mTc originou uma relação de tumor/sangue de, 8,3 passadas .24 h com uma dose total de 1,5 % ID/g em células SK-OV-3 (Waibel et al., 1999) , sendo relatados, resultados semelhantes para o scFv anti-c-erbB2 C6.5 34. Para o 4DSMOC-A os requerentes encontraram, passadas 24 h, apenas um fraco enriquecimento com uma dose total de. 0,84 % ID/g e uma relação tumor/sangue. de 1,95 (quadro 3), enquanto a. aplicação in vivo do scFv 4DSMOC-B em ratos portadores de tumor das SW2 resultou numa relação tumor/sangue de 5,25 passadas 24 h com uma dose total de 1,47 % ID/g no tumor. A dose máxima no tumor foi medida passadas 4 h com 1,82 % ID/g, que depois diminuiu muito lentamente, reflectindo uma ligação rápida e estável do scFv 4D5MOC-B com' o antigénio 32 (quadro 3). Para o scFvde controlo anti-fluoresceina não específico FITC-E2 não se encontrou, nenhum enriquecimento no sítio do tumor (quadro 4) .
Os estudos de. purificação revelaram o scFv 4DSM0C-B como uma molécula de desaparecimento muito rápido com .um tijOt = 6 min e um t^íi = 228 min. A comparação com o scFv 4D5 com, um ti* (a) medido = 7,5 min mostra um comportamento de purificação excelente, o que é um pré-requisito para se conseguir taxas de tumor/sangue que não se perdem pelo enxerto do .anel.
Discussão Já foi relatado que o Acm M0C31 marcado com índio-DTPA localizado no tumor primário e nas metástases num ensaio., clínico com pacientes com cancro do pulmão' de células pequenas,, mas não foi superior a outros processos dè diagnóstico por exemplo como ; a recolha dè imagens por . tomografia computorizada Uma fusão química do Açm MQC31 com a exotoxiná-A (ETA) levou a um atraso do crescimento para tumores grandes (120 mm3) em ratos pelados, e foi proposto que a redução da dimensão do anticorpo que vai atingir o alvo aumenta a eficiência 8.' Fica ainda por ser analisado se uma melhor penetração no tecido e tuna taxa de çlearance mais rápida do fragmento scFv anti-GPE2 muito mais pequeno levaria a melhores resultados ou se a sua capacidade acrescida para aceder a- tecidos epiteliais normais que expressam GPE-2, não acessível aos Acms devido ao seu peso molecular de 150 kDa 1, limitaria o poder de resolução do processo.' O scFv melhorado pode servir.como um bloco de construção para outros formatos de moléculas recombinantes tal como os scFv dimerizados e multimerizados Fab ou (Fab)2 11 para optimizar os efeitos da dimensão e de 33 avidez. Podem também fundir-se com outros domínios efectores na estruturação de terapêuticas à base de fragmentos de anticorpos. Uma fusão de scFv M0C31-ETA ln vitro em células SW2 foi dez mil vezes mais tóxica do que a fusão do Acm M0C31 com ETA (Zimmermann, resultados não publicados). 0 scFv M0C31 original não modificado foi também, utilizado para a construção de um diacorpo com especificidade de CD3 para atingir novamente as células T. Neste formão o scFv M0C31 pareceu estar de alguma forma estabilizado e foi referenciado um semi-período de vida de 12 h, mas o rendimento foi tão fraco como para o scFv M0C31 isolado 37 e não foi. relatada até agora nenhuma aplicação in vivo.
Durante a criação dos modelos os requerentes notaram que o domínio VH domínio da·', matriz da estrutura 4D5 pertence a uma subclasse, estrutural diferente- da do anel dador M0C31. Dado que há vários exemplos na literatura ém que falha um ..simples enxerto de anel e. então as estruturas quiméricas têm de. ser recuperadas por meio de múltiplas mutações adicionais repostas 35, os requerentes prepararam directamente uma segunda estrutura·' quimérica na qual está retida a subclasse estrutural e a envolvente do núcleo de M0G31. Isto envolveu a alteração de.mais oito resíduos, a maior parte deles no núcleo, na sequência de murino,. correspondendo essencialmente a- um ressurgimento do domínio' VH do M0C31. Estas mutações adicionais não tiveram efeito na afinidade do antigénio, mas tiveram um efeito benéfico na. estabilidade da.· estrutura quimérica. As mutações adicionais em 4DSM0C-B originaram uma molécula que . se comportou de' uma forma muito semelhante ao scFv 4D5 que tem um comportamento muito bom. Isto é notável, dado que 4D5MOC-B é removida primeiro numa sequência de 4D5 é depois em 4D5MOC-A e sugere que pode ser crítico para manter uma classe de estruturas, tal como definido pelos resíduos H6, 34 Η7 e H9 por toda a parte e não misturado na estrutura tal como nos resíduos que estão inter-relacionados. Além disso, embora 4DSM0C-B esteja mais próximo de M0C31 na sequência, .esta última molécula é a menos estável de todas.
Foi re.centemente demonstrado que o domínio VL de 4D5 é excepcionalmente estável e a estabilidade termodinâmica do scFv 4D5 está' limitada pela estabilidade intrínseca do ' seu domínio VH domínio- 20. O enxerto da superfície de interacção do antigénío de MOC31 neste fragmento resultou numa estrutura quimérica de estabilidade intermédia. Isto podia ser devido a interacções desfavoráveis dentro, dos anéis enxertados .ou entre resíduos do núcleo enxertados e resíduos do núcleo da estrutura não compatíveis. Contudo, há poucos contactós entre esses , resíduos da estrutura no núcleo inferior que difere entre .4D5 e M0C31 e os resíduos do núcleo doa anéis enxertados, sendo os dois separados.por uma.camada de resíduos conservados (Figura 1). 0 principal contacto directO entre.os resíduos alterados nó enxerto do. anel e o grupo de resíduos adicionalmente alterados no 4D5MOC-B, é entre Met H48 (Vai emn'405) e Fe H63. (Vai em 4D5 e em 4DSM0C-A)'. Se tiver havido um confronto estérico no' enxerto original, é de esperar que a situação esteja agravada pela substituição do resíduo de.. contacto com um resíduo maior. É por isso mais provável que a influência da desestabilização nos' anéis- tenha sido compensada , por uma estabilização geral do núcleo do domínio. A.estabilização conseguida pelas mutações do núcleo em 4D5MOC-B foi de crucial importância para o enriquecimento efeçtivo no sítio do·· tumor. A estrutura mais ..estável, 4D5MOC-B, enriquecida até 1,47 % ID/g de tecido, com uma relação .tumor/sangue de 5,25. 0 M0C31 da sonda de agregação foi eliminado da circulação muito mais lentamente do que os anticorpos de controlo e· as estruturas quiméricas mais estáveis. Resta saber em 'que medida' um outro aumento da estabilidade pode | 35 ainda aumentar a dose total de enriquecimento e as relações tumor/sangue.. .
Os requerentes demonstram neste estudo que a estratégia de engenharia genética para a dobragem e a estabilidade constituem uma ferramenta genérica, para o aumento do interesse de anticorpo-fragmentos. Os requerentes utilizaram como exemplo a conversão ' de um scFv anti-GPE-2 instável e que. se expressa muito, pouco em murinos, que falhou in vivo, num fragmento de anticorpo humanizado e muito estável ·. com uma boa expressão- e com -a . mesma especificidade.. Os requerentes também referem pela primeira vez o direccionamento in vivo de xeno-enxertos que apresentam GPE-2 em GDI de. ratos pelados. 0 scFv 4DSM0C-B tratado por engenharia genética ultrapassa as limitações do scFv M0C31 e será um importante- bloco de construção pa.ra o. desenvolvimento de novos reagentes à base de fragmentos de anticorpos para fins de visualização e terapêuticos, dirigidos contra os carcinomas que expressam GPE-2. . Os requerentes acreditam que para . além da utilização de grandes reportórios de bibliotecas a partir dos quais se. podem seleccionar novos fragmentos de anticorpos com propriedades excepcionais, a engenharia genética para a dobragem e a estabilidade das moléculas recombinantes é de extraordinária importância para a sua utilização futura em larga escala em todas as aplicações, e especialmente na medicina dos tumores. Pode-se enfatizar novamente que as propriedades biofísicas influenciam fortemente a capacidade de um fragmento scFv para atingir um sítio de tumor, mesmo quando as regiões de determinação da complementaridade e as constantes de ligação são idênticas. Isto- indica que as propriedades biofísicas de um fragmento de anticorpo têm uma importância de longe muito maior para o desempenho biológico que tenha sido considerado de uma forma geral até hoj e. 36
Quadro 1: Comparação das afinidades e constantes de taxas cinéticas conforme determinado por radioimunoensaio (RIE) em células SW2 e por ressonância plasmónica da superfície (BlAcore).
Anticorpo RIE em células Kd* (nM) Ressonância plasmónica da superfície (RPS) Kd* (nM) Κοη(Τθ5Μ'·ν x) Koff (10'V1) scFv MOC31 10,8±2,6 3,0 0,99±0,01 O,3+0,01 4D5MOC-A 3,6+0,5 3,5 1,29+0,001 0,45+0,001 4D5MOC-B 3,7+0,5 3,9 1,84+0,02 0,717+0,001
As medições realizaram-se a 4 °C (°) e a 20°C (A)
Quadro 2: Biodistribuição de scFvs marcados com 99raTc: em ratos pelados Balb/C xenoenxertados com tumores deSW2
ScFv MOC31 FITC-E2 Órgãos 1 h (n=3) 4 h (n=3) 24 h (n=3) 24 h (n=3) % Dl/g % Dl/g % Dl/g % Dl/g Sangue 8,46 ±0,87 5,55 ±1,98 1,34 ±0,15 0,5 ±0,13 Coração 5,1 ± 0,34 5,32 ±1,36 1,39 ±0,25 0,47 ±0,23 Pulmão 7,37±0,95 7,14+1,61 2,09 ±0,5 0,58 ±0,16 Baço 14,06+1,91 17,84+2,77 7,6 ±0,56 1,2 ± 0,09 Rim 253,69+10,64 263,28±43, 117,4 ±12,2 224,09 40,4 Estômago 4,71+1,04 4,08 +1,04 1,28 ±0,21 0,25 ±0,14 Intestino 5,85+0,34 5,4 ±1,97 1,56 ±0, 07 0,34 ±0,04 Fígado 35,03+0,86 44,8 ±9,54 20,38 ±3,44 4,44 ±0,65 Músculos 1,64±0,23 1,57 ±036 0,75 ±0,82 0,31 ±0,15 Ossos 5,97+0,41 6,01+1,71 2,04 +0,68 0,57 ±03 Tumor 2,46+0,88 3,97 ±1,07 1,24+0,74 0,4±0,2 Relação tumor/sangue 0,29 0, 71 0,92 1,35 a biodistribuição dos scFv M0C31 e do FITC-E2 marcados com SMTc foi estudada em ratos pelados fêmeas Balb/C com oito semanas de idade que eram portadores de tumores de SW2 com 17 dias depois da injecção dos anticorpos radiomarcados nos animais. Os números representam a ΐ de dose injectada por grama de tecido (%Dl/g) . Os resultados foram expressos como a média. 37
Quadro 3: Biodistribuição de scFvs marcados com 99raTecnécio: em ratos pelados GDI rato xeno-enxertados com tumores de SW2 estavam incluídos 4D5MOC-B 4D5MOC-A FITC-E2 Órgãos lh (n=3) 4h (n=3) 24h (n=3) 24h (n=3) 24h (n-3) % Dl/g % Dl/g % Dl/g % Dl/g % Dl/g Sangue 2, 92*0,47 1,31±0,23 0,28*0,06 1,43*0,20 0,17*0,02 Coração 0,97*0,21 0, 57±0, 11 0,28*0,09 0,63*0,18 0,16*0,04 Pulmão 3,2*1,29 1,2±0,08 1,14*0,60 1,77*0,95 0,24*0,05 Baço 0,61*0,OS 0,67+0,19 0,7*0,13 1,57*0,44 0,22*0,04 Rim 120,79±7,19 140,56*3,94 300,17*85,2 90, 53*52,4 383,91*57,3 Estômago 0,48+0,09 0,49*0,1 0,24*0,21 0,26*0,07 0,2S±0,13 Intestino 1,33±0,64 0,71*0, 06 0,30*0,07 0,48*0,15 0,21*0,07 Fígado 6,49±1,53 6,86*0,32 2,38*0,52 4,37+1,87 1,33+0,33 Músculo 0, 27±0,01 0,17*0, 03 0,1*0,02 0,21*0,09 0,07+0,01 Ossos 0,2 9*0,21 0,21*0, 16 0,06*0,05 0,25*0,31 0,06+0,05 Tumor 1,74*0,5 1,82*0,22 1,47*0,32 0,84+0,38 0,23*0,04 Relação tumor/sangue 0,59 1,33 5,25 1, 95 1,35 A biodistribuição dos SCFir 4D5MOC-A, 4D5MOC-B e FITC-E2 marcados com ’"*Tc foi estudada em ratos pelados fêmeas CDl com oito semanas de idade que eram portadores de tumores de SW2 com 137 dias depois da injecçâo dos anticorpos radiomarcados nos animais. Os números representam a % de dose injectada por grama de tecido . Os resultados foram expressos como a média-
LITERATURA 1. De Leij, L. , Helrich, W. , Stein, R. & Mattes, MJ. SCLC-cluster-2 antibodies detect the pancarcinoma/epithelial glycoprotein GPE-2. Int J Câncer Suppl 8, 60-3 (1994). 2. Riethmuller, G. et al. Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. German Câncer Aid 17-1 A Study Group [ver comentários]. Lancet 343, 1177-83 (1994) . 3. Elias, D.J. et al. Phase I clinicai comparative study of monoclonal antibody KS1/4 and KSl/4-methotrexate immunconjugate in patients wit non-small-cell lung carcinoma. Câncer Res 50, 4154-9 (1990). 4. Kosterink, J.G. et al. Pharmacokinetics and scintigraphy of indium-lll-DTPA-MOC-31 in small-cell lung 38 carcinoma. J Nucl Med 36, 2356-62 (1995). 5. Litvinov, S.V., Velders, M.P., Bakker, H.A., Fleuren, G.J. & Warnaar, S. O. Ep-CAM: a human epithelial antigen is a homophilic cell-cell adhesion molecule. J Cell Biol 125, 437-46 (1994). 6. Cirulli, V. et al. KSA antigen Ep-CAM mediates cell-cell adhesion of pancreatic epithelial cells: morphoregulatory roles in pancreatic islet development. J Cell Biol 140, 1519-34 (1998). 7. Basak, S- et al. Colorectal carcinoma invasion inhibition by C017-1A/GA733 antigen and its murine homologue [ver comentários]. J Nati Câncer Inst 90, 691-7 (1998). 8. Zimmermann, S. et al. A novel immunotoxin recognising the epithelial glycoproteína-2 has potent antitumoural activity on chemotherapy-resistant lung câncer. Câncer Immunol Immunother 44, 1-9 (1997). 9. Huston, J.S. et al. Medicai applications of single-chain antibodies. Int Rev Immunol 10, 195-217 (1993). 10. Cárter, P. & Merchant, A.M. Engineering antibodies for imaging and therapy. Curr Opin Biotechnol 8, 449-54 (1997). 11. Pluckthun, A. & Pack, P. New proteína engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnology 3, 83-105 (1997). 12. Bird, R.E. et al. Single-chain antigen-binding proteínas [a errata publicada aparece em Science 1989 Abr 28; 244 (4903:09]. Science 242, 423-6 (1988). 13. Huston, J.S. et al. Proteína engineering of antibody binding sítes: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coll. Proc Nati Acad Sei USA 85, 5879-83 (1988) . 14. Skerra, A. & Pluckthun, A. Assembly of a functional 39 immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coll. Science 240, 1038-41 (1988). 15. Vaughan, T.J. et al. Huxnan antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage dísplay library [ver comentários] . Nat Biotechnol 14, 309-14 (1996). 16. Krebber, A. et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods 201, 35-55 (1997). 17. Verhaar, M.J. et al. A single chain Fv derived from a filamentous phage library has distinct tumor targeting advantages over one derived from a hybridoma. Int J Câncer 61, 497-501 (1995) . 18. Jung, S. & Pluckthun, A. Improving in vivo folding and stability of a single-chain Fv antibody fragment by loop grafting. Protein Eng 10, 959-66 (1997) . 19. Cárter, P. et al. Humanization of an anti-pl 85HER2 antibody for human câncer therapy. Proc Nati Acad Sd USA 89, 4285-9 (1992). 20. Worn, A. & Pluckthun, A. An intrinsically stable antibody scFv fragment can tolerate the loss of both disulfide bonds and fold correctly. FEBS Lett 427, 357-61 (1998). 21. Knappik, A. & Pluckthun, A. Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding. Proteína Eng 8, 81-9 (1995). 22. Pokkuluri, P.R. et al. Preparation, characterization and crystallization of an antibody Fab fragment that recognizes RNA. Crystal structures of native Fab and three Fab-mononucleotide complexes. Journal of Molecular Biology 243, 283-97 (1994). 23. Tulip, W.R., Varghese, J.N., Webster, R.G., Laver, W.G. & Colman, P.M. Crystal structures of two mutant 40 neuraminidase-antibody complexes with substitutions in the interface. Journal Biology 227, 149-59 (1992). amino of acid Molecular 24. Tulip, W.R., Varghese, J.N., Laver, W.G., Webster, R.G. & Colman, P.M. Refined crystal structure of the influenza virus N9 neuraminidase-NC41 Fab complex. Journal of Molecular Biology 227, 122-48 (1992). 25. Shoham, M. Crystal structure of an anticholera toxin peptide complex at 2.3 A. Journal of Molecular Biology 232, 1169-75 (1993). 26. Eigenbrot, C., Randal, M., Presta, L., Cárter, P. & Kossiakoff, A.A. X-ray structures of the antigen-binding domains from three variants of humanized anti-pl85HER2 antibody 4D5 and comparison with molecular modeling. Journal of Molecular Biology 229, 969-95 (1993). 27. Prodromou, C. & Pearl, L.H. Recursive PCR: a novel technique for total gene synthesis. Protein Eng 5, 827-9 (1992). 28. Tang, Y., Jiang, N., Parakh, C. & Hilvert, D. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology. J Biol Chem 271, 15682-6 (1996). 29. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J. & Bunn, P.A., Jr. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabelled monoclonal antibodies by linearextrapolation to binding at infinite antigen excess. J Immunol Methods 72, 77-89 (1984). 30. Roovers, R.C. et al. High-affinity recombinant phage antibodies to the pan-carcinoma marker epithelial glyco-proteína-2 for tumour targeting. Br J Câncer 78, 1407-16 (1998) . 31. Saul, F.A. & Poljak, R.J. Structural patterns at residue positions 9, 18, 67 and 82 in the VH framework 41 regions of human and murine immunoglobulins. J Mol Biol 230, 15-20 (1993). 32. Langedijk, A.C. et al. The nature of antíbody heavy chain residue H6 strongly influences the stability of a VH 50domain lacking the disulfide bridge. J Mol Biol 283, 95-110(1998). 33. Bothmann, H. & Pluckthun, A. Selection for a periplasmic factor improving phage display and functional periplasmic expression. 34. Adams , G.P. et al. Increased affinity leads to improved selective tumor delivery of single-chain Fv antibodies . Câncer Res 58, 485-90 (1998). 35. Proba, K. , Worn, A. , Honegger, A. & Pluckthun, A.
Antibody scFv fragments without disulfide bonds made by molecular evolution. J Mol Biol 275, 245-53 (1998). 36. Baca, M., Presta, L.G., 0'Connor, S.J. & Wells, J.A. Antibody humanization using monovalent phage display. J Biol Chem 272, 10678-84 (1997) . 37. Helfrich, W. et al. Construction and characterization of a bispecific diabody for retargeting T cells to human carcinomas. Int J Câncer 76, 232-9 (1998). 38. Allazikani,B., Lesk,A.M. & Chothia,C. (1997). STANDARD CONFORMATIONS FOR THE CANONICAL STRUCTURES OF IMMUNOGLOBULINS. J. Mol. Biol. 273, 927 - 948. 39. Alberto, R., Schibli, R., Egli, A.., Schubiger, P. A., Abram, U. & Kaden T.A. (1998). A novel organometallic aqua complex of technetium for labeling of biomolecules: Synthesís of [99mTc(OH2)3(C03)]+ from [99mTc04]- in aq-uaeous solution and lst reaction with a bifunctional ligand. J. Am. Chem. Soc. 120, 7987-7988. 40. Better, M. , Chang, P., Robinson, R. & Horwítz, A.H. (1988). E. coli secretion of an active chimeric antibody fragment. Science 240, 1041-1043. 42 41. Blake, M.S., Johnston, K.H., Russel-Jones, G.J. & Gotschlich, E.C. (1984). A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Anal. Biochem. 136, 175-179. 42. Brinkmann, U., Reiter, Y.r Jung, S.r Lee, B. & Pastan, I. (1993). A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv fragment. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90, 7538-7542. 43. COLMAN, P.M., LAVER, W.G., VARGHESE, J.N., BAKER, A.T., TULLOCH, P.A., AIR, G.M. & WEBSTER, R.G. (1987). THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF A COMPLEX OF ANTIBODY WITH INFLUENZA VIRUS NEURAMINIDASE, NATURE 326, 358. 44. Glockshuber, R., Malia, M., Pfitzinger, I. & Pliickthun, A. (1992) . A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments. Biochemistry 29, 1362-1366. 45. Hiatt, A. (1990). Antibodies produced in planta. Nature 344, 469-470. 46. Hiatt, A. & Ma, J. K. (1993) . Characterization and applications of antibodies produced in'plants. Int. Rev. Immunol. 10, 139-152. 47. Hochuli, E., Bannwarth, W., Dõbeli, H. , Gentz, R. & Stuber, D. (1988). Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Bio/Technology 6, 1321-1325. 48. Ηορρ, T.P., Prickett, K.S., Price, V.L., Libby, R.T., March, C.J., Cerretti, D.P., Urdal, D.L. & Conlon, PJ. (1988). A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Bio/Technology 6, 1204-1210. 49. Horwitz, A. H., Chang, C. P. , Better, M. , Hellstrom, K. E. & Robinson, R. R. (1988). Secretion of functional antibody and Fab fragment from yeast cells. Proc. Natl. 43
Acad. Sei. U.S.A. 85, 8678-8682. 50. Kabat, E.A., Wu, T.T., & Bílofsky, Η. (1979) . Sequences of Immunoglobulin Chains, National Institutes of Health..NIH Publication 80-2008. 51. Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesmann, K.S. &
Foeller, C. (1991). Sequences of proteínas of immunological interest. U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of
Health. NIH Publication 91-3242. 52. Knappik, A. & Pliickthun, A. (1994). An improved affinity tag based on the FLAG peptide for detection and purification of recombinant antibody fragments. BioTechniques 17, 754-761. 53. Knappik, A. & Pliickthun, A. (1995). Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding.
Proteína Eng. 8, 81-89. 54. Lindner, P., Guth, B., Wiilfing, C., Krebber, C.,
Steipe, B., Miiller, F. & Pliickthun, A. (1992). Purification of native proteínas from the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli using IMAC and histidine tails: a comparison of proteína and protocols. Methods: A Companion to Methods Enzymol. 4, 41-56. 55. Nyyssonen, E., Penttila, M. , Harkki, A., Saloheimo, A., Knowles, J. K. & Keranen, S. (1993) . Efficient production of antibody fragments by the filamentous fungus Trichoderma' reesei. Bio/Technology 11, 591-595. 56. Pack, P. & Pliickthun, A. (1992). Miniantibodies: use of amphipathic helíces to produce functional, flexibly línked dimeric Fv fragments with high avídity in Escherichia coli. Biochemistry 31, 1579-1584. 57. Pack, P. , Kujau, M., Schroeckh, V., Kniipfer, U. , Wenderoth, R. , Riesenberg D. & Pliickthun, A. (1993). Improved bivalent miniantibodies, with identical avidity as whole antibodies, produced by high cell density 44 fermentation of in Escherichia coli. Bio/Technology 11, 1271-1277. 58. Pack, P. (1994). Mini-Antikõrper: Bivalente, tetravalente and bispezifische Immunglobuline aus E. coli. Tese de doutoramento, 59. Ludwig-Maximilians-Universitãt Munchen. 60. Potter, K. N., Li, Y. & Capra, J. D. (1993). Antibody production in the baculovirus expression system. Int. Rev. Immunol. 10, 103-112. 61. Ridder, R., Schmitz, R., Legay, F. & Gram, H. (1995). Generation of rabbit monoclonal antibody fragments from a combinatorial phage display library and their production in the yeast Pichia pastoris. Bio/Technology 13, 255-260. 62. Rosenberg, S.A. & Lotze, M.T. (1986). Câncer immunotherapy using interleukin-2 and interleukin-2 activated lymphocytes. Ann. Rev. Immunol. 4, 681-709. 63. SHOHAM, M. , PROCTOR, P., HUGHES, D. & BALDWIN, E.T. (1991). CRYSTAL PARAMETERS AND MOLECULAR REPLACEMENTOFAN ANTICHOLERA TOXIN PEPTIDE COMPLEX, PROTEÍNAS.STRUCT.FUNCT. 11, 218. 64. Skerra, A. & Pluckthun (1988). Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 240, 1038-1041. 65. Trill, J. J., Shatzman, A. R. & Ganguly, S. (1995).. Production of monoclonal àntibodies in COS and CHO cells. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 553-560. 66. TULIP, W.R., VARGHESE, J.N., WEBSTER, R.G., AIR, G.M., LAVER, W.G. & COLMAN, P.M. (1989). CRYSTAL STRUCTURES OF NEURAMINIDASE-ANTIBODY COMPLEXES, COLD SPRING HARBOR SYMP.QUANT.BIOL. 54, Pt. 1, 257-63. 67. Ullrich, H.D., Patten, P.A., Yang, P.L., Romesberg, F.E. & Schultz, P.G. (1995). Expression studies of catalytic àntibodies. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 11907-11911. 45 68. Vitetta, E.S., Thorpe, P.E. & Uhr, J. (1993). Immunotoxins: magic bullets or misguided missiles. Immunol. Today 14, 253-259. 69. Waibel, R. , Alberto, R., Willuda, J., Finnem, R., Schibli, R., Stichelberger, A., Egli, A., Abram, U-, Mach, J.P., Pluckthun, A. & Schubiger, P.A. (1999) Nature Biotechnol. 17, 897-901.
Ward, V. K-, Kreissig, S. B., Hammock, B. D. & Choudary, P. V. (1995). Generation of an expression library in the baculovirus expression vector system. J. Virol. Methods 53, 263-272. 70. Whitelam, G. C., Cockbum, W. & Owen, M. R. (1994). Antibody production in transgenic plants. Biochem. Soc. Trans. 22, 940-944. 71. Willuda, J-, Honegger, A., Waibel, R., Schubiger, P.A., Stahel, R., Zangemeister-Wittke, U. & Pluckthun, A. (1999) Câncer Res. 59, 5758-5767. 72. Wu, X. C., Ng, S. C., Near, R. I. & Wong, S. L. (1993) . Efficient production of a functional single-chain antidigoxin antibody via an engineered Bacillus subtilis expression-secretion System. Bio/Technology 11, 71-76.
NACCESS S. Hubbard and J. Thornton, 1992, http://sjh.bi.umist.ac.uk/nacce ss.html Algorithm: Lee &
Richards (1971, J. Mol. Biol., 55, 379-400)
Vbase:http://wvvw.mrc-cpe.cam.ac.uk/ímt-doc/ lan Tomlinson, imt@ mrc-imb.cam.ac.uk, fax +44 1223 402140 MRC Centre for Protein Engineering, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, U.K. 46 IMGT: http://www.ebi.ac.uk/iiagt/
Esta apresentação pode ser copiada e distribuída livremente, sem permissão prévia, desde que seja referido o IMGT, e citado como: "IMGT, the International ImMunoGeneTics database http://imgt.cnusc.fr:8104 (Coordenadora: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, França [email protected]). Para referência: Nucleic Acids Research, 25, 206-211 (1997)."
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ-ID No. 1: Fragmento humano soFv anti-c-ErbB2 4DS:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWIQQKPGKAPKLLIISASFLrSGVHSRFSGSRSGT DFTLTXSSLQPEDFATIXCQQHXTTPPTFGQGTKVEIKRTPSHNSHQVHSAGGPTANSGTSGSEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTIJHWVRQAPGKGLEWVARIXPTNGITRIADSVKGRFTISADTS KNTAILQMNSLRAEDTAVIICSRWGGDGFIAMDXWGQGTLVTVSS SEQ-ID No. 2: Fragmento scFv anti-GPE-2 obtido de MOC31 de hibridoma de murino
D XVMTQSAFSNPVTLGTSASISCRSTKSLLHSNGITILIWILQKPGQSPQLLIIQMSNLASGVHDRFSS S GSGTDFTLRISRVEAEDVGVIICAQNLEIPRTFGGGTKLEIKRTPSHNSHQVHSAGGPTANSGTSGSQV QLQQSGPELKKPGE TVKISCKASGIXFTNIGMN WVKQAPGRGLKWMGWINTITG ESTIADDFKGRFA FSLET SASAAILQINNIjKNEDTATIFCARFAIKGDIWGQGTTLTVS S
SEQ-ID No. 3: Fragmento scFv anti-GPE-2 4D5M0C-B
DIQMXQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITILIWXQQKPGICAPKIiLUQMSNIiASGVHSRFSSS GSGTDFTLTIS SLQPEDFATIICAQNLEIPRTFGQGTKVELKRTP SHNSHQVH SAGGPTANSGT SGSEV QLVQS GPGLVQPGGSVRIS CAASGITFTNIGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTITGE ST IADS FKGRFT FSLDTSASAAILQINSLRAEDTAVIICARFAIKGDIWGQGTLLTVS S
Lisboa, 30 de Setembro de 2008 47

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Imunoglobulina ou fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio caracterizados pelo facto de serem, um fragmento scFv anti-GPE-2 4D5MOCB (SEQ-ID No. 3).
  2. 2. Sequência de ácidos nucleicos ou sequências de ácidos nucleicos caracterizadas pelo facto de codificarem a imunoglobulina ou fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1.
  3. 3. Processo para a produção da imunoglobulina ou do fragmento de imunoglobulina- de ligação ao antigénio estabilizados, de acordo com a . reivindicação 1, caracte-rizado pelo facto de, compreender a expressão de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 2 que codificam a referida imunoglobulina: ou o referido fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio num sistema de expressão apropriado.
  4. 4. Composição farmacêutica caracterizada pelo., facto de conter a imunoglobulina ou o fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação '1 e, eventualmente, um veiculo e/ou diluente aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.
  5. 5. Utilização do' fragmento scFv anti-GPE-2 4DSM0C-B de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se destinar à preparação de umã composição farmacêutica para o tratamento de carcinomas em seres humanos.
  6. 6. Fragmento scFv anti-GPE-2 4D5MOC-B de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se destinar ao tratamento de carcinomas em seres humanos. 1
  7. 7. Composição de diagnóstico caracterizada pelo facto de conter o fragmento de imunoglobulina de ligação ao anti-génio de acordo com a reivindicação 1.
  8. 8. Kit· de diagnóstico caracterizado pelo facto de conter o fragmento de imunoglobulina de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 30 de Setembro de 2008·
PT00926853T 1999-04-09 2000-04-10 Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado PT1171468E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99107030 1999-04-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1171468E true PT1171468E (pt) 2008-10-08

Family

ID=8237927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT00926853T PT1171468E (pt) 1999-04-09 2000-04-10 Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado

Country Status (10)

Country Link
US (4) US7033798B2 (pt)
EP (2) EP1171468B1 (pt)
JP (1) JP4540856B2 (pt)
AT (1) ATE399796T1 (pt)
CA (1) CA2369622C (pt)
DE (1) DE60039354D1 (pt)
DK (1) DK1171468T3 (pt)
ES (1) ES2308981T3 (pt)
PT (1) PT1171468E (pt)
WO (1) WO2000061635A2 (pt)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1171468E (pt) * 1999-04-09 2008-10-08 Univ Zuerich Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado
EP1551453A4 (en) 2002-06-17 2007-04-25 Us Gov Health & Human Serv SPECIFICITY GRAFTING OF A MICE RESPONSE TO A HUMAN FRAME
CN100417414C (zh) * 2003-04-30 2008-09-10 苏黎世大学 免疫毒素在制备治疗头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌药物中的应用
GB0319601D0 (en) * 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
EP2377936A3 (en) 2005-03-25 2012-06-13 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
ATE509033T1 (de) * 2006-03-20 2011-05-15 Univ California Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting
EA200802061A1 (ru) 2006-03-28 2009-04-28 Байоджен Айдек Эмэй Инк. Антитело или его фрагмент, специфично связывающееся с рецептором 1 инсулиноподобного фактора роста (igf-r1) (варианты), композиция на его основе, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область антитела (варианты), содержащие полинуклеотид композиция (варианты) и вектор, содержащая вектор клетка-хозяин (варианты), способ продуцирования антитела или его фрагмента (варианты) и способ лечения гиперпролиферативного заболевания у животного организма
JP2010538012A (ja) * 2007-08-28 2010-12-09 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド Ｉｇｆ−１ｒの複数のエピトープに結合する組成物
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
EP2740490A1 (en) * 2007-10-03 2014-06-11 Cornell University Treatment of proliferative disorders using antibodies to PSMA
US8728479B2 (en) 2009-03-31 2014-05-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antigen-binding proteins comprising recombinant protein scaffolds
WO2015048901A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Viventia Bio Inc. Anti-epcam antibodies and methods of use
CA2996848C (en) 2014-09-04 2021-01-05 Stemcell Technologies Inc. Soluble antibody complexes for t cell or nk cell activation and expansion
EP3268041A4 (en) 2015-03-12 2018-09-05 Viventia Bio Inc. Dosing strategies for targeting epcam positive bladder cancer
CN108513547A (zh) 2015-03-12 2018-09-07 维文蒂亚生物公司 用于epcam阳性膀胱癌的治疗方法
JP6932709B2 (ja) * 2015-11-04 2021-09-08 ジェイ． プライスマン，ソール Ｈｅｒ２を標的とするキメラ抗原受容体
CN110248674B (zh) * 2016-09-07 2021-10-26 萨辛生命科学有限公司 针对vegf的合成抗体及其用途
US20200102373A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Colorado State University Research Foundation Scfv's for live cell imaging and other uses
CN110194803B (zh) * 2019-06-26 2021-01-05 上海科棋药业科技有限公司 一种靶向EpCAM的嵌合抗原受体及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1171468E (pt) * 1999-04-09 2008-10-08 Univ Zuerich Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
CN100417414C (zh) * 2003-04-30 2008-09-10 苏黎世大学 免疫毒素在制备治疗头颈鳞状上皮细胞癌或膀胱癌药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1171468A2 (en) 2002-01-16
US7858088B2 (en) 2010-12-28
US20110136173A1 (en) 2011-06-09
JP4540856B2 (ja) 2010-09-08
US20060159683A1 (en) 2006-07-20
ATE399796T1 (de) 2008-07-15
WO2000061635A3 (en) 2001-05-10
US20080299124A1 (en) 2008-12-04
EP1171468B1 (en) 2008-07-02
WO2000061635A2 (en) 2000-10-19
CA2369622A1 (en) 2000-10-19
DK1171468T3 (da) 2008-10-20
DE60039354D1 (de) 2008-08-14
ES2308981T3 (es) 2008-12-16
EP1918303A2 (en) 2008-05-07
CA2369622C (en) 2011-06-14
US7341722B2 (en) 2008-03-11
US7033798B2 (en) 2006-04-25
US8137932B2 (en) 2012-03-20
EP1918303A3 (en) 2008-05-14
US20020146846A1 (en) 2002-10-10
JP2002542773A (ja) 2002-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7858088B2 (en) Method for the stabilization of chimeric immunoglobulins or immunoglobulin fragments, and stabilized anti-EGP-2 scFv fragment
US11566071B2 (en) Nucleic acid molecules encoding anti-GPRC5D antibodies
Willuda et al. High thermal stability is essential for tumor targeting of antibody fragments: engineering of a humanized anti-epithelial glycoprotein-2 (epithelial cell adhesion molecule) single-chain Fv fragment
EP3226897B1 (en) Antibodies targeting b-cell maturation antigen and methods of use
US5753204A (en) Biosynthetic binding proteins for immunotargeting
ES2212340T3 (es) Secuencias de peptidos como regiones bisagra en fragmentos de inmunoglobulina similares a proteinas y su uso en medicina.
Carmichael et al. The crystal structure of an anti-CEA scFv diabody assembled from T84. 66 scFvs in VL-to-VH orientation: implications for diabody flexibility
JP7056858B2 (ja) 新規な組換え型二機能性融合タンパク質、その調製方法および用途
JPH09505737A (ja) 癌胎児性抗原（ｃｅａ）に対する抗体
JP2009268470A (ja) 抗体分子を用いての腫瘍脈管系の選択的標的化
US8344109B2 (en) Anti-ricin antibody
WO2023133842A1 (zh) 一种靶向IL-18Rβ的抗体及其应用
CN116554322A (zh) 一种靶向IL-18Rβ的抗体及其应用
CN116120450A (zh) 靶向人cd38分子的驼科纳米抗体制备和应用
CN117177999A (zh) 一种靶向IL-18Rβ的抗体及其应用
NZ732567B2 (en) Antibodies targeting g-protein coupled receptor and methods of use
US20070031931A1 (en) Biosynthetic binding proteins for immuno-targeting
US20050058638A1 (en) Biosynthetic binding proteins for immuno-targeting
Holm Functional mapping and in vivo metabolism of the monoclonal antibody TS1 and its single-chain fragment: Its interaction with the antigen and the anti-idiotype