CN101137673A - Cripto结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗CRIPTO抗体及其部分的人源化形式。在一实施方案中，所述抗体或包含它们的多肽(例如全长抗体或结构域删除的抗体)的可变区可以用于治疗一些疾病，比如癌症。

Description

CRIPTO结合分子
相关申请
本申请享有2005年1月5日提交的名为“Purification and PreferentialSynthesis of Binding Molecules”的USSN60/641691的优先权。本申请与2003年6月27日提交的名为“Purification and Preferential Synthesis of Polypeptides”的USSN60/483877、2003年10月3日提交的名为“Purification and PreferentialSynthesis of Antigen Binding Polypeptides”的USSN60/508,810相关。本申请还与2004年6月28日提交名为“Purification and Preferential Synthesis ofBinding Molecules”的USSN10/880,320有关。同样与本申请相关的有2004年9月20日提交的名为“Cripto-Specific Antibodies”的USSN10/945,853、2003年10月23日提交的名为“Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof Cripto”的USSN10/693,538；2002年3月22日提交的名为“Antibodies Directed to theLigand Binding Domain of Cripto”的美国专利申请60/367,002；2001年6月26日提交的名为“Cripto B locking Antibodies and Uses Thereof”的申请60/301,091；2001年5月17日提交的名为“Antibodies Directed to the LigandBinding Domain of Cripto”的申请60/293,020；以及2001年4月26日提交的名为“Antibodies Directed to the Ligand B inding Domain of Cripto”的申请60/286,782。这些专利申请均以参考文献的方式全文引入本文。
背景技术
抗体及其各种工程化形式在当前是用于治疗多种疾病患者的有效治疗剂。这些抗体中的一些可以识别位于肿瘤细胞表面的抗原。Cripto是一种在许多肿瘤细胞中过表达的188个氨基酸的细胞表面蛋白。在对人胚胎癌文库进行的cDNA筛选中分离到了Cripto(Ciccodicola et al.，1989，EMBO J.8：1987-91)。Cripto原来被划分为EGF家族的成员(Ciccodicola et al.，supra)；但是，后来的分析表明Cripto不与任何已知EGF受体结合，它的类似EGF的结构域实际上与EGF家族是趋异进化的(Bianco et al.，1999，J.Biol.Chem.274：8624-29)。
在许多组织(包括，但不限于脑、***、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃)中，Cripto蛋白的过表达是与肿瘤相关的(Panico et al.，1996，Int.J.Cancer65：51-56；Byrne et al.，1998，J.Pathology185：108-11；DeAngelis et al.，1999，Int.J.Oncology14：437-40)。
对结合Cripto的小鼠抗体已有描述。然而，尽管小鼠抗体可以用于人体作为治疗剂，因为它们并非来源于人，就有可能是免疫原性的。给予这样的抗体可能导致中和抗体反应(人抗小鼠抗体(HAMA)反应)，因此在需要反复给予所述抗体的情况下就尤其麻烦，例如治疗慢性或复发性疾病状况。同时，因为它们含有的是小鼠恒定区，可能不会显示人效应物功能。
努力减弱免疫原性危险时，通常会制备“人源化”抗体。在一个实验方案中，将来源于小鼠的抗体的CDRs转移到人框架区上产生了“CDR移植”抗体。一般，框架区中可能影响抗原结合能力的氨基酸残基会被突变成相应的小鼠残基。
但是，虽然人源化抗体因其可能在人体中具有低免疫原性而备受期待，它们的产物是无法预计的。例如，抗体的序列修饰可能导致极大甚至完全丧失其抗原结合亲和性，或者失去结合特异性。此外，尽管进行了序列修饰，″人源化抗体″可能还是会在人体中表现出免疫原性。人源化抗-Cripto抗体的研发对于抑制患者细胞内表达Cripto所造成的后果大有益处。此外，开发出这类抗体就提供了一个寻靶到Cripto阳性肿瘤细胞的途径，从而可以递送抗肿瘤剂，比如毒素、放射性标记等。
发明简述
本发明是基于，至少是部分基于，抗Cripto的CDR移植抗体和其它人源化抗体的开发。如下文详述，开发了多种形式的人源化抗Cripto抗体，并与美登木素生物碱(maytansinoids)偶联来检测动物模型中的肿瘤生长。以下实施例中展示的结果体现出这些抗体用于抑制肿瘤细胞体内生长的用途。这些人源化的抗Cripto抗体比小鼠抗体更适合用在人受试者中。
人源化全长抗体和缺少CH2区的人源化抗体都有人制备过。删除了CH2区的抗体组合物包含由不同同种型构成的二聚体结合分子(即包含两个重链部分的分子，其中所述分子的一部分包含两个借助至少一个链间二硫键连接在一起的重链部分(A型)，所述分子的另一部分包含两个不是借助至少一个链间二硫键连接在一起的重链部分(B型))的混合物。可以优选获得一种或另一种同种型，例如通过利用疏水相互作用层析进行分离，或者通过包含上会导致优先生物合成A同种型或B同种型的合成连接肽。本发明的连接肽可以包含在任何倾向于形成A型和B型的二聚体分子中，例如，抗体分子、结构域删除的抗体分子(例如，缺少全部或部分CH2区)、微抗体、二价二聚体、融合蛋白等。在一个优选实施方案中，A型的形成增加。A型多肽二聚体在体外表现出稳定性增强和体内生物分布增加。
相应的，本发明一个方面涉及这样的结合分子，其包含至少一个选自以下组的CDR序列：
CDR L1：RS SQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：9)，
CDR L2：KVSNRFS(SEQ ID NO：10)，
CDR L3：FQGSHVPLT(SEQ ID NO：11)，
CDR H1：SYWIH(SEQ ID NO：12)，
CDR H2：ENDPSNGRTNYNEKFKN(SEQ ID NO：13)和
CDR H3：GPNYFYSMDY(SEQ ID NO：14)，以及来自人受体免疫球蛋白序列的可变框架区序列，其中该结合分子特异结合人Cripto抗原。
在一实施方案中，结合分子包含CDR H3序列GPNYFYSMDY(SEQ IDNO：14)。
在另一实施方案中，结合分子包含CDR H2序列ENDPSNGRTNYNEKFKN(SEQ ID NO：13)。
在一实施方案中，结合分子包含CDR H1序列SYWIH(SEQ ID NO：12)。
在一实施方案中，结合分子包含CDR L3序列FQGSHVPLT(SEQ IDNO：11)。
在一实施方案中，结合分子包含CDR L2序列KVSNRFS(SEQ IDNO：10)。
在一实施方案中，结合分子包含CDR L1序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：9)。
在一实施方案中，所述可变框架区序列中至少一个框架残基被取代为相应小鼠B3F6可变区序列中到相应氨基酸残基。
在另一方面，本发明涉及的结合分子包含：轻链可变区，其包含SEQID NO：39的CDR1-3和来自人受体免疫球蛋白轻链序列到可变框架区；和重链可变区，其包含SEQ ID NO：40的CDR1-3和来自人受体免疫球蛋白重链到可变框架区，其中该结合分子特异结合人CRIPTO抗原。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白重链的可变框架区与SEQID NO：40的框架和CDR区至少约50％相同。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白重链的可变框架区来源于人亚型I(human subgroup1)序列、人亚型I共有序列(consensus sequence)，或者人种系序列(human germline sequence)。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白重链的可变框架区包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列到可变框架区与SEQ ID NO：39的框架和CDR区至少约60％相同。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列到可变框架区来源于人κ2亚型序列、人κ2亚型共有序列，或者人种系序列。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列。
在一实施方案中，来自人受体免疫球蛋白重链之可变框架区中的至少一个框架残基被SEQ ID NO：40所示的小鼠氨基酸序列中的相应氨基酸残基取代，其中所述的至少一个氨基酸残基是
a)规范残基(canonical residue)，
b)界面堆积残基(interface packing residue)，
c)靠近结合位点的不常见或罕见残基，
d)具有与CDR中一些原子距离在3???单位以内的的侧链原子的残基。
在一实施方案中，所述至少一个框架残基是选自H1、H48、H67、H71、H73、H81、H82b、H93和H112(Kabat编号体系)。
在一实施方案中，所述至少一个框架残基包括H48、H67、H71、H73、H93和H112。
在一实施方案中，所述至少一个框架残基是H71和H112。
在一实施方案中，所述至少一个框架残基包括H1、H48、H71、H81、H82b和H112。
在一实施方案中，来自人受体免疫球蛋白轻链之可变框架区中的至少一个框架残基被SEQ ID NO：39所示的小鼠序列中的相应氨基酸残基取代，其中所述的至少一个氨基酸残基是
a)规范残基，
b)界面堆积残基，
c)靠近结合位点的不常见或罕见残基，
d)其一个侧链原子与CDR中的一些原子距离在3埃单位以内的残基。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列到可变框架区是L2或L100(Kabat编号体系)。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区是L2。
在一实施方案中，所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区包括L2和L100。
另一方面，本发明涉及这样的结合分子，其包含：轻链以及重链，该轻链含有VL序列的CDR和框架氨基酸序列，并任选含有信号序列，其中所述VL序列选自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：50，以及位于SEQ ID NO：52中的氨基酸残基1-112；该重链含有VH序列的CDR和框架氨基酸序列，并任选含有信号序列，其中所述VH序列选自SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：51、以及位于SEQ ID NO：55中的氨基酸残基1-121；其中该结合分子特异结合人Cripto抗原。
在一实施方案中，所述结合分子包含轻链和重链，该轻链含有SEQ IDNO：52中氨基酸1-121所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列；该重链含有SEQ ID NO：55中氨基酸1-121所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列。
在一实施方案中，所述结合分子包含轻链和重链，该轻链含有SEQ IDNO：47所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列；该重链含有SEQ ID NO：48所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列。
在一实施方案中，所述结合分子包含轻链和重链，该轻链含有SEQ IDNO：47所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列；该重链含有SEQ ID NO：49所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列。
在一实施方案中，所述结合分子包含轻链和重链，该轻链含有SEQ IDNO：47所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列；该重链含有SEQ ID NO：51所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列。
在一实施方案中，所述结合分子包含轻链和重链，该轻链含有SEQ IDNO：50所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列；该重链含有SEQ ID NO：48所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列。
在一实施方案中，所述结合分子包含轻链和重链，该轻链含有SEQ IDNO：50所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列；该重链含有SEQ ID NO：49所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列。
在一实施方案中，所述结合分子包含轻链和重链，该轻链含有SEQ IDNO：50所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列；该重链含有SEQID NO：51所示的框架和CDR氨基酸序列，以及任选的信号序列。
在一实施方案中，所述结合分子的重链包含CH3区，后者通过合成连接肽与VH、VL或CH1区发生遗传融合(genetically fused)。
在一实施方案中，所述结合分子重链缺少全部或部分CH2区。
在一实施方案中，所述结合分子包含来源于抗体亚型的恒定区，其中的抗体亚型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一实施方案中，所述结合分子包含来源于绞链区的氨基酸序列，其中的绞链区选自γ1绞链、γ2绞链、γ3绞链和γ4绞链。
在一实施方案中，所述结合分子包含嵌合绞链。
在一实施方案中，所述结合分子包含IgG1绞链区的至少一部分，IgG3绞链区的至少一部分。
在一实施方案中，所述结合分子包含的重链恒定区在位点239或242(Kabat编号体系)含有半胱氨酸。
在一实施方案中，所述结合分子包含的重链恒定区与野生型Fc区相比，含有至少一个氨基酸修饰。在一实施方案中，所述修饰包含在EU位点297-299中任一位点的氨基酸取代，从而该变体在哺乳动物细胞中表达时，基本上是非糖基化的。
在一实施方案中，所述结合分子与具有野生型Fc区的结合分子相比，效应物功能下降。
在一实施方案中，所述结合分子具有降低的抗原依赖性细胞毒性。
在一实施方案中，所述结合分子具有延长的半衰期。
在一实施方案中，修饰的Fc区有至少一个工程化半胱氨酸残基。在一实施方案中，该工程化半胱氨酸残基位于Fc区到CH3区中。
在一实施方案中，本发明涉及偶联了效应物部分的结合分子。在一实施方案中，所述效应物部分选自细胞毒素、前药、生物毒素和放射性同位素。
在一实施方案中，所述效应物部分是通过酰胺键偶联的。
在一实施方案中，所述效应物部分是美登木素生物碱。
在一实施方案中，轻链包含SEQ ID NO：53所示的框架和CDR氨基酸序列，重链包含SEQ ID NO：56所示的框架和CDR氨基酸序列。
在一实施方案中，轻链包含SEQ ID NO：53所示的框架和CDR氨基酸序列，重链包含SEQ ID NO：57所示的框架和CDR氨基酸序列。
在一实施方案中，结合分子包含γ1亚型的重链恒定区。
在一实施方案中，结合分子包含SEQ ID NO：71所示的重链恒定区序列。
在另一方面，本发明涉及人源化的抗Cripto单克隆抗体，该抗体由保存在ATCC的保存号为的细胞系产生。
在一实施方案中，结合分子包含轻链和重链，所述轻链含有SEQ IDNO：53所示序列，所述重链含有SEQ ID NO：58所示序列。
在一实施方案中，结合分子包含轻链和重链，所述轻链含有SEQ IDNO：54所示序列，所述重链含有SEQ ID NO：56所示序列。
在一实施方案中，结合分子包含轻链和重链，所述轻链含有SEQ IDNO：54所示序列，所述重链含有SEQ ID NO：57所示序列。
在一实施方案中，结合分子包含轻链和重链，所述轻链含有SEQ IDNO：54所示序列，所述重链含有SEQ ID NO：58所示序列。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含轻链和重链，所述轻链含有SEQ ID NO：52所示序列，所述重链含有SEQ ID NO：55所示序列。
在另一方面，本发明涉及删除了CH2区的结合分子，该分子包含轻链和重链，所述轻链含有选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的轻链可变区序列；所述重链含有选自SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQID NO：57和SEQ ID NO：58的重链可变区(VH)序列；其中所述结合分子特异结合人CRIPTO抗原。
在一实施方案中，轻链具有SEQ ID NO：53所示的序列，重链具有SEQ IDNO：60所示的序列。
在一实施方案中，其中所述轻链具有SEQ ID NO：53所示的序列，重链具有SEQ ID NO：61所示的序列。
在一实施方案中，轻链具有SEQ ID NO：53所示的序列，重链具有SEQ IDNO：62所示的序列。
在一实施方案中，轻链具有SEQ ID NO：54所示的序列，重链具有SEQ IDNO：60所示的序列。
在一实施方案中，轻链具有SEQ ID NO：54所示的序列，重链具有SEQ IDNO：61所示的序列。
在一实施方案中，轻链具有SEQ ID NO：54所示的序列，重链具有SEQ IDNO：62所示的序列。
在一实施方案中，轻链具有SEQ ID NO：52所示的序列，重链具有SEQ IDNO：59所示的序列。
在一实施方案中，结合分子被改变成在该结合分子的至少一个CDR中包含至少一个保守氨基酸取代。
在一实施方案中，本发明的结合分子是双特异性的。
在一实施方案中，本发明的结合分子是四价的。
在一实施方案中，本发明的结合分子是全长抗体。
在一实施方案中，本发明的结合分子是抗体片段。
在另一方面，本发明涉及包含多肽二聚体的组合物，该多肽二聚体具有至少两个结合位点和至少两个多肽链，其中所述的至少两个结合位点中的至少一个含有人源化B3F6可变区，所述的至少两个多肽链含有至少一个重链部分和合成连接肽。其中所述多肽二聚体约70％以上包含借助至少一个链间二硫键连接在一起的多肽链，所述连接肽在Kabat编号体系的243位点包含脯氨酸残基。
在一实施方案中，90％以上的多肽二聚体通过至少一个链间二硫键连在一起。
在一实施方案中，所述合成连接肽还在Kabat编号体系的位点239或242包含半胱氨酸残基。
在一实施方案中，至少一个所述多肽链包含通过连接肽与VL、VH或CH1区连在一起的CH3区。
在一实施方案中，所述合成连接肽还在Kabat编号体系的位点244包含丙氨酸残基，在位点245包含脯氨酸残基。
在另一方面，本发明涉及人源化抗Cripto抗体，该抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示的轻链，和氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示的重链，其中所述抗体偶联了美登木素生物碱。
另一个方面，本发明涉及包含所述结合分子和可药用载体的组合物。
在一实施方案中，结合分子是人源化抗Cripto抗体的变体，其中所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO：53所示的轻链，和氨基酸序列如SEQ IDNO：57所示的重链，其中该变体包含至少一个保守氨基酸取代，其中该变体保留了特异结合人Cripto的能力。
在另一实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，该核酸分子包含编码结合分子之重链或轻链的核苷酸序列；或者涉及与前述核苷酸序列的互补序列在高度严格条件下杂交的核酸分子。在一实施方案中，所述核酸分子位于载体中。
在一实施方案中，本发明涉及包含这种载体的宿主细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及制备所述结合分子的方法，该方法包括将宿主细胞在能产生结合分子的条件下进行培养，并从宿主细胞或培养基中分离结合分子。
在另一实施方案中，本发明涉及用发明所述结合分子治疗能够受益于该项治疗的受试者的方法，该方法包括将结合分子给予受试者来进行治疗。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗恶性肿瘤的方法，该方法包括将编码权利要求1-80任何一项所述结合分子的核酸分子，在一定条件下给予患有恶性肿瘤的患者，从而使得结合分子被表达，患者的恶性肿瘤得到治疗。
在一实施方案中，受试者患有癌症。
在一实施方案中，所述方法还包含给予其它试剂。
在一实施方案中，所述其它试剂是化疗剂。
在一实施方案中，所述其它试剂选自那他珠单抗(natalizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、因福利美(infliximab)、利妥昔单抗(rituximab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、爱必妥(cetuximab)、盐酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride)、托西莫单抗(tositumomab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、IMC-C225、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、氟维司群(fulvestrant)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、他莫昔芬(tamoxifen)、α干扰素、地尼白介素(denileukin diftitox)、奥利莫森(oblimersen)、盐酸厄洛替尼(erlotinib HCl)、保特佐米(bortezomib)、沙利度胺(thalidomide)和内皮抑制素(Endostatin)。
在另一方面，本发明涉及抑制患者细胞内Cripto表达造成的影响的方法，该方法包括将有效剂量的发明所述结合分子给予患者。
在一实施方案中，结合分子的有效剂量是至少5mg/kg。
在另一实施方案中，结合分子的有效剂量是至少约10mg/kg。
在一实施方案中，结合分子经腹膜内、口服、鼻内、皮下、肌内、局部或静脉内给药。
在一实施方案中，患者患有以下器官的癌症，包括脑、***、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、尿道、宫颈、胰腺和胃。
附图说明
图1A(SEQ ID NO：1)显示了重链CH2结构域删除的嵌合抗CRIPTO单克隆抗体的DNA序列，其中所述抗体由分别与人重链和轻链恒定区融合的小鼠重链和轻链可变区构成(chB3F6)，该抗体含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[GlySer]绞链连接肽。图1B(SEQ ID NO：2)显示轻链CH2结构域删除的chB3F6的DNA序列。
图2A(SEQ ID NO：3)显示了重链CH2结构域删除的chB3F6的氨基酸序列，该抗体含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[GlySer]绞链连接肽。图2B(SEQ ID NO：4)显示轻链CH2结构域删除的chB3F6的氨基酸序列。
图3显示了给CH2结构域删除的chB3F6抗体包含上G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽(SEQ ID NO：5)使得所产生的基本上都是A型抗体，只有很少的或没有可检测到的B型抗体(见第4道)。
图4显示了嵌合B3F6(chB3F6)和含有连接肽(B3F6ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245)的嵌合B3F6结构域删除的抗体，竞争结合GEO肿瘤细胞的能力相同。
图5显示了供体小鼠B3F6轻链可变区、人受体、以及我们制备的各种人源化形式的轻链序列比对。CDR序列用阴影表示。供体和受体FR氨基酸残基之间的不同用粗体显示。回复突变用粗体和小写字母表示。Kabat编号沿序列比对标记在上面。
图6显示了供体小鼠B3F6重链区、人受体、以及我们制备的各种人源化形式的重链序列比对。CDR序列用阴影表示。供体和受体FR氨基酸残基之间的不同用粗体显示。回复突变用粗体和小写字母表示。Kabat编号沿序列比对标记在上面。
图7显示了用于制备结构域删除抗体(包含绞链连接肽(HCP))的恒定区序列和用于制备全长抗体的全长IgG1恒定区序列。
图8显示了嵌合结构域删除的B3F6与结构域删除的人源化B3F6版本1和版本2的结合能力的比较。
图9显示了嵌合结构域删除的B3F6与结构域删除的人源化B3F6版本3、版本4、版本5和版本6的结合能力的比较。
图10显示了偶联了DM4的全长B3F6对裸鼠中已建成的BT-474异体移植肿瘤的影响，这是通过测量肿瘤重量的变化得出的。B3F6.1-DM4偶联物每7天以15mg/kgIV给予三个月(q7d×3)加上第43天(n＝8)；或者给予q7d×3加上第43天给予25mg/kg(n＝8)；B3F6.1-DM4以35mg/kg IV给予q7d×3(n＝8)或者在第15、22、33和36天(n＝8)给予；载体(n＝16)经IV给予q7d×3，紫杉萜(Taxol)(n＝7)从第15天开始经IP给予q4d×3。竖线代表平均值的标准误差。
图11中板块A和B显示偶联了DM4的全长B3F6对裸鼠中BT-474异体移植肿瘤的影响。带有已建成BT-474人乳腺肿瘤的小鼠，用B3F6.1-DM4以15mg/kg IV处理q7d×3加上第43天(n＝8)；或者q7dx3加上第43天用25mg/kg处理(n＝8)；B3F6.1-DM4以35mg/kg经IV处理q7d×3(n＝8)或者在第15、22、33和36天(n＝8)给予；对照(n＝16)经IV给予q7d×3，紫杉萜(n＝7)从第15天开始经IP给予q4d×3。板块A显示了第58天时各个肿瘤的重量。板块B显示了剩余处理组在第76天时各个肿瘤的重量。每个点代表每只小鼠的肿瘤重量，线代表每组的平均肿瘤重量。
图12显示了偶联了DM4和紫杉萜的全长B3F6对裸鼠中已建成的BT-474异种移植肿瘤的影响。该图显示了用检测组平均肿瘤大小占平均载体对照肿瘤大小的百分比进行的比较。带有已建成BT-474人乳腺肿瘤的小鼠用B3F6.1-DM4以15mg/kgIV处理q7d×3加上第43天(n＝8)；或者q7d×3加上第43天用25mg/kg处理(n＝8)；B3F6.1-DM4以35mg/kg经IV处理q7d×3(n＝8)或者在第15、22、33和36天(n＝8)给予；对照(n＝16)经IV给予q7d×3，紫杉萜(n＝7)从第15天开始经IP给予q4d×3。横线代表National Cancer Institute规定的活性标准(42％)。
图13显示移植了BT-474人乳腺癌肿瘤，并用偶联了DM4或紫杉醇的全长B3F6处理的裸鼠体重。小鼠从第15天开始，用B3F6.1-DM4以15mg/kg经IV处理q7d×3加上第43天(n＝8)；或者q7d×3加上第43天用25mg/kg处理(n＝8)；B3F6.1-DM4以35mg/kg经IV处理q7d×3(n＝8)或者在第15、22、33和36天(n＝8)给予；对照(n＝16)经IV给予q7d×3，紫杉萜(n＝7)经IP给予q4d×3。竖线代表平均值的标准误差。
图14显示了结构域删除(dd)huB3F6-DM4对BT-474乳腺癌细胞的影响，这是通过测量肿瘤重量的变化来衡量的。偶联DM-4的抗体以18mg/kg、10mg/kg给予5个剂量，紫杉萜以25mg/kg给予时，可观察到明显效果。
图15显示了结构域删除(dd)huB3F6-DM4对BT-474癌细胞的影响，这是通过测量肿瘤重量的变化来衡量的。在三个周的肿瘤退化/停滞之后，重新对动物进行给药。以10mg/kg给予偶联DM-4的抗体和25mg/kg给予紫杉萜的情况中，观察到明显效果。
图16显示了结构域删除(dd)huB3F6-DM4对BT-474癌细胞的影响。肿瘤重量用它们占被测肿瘤重量/载体对照的百分比来表示。紫杉萜和10mg/kg的huB3F6-DM4均使肿瘤重量减少了50％或以上。
图17显示了结构域删除(dd)的huB3F6-DM4对BT-474癌细胞的影响，这是通过测量肿瘤重量的变化来衡量的。动物在周一、周三、周五和周一给药。第7组中维持了7/8的动物。
图18显示了偶联了DM4或顺铂的全长B3F6对裸鼠中已形成的NCCIT异种移植肿瘤的影响，这是通过肿瘤重量的变化表现出来的。B3F6.1-DM4以6(n＝8)、10(n＝8)、15(n＝8)和25(n＝8)mg/kg经IV给予q7d×3(如箭头所示)，载体经IV给予(n＝16)q7d×3，以及顺铂从第15天开始以2mg/kg经SC给予(n＝8)3×/wk×6。竖线代表平均值的标准误差。
图19板块A和B以散点图的形式显示了全长B3F6.1-DM4对裸鼠肿瘤的影响。带有已形成NCCIT人睾丸瘤的裸鼠如下处理，B3F6.1-DM4以6(n＝8)、10(n＝8)、15(n＝8)和25(n＝8)mg/kg经IV给予q7d×3，载体(n＝16)经IV给予q7d×3，以及顺铂(n＝8)从第15天开始经SC给予3×/wk×4。板块A显示了第70天的各个肿瘤重量。板块B显示了剩余处理组在第107天的各个肿瘤重量。每个点代表每只小鼠的肿瘤重量，线代表每组的平均肿瘤重量。
图20显示了偶联了DM4或顺铂的全长B3F6对裸鼠中已形成NCCIT异种移植肿瘤的影响。该图展示了用检测组平均肿瘤大小占平均载体对照肿瘤大小的百分比进行的比较。带有已形成NCCIT人睾丸肿瘤的裸鼠如下处理，B3F6.1-DM4以6(n＝8)、10(n＝8)、15(n＝8)和25(n＝8)mg/kg经IV给予q7d×3，载体(n＝16)经IV q7d×3，以及顺铂从第15天开始经SC给予(n＝8)3×/wk×4。横线表示National Cancer Institute规定的活性标准(42％)。
图21显示植入了NCCIT异种移植肿瘤，并以偶联了DM4或顺铂的全长B3F6处理的小鼠的平均体重。小鼠用6(n＝8)、10(n＝8)、15(n＝8)和25(n＝8)mg/kg经IV处理q7d×3，载体(n＝16)经IV处理q7d×3，以及顺铂(n＝8)从第15天开始经SC处理3×/wk×4。竖线代表平均值的标准误差。
图22板块A和B显示了在第15天给予偶联了DM4的全长B3F6对裸鼠中已形成的NCCIT异种移植肿瘤的重新生长的影响，这是通过肿瘤重量变化体现出来的。B3F6.1-DM4以25(n＝8)mg/kg经IV在第15天给予1次；B3F6.1-DM4以10(n＝8)mg/kg经IV在第15、37和44a天给予；载体(n＝16)经IV给予q7d×3；以及顺铂(n＝8)从第15天开始以2mg/kg经SC给予3×/wk×6。竖线代表平均值的标准误差。板块A显示了所有以10mg/kg给剂的小鼠的组合数据。板块B显示了与以10m/kg在第15、37和44天给剂的小鼠(n＝3)的数据分开的以10m/kg在第15和37天给剂的小鼠(n＝5)的数据。
a第44天，仅3只表现进行性肿瘤生长的小鼠被给药。
图23板块A和B显示了通过测量肿瘤重量变化反映的全长B3F6.1-DM4对裸鼠肿瘤的影响。带有已形成NCCIT人睾丸肿瘤的小鼠如下处理：B3F6.1-DM4以25(n＝8)mg/kg经IV在第15天给予；B3F6.1-DM4以10(n＝8)mg/kg经IV在第15、37和44a给予；对照(n＝16)经IV给予q7d×3；以及顺铂(n＝8)从第15天开始以2mg/kg经SC给予3×/wk×6。板块A显示了第70天各个肿瘤的重量。板块B显示了剩余处理组在第107天的各个肿瘤重量。每个点代表每只小鼠的肿瘤重量，线代表每组的平均肿瘤重量。
图24板块A和B显示了偶联了DM4或顺铂的全长B3F6对裸鼠中已形成NCCIT异种移植肿瘤的影响。该图展示了用检测组平均肿瘤大小变化占平均载体对照肿瘤大小变化的百分比进行的比较。带有已形成NCCIT人睾丸肿瘤的裸鼠如下处理，B3F6.1-DM4以25(n＝8)mg/kg在第15天经IV给予一次；B3F6.1-DM4以10(n＝8)mg/kg在第15、37和44a天经IV给予；载体(n＝16)经IV给予q7d×3，以及顺铂(n＝8)从第15天开始以2mg/kg经SC给予3×/wk×4。板块A显示了所有以10mg/kg给剂的小鼠的组合数据。板块B显示了与以10m/kg在第15、37和44天给剂的小鼠(n＝3)的数据分开的以10m/kg在第15和37天给剂的小鼠(n＝5)的数据。横线代表NationalCancer Institute规定的活性标准(42％)。
a第44天，仅3只表现进行性肿瘤生长的小鼠被以10mg/kg给剂。
图25板块A和B显示了带有已形成NCCIT人睾丸肿瘤，并如下处理过的裸鼠的平均体重，全长B3F6.1-DM4以25(n＝8)mg/kg在第15天经IV给予一次；B3F6.1-DM4以10(n＝8)mg/kg在第15、37和44a天经IV给予；载体(n＝16)经IV给予q7d×3，以及顺铂(n＝8)从第15天开始以2mg/kg经SC给予3×/wk×4。板块A显示了所有以10mg/kg给剂的小鼠的组合数据。板块B显示了与以10m/kg/注射在第15、37和44天给剂的小鼠(n＝3)的数据分开的以10m/kg/注射在第15和37天给剂的小鼠(n＝5)的数据。
a第44天，仅3只表现进行性肿瘤生长的小鼠被以10mg/kg给剂。
图26显示了以下处理对裸鼠中已建立Calu-6异种移植肿瘤的肿瘤重量变化的影响，处理包括全长B3F6.1-DM4以10(n＝8)和20(n＝8)mg/kg经IV在第13、17和21天给予(以箭头表示)；从第14天开始载体(n＝16)经IV给予3×/wk×4；以及Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21、24-26天给予。竖线代表平均值的标准误差。
图27显示偶联了DM4的全长B3F6对裸鼠中已形成Calu-6异种移植肿瘤的影响。小鼠的处理包括B3F6.1-DM4以10(n＝8)和20(n＝8)mg/kg经IV在第13、17和21给予；载体(n＝16)从第14天开始经IV给予3×/wk×4；Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21和24-26天给予。每个点代表每只小鼠的肿瘤重量，横线代表每组的平均肿瘤重量。
图28显示偶联了DM4或Camptosar的全长B3F6对裸鼠中已形成的Calu-6异种移植肿瘤的影响。该图展示了用检测组平均肿瘤大小占平均载体对照肿瘤大小的百分比进行的比较。带有已形成的Calu-6异种移植肿瘤的裸鼠如下处理：B3F6.1-DM4以10(n＝8)和20(n＝8)mg/kg经IV在第13、17和21天给予；载体(n＝16)经IV从第14开始给予3×/wk×4；以及Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21、24-26天给予。横线表示National Cancer Institute的活性(42％)标准。
图29显示了带有已形成的Calu-6异种移植肿瘤并用偶联了DM4的全长B3F6处理过的裸鼠的体重。小鼠的处理包括B3F6.1-DM4以10(n＝8)和20(n＝8)mg/kg经IV在第13、17和21天给予(如箭头所示)；载体(n＝16)从第14天开始经IV给予3×/wk×4；以及Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21、24-26天给予。竖线代表平均值的标准误差。
图30显示偶联了DM4或Camptosar的全长B3F6对裸鼠中已形成的Calu-6异种移植肿瘤的影响。B3F6.1-DM4以15(n＝8)和30(n＝8)mg/kg经IV给予q7d×3(如箭头所示)；载体(n＝16)从第14天开始经IV给予3×/wk×4；以及Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21、24-26天给予。图中显示了已形成的Calu-6异种移植肿瘤的肿瘤重量变化。竖线代表平均值的标准误差。
图31显示了全长B3F6.1-DM4对裸鼠中已形成的Calu-6异种移植肿瘤的影响。带有已形成的Calu-6异种移植肿瘤的裸鼠如下处理：B3F6.1-DM4以15(n＝8)和30(n＝8)mg/kg经IV给予q7d×3；载体(n＝16)从第14天开始经IV给予3×/wk×4；以及Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21、24-26天给予。每个点代表每只小鼠的肿瘤重量，线代表每组的平均肿瘤重量。
图32显示偶联了DM4或Camptosar的全长B3F6对裸鼠中已形成的Calu-6异种移植肿瘤的影响。数据展示为用检测组平均肿瘤大小占平均载体对照肿瘤大小的百分比表示的比较。带有已形成的Calu-6异种移植肿瘤的裸鼠如下处理：B3F6.1-DM4以15(n＝8)和30(n＝8)mg/kg经IV给予q7d×3；载体(n＝16)从第14天开始经IV给予3×/wk×4；以及Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21、24-26天给予。横线表示National CancerInstitute的活性(42％)标准。
图33显示了裸鼠体重，这些裸鼠带有已形成的Calu-6人肺间变性肿瘤，并经如下处理：全长B3F6.1-DM4以15(n＝8)和30(n＝8)mg/kg经IV给予q7d×39(如箭头所示)，对照(n＝16)从第14天开始经IV给予3×/wk×4，以及Camptosar(n＝8)以10mg/kg经SC在第13-14、17-21、24-26天给予。竖线代表平均值的标准误差。
发明详述
本发明至少部分基于CDR移植的和其它人源化抗Cripto抗体的进展。更具体地说，这些抗体来源于小鼠抗体B3F6。如本文所述，我们开发了多种形式的人源化抗Cripto抗体，并使之偶联美登木素生物碱以用于在肿瘤细胞模型中进行测试。结果证明了这些抗体可以用于体内抑制肿瘤细胞的生长。这些人源化抗Cripto抗体比小鼠抗体更适合用于人受试者。
人源化全长抗体和缺少CH2区的人源化抗体均已有制备。通常，细胞培养所产生的重组CH2区删除抗体会导致绞链区异质性，因此使得溶液中存在两种形式的抗体。在天然溶液中，这两种抗体形式均以二聚体蛋白存在(每个单体包含一个重链和一个轻链)。每个免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链结构，其中二聚体通过链间重链二硫键维持在一起(A型)，一个包含其中二聚体不以链间二硫键连在一起的形式(B型)。B型在天然条件下也可以形成稳定的二聚体，但可以在变性、非还原条件下进行鉴定，在该条件下，重链解离产生一个75-80kDa的分子。这两种形式即使经过单抗亲和纯化也非常难以分开。
在各种完整IgG亚型中出现B型的频率归因于，但不限于，与单抗分子绞链区亚型相关的结构差异。实际上，在人IgG4的绞链区的单个氨基酸取代可以使B型的出现(Angal etal.1993.Molecular Immunology30：105)显著降低到通常在用人IgG1绞链时观察到的水平。然而，将同一氨基酸取代应用于CH2区删除抗体时不能消除制剂中的B型。
如本文所述，在本发明的人源化Cripto结合分子中包含上一些连接肽导致特定多肽二聚体的优先生物合成，这些二聚体有些通过至少一个链间二硫键连在一起，或者不通过至少一个链间二硫键连在一起。在进一步描述本发明之前，为了方便起见，一些名词描述如下：
I.定义
本发明的结合分子是这样一些多肽分子，它们包含至少一个结合结构域，该结构域包含能特异结合人Cripto分子的结合位点。人Cripto的示范性序列如SEQ ID NO：6(CR-1)和SEQ ID NO：7(CR-3)所示。CR-1对应编码在未分化的人畸胎癌细胞中表达的人Cripto蛋白质的结构基因，CR-3对应编码区中含有7个碱基取代的mRNA完整拷贝，这些碱基取代代表了沉默和置换取代。CR-1定位到染色体3上，CR-3定位到Xq21-q22上(Dono et al.1991.AmJHum Genet.199149：555)。
本发明的结合分子包含至少一个来源于小鼠B3F6抗体的CDR。小鼠B3F6抗体结合到Cripto内跨越氨基酸残基46-62的结构域中的表位。制备小鼠B3F6抗体(又称为B3F6.17)的杂交瘤以PTA-3319的保藏号保存在ATCC。所述抗体通过用在CHO细胞中表达的Cripto融合蛋白免疫小鼠而获得。用于免疫的融合蛋白包含融合了人IgG1Fc区的Cripto的氨基酸残基1到169[SEQID NO：6的氨基酸1-169](构建物称为CR(del C)-Fc)。制备B3F6抗体的方法在例如WO02/088170中有更详细的描述。
本文中，名词″来源于″指定蛋白质是指多肽的来源。在一实施方案中，所述来源于特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或其相关序列。在一实施方案中，所述来源于特定起始多肽的氨基酸序列不是连续的。例如，在一实施方案中，有1、2、3、4、5或6个CDR来源于起始抗体。在一实施方案中，来源于特定起始多肽或氨基酸序列之多肽或氨基酸序列的氨基酸序列与所述起始序列、或者其部分基本相同，其中所述部分由至少3-5个氨基酸、5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸，或至少30-50个氨基酸组成；或者本领域技术人员可以识别出其来源是所述起始序列。在一实施方案中，来源于起始抗体的一或多个CDR序列被改变，从而产生变体CDR序列，其中所述变体CDR序列保持了Cripto结合活性。
本领域技术人员还会理解，可以对本发明的结合分子进行修饰，从而使其与所来源的B3F6分子的氨基酸序列不同。例如，可以进行核苷酸或氨基酸取代，这些取代导致在非关键氨基酸残基上发生保守取代或改变(例如在CDR和/或框架残基)。本发明的结合分子保持了结合Cripto的能力。
编码多肽非天然变体的分离核酸分子可以通过在免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一或多个核苷酸取代、添加或删除，从而使得所编码的蛋白中被引入一或多个氨基酸取代、添加或删除而产生。可以通过标准技术来引入突变，比如定点突变和PCR-介导的突变。优选的，在一或多个非关键氨基酸残基上做保守性氨基酸取代。″保守性氨基酸取代″是指氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基所代替。本领域对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有界定，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、颉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、颉氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非关键氨基酸残基可以用来自相同侧链家族中的另一个氨基酸残基来代替。在另一实施方案中，一串氨基酸可以用结构上类似、在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的氨基酸串来代替。
替代的，在另一实施方案中，可以沿全部或部分免疫球蛋白编码序列随机引入突变。
在一实施方案中，所述结合分子包含一个结合位点。在另一实施方案中，所述结合分子包含至少两个结合位点。在一实施方案中，结合分子包含两个结合位点。在一实施方案中，结合分子包含三个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包含四个结合位点。
在一实施方案中，本发明的结合分子是单体。在另一实施方案中，本发明的结合分子是多聚体。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子是二聚体。在一实施方案中，本发明的二聚体是同源二聚体，包含两个相同的单体亚基。在另一实施方案中，本发明的二聚体是异源二聚体，包含两个不同的单体亚基。所述二聚体的亚基可以包含一或多个多肽链。例如，在一实施方案中，所述二聚体包含至少两个多肽链。在一实施方案中，所述二聚体包含两个多肽链。在另一实施方案中，所述二聚体包含四个多肽链(例如，在抗体分子的情况中)。
优选的发明所述结合分子包含来源于人氨基酸序列的框架和恒定区氨基酸序列。但是，结合多肽也可以包含来源于其它哺乳动物物种的框架和/或恒定区序列。例如，灵长类框架区(例如非人灵长类)、重链部分和/或绞链部分都可以包括在所述结合分子中。在一实施方案中，结合多肽的框架区可以有一或多个小鼠氨基酸，例如人或非人灵长类框架氨基酸序列可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的小鼠氨基酸残基。优选的发明所述结合分子比起始的B3F6小鼠抗体免疫原性低。
本文中，名词“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。含有重链部分的多肽包含至少以下之一：CH1区、绞链(例如上游、中间和/或下游绞链区)结构域、CH2区、CH3区、或者它们的变体或片段。在一实施方案中，发明所述多肽所包含的多肽链含有CH1区、至少部分绞链区，和CH2区。在另一实施方案中，发明所述多肽所包含的多肽链含有CH1区和CH3区。在另一实施方案中，发明所述多肽所包含的多肽链含有CH1区、至少部分绞链区，和CH3区。在另一实施方案中，发明所述多肽所包含的多肽链含有CH3区。在一实施方案中，本发明的多肽缺少至少部分CH2区(例如，全部或部分CH2区)。在另一实施方案中，本发明的多肽包含完整的Ig重链。如上所述，本领域技术人员会理解，可以对这些结构域(例如，所述重链部分)进行修饰从而使其与天然免疫球蛋白分子的氨基酸序列不同。
在一实施方案中，发明所述结合分子的至少两个多肽链包含至少一个来源于抗体或免疫球蛋白分子的重链部分。在一实施方案中，发明所述多肽的至少两个重链部分位于不同多肽链上，并借助例如至少一个二硫键(A型)或借助非共价键相互作用(B型)而形成二聚体多肽，该二聚体的每个单体包含至少一个重链部分。
在一实施方案中，二聚体的一个多肽链的重链部分与该二聚体第二个多肽链的重链部分相同。在一实施方案中，发明所述二聚体的单体(或半体)都是相同的。在另一实施方案中，它们是不同的。例如，每个单体可能包含不同的靶结合位点。
在一实施方案中，本发明的二聚体是通过共价相互作用(例如二硫键)连在一起的。在一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是两个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是三个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是四个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是五个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是六个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是七个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是八个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是九个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选是十个二硫键连在一起的。在进一步的实施方案中，本发明的二聚体不是通过二硫键连在一起的，而是借助例如非共价相互作用。
多肽的重链部分可以来源于不同免疫球蛋白分子。例如多肽的重链部分可以包含来源于IgG1分子的CH1区和来源于IgG3分子的绞链区。在另一个实施例中，所述重链部分可以包含这样的绞链区，该绞链区部分来源于IgG1分子，部分来源于IgG3分子。在另一个实施例中，重链部分可以包含嵌合绞链，其部分来源于IgG1分子，部分来源于IgG4分子。
本文中，名词“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选的，所述轻链部分包含至少一个VL或CL结构域。
在一实施方案中，本发明的多肽包含不是来源于Ig分子的氨基酸序列或者一或多个部分。示范性的修饰在下文有更详细的描述。例如，在一实施方案中，本发明的多肽可以包含柔性的接头序列。在另一实施方案中，所述多肽可以被修饰从而添加一或多个功能部分(例如，PEG、药物、前药，和/或可检测标记)。
″嵌合″蛋白质包含连接了第二氨基酸序列的第一氨基酸序列，而天然情况中，它们不会连在一起。所述氨基酸序列可能在正常情况下存在于分开的蛋白质中，这些蛋白质在融合多肽中被凑到一起；或者它们通常就存在于相同蛋白质中，但在融合多肽中处于新的排列方式。制备嵌合蛋白质可以通过例如化学合成，或者通过创造出按所需位置关系编码的多核苷酸并进行翻译。示范性的嵌合多肽包括本发明的融合蛋白质和嵌合绞链连接肽。
在一实施方案中，本发明的结合多肽是一个融合蛋白质。在一实施方案中，本发明的融合蛋白是包含结合结构域(该结构域含有至少一个结合位点)和二聚体化结构域(该结构域含有至少一个重链部分)的嵌合分子。所述重链部分可以来自任何免疫球蛋白，比如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD或IgM。在一实施方案中，该融合蛋白还包含合成的连接肽。
在本发明的另一实施方案中，结合分子是″抗体-融合蛋白嵌合体”。这些分子包含的分子结合了抗体的至少一个结合结构域和至少一个融合蛋白。优选的，两个多肽之间的界面是免疫球蛋白分子的CH3区。
名词″异源″在用于多核苷酸或多肽时，意味着该多核苷酸或多肽来源于与之进行比较的实体的其它部分基因型不同的实体。例如，异源多核苷酸或抗原可以来源于不同物种、不同细胞型，或不同个体的相同细胞型。
名词″配体结合区″或“配体结合部分”用于本文是指任何天然受体(例如，细胞表面受体)或该受体的任何区域或衍生物，这些区域或衍生物保持了至少一定性质的配体结合能力，优选保持了相应天然受体的生物活性。
名词″受体结合区″或“受体结合部分”用于本文是指任何天然配体或该配体的任何区域或衍生物，这些区域或衍生物保持了至少一定性质的受体结合能力，优选保持了相应天然配体的生物活性。
在一实施方案中，本发明的结合分子是“抗体”或“免疫球蛋白”分子，例如天然抗体或免疫球蛋白分子(或其抗原结合片段)，或者基因工程化抗体分子，它们结合抗原的方式与抗体分子类似。本文中，名词″免疫球蛋白″包括这样的多肽，无论是否具备任何相关的特异免疫反应性，它都有组合在一起的两条重链和两条轻链。″抗体″是指那些对目标抗原(例如，肿瘤相关抗原)有明显的已知特异免疫反应活性的组合。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间有或没有链间共价键。脊椎动物***的基本免疫球蛋白结构已有了较好的理解。
如下文将详细讨论的，一般意义上名词“免疫球蛋白”包含可以从生物化学属性加以区别的5类不同抗体。抗体的所有五个种类均在本发明的范围内，以下讨论一般是针对免疫球蛋白分子中的IgG类。就IgG而言，免疫球蛋白包含两个相同的分子量约23,000道尔顿的轻链多肽链，和两个相同的分子量为53,000-70,000的重链。这四条链通过二硫键连接成Y形构型，其中轻链从“Y”的开口处开始，一直延续到可变区承托着重链。
轻链和重链均被划分成结构和功能同源的一些区域。名词″恒定″和″可变″是就功能而言的。就此而言，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变区均参与决定抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物特性，比如分泌、经胎盘传递、Fc受体结合、补体结合等。传统上，恒定区结构域的编号随着它们离抗原结合位点或抗体的氨基端更远而增加。N末端是可变区，C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
本文中，名词“可变区CDR氨基酸残基”包括利用基于序列或结构的方法鉴定到的CDR或互补性决定区中的氨基酸。本文中，名词″CDR″或″互补性决定区″意味着可见于重链和轻链多肽之可变区的非连续性抗原结合部位。这些特定区域已由Kabat等(J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Sequences of protein ofimmunological interest.(1991))、Chothia等(J.Mol.Biol.196：901-917(1987))以及MacCallum等(J.Mol.Biol.262：732-745(1996))描述过，在这些文献中，定义包括了在相互之间进行比较时，氨基酸残基重叠或亚组。我们列出了涵盖以上引用的每个文献所定义的CDR的氨基酸残基进行比较。优选地，名词“CDR”是Kabat在序列比较的基础上所定义的CDR。
CDR定义 MacCallum3
Kabat1 Chothia2
VH CDR1VH CDR2VH CDR3VLCDR1VLCDR2VLCDR3 31-3550-6595-10224-3450-5689-97 26-3253-5596-10126-3250-5291-96 30-3547-5893-10130-3646-5589-96
1残基编码按照Kabat等的***命名法，同上
2残基编码按照Chothia等的命名法，同上
3残基编码按照MacCallum等的命名法，同上本文中，名词“可变区框架(FR)氨基酸残基”是指那些位于Ig链的框架区中的氨基酸。用于本文的名词“框架区”或“FR区”包括属于可变区，但不属于CDR(例如，按照Kabat对CDR的定义)的氨基酸残基。因此，可变区框架约长100-120氨基酸，但只包括CDR之外的那些氨基酸。作为重链可变区和Kabat等定义的CDR的具体例子，框架区1对应涵盖氨基酸1-30的可变区结构域；框架区2对应涵盖氨基酸36-49的可变区结构域；框架区3对应涵盖氨基酸66-94的可变区结构域；框架区4对应从氨基酸103到可变区末端的可变区结构域。轻链框架区类似地被每个轻链可变区CDR分隔开。类似的，采用Chothia等或者McCallum等对CDR的定义，框架区被上面分别描述的CDR末端分隔开。在优选实施方案中，CDR是按照Kabat的定义。
在天然抗体中，每个单体抗体中的六个CDR是短的非连续氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现其三维构型时，这些序列处于特异性的位置从而构成抗原结合位点。重链和轻链可变区其它部分的氨基酸序列的分子间差异小，被命名为框架区。框架区基本上采取β-折叠构型，CDR形成连接β折叠的一些环，在一些情况中构成β折叠的一部分。因此，这些框架区形成了一个支架，通过链间、非共价相互作用保证六个CDR处于正确的方位。被定位的CDR所构成的抗原结合位点界定出一个与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这一互补表面会促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地鉴定出CDR的位置。
如前文所述，各个免疫球蛋白类型的恒定区亚基结构和三维构型是人们熟知的。本文中，名词“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，名词“CH1区”包括免疫球蛋白重链的第一个(最氨基端的)恒定区结构域。CH1区与VH结构域相邻，并且处于免疫球蛋白重链分子中绞链区的氨基端。
本文中，名词“CH2区”包括重链分子的一部分，按照常规的编号体系，该部分约从例如抗体的残基244延伸到残基360(残基244到360，Kabat编号体系；残基231-340，EU编号体系，Kabat EA et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.Bethesda，US Department of Health and HumanServices，NIH.1991)。CH2区的独特之处在于它不与其它结构域紧密配对。而是在完整的天然IgG分子中，有两个N-连接的分支碳水化合物链***到两个CH2区之间。还有很多报道称CH3区从CH2区延伸到IgG分子的C末端，包含约108个残基。
本文中，名词“绞链区”包括重链分子中连接CH1区和CH2区的部分。绞链区包含约25个残基，它是柔性的，因此两个N末端抗原结合区可以独立移动。绞链区可以进一步划分成三个不同的结构域：上游、中间和下游绞链区(Roux et al.J.Immunol.1998 161：4083)。
轻链分为kappa或lambda(K，λ)。每个重链种类可以组合kappa或lambda轻链。一般来说，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程化宿主细胞产生时，轻链和重链是共价结合在一起的，两个重链的″尾巴″部分通过共价二硫键或非共价键连在一起。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉末端的N端到每个链的底部的C末端。本领域技术人员知道重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚型(例如，γ1-γ4)。重链的特性决定了抗体的种类分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已被很好的研究过，并且人们知道它们具有特定的功能。参照本文的公开内容，技术人员可以容易地看出这些种类和亚型的修饰版，因此这些修饰版本也属于本发明的范围。
如上文所述，可变区使得抗体有选择性地识别并特异结合抗原的表位。这就是说，抗体的VL结构域和VH结构域结合起来形成了决定三维的抗原结合位点的可变区。这一四级抗体结构构成了位于Y构型每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点是由位于每个VH和VL上的三个互补决定区(CDR)界定的。
名词“片段”是指抗体或抗体链的一部分或组成部分，其包含的氨基酸残基比完整或整个抗体或抗体链要少。名词“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的一个多肽片段，该片段能结合抗原或与完整抗体(即它所来源的完整抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。本文中，名词抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如，抗体轻链(VL)、抗体重链(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段和单结构域抗体片段(DAb)。可以将完整抗体或抗体链通过例如化学或酶法处理来获得所述片段，或者通过重组手段。
本文中，名词“结合位点”包含多肽这样的区域，其负责选择性地与目标分子(例如，抗原、配体、受体、底物或抑制剂)结合。结合结构域包含至少一个结合位点。示范性的结合结构域包括抗体可变区、配体的受体结合区、受体的配体结合区或者酶反义中心。
本文中，名词“价”是指多肽中可能的靶结合位点数目。每个靶结合位点特异结合一个靶分子或者靶分子上的特定位点。当多肽包含一个以上靶结合位点时，每个靶结合位点可以特异结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的配体或不同的抗原，或者同一抗原上的不同表位)。这里讨论的结合分子有至少一个针对人Cripto分子的结合位点。
名词“特异性”是指与指定目标特异结合(例如与之发生免疫反应)的能力。多肽可以是单特异性，含有一或多个特异结合靶分子的结合位点；或者多肽可以是多重特异性的，含有两个或更多个特异结合相同或不同靶分子的结合位点。
在一实施方案中，本发明的结合分子对一个以上靶分子有特异性。例如，在一个实施例中，本发明的多特异性结合分子能结合Cripto和肿瘤细胞上表达的第二个分子。本领域已知这样的包含抗原结合位点的示范性抗体，其中所述结合位点能与肿瘤细胞上表达的抗原发生结合，可以在本发明的结合分子中包括来自这类抗体的一或多个CDR。这类抗体的例子包括：2B8、Lym1、Lym2、LL2、Her2、B1、MB1、BH3、B4、B72.3、5E8和5E10。在一个优选实施方案中，本发明的多肽是能结合CD20的C2B8抗体。在另一个优选实施方案中，本发明的多肽是能识别TAG72的CC49抗体。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含一个连接肽。发明所述连接肽是合成的。本文中，名词“合成的”涉及到多肽时包括含有非天然氨基酸序列的多肽。例如，是天然多肽的修饰形式的非天然多肽(例如，包含添加、取代或删除这样的突变)，或者该多肽包含第一氨基酸序列与(是或不是天然的)第二氨基酸序列以氨基酸的线性顺序连接在一起，而它们在自然界中不是天然连接在一起的。
本发明的连接肽将发明所述结合分子的两个结构域(例如，结合结构域和二聚体化结构域)连在一起。例如，连接肽将重链部分连到含有结合位点的结合结构域上。在一实施方案中，连接肽以多肽链的线性氨基酸顺序连接着两个重链恒定区，比如CH1和CH2区，CH1和CH3区；绞链区和CH1区；绞链区和CH3区；VH和绞链区，或者CH3区和非免疫球蛋白多肽)。优选的，这类连接肽给结合分子提供了柔性，并促进借助二硫键发生二聚体化。在一实施方案中，本发明的连接肽被用来代替一或多个重链结构域(例如，结构域删除的构建体中至少恒定区结构域的一部分(例如，至少CH2区的一部分)和/或至少绞链区的一部分(例如，至少下游绞链区结构域的一部分))。例如，在一实施方案中，VH结构域与CH3区通过连接肽融合在一起(连接肽的C末端连到CH3区的N末端，连接肽的N末端连到VH结构域的C末端)。在另一实施方案中，VL结构域与CH3区通过连接肽融合在一起(连接肽的C末端连到CH3区的N末端，连接肽的N末端连到VL结构域的C末端)。在另一实施方案中，CH1区与CH3区通过连接肽融合在一起(连接肽的C末端连到CH3区的N末端，连接肽的N末端连到CH1区的C末端)。
在一实施方案中，合成连接肽包含恒定区结构域的一部分。例如，在一实施方案中，代替CH2区的连接肽可能包含CH2区的一部分。
在一实施方案中，连接肽包含甘氨酸-丝氨酸接头，或由该接头构成。本文中，名词“甘氨酸-丝氨酸接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基构成的肽。甘氨酸/丝氨酸接头的例子包含氨基酸序列GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：8)。在一实施方案中，本发明的连接肽包含至少部分(例如，来源于IgG1、IgG3或IgG4分子的)上游绞链区、至少部分(例如，来源于IgG1、IgG3或IgG4分子的)中间绞链区以及一系列甘氨酸/丝氨酸氨基酸残基(例如，甘氨酸/丝氨酸接头，比如GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：8))。在一实施方案中，与天然IgG1或IgG3绞链区相比，所述连接肽包含一或多个氨基酸取代。在另一实施方案中，连接肽包含比如WO02/060955中描述的氨基酸序列。连接肽在下文有更详细的描述。
本文中，名词“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含一个巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥。在多数天然IgG分子中，CH1和CL区是通过二硫键连接的，两个重链是通过对应于Kabat编号***的239和242位点(EU编号体系的位点226或229)的两个二硫键连接的。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含抗体结合位点。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子是全长抗体分子。在另一实施方案中，本发明的结合分子是抗体分子的片段。在另一实施方案中，本发明的结合分子是修饰或合成的抗体分子。
本发明的结合分子可以利用本领域已知的技术来制备。在一实施方案中，发明所述多肽是“重组产生”的抗体分子，即是利用重组DNA技术产生的。制备抗体分子的示范性技术在下文有更详细的描述。
在一实施方案中，本发明的多肽是修饰的抗体。本文中，名词“经修饰的抗体”包括合成形式的抗体，即抗体被改变成非天然形式，例如包含至少两个重链部分，但不是两个完整的重链的抗体(比如，结构域删除抗体或微抗体)；被改变成可以结合两个或更多个不同抗原或单个抗体上的不同表位的多重特异性抗体(例如，双特异性、三特异性等)；重链分子与scFv分子相连等。ScFv分子是本领域已知的，在美国专利5,892,019中有描述。此外，名词“经修饰的抗体”包括多价形式的抗体(例如，三价、四价等抗体，它们能结合三个或更多个拷贝的相同抗原)。在另一实施方案中，本发明的结合分子是融合蛋白，其包含至少一个缺少CH2区的重链部分，并包含一个多肽的结合结构域，其中所述多肽含有受体配体对之一的结合部分。
在一实施方案中，名词“经修饰的抗体”根据本发明包括免疫球蛋白、抗体或它们的免疫反应片段或重组体，其中一或多个恒定区结构域的至少一部分被删除或改变，从而赋予了所希望的一些生化特性，比如与具有大体相同的免疫原性的完整的未改变抗体相比，其具有了非共价键地形成二聚体的能力、定位到肿瘤位点的能力增强，或者血清半衰期降低。在一个优选实施方案中，本发明的多肽是结构域删除的抗体，其包含与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但是缺少一或多个重链结构域的至少一部分。更优选的，经修饰的抗体的恒定区的一个整个结构域被删除，还要优选的是，全部或部分CH2区被删除。
在优选实施方案中，本发明的多肽不会在人体中引起有害的免疫应答。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含恒定区，例如重链恒定区，与野生型恒定区相比，该恒定区被修饰。这就是说，文中公开的发明所述多肽可能包含对三个重链恒定区结构域(CH1、CH2或CH3)中的一或多个，以及/或者轻链恒定区结构域(CL)的改变或修饰。所述修饰的例子包括在一或多个结构域中氨基酸的添加、删除或取代。
本文中，名词“恶性肿瘤(malignancy)”是指非良性的肿瘤或癌症。本文中，名词“癌症”包括以不受调节或失去控制的细胞生长为特点的恶性肿瘤(癌)。癌症的例子包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。名词“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，那些细胞没有转移到肿瘤开始的部位之外的位点)和继发性恶性肿瘤(例如，通过转移，即肿瘤细胞迁移到肿瘤开始的部位之外的位点形成的)。
本文中，名词“基于疏水相互作用将多肽分离开的介质”包括这样的介质，它们含有能共价结合到某种基质上的疏水基(例如，烷基或芳香基团)。这类介质可以用于借助溶剂和多肽表面上的可接近非极性基团以及介质的疏水配基之间的相互作用来分离所述多肽。这类介质的例子是TosohBioscience提供的Phenyl5PW-HR。
本文中，名词“导电性”包括用microSiemens/cm(以前是micromhos/cm)测量到的溶液的导电性。溶液的离子含量越高，其导电性越强。导电性可以利用领域熟知的技术很容易地测量到(例如，通过测量流过两个电极之间的电流)。
使用本发明的分离方法时，可以用pH在酸性到中性(例如从约pH3.5到接近中性)范围内的溶液。本文中，名词“接近中性pH”包括约为7的pH值。例如，在一实施方案中，发明的分离方法可以用pH约3、约4、约5、约6、约7或约8的溶液(例如缓冲液)来实现。优选，所述溶液的pH是约6或7.在一实施方案中，所述溶液的pH是约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9或约8.0。
本文中，名词“亲和基质”包括其上带有亲和配基的比如琼脂糖、带有可调节孔的玻璃，或者聚(苯乙烯二乙烯)苯的基质。所述亲和配基能够结合目的多肽，而杂质多肽不与亲和配基进行结合。目的多肽可以利用已知实验步骤从亲和基质上洗脱下来。
本文中，名词“工程化的”包括通过合成手段(例如，通过重组技术、体外肽合成、肽的酶法或化学偶联，或者这些技术的组合)对核酸或多肽分子进行操作。优选的，本发明的结合分子是工程化用于例如表达发明所述连接肽的。
本文中，名词″连接了″、″融合了″或者″融合″可以交换使用。这些名词是指通过包括化学偶联或重组这样的手段将两个以上的元件或成分联系到一起。″符合读框的融合″是指将两个或以上的开放阅读框(ORFs)连在一起形成一个连续的更长的ORF，连接方式保证了处于起始ORF的正确阅读框。因此，得到的重组融合蛋白是含有两个或以上片段的单个蛋白质，其中的片段对应由起始ORF编码的多肽(这些片段在自然界中通常不会连在一起)。虽然全部融合片段的阅读框被制成了连续的，这些片段可以被例如符合读框的接头序列物理上或立体地分隔开。
在讨论多肽时，″线性序列″或″序列″是指多肽中氨基酸的顺序处于从氨基到羧基的方向，其中序列中相邻的残基在该多肽的一级结构中是连续的。
本文中，短语“因给予结合分子而受益的受试者”包括这样一些受试者(比如哺乳动物受试者)，它们因给予所述结合分子而受益，这些结合分子是用来例如检测该结合分子能识别的抗原，以及/或者受益于用该结合分子进行处理从而减少或去除这些分子能够识别的目标物。例如，在一实施方案中，受试者可能受益于减少或去除循环***或血清中的可溶性或颗粒性分子(例如毒素或病原菌)，或者受益于减少或去除表达靶分子的细胞群(例如肿瘤细胞)。正如文中更详细的描述，所述结合分子可以以非偶联的形式使用，或者偶联到例如药物、前药或表位上来使用。
II.人源化
在一实施方案中，发明所述结合分子包含或来源于至少一个人源化的B3F6抗体可变区，例如轻链或重链可变区。
名词“人源化抗体”是指这样的抗体，其包含至少一个含有基本来自人抗体链(称为“受体抗体”)的可变区框架残基，和至少一个基本来自非人抗体(称为“供体抗体”)的互补性决定区(“CDR”)。如果存在恒定区，则恒定区也是基本或完全来自人免疫球蛋白。
小鼠B3F6的CDR如下表1所示：
表1：B3F6CDR序列(Kabat定义)
CDR L1 RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO：9
CDR L2 KVSNRFS SEQ ID NO：10
CDR L3 FQGSHVPLT SEQ ID NO：11
CDR H1 SYWIH SEQ ID NO：12
CDR H2 ENDPSNGRTNYNEKFKN SEQ ID NO：13
CDR H3 GPNYFYSMDY SEQ ID NO：14
在一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少一个B3F6抗体分子的重链或轻链CDR。在另一实施方案中，发明所述抗原结合分子包含至少两个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，发明所述抗原结合分子包含至少三个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，发明所述抗原结合分子包含至少四个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，发明所述抗原结合分子包含至少五个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，发明所述抗原结合分子包含至少6个来自B3F6抗体分子的CDR。在一实施方案中，所述至少一个CDR(或结合分子含有的一个以上B3F6CDR中的至少一个CDR)被修饰，因此其序列与天然B3F6分子的CDR不同，但保留了结合B3F6的能力。
人源化抗体可以利用重组DNA技术来制备，参见例如Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，86：10029-10033；Jones et al.，Nature，(1986)，321：522-25；Riechmann et al.，Nature，(1988)，332：323-27；Verhoeyen et al.，Science，(1988)，239：1534-36；Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，86：3833-37；美国专利5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370。
当已经选择了用于人源化的优选的非人供体抗体时，合适的人受体抗体可以得自，例如被表达的人抗体基因序列库、种系Ig序列或者几种人抗体共有序列。如果人可变结构域框架处于和CDR所来源的非人可变框架相同或类似的构型，则将该非人CDR替代到人可变区结构域框架中非常可能的结果是会保持它们的正确空间方向。实现这一点是通过从这样一些人受体抗体中获取人可变区，所述受体抗体的框架序列与CDR所来源的非人可变框架结构域有很高的序列同一性。重链和轻链可变框架区可以来源于相同或不同人抗体序列。优选的，人受体抗体保留了供体抗体的规范残基和界面残基。此外，优选人受体抗体在CDR环的长度上具有相当的类似性。参见Kettleborough et al.，Protein Engineering 4：773(1991)；Kolbinger et al.，Protein Engineering 6：971(1993)和Carter et al.，WO92/22653。
鉴定了供体抗体和合适的人受体抗体后，下一步是确定这些成分中的哪些残基应当被取代以便对所得人源化抗体的特性进行优化。通常，要用抗原结合所需要的非人供体免疫球蛋白轻链或重链中那些氨基酸的部分或全部(例如，一或多个CDR)来取代人受体抗体轻链或重链中的相应氨基酸。人受体抗体保留了不为抗原结合所需要的一些或全部氨基酸。一般来说，应当尽量减少将人氨基酸残基替代为小鼠的，因为引入小鼠残基会增加人体中抗体引发的人-抗鼠抗体(HAMA)反应的危险性。可以采用本领域认可的方法来测定免疫反应以便监测特定患者或进行临床试验时的HAMA反应。被给予人源化抗体的患者可以在接受该治疗的开始和过程中做免疫原性评价。可以利用本领域技术人员已知的方法(包括表面等离子共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析)检测患者血清样品中针对人源化治疗剂的抗体来测量HAMA反应。
如果需要，可以将人框架区的一或多个残基改变成小鼠抗体中相应位点的残基，从而保留人源化抗体对抗原的结合亲和性。这种改变有时被称为″回复突变″。根据对CDR构象和/或结合抗原的可能影响，挑选一些人可变区框架氨基酸残基来进行回复突变。用人可变框架区代替小鼠CDR区会造成构象限制，除非通过对一些氨基酸残基进行取代来纠正这一点，它会导致结合亲和性的丧失。
在一实施方案中，挑选用于回复突变的氨基酸残基可以利用本领域认可的技术，部分地通过计算机模拟来决定。通常，从免疫球蛋白链或其结构域的已知结构出发产生出分子模型。将待模拟链与三维结构(例如，X-射线结构)已知的链或结构域的氨基酸序列进行比较，选择表现出最高序列相似性的链或结构域为出发点来构建分子模型。对解决好的起始结构进行修饰，使之容许待模拟的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的氨基酸的不同。然后将修饰过的结构组装成复合免疫球蛋白。最后，通过能量最小化、确认所有原子相互之间保持适当的距离，以及键长和角度处于化学上可接受的范围来进一步改善模型。
在另一实施方案中，可以利用基于已有知识的方法或数据库分析来做人源化。例如，这类人源化策略可以根据Rosok等(Rosok MJ，et al.，1996.J.Biol.Chem.271：22611-22618)描述的方法，建立在目测和分析V区序列的基础上。鉴定出规范决定因素、表面残基和可能发生接触的残基。根据Chothia等(Chothia C and Lesk AM.1987.J.Mol.Biol.196：901-917)对CDR环的结构学定义、Kabat等(Kabat EA，Wu TT，Reid-Miller M，Parry HM，andGottesman KS.1987.Sequences of Protein of Immunological Interest，U.S.department of Health and Human Services，NIH，Bethesda，MD)对序列高变性的定义，以及MacCallum等(MacCallum RM，Martin ACR，and Thorton JM.1996.J.Mol.Biol.262：732-745)对可能的抗原接触残基的定义，来记录可能发生接触的残基并大概地做分类。将遵循Kabat编号和定义的小鼠CDR环全部移植到受体人框架上。鉴定出Padlan(Padlan EA.1991.Mol Immunol.28：489-498)所定义的堆积残基，并尝试按照Singer等(Singer II et al.1993.J.Immunol.150：2844-2857)描述的策略来保留这些堆积残基。框架序列中的每个残基被指定为Harris和Bajorath(Harris L and Bajorath J.1995.ProteinScience4：306-310)描述的抗体人源化中的低度、中等或高度“危险位点”。
一般来说，低危险位点保留人的残基。对于许多各不相同的中等和高度危险氨基酸位点可以参考公开的或私有的人源化抗体序列资料。在参考以前的人源化抗体序列时，要记录下含有人或小鼠(回复突变)氨基酸残基是否会产生功能性的结合活性。在考虑进行取代的情况中，可以参考氨基酸取代图谱(D.Bordo and P.Argos.1991.J.Mol.Biol.217：721-729)以便确认这些残基是功能上可以互换的。
也可以部分地通过研究特定位置上的氨基酸的特性，或者根据经验知道的特定氨基酸之取代或突变所造成的影响来挑选进行取代的氨基酸残基。例如，当非人可变区框架残基和选定的人可变区框架残基是不同的氨基酸，供体抗体中的氨基酸是规范残基、界面堆积残基，或者靠近结合位点的不常见或罕见残基时，通常应当将人框架氨基酸取代为来自非人供体抗体的对等的框架氨基酸。
在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人氨基酸残基回复突变为相应的小鼠氨基酸残基，其中该氨基酸残基是界面堆积残基。“界面堆积残基”包括按照例如Novotny和Haber(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4592-66(1985))定义的位于VL和VH之间的界面上的残基。
在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人氨基酸残基回复突变为相应的小鼠氨基酸残基，其中该氨基酸残基是规范残基。“规范残基”是已知对CDR构象非常重要的规范类型或结构类型(Tramontano et al.，J.Mol.Biol.215：175(1990)，该文章全文以参考文献的方式引入本文)中的那些保守框架残基。规范残基包括轻链中的2、25、27B、28、29、30、33、48、51、52、64、71、90、94和95，以及重链中的24、26、27、29、34、54、55、71和94残基。其它残基(例如，CDR结构决定残基)可以根据Martin和Thorton((1996)J.Mol.Biol.263：800)的方法来鉴定。
在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人氨基酸残基回复突变为相应的小鼠氨基酸残基，其中该氨基酸残基处于能够和CDR相互作用的位置。特别是，在许多抗体中，轻链中位点2、48、64和71的氨基酸以及重链中位点26-30、71和94(按照Kabat的编号)的氨基酸是已知能与CDR发生相互作用的。轻链位点35和重链位点103的氨基酸也有可能与CDR相互作用。
在例如美国专利5585089中提出了挑选进行取代的框架残基的示范性技术。那项专利中描述了几类可以被改变的人框架氨基酸。在一实施方案中，第2类氨基酸被回复突变为相应的小鼠残基。具体来说，第2类氨基酸是人受体免疫球蛋白框架中的不常见氨基酸(即，罕见氨基酸，该名词在文中表示在代表性数据库中，人重链(轻链)V区序列中低于约20％，通常低于约10％会在该位点出现这个氨基酸)，如果该位点的供体氨基酸对于人序列来说是典型的(即，常见，该名词在文中表示所述氨基酸出现在代表性数据库中约25％以上，通常是约50％以上的序列中)，则应当选择非人供体氨基酸(例如，小鼠氨基酸)，而不是人受体氨基酸。这个标准保证了人框架中的非典型氨基酸不会破坏抗体的结构。并且，通过用供体抗体中的氨基酸来代替不常见氨基酸，而该氨基酸碰巧是人抗体的典型氨基酸，则人源化抗体的免疫原性可能下降。
所有人轻链和重链可变区序列均被分别划分成相互之间同源性高、在一些关键位点有相同氨基酸的序列″亚群″(Kabat et al.，op.cit.)。在确定人受体序列中的氨基酸对于人序列来说是“罕见”还是“常见”的时候，经常优选只将相同亚群中的人序列考虑为受体序列。
在一实施方案中，第3类氨基酸被回复突变为相应的小鼠残基。属于第3类的残基在人源化免疫球蛋白链中与3个CDR中的一或多个相邻，可以选择供体氨基酸而非受体氨基酸。这些氨基酸特别可能与CDR中的氨基酸相互作用，因此如果选择受体中的，它们会使供体CDR变形而降低了亲和性。而且，相邻氨基酸可能与抗原直接相互作用(Amit et al.，Science，233，747-753(1986))，挑选供体中的这些氨基酸可能有益于保持原来抗体中提供亲和性的所有的抗原接触。
在一实施方案中，第4类氨基酸被回复突变成相应的小鼠残基。第4类氨基酸是这样一些氨基酸，通常在原来的供体抗体的三维模型中，CDR之外的一些氨基酸与CDR很近，有很大的可能性通过氢键、范德华力、疏水相互作用等与CDR中的氨基酸发生相互作用。在这些氨基酸位点，可能应当选择供体免疫球蛋白氨基酸，而非受体免疫球蛋白氨基酸。遵循这个标准的氨基酸一般有侧链原子和CDR中的一些原子距离在3埃以内，并且必须含有能与这些CDR原子通过比如上面列举的已知化学作用力发生相互作用的原子。
在可能形成氢键的原子的例子中，3埃是测量的它们的原子核的距离，但是对于不形成氢键的原子，3埃是测量的它们的范德华表面之间的距离。因此，在后一种情况中，被认为能发生相互作用的原子的原子核必须处于6埃以内(3+范德华半径之和)。许多情况中，原子核相距4或5或6_。确定某个氨基酸能否与CDR相互作用时，优选不要将重链CDR2的最后8个氨基酸认为是CDR的一部分，因为从结构来看，这8个氨基酸更象是框架的一部分。
框架中能与CDR氨基酸发生相互作用的氨基酸属于第4类，可以通过另一种方式进行区别。每个框架氨基酸的溶剂可及性表面积以两种方法计算：(1)在完整抗体中，和(2)在假象的去除了CDR的抗体分子中。这些数字之间约10平方埃或以上的明显不同表明框架氨基酸与溶剂的接触至少部分被CDR阻断，因此该氨基酸与CDR有相互作用。氨基酸的溶剂可及性表面积可以在抗体的三维模型的基础上，利用本领域已知的算法来计算(例如，Connolly，J.Appl.Cryst.16，548(1983)和Lee and Richards，J.Mol.Biol.55，379(1971))。框架氨基酸还可能偶尔通过影响另一个框架氨基酸的构象，使之与CDR发生接触，从而与CDR间接地相互作用。
已知在许多抗体中，框架中多个位点的氨基酸能够与CDR相互作用(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196，901(1987)、Chothia et al.，Nature342，877(1989)以及Tramontano et al.，J.Mol.Biol.215，175(1990)，这些文章全部以参考文献的方式引入本文)，特别是，轻链的位点2、48、64和71以及重链的26-30、71和94(按照Kabat的编号***，op.cit.)，因此这些氨基酸一般属于第4类。通常，本发明的人源化免疫球蛋白除此之外还包括属于第4类的供体氨基酸(当它们不同时)。轻链位点35以及重链位点93和103的氨基酸也可能与CDR有相互作用。与这一点一致的，在一实施方案中，人源化免疫球蛋白中可能包括一或多个供体氨基酸，而非受体氨基酸(当它们不同时)。另一方面，一些可能属于第4类的位点，比如轻链的前5个氨基酸，可能从受体免疫球蛋白中挑选而并不损失人源化免疫球蛋白的亲和性。
除了以上这些描述在什么情况下，人源化免疫球蛋白中的氨基酸应当取自供体的类别，人源化免疫球蛋白中的一些氨基酸如果落入第5类，它们既不能从供体也不能从受体中获取。如果供体免疫球蛋白中给定位点的氨基酸对于人序列来说是上文中定义的“罕见的”，受体免疫球蛋白中该位点的氨基酸对于人序列也是“罕见的”，则人源化免疫球蛋白中该位点的氨基酸可以选择人序列中的一些“典型”氨基酸。优选的选择是最常出现在与受体序列属于同一亚群之已知人序列的这个位点的氨基酸。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含三个B3F6轻链CDRs(CDRL1、CDRL2和CDRL3)和人轻链框架区。在一实施方案中，本发明的结合分子还包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的至少一个回复突变，所述残基是至少一个选自2和100的位点。在一实施方案中，本发明的结合分子还包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的一个回复突变，所述残基位于选自2和100的一个位点。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含位于人源化B3F6轻链的位点2和100的回复突变。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含位于人源化B3F6轻链的位点2的回复突变和至少另外一个回复突变。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含位于人源化B3F6轻链的位点100的回复突变和至少另外一个回复突变。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含三个B3F6重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和人重链框架区。在一实施方案中，发明所述结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的至少一个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的至少一个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的一个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的一个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的两个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的两个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的三个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的三个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的四个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的四个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的五个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的五个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的六个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的六个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的七个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的七个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的八个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的八个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1，48，67，71，73，81，82b，93和112的九个位点上，包含人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的九个回复突变。
在一实施方案中，本发明涉及B3F6抗体的人源化可变区，以及包含该人源化可变区的多肽。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含如SEQ ID NO：52中氨基酸1-112所示的CDR移植的轻链可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含如SEQ ID NO：55中氨基酸1-121所示的CDR移植的轻链可变区序列。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：47所示的轻链版本1可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：48所示的重链版本1可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQID NO：49所示的重链版本2可变区序列。
在另一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：50所示的轻链版本2可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：51所示的重链版本3可变区序列。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：52所示的CDR移植的轻链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：53所示的版本1轻链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：54所示的版本2轻链。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：55所示的CDR移植的重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：56所示的版本1重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：57所示的版本2重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：58所示的版本3重链。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：59所示的CDR移植的结构域删除重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ IDNO：60所示的版本1结构域删除重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：61所示的版本2结构域删除重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：62所示的版本3结构域删除重链。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含如SEQ ID NO：63所示的CDR移植的轻链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：64所示的版本1轻链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：65所示的版本2轻链序列，其包括任选的信号序列。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：66所示的CDR移植的重链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：67所示的版本1重链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：68所示的版本2重链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQID NO：69所示的版本3重链序列，其包括任选的信号序列。
在一实施方案中，将包含小鼠B3F6CDR和人框架区的轻链与包含小鼠B3F6CDR和人框架区的重链结合在一起。在一实施方案中，将包含小鼠B3F6CDR和人框架区的轻链与人源化B3F6重链组合在一起，后者含有人框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的至少一个回复突变。在一实施方案中，将含有至少一个人框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变的人源化B3F6轻链，与含有至少一个人框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变的人源化B3F6重链组合在一起。在另一实施方案中，将这样的轻链与人源化B3F6重链组合在一起，所述轻链包含小鼠B3F6CDR和人框架区以及至少一个从人框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变。示范性的组合方式在以下实施例中有更详细的描述。例如，在一实施方案中，实施例中的人源化L1轻链与实施例中的H1重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第1个版本。在另一实施方案中，实施例中的人源化L1轻链与实施例中的H2重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第2版本。在另一实施方案中，实施例中的人源化L1轻链与实施例中的H3重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第3版本。在另一实施方案中，实施例中的人源化L2轻链与实施例中的H1重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第4个版本。在另一实施方案中，实施例中的人源化L2轻链与实施例中的H2重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第5个版本。在另一实施方案中，实施例中的人源化L2轻链与实施例中的H3重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第6个版本。对本领域普通技术人员来说，显然这些组合方式都在本发明的范围内。
在一实施方案中，本发明的结合分子是由根据布达佩斯条约，保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，10801University Boulevard，Manassas，VA，20110)，保藏号为PTA-7284的细胞系产生的抗体。
II.结合分子的形式
A.抗体或其部分
在一实施方案中，本发明的结合分子是抗体分子。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子是能结合Cripto的人源化抗体或其部分。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含人源化抗体的抗原结合片段，该片段能够结合Cripto，以及第二个抗体的抗原结合片段。
利用本领域认可的实验方法，例如优选通过在哺乳动物中多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如，纯化的肿瘤相关性抗原或含有该抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂来培育抗体。这类接种通常会引发包括由激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体在内的免疫应答。虽然可以从动物血清中收集所得抗体来获得多克隆制剂，一般更希望从脾、***或外周血中分离单个淋巴细胞以便得到单克隆抗体(MAbs)的均一制剂。优选的，所述淋巴细胞得自脾。
在这个众所周知的方法(Kohler et al.，Nature，256：495(1975))中，将来自被注射了抗原的哺乳动物中相对生命期短或者会死亡的淋巴细胞与永生的肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，从而制备出杂交细胞或“杂交瘤”，它们既可以无限增殖又能产生遗传编码的B细胞抗体。经过挑选、稀释并与含有特定基因的单个株重新生长将所得杂交瘤分离成单个基因株以便形成单种抗体。它们产生的抗体均一地抗目的抗原，就其纯基因家系而言，被称为″单克隆的″。
将这样制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，优选培养基含有一或多种能够抑制未融合之亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。本领域技术人员知道，用于形成、挑选和培养杂交瘤的试剂、细胞系和培养基可以从多种来源购买，标准方法已建立完善。通常，要检测杂交瘤生长所用培养基中产生的针对目的抗原的单克隆抗体。优选的，通过免疫沉淀或者体外测试法(比如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA))来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。鉴定到能产生所需特异性、亲和性或/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可以经有限稀释步骤进行亚克隆并用标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp
59-103(Academic Press，1986))。更好的是通过常规纯化方法，比如蛋白A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中分离出来。
在另一实施方案中，可以利用常规步骤(例如，利用能够特异结合编码小鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离出编码所需单克隆抗体的DNA并测序。分离并亚克隆的杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。一经分离，DNA可以引入表达载体，然后将后者转染到否则不会产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞中，比如E.coli细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体地说，可以按照Newman等1995年1月25日提交的美国专利5,658,570(全文以参考文献方式引入本文)中描述的，用分离的DNA(可以是如本文描述的合成DNA)来克隆恒定和可变区序列以便制备抗体。基本上，该专利详述了从所选细胞中提取RNA、转换成cDNA以及用Ig特异引物经PCR扩增。适用于该目的的引物在美国专利5,658,570中也有描述。如下文更详细描述的，表达所需抗体的转化细胞可以较大量地培养以便提供免疫球蛋白的临床和商业供应。
本领域技术人员还会理解，编码抗体或抗体片段(例如，抗原结合位点)的DNA还可以例如利用pd噬菌体或Fd噬菌粒技术，来源于抗体噬菌体文库。示范性的方法在例如EP 368 684 B1、美国专利5,969,108、Hoogenboom，H.R.and Chames.2000.Immunol.Today 21：371、Nagy et al.2002.Nat.Med.8：801、Huie et al.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：2682、Lui et al.2002.J.Mol.Biol.315：1063中有描述，这些文献均以参考文献的方式引入本文。有些出版物(例如Marks et al.Bio/Technology10：779-783(1992))描述过通过链改组来产生高亲和性人抗体、以及用组合感染和体内重组作为构建大噬菌体文库的策略。在另一实施方案中，可以利用核糖体展示代替噬菌体作为展示平台(参见例如，Hanes et al.2000.Nat.Biotechnol.18：1287；Wilson et al.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：3750；或Irving et al.2001J.Immunol.Methods248：31)。在再一实施方案中，可以筛选细胞表面文库来获得抗体(Boder et al.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：10701；Daugherty et al.2000J.Immunol.Methods 243：211)。这些提供了用于分离以及随后克隆单克隆抗体的传统杂交瘤技术的替代方法。
在本发明的另一实施方案中，发明所述结合分子的结合位点可以由人抗体或基本上是人抗体提供。人抗体或基本上是人抗体可以在不能自身产生免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中制备(参见例如，美国专利6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369，均以参考文献方式引入本文)。例如，有人描述过将嵌合和种系突变小鼠中抗体的重链连接区做纯合删除，导致内源抗体产生被完全抑制。将人免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中，使得它在抗原攻击时产生人抗体。另一种优选的利用SCID小鼠产生人抗体的手段在美国专利5,811,524中有描述，该专利以参考文献方式引入本文。如果与这些人抗体相关的基因物质也能如文中所述进行分离和操作会很有益。
还有一种高效率产生重组抗体的途径在Newman，Biotechnology，10：1455-1460(1992)中公开了。具体来说，这个技术使得产生了含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类源化抗体。该文献以引用的方式全文引入本文。此外，这一技术在共同转让的美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中也有描述，这些专利均以参考文献的方式引入本文。
在另一实施方案中，可以通过显微操作挑选淋巴细胞，并分离可变区基因。例如，可以从接种的哺乳动物中分离外周血单核细胞，体外培养约7天。在培养物中筛选符合标准的特异IgG。分离阳性孔中的细胞。经FACS分离单个产生Ig的B细胞，或者在补体介导的溶血斑实验中鉴定它们。产生Ig的B细胞可以显微操作到一个试管中，利用例如RT-PCR扩增VH和VL基因。将VH和VL基因克隆到抗体表达载体中，转染到细胞(例如，真核或原核细胞)内进行表达。
此外，用于产生发明所述结合分子的基因序列可以得自许多不同来源。例如，象上面大量讨论过的，许多人抗体基因是公众可以获取的保存形式。许多抗体和抗体编码基因的序列已被公开了，可以利用本领域认可的技术由这些序列化学合成合适的抗体基因。与本发明这一方面相符的寡核苷酸合成技术是技术人员熟知的，可以利用任何商品自动合成仪来实现。另外，文中给出的编码不同种类重链和轻链的DNA序列可以通过商业的DNA合成服务获得。然后可以将利用任何以上方法得到的遗传物质进行改变或合成从而得到本发明的多肽。
替代的，可以用技术人员熟知的技术挑选和培养抗体产生细胞系。这类技术在许多实验室手册和主流出版物中都有描述。就此而言，适用于本发明的技术在Current ProtocolsinImmunology，Coligan et al.，Eds.，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)中有描述，该书以参考文献的方式全文引入本文，包括补充内容。
应当进一步意识到本发明的范围进一步覆盖了抗原结合DNA序列的所有等位基因、变体和突变。
众所周知，RNA可以从起始杂交瘤细胞或其它转化细胞中通过标准技术分离到，所述技术是比如异硫氰酸胍提取和沉淀，随后进行离心或层析。如果需要，可以通过标准技术(比如在oligo dT纤维素上进行层析)从总RNA中分离mRNA。合适的技术是本领域所熟悉的。
在一实施方案中，编码抗体轻链和重链的cDNA可以同时或分别用逆转录酶和DNA聚合酶，根据公知方法制备。可以在已公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的基础上，用共有恒定区引物或更特异的引物引发PCR。如上面讨论过的，PCR也可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况中，可以用共有引物或更大的同源探针，比如小鼠恒定区探针来筛选文库。
可以采用领域已知的技术从细胞中分离DNA(通常是质粒DNA)，并按照在例如前面与重组DNA技术相关的参考文献中详细描述的标准公知技术做限制酶切图谱和测序。当然，根据本发明，在分离或随后的分析过程中，DNA可以是合成的。用于发明所述结合分子的示范性抗体或其片段包括能够识别文中给出的靶物质的抗体。
在以些实施方案中，可用领域公知技术制备抗体的抗原结合片段。
B.经修饰的抗体
在一实施方案中，本发明的结合分子包含被修饰的抗体，或由经修饰的抗体组成，即来源于抗体的分子，但不是野生型抗体，例如微抗体(微抗体可以用领域中已描述过的方法来制备(参见，例如美国专利5,837,821或WO94/09817A1)等)。
1.结构域删除抗体
在一实施方案中，发明所述结合分子包含的合成恒定区有一或多个结构域被部分或完全删除(“结构域删除抗体”)。在特别优选的实施方案中，适用修饰抗体包含结构域删除的构建体或变体，其中整个CH2区被去除(ΔCH2构建体)。对于其它优选实施方案，可以用一个短的连接肽来取代被删除的结构域以便可变区具有柔性并能自由移动。本领域技术人员理解，由于CH2区对抗体分解代谢速率的调节作用，这样的构建体是特别优选的。
在另一实施方案中，本发明的经修饰的抗体是CH2区删除抗体。结构域删除构建体可以利用编码IgG1人恒定区的载体(例如，购自IDECPharmaceuticals，San Diego)来获得(参见，例如WO02/060955A2和WO02/096948A2)。这个示范性的载体被工程化删除了CH2区，提供了一种表达结构域删除IgG1恒定区的合成载体。然后编码小鼠C2B8抗体、5E8抗体、B3F6抗体的可变区，或人源化CC49抗体的可变区的基因被***到该合成载体并克隆。当在转化细胞中表达时，这些载体分别提供了C2B8.ΔCH2、5E8.ΔCH2、B3F6.ΔCH2或huCC49.ΔCH2。这些构建体表现出许多特性，使得它们成为了特别有吸引力的单体亚基候选对象。人源化结构域删除的B3F6抗体也有制备，并在随后的实施例中有更详细的描述。
我们要指出的是这些示范性的构建体被工程化了，使得CH3区直接融合到相应发明所述多肽的绞链区。在其它构建体中，可能希望在绞链区和合成CH2和/或CH3区之间提供一个间隔肽。例如，可以表达这样的适用构建体，其中CH2区被删除，剩下的CH3区(合成或非合成的)借助5-20个氨基酸的间隔肽连接了绞链区。例如，可以加上这样的间隔肽来保证恒定结构域的调节元件处于游离状态，具有可及性，或者绞链区保持灵活。例如，可以使用这样一种结构域删除的B3F6构建体，该构建体有取代了CH2区的短氨基酸间隔GGSSGGGGSG(SEQ.ID No.8)和下游绞链区(B3F6.ΔCH2[gly/ser])。其它示范性的连接肽如表2所示。这些连接肽可以用于本发明的任何多肽。优选的，所述连接肽用于缺少CH2重链结构域的多肽。优选的，任何适合本发明的接头是相对非免疫原性的，不会抑制发明所述多肽的非共价键结合。
在一实施方案中，只要能够在单体亚基之间形成共价或非共价键连接，发明所述多肽可以包含这样的免疫球蛋白重链，该重链带有少数甚至单个氨基酸删除或取代。例如，在CH2区的选定区域发生单氨基酸突变可能就足够极大地减少Fc结合，从而提高对肿瘤的定位。类似的，可能希望直接删除一或多个恒定区结构域中控制效应物功能(例如，补体结合)的那部分。这种部分删除恒定区的做法可能会改善抗体的选定特性(血清半衰期)，而与目标恒定区结构域相关的其它所需功能保持完整。而且，如上文提到的，公开的抗体的恒定区可以是合成的，通过一或多个氨基酸的突变或取代来增强所得构建体的特性。从这一点来说，有可能将保守结合位点(例如，Fc结合)所赋予的活性破坏掉，而基本上维持被修饰抗体的构型和免疫原性特点。但是，其它优选实施方案可能包含在恒定区中添加一或多个氨基酸以便增强所需特性(比如效应物功能)或者实现更强的细胞毒素或碳水化合物附着。在这些实施方案中，可能会希望***或重复来源于选定恒定区结构域的特异序列。
本领域已知恒定区介导着多种效应物功能。例如，补体的C1组分与抗体结合会激活补体体系。补体的活化在调理作用和病原菌细胞的裂解中非常重要。补体的活化还能刺激炎症反应，并可能参与自身免疫超敏感性。此外，随着抗体Fc区域的Fc受***点结合到细胞上的Fc受体(FcR)，抗体即借助Fc区域结合到细胞上。许多Fc受体针对着不同种类的抗体，包括IgG(gamma受体)、IgE(epsilon受体)、IgA(alpha受体)和IgM(mu受体)。抗体结合细胞表面上的Fc受体引发大量重要和多样的生物反应，包括胞吞和破坏被抗体包被的颗粒、清除免疫复合体、杀伤细胞(被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)对包被抗体的靶细胞的水解、释放炎性介质、胎盘转移以及控制免疫球蛋白的产生。
在一实施方案中，可以利用IgG4抗体的恒定区来消除或降低效应物功能，该恒定区被认为不会锐减靶细胞；或者利用本领域已知技术(例如，美国专利5585097)制备这样的Fc变体，这些变体中Fc区域里对于效应物功能很关键的残基被突变。例如，恒定区结构域的删除或灭活(通过点突变或其它手段)可能减少Fc受体结合循环***中的经修饰的抗体，从而提高对肿瘤的定位。其它情况中，可能与本发明一致的恒定区修饰会减缓补体结合，因此降低了其血清半衰期以及它和所偶联的细胞毒素的非特异联系。然而，可以用恒定区的其它修饰来改变二硫键或寡糖部分，从而使其定位因为抗原特异性或抗体柔性增加而增强。更一般来说，本领域技术人员会认识到如本文的描述进行修饰的抗体可能产生许多微妙的效果，这些效果可能或不能很容易地得到赞赏。但是，这些修饰所产生的生理特性、生物可得性及其它生化效果(比如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期)不需要经过过多实验，可以容易地利用已知免疫技术测量和定量。
在一实施方案中，可以用本领域已知技术由整个前体或亲本抗体制得修饰形式的抗体。示范性技术在下文有更详细描述。
包含重链的多肽可以包含或不包含不是来源于免疫球蛋白分子的其它氨基酸序列或部分。以下更详细地描述了这类修饰。例如，在一实施方案中，发明所述多肽可能包含一个柔性接头序列。在另一实施方案中，多肽可以被修饰以添加一个功能部分，比如药物或PEG。
2.双特异性结合分子
在一实施方案中，本发明的结合分子是双特异性的。例如，在一实施方案中，所述结合分子结合了Cripto和另一个分子。在一实施方案中，本发明的双特异性结合分子可能包含附加的结合位点，后者能结合一或多个肿瘤分子或与肿瘤细胞生长相关的分子。在一实施方案中，用于赘生性紊乱，公开多肽的抗原结合位点(即，可变区或免疫反应片段或它们的重组体)结合到位于恶性肿瘤部位的选定肿瘤相关分子。考虑到已表达过的与赘生肿瘤细胞生长相关的分子的数量和相关抗体的数量，本领域技术人员应意识到，要求保护的结合分子的结合位点可以来源于大量完整抗体之一。更具体来说，用于本发明的结合位点可以得自或来源于任何抗体(包括文献中已有报道的)，只要该抗体能和与选定情况相关的靶分子或标记物反应。此外，用于产生本文公开的多肽的亲本或前体抗体，或者它们的片段可以是来自小鼠的、来自人的、嵌合的、人源化的、来自非人灵长类的或灵长类化的。在其它优选实施方案中，本发明的多肽可以包含具有本文描述的被改变恒定区的单链抗体构建体(比如美国专利5892019中公开的那些，该专利以参考文献的方式引入本文)。因此，这些类型的抗体任何一种都可以用来获得能引入发明所述双特异性分子的结合位点。
本文中，″肿瘤相关分子″意味着任何通常与肿瘤细胞联系在一起的抗原或靶分子，即其表达程度与正常细胞相同或更高。更广泛的说，肿瘤相关分子包括任何这样的分子，这些分子即使在非恶性肿瘤细胞上也有表达，它们使得免疫反应抗体能定位到赘生性细胞上。这些分子可能相对具有肿瘤特异性，其表达限于恶性肿瘤细胞表面。替代的，可能在恶性和非恶性肿瘤细胞上都能发现这类分子。例如，CD20是一种在恶性和非恶性B细胞表面上都有发现的全B抗原，它已被证实是治疗非何杰金氏病的免疫治疗抗体的极其有效的一个目标。
在这方面，全T细胞抗原，比如CD2、CD3、CD5、CD6和CD7也包含本发明意义中的肿瘤相关分子。其它示范性肿瘤相关分子包括，但不限于Lewis Y、MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV16、HPV E6&E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、HLA-DR、EGF受体和HER2受体。许多情况中，这些抗原每一个的免疫反应抗体在文献中已有表达。本领域技术人员会理解，与本发明一致的，这些抗体每一个都可以作为发明所述多肽的前体。
相应的，发明所述结合位点可以来源、产生自能和肿瘤相关分子反应的许多抗体之一，或者由该抗体制成。在一实施方案中，所述结合位点是合成或结构域删除的抗体，这些抗体来源于利用常见基因工程技术将一或多个恒定区结构域的至少一部分删除或改变，从而提供所需的生化特性，比如降低的血清半衰期。更具体的说，如下文会举例说明的，本领域技术人员可以容易地分离到所述抗体可变区和/或恒定区相应的基因序列，将适当的核苷酸删除或改变从而提供本发明的多肽作为符合本发明的单体亚基。如果能够利用已成熟的方法将本发明的适用多肽以临床或商业规模进行表达和产生则更好。
以前报道过的能与肿瘤相关分子反应的抗体可以按照本文的描述做改变，从而给发明所述多肽提供一或多个结合位点。可以用来给所述多肽提供结合位点的示范性抗体(或者结合位点可以来源的抗体)包括，但不限于2B8和C2B8(Zevalin_and Rituxan_，IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego)、Lym1和Lym2(Techniclone)、LL2(Immunomedics Corp.，New Jersey)、HER2(Herceptin_，Genentech Inc.，South San Francisco)、B1(Bexxar_，Coulter Pharm.，San Francisco)、Campath_(Millennium Pharmaceuticals，Cambridge)MB1、BH3、B4、B72.3(Cytogen Corp.)、CC49(National Cancer Institute)和5E10(University of Iowa)。在优选实施方案中，本发明的多肽会与以上列举的抗体结合相同的肿瘤相关抗原。在特别优选的实施方案中，所述多肽来源于2B8、C2B8、CC49和C5E10，或者和它们结合的抗原相同，更优选的是，所述多肽包含结构域删除的抗体(即，ΔCH2抗体)。
在第一优选实施方案中，本发明的多肽与相同的肿瘤相关抗原结合，比如Rituxan_。Rituxan_(又称为利妥昔单抗、IDEC-C2B8和C2B8)是第一个FDA批准的用于治疗人B细胞淋巴瘤的单克隆抗体(参见美国专利5,843,439；5,776,456和5,736,137，这些专利均以参考文献的方式引入本文)。Y2B8(90Y标记的2B8；Zevalin_；替伊莫单抗)是C2B8的小鼠亲本。Rituxan_是一种嵌合的抗CD20的单克隆抗体，该抗体具有生长抑制性，并且有报道说它能体外致敏一些淋巴瘤细胞系，使其被化疗剂细胞凋亡。所述抗体能够有效地结合人补体，具有强FcR结合能力，并且能借助补体依赖性(CDC)和抗体依赖性(ADCC)机制体外有效地杀伤人淋巴细胞(Reff et al.，Blood83：435-445(1994))。本领域技术人员明白，按照本公开文本能够结合Cripto和CD20+的双特异性结合分子，可以用来以偶联或非偶联形式有效地治疗出现CD20+恶性肿瘤的患者。更一般地说，我们要重申本文公开的多肽可以以“裸露”或未偶联状态或者偶联细胞毒试剂来有效地治疗多种病患之一。
在本发明其它优选实施方案中，发明所述双特异性多肽可以包含来自CC49抗体(或来源于CC49抗体)的结合位点。正如前面提到的，CC49能够结合人肿瘤相关抗原TAG-72，该抗原与一些来自人的肿瘤细胞，特别是LS174T肿瘤细胞系的表面有关。LS174T[American Type Culture Collection(文中称为ATCC)No.CL 188]是LS180(ATCC No.CL187)结肠腺癌细胞系的变体。
我们还知道，已开发了对TAG-72有结合特异性的许多小鼠单克隆抗体。这些单克隆抗体中的一个，被称为B72.3是由杂交瘤B72.3(ATCC No.HB-8108)产生的小鼠IgG1。B72.3是用人乳腺癌提取物作为免疫原开发出的第一代单克隆抗体(参见Colcher et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，78：3199-3203(1981)；以及美国专利4,522,918和4,612,282，这些出版物均以参考文献的方式引入本文)。其它针对TAG-72的单克隆抗体被命名为″CC″(表示结肠癌)。正如Schlom等(美国专利5,512,443，以参考文献的方式引入本文)描述的，CC单克隆抗体是用TAG-72从B72.3中纯化制备的第二代小鼠单克隆抗体家族。由于它们对TAG-72的结合亲和性相对较好，以下CC抗体已被保存在ATCC，其获取受到限制：CC49(ATCC No.HB 9459)；CC83(ATCC No.HB9453)；CC46(ATCC No.HB 9458)；CC92(ATTCC No.HB 9454)；CC30(ATCC No.HB9457)；CC11(ATCC No.9455)；和CC15(ATCC No.HB 9460)。美国专利申请公开号5,512,443进一步教导了，可以利用本领域已知的重组DNA技术将公开的抗体改变成它们的嵌合形式，例如通过用人恒定区结构域(Fc)取代小鼠恒定区。除了公开了小鼠和嵌合抗TAG-72抗体，Schlom等还制备了PCT/US99/25552中公开的人源化CC49抗体的变体，和美国专利5,892,019中公开的单链构建体，这两份专利均以参考文献的方式引入本文。本领域技术人员明白，以上提到的抗体、构建体或重组体，以及它们的变体可以是合成的，并用于制备发明所述双特异性分子。
除了上面讨论过的抗TAG-72抗体，多个研究小组还报道过结构域删除CC49和B72.3抗体的构建和部分研究情况(例如，Calvo et al.CancerBiotherapy，8(1)：95-109(1993)、Slavin-Chiorini et al.Int.J.Cancer 53：97-103(1993)和Slavin-Chiorini et al.Cancer.Res.55：5957-5967(1995)。这些构建体也可以包括在本发明的双特异性分子中。
在一实施方案中，本发明的双特异性分子与CD23结合(美国专利6,011,138)。在一个优选实施方案中，本发明的双特异性结合分子包含的结合位点能结合到和5E8抗体结合的相同表位上。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个来自抗CD23抗体(例如5E8抗体)的CDR。
在另一实施方案中，本发明的双特异性分子包含来源于C5E10抗体的一个结合位点(或者是与C5E10抗体结合相同肿瘤相关性抗原的结合位点)。正如同时待审的专利申请09/104,717中提出的，C5E10是一种约115kDa的识别糖蛋白决定物的抗体，它似乎是***肿瘤细胞系(例如，DU145、PC3或ND1)所特有的。因此，结合本发明来看，可以产生特异结合C5E10所识别的相同肿瘤相关抗原的双特异性多肽(例如，CH2区删除抗体)，并以偶联或未偶联形式用于治疗赘生性紊乱。在特别优选的实施方案中，所述结合分子来源于或者包含C5E10抗体之抗原结合区的全部或部分，象ATCC保藏号为PTA-865的杂交瘤细胞系所分泌的。然后可以将得到的结合分子象下文描述的那样偶联上放射性核素，并按照本文的方法给予患有***癌的患者。
在另一实施方案中，可以在发明所述结合分子中包含一个配体，例如用来赋予对特定受体的结合能力，或者在结合分子中加上一个受体，用于例如从循环***中去除某配体。所述双特异性结合分子可以包含的示范性配体及其受体包括：
a.细胞因子或细胞因子受体
细胞因子对淋巴细胞的增殖、分化和功能性活化有多效性效应。各种细胞因子或其受体结合部分可以用在本发明的融合蛋白中。细胞因子的例子有，白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18)、集落刺激因子(CSF)(例如，粒细胞CSF(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)，和单核细胞巨噬细胞CSF(M-CSF))、肿瘤坏死因子(TNF)α和β，以及干扰素比如干扰素-α、β或γ(美国专利4,925,793和4,929,554)。
细胞因子受体通常由配体特异性α链和共有的β链构成。细胞因子受体的例子有，GM-CSF、IL-3(美国专利5,639,605)、IL-4(美国专利5,599,905)、IL-5(美国专利5,453,491)、IFNγ(EP0240975)的受体，及TNF受体家族(如TNFα(例如TNFR-1(EP417，563)、TNFR-2(EP417，014)淋巴毒素β受体)。
b.粘附蛋白或其受体
粘附蛋白是使得细胞能够相互作用的膜结合蛋白质。各种粘附蛋白，包括白细胞归巢受体和细胞粘着分子，以及它们的受体结合部分可以引入到本发明的结合分子中。白血病归巢受体在发炎过程中表达在白细胞表面上，其包含β-1整合蛋白(例如，VLA-1，2，3，4，5和6)和β2-整合蛋白(例如，LFA-1，LPAM-1，CR3和CR4)，前者介导该受体与胞外基质成分的结合，后者能结合到血管内皮细胞上的细胞粘着分子(CAM)。示范性的CAM包括ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1和MAdCAM-1。其它CAM包括选择蛋白家族成员，包括E-选择蛋白、L-选择蛋白、和P-选择蛋白。
c.趋化因子或其受体
刺激白细胞向感染部位迁移的趋化因子和趋化蛋白也可以引入到发明所述结合分子中。示范性的趋化因子包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、嗜中性白细胞趋化因子以及RANTES(调节活化的正常T细胞表达和分泌的(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted))。
d.生长因子或生长因子受体
生长因子或其受体(或其受体结合或配体结合部分)或能与它们结合的分子也可以引入本发明的结合分子中。生长因子的例子有，血管生成素；血管内皮生长因子(VEGF)及其同种型(美国专利5,194,596)；内皮细胞生长因子(EGFs)；成纤维细胞生长因子(FGF)，包括aFGF和bFGF；心钠素(ANF)；肝细胞生长因子(HGFs；美国专利5,227,158和6,099,841)；神经营养因子，比如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)；或者神经生长因子，比如NGF-β血小板衍生的生长因子(PDGF)(美国专利4,889,919，4,845,075，5,910,574和5,877,016)；转化生长因子(TGF)，比如TGF-α和TGF-β(WO90/14359)；骨诱导生长因子，包括骨形态发生蛋白(BMP)；类胰岛素生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II；美国专利6,403,764和6,506,874)；***(EPO)；干细胞因子(SCF)，血小板生成素(c-Mpl配体)和Wnt多肽(美国专利6,159,462)。
可以使用的示范性生长因子受体包括EGF受体(EGFRs)；VEGF受体(例如，Flt1或Flk1/KDR)，PDGF受体(WO90/14425)；HGF受体(美国专利5,648,273和5,686,292)；IGF受体(例如，IGFR1和IGFR2)以及神经营养受体，包括低亲和性受体(LNGFR)，又称为p75NTR或p75，该受体能够结合NGF、BDNF和NT-3；和高亲和性受体，该受体是受体酪氨酸激酶trk家族的成员(例如，trkA，trkB(EP455，460)，trkC(EP522，530))。在另一实施方案中，针对的是IGFR1和VEGF。还有一实施方案中，针对的是VLA4和VEGF。
还可以针对其它细胞表面受体和/或它们的配体(例如，TNF家族受体或其配体，在本文有更详细的描述)。
e.激素
生长激素，或能结合这些激素作为发明所述结合分子的靶向剂的分子的例子有，肾素、人生长激素(HGH；美国专利5,834,598)、N-甲硫氨酰人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素(PTH)；促甲状腺素(TSH)；甲状腺素；胰岛素原和胰岛素(美国专利5,157,021和6,576,608)；促卵泡激素(FSH)，降钙素，***(LH)，脂激素(leptin)，胰高血糖素；蛙皮素；基因重组人生长激素；缪勒管抑制因子；松弛素和松弛素原；促性腺素关联肽；催乳素；胎盘催乳素；OB蛋白；或缪勒管抑制因子。
f.凝血因子
用来作为发明所述结合分子的靶向剂的血液凝集因子的例子有，凝血因子(例如，因子V，VII，VIII，X，IX，XI，XII和XIII，von Willebrand因子)；组织因子(美国专利5,346,991、5,349,991、5,726,147和6,596,84)；凝血酶和凝血酶原；纤维蛋白和纤维蛋白原；血纤蛋白溶酶和血纤蛋白溶酶原；纤溶酶原激活物，比如尿激酶或者人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)。
C.融合蛋白
本发明还涉及包含一或多个免疫球蛋白结构域的结合分子。在一实施方案中，本发明的融合蛋白包含结合结构域(其包含至少一个结合位点)和二聚体化结构域(其包含至少一个重链部分)。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子可能包含至少一个人源化B3F6结合位点和一个二聚体化结构域。所述融合蛋白是双特异性的(有一个第一靶分子的结合位点，和一个第二靶分子的第二结合位点)。在一实施方案中，所述融合蛋白是多价的(有针对相同靶分子的两个结合位点)。
在一实施方案中，所述融合蛋白包含B3F6结合位点，至少一个重链结构域和合成连接肽。
文献中报道的融合蛋白的例子有以下物质的融合蛋白：T细胞受体(Gascoigne et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：2936-2940(1987))；CD4(Capon et al.，Nature337：525-531(1989)；Traunecker et al.，Nature339：68-70(1989)；Zettmeissl et al.，DNA Cell Biol.USA9：347-353(1990)；和Byrn et al.，Nature344：667-670(1990))；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson et al.，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson et al.，Nature349：164-167(1991))；CD44(Aruffo et al.，Cell61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley et al.，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley et al.，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic et al.，Cell66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10535-10539(1991)；Lesslaueret al.，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel et al.，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；以及IgE受体a(Ridgway and Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))。
在一实施方案中，当制备发明所述融合蛋白时，编码结合结构域(例如，人源化B3F6结合结构域)的核酸C-末端与编码免疫球蛋白恒定结构域序列之N-末端的核酸融合。N-末端融合也是可能的。在一实施方案中，融合蛋白包含CH2和CH3区。还可以在恒定区Fc部分的C末端，或者重链CH1紧挨N末端的位置或者轻链中的相应区域进行融合。
在一实施方案中，配体或受体结构域的序列与免疫球蛋白Fc区的N末端融合在一起。还可能将整个重链恒定区与配体或受体结构域的序列融合起来。在一实施方案中，用于融合的是从绞链区中木瓜蛋白酶切割位点(即残基216，假设重链恒定区的第一个残基在位点114)上游开始的一段序列，该序列从化学性质上界定了IgG Fc，或者其它免疫球蛋白中的类似位点。进行融合的确切位点并不重要；一些位点是我们非常了解的，可以根据优化所述分子的生物活性、分泌或结合特点的要求进行选择。制备融合蛋白的方法是本领域已知的。
对于双特异性融合蛋白，所述融合蛋白被组装成多聚体，特别是杂二聚体或杂三聚体。通常，这些组装好的免疫球蛋白具有已知单元结构。IgG、IgD和IgE均以基本的四链结构单元的形式存在。在更高分子量免疫球蛋白中是四链单元的重复；IgM一般是由二硫键连接在一起的四链基本单元的五聚体。IgA球蛋白，以及有时IgG球蛋白，可能还会以多聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况中，四个单元中的每一个可能是相同或不同的。
例如WO0069913A1和WO0040615A2中教导了融合蛋白。融合蛋白可以利用本领域熟知的方法来制备(参见，例如美国专利5,116,964和5,225,538)。通常，配体或受体结构域通过C-末端融合到重链(或重链部分)恒定区的N-末端，代替了可变区。优选在融合前将配体结合受体中所有跨膜区或者脂类或磷脂锚识别序列灭活或删除。将编码配体或受体结构域的DNA用限制性内切酶在其中编码所需ORF片段的DNA的5’和3’端或者附近进行切割。然后将得到的DNA片段容易地***编码重链恒定区的DNA。可以根据经验挑选进行融合的确切位点以便优化可溶性融合蛋白的分泌或结合特性。然后编码融合蛋白的DNA被转染到宿主细胞内进行表达。
III.合成的连接肽
在一实施方案中，发明所述二聚体的至少一个多肽链包含合成连接肽。在一实施方案中，发明所述二聚体的至少两个链包含连接肽。在优选实施方案中，发明所述二聚体的两个链包含连接肽。
在一实施方案中，可以用连接肽将两个重链部分符合读框地连接到一个多肽链中。例如，在一实施方案中，本发明的连接肽可以用于将CH3区(或合成CH3区)与绞链区(或合成绞链区)融合。在另一实施方案中，本发明的连接肽被用于将CH3区(或合成CH3区)融合到CH1区(或合成CH1区)上。还有一实施方案中，连接肽可以作为绞链区(或合成绞链区)和CH2区(或合成CH2区)之间的间隔肽。
在另一实施方案中，CH3区可以被融合到胞外蛋白结构域上(例如，VL结构域(或合成结构域)、VH结构域(或合成结构域)、CH1结构域(或合成结构域)、绞链区(或合成绞链)，或者融合到受体的配体结合部分或配体的受体结合部分上)。例如，在一实施方案中，VH或VL结构域借助连接肽(连接肽的C末端连着CH3区的N-末端，连接肽的N末端连着VH或VL结构域的C末端)被融合到CH3区上。在另一实施方案中，CH1借助连接肽(连接肽的C末端连着CH3区的N-末端，连接肽的N末端连着CH1区的C末端)融合到CH3区上。在另一实施方案中，本发明的连接肽可以用于将CH3区(或合成CH3区)融合到绞链区(或合成绞链区)或其部分上。还有一实施方案中，连接肽可以作为绞链区(或合成绞链区)和CH2区(或合成CH2区)之间的间隔肽。
在一实施方案中，连接肽可以包含甘氨酸/丝氨酸间隔或由它构成。例如，可以使用含有短氨基酸间隔序列GGSSGGGGSG(SEQ ID No.8)的结构域删除构建体(CH2[gly/ser])，间隔序列取代了CH2区和下游绞链区。在另一实施方案中，连接肽包含氨基酸序列IGKTISKKAK(SEQ ID NO：15)。
在另一实施方案中，连接肽可以包含免疫球蛋白绞链区的至少一部分。例如，构建嵌合绞链区可以将来源于不同抗体表位的绞链元件联合起来。在一实施方案中，连接肽包含IgG1绞链区的至少一部分。在另一实施方案中，连接肽可以包含IgG3绞链区的至少一部分。在另一实施方案中，连接肽可以包含IgG1绞链区的至少一部分和IgG3绞链区的至少一部分。在一实施方案中，连接肽可以包含IgG1上游和中间绞链以及单个IgG3中间绞链区重复基序。
因为这类含有来源于免疫球蛋白绞链区的氨基酸序列的连接肽中各个氨基酸的编号根据该连接肽的长度可能不同，这些分子中氨基酸位点的编号按照Kabat编号体系给出(参见，例如表2)。表3显示了IgG1、IgG3和IgG4分子的天然绞链序列。表2显示了这些绞链分子各部分的Kabat编号，还显示了该表中存在的连接肽氨基酸残基的Kabat编号。
在一实施方案中，本发明的连接肽包含非天然免疫球蛋白绞链区结构域，例如所述绞链区结构域天然情况下不会在包含该绞链区结构域的多肽中见到，和/或该绞链区结构域是被改变过的，因此它的氨基酸序列与天然免疫球蛋白绞链区结构域不同。在一实施方案中，可以对绞链区结构域进行突变以便制得本发明的连接肽。在一实施方案中，发明所述连接肽包含的绞链区不含有天然数量的半胱氨酸，即该连接肽包含的半胱氨酸比天然绞链分子要少或多。在一个优选实施方案中，在多肽中引入所述连接肽得到的组合物，其中50％、60％、70％、80％或90％以上的二聚体分子以这样的形式存在，即两个重链部分借助至少一个链间二硫键连在一起。
在本发明的一实施方案中，所述连接肽包含绞链区结构域，该结构域与Kabat编号***中氨基酸位点243对应的氨基酸位点含有脯氨酸残基(位点230，EU编号***)。在一实施方案中，连接肽Kabat编号***中氨基酸位点244对应的氨基酸位点含有丙氨酸残基(位点246，EU编号***)。在另一实施方案中，发明所述连接肽在与位点245对应的氨基酸位点包含脯氨酸残基(Kabat编号***；位点247，EU编号***))。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号***的位点239对应的氨基酸位点包含半胱氨酸残基(位点226，EU编号***)。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号***的位点239对应的氨基酸位点包含丝氨酸残基(位点226，EU编号***)。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号***的位点242对应的氨基酸位点包含半胱氨酸残基(位点229，EU编号***)。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号***的位点242对应的氨基酸位点包含丝氨酸残基(位点229，EU编号***)。
在一实施方案中，可以挑选连接肽以便优先合成多肽的特定同种型，例如其中两个重链部分借助二硫键连接或者不借助二硫键连接。例如，如以下实施例中的描述，G1/G3/Pro243+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：26)、G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：5)、Pro243+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：33)和Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接头(SEQID NO：32)，连接肽导致仅产生A型CH2区删除抗体，没有可检测的B型。相反，CH2区删除Cys242Ser：Pro243(SEQ ID NO：31)，和CH2区删除Cys242Ser：Pro243Ala244Pro245(SEQ ID NO：32)，均优先产生B同种型。因此这些合成绞链区可以用于倾向性地合成A型或B型。根据CH3区所有四种人亚型之间的高同源性，这对抗体的任何亚型(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)都是正确的。(包括相同和保守氨基酸残基，IgG1CH3区与IgG2CH3区98.13％同源，与IgG3CH397.20％同源，与IgG4CH396.26％同源)。除非另有说明，指代本发明连接肽和各种结合分子的括号内内容代表等同的术语。
在一实施方案中，发明所述连接肽包含的绞链区结构域跟随着柔性gly/ser接头。示范性的连接肽如表2和SEQ ID NO：5、25-34所示。人们会理解，产生这些示范性连接肽的变体形式可以通过向编码该连接肽的核苷酸序列中引入一或多个核苷酸取代、添加或删除，从而在连接肽中引入一或多个氨基酸取代、添加或删除。例如，可以通过标准技术来引入突变，比如定点突变和PCR介导的突变。优选的，在一或多个非关键氨基酸残基进行保守性氨基酸取代，使得连接肽选择性促进合成A型或B型的能力没有改变。因此，优选将免疫球蛋白多肽中的非关键氨基酸残基用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一实施方案中，可以将一串氨基酸用结构类似、而侧链家族成员的顺序和/或组成不同的氨基酸串取代。
本发明的连接肽可以是不同长度的。在一实施方案中，发明所述连接肽长约15到50个氨基酸。在另一实施方案中，发明所述连接肽长约20到45个氨基酸。在另一实施方案中，发明所述连接肽长约25到40个氨基酸。在另一实施方案中，发明所述连接肽长约30到35个氨基酸。在另一实施方案中，发明所述连接肽长约24到27个氨基酸。在另一实施方案中，发明所述连接肽长约40到42个氨基酸。
可以利用本领域已知技术将连接肽引入多肽序列。例如，在一实施方案中，可以采用重叠延伸(SOE)方法(Horton，R.M.1993 Methods inMolecular Biology，Vol15：PCR Protocols：Current Methods and applications.Ed.B.A.White)。通过DNA序列分析可以证实发生的修饰。质粒DNA可以用于转化宿主细胞以便稳定地产生所得多肽。
在一实施方案中，将一个所述连接肽引入多肽产生的组合物包含具有至少两个结合位点和至少两个多肽链的结合分子，其中至少两个多肽链包含一个合成连接肽，而且50％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，60％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，70％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，80％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，90％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。
IV.结合分子的表达
如上所述对分离的遗传物质进行操作以便提供发明所述多肽之后，通常要将基因***表达载体来引入宿主细胞，该宿主细胞可以用于表达所需量的多肽，进而提供要求保护的结合分子。
为了说明书和权利要求，名词“载体”或“表达载体”用在本文中意味着作为将所需基因导入细胞并进行表达的媒介物(vehicle)的载体。正如本领域技术人员已知的，这类载体可以容易地从质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒中选择。通常，适用于本发明的载体包含选择标记、协助克隆所需基因的合适的酶切位点以及进入真核或原核细胞并且/或者在真核或原核细胞中复制的能力。
用于本发明时，有大量表达载体***可以采用。例如，一类是利用来源于动物病毒的DNA元件的载体，其中所述动物病毒是比如牛***瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它载体涉及到利用带有内部核糖体结合位点的多顺反子***。此外，可以通过导入一或多个能够用来挑选被转染宿主细胞的标记物来挑出DNA整合到染色体中的细胞。所述标记物可以给营养缺陷型宿主提供原养型能力、提供对杀生物剂的抗性(例如，抗生素)或对重金属(比如铜)的抗性。选择标记基因可以直接连在待表达DNA序列上，或者通过共转化导入相同的细胞。合成mRNA的最佳条件可能还需要另外的元件。这些元件可以包括信号序列、切割信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。在特别优选的实施方案中，将克隆的可变区基因和按照上面的讨论合成的重链和轻链恒定区基因(优选人的)一起***表达载体。优选的，用IDEC，Inc.的专有表达载体NEOSPLA(美国专利6159730)来实施。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主启动子、SV40复制原点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和2、二氢叶酸还原酶基因和引导序列。在后面的实施例中会看到，在该载体中引入可变和恒定区基因，转染CHO细胞，然后在含有G418的培养基中进行挑选和氨甲喋呤扩增会造成抗体的高水平表达。美国专利5736137和5658570中也有关于载体***的教导，这两篇专利均以参考文献的方式全文引入本文。该***提供了高表达水平，例如>30pg/细胞/天。其它示范性的载体***在例如美国专利6413777中有公开。
在其它优选实施方案中，本发明的多肽可以用多顺反子构建体来表达，比如2001年11月16日提交的待审美国临时申请60/331,481中公开的那些，该申请全文引入本文。在这些新的表达***中，多个目的基因产物，比如抗体的重链和轻链可以由单个多顺反子构建体产生。这些***有利地利用了一个内部核糖体进入位点(IRES)来提供在真核细胞内较高水平表达发明所述多肽。适用的IRES序列在美国专利6,193,980中有公开，该专利同样引入本文。本领域技术人员能够意识到，可以利用这类表达***来高效地产生本申请公开的各种多肽。
更一般地，一旦准备好了编码某多肽(例如，经修饰的抗体)之单体亚基的载体或DNA序列，可以将表达载体导入合适的宿主细胞。即可以转化宿主细胞。质粒可以通过本领域技术人员所熟知的多种技术导入宿主细胞。这些技术包括，但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包被DNA进行的细胞融合、显微注射以及用完整病毒进行感染。参见，Ridgway，A.A.G.″Mammalian Expression Vectors″Chapter24.2，pp.470-472Vectors，Rodriguez and Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass.1988)。最优选的，质粒借助电穿孔导入宿主。将转化细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，检测重链和/或轻链蛋白合成。示范性的检测技术包括酶联免疫吸附检定法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或荧光激活的细胞分选法(FACS)、免疫组织化学法等。
本文中，名词“转化”是从广义上指将能改变表现型的DNA导入受体宿主细胞从而造成了受体细胞的变化。
在同样的那些话语中，“宿主细胞”是指利用重组DNA技术转化了编码至少一种异源基因的载体构建体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的过程时，名词″细胞″和″细胞培养物″可以交换使用来指示抗体的来源，除非另外清楚地说明。换句话说，从“细胞”中回收多肽可能意味着离心沉淀完整细胞，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。
用于蛋白质表达的宿主细胞最优选是来源于哺乳动物的；本领域技术人员有能力确定最适用于待表达基因产物的具体细胞系。示范性的宿主细胞系包括，但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR删除)、HELA(人***细胞)、CVI(猴肾细胞系)、COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。尤其优选CHO细胞。宿主细胞系通常可以得自商业服务机构、American TissueCulture Collection或已发表的文献。
体外制备保证了能够扩大规模产生大量的所需多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，包括均匀悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或者固定化或截留细胞培养(例如，在中空纤维、微囊、琼脂糖微珠或陶瓷柱上进行)。如果需要并且/或者希望，可以在例如优选地生物合成了合成绞链区多肽之后，或者在进行文中描述的HIC层析步骤之前，通过常规的层析方法将多肽溶液进行纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析或(免疫-)亲和层析。
编码发明所述多肽的基因也可以在非哺乳动物细胞内进行表达，比如细菌或酵母或植物细胞。就此而言，应该意识到各种单细胞非哺乳动物微生物比如细菌也可以被转化；即那些能够在培养基中或发酵生长的。易于被转化的细菌，包括肠杆菌科的成员，比如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌科，比如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。还应该进一步意识到，在细菌中进行表达时，多肽通常成为内涵体的一部分。多肽必须被分离、纯化，然后组装成功能性分子。当需要四价形式的抗体时，然后就将亚基自组装成四价抗体(WO02/096948A2)。
除了原核细胞，还可以使用真核微生物。虽然也可以购买到大量其它菌株，但酿酒酵母，或普通面包酵母是最常用的真核微生物。对于在酵母中进行表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb et al.，Nature，282：39(1979)；Kingsman et al.，Gene，7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene，10：157(1980))。这个质粒已含有TRP1基因，该基因给不能在色氨酸上生长的酵母突变株(例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，85：12(1977))提供了选择标记。然后酵母宿主细胞基因组中特征性的trpl损伤提供了有效的环境，通过在没有色氨酸的情况下的生长来探测发生了转化。
V.将包含至少一个链间二硫键的结合分子与缺少链间二硫键的分 子分开
本发明在一个方面涉及通过疏水作用层析从混合物中分开具有两个重链部分的分子，所述混合物中一部分分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式，一部分分子包含的重链部分没有借助至少一个链间二硫键来连接。
疏水作用层析的首次建立是基于如下观察，即蛋白质可以被截留在包含烃间隔臂、但是缺少亲和配体的亲和胶上。可以通过改变溶剂、pH、离子强度，或者通过加入离液剂或有机改性剂(比如乙烯或丙二醇)来影响蛋白从HIC支持物上的洗脱。描述疏水作用层析的一般原理可以在例如美国专利3917527和美国专利4000098中找到。就高效液体层析(HPLC)而言的HIC已被用于在一个步骤的实验方法中，将缺少重链部分的抗体片段(例如F(ab′)2)与完整抗体分子分开(Morimoto，K.et al.，L Biochem.Biophvs.Meth.24：107(1992))。
本发明的分离方法可以应用在未纯化的多肽上(例如，培养物上清液或制剂或者由原核细胞内涵体分离到的多肽制剂)。替代的，所述分离方法可以应用于经过一或多个起始纯化步骤得到的多肽混合物，例如将包含A型和B型的制备物从亲和基质上洗脱下来之后。
在一实施方案中，进行HIC层析的结合分子包含发明所述连接肽。
在一个优选实施方案中，可以将HIC应用到已通过其它蛋白纯化步骤部分纯化的混合物上。名词″部分纯化″用于本文包括这样的蛋白制剂，其中目的蛋白至少占5％重量比，更优选至少10％，最优选至少45％。起始或后续纯化步骤可以用来去除，例如免疫球蛋白凝集物、错折叠的种类、宿主细胞蛋白、来自前面层析步骤的残余物质(比如使用过蛋白A的情况中的蛋白A)。在一实施方案中，可以给包含发明所述连接肽的多肽进行HIC。相应的，应当意识到HIC的应用可以贯穿整体的纯化方案。可以用在HIC之前或之后的示范性纯化步骤包括：亲和层析(例如，PROSEP-A_(BioProcessing Ltd.，U.K.)，其含有共价偶联在口径可调的玻璃上的蛋白A，或者Protein A
SEPHAROSE_Fast Flow(Pharmacia)或TOYOPEARL650M Protein A(TosoHaas))。对于人γ1，γ2或γ4，优选使用蛋白A；对于小鼠亚型优选使用蛋白G。如果分子含有CH3区，可以使用Bakerbond ABXtm树脂。另外或者替代的，可以采用离子交换层析。在这方面，可以将各种阴离子或阳离子取代基附着到基质上形成层析的阴离子或阳离子支持物。阴离子交换取代基包括二乙氨乙基(DEAE)、四级氨乙基(QAE)和季铵(Q)基团。阳离子交换取代基包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐(P)和磺酸盐(S)。纤维素离子交换树脂，比如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可以从Whatman Ltd.Maidstone，Kent，U.K购买。SEPHADEX_基的和-交联的离子交换剂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-SEPHADEX_以及DEAE-、Q-、CM-和S-SEPHAROSE_以及SEPHAROSE_Fast Flow都可以从Pharmacia AB购买。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-异丁烯酸酯共聚物，比如TOYOPEARL DEAE-650S或M以及TOYOPEARL CM-650S或M可以从Toso Haas Co.，Philadelphia，Pa购买。因为从离子交换支持物上洗脱通常要加盐，而且盐浓度增加的情况下，HIC效率提高，因此优选在离子交换层析步骤或其它盐介导的纯化步骤之后引入一个HIC步骤。可以添加的其它纯化方案包括，但不一定限于：进一步离子交换层析、大小排阻层析、病毒灭活、浓缩和冷冻干燥、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行的层析、在肝素SEQHAROSETM上进行层析、层析聚焦或硫酸铵沉淀。
用所述方法进行纯化之前，优选将包含待分离多肽混合物的组合物放在酸性或接近中性pH的缓冲液中。这可以通过例如加入浓缩缓冲液、将样品重悬于缓冲液、替换缓冲液(例如利用透析或超滤)来实现。替代的，可以简单地将样品缓冲液的pH调到希望的范围。
疏水相互作用在高离子强度时最强，因此，这种形式的分离可以方便地在盐沉淀或离子交换程序之后进行。高盐浓度有利于蛋白质吸附到HIC柱子上，但是具体的浓度根据蛋白质的性质和所选的特定HIC配体可能在很大的范围内变化。各种离子根据它们是否能促进疏水相互作用(盐析效果)，还是破坏水结构(离液效果)因此导致疏水相互作用减弱，排列成所谓的疏溶系列(soluphobic series)。阳离子按盐析效果增强的顺序排是Ba++<Ca++<Mg++<Li+<Cs+<Na+<K+<Rb+<NH4+，而阴离子可以按照离液效果增强的顺序排是PO---<SO4 --<CH3COOO-<Cl-<Br-<NO3 -<ClO4 -<I-<SCN-。
一般来说，硫酸Na、K或NH4能有效地促进HIC中的配体-蛋白质相互作用。盐类可能按照以下关系影响相互作用的强度：(NH4)2SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCN。通常，可以使用约0.75到约2M浓度的硫酸铵，或者约1到4M之间的NaCl。
许多层析支撑物可以用于HIC柱子的制备，使用最广泛的是琼脂糖、硅石和有机聚合物或者共聚物树脂。疏水作用材料通常是偶联了疏水配体(例如烷基或芳香基)的基础基质(例如，亲水碳水化合物(比如交联的琼脂糖)或者合成共聚物材料)。优选的HIC材料包含取代有苯基的琼脂糖树脂。示范性的HIC材料包括：苯基SEPHAROSETM、低或高取代的FAST FLOW(Pharmacia LKB Biotechnology，AB，Sweden)；苯基SEPHAROSETM HighPerformance柱子；苯基或丁基-SEPHAROSE_CL-4B、丁基-SEPHAROSE_FF、辛基-SEPHAROSE_FF和苯基-SEPHAROSE_FF(Pharmacia LKBBiotechnology AB，Sweden)；FractogelTM EMD丙基或FRACTOGELTMEMC苯基柱子(E.Merck，Germany)；MACROPREPTM甲基或MACRO-PREPTM t-丁基支持物(Bio-Rad，California)；WP HI-Propyl(C3)TM柱子(J.T.Baker，New Jersey)。示范性的HIC材料还可以购自Tosoh Corporation，Tokyo，Japan，其产品名称为TOYOPEARL***650、苯基650、丁基650(Fractogel)、***-5PW-HR或苯基-5PW-HR；以烷基-琼脂糖的产品名称购自Miles-Yeda，Rehovot，Israel，其中所述烷基含有2-10个碳原子；以及购自J.T.Baker，Phillipsburg，N.J的产品Bakerbond WP-HI-丙基。还可能利用常规化学制备所需HIC柱子(参见：例如Er-el.Z.gl all，Biochem.Biophys.Res.Comm.49：383(1972)或Ulbrich，V.rd gL Coll.Czech.Chem.Commum.9：1466(1964))。
具体胶的选择可以由技术人员确定。通常，蛋白与HIC配体相互作用的强度随着烷基配体的链长增加而增强，但是有约4到8个碳原子的配体适用于多数分离。苯基的疏水性与戊基大致相同，但是因为可能与蛋白上的芳香基团形成pi-pi轨道相互作用，选择性也许不同。选择性还受到支持树脂的化学特性的影响。
配体密度是一个重要的参数，因为它既影响相互作用的强度，又影响到柱子的容量。商品苯基或辛基胶的配体密度在40p mol/ml胶床的量级。胶容量是所讨论的具体蛋白的函数，以及pH、温度和盐种类及浓度的函数，但是通常可以预期落在3-20mg/ml胶的范围内。
一般来说，温度下降会降低与HIC材料的相互作用。然而，必须将通过提高温度获得的益处与温度升高可能对蛋白质稳定性的影响这样的副作用进行权衡。
在一实施方案中，本发明的多肽可以等度洗脱。在等度洗脱中，所有的化合物同时开始在柱子中迁移。但是，每种物质迁移速率不同，造成洗脱速度较快或慢。例如，象在实施例中描述的，A型可以通过流经柱子来洗脱。
在另一实施方案中，一或多个发明所述多肽可以结合到柱子上，利用例如逐步洗脱或梯度洗脱来进行洗脱。洗脱，无论是逐步或梯度洗脱，可以多种方式实现：(a)通过改变盐浓度，(b)通过改变溶剂的极性或者(c)通过加入去污剂。通过降低盐浓度，吸附的蛋白按疏水性渐高的顺序洗脱。极性的改变可能受到加入溶剂(比如乙烯或丙二醇或(异)丙醇)，从而降低疏水作用的强度的影响。去污剂可以作为蛋白的置换剂，主要用于与膜蛋白的纯化相关的方面。
在进行分离时，可以利用例如批量纯化技术或柱子使得多肽混合物与HIC材料进行接触。在HIC纯化之前，可能最好例如使混合物通过一个前柱来除去任何离液剂或非常疏水的物质。
例如，批量纯化时，在所需起始缓冲液中制备HIC材料，或者将HIC材料平衡至该缓冲液。这样得到HIC材料浆。将多肽溶液与该浆状物接触，使待分离多肽中的至少一种吸附到HIC材料上。通过例如使浆状物静置，移取上清液来从浆状物中分离出含有未结合到HIC材料上的多肽溶液。可以将浆状物经过一或多个洗涤步骤。如果需要，浆状物可以与低导电性溶液进行接触，以解吸附结合到HIC材料上的多肽。为了洗脱结合的多肽，可以降低盐浓度。
在一实施方案中，可以将HIC材料装入柱子。将含有待分离多肽的混合物上样到柱子上，使要分离的多肽中的至少一种吸附到柱子上。不能吸附到柱子上的多肽流出，并收集。为了洗脱结合的多肽，可以以逐步的方式或者利用盐梯度来降低盐浓度。
因为B型比A型疏水性更强，以约0.7M(e.g.，0.73M)硫酸铵/20mM磷酸钠(pH4.0到pH8.0)作为流动相，B型不可逆地结合到固定相上。A型在这些条件下，结合到固定相的程度较低，因此可以被等度洗脱，即它与流过组分一起离开柱子。等度洗脱A型之后，除去流动相中的硫酸铵将B型解吸附。
在一例纯化方案中，在缓冲液中平衡HIC材料，该缓冲液含有的盐浓度产生的导电性在约160到110，优选在约140到115，更优选在约130或120到117mS/cm之间。例如，示范性的起始溶液包含的盐浓度是约1M到0.7M，例如1M到0.7M的硫酸铵。在一个优选实施方案中，将含有待分离多肽混合物的溶液也调节到相同，或大概相同的导电性(例如，利用浓缩的盐储液)。在这些条件下，A型在导电性约120mS/cm时从柱子上洗脱。为了洗脱B型，可以在柱子上逐步或线性梯度降低硫酸铵浓度。B型在电导率约115到100mS/cm时洗脱。
在一实施方案中，由所述纯化方法得到一种包含结合分子的组合物，所述结合分子有至少两个结合位点和两个重链部分，其中重链部分缺少CH2区，并且50％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，60％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，70％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，80％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，90％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。
在一实施方案中，由所述纯化方法得到一种包含重组结合分子的组合物，所述结合分子有至少两个结合位点和两个重链部分，其中99％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。
在一实施方案中，由所述纯化方法得到一种包含结合分子的组合物，所述结合分子有至少两个结合位点和两个重链部分，其中95％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式，并且多肽的重链部分来源于IgG4亚型抗体。
在一实施方案中，由所述纯化方法得到一种包含结合分子的组合物，所述结合分子有至少两个结合位点和两个重链部分，其中重链部分缺少CH2区，并且80％以上的分子处于两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。
在另一个方面，本发明还提供了监测纯化结果和/或优先生物合成的方法，所述方法包含测量组合物中A型和B型的相对含量。可以如文中描述的，利用非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或者质谱来测量A型和B型。
VI.结合分子的标记或偶联
本发明的结合分子可以以非偶联形式来使用，或者偶联多种效应物(即功能部分)中的至少一种，从而例如协助探测目标分子或者给患者成像或治疗。发明所述多肽可以在纯化之前或之后，或进行纯化时做标记或偶联。具体来说，本发明的多肽可以偶联上细胞毒素(比如放射性同位素、细胞毒性药物或毒素)、治疗剂、细胞生长抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白质、病毒、脂类、生物应答调节剂、药剂、免疫活性配体(例如淋巴因子或其它抗体，其中所得分子既能结合赘生性细胞，又结合效应细胞，比如T细胞)、PEG或用于成像的可检测部分。在另一实施方案中，本发明的多肽可以偶联到能降低肿瘤血管形成的分子上。在其它实施方案中，文中公开的组合物可能包含偶联了药物或前药的发明所述多肽。本发明的再一些实施方案包括偶联了特异性生物毒素(比如蓖麻毒蛋白、白树毒蛋白(gelonin)、假单胞菌外毒素或白喉毒素)或其生物毒素片段之发明所述多肽的用途。选择使用偶联或未偶联多肽取决于癌症的类型和发展阶段、所用的辅助治疗(例如化疗或外部放疗)以及患者的状态。应当意识到，本领域技术人员根据本文的教导可以容易地作出这类选择。
应当意识到，在以前的研究中，标记了同位素的抗肿瘤抗体已被成功地用于在动物模型中，一些例子中是在人中破坏实体瘤以及淋巴瘤/白血病细胞。示范性的放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。放射性核素的作用是通过产生在核DNA中造成多个链断裂的电离辐射，从而导致细胞死亡。用于产生治疗偶联物的同位素通常产生高能量α-或β-粒子，这些粒子路径长度短。这类放射核素能够杀死与它们靠近的细胞，例如被偶联分子吸附或进入的赘生性细胞。它们对非域化细胞有很小的或没有效果。放射核素大体上是非免疫原性的。
在与本发明相关的放射标记偶联物的使用方面，本发明的多肽可以直接标记(比如通过电离)或利用螯合剂来间接标记。本文中，短语″间接标记″和″间接标记方法″均意味着螯合剂共价地连接着所述结合分子，而至少一种放射性核素与该螯合剂相关联。这些螯合剂通常是指双功能螯合剂，因为它们既能结合多肽，又能结合放射性核素。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰苯-3-methyldiothelene三胺五乙酸(″MX-DTPA″)和环己基二乙三胺五乙酸(″CHX-DTPA″)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核素包括111In和90Y。
本文中，短语″间接标记″和″间接标记方法″均意味着放射性核素直接共价地连到多肽上(通常借助氨基酸残基)。更具体的说，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后一种情况中，标记定点到多肽上的特定位点，比如仅存在于偶联物Fc部分的N-连接的糖残基。此外，各种直接标记技术和实验方案是适用于本发明的。例如，锝-99m标记的多肽可以通过配体交换过程来制备，即通过用锡离子溶液还原锝酸盐(pertechnate(TcO4 -))，将被还原的锝螯合到Sephadex柱子上，将多肽上样到该柱子上；或者通过批量标记技术，例如将锝酸盐、还原剂(比如SnCl2)、缓冲液(比如苯二甲酸钠钾溶液)，以及抗体一起保温。在任何情况中，用于直接标记抗体的优选放射性核素是本领域公知的，特别优选用于直接标记的放射性核素是通过酪氨酸残基共价连接的131I。根据本发明，多肽可以用例如放射性钠或钾碘化物和化学氧化剂(比如次氯酸钠、氯氨T等)，或者酶学氧化剂(乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖)来进行衍生。但是，为了本发明的目的，特别优选的是间接标记方法。关于螯合剂和螯合偶联物的专利是本领域已知的。例如，Gansow的美国专利4,831,175涉及多重取代的二乙三胺五乙酸螯合物，和含有该螯合物的蛋白偶联体，以及它们的制备方法。Gansow的美国专利5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471还涉及到多重取代的DTPA螯合物。这些专利均全文引入本文。其它适用的金属螯合剂的例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮四癸烷(tetraazatetradecane)、1，4，8，11-四氮四癸烷-1，4，8，11-四乙酸、1-氧代-4，7，12，15-四氮七癸烷-4，7，12，15-四乙酸等等。环己基-DTPA或CHX-DTPA是特别优选的，在下文有大量的例子。还有其它一些适用的螯合剂，包括有待发现的，可能很容易地被技术人员识别，显然在本发明的范围内。
优选待审专利申请序列号08/475,813，08/475,815和08/478,967中用于协助螯合的相容螯合剂，包括特异性双功能螯合剂来提供对三价金属的高亲和性，显示升高的肿瘤对非肿瘤比率，骨吸收下降以及在更高的核素在体内目标部位(即B细胞淋巴瘤肿瘤位点)的累积。但是，其它具备或不具备所有这些特点的双功能性螯合剂也是本领域已知的，并且有益于肿瘤治疗。还应当意识到，与本文的教导一致的，为了诊断和治疗目的，多肽可以偶联不同的放射性标记。为了这个目的，前面提到的待审专利申请(以参考文献的方式全文引入本文)公开了放射性标记的治疗偶联物，其用于在给予治疗抗体前进行肿瘤诊断“成像”。“In2B8”偶联物包含小鼠单克隆抗体2B8，该抗体对人CD20抗原具有特异性，借助双功能螯合剂连接111In，其中所述螯合剂是包含1∶1混合的1-异硫氰苯-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰苯-DTPA的MX-DTPA(二乙三胺五乙酸)。111In是特别优选的诊断放射核素，因为在约1到10mCi可以安全地给药而没有可检测到的毒性；成像数据通常可以预测后续的90Y标记的抗体分布。多数成像研究使用5mCi111In标记的抗体，因为这个剂量既安全又比更低剂量的成像效果好，最佳成像效果在给予抗体后的3到6天。参见，例如Murray，J.Nuc.Med.26：3328(1985)和Carraguillo et al.，J.Nuc.Med.26：67(1985)。
如上文所述，有许多核素可以用于本发明，本领域技术人员可以容易地确定各种情况下，哪种核素是最合适的。例如，131I是公知用于定向免疫治疗的核素。然而，131I的临床应用可能受到几个因素的限制：物理半衰期为8天；碘化抗体在血液和肿瘤部位的脱卤作用；以及发射特性(例如，γ组分高)，这对肿瘤局部剂量蓄积可能是亚适状态。随着更佳螯合剂的出现，在蛋白质上连接金属螯合基团的能力提高了利用其它核素，比如111In和90Y的机会。90Y提供了几个用于放射免疫治疗的优势：90Y的半衰期是64小时，足够抗体在肿瘤部位的积累；并且与例如131I不同，90Y是单纯的高能β射线源，在衰变过程中不产生γ辐射；辐射范围限于100到1000细胞直径的组织内。另外，最低贯穿辐射量使得可以门诊给予90Y标记的抗体。此外，细胞杀伤不要求标记抗体必须内在化，电离辐射的局部发射对没有靶分子的临近肿瘤细胞是致死的。
本领域技术人员会意识到，这些非放射活性的偶联物也可以根据要偶联的试剂利用多种技术来组装。例如，通过例如将多肽与生物素的活化酯(比如生物素N-羟基琥珀酰胺酯)进行反应来制备与生物素形成的偶联物。类似的，带有荧光标记的偶联物可以在有偶联剂(例如前面列举的)的情况下制备，或者通过与异硫氰酸酯，优选异硫氰酸荧光素进行反应来制备。发明所述多肽与细胞生长抑制剂/细胞毒性物质以及金属螯合剂的偶联物可以通过类似的方式制备。
许多效应物部分缺少合适的抗体可以连接的功能基团。在一实施方案中，效应物部分，例如药物或前药通过连接部分连到抗体上。在一实施方案中，所述连接部分含有能够在特定位点激活细胞毒性的化学键。合适的化学键是本领域公知的，包括二硫键、酸敏性键、光敏性键、肽酶敏感性键、在巯基和顺丁烯二酰亚胺之间形成的硫醚键，以及酯酶敏感性键。最优选，所述连接部分包含二硫键或硫醚键。与本发明一致的，所述连接部分优选包含活性化学基团。特别优选的活性化学基团是N-琥珀酰亚胺酯和N-磺基琥珀酰亚胺酯。在一个优选实施方案中，所述活性化学基团可以借助巯基之间的二硫键共价结合到效应物上。在一实施方案中，效应物分子被修饰以便含有巯基。本领域技术人员明白，巯基含有与氢原子结合的硫原子，通常又称为硫氢基，可以用″--SH″或″RSH″表示。
在一实施方案中，可以用连接部分将效应物部分与结合分子连接起来。本发明的连接部分可以是可切割的或不可切割的。在一实施方案中，可切割连接部分是氧化还原切割性连接部分，因此该连接部分在较低氧还电势的环境中是可切割的，这种环境是比如细胞质和其它带有游离硫氢基的分子浓度较高的区域。因为氧还电势的改变而被切割的连接部分的例子包括那些含有二硫键的。促进切割的因素可以通过发明所述结合蛋白被吸收到胞内提供，细胞质的较低氧还电势促使连接部分被切割。在另一实施方案中，pH降低引发美登木素生物碱释放到靶细胞内。在许多生理或病理过程中涉及到pH的下降，比如内体转运、肿瘤生长、发炎和心肌局部缺血。pH由生理值7.4下降到内体中的5-6，或者溶酶体中的4-5。可以用来导靶到肿瘤细胞的溶酶体或内体的酸敏感性连接部分的例子包括，在比如乙缩醛、缩酮、原酸酯、腙、三苯甲基、cis-aconityls或thiocarbamoyls中可以发现的带有酸敏性键的那些(参见，例如Willner et al.，(1993)，Bioconj.Chem.，4：521-7；美国专利4,569,789、4,631,190、5,306,809和5,665,358)。其它示范性的酸敏感性连接部分包含二肽序列Phe-Lys和Val-Lys(King et al.，(2002)，J.Med.Chem.，45：4336-43)。促进切割发生的因素可以由摄取到胞内并运输到低pH的内体区室(例如溶酶体)来提供。其它示范性的酸敏性连接部分是那些含有两个或多个供两个或多个美登木素生物碱附着的酸切割性键(Kinget al.，(1999)，Bioconj.Chem.，10：279-88；WO98/19705)。
可切割的连接部分可以是对生物供应的与特定靶细胞(例如，溶酶体或肿瘤相关酶)相关的切割试剂敏感。可以通过酶法切割的连接部分的例子包括，但不限于肽和酯。示范性的可酶切连接部分包括对肿瘤相关性蛋白酶，比如组织蛋白酶B或血纤蛋白溶酶敏感的那些(Dubowchik et al.，(1999)，Pharm.Ther.，83：67-123；Dubowchik etal.，(1998)，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：3341-52；de Groot et al.，(2000)，J.Med.Chem.，43：3093-102；de Groot et al.，(1999)m42：5277-83)。Cathepsin B可切割的位点包括二肽序列：颉氨酸-瓜氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(Doronina et al.，(2003)，Nat.Biotech.，21(7)：778-84)；Dubowchik et al.，(2002)，Bioconjug.Chem.，13：855-69)。其它示范性的酶切位点包括由4到16个氨基酸的寡肽序列形成的(例如，Suc-β-Ala-Leu-Ala-Leu)，该位点可以被trouse蛋白酶，比如甲拌磷寡肽酶(TOP)识别，该酶优选由嗜中性粒细胞、巨噬细胞和其它粒细胞释放。
在进一步的实施方案中，连接部分的形成是通过将发明所述结合分子与公式为X-Y-Z的连接分子进行反应：
其中：
X是附着部分；
Y是间隔部分；以及
Z是效应物附着部分。
名词“结合分子附着部分”包括使得接头能共价附着到发明所述结合分子上的部分。
所述附着部分可以包含，例如1-60个碳、氧、氮、硫原子的共价链，任选以氢原子取代和其它使得结合分子能行使其预期功能的取代。附着部分可以包含肽、酯、烷基、烯基、炔基、芳香基、***、硫醚等功能基团。优选的，附着部分的选择保证它能与包含至少一个抗原结合位点的多肽上的活性功能基团发生反应，形成本发明的结合分子。附着部分的例子包括，例如氨基、羧基和巯基附着部分。
氨基附着部分包括与多肽上的氨基反应，从而形成本发明的结合分子的一部分。氨基附着部分是本领域已知的。氨基附着部分的例子包括，活化脲(例如，与结合分子上的氨基发生反应形成包含脲基团的连接部分)、醛(例如，能与结合分子上的氨基发生反应的)，以及活化异硫氰酸酯(其能与结合分子上的氨基发生反应形成包含脲基团的连接部分)。氨基附着部分的例子包括，但不限于N-琥珀酰亚胺基、N-磺基琥珀酰亚胺、N-对酞内酰胺(phthalimidyl)、N-磺基对酞内酰胺、2-硝基苯、4-硝基苯、2，4-二硝基苯、3-磺酰基-4-硝基苯或3-羧基-4-硝基苯部分。
羧基附着部分包括能与多肽上的羧基基团发生反应，从而形成发明所述结合分子的一部分。羧基附着部分是本领域已知的。羧基附着部分的例子包括，但不限于活化的酯中间体和活化的羰基中间体，它们能与结合分子上的COOH基团发生反应，形成包含酯、硫酯或酰胺基团的连接部分。
巯基附着部分包括能与多肽上的巯基基团发生反应，从而形成发明所述结合分子的一部分。巯基附着部分是本领域已知的。巯基附着部分的例子包括，但不限于活化的酰基(能与结合分子上的硫氢基发生反应形成包含硫酯的连接部分)、活化的烷基(能与结合分子上的硫氢基发生反应形成包含硫酯的连接部分)、Michael受体，比如马来酰亚胺或丙烯基团(能与结合分子上的硫氢基发生反应形成Michael型添加反应产物)、以还原氧化反应与硫氢基发生反应的基团、活化的二硫化物基团(能与结合分子上的硫氢基团发生反应形成，例如包含二硫化物部分的连接部分)。其它巯基附着部分包括丙烯酰胺、α-碘乙酰胺以及环丙烷-1，1-二羰基化合物。此外，巯基附着部分可能含有这样的部分，其能将结合分子上的巯基修饰形成另外的活性基团，连接分子结合其上形成本发明的结合分子。
间隔部分，Y是一个含有一或多个氨基酸残基的共价键或原子共价链。它还可能包含0-60个碳、氧、硫或氮原子，任选被氢或其它使得结合分子能行使其预期功能的取代物所取代。在一实施方案中，Y包含烷基、烯基、炔基、酯、醚、羰基或酰胺部分。
在另一实施方案中，结合分子上的巯基被转化为活性基团，比如活性羰基基团，比如酮或醛。然后所述附着部分与酮或醛反应形成本发明所需的化合物。羰基活性附着部分的例子包括，但不限于肼、酰肼、O-取代的羟胺、α-β-不饱和酮，以及H2C＝CH-CO-NH-NH2。可以用于形成发明所述结合分子的其它附着部分的例子以及修饰巯基部分的方法在Pratt，M.L et al.J Am Chem Soc.2003 May 21；125(20)：6149-59；和Saxon，E.Science.2000Mar17；287(5460)：2007-10中有描述。
连接分子可以是任何能与效应物部分，或效应物的衍生物发生反应，形成发明所述结合分子的分子。例如，效应物部分可以借助二硫键连接到分子的其它部分。在这种情况中，连接部分的选择保证它能与合适的效应物部分衍生物发生反应，从而使得该效应物部分附着到发明所述结合分子上。如上所述，可以选择在合适的环境中，接头能被切割的连接部分和/或整个接头。
特别优选的接头分子包括，例如N-琥珀酰亚胺3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯(SPDP)(参见，例如Carlsson et al.，Biochem.J.，173，723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺4-(2-嘧啶二硫)丁酸酯(SPDB)(参见，例如美国专利4,563,304)、N-琥珀酰亚胺4-(2-嘧啶二硫)戊酸酯(SPP)(参见，例如CAS Registry number341498-08-6)、N-琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)(参见，例如Yoshitake et al.，Eur.J.Biochem.，101，395-399(1979))和N-琥珀酰亚胺4-甲基-4-[2-(5-硝基-吡啶基)—二硫]戊酸酯(SMNP)(参见，例如美国专利4,563,304)。最优选的用于发明所述组合物的接头分子是SPP、SMCC和SPDB。在一个优选实施方案中，用SPDB将效应物部分连接到发明所述结合分子上。
优选用于本发明的细胞毒性效应物部分是细胞毒性药物，特别是用于癌症疗法的。本文中，″细胞毒素或细胞毒试剂″意味着任何对细胞生长和增殖有害的试剂，其可能表现为使细胞和恶性肿瘤减少、抑制或破坏。示范性的细胞毒素包括，但不限于，放射性核素、生物毒素、酶学活性毒素、细胞生长抑制剂或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体和生物应答调节剂(比如细胞因子)。任何阻滞或减慢免疫反应性细胞或恶性肿瘤细胞生长的细胞毒素均在本发明范围内。
细胞毒素的例子通常包括，细胞生长抑制剂、烷基化试剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂等等。与本发明相容的示范性的细胞生长抑制剂包括烷基化物质，比如双氯乙基亚胺(mechlorethamine)、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，还有亚硝基脲化合物，比如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。
特别优选的偶联部分是美登木素生物碱。美登木素生物碱最初分离自东非一种属于美登木属的灌木，但后来发现它也是土壤细菌如珍贵束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)的代谢物(参见，例如美国专利3,896,111)。本领域已知美登木素生物碱包括美登素(maytansine)、美登木醇(maytansinol)、美登木醇的C-3酯以及其它美登木醇类似物和衍生物(参见，例如美国专利5,208,020和6,441,163)。美登木醇的C-3酯可以是天然的或合成的。并且，天然和合成C-3美登木醇酯可以归类为简单羧酸的C-3酯，或与N-甲基-L-丙氨酸形成的C-3酯，后者比前者细胞毒性更强。合成的美登木素生物碱类似物是本领域已知的，在例如Kupchan et al.，J.Med.Chem.，21，31-37(1978)中有描述。制备美登醇及其类似物和衍生物的方法在例如美国专利4,151,042中有描述。
适合作为抗体偶联物的美登木素生物碱可以用本领域已知的方法从天然来源分离，合成制备，或者半合成制备。此外，可以通过任何合适的方式对美登木素生物碱进行修饰，只要最后的偶联物分子保留了足够的细胞毒性。
特别优选的包含连接部分、含有活性化学基团的美登木素生物碱是美登木醇的C-3酯和它们的类似物，其中连接部分含有二硫键，附着部分包含N-琥珀酰亚胺或N-磺基琥珀酰亚胺酯。美登木素生物碱上的许多位点可以作为通过化学键与连接部分连在一起的位置，例如通过效应物附着部分。例如，带有羟基的C-3位点、修饰有羟甲基的C-14位点、修饰有羟基的C-15位点以及带有羟基基团的C-20位点都很有用。最优选的连接部分是与美登木醇的C-3位点连在一起。最优选的，与发明所述组合物联系在一起使用的美登木素生物碱是N.sup.2′-去乙酰-N.sup.2′-(-3-巯基-1-氧代丙基)-美登木素(DM1)或N.sup.2′-去乙酰-N.sup.2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登木素(DM4)。
带有其它化学键的连接部分，和其它美登木素生物碱一样也可以用于本发明的情况中。可以引入所述连接部分的其它化学键的特定例子包括以上描述的，比如酸敏性键、硫醚键、光敏键、对肽酶敏感键和对酯酶敏感键。制备带有连接部分和/或效应物附着部分的美登木素生物碱在例如美国专利5,208,020、5,416,064和6,333,410中有描述。
美登木素生物碱的连接部分(和/或效应物附着部分)通常，并且优选是更大的接头分子的一部分，所述接头分子是用来将抗体与美登木素生物碱连在一起的。任何合适的接头分子都可以用于本发明，只要该接头分子保证美登木素生物碱和抗体分别保留了它们的细胞毒性和导向特点。连接分子通过化学键(如上所述)将美登木素生物碱连到抗体上，因此美登木素生物碱和抗体是化学偶联(例如，共价结合)在一起的。希望连接分子通过二硫键或硫醚键将美登木素生物碱化学偶联到抗体上。最优选的，抗体是借助二硫键偶联到美登木素生物碱上的。
其它优选的细胞毒试剂种类包括，例如蒽环霉素(anthracycline)族药物、长春花药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷酸、蝶啶族药物、diynenes以及鬼臼毒素。这些种类中特别有用的包括，例如阿霉素、洋红霉素(carminomycin)、柔红霉素daunorubicin(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、氨基喋呤(aminopterin)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤(methopterin)、普卡霉素(mithramycin)、链黑菌素(streptonigrin)、二氯甲胺蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素(porfiromycin)、5-氟脲嘧啶、氟尿苷、喃氟啶(ftorafur)、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞嘧啶(cytosinearabinoside)，鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物，比如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷，马法兰(melphalan)，长春花碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，异长春碱(leurosidine)，长春地辛(vindesine)，环氧长春碱(leurosine)等等。还有一些与本文的教导相容的细胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷(taxane)，松胞菌素B(cytochalasin B)，短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、吐根碱(emetine)，鬼臼噻吩甙(tenoposide)，秋水仙碱(colchicin)、二羟基炭疽菌素、二酮(dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及它们的类似物或同系物。激素和激素拮抗剂，比如皮质类固醇激素，例如***(prednisone)；孕激素，例如羟基孕酮或medroprogesterone；***，例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)；抗***，例如他莫昔芬；雄激素，例如睾酮，以及芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特(aminogluthetimide)也与本文的教导相容。正如前面提到的，本领域技术人员可以对所需化合物进行修饰，从而使得该化合物的反应更方便制备发明所述偶联物。
一例特别优选的细胞毒素包含抗肿瘤抗生素中烯二炔(enediyne)家族的成员或衍生物，包括加里车霉素(calicheamicin)、esperamicins或dynemicins。这些毒素非常强力，通过切割核DNA导致细胞死亡。与能被体内切割产生许多无活性但是有免疫原性的多肽片段的蛋白质毒素不同，象加里刹霉素、esperamicins和其它烯二炔这样的毒素是基本没有免疫原性的小分子。这些非肽毒素是通过以前用于标记单克隆抗体和其它分子的技术化学连接到二聚体或三聚体上的。这类连接技术包括借助仅存在于构建物Fc部分上的N-连接的糖残基发生的位点特异性连接。这种定点连接技术的优势是减少了连接对构建体的结合特性的可能影响。
应当意识到，在其它细胞毒素中，多肽也可以与生物毒素相关联，比如蓖麻毒蛋白(ricin)亚基A、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素、肉毒毒素(botulinum)、cyanginosins、石房蛤毒素(saxitoxin)、志贺毒素(shigatoxin)、破伤风、河豚毒素(tetrodotoxin)、单端孢霉毒素(trichothecene)、致震颤真菌毒素(verrucologen)或是毒性酶。优选的，利用能直接表达抗体-毒素构建体的基因工程技术来制备这些构建体。其它能与发明所述多肽相关联的生物应答调节剂包含细胞毒素，比如淋巴因子和干扰素。就本说明书公开内容而言，本领域技术人员应当能很容易地利用常规技术制成这类构建体。
另一类可以与所公开多肽联合使用的相容生物毒素是放射增敏药物，其可能能被有效地定向到肿瘤或免疫反应性细胞。这类药物增加了它们对电离辐射的敏感性，从而提高了放疗法的效果。被肿瘤细胞内在化的抗体偶联物会将放射增敏剂递送到细胞核附近，那里的放射增敏作用最强。没有发生结合的连接有放射增敏剂的发明所述多肽会很快从血液中被清除，使其余的放射增敏试剂局限于目标肿瘤中，而在正常组织中只有最低的摄取。从血液中迅速清除后，以三种方式之一进行辅助放疗：1)特异针对肿瘤的体外照射，2)直接植入肿瘤的放射性或3)用相同的导向抗体进行***放射免疫疗法。这个方法的一个很有吸引力的变化是将治疗放射性同位素附着到放射增敏的免疫偶联物上，从而给患者提供了给予单种药物的方便。
在一实施方案中，可以偶联一个能够提高多肽稳定性或效力的部分。例如，在一实施方案中，可以给发明所述多肽偶联上PEG以便提高它们的体内半衰期(Leong，S.R.，et al.2001.Cytokine 16：106；2002；Adv.inDrug Deliv.Rev.54：531；or Weir et al.2002.Biochem.Soc.Transactions30：512)。
如前面提到的，相容细胞毒素可以包含前药。本文中，名词“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物，与亲本药物相比，它们对肿瘤细胞的细胞毒性低，能被酶法激活或转化成活性更高的亲本形式。与发明相容的前药包括，但不限于，含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药，任选含有被取代苯氧乙酰胺的前药或任选含有被取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前药，它们能被转化为细胞毒性更高的游离型药物。在一实施方案中，细胞毒性试剂，比如美登木素生物碱被以前药的形式给予，在二硫键被水解后释放。可以衍生成前药形式用于本发明的细胞毒性药物的进一步例子包括上面描述过的那些化疗试剂。
V.多肽的给药
制备并将发明所述多肽给予受试者的方法是本领域技术人员所熟知或很容易确定的。本发明的多肽的给药途径可以是口服、肠胃外、经吸入或体表。名词“肠胃外”用于本文包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或***给药。通常优选静脉内、动脉内、皮下和肌内形式的肠胃外给药方式。所有这些给药方式都明显被认为是本发明范围内的，但一种给药形式是用于注射，特别是静脉内或动脉内注射或点滴的溶液。一般来说，适用于注射的医药组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酸酯)，任选稳定剂(例如人白蛋白)等。但是，在其它与本文教导相容的方法中，可以将多肽直接递送到有害细胞群体的部位，从而提高患病组织与治疗剂的接触。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(比如橄榄油)以及可注射的有机酯(比如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的培养基。在本发明中，可药用载体包括，但不限于0.01-0.1M，优选0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐水。其它常见肠胃外载体包括磷酸钠溶液、Ringer′s右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的Ringer′s溶液，或者混合油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，比如基于Ringer′s右旋糖的等等。还可以有防腐剂和其它添加剂，例如象抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更具体地说，适用于注射用途的医药组合物包括无菌水性溶液(当是水溶性的)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在这些情况中，所述组合物必须是无菌的，处于容易进行注射器操作的液态。应当在制造和储存条件下是稳定的，优选抗微生物(比如细菌和真菌)污染地保存。载体可以是溶剂或分散体介质，其含有例如水、乙醇、多醇(例如，甘油、丙二醇和液态丙二醇等)，和它们的合适混合物。可以利用包被比如卵磷脂、在分散体的情况中维持所需颗粒大小，以及使用表面活性剂来保持合适的流动性。预防微生物的作用可以用各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选组合物中包括等渗剂，例如糖、多醇(比如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过在组合物中包括能延迟吸收的发生的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以将注射组合物的吸收延长。
在任何情况中，可将所需量活性化合物(例如，多肽自身或联合其它活性试剂)、与所需的如本文所列的一或多种成分，一起引入合适溶剂中，过滤除菌，制得无菌注射液。通常将活性化合物引入含有基本分散体介质的无菌载体和以上列举的其它所需成分，制得分散体系。对于制备无菌注射液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤溶液产生出活性成分和任何其它所需成分的粉末。用于注射的制剂根据本领域已知的方法经过加工、加入容器(比如安瓿、袋子、瓶子、针筒或小瓶)，在无菌条件下封口。进一步，可以将制剂包装，以试剂盒的形式出售，象待审美国专利申请09/259,337和09/259,338中描述的那些，这两份申请以参考文献方式引入本文。这类制造产品优选带有标签或包装插页，表明相关组合物用于治疗患有或易得自身免疫或赘生性紊乱的对象。
发明所述组合物用于治疗上述状况的有效剂量根据许多不同因素而变化，这类因素包括给药方式、靶位点、患者的生理状况、患者是人还是动物、给予的其它药物，以及处理是预防性还是治疗性的。通常，患者是人，但是包括转基因哺乳动物在内的非人哺乳动物也可以被处理。可以用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定以便优化安全性和效果。
用抗体进行被动免疫时，剂量可以处于例如约0.0001到100mg/kg，更通常是0.01到mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或处于1-10mg/kg的范围，优选至少1mg/kg。以上范围内的中间剂量也属于本发明的保护范围。
可以每天、隔天、每周或按照经验决定的其它时间表给予受试者这样的剂量。示范性的治疗需要在长时间内，例如至少6个月内以多次剂量来给予。其它示范性的治疗方案要求每两周一次，或每月一次或每3到6个月一次给药。示范性的剂量安排包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg、隔天30mg/kg或者每周60mg/kg。在一些方法中，同时给予两种或多种具有不同结合特性的单克隆抗体，这种情况中，每种给予的抗体的剂量可能落在提到的范围内。
本发明的结合分子可以采取多次给药的方式。各个剂量之间的间隔可以是例如，每天、每周、每月或每年。间隔也可以是不规律的，通过测量患者血液中多肽或靶分子的浓度来决定。在一些方法中，调节剂量使血浆结合分子和毒素浓度达到例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml。替代的，结合分子可以以缓释剂型给予，这种情况给药的频率要低。剂量和给药频率根据患者体内抗体的半衰期而不同。通常，人源化抗体表现出最长的半衰期，然后是嵌合抗体和非人源化抗体。在一实施方案中，以未偶联的形式给予发明所述结合分子。在另一实施方案中，发明所述多肽以偶联形式多次给予。还有一实施方案中，发明所述结合分子以未偶联形式给予，然后给予偶联形式的，或者反过来。
给药的剂量和频率可能根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性用途中，将含有所述抗体的组合物或混合物给予还没有处于患病状态的患者来提高其抵抗力。这样的用量定义为“预防有效剂量”。这种用途中，确切的用量还是要取决于患者的健康状况和整体免疫能力，但通常在每剂量0.1到25mg，特别是0.5到2.5mg每剂量。在较长时间内，以不太频繁的频率给予较低剂量。一些患者要在有生之年持续接受治疗。
在治疗性用途中，有时需要以较短的间隔给予较高剂量(例如，每次剂量约1到400mg/kg的结合分子或抗体；对放射性免疫偶联物来说常见的是5到25mg，细胞毒素-药物偶联分子要更高的剂量)，直到疾病进展被减轻或终止，优选直到患者的疾病症状得到部分或全部改善。之后，可以对患者执行预防性方案。
在一实施方案中，可以用编码发明所述多肽的核酸分子(例如在载体中)来处理受试者。编码多肽的核酸剂量在每个患者约10ng到1g、100ng到100mg、1μg到10mg或30-300μgDNA的范围内。对于感染性病毒载体，剂量在每次10-100，或更多病毒粒子。
治疗剂可以通过肠胃外、体表、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内的方式用于预防性和/或治疗性处理。抗体的给药优选以肌内注射或静脉内滴注进行。在一些方法中，一些治疗抗体直接注射到颅内。一些方法中，抗体以缓释组合物或装置的形式给予，比如MedipadTM装置。
任选将本发明的试剂与其它对需要处理(例如，预防性或治疗性)的紊乱或状况有效的试剂一起联合给药。优选的其它试剂是那些被本领域认可、常规性给予特定紊乱的试剂。
90Y标记的发明所述多肽的有效一次治疗剂量(即治疗有效量)在约5到75mCi，更优选在约10到40mCi。131I标记的抗体的单次治疗骨髓非清除性有效剂量在约5到70mCi，更优选约5到40mCi。131I标记的抗体的单次治疗清除有效剂量(即，可能需要自体骨髓移植)在约30到600mCi，更优选在约50到500mCi。就嵌合抗体而言，由于其在循环***的半衰期比小鼠抗体长，碘-131标记的嵌合抗体的一次治疗非骨髓清除有效剂量在约5到40mCi，更优选少于约30mCi。对于例如111In标记，成像要求的标准通常少于5mCi。
虽然对于131I和90Y已取得了大量的临床检验，其它放射标记也是本领域已知的，曾被用于类似的目的。还有另外一些放射性同位素被用于成像。例如，其它与本发明范围相容的放射性同位素包括，但不限于123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211At和213Bi。在这方面，α、β和γ放射源均与本发明相容。此外，参考本公开文本，应当承认本领域技术人员可以容易地确定哪些放射性核素与选定的治疗进程相匹配，而不需进行过多实验。用于这一目的，其它曾被用于临床诊断的放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga以及111In。抗体也曾被标记上各种放射性核素可能用于定向免疫治疗(Peirersz et al.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核素包括188Re和186Re，以及略微少见的199Au和67Cu。美国专利5,460,785提供了涉及到这些放射性同位素的另外一些资料，该专利以参考文献方式引入本文。
无论以偶联或未偶联形式使用本发明的多肽，都应当意识到，本发明的主要优点是可以将这些多肽用于骨髓抑制患者，特别是正在进行，或已进行了辅助治疗，比如放疗或化疗的那些患者。在其它优选实施方案中，多肽(也是偶联或未偶联形式)可以与化疗剂联合用于治疗方案中。本领域技术人员明白，这类治疗方案可能包含将本文公开的抗体与一或多种化疗剂顺序、同时、合并或共同进行给药。本发明这个方面特别优选的实施方案包含给予偶联了毒素的结合分子，例如偶联了美登木素生物碱，比如D4美登木素生物碱。
虽然多肽可以象上面描述的进行给药，应当强调的是在其它实施方案中，可以将偶联和未偶联多肽给予除此之外健康的患者作为第一组治疗剂。在这类实施方案中，可以将多肽给予红髓储备正常或达到平均水平的患者，以及/或者给予未曾、没有进行辅助疗法(比如体外照射或化疗)的患者。
但是，象上面讨论过的，本发明的选择实施方案包含将所述多肽给予骨髓抑制患者，或者与一或多种辅助疗法，比如放疗或化疗联合使用(即联合治疗方案)。本文中，联合或组合给予多肽和辅助疗法意味着顺序、同时、共同、合并、相伴或同期给予或采用所述疗法和本文公开的多肽。本领域技术人员会理解，给予或采用联合治疗方案的各种成分时应当定时以便提高治疗的整体效果。例如，应当以标准的已知治疗程序给予化疗剂，然后在几周内给予发明所述放射免疫偶联物。相反，可以静脉内给予连接了细胞毒素的多肽，然后进行肿瘤局部的体外放射。在还有一些实施方案中，可以将多肽与一或多种选定的化疗剂在一次就诊时给予。技术人员(例如，有经验的肿瘤专科医生)根据选定的辅助疗法和本说明书的教导，能很容易地确定有效的联合治疗方案，而不需过多实验。
在这方面，应当意识到，多肽(偶联或未偶联的)和化疗剂的组合可以按照任何顺序，任何时间段，只要给患者提供治疗效果。这就是说，化疗剂和多肽可以以任何顺序给予或者同时给予。在一些实施方案中，本发明的多肽被给予已经接受过化疗的患者。在其它实施方案中，多肽和化疗基本上同时或同期给予。例如，患者在化疗疗程中可以被给予所述结合分子。在优选实施方案中，在接受任何化疗剂或治疗的一年内给予结合分子。在其它优选实施方案中，在任何化疗剂或治疗的10、8、6、4或2个月内给予多肽。还有的优选实施方案中，接受任何化疗剂或治疗的4、3、2或1周内给予多肽。再一些优选实施方案中，接受选定化疗剂或治疗的5、4、3、2或1天内给予多肽。应当进一步意识到，两种试剂或治疗可以在几小时或几分钟内给予患者(即基本同时的)。
此外，遵循本发明，骨髓抑制患者意味着任何血液计数下降的患者。本领域技术人员应当意识到，有几种血液计数参数被常规用作骨髓抑制的临床表征，可以很容易地测量患者体内的骨髓抑制程度。本领域认同的骨髓抑制测量的例子是中性粒细胞绝对数(ANC)或血小板计数。这种骨髓抑制或部分骨髓抑制可能是多种生化紊乱或疾病的结果，或者更有可能的，是先前化疗或放疗造成的后果。这方面，本领域技术人员会明白，曾经接受常规化疗的患者一般会表现出红髓储备下降。正如上面讨论过的，这样的受试者通常不能用最佳水平的细胞毒素(即放射性核素)来治疗，因为会出现不能接受的副作用(比如贫血或免疫抑制)导致更高的死亡率或致残率。
更具体的说，发明所述偶联或未偶联多肽可以用来有效地治疗ANC低于约2000/mm3或血小板计数低于约150,000/mm3的患者。更优选的，本发明的多肽可以有效地治疗ANC低于约1500/mm3、低于约1000/mm3或者更优选低于约500/mm3的患者。类似的，本发明的多肽可以用来有效地治疗血小板计数低于约75,000/mm3、低于约50,000/mm3或者甚至低于约10,000/mm3的患者。更一般的来说，本领域技术人员可以容易地采用国家制定的指南和程序确定患者是否骨髓抑制。
如上文指出的，许多骨髓抑制患者已经经过了多个疗程，包括化疗、植入放疗或体外放射。在后一种情况中，体外放射源是用于对恶性肿瘤进行局部辐射的。对于植入放疗法，放射性试剂通过手术放置到恶性肿瘤内部，从而选择性地辐射疾病部位。任何情况中，本文公开的多肽都可以用于治疗表现出骨髓抑制的患者的紊乱，而不管是什么原因引起的骨髓抑制。
在这方面，应当进一步意识到，本发明的多肽可以与任何能消除、减少、抑制或控制赘生性细胞的体内生长的化疗剂组合起来使用(例如，提供联合治疗方案)。正如讨论过的，这类试剂经常导致红髓储备的下降。它的下降可能是全部或部分由于发明所述化合物的骨髓毒性消除引发的，这使得能够积极地治疗这些患者的瘤形成。在其它优选实施方案中，本文公开的放射标记免疫偶联物可以有效地与能提高赘生性细胞对放射性核素的易感性的放射增敏剂一起使用。例如，可以在放射标记的结合分子已基本从血液中清除，但在肿瘤部位仍维持在治疗有效水平时，给予放射增敏化合物。
考虑到本发明的这些方面，与发明相容的示范性的化疗剂包括烷基化试剂、长春碱类(例如长春新碱和长春花碱)、甲苄肼(procarbazine)，甲氨喋呤和***。四种药物的组合MOPP(mechlethamine(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、甲苄肼和***)对治疗各种淋巴瘤非常有效，构成本发明的一个优选实施方案。对于MOPP抗性的患者，可以使用ABVD(例如，阿霉素、博莱霉素、长春花碱和达卡巴嗪(dacarbazine))、ChlVPP(苯丁酸氮芥(chlorambucil)、长春花碱、甲苄肼和***)、CABS(洛莫司汀(lomustine)、多柔比星、博莱霉素和链脲霉素(streptozotocin))、MOPP加上ABVD、MOPP加上ABV(多柔比星、博莱霉素和长春花碱)或BCVPP(卡莫司汀(carmustine)、环磷酰胺、长春花碱、甲苄肼和***)的组合。对于标准剂量和时间安排参见Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler(MalignantLymphomas，in HARRISON′S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE1774-1788(KurtJ.Isselbacher et al.，eds.，13thed.1994))和V.T.DeVita etal.，(1997)以及他们引用的参考文献。这些疗法可以不做变动地使用，或者根据具体患者的需要进行改动，与本发明描述的一或多种多肽联合使用。
适用于本发明的其它方案包括使用一种烷基化试剂，比如环磷酰胺或苯丁酸氮芥；或者组合物，比如CVP(环磷酰胺、长春新碱和***)、CHOP(CVP和多柔比星)、C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、***和甲苄肼)、CAP-BOP(CHOP加上甲苄肼和博莱霉素)、m-BACOD(CHOP加上甲氨喋呤，博莱霉素和甲酰四氢叶酸(leucovorin))、ProMACE-MOPP(***、甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氢叶酸加上标准MOPP)、ProMACE-CytaBOM(***、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博莱霉素、长春新碱、甲氨喋呤和甲酰四氢叶酸)以及MACOP-B(甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、固定量的***，博莱霉素和甲酰四氢叶酸)。本领域技术人员很容易给这些治疗方案确定标准剂量和时间安排。CHOP还曾被与博莱霉素、甲氨喋呤、甲苄肼、氮芥、阿糖胞嘧啶和依托泊苷联合使用。其它相容化疗剂包括，但不限于2-氯去氧腺苷(2-CDA)、2′-去氧肋间型霉素和氟达拉宾(fludarabine)。
对于有中等或高度NHL的患者，没有达到缓解或者发生复发的要使用救援治疗。救援治疗采用比如阿糖胞嘧啶、顺铂、依托泊苷和异环磷酰胺这些药物，单独使用或联合使用。对于复发或侵略型形式的一些赘生性紊乱，经常使用以下方案：IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨喋呤和依托泊苷)、MIME(丙米腙(methyl-gag)、异环磷酰胺、甲氨喋呤和依托泊苷)、DHAP(***(dexamethasone)、高剂量阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、顺铂)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲苄肼、***和博莱霉素)以及CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和***)，它们的给剂频率和时间安排都是公知的。
与本发明的多肽联合使用的化疗剂的量可以根据受试者而不同，或者可能按照本领域已知的进行给药。参见例如，Bruce A Chabner et al.，Antineoplastic Agents，in Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics1233-1287((Joel G.Hardman et al.，eds.，9th ed.1996)。
在一实施方案中，本发明的结合分子可以作为一种预防性疗法给予已经、正在或者将要进行手术的受试者，所述手术是例如去除原发肿瘤、转移或癌前生长或组织。
在另一实施方案中，本发明的结合分子可以与生物制剂一起使用。可以用于治疗癌症的生物制剂是本领域已知的，发明所述结合分子可以与例如这些已知的生物制剂一起使用。
例如，FDA已批准将以下生物制剂用于治疗乳腺癌：Herceptin_(曲妥珠单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA；一种人源化单克隆抗体，在HER2阳性乳腺癌中有抗肿瘤活性)；Faslodex_(氟维司群，AstraZenecaPharmaceuticals，LP，Wilmington，DE；一种用于治疗乳腺癌的***受体拮抗剂)；Arimidex_(阿那曲唑，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；一种非类固醇类芳香化酶抑制剂，它能阻断产生***所需要的芳香化酶)；Aromasin_(依西美坦，Pfizer Inc.，New York，NY；一种用于治疗乳腺癌的不可逆的类固醇类芳香化酶)；Femara_(来曲唑，Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，NJ；一种FDA批准用于治疗乳腺癌的非类固醇类芳香化酶抑制剂)；以及Nolvadex_(他莫昔芬，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；一种FDA批准用于治疗乳腺癌的非类固醇类抗***)。其它能与发明所述结合分子组合使用的生物制剂包括：AvastinTM(贝伐单抗，Genentech Inc.；FDA批准的第一个设计用于抑制血管新生的疗法)；和Zevalin_(替伊莫单抗，Biogen Idec，Cambridge，MA；一种目前批准用于治疗B细胞淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
此外，FDA还批准了以下生物制剂用于治疗大肠癌：AvastinTM；ErbituxTM(爱必妥，ImClone Systems Inc.，New York，NY，和Bristol-Myers Squibb，New York，NY；是一种定向抗表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；Gleevec_(甲磺酸伊马替尼；蛋白激酶抑制剂)；和Ergamisol_(盐酸左旋咪唑，Janssen Pharmaceutica Products，LP，Titusville，NJ；FDA1990年批准的一种免疫调节剂，与5-氟尿嘧啶联合用于Dukes’C期结肠癌患者手术切除后的辅助治疗)。
目前批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的疗法包括：Bexxar_(托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗，GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC；一种多步骤治疗，涉及到连接有放射性分子(碘I-131)的小鼠单克隆抗体(托西莫单抗))；Intron_A(干扰素α-2b，Schering Corporation，Kenilworth，NJ；一种批准与含有蒽环霉素的联合化疗((例如，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***[CHOP]))一起用于治疗卵泡非霍奇金淋巴瘤的干扰素)；Rituxan_(利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA，和Biogen Idec，Cambridge，MA；一种批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体；Ontak_(地尼白介素，Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego，CA；由白喉毒素的一个片段与白细胞介素-2遗传融合(genetically fused)构成的融合蛋白)；以及Zevalin???(替伊莫单抗，Biogen Idec；FDA批准用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的放射标记单抗)。
用于治疗白血病，能与本发明的结合分子联合使用的示范性生物制剂包括Gleevec_；Campath_-1H(阿仑单抗，Berlex Laboratories，Richmond，CA；一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病的单抗)。此外，Genasense(奥利莫森，Genta Corporation，Berkley Heights，NJ；一种开发中的用于治疗白血病的BCL-2反义治疗剂(例如单独使用或者与一或多种化疗剂，比如氟达拉宾和环磷酰胺联合使用)可能与要求保护的结合分子一起给药。
用于治疗肺癌，示范性的生物制剂包括TarcevaTM(盐酸厄洛替尼，OSIPharmaceuticals Inc.，Melville，NY；一种设计用来寻靶到人表皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。
用于治疗多发性骨髓瘤，示范性的生物制剂包括Velcade_Velcade(保特佐米，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge MA；一种蛋白酶体抑制剂)。其它生物制剂包括Thalidomid_(沙利度胺，Clegene Corporation，Warren，NJ；一种免疫调节剂，似乎具有多种作用，包括能抑制骨髓瘤细胞的生长和存活以及血管新生)。
其它示范性的生物制剂包括由ImClone Systems，Inc.，New York，NY开发的MOAB IMC-C225。
此外，要求保护的结合分子可以与疫苗或其它试剂(例如，细胞因子)一起给予以便调节抗癌免疫应答。例如，Melacine_(Corixa Corporation，Seattle，WA)是一种异源肿瘤疫苗，曾有报道它在治疗T3N0M0切除的黑素瘤中取得很有前途的结果。GMK_(Progenics Pharmaceutical，Inc.，Tarrytown，NY)是作为辅助的第III期试剂给予黑素瘤复发高危险性患者的神经节苷酯抗原。抗胃泌素治疗疫苗(Anti-gastrin therapeutic vaccine)_(AphtonCorporation，Miami，FL)中和激素G17和glyextened，正在大肠癌、胰腺癌和胃癌患者的第III期临床实验。CeaVac_(Titan Pharmaceuticals，Inc.，SouthSan Francisco，CA)是一种用于大肠癌研究的抗独特型抗体的疫苗。最后，Theratope_(Biomira Inc.，Edmonton，Alberta，Canada)是一种合成的碳水化合物治疗疫苗，正在研究它作为转移性乳腺癌患者的第III期试剂(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，2000)。
在另一实施方案中，本发明的结合分子可以和抗血管新生试剂一起给药，例如内皮抑制素(一种内源的、来源于肿瘤的内皮特异性抑制剂，它能终止微血管内皮细胞的产生)、抗VEGF抗体、沙利度胺，或基质金属蛋白酶抑制剂(抑制血管基底膜的合成和降解)。
如前文所述，可以将本发明的多肽、其免疫活性片段或重组体以治疗有效量用于体内治疗哺乳动物的紊乱。在这方面，应当意识到所公开抗体要配制成能协助活性试剂的给药并提高其稳定性的形式。优选的，符合本发明的医药组合物包含可药用无毒、无菌载体，比如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。为了本发明的目的，偶联或未偶联治疗试剂的医药有效量多肽、其免疫活性片段或重组体应该理解为这样的用量，其足够实现与靶分子的有效结合，并取得效果，例如减轻疾病或紊乱的症状或者检测到靶物质或细胞。在肿瘤细胞的情况中，优选所述多肽能与赘生性或免疫活性细胞上的选定免疫活性抗原发生相互作用，并能引起这些细胞的死亡增加。当然，可以将本发明的医药组合物单剂量或多次剂量给予，从而提供医药有效量的多肽。
在本公开的范围内，可以将发明所述多肽按照前面提到的治疗方法以足够产生治疗或预防效果的用量给予人或其它动物。可以将本发明的多肽以常规剂量形式给予这样的人或其它动物，即通过将发明所述抗体与常规可药用载体或稀释剂按照已知技术结合在一起制备的。本领域技术人员会意识到，可药用载体或稀释剂的形式和特点受到与之结合使用的活性成分的量、给药途径和其它公知变量的限制。本领域技术人员还会意识到，包含一或多种所述多肽的混合物可能被证明特别有效。
VI.使用方法
本发明的分子可以用于诊断或治疗目的。发明的优选实施方案提供了用于诊断和/或治疗一些紊乱的化合物、组合物、试剂盒和方法，所述紊乱是例如需要这类治疗的哺乳动物受试者的赘生性紊乱。优选的，所述受试者是人。
本发明的多肽可以用于多种不同用途。例如，在一实施方案中，所述结合分子可以用于利用例如ELISA检测法体外探测Cripto。示范性的检测方法是本领域已知的，参见例如美国专利申请20040077025。
在另一实施方案中，所述结合分子可以用于利用成像技术探测是否存在带有Cripto的细胞。对于这类应用，可能最好象下文进一步描述的那样，给结合分子偶联一个可检测部分，例如放射标记。
在另一实施方案中，所述结合分子可以用于减少或清除被本发明的结合分子识别到的带有靶分子(例如Cripto的表位)的细胞。在另一实施方案中，所述结合分子能有效地降低循环***中可溶性靶分子的浓度或将其清除。
在一实施方案中，本发明的结合分子能够减小肿瘤的大小、抑制肿瘤生长并且/或者延长带有肿瘤的受试者的存活时间。相应的，本发明还涉及通过将有效、无毒剂量的多肽给予人或动物来治疗人或其它动物体内肿瘤的方法。本领域技术人员通过常规实验应当能够确定为了治疗恶性肿瘤，什么是多肽的有效、无毒的剂量。例如，多肽的治疗活性用量根据一些因素而不同，这些因素包括比如疾病阶段(例如，第1期相对第4期)、年龄、性别、综合征和受试者的体重，以及抗体在受试者体内引发所期望的反应的能力。可以调节剂量方案来提供最佳治疗反应。例如，可以每天给予几个分开的剂量，或者根据治疗的不良状况相应地减少剂量。但是，通常有效剂量预期在约0.05到100毫克每公斤体重每天，更优选每天约0.5到10毫克每公斤体重。
为了澄清，“哺乳动物”是指任何划分为哺乳动物的动物，包括人、家养的和养殖的动物，以及动物园、运动动物或宠物，比如狗、马、猫、牛等。优选，所述哺乳动物是人。“处理”是指治疗性处理和预防或防止性措施。需要处理的包括已患有疾病或紊乱的，也包括要给他们预防所述疾病或紊乱的。因此，哺乳动物可能已被诊断为患有该病或紊乱，或者易患该病或对该病易感。
一般来说，本公开的发明可以用于预防性或治疗性处理任何含有标记的赘生物，所述标记使得结合分子能够寻靶到癌细胞上。在一个优选实施方案中，本发明的结合分子被用于处理实体瘤。可以处理的示范性的癌症包括，但不限于***、胃癌，比如结肠、皮肤、乳腺、卵巢、肺和胰腺癌。在另一实施方案中，本发明的抗体可以用于处理卡波西肉瘤、CNS瘤形成(毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤)、黑素瘤、胃肠道和肾肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤(优选多形性胶质母细胞瘤)、平滑肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢的***状囊腺癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm′s tumor)或小细胞肺癌。应当意识到，可以在参考本公开文本的情况下，无需过多实验，由与上面提到的瘤有关的肿瘤相关分子得到合适的多肽。
示范性的可接受本发明所述处理的血液肿瘤包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(Burkitt′s型白血病)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和单核细胞白血病。应当意识到，本发明的化合物和方法对治疗各种B细胞淋巴瘤尤其有效，包括低度恶性/滤泡型非霍奇金淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度恶性/滤泡型NHL、中度恶性袮漫性NHL、高度免疫母细胞性NHL、高度淋巴母细胞性NHL、高度小无裂细胞型NHL、肿块性病变NHL和Waldenstrom’s巨球蛋白血症。对本领域技术人员来说，显然这些淋巴瘤因为不断变化的分类***经常有不同的名称，患有划分到不同名称下的淋巴瘤的患者也可能受益于本发明的联合治疗方案。除了以上提到的赘生性紊乱，应当意识到本文公开的发明可以有利地用于治疗其它带有适合的肿瘤相关分子的恶性肿瘤。
在发明的一实施方案中，提供了能够特异结合Cripto的分子，并且所述分子能够抑制患者的肿瘤细胞生长，特别是那些由活化素B信号传导的消失或下降来介导的肿瘤生长。在一些实施方案中，肿瘤细胞是大脑、头部、颈部、***、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、尿道、宫颈、胰腺和胃肿瘤细胞。在其它实施方案中，本发明的结合分子特异结合Cripto，并抑制过表达Cripto的肿瘤细胞的生长。在一实施方案中，所述肿瘤细胞是过表达Cripto的细胞系，比如来源于脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、尿道、宫颈、胰腺和胃癌的细胞系。
本发明通过以下实施例进一步得到阐述，这些实施例不应被看作是限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和已公开的专利申请均以参考文献的方式引入本文。
实施例
实施例1：A和B同种型的鉴定
抗体分子溶液包含两种不同的同种型。一种是A型，它含有借助至少一个二硫键连在一起的重链分子。另一种是B型，它含有并未借助至少一个二硫键连在一起的重链分子。在完整γ1单抗(比如Rituxan_)中未见B型或者B型的出现几率非常低。但是，对于具有类似绞链的结构域删除(dd)构建体，B型出现的几率高得多。这两个同种型可以利用变性、非还原SDS-PAGE来区分。在结构域删除抗体制剂中，A型以120kDa的二聚体形式出现，而B型是60kDa的单体。
实施例2：鉴定CH2区删除单抗片段中的绞链区
绞链区可以进一步分成三个不同的区域：上游、中间和下游绞链区(Roux et al.J.Immunol.1998161：4083)。表3显示了涵盖IgG1和IgG3绞链中这些区域的多肽序列。IgG3绞链中部区域除了两个保守的半胱氨酸残基，还含有一个重复了三次的15个氨基酸的基序。用来自这些区域的氨基酸序列设计合成IgG1/IgG3连接肽。它们由对应位点226到238的上游绞链残基、对应位点239到241的中部绞链，和对应位点241EE到242的单IgG3中间绞链重复基序构成，再加上位点243添加的脯氨酸或者位点243、244和245分别添加的脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸(Kabat编号***)，然后是一个柔性Gly/Ser间隔(表2)。此外，新的连接肽被设计成在位点239或242含有取代半胱氨酸的丝氨酸，结合上在位点243添加的脯氨酸或者在位点243、244和245分别添加的脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸(Kabat编号***)。还制备了Pro243Ala244Pro245和Pro243连接肽。表2显示了亲本CH2区删除人源化CC49连接肽的氨基酸序列，该序列从IgG1绞链的第一个残基(位点226，Kabat编号***)开始到绞链/GlySer连接肽的最后一个残基。还通过与CC49的序列比对显示了各种连接肽设计，半胱氨酸残基的位点按Kabat编号***指示。
表2：绞链区连接肽序列
Figure A20068000721600971
表3：IgG1、IgG3和IgG4绞链区
IgG 上游绞链区 中间绞链区 下游绞链区
IgG1IgG3IgG4 EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：17)ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：20)ESKYGPP(SEQ ID NO：22) CPPCP(SEQ ID NO：18)CPRCP(EPKS CDTPPP CPRCP)3(SEQ ID NO：21)CPSCP(SEQ ID NO：23) APELLGGP(SEQ ID NO：19)APELLGGP(SEQ ID NO：19)APEFLGGP(SEQ ID NO：24)
实施例3.构建连接多肽和同种型的优先合成
将表2中显示的编码绞链区连接肽的核酸序列，利用重叠延伸(SOE)方法(Horton，R.M.1993 Methods in Molecular Biology，Vol15：PCRProtocols：Current Methods and applications.Ed.B.A.White)引入CH2区删除huCC49基因序列中。经DNA序列分析确认绞链区的正确修饰。用质粒DNA转化CHO DG44细胞以便稳定产生抗体蛋白。
构建含有表2所示8种设计的合成连接肽的CH2区删除huCC49抗体，并在CHO DG44细胞中制备抗体。从分离细胞系中收集上清液，经免疫检定法确定培养物上清液中的抗体浓度。来自每个细胞系含有从0到30ng总抗体蛋白的上清液经非还原性SDS-PAGE电泳，然后用偶联HRP的抗人K抗体进行蛋白印迹来探测CH2区删除huCC49的A型和B型。在这些情况下，A型以单个120kDa的同型二聚体迁移，B型是60kDa的双条带。还可以看到的是κ链的单体和二聚体。发现如SEQ ID NOs：5、26、32和33所示的连接肽均能提高所产生的A型的比例。这些结果表明，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)和G1/G3/Pro243+[Gly/Ser](SEQ ID NO：26)绞链造成即使不是全部，也是主要产生了A型CH2区删除huCC49抗体，而很少或没有可检测到的B型。相反，CH2区删除huCC49Cys242Ser：Pro243(SEQ IDNO：30)和CH2区删除huCC49Cys242Ser：Pro243Ala244Pro245(SEQIDNO：32)分别造成中等程度和明显地倾向于产生B同种型。
利用含有引入到huCC49抗体序列中的Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：32)和G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)连接肽的细胞系来产生抗体。Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]和G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽还被引入huCC49V2抗体序列，并制得细胞系(人源化CC49版本2序列是本领域已知的)。由CHO DG44细胞产生抗体，并用以下实施例4中描述的方法进行纯化。表4中报告了经过蛋白G和HIC步骤后A同种型的产量。从这些结果可以清楚地看到，CH2区删除抗体的绞链区中引入的修饰导致优先合成A同种型。按照实施例4描述的HIC纯化技术，纯化的HuCC49Pro230Ala231Pro232和HuCC49V2Pro230Ala231Pro232A型达到了98％以上。，只经过蛋白G柱子纯化，没有进一步HIC纯化的HuCC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245和HuCC49V2G1/G3/Pro243Ala244Pro245A型物质基本都以单峰在≥96％纯度洗脱出来。所有的抗体都经过大小排阻层析检验，发现是以单峰洗脱的，这表明抗体产物没有明显的凝聚或降解。
利用肽谱分析来确定CH2区删除HuCC49、HuCC49PAP和HuCC49G1/G3/PAP抗体之重链绞链区中的二硫键的完整性。按照以下描述将CH2区删除CC49抗体样品进行变性、还原并用胰蛋白酶消化：150ug的液份在HPLC水中稀释到100ml，在6M盐酸胍、50mM Tris pH8.0中做变性。通过加入20mM DTT，于37℃保温30分钟将样品还原。还原好的样品用50mM碘乙酸在37℃烷基化30分钟。加入过量DTT来终止烷基化反应。利用PD-10柱子将还原并烷基化的样品换到25mM TRIS，20mM CaCl2(pH7.5)的缓冲液中。向每个样品以1：15(w/w)比例加入胰蛋白酶，于37℃保温4小时。加入三氟乙酸(TFA)至终浓度为0.1％来终止消化反应。然后根据以下描述的层析条件对胰蛋白酶消化过的样品(15ug)进行分析。
经内切蛋白酶Lys-C消化来分析CH2区删除CC49抗体样品。变性还原样品的制备是通过向1.5mg/mL样品中加入终浓度为4M的盐酸胍和25mM的DTT。未还原样品的制备是给1.5mg/mL样品加入盐酸胍至终浓度为4M。将样品在37℃保温2小时。然后以1∶1(v/v)向样品中加入消化缓冲液(50mMTris，pH7.0和0.062AU/ml内切蛋白酶Lys-C)，样品在37℃保温15小时。15小时后，加入第二份酶(0.29mAU：ug抗体)，样品在37℃再保温6小时。加入终浓度0.1％的TFA来终止反应。然后按照下面描述的程序对非还原和还原的内切蛋白酶Lys-C消化过的样品(12ug)进行分析。
HPLC/质谱分析。在连有一台Agilent MSD单节四级质谱仪的Agilent
1100HPLC***上分析样品。使用了反相C18柱子(Vydac catalog number218TP52)，其洗脱***是水/0.1％TFA(v/v)(缓冲液A)和乙腈/0.1％TFA(v/v)(缓冲液B)，流速为0.2mL/分钟。加入柱后“TFA固定剂”溶液，即0.1mL/分钟的乙腈和乙酸(1∶1v/v)来提高电离。柱温度控制在45℃，于215和280nm监控洗脱谱。总的离子层析谱以正离子模式监测。将样品注射到柱子上，梯度在0％缓冲液B保持5分钟。洗脱的完成是在125分钟内从0到50％缓冲液B的线性梯度，然后75％缓冲液B洗10分钟，0％缓冲液B重新平衡30分钟。
在内切Lys-C还原分析中，所有的样品都没有检测到片段(L52-109)。这个片段疏水性极高，可以由于强相互作用没能从柱介质上洗脱下来。在所有的样品中也都检测到了相应的胰蛋白酶解片段(L68-109)。因为这些片段含有很多氨基酸，氨基酸相同百分比下降到了～89％同一性。此外，G1/G3/PAP的内切Lys-C分析也没有检测到片段(L68-119)，使得同一性降低到了～79％。
内切Lys-C非还原分析给出了好得多的结果。所有样品中都检测到片段(L52-109)与片段(L1-24)以二硫键连接。也检测到了所有其它二硫键，全部样品的总氨基酸同一性达到～99％。G1/G3/PAP样品在原来的(H224-227)CPPC绞链区下面显示出另外一个位于片段(H232-275)中的重链-重链二硫键。测量了工程化绞链区肽的理论和表观分子量。HuCC49ΔCH2绞链内切Lys-C非还原肽(残基H221-257)的表观MW为7419.4，与含有两个链间二硫键的绞链的计算质量7419.4g/mol很吻合。HuCC49ΔCH2PAP绞链内切Lys-C非还原肽(残基H221-260)的表观分子量为7949.7，也和含有两个链间二硫键的相连绞链的计算质量7949.8g/mol吻合较好。HuCC49ΔCH2G1/G3/PAP经过内切Lys-C的消化，由于含有15个氨基酸的γ3基序中Kabat位点241II的赖氨酸，产生了两个绞链非还原肽片段。残基H221-231和H232-275的肽片段表观分子量为2414.3和8782.6，分别与它们的计算质量2413.0和8782.0g/mol吻合很好。这些质量数据支持了这样的论点，即来源于HuCC49ΔCH2G1/G3/PAP的THTCPPCPEPK肽(残基H221-231)含有两个链间二硫桥。重要的是，包含残基H232-275的肽含有至少一个链间二硫桥，这与嵌合G1/G3/PAP绞链参与形成两个以上二硫键的观点是一致的。这些分析显示，HuCC49ΔCH2PAP绞链形成了两个重链链间二硫键。HuCC49ΔCH2G1/G3/PAP绞链形成了至少三个重链链间二硫键，但也可能是五个。可以肯定的是，片段HuCC49ΔCH2G1/G3/PAP残基H232-275含有最少一个链间二硫键，但是要区别含有三个链间二硫键的绞链区和含有一个、两个链间二硫键的绞链区的重量差别是不可能的。
表4.亲和层析(蛋白G)和HIC纯化后的A型抗体的百分比
CH2区删除抗体 A型抗体百分比
蛋白G之后 HIC纯化之后
HuCC49(连接肽SEQ ID NO：25) 60 98
HuCC4 9PAP(连接肽SEQ ID NO：32) 83 98
HuCC49 V2 PAP(连接肽SEQ ID NO：32) 90 99
HuCC49 G1/G3/PAP(连接肽SEQ ID NO：5) 98 未做
HuCC49 V2 G1/G3/PAP(连接肽SEQ ID NO：5) 96 未做
这些数据显示，新的工程化合成绞链区连接肽可以用于倾向性地形成A或B同种型。这些研究还揭示了，位点242(Kabat编号***)的半胱氨酸残基在合成CH2区删除抗体A型中的重要性。相应的，在一实施方案中，本发明的连接肽在位点239或242至少含有一个半胱氨酸。用丝氨酸取代位点239或242的半胱氨酸(例如，利用SEQ ID NO：28、29、30或31所示的连接肽)使CH2区删除抗体的生物合成移向B型。使用能够提高所产生A型的比例的连接肽会给产生、产量和/或稳定性方面带来改善。基于所有四种人抗体亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH3区的高度同源性，这些合成绞链区连接肽可以用于在任何抗体亚型中增加CH2区删除抗体A同种型的合成。相同和保守氨基酸残基包含在内，IgG1CH3区与IgG2CH398.13％同源，与IgG3CH397.20％同源，与IgG496.26％同源。
实施例4：从含有两种同种型的单抗混合物中纯化A型和B型
用1M Tris(pH9.0)将10mL ddCC49上清液滴定到最终pH为7.5。将该物质经一系列Sol-Vac0.8μ和0.4μ膜过滤。用1xPBS以80ml/分钟的流速预平衡100ml XK50蛋白G柱子。将滴定好的过滤上清液以80ml/分钟上样到柱子上。用平衡缓冲液将结合的蛋白质洗两个柱体积，然后用100mM甘氨酸在pH3.0进行洗脱。收集含有ddCC49峰的流份，立即用1M Tris(pH9.0)滴定到最终pH为7.0。
Toso Biosep Phenyl5PW-HR柱子用20mM磷酸盐(pH7.2)：1M硫酸铵预平衡。用3.5M硫酸铵(pH7.2)储液将蛋白G洗脱液滴定到1M硫酸铵，以2mg/ml胶床的浓度上样。结合了的蛋白质用20mM磷酸盐(pH4)或7.2硫酸铵洗，将电导率调节到116.4mS/cm。由该条件洗脱下来的物质在非还原性SDS-PAGE上的表观分子量约为120kD(A型)。剩下的结合抗体进一步用磷酸盐缓冲液中硫酸铵浓度逐渐减少的线性梯度来洗脱。后来洗脱的抗体重链之间明显缺少二硫键，其分子量约60kDa(B型)。
将硫酸铵浓度调整到1M，重新上样到清洗过的Phenyl5PW-HR柱子上，可以重新获得以上纯化过的物质。结合蛋白用20mM磷酸盐(pH7.2)洗脱，透析到1×PBS中。
实施例5.A型和B型稳定性的比较
A型和B型的生物活性(在初步实验中测到的，例如利用直接结合或竞争结合研究)显示，A型和B型具有类似的生物活性。
对A型和B型的稳定性也进行了比较。将纯化的ddCC49分子用装有YM30膜(Millipore)的Amicon浓缩器浓缩到约5mg/ml。将浓缩好的物质按每种同种型平均分成四份，每份放入10K透析盒(Pierce，cat#66410)中在以下缓冲液中透析16小时：1)10mM磷酸钠，pH3；2)10mM醋酸钠，pH5；3)10mM磷酸钠，pH7；和4)10mM硼酸钠，pH9。透析后，将每种溶液中的蛋白浓度调节到3mg/ml。除了纯的A和B同种型溶液之外，将每个pH的一部分A溶液和B溶液混合产生含有各50％的同种型的混合物。共产生12种制剂(4个pH水平乘上3种抗体溶液)。将溶液过滤并装入带有灰色丁基塞子的3ml
Type-1玻璃血清管(West Pharmaceuticals)中。
选择2-8℃、20-25℃和38-42℃这三个温度保存蛋白质溶液以进行稳定性检测。保存前，从每种制剂中取500μl样品进行物理和化学分析，这些起点的数据作为对照。进入保存后，按照以下时间表取出样品：2周、1个月、2个月和3个月，立即提交检测。
为了评价这两种同种型的物理和化学稳定性，采用了以下方法：测量OD320的浊度、非还原性SDS-PAGE，和大小排阻层析。
对保存在2-8℃、20-25℃和38-42℃的样品在不同时间点进行非还原性SDS-PAGE。保存在2-8℃时，A型和B型在pH5均比较稳定。但是，当在pH7和9配制时，比原来的主要条带(A型是120kDa，B型是60kDa)小的条带数目增加表明A型和B型都发生了降解。我们注意到，特别是pH7和9，保存在低温和中等温度的样品，小于55kDa的条带的强度和数目在B型中比A型更高。这表明，在这些条件下，A同种型比B同种型更稳定。然而，对pH5、保存在20-25℃的A同种型并不是这样。这个样品似乎比B同种型有更多的片段。这似乎是因为微生物污染产生的假象(以下有更详细的讨论)。在高保存温度时，两种同种型在pH9都被显著降解，样品之间胶的样式几乎没有差别。在这样的条件下，在胶的顶部出现痕量的???散条带，表明有凝聚物的形成。因为凝聚物可以用SDS溶解，采用下面的章节中描述的方法对凝聚现象进行了研究。
表5A到表5C列出了保存在三个不同温度的ddCC49的浊度数据。浊度测量了可溶和不可溶的凝聚物，是基于被这些颗粒散射的光的量。存在凝聚物时，它会散射光线导致A320升高。如表5A-C所示，ddCC49分子保存在2-8℃时，随着pH的增加，A同种型和B同种型的浊度都增加，其中前者比后者的浊度低。对保存在较高温度(20-25℃和38-40℃)，少于一个月的样品也有这一趋势。当保存时间达到3个月，高pH和高温度的样品浊度明显增加，A型和B型的差别消失了。这些结果与SDS-PAGE结果平行，都表明这两种同种型在pH3和5相对稳定(就不形成凝聚物而言)，A同种型比B同种型更不容易发生凝聚。
表5A.保存于2-8℃的ddCC49样品在A320测到的浊度
A同种型 B同种型 混合物
时间(月) pH＝3 5 7 9 3 5 7 9 3 5 7 9
0 0.030 0.038 0.044 0.056 0.034 0.042 0.046 0.066 0.036 0.042 0.051 0.061
1/2 0.029 0.029 0.046 0.045 0.030 0.038 0.048 0.058 0.034 0.033 0.043 0.055
1 0.033 0.039 0.035 0.055 0.033 0.035 0.044 0.059 0.032 0.040 0.039 0.066
22 0.042 0.022 0.042 0.044 0.039 0.037 0.055 0.067 0.042 0.024 0.040 0.058
3 0.035 0.047 0.051 0.050 0.038 0.041 0.066 0.081 0.027 0.048 0.051 0.065
表5B.保存于20-25℃的ddCC49样品在A320测到的浊度
A-同种型 B-同种型 混合物
时间(月) pH＝3 5 7 9 3 5 7 9 3 5 7 9
1/2 0.031 0.032 0.056 0.066 0.039 0.034 0.064 0.083 0.034 0.039 0.060 0.071
1 0.025 0.043 0.055 0.090 0.034 0.042 0.070 0.084 0.028 0.039 0.055 0.094
2 0.034 0.053 0.077 0.113 0.046 0.032 0.090 0.087 0.037 0.038 0.066 0.108
3 0.036 0.056 0.156 0.143 0.029 0.060 0.121 0.125 0.044 0.050 0.101 0.142
表5C.保持于38-42℃的ddCC49样品在A320测到的浊度
A同种型 B同种型 混合物
时间(月) pH＝3 5 7 9 3 5 7 9 3 5 7 9
1/2 0.041 0.042 0.068 0.063 0.041 0.044 0.080 0.067 0.041 0.039 0.070 0.064
1 0.041 0.043 0.071 0.065 0.036 0.040 0.079 0.069 0.032 0.048 0.078 0.070
2 0.047 0.030 0.066 0.060 0.046 0.045 0.087 0.082 0.051 0.034 0.078 0.079
3 0.058 0.051 0.098 0.105 0.046 0.057 0.101 0.157 0.056 0.057 0.101 0.126
大小排阻层析(SEC)这种方法可以高效地揭示完整分子和被降解产物(片段和可溶性凝聚物)的百分比，而且可重复性高。表5A-C中列出了保存在不同温度时，A同种型、B同种型完整单体和混合物的百分比。对于保存在2-8℃的样品，显然A型比B型有更高百分比的单体，而A型和B型的混合物处于它们之间。在这个保存温度，两个同种型在pH3、5和7(其中pH5是最稳定的条件)约3个月内相对稳定。但是，在pH9，B型的单体百分比有明显下降，而A型只有略微降低。在升高的温度下，所有样品都显示出随保存时间增加，单体百分比明显下降；A同种型表现优于B同种型。但是，有一个例外是保存在室温的pH5的A同种型样品比B同种型或混合物在类似保存条件下的降解多得多。仔细检验这个特定A同种型小管，样品的SDS-PAGE和SEC数据提示了可能是微生物污染导致了这个意外的结果。首先，SEC和SDS-PAGE结果都表明，这个样品的降解主要是通过片段的增加反映的，估计是由于微生物消化产生的，否则预计凝聚现象会有某种程度的提高。其次，含有各50％的A和B同种型的混合物样品表现出比B同种型更好的稳定性特征说明，一定是A同种型更稳定促成了更高的单体百分比。最后，保存在2-8℃和38-42℃的pH5的A同种型比B同种型在类似条件下都有更高百分比的单体。因此，中等保存温度应当给出类似的结果。由于样品数目有限，无法进行微生物污染检测。
我们还注意到，保存在高pH(9)和40℃的IDEC-159的两种同种型，单体百分比都减少到约30％。在这些恶劣条件下，两个同种型的稳定性的差别消失了。SEC结果印证了采用SDS-PAGE得到的结果。两个结果都表明，虽然这两种同种型的一些化学和物理特性有所不同，它们的降解机制和副产物即使不是相同的，也是类似的。
总而言之，SEC结果表明A和B同种型的最佳pH均在约5。就类似的保持条件下，能保持更高百分比的完整单体而言，A同种型比B同种型更稳定。
表6A.保存在2-8℃的ddCC49样品中单体的百分比
A同种型 B同种型 混合物
时间(月) pH＝3 5 7 9 3 5 7 9 3 5 7 9
0 98.81 99.13 98.16 97.93 97.02 97.70 96.88 93.51 97.83 98.27 97.44 95.81
1/2 98.98 99.16 98.25 98.00 97.15 97.87 96.96 91.95 98.15 98.49 97.68 95.59
1 98.80 99.20 97.99 97.11 97.02 97.81 96.62 88.99 98.04 98.45 97.41 94.45
2 98.74 99.01 98.00 95.67 97.15 97.69 95.50 84.84 98.06 98.34 96.81 92.17
33 98.28 98.89 97.88 95.31 96.69 98.14 95.37 85.98 97.61 98.15 96.65 89.90
表6B.保存在20-25℃的ddCC49样品中单体的百分比
A-同种型 B-同种型 混合物
时间(月) pH＝3 5 7 9 3 5 7 9 3 5 7 9
1/2 97.83 99.04 97.12 93.65 95.84 97.62 93.71 79.61 96.75 98.30 95.37 87.67
1 96.60 9663 95.65 88.09 94.38 97.23 90.69 72.26 95.36 97.99 93.05 80.92
2 93.62 92.79 93.17 80.06 91.71 96.96 85.51 66.53 92.78 97.51 89.33 73.91
3 92.81 89.56 x 74.31 89.30 96.04 82.57 63.25 90.46 97.02 86.80 69.36
表6C.保存在38-42℃的ddCC49样品中单体的百分比
A同种型 B同种型 混合物
时间(月) pH＝3 5 7 9 3 5 7 9 3 5 7 9
1/2 86.31 97.50 85.06 66.42 79.85 94.29 69.68 63.64 82.09 95.70 76.24 63.95
1 78.71 95.19 73.77 51.55 66.73 89.37 54.70 50.10 68.53 92.02 62.93 49.28
2 66.64 91.63 60.45 38.43 60.29 81.08 42.98 37.09 61.33 85.81 51.08 36.68
3 57.87 86.99 52.82 30.81 43.61 74.23 36.68 29.73 46.75 80.93 44.35 30.18
实施例6.A型和B型的制备型纯化(preparative purification)
IDEC-159(ddCC49)是针对TAG-72抗原的CH2区删除单抗，所述抗原表达在肿瘤表面上。IDEC-159含有抗体的两个同种型，称为A型和B型。目前IDEC-159的细胞培养过程产生约50∶50比率的A型和B型。A同种型是重链Fc部分中的CH2区域有删除的抗体。除了发生删除的CH2区域，B同种型的FC区域还缺少二硫键，只是通过疏水相互作用和盐桥联系在一起。
IDEC-159纯化过程的第三个和最后的层析步骤是将IDEC-159的两种同种型分开。分离是利用Phenyl TSKgel5PW-HR吸附剂通过疏水相互作用层析(HIC)实现的。因为B型比A型疏水作用更强，用约0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠(pH4.0-pH7.0)作为流动相，它会不可逆地吸附到固定相上。A型在这样的条件下，与固定相的结合程度较低，因此可以等度洗脱，即与流出液一起离开柱子。等度洗脱A型后，除去流动相中的硫酸铵使B型解吸附。利用以下方法分离IDEC-159的两种同种型：
·柱子用≥3个柱体积(CV)的0.5N NaOH，以≤150cm/hr清洗。
·用≥5个柱体积的0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠(pH4.0)，以≤150cm/hr流速平衡柱子。
·将柱子用室温的TMAE流出液上样，该流出液已经过调节使之含有0.43体积的2.5M硫酸铵/20mM磷酸钠(pH4.0)储液，5mg每毫升树脂。将抗体以pH4.0、≤100cm/hr的流速上样到柱子上。当流出液在280nm的OD达到10mAU时，开始收集抗体。
·用15个柱体积的0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠(pH4.0)以≤100cm/hr的流速洗柱子。在这15个柱体积清洗过程继续收集抗体，然后将出口转回废液。
·将柱子用≥5个柱体积的20mM磷酸钠(pH4.0)，以≤100cm/hr的流速剥胶。柱子用≥3个柱体积的0.5N NaOH，以≤150cm/hr的流速清洗。
·用≥3个柱体积的0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠(pH4.0)，以≤150cm/hr的流速平衡柱子。
·将柱子保存在≥3个柱体积的20％乙醇中，流速≥150cm/hr。
以制备规模(5L柱体积，总IDEC-159上样量约20g)进行了两种同种型的分离。开始的两个峰包含等度洗脱的A型，第二个峰显示了被洗脱的B型，而第三个峰含有清洗过程中从固定相上除下来的杂质。
这个方法在制备规模上分离A型和B型的能力还通过SDS PAGE证明了。用0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠(pH4.0)(第6到8道)等度洗脱的流份主要含有A型(纯度>90％)。
实施例7.单克隆抗体CC49的人源化
对CC49抗体做了一些改变以便制备人源化CC49版本2(huCC49V2)。为了进一步减少人源化CC49单抗的潜在免疫原性，对抗体中存在的小鼠残基进行了检验，考虑是否用人框架残基进行代替，所述人框架残基用于轻链取代是来源于人受体序列LEN，用于重链取代是来源于21/28′CL(Singer I Iet al.，1993.Optimal Humanization of 1B4，an Anti-CD18Murine MonoclonalAntibody，is Achieved by Correct Choice of Human V-Region FrameworkSequences.J.Immunol.150：2844-2857；Padlan E A，1991.Possible ProcedureFor Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Domains WhilePreserving Their Ligand-Binding Properties.Molecular Immunol.28：489-498)。
被认为对于保存组合位点的特异性和亲和性很重要的框架残基显示出只有很少的差别。在重链序列中，预计被掩盖的位点69(亮氨酸)和位点93(苏氨酸)的残基分别用人残基异亮氨酸和丙氨酸取代。在轻链序列中，预计基本被掩盖的位点43(丝氨酸)的残基用人残基脯氨酸取代。
制备V2CC49抗体的结构域删除形式，将连接肽***huCC49V2序列。制备含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]绞链连接肽的CH2区删除huCC49V2以及CH2区删除huCC49V2。
实施例8.包含新连接肽的抗体的生物分布性能提高
利用Wallac1420Multilabel Counter Victor V(PerkinElmer)通过时间分辨荧光免疫分析法，在竞争结合检定法中检测各种形式的结构域删除抗体(有或没有连接肽)结合牛颌下腺粘蛋白的能力，该蛋白是TAG-72抗原的来源。评价的抗体包括HuCC49 PAP(含有SEQ ID NO：32所示之连接肽)、HuCC49 V2 PAP(含有SEQ ID NO：32所示之连接肽)、HuCC49 G1/G3：PAP(含有SEQ ID NO：5所示之连接肽)、HuCC49 V2 G1/G3/PAP(含有SEQ IDNO：5所示之连接肽)，以及对照亲本HuCC49抗体。所有三种绞链区被工程化的抗体的相对结合活性没有大的区别，或者在对照亲本CC49抗体的2-3倍之内。
在带有LS-174T人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠中评价和比较偶联了90Y-2-(p-异硫氰基苄基)(p-SCN-Bz)-环己基二乙烯三胺五乙酸配体(CHx-DTPA)的HuCC49 V2 PAP(含有SEQ ID NO：32所示之连接肽)和对照亲本HuCC49抗体的生物分布。第3和24小时确定每克肿瘤或正常组织的90Y放射标记抗体的辐射剂量百分比(％ID)，示于表7。
表7.
7只小鼠/组
血液 脾 肾 肝脏 肿瘤
HuCC49
3小时 20.1±3.5 6.1±1.6 11.7±1.7 10.1±1.8 9.3±2.0
24小时 0.7±0.2 9.5±4.0 11.0±2.0 12.0±1.5 12.7±7.1
HuCC49 V2 PAP
3小时 24.6±3.0 4.6±2.2 10.0±1.4 8.4±1.0 16.1±5.0
24小时 2.0±0.6 7.7±1.8 6.7±0.4** 11.2±2.2 21.3±4.8*
数据代表平均值+/-标准差
*与肿瘤中HuCC49的24小时点相比，非配对样本t检验p<0.05
**与肾中HuCC49的24小时点相比，非配对样本t检验p<0.001
令人惊奇的是，HuCC49 V2 PAP在24小时时间点的摄取量在肿瘤中比对照HuCC49抗体明显更高(p<0.05非配对样本t检验)，相反，在肾中更低(p<0.01)。当比较这些抗体的肿瘤对器官比率时，HuCC49 V2 PAP在除了血液的所有器官中产生更高的肿瘤对器官比率。
这些结果提示，这些新的绞链给抗体带来了结构变化，正面地影响了肿瘤定位，并且降低了正常器官(比如肾)的摄取。因此，这些新绞链特别适用于引入到治疗抗体中。
实施例9.包含新连接肽的抗体的生物分布性能改善：详细时间历程
本实施例证实并延伸了实施例8中呈现的结果。用预先冲洗过的AmiconCentricon30将抗体人CC49 V2 G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQID NO：5)和HuCC49(gly/ser)渗滤并浓缩到低金属5mM醋酸钠缓冲液(pH5(LMB))中。Centricon超滤离心是在维持在2-8℃的固定角度转头上以5000xg进行的。各种抗体的回收是通过向样品库中加入50μl LMB，稍微涡旋混匀，于1000x g反向旋转(back-spinning)10分钟。蛋白质浓度用UV分光计于280nm测定，所用消光系数是1.48。然后用LMB将每种抗体调节到10.5mg/ml。
用1.0M硼酸(pH8.6，Chelex处理过，0.2μm过滤的)将抗体调节到～pH8.6。然后以3摩尔螯合剂比1摩尔抗体的摩尔比例加入CHx-DTPA(溶于1.0M硼酸)。加入的硼酸的量是抗体体积的九分之一。然后将这个混合物涡旋混匀，在室温下培育16到18小时。象前面的渗滤那样，将混合物加入新的预先冲洗过的Centricon30中，渗滤到低金属5mM醋酸钠、150mM氯化钠(pH5)中来终止反应。将每种抗体的浓度调节到3mg/ml。
给雌性裸鼠在右腿内侧s.c.接种悬浮于HBSS(Biowhittaker，Cat#10-547F)中的LS174T细胞。在研究开始前一天测量肿瘤大小。将长度乘上宽度平方的二分之一[L x((W2)/2)]来计算肿瘤体积。将小鼠以平均肿瘤体积达到～200mm3分组。
在零点给42只裸鼠注射111In标记的CH2结构域删除抗体。本实验跟踪了抗体跨越七个时间点的分布情况，其中每个时间点由六只小鼠组成。将小鼠抓在涂有焦油的称重纸上，挤压膀胱来收集每只小鼠的尿液。血液通过“眼底出血”来提取(约每只小鼠200μl)。对于每只小鼠，在血液和尿液采样过程中分泌的所有***物都要收集起来。采血之后，将小鼠颈椎脱位处死。六只小鼠每个都被处死之后，经解剖收集其他样品。所有样品(除了皮肤)用3％***冲洗，在纸巾上拍干，然后称重。所有样品都用涂有焦油的纸称重。
采集样品后，将样品放入硼硅酸盐试管，在γ计数器上与衰退对照一起进行计数，所述对照由标记抗体的1∶10稀释液构成。计算每个器官或组织相对衰退对照的放射活性百分比(％放射剂量/g组织或器官)。本实施例显示，包含新连接肽的抗体分子在肾中的蓄积下降，在血液中的蓄积略有增加，在肿瘤中的积聚明显增加。这样的表现与这些分子在体内的稳定性增加，效力和安全性提高是一致的。
实施例10.包含连接肽的抗体对还原剂的敏感性下降
本实施例显示，结构域删除的CC49 G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)和亲本CC49对谷胱甘肽(GSH)还原表现得比带有Gly-Ser绞链接头的结构域删除CC49更稳定。
简单地说，将50μg ddCC49(Gly-Ser)、ddCC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)或亲本CC49与0、1、5或10mM GSH在室温下培育1小时。所用反应缓冲液包括100mM PBS(pH7.2)或100mM醋酸钠、100mM NaCl(pH4.5)。将GSH处理过的抗体与SDS一起加热，上样到4-20％的梯度SDS-PAGE非还原胶上。使上样样品在室温下，120伏恒压下跑胶90分钟。蛋白用考马斯染色并干胶。
结构域删除的CC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)和亲本CC49对谷胱甘肽(GSH)还原表现得比带有Gly-Ser绞链接头的结构域删除CC49更稳定。此外，100mM醋酸钠(pH4.5)缓冲液与100mM PBS(pH7.2)相比能进一步保护结构域删除CC49G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)不被GSH还原。出人意料地观察到对还原剂的敏感性下降提示了G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)绞链设计使得可以利用象用于制备药物偶联物(例如，SPDP接头)的那些还原剂，或者将放射性同位素附着到抗体上的技术(例如，99MTc)，而同时保持抗体的物理完整性。对还原剂敏感性下降这一优点似乎没有改变CH2结构域删除构建体的药物代谢动力学优势(见实施例9中的小鼠生物分布数据)。对还原剂的敏感性下降可能还可以预示其体内稳定性增加。
实施例11包含连接肽的抗CD20抗体
按照实施例3的描述，将绞链区连接肽G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)引入CH2结构域删除C2B8抗体。C2B8是一种嵌合的抗CD20单抗，其包含分别与人重链和轻链恒定区融合的小鼠重链和轻链可变结构域。通过DNA序列分析确认绞链区被正确地修饰。用质粒DNA转化CHO DG44细胞以便瞬时产生抗体蛋白。
由产生含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域删除C2B8抗体的细胞收集上清液，通过免疫分析法确定培养液上清中的抗体浓度。将得自瞬时细胞培养物的约3ng总抗体蛋白与CH2结构域删除huCC49单抗通过非还原SDS-PAGE电泳进行比较，随后用偶联HRP的抗人IgG进行蛋白印迹来探测CH2结构域删除huCC49的A和B同种型。在这些条件下，A型以单个120kDa的同型二聚体迁移，B型以60kDa的双体迁移。发现引入SEQ ID NO：5所示之连接肽显著地提高了所产生的A型的比例。这些结果显示，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]hinge(SEQ ID NO：5)导致几乎全部产生A型CH2结构域删除C2B8抗体，而很少有或没有可检测到的B型，这表明该绞链产生A型同种型的用途可以普遍地应用到有不同特异性的抗体上。
实施例12.包含连接肽的抗CD23抗体
用绞链区连接肽G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)基本按照实施例3的描述构建CH2结构域删除5E8(5E8ΔCH2)抗体。5E8是嵌合的抗CD23单抗，其由分别融合了人重链和轻链恒定结构域的灵长类重链和轻链可变结构域组成。通过DNA序列分析确认绞链区发生了正确的修饰。5E8轻链和重链的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。用质粒DNA转化CHODG44细胞来产生抗体蛋白。
用含有引入到5E8ΔCH2抗体序列中的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)连接肽的细胞系(1A7)来产生抗体。抗体按照以上实施例4描述的方法制备和纯化。5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体，仅用蛋白G柱子纯化后，不经进一步HIC纯化即可基本以≥97％的纯度单峰洗脱。还原和非还原的纯化蛋白样品经SDS-PAGE电泳分析。在非还原条件下，A型预期以单个120kDa的同型二聚体迁移，B型以60kDa的双体迁移。我们发现SEQ ID NO：5所示之连接肽显著提高了所产生的A型的比例。这个结果显示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]绞链(SEQ ID NO：5)导致几乎全部产生A型5E8ΔCH2抗体，而很少有或没有可检测到的B型，表明该绞链产生A型同种型的用途可以普遍地应用到有不同特异性的抗体上。5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体经大小排阻层析检验，发现是以单峰被洗脱，这说明抗体产物没有明显的聚集和降解。进一步用Delphia荧光计(Wallac1420Multilabel Counter Victor V，PerkinElmer)在FRET(荧光共振能量转移)竞争结合检定法中测试5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体，即测试该抗体和标记了Eu的5E8IgG竞争结合标记了Cy5的可溶性CD23。在竞争结合检定法中对5E8ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245(含有SEQ ID NO：5所示之连接肽)和对照亲本5E8IgG抗体做了评价。绞链工程化抗体的相对结合活性与对照亲本5E8IgG抗体没有可辨别的区别。从这些结果可以清楚地看到，在5E8ΔCH2抗体中引入绞链区(含有SEQ ID NO：5所示之连接肽)导致在保持全部结合活性的同时，优选合成A同种型，这支持了所述工程化绞链的普适性。
实施例13.包含连接肽的chB3F6抗体
用绞链区连接肽G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)基本按照实施例3的描述构建CH2结构域删除的嵌合B3F6(chB3F6ΔCH2)抗体。“chB3F6”是嵌合抗Cripto单抗，其由分别融合了人重链和轻链恒定结构域的小鼠重链和轻链可变结构域组成。通过DNA序列分析确认绞链区发生了正确的修饰。chB3F6轻链和重链的核酸和氨基酸序列分别如图1和2所示。用质粒DNA转化CHO DG44细胞来产生抗体蛋白。
用含有引入到chB3F6ΔCH2抗体序列之G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)连接肽的细胞系(3C7)来产生抗体。抗体按照以上实施例4描述的方法制备和纯化。chB3F6ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体，仅用蛋白G柱子进行纯化后，不经进一步HIC纯化即可基本以97％的纯度单峰洗脱。还原和非还原的纯化蛋白样品经SDS-PAGE电泳分析。在这些条件下，A型预期以单个120kDa的同型二聚体迁移，B型以60kDa的双体迁移。我们发现SEQ ID NO：5所示之连接肽显著提高了所产生的A型的比例。这个结果显示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]绞链(SEQ ID NO：5)导致几乎全部产生A型chB3F6ΔCH2抗体，而很少有或没有可检测到的B型，表明该绞链产生A型同种型的用途可以普遍地应用到有不同特异性的抗体上。chB3F6ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体经大小排阻层析检验，发现基本是以单峰(93-98％的单体)被洗脱，这说明抗体产物有很少或没有明显的聚集和降解。进一步与标记了FITC的B3F6IgG一起用流式细胞竞争结合法来测试chB3F6ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体与GEO肿瘤细胞的结合，该肿瘤细胞是CRIPTO抗原的来源。对chB3F6ΔCH2G1/G3/Pro243Ala244Pro245(含有SEQ ID NO：5所示之连接肽)和两个对照chB3F6IgG抗体样品进行评价。绞链工程化抗体的相对结合活性与对照亲本chB3F6IgG抗体没有可辨别的差异。从这些结果可以清楚地看到，在chB3F6ΔCH2抗体中引入绞链区(含有SEQ ID NO：5所示之连接肽)导致在保持全部结合活性的同时，优选合成A同种型，这进一步支持了所述工程化绞链的普适性。
实施例14.B3F6抗Cripto抗体人源化形式的制备
将B3F6抗体的可变区进行测序。小鼠B3F6抗体的轻链可变区序列如下：
1   Df LMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRsSQSiV HSNGNTYlEW YLQKPGQSPK
51  LLiY KvsNRF SGVPDRFSgS GSGTDfTLKI SRVEAEDLGV YYCFqGSHVp
101 LTFGAGTKLE LK(SEQID NO：39)
小鼠B3F6抗体的重链可变区序列如下：
1   QVQLQQVGAE LVKPGASVKL SCKaSgyTfT SYWiHWVKQR PGQGLEWIGE
51  NDpSNgRTNY NEKFKNKATL TvDKSSSTAY MHLSSLTSED SAVYYCSrGP
101 NYFYSMDYWG QGTSVTVSS(SEQ ID NO：40)
对于每个序列，CDR残基加有下划线，规范残基以小写字母表示，不常见规范残基以小写、斜体和粗体表示。
补体决定区(CDRS)被划归规范种类。CDR含有最可能结合抗原的残基，必须留在重构的抗体中。CDR是按照Kabat等(Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.and Foeller，C.(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest.5th Edition，U.S.Dept.Health and Human Services.U.S.Govt.Printing Office)根据序列界定的。CDR落入规范种类(Chothia，C.，Lesk，A.M.，Tramontano，A.，Levitt，M.，Smith-Gill，S.J.，Air，G.，Sheriff，S.，Padlan，E.A.，Davies，D.，Tulip，W.R.，Colman，P.M.，Spinelli，S.，Alzari，P.M.and Poljak，R.J.(1989)Nature342：877-883)，其中关键残基在很大程度上决定了CDR环的结构构象。这些残基几乎总是要保留在重构抗体中。重链和轻链的CDR分为以下的规范类型：
轻链：                            重链：
L1：16个残基    第4类             H1：5个残基第1类
L2：7个残基     第1类             H2：17个残基第2类
L3：9个残基     第1类             H3：10个残基没有规范类型
表8列举了对这些种类很重要的规范残基。环L1在位点2有一个F，而规范残基是V/I。环H2在位点71有一个V，而规范残基是A/T/L(虽然V对于H2第1类是规范的)。
表8
L1    第4类    2(V，I)25(S)27b(I，L)33(L)71(F)
L2    第1类    48(I)51(A，T)52(S，T)64(G)
L3    第1类    90(Q，N，H)95(P)
H1    第1类    24(A，V，G)，26(G)，27(F，Y)，29(F)，34(M，W，I)，94(R，K)
H2    第2类    52a(P，T，A)，55(G，S)，71(A，T，L)
H3    没有规范种类
利用FASTA程序和共有序列数据库将可变轻链和重链与小鼠和人亚型共有序列(Kabat et al.1991)进行比较。发现可变轻链是小鼠κ2亚型的成员，在113氨基酸的重叠中有92.9％的相同性。序列比对如下所示：
B3F6轻链与小鼠K2亚型共有序列的比对
>>moukv2长度：113August 6，199215：04Type：P C(113aa)
initn：654initl：654opt：700z-score：83.4E()：0.24
Smith-Waterman分数：700；113个氨基酸重叠中92.920％的相同性
               10         20       30         40       50       60
B3F6 L DFLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF
      X.::::::::::::::::::::::::.::::::::::::::::::::::::::::::::
moukv2 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF
                10        20       30        40         50       60
               70        80        90      100        110
B3F6 L SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP-LTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：39)
       ::::::::::::::::::::::::::::::::::::.::X:::.:::::.:
moukv2 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGTHVPPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：41)
               70         80        90      100        110
发现可变重链是小鼠2B亚型的成员，在128氨基酸的重叠中有80.5％的相同性。序列比对如下所示：
B3F6重链与小鼠2B亚型共有序列的比对
>>mouhv2b长度：127August6，1992 15∶04 Type：P(127aa)
initn：664 initl：592 opt：653z-score：96.8E()：0.043
Smith-Waterman分数：653；128氨基酸的重叠有80.469％的相同性
               10        20        30        40        50        60
B3F6 H QVQLQQVGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGENDPSNGRTNY
X::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::.::..::::
mouhv2 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGRIDPNSGGTNY
               10        20        30       40         50        60
               70        80        90           100        110
B3F6 H NEKFKNKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSR----GPN-YFYSMDYWGQ
：：：：：.：：：：：：：：：：：：：：：.：：：：：：：：：：：：：：.X：.：.：.：：：：：
mouhv2 NEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGGSSXXVYXYWY-FDYWGQ
              70       80        90              100           110
B3F6 H GTSVTVSS  (SEQ ID NO：40)
:::.:::::
mouhv2 GTTVTVSS  (SEQ ID NO：42)
     120
可变轻链对应人κ2亚型，114氨基酸的重叠有76.3％的相同性。序列比对如下所示：
B3F6轻链与人κ2亚型共有序列的比对
>>humkv2长度：114August6，199215∶04Type：PC(114aa)
initn：566initl：383opt：571z-score：73.2E()：0.88
Smith-Waterman分数：571；114氨基酸的重叠有76.316％的相同性
               10        20       30           40       50
B3F6 L DFLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHS-NGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR
:..:::.::::::.:.::::::::::..::.X:.::.::::::::::.::::::::
humkv2 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSXDGNNYLNWYLQKPGQSPQLLIYLVSNR
               10        20        30         40        50       60
      60        70        80        90       100        110
B3F6 L FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP-LTFGAGTKLELK  (SEQ ID
NO：39)
        :::::::::::::::::::::::::::.:::::.:..X::::::.:.L
humkv2 ASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQXPRXTFGQGTKVEIK(SEQID
NO：43)
               70        80         90       100       110
可变重链对应人亚型1，129氨基酸的重叠有65.1％的相同性。序列比对如下所示：
B3F6重链与人亚型1共有序列的比对
>>humhvl长度：129August6，199215∶04Type：P C(129aa)
initn：348initl：274opt：532z-score：85.5E()：0.18
Smith-Waterman分数：532；129氨基酸的重叠有65.116％的相同性
               10        20        30        40        50
B3F6 H QVQLQQVGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGENDP-SNGRTN
       X::::::::.:::::::.:::::::::::::::.::::::::.:.X.::::
humhvl QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPYGNGDTN
               10        20        30        40        50        60
      60        70        80        90       100       110
B3F6 H YNEKFKNKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSRGPNYF-YSMDYWG
       :.::....:.:.::.:::::.:::::::.:::::.:.:.::.::::
humhvl YAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAPGYGSGGGCYRGDYXFDYWG
                70        80        90       100      110      120
B3F6 H QGTSVTVSS  (SEQ ID NO：40)
::::::::
humhvl QGTLVTVSS (SEQ ID NO：44)
在一个人源化设计中，利用了B3F6Fab与抗原结合肽复合体的x射线结构。挑选最类似的人表达的抗体序列作为抗体框架。为了找到最相似的表达序列，从NCBI NR数据库和Kabat数据库中搜索最同源的表达人框架。对重链和轻链序列进行了两次搜索(CDR标记和未标记的情况下)。挑选最适合的表达序列包括检查规范和界面残基的序列相同性，以及检查CDR环长度的类似程度。抗体的来源也是一个决定因素。排除以前被人源化过的抗体。进行NCBI NR数据库搜索时，我们用了BLAST，Kabat数据库搜索用的是FASTA。
在nr数据库中发现了最合适的表达轻链(gi-21669417(BAC01733)；Akahori等(未发表，见NCBI网址))，该序列来源于从组织、扁桃体、脐带、外周血和骨髓的混合物中分离的抗体。比对如下所示：
B3F6轻链和人gi-21669417(BAC01733)的比对
>>BAC01733(112aa)
initn：447initl：447 opt：447
Smith-Waterman分数：447；112氨基酸的重叠有61.607％的相同性
               10        20        30        40        50        60
B3F6 L DFLMTQTPLSLPVSLGDQASISCXXXXXXXXXXXXXXXXWYLQKPGQSPKLLIYXXXXXX
       X.:::.::::::.:.::::::::::::::::.::::
BAC017 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRA
               10        20         30       40        50        60
               70        80        90       100       110
B3F6 L XGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCXXXXXXXXXFGAGTKLELK(SEQ IDNO：39)
:::::::::::::::::::::::::::.:::::..:::::::.X
BAC017 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK  (SEQID
NO：45)
               70        80        90       100       110
在nr数据库中发现了最合适的重链(gi-14289106(AAK57792)；Salcedo等(2002))，该序列来源于良性淋巴增生中的一组多克隆B淋巴细胞。比对如下所示：
B3F6重链和人gi-14289106的比对
>>gi|14289106|gb|AAK57792.1|免疫球蛋白重链(120氨基酸)
initn：395 initl：395opt：397
Smith-Waterman分数：397；119氨基酸的重叠有53.782％的相同性
               10        20        30        40        50        60
B3F6 H QVQLQQVGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTXXXXXWVKQRPGQGLEWIGXXXXXXXXXXX
       .X::.:::.::::::::::::::::::::.::::::::.:
gi|142 EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYFMHWVRQAPGQGLEWMGRINPNSGGTNY
               10        20        30       40         50        60
               70        80        90       100       110
B3F6 H XXXXXXKATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSRXXXXXXXXXXWGQGTSVTVSS
(SEQID NO：40)
             ..::::::::::.::::.:.:::::.:::::::::X
gi|142 AQKFQGRVTLTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARLDTAIDAFDIWGQGTMVTVCSN
(SEQ ID NO：46)
               70        80        90       100       110       120
用这两个人表达序列对NCBI的种系序列数据库进行搜索，由此得到以下选定的种系：对于轻链是A3*/A19*(BAC01733)，对重链是VH1-2*(AAK57792)。
选定的人框架残基用于回复突变成相应的小鼠残基。优选保留规范残基、界面堆积残基和不常见小鼠残基，这些残基靠近结合位点。此外，要仔细分析与任何CDR残基距离6_以内的残基对CDR构象的可能影响。
在人源化B3F6轻链的一个版本中，位点2的V被改成F。这个位点的氨基酸被鉴定为非常重要，因为它与L93(CDR-L3)有相互作用。这个CDR参与和来源于抗原的肽进行的结合。
利用这个方法制备了轻链的一个版本：
轻链版本L1(1个回复突变)
DfVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPQ LLIYKVSNRF
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCFQGSHVP LTFGQGTKLE IK(SEQ ID NO：47)
在人源化B3F6重链中挑选以下氨基酸残基进行可能的回复突变：位点48的M、位点67的V、位点71的R、位点73的T、位点93的A以及位点112的C。
位点48的M被确认靠近CDR-H2，但是不靠近肽抗原。在一个版本的人源化重链中保留了这个残基，在另一个版本中它被回复突变成I。
位点67的V被确认靠近CDR-H2，但是不靠近肽抗原。在一个版本的人源化重链中保留了这个残基，在另一个版本中它被回复突变成A。
位点71的R被证明是规范残基。在两个版本中它均被回复突变为V。
位点73的T被证明靠近CDR-H2，但是不靠近肽抗原。在一个版本的人源化重链中保留了这个残基，在另一个版本中它被回复突变成K。
位点93的A被证明是界面残基，与侧链没有明显的接触。在一个版本的人源化重链中保留了这个残基，在另一个版本中它被回复突变成S。
位点112的C被证明是不常见人残基。两个版本中均被回复突变成S。
利用这个方法制备了两个版本的重链：
重链版本H1(6个回复突变)
EVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIHWVRQA PGQGLEWiGE NDPSNGRTNY
NEKFKNRaTL TvDkSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCsRGP NYFYSMDYWG QGTMVTVsS(SEQ ID
NO：48)
版本H2(2个回复突变)
EVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIHWVRQA PGQGLEWMGE NDPSNGRTNY
NEKFKNRVTL TvDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARGP NYFYSMDYWG QGTMVTVsS(SEQ ID
NO：49)
实施例15.制备B3F6抗Cripto抗体的其他人源化形式
用基于已有知识的方法(搜索其他人源化抗体的数据库来确定可以容忍的序列变化)制备了另一版本的轻链，其包含位点2和位点100的回复突变。
人源化策略建立在目测和根据Rosok等(Rosok MJ，et al.，1996.J.Biol.Chem.271：22611-22618)描述的方法对V区序列进行分析的基础上。鉴定出规范决定物、表面残基和可能的接触残基。记录可能的接触残基并大体分类，分类依据是Chothia等(Chothia C and Lesk AM.1987.J.Mol.Biol.196：901-917)定义的CDR环的结构规范、Kabat等(Kabat EA，Wu TT，Reid-MillerM，Parry HM，and Gottesman KS.1987.Sequences of Protein of ImmunologicalInterest，U.S.department of Health and Human Services，NIH，Bethesda，MD)定义的序列高变性，以及MacCallum等(MacCallum RM，Martin ACR，andThorton JM.1996.J.Mol.Biol.262：732-745)定义的可能抗原接触残基。将遵照Kabat编号和定义的小鼠CDR环整个移植到受体人框架上。鉴定到了Padlan(Padlan EA.1991.Mol Immunol.28：489-498)定义的堆积残基，并试图按照Singer等(SingerII et al.1993.J.Immunol.150：2844-2857)描述的策略保留这些堆积残基。将框架序列中的每个残基按照Harris和B ajorath(Harris Land Bajorath J.1995.Protein Science4：306-310)的描述分成抗体人源化的低度、中等或高度“危险位点”。
一般来说，低度危险位点保留人的残基。对于许多不相同的中等和高度危险氨基酸位点，参考人源化抗体集合，并要考虑包含上人或小鼠(回复突变)氨基酸残基是否能得到功能性结合活性。在考虑进行取代的情况中，参考氨基酸取代图谱(D.Bordo and P.Argos.1991.J.Mol.Biol.217：721-729)确认这些残基有功能互换性。
利用这种方法，制备了一个轻链版本。该轻链序列如下所示：
轻链版本L2：
DfVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPQ LLIYKVSNRF
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCFQGSHVP LTFGaGTKLE IK(SEQ ID NO：50)
制备了另一版本的重链，其在位点1、48、71、81、82b和112包含回复突变：
用这个方法，制备了一个版本的重链。该重链的序列如下所示：
重链版本H3：
qVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIHWVRQA PGQGLEWiGE NDPSNGRTNY
NEKFKNRVTL TvDTSISTAY MhLSsLRSDD TAVYYCARGP NYFYSMDYWG QGTMVTVsS(SEQ ID
NO：51)
图5给CDR移植的人源化B3F6序列的标注版本和包含回复突变的版本显示了轻链，图6显示了重链。图中还标明了发生回复突变的位点的Kabat编号。
实施例16.制备全长人源化B3F6抗Cripto抗体
制备了6个人源化全长B3F6抗体和6个人源化结构域删除B3F6抗体，它们具有以下人源化重链和轻链组合：
全长版本1-人源化(hu)B3F6轻链版本L1/重链版本H1(L1/H1)
全长版本2-huB3F6L1/H2
全长版本3-huB3F6L1/H3
全长版本4-huB3F6L2/H1
全长版本5-huB3F6L2/H2
全长版本6-huB3F6L2/H3
用于制备全长抗体分子的IgG1重链恒定区的氨基酸序列如图7所示。
CDR移植的B3F6轻链和版本L1和L2的完整氨基酸序列如下所示：
CDR移植的B3F6轻链
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC(SEQ ID NO：52)
huB3F6L1
DFVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC(SEQ ID NO：53)
huB3F6L2DFVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC(SEQ ID NO：54)
CDR移植的B3F6重链和制备的全长抗体版本H1、H2和H3的完整氨基酸序列如下所示：
CDR移植的全长B3F6重链
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGENDPSNGRTNYNEKFKNR
VTLTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH
KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：55)
huB3F6H1
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGENDPSNGRTNYNEKFKNRA
TLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSRGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS
GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR
EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：56)
huB3F6H2
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGENDPSNGRTNYNEKFKNR
VTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH
KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：57)
huB3F6H3
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGENDPSNGRTNYNEKFKNRV
TLTVDTSISTAYMHLSSLRSDDTAVYYCARGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS
GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR
EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：58)
在稳定的大规模培养物中，全长版本2人源化抗体(包含版本1轻链和版本2重链)产生了最高量的抗体，并且其结合亲和性与亲本小鼠抗体相当。
实施例17.制备结构域删除的人源化B3F6抗Cripto抗体
制备了6个人源化CH2结构域删除B3F6抗体，它们具有以下人源化重链和轻链组合：
结构域删除(dd)版本1-人源化结构域删除B3F6轻链版本1/重链版本1(L1/H1)
dd版本2-huddB3F6L1/H2
dd版本3-huddB3F6L1/H3
dd版本4-huddB3F6L2/H1
dd版本5-huddB3F6L2/H2
dd版本6-huddB3F6L2/H3
用于制备结构域删除抗体分子的重链恒定区的氨基酸序列如图7所示。
用于制备结构域删除抗体的CDR移植的B3F6轻链和轻链版本L1和L2的完整氨基酸序列如下所示：
CDR移植的B3F6轻链
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC(SEQ ID NO：52)
huB3F6L1
DFVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC(SEQ ID NO：53)
huB3F6L2
DFVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC(SEQ ID NO：54)
用于制备结构域删除抗体的CDR移植B3F6重链和版本H1、H2和H3的完整氨基酸序列如下所示：
CDR移植的CH2结构域删除B3F6重链
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGENDPSNGRTNYNEKFKNR
VTLTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH
KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDEL
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：59)
huB3F6H1
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGENDPSNGRTNYNEKFKNRA
TLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSRGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS
GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH
EALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：60)
huB3F6H2
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGENDPSNGRTNYNEKFKNR
VTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH
KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDEL
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：61)
huB3F6H3
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGENDPSNGRTNYNEKFKNRV
TLTVDTSISTAYMHLSSLRSDDTAVYYCARGPNYFYSMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS
GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH
EALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：62)
我们测试了结构域删除抗体的六个版本(不包括CDR移植的抗体)的结合活性。简单地说，将GEO人结肠腺癌细胞在有2mM谷氨酰胺、0.5mM丙酮酸钠、青霉素/链霉素，和非必需氨基酸的DMEM，10％FBS中培养。用PBS，20mM EDTA在1200rpm离心3分钟从三角瓶中取出细胞，重悬于PBS、0.02％叠氮化合物、0.1％BSA中。将各种浓度的人源化或嵌合抗体与终浓度5nM小鼠B3F6在聚丙烯V-型底平板中混匀。每个平板中加入一百万个GEO细胞，和抗体一起在4度培育2小时。将细胞用FACS缓冲液洗三次，与抗小鼠IgG藻红蛋白偶联物的1∶500稀释液在4度培育1小时。将细胞再洗1次，在3％***中固定，在FACScalibur仪器上跑样。将平均荧光强度(MFI)对人源化或嵌合抗体浓度做图。通过四参数拟合确定IC50。每次实验中，将每种人源化抗体的IC50与那次实验中嵌合抗体的IC50进行比较。结果如以下表9所示：
表9
抗体 IC50(nM)
嵌合dd-B3F6(实验1)dd-B3F6版本1dd-B3F6版本2嵌合dd-B3F6(实验2)dd-B3F6版本3dd-B3F6版本4dd-B3F6版本5dd-B3F6版本6 2321261563183243
实施例18.偶联了毒素的人源化B3F6抗体在体内模型中有效地抑制人乳腺癌细胞生长
本实施例中使用了以下材料和方法：
小鼠
140只雌性无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)在十周龄时开始实验。动物在移植肿瘤前在实验室中适应至少五天。小鼠关在通风的笼子里，允许随意摄取食物和水。
肿瘤模型
BT-474肿瘤得自冷藏的实体瘤片段，后者是在Biogen Idec(cryo reg#0141，最初是由得自American Tissue Type Collection(Manassas，VA)的细胞建立起来的)建立起来的连续传代体内供体系。在进行本试验的移植之前，将冷藏的肿瘤片段取出，在雌性无胸腺裸鼠中连续SC体内传代3代。在移植到小鼠中的肿瘤组织样品上进行细菌培养。移植后24小时和48小时的细菌学培养都表明没有染菌。
第一天，给小鼠在左胁植入BioMedics动物ID芯片(Model IMI-1000；Seaford，DE)SC。第0天，从八只供体动物中收集肿瘤，去除赘生性组织，切碎，3mm3的BT-474肿瘤片段SC植入每个小鼠的右胁部分。从第5天开始，至少每周两次记录肿瘤大小和体重测量值。当测量到肿瘤最少有100mg(第15天)时，排除非进行性生长的肿瘤，根据肿瘤大小将小鼠随机分到处理和对照组中(见表10)。
表10：对照和试验处理组
试剂 剂量/注射 美登素等效剂量(μg/kg) 途径 时间安排 小鼠数目
载体对照 10ml/kg 0 IVa q7dx3 16
B3F6.1-DM4 15mg/kgg/kg 266 IV q7dx3加上第43天 8
B3F6.1-DM4 15mg/kg25mg/kg 266418 IVIV q7dx3第43天 8
B3F6.1-DM4 35mg/kg 620 IV q7dx3 8
B3F6.1-DM4 35mg/kg 620 IV 第15，22，33，36天 8
紫杉萜 25mg/kg IPb q4dx3 7
a静脉内
b.腹膜内
实验材料和阳性化疗剂
美登素DM4偶联(2000-673.5D/A，6mg/ml和2000-79，3.3D/A，5.5mg/ml)在ImmunoGen，Inc(Cambridge，MA)利用ImmunoGen的肿瘤激活前药(TAP)技术制备。在所有实验中，B3F6抗体平均每个抗体偶联3-4个DM4分子。作为递送的DM4量的一个例子，23mg/kg剂量的B3F6-DM4偶联抗体，平均3DM4/单抗时，对应约350ug/kg的DM4。临床级的TaxolTM(紫杉萜注射液，NDC0015-3476-30)购自Bristol-Myers Squibb(Lot No4L83460，exp.Nov.2007)。
测试组和处理方案
表10描述了测试组和处理方案。载体对照(10mM柠檬酸缓冲液，pH5.5，135mM氯化钠)每周IV给予一次，给予三剂(q7dx3)，TaxolTM每四天经IP给予一次，共给予三次(q4dx3)。B3F6.1-DM4以15mg/kg IV给予q7dx3，加上第43天的一次剂量，或者q7dx3加上第43天给予25mg/kg。B3F6.1-DM4以35mg/kg IV给予q7dx3或者在第15、22、33和36天给予。所有处理在第15天开始。
评价抗癌症活性
用数码卡尺确定肿瘤的测量值。在第0天记录体重和肿瘤大小，持续每周记录两次至试验结束。用计算扁椭圆形体积的公式由两维肿瘤测量值来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤大小(mm3)＝(长度x宽度2)÷2。假设密度为1，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。
第58天，将用载体对照、紫杉萜和15mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组安乐死。继续每周获取剩余组的肿瘤重量和体重。用35mg/kg/注射处理q7dx3的组在第76天被安乐死。在第15、22、33和36天用35mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组在第83天试验结束时被安乐死。
统计分析
在每个试验结束时，对平均肿瘤重量进行Student’s t检验来确定每个处理组和载体对照组之间是否有统计学上的显著差异。
移植后的成瘤率为98％，挑选处于很窄范围内大小的小鼠开始处理。载体对照组的肿瘤生长情况很好地落在我们通常在这个模型中看到的范围内。紫杉萜引起与该模型保持一致的反应，从第26天到第50对肿瘤生长有显著(P<0.05)抑制。第58天，将用载体对照、紫杉萜和15mg/kg/注射的B3F6.1-DM4处理的组安乐死。继续每周获取剩余组的肿瘤重量和体重。用35mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理q7dx3的组在第76天被安乐死。在第15、22、33和36天用35mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组在第83天试验结束时被安乐死。
图10-13显示各种方案中IV给予的两种剂量(15和35mg/kg/注射)的B3F6.1-DM4对肿瘤重量、％处理/对照(％T/C)、以及带有已形成的BT-474异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠体重的影响。以15mg/kg/注射B3F6.1-DM4IV给予q7dx3加上第43天另外给药一次显著抑制了第33天到第47天的肿瘤生长，但是当该组在第58天结束试验时，已经没有明显的抑制作用了。用15mg/kg/注射B3F6.1-DM4IV给予q7dx3以及第43天给予25mg/kg/注射的另一个组，在整个试验过程中都没有表现出对肿瘤生长的明显抑制。以35mg/kg/注射B3F6.1-DM4进行的两种给药方案都对肿瘤生长从第29天到第58天结束载体对照组时有统计上的明显(P<0.001)抑制作用。
到第29天，两个用35mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的两个组的％T/C下降到42％活性的NCI标准以下，并在试验剩下的时间内都保持在这个水平以下。用15mg/kg B3F6.1-DM4处理的组的％T/C没有下降到42％以下。
临床观察
有几只用B3F6.1-DM4处理的小鼠出现了皮肤的棒杆菌感染。这种细菌存在于皮肤上，被认为是当动物受到胁迫时发生的机会感染。用35mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的多数小鼠到第29天都发展出感染，所有感染到第43天都消失了(除了No.33)。
一只用紫杉萜处理的小鼠因为给予紫杉萜时的技术失误出现体重下降。已知紫杉萜会引起GI毒性，在IP给予该细胞毒性试剂时要特别注意。给予SC液体没能改善小鼠的状况，按照IACUC关于体重下降的指南(当体重下降超过20％时施以安乐死)，它在第26天被安乐死，这是它接受最后一剂紫杉萜后三天。这只动物的数据不包括在图和统计分析中。
一只用35mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理q7dx3的小鼠从第26天开始出现体重下降。体重下降持续到被迫在第43天按照IACUC指南将小鼠安乐死，这是它接受最后一剂B3F6.1-DM4后14天。解剖显示在胸部有清澈的皮下液体。不知道体重下降是否与处理有关，因为这组中只有另外一只小鼠有轻微的体重下降。但是，No.35也出现了棒杆菌感染，这可能引起体重的轻微下降。
在第50天，载体对照组的一只小鼠在它的肿瘤重量达到其体重20％以上时，按照IACUC指南被安乐死。载体对照组中的另一只小鼠在第50天被安乐死，因为肿瘤发生严重的溃疡和体重下降。这些小鼠的肿瘤重量保存在数据中用于剩下的试验。
实施例19.偶联了毒素的人源化结构域删除B3F6抗体在体内模型中能有效抑制乳腺癌细胞的生长
本实施例使用了以下材料和方法：
动物：
135只来自Harlan Sprague Dawley(Madison，WI.)的无胸腺雌性裸鼠在6-7周龄开始试验。动物在移植肿瘤前在实验室中适应至少五天。移植肿瘤前，给动物分别植入动物ID芯片。试验组包括8只动物，载体对照组包括20只动物。
肿瘤：
BT-474体外细胞系原来得自NCI Tumor Repository。连续移植的体内供体系(来自Biogen Idec冷藏编号0141(没有补充***)建立于BiogenIdec，并在移植到本试验的动物中前，在无胸腺雌性裸鼠中移植4代。按照3mm3的组织片段/小鼠给动物皮下移植到右胁部位。
当肿瘤达到最小为100mg时开始处理。将动物随机分到以下测试和对照组：
表11.
组 处理** 小鼠数
1.2.3.4.5.6. 载体对照，0.2ml/鼠，i.v.，2x/天给予5次剂量(20mM柠檬酸缓冲液pH5.5，135mM氯化钠)阳性化疗剂，紫杉萜，25.0mg/kg/注射.i.p.q4dx3ddB3F6.1-DM4，18.0mg/kg/注射，i.v.，2x/天给予5次剂量(3.5DM4/单抗)ddB3F6.1-DM4，10.0mg/kg/注射，i.v.，2x/天给予5次剂量(3.5DM4/单抗)ddB3F6.1-DM4，3.0mg/kg/注射，i.v.，2x/dayfor5doses(3.5DM4/单抗)ddB3F6.1裸露单抗，18.0mg/kg/注射，i.v.，2x/天进行5次剂量 1688888
注：**剂量是基于23mg/kg剂量＝3药物/单抗给动物提供350ug/kg的美登素(MTD)。
测试时间安排是：
第1天：植入动物ID芯片，记录起始体重。
第0天：将肿瘤收集并移植，将小鼠随机化。在肿瘤上做细菌培养。
第4天：记录各阶段肿瘤(staging tumor)的体积测量值，并继续每天或每隔一天记录直到分阶段的当天(staging day)。
挑选肿瘤最小为100mg的小鼠。将小鼠随机分配，记录它们的体重。处理以单个IV剂量给予。阳性对照试剂按照q4dx3的安排经IP给予。
在分阶段的当天记录体重和肿瘤测量值，继续每周记录2次直至结束试验。
图14-17中的数据显示，结构域删除B3F6能有效地给用特定浓度结构域删除分子处理过的小鼠降低肿瘤重量。
实施例20.偶联了毒素的人源化B3F6抗体在体内模型中有效抑制人睾丸癌细胞的生长
在以下实施例中，抗Cripto人源化IgG1单克隆抗体(mAb)B3F6(又称为B3F6.1)被偶联了DM4，后者是细胞毒试剂美登素的一种衍生物(B3F6.1-DM4)。在雄性无胸腺裸鼠中评价该偶联物的抗癌活性，这些小鼠带有已建成的、皮下(SC)植入的NCCIT人睾丸癌异种移植物。动物组用6、10、15和25mg/kg/注射(分别相当于100、178、266和444ug/kg美登素)的B3F6.1-DM4单抗静脉内(IV)每周给予一次，共给予三个剂量(q7dx3)；或者以25和10mg/kg/注射在第15天及根据肿瘤再生长情况决定的其他天给予；载体对照IV q7dx3，或者顺铂(阳性化疗对照)以2mg/kg/注射SC每周三次，共给予6个剂量(3x/wk x6)。处理在第15天当肿瘤最小变化达到100mg时开始。
试验结果显示，载体对照组的肿瘤生长情况很好地落在该模型可接受范围内。顺铂对肿瘤生长从第20天到第66天有明显的(P<0.05)抑制。以10(P<0.001)、15(P<0.001)和25mg/kg/注射(P<0.001)给予B3F6.1-DM4q7dx3的情况中，肿瘤从第20天开始发生退化，并且退化持续到第107天结束试验时。以6mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理q7dx3使肿瘤从第20天到第44天发生退化，显著(P<0.001)抑制了肿瘤的生长直到该组试验在第70天结束。以25mg/kg在第15天给予一次B3F6.1-DM4造成整个试验过程中肿瘤都有退化(P<0.001)。在第15天以10mg/kg给予一次B3F6.1-DM4，引起肿瘤在开始阶段退化(P<0.001)。在第37和44天另外以10mg/kg给药导致已经开始重新生长的肿瘤发生退化(P<0.01)。总之，按照我们所测试的剂量方案给予B3F6.1-DM4能高效地抗已建成的NCCIT睾丸癌的异种移植物。
本实施例中使用了以下材料和方法
小鼠
一百五十(150)只雄性无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)在七到八周龄时开始实验。动物在被移植肿瘤前在实验室中适应至少五天。小鼠关在通风的笼子里，允许随意摄取食物和水。
肿瘤模型
NCCIT细胞购自American TissueType Collection(Manassas，VA)。该细胞系在进行移植前体外传代4次。将细胞体外生长在不含抗生素的RPMI-1640+10％胎牛血清(FBS)培养基中(5％CO2)。对植入小鼠中的细胞匀浆制备物样液进行细菌培养。移植后24小时和48小时的细菌学培养都表明没有染菌。
第一天，给小鼠在左胁植入BioMedics动物ID芯片(Model IMI-1000；Seaford，DE)SC。第0天，将悬于200μl RPMI-1640(没有血清(25％)、加有Matrigel(75％))的5x106NCCIT细胞SC植入每个小鼠的右胁部分。从第6天开始，至少每周两次记录肿瘤大小和体重测量值。第15天，排除非进行性生长的肿瘤，将肿瘤重量最少增加了100mg、最多增加244mg的小鼠随机分到处理和对照组中(见表12)。考虑到接种物中Matrigel的体积，将从第一次测量以来发生的肿瘤重量变化，而不是实际的肿瘤重量用于评价肿瘤生长情况。
实验材料和阳性化疗剂
DM4偶联物(2000-67，6.0mg/ml)在ImmunoGen，Inc(Cambridge，MA)利用ImmunoGen的肿瘤激活前药(TAP)技术制备。载体对照和B3F6.1-DM4单抗给剂溶液(Lot No11155-104，formulation，notebook：LC11155-104)由Biogen Idec的Ling Ling Chen提供。临床级的Platinol-AQ(cisplatin injection，NDC0015-3221-22)购自Bristol-Myers Squibb(Lot No2C65556，exp.Mar.2003)。
测试组和处理方案
表12描述了各测试组和处理方案。B3F6.1-DM4在无胸腺裸鼠中的半衰期是3.9天。将B3F6.1-DM4单抗静脉内(IV)每周给予一次，共给剂三次(q7d x3)；或者在第15天及根据肿瘤再生长情况决定的其后某天给剂。载体对照(10mM柠檬酸缓冲液，pH5.5，135mM氯化钠)IV给予q7dx3；顺铂SC每周给予三次，共给予六次(3x/wk x6)。所有处理在第15天开始。
表12显示了对照和试验处理组
对照和试验处理组
试剂 剂量/注射 美登素等效剂量(μg/kg) 途径 时间安排 小鼠数
载体对照 10ml/kg 0 IVa q7d x3 16
B3F6.1-DM4 6mg/kg 100 IV q7d x3 8
B3F6.1-DM4 10mg/kg 178 IV q7d x3 8
B3F6.1-DM4 15mg/kg 266 IV q7d x3 8
B3F6.1-DM4 25mg/kg 444 IV q7d x3 8
B3F6.1-DM4 10mg/kg 100 IV 第15，37，44天 8
B3F6.1-DM4 25mg/kg 444 IV 第15天 8
顺铂 2mg/kg SCb 3x/wk x6 8
所有处理从第15天开始
a静脉内
b皮下
抗癌症活性的评价
用数码卡尺确定肿瘤的测量值。在第6天记录体重和肿瘤大小，持续每周至少记录两次至试验结束。用计算扁椭圆形体积的公式由两维肿瘤测量值来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)÷2。假设密度为1，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。
考虑到接种物中Matrigel的体积，将从第一次测量(第6天)以来发生的肿瘤重量变化，而不是实际的肿瘤重量用于评价肿瘤生长情况。
第70天，将用载体对照、顺铂和6mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组安乐死。继续跟踪剩余各组的情况，直至第107天试验结束。
统计分析
在每项试验结束时，对平均肿瘤重量进行Student t检验来确定每个处理组和载体对照组之间是否有统计学上的显著差异。
在试验后期，当载体对照组中的一些小鼠肿瘤重量超过其体重的20％时，按照LACUC指南将它们安乐死。将它们的最终肿瘤重量保存在数据中至试验结束。
移植后的成瘤率达到95％，挑选肿瘤重量变化处于某个很窄范围内的小鼠开始处理。载体对照组的肿瘤生长情况很好地落在我们通常在这个模型中看到的范围内。顺铂引起与该模型保持一致的反应，从第26天到第66天对肿瘤生长有显著(P<0.05)抑制。第70天，将用载体对照、顺铂和6mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组安乐死。继续跟踪剩余各组至第107天结束试验。
图18-21显示四种剂量(6、10、15和25mg/kg/注射)B3F6.1-DM4处理q7dx3或者顺铂给予3x/wk x6对肿瘤重量变化、％处理/对照、以及带有已建成NCCIT异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠体重的影响。以10(P<0.01)、15(P<0.001)和25mg/kg/注射(P<0.001)给予B3F6.1-DM4q7dx3的情况中，肿瘤从第20天到第70天(结束载体对照组的时候)发生退化，这些组的肿瘤退化持续到第107天结束试验时。以6mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理q7dx3使肿瘤从第20天到第44天发生退化。第44天之后，这个组的许多肿瘤开始重新生长，然而肿瘤的生长直到该组试验在第70天结束都被显著(P<0.01)抑制了。
到第23天，用6和10mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组的％T/C下降到42％活性的NCI标准以下，并在试验剩下的时间内都保持在这个水平以下。用25mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组的％T/C到第20天下降到42％以下，并且从第23天开始在试验剩下的时间内都保持在10％以下。
图22-25显示在第15天给予一次25mg/kg/注射B3F6.1-DM4；在第15天和根据肿瘤生长情况决定的其他天(第37&44天)给予10mg/kg/注射B3F6.1；或者顺铂给予3x/wk x6对肿瘤重量变化、％处理/对照、以及带有已建成NCCIT异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠体重的影响。以25mg/kg/注射在第15天给予一次B3F6.1-DM4，使肿瘤从第20天到第70天(结束载体对照组的时候)发生退化(P<0.001)。这些组的肿瘤退化持续到第107天结束试验时。以10mg/kg/注射B3F6.1-DM4在第15天给予一次导致肿瘤发生退化(P<0.001)。在第37和44天另外给予10mg/kg使得已开始重新生长的肿瘤退化。
到第20天，用10和25mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理的组的％T/C下降到42％活性的NCI标准以下，并在试验剩下的时间内都保持在这个水平以下。
有几只用B3F6.1-DM4处理的小鼠出现了皮肤的轻微到中度棒杆菌感染，在出现几天内就消失了。这种细菌存在于皮肤上，被认为是当动物受到胁迫时引发机会感染。两只用25mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理q7dx3的小鼠；两只以25mg/kg/注射在第15天给予一次的小鼠；以及一只以15mg/kg/注射处理q7dx3的小鼠在第20到23天间显示感染的迹象。一只以25mg/kg/注射处理q7dx3的小鼠在第30天显示轻微的感染迹象。
在第52天，一只以25mg/kg/注射B3F6.1-M4处理q7dx3的小鼠呈现肿胀的腹部，膀胱不能be expressed。这只小鼠被安乐死，解剖发现一个膀胱结石。
实施例21.人源化B3F6在体内模型中抑制CLAU-6人肺癌细胞的生长
本试验的目的是确定当在已建成、预先形成的肿瘤块上进行处理时，B3F6.1-DM4偶联单抗对Calu-6异种移植肿瘤的生长的效力。
本实施例使用了以下材料和方法：
小鼠
160只雌性无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)在八到九周龄时开始实验。动物在被移植肿瘤前在实验室中适应至少五天。小鼠关在通风的笼子里，允许随意摄取食物和水。
肿瘤模型
Calu-6细胞购自American Tissue Type Collection(Manassas，VA)。该细胞系在进行移植前体外传代11次。将细胞体外生长在不含抗生素的RPMI-1640+10％胎牛血清(FBS)培养基中(5％CO2)。对植入小鼠中的肿瘤匀浆制备物样液进行细菌培养。移植后24小时和48小时的细菌学培养都表明没有染菌。
第1天，给小鼠在左胁皮下植入BioMedics动物ID芯片(ModelIMI-1000；Seaford，DE)SC。第0天，将悬于不含血清的200μLRPMI-1640的5x106Calu-6细胞SC植入每个小鼠的右胁部分。从第4天开始，至少每周两次记录肿瘤大小和体重测量值。当测量到肿瘤重量最少100mg时，将小鼠随机分到处理和对照组中(见表13)。
实验材料和阳性化疗剂
DM4偶联物(2000-793.3D/A，5.5mg/ml)在ImmunoGen，Inc(Cambridge，MA)利用ImmunoGen的肿瘤激活前药(TAP)技术制备。载体对照和B3F6.1-DM4单抗给剂溶液(Lot#10878-49，formulation，notebook：AC
10878-49)由Biogen Idec的Anne Cheung提供。临床级的CamptosarTM(伊立替康(irinotecan)注射液，NDC0009-7529-01)购自Pharmacia和Upjohn(前7个剂量Lot No.76KD P，2006年7月过期；最后三个剂量Lot No.46MFH，2007年8月过期)。
测试组和处理方案
表13描述了各测试组和处理方案。B3F6.1-DM4在无胸腺裸鼠中的半衰期是3.9天。所有B3F6.1-DM4单抗均经IV在第13、17和21天给予；或者每周一次，共给剂三次(q7d x3)。载体对照(10mM柠檬酸缓冲液，pH5.5，135mM氯化钠)给予q7dx3，伊立替康在第13-14、17-21和24-26天经IP给药。载体对照组的给剂方案与和本报道无关的处理组给剂方案平行，在第14天给予第一次处理。B3F6.1-DM4和伊立替康处理在第13天开始。
表13：对照和试验处理组
试剂 剂量/注射 美登素等效剂量(μg/kg) 途径 时间安排 小鼠数
载体对照 10ml/kg 0 IVa 3x/wk x4 16
B3F6.1-DM4 10mg/kg 167 IV 第13，17，21天 8
B3F6.1-DM4 20mg/kg 334 IV 第13，17，21天 8
B3F6.1-DM4 15mg/kg 251 IV Q7d x3 8
B3F6.1-DM4 30mg/kg 502 IV Q7d x3 8
伊立替康 10mg/kg IPb 第13-14，17-21天 8
a静脉内
b腹膜内
抗癌活性的评价
用数码卡尺确定肿瘤的测量值。在第4天记录体重和肿瘤大小，持续每周至少记录两次至试验结束。用计算扁椭圆形体积的公式由两维肿瘤测量值来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)÷2。假设密度为1，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。
统计分析
在每项试验结束时，对平均肿瘤重量进行Student’s t检验来确定每个处理组和载体对照组之间是否有统计学上的显著差异。
抗肿瘤活性
移植后的成瘤率达到90％，挑选肿瘤重量处于某个很窄范围内的小鼠开始处理。伊立替康引起与该模型相符的反应，从第20天到该组试验结束时的第45天对肿瘤生长都有显著(P<0.001)抑制。
图26-29显示两种剂量(10和20mg/kg/注射)B3F6.1-DM4在第13、17和21天IV给予；或者伊立替康在第13-14、17-21和24-26天给予对肿瘤重量、最终肿瘤重量、％处理/对照、以及带有已建成Calu-6异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠体重的影响。两种剂量的B3F6.1-DM4在以下持续时间内都对肿瘤生长有显著抑制：
·10mg/kg：第24到45天(第24、35-38和45天，P<0.01；第27-32和41天，P<0.001)
·20mg/kg：第24到45天(P<0.001)
％T/C在第32到45天达到42％活性的NCI标准以下。
图30-33显示两种剂量(15和30mg/kg/注射)B3F6.1-DM4经IV给予q7dx3；或者伊立替康在第13-14、17-21和24-26天给予对肿瘤重量变化、最终肿瘤重量、％处理/对照、以及带有已建成Calu-6异种移植肿瘤的无胸腺裸鼠体重的影响。两种剂量的B3F6.1-DM4在以下持续时间内都对肿瘤生长有显著抑制：
·15mg/kg：第32到45天(第32-35和45天，P<0.01；第38-41天，P<0.001)
·30mg/kg：第24到45天(第24天，P<0.01；第27-45，P<0.001)
30mg/kg时，％T/C在第32到45天达到42％活性的NCI标准以下。
10mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理组中的一只小鼠，在移植后的第32天，即接受最后一次B3F6.1-DM4后11天死亡。这只动物没有表现出给剂后的毒性迹象，该组的其他动物也没有表现出任何病态。
30mg/kg/注射B3F6.1-DM4处理组中的所有小鼠出现皮肤的棒杆菌感染，感染在最后一次给予B3F6.1-DM1后的几天消失。这种细胞存在于皮肤上，被认为是当动物受到胁迫时引发机会感染。该组的所有动物在给剂过程中都发生了体重下降，但是体重下降和感染在给剂停止后都解决了。该组的一只小鼠还出现了R耳耳廓的次级葡萄球菌感染，感染在几天内消失了。
等同物
仅利用常规实验，本领域技术人员就能意识到，甚至能确定本文描述的发明特定实施方案的许多等同物。这些等同物也被以下权利要求所涵盖。
序列表
<110>比奥根艾迪克MA公司(Biogen IDEC MA，Inc.)
<120>CRIPTO结合分子
<130>BGNA019CPPC
<150>60/641691
<151>2005-01-05
<160>71
<170>Fa s tSEQ for Windows Ver s ion4.0
<210>1
<211>1095
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>1
caggtccaac tgcagcaggt tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg    60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tacactgggt gaagcagagg    120
cctggacagg gccttgagtg gattggagag aatgatccta gcaacggtcg tactaactac    180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aaggggccct    300
aattacttct attctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagct    360
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc    420
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg    480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga    540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac    600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa    660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct    720
cccccatgcc cacggtgccc agcacctgga ggtggctcga gtggaggcgg ttccggaggg    780
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac    840
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg    900
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac    960
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac    1020
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc    1080
tccctgtctc cgggt                                                     1095
<210>2
<211>657
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>2
gattttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc    60
atctcttgca gatcaagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg    120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctcatct acaaagtttc caaccgattt    180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc    240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct    300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaagcgta cggtggctgc accatctgtc    360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg    420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa    480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc    540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa    600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtg        t657
<210>3
<211>365
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Va l Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
 1               5                   10                 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55              60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                   75                 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            260                 265                 270
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        275                 280                 285
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    290                 295                 300
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
305                 310                 315                 320
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                325                 330                 335
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            340                 345                 350
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        355                 360                 365
<210>4
<21l>219
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>4
Asp Phe Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>5
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>5
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu
 1               5                  10                  15
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
            20                  25                  30
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        35                  40
<210>6
<211>188
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>6
Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
 1               5                  10                  15
Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
            20                  25                  30
His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp
        35                  40                  45
Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65                  70                  75                  80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys
            100                 105                 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
        115                 120                 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala
    130                 135                 140
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala
145                 150                 155                 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
                165                 170                 175
Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
            180                 185
<210>7
<211>188
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>7
Met Asp Cys Arg Lys Met Val Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
 1               5                  10                  15
Met Ala Ile Ser Lys Ala Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
            20                  25                  30
His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Asp Leu Ala Phe Arg Asp
        35                  40                  45
Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Val Leu Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65                  70                  75                  80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Glu Ser Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys
            100                 105                 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
        115                 120                 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala
    130                 135                 140
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala
145                 150                 155                 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
                165                 170                 175
Leu Ala Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
            180                 185
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>8
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
 1               5                  10
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>9
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
 1               5                  10                  15
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>10
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
 1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>11
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
 1               5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>12
Ser Tyr Trp Ile His
 1               5
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>13
Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
 1               5                  10                  15
Asn
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>14
Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
 1               5                  10
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>15
Ile Gly Lys Thr Ile Ser Lys Lys Ala Lys
 1               5                  10
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>16
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
 1               5                  10                  15
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>17
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
 1               5                  10
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>18
Cys Pro Pro Cys Pro
 1               5
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>19
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
 1               5
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>20
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
 1               5              10
<210>21
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>21
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
 1               5                  10                  15
Pro Arg Cys Pro
            20
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>22
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
 1               5
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>23
Cys Pro Ser Cys Pro
 1               5
<210>24
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>24
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
 1               5
<210>25
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>25
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gys Pro Pro Cys Gly Gly
 1            5              10           15
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20
<210>26
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>26
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu
1                5                  10                  15
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys PRo Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        35                  40
<210>27
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20
<210>28
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>28
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
<210>29
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>29
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
2025
<210>30
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
<210>31
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>31
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
<210>32
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>32
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
<210>33
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>33
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
<210>34
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>34
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Glu Pro Lys Ser
 1               5                  10                 15
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
            20                  25
<210>35
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>35
Cls Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
 1               5                  10                  15
<210>36
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>36
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
 1               5                  10
<210>37
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>37
Glu Ser Lys Tyr Gly
 1               5
<210>38
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>38
Pro Pro Cys Pro Ser
 1               5
<210>39
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>39
Asp Phe Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
<210>40
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Val Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ser Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>41
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>41
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>42
<211>129
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<220>
<221>VARIANT
<222>108，109，112
<223>Xaa＝Any Amino Acid
<400>42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ser Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Xaa Xaa Val Tyr Xaa
            100                 105                 110
Tyr Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>43
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<220>
<221>VARIANT
<222>33，100，103
<223>Xaa＝Any Amino Acid
<400>43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Xaa Asp Gly Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
                85                  90                  95
Ala Leu Gln Xaa Pro Arg Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
            100                 105                 110
Ile Lys
<210>44
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<220>
<221>VARIANT
<222>117
<223>Xaa＝Any Amino Acid
<400>44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr
            100                 105                 110
Arg Gly Asp Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser
130
<210>45
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>45
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>46
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Phe Met His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln
    50                  55                  60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Leu Asp Thr Ala Ile Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Cys Ser Asn
              115            120
<210>47
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>47
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>48
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                105                  110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>49
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                   45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>50
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>50
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>51
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>51
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>52
<211>223
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>52
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Ala Ser Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                  215                220
<210>53
<211>223
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>53
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Ala Ser Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
<210>54
<211>223
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>54
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Ala Ser Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
<210>55
<211>460
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Ala Ser
        195                 200                 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys Val Glu
    210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
            260                 265                 270
Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
        275                 280                 285
Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
    290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
                325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
            340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
        355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
    370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
                405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455             460
<210>56
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
       195                  200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
        275                 280                 285
Trp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg
            420                 425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
<210>57
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                     255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                     270
Val Val Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
        275                 280                     285
Trp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                     300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                     315             320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                     330             335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                     345             350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                     360             365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                     375             380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                     390             395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                    405             410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg
                420             425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
            435             440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
       450           455            460
<210>58
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
        275                 280                 285
Trp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg
            420                 425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
<210>59
<211>373
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Ala Ser
        195                 200                 205
Asn His Lys Pro SerAsn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys Val Glu
    210                215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Gly
                245                 250                 255
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            260                 265                 270
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
        275                 280                 285
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    290                 295                 300
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
305                 310                 315                 320
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                325                 330                 335
Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
            340                 345                 350
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Pro Gly
    370
<210>60
<211>375
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu
            260                 265                 270
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    290                 295                 300
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
305                 310                 315                 320
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                325                 330                 335
Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
           340                  345                 350
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    370             375
<210>61
<211>375
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu
            260                 265                 270
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    290                 295                 300
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
305                 310                 315                 320
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                325                 330                 335
Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            340                 345                 350
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    370             375
<210>62
<211>375
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>62
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu
            260                 265                 270
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    290                 295                 300
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
305                 310                 315                 320
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                325                 330                 335
Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            340                 345                 350
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    370             375
<210>63
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>63
Met Lys Leu Pro Val Ala Arg Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile
 1               5                  10                  15
Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
        35                  40                  45
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
Lys Leu Glu Ile Lys
    130
<210>64
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>64
Met Lys Leu Pro Val Ala Arg Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile
 1               5                  10                  15
Pro Ala Ser Ser Ser Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
        35                  40                  45
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
Lys Leu Glu Ile Lys
    130
<210>65
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>65
Met Lys Leu Pro Val Ala Arg Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile
 1               5                  10                  15
Pro Ala Ser Ser Ser Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
        35                  40                  45
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
        115                 120                 125
Lys Leu Glu Ile Lys
       130
<210>66
<211>144
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>66
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg
            100                 105                 110
Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe
        115                 120                 125
Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
<210>67
<211>146
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>67
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg
            100                 105                 110
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn
        115                 120                 125
Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Ser
145
<210>68
<211>146
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>68
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg
            100                 105                 110
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn
        115                 120                 125
Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Ser
145
<210>69
<211>146
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>69
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser
            100                 105                 110
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn
        115                 120                 125
Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Ser
145
<210>70
<211>251
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>70
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
                85                  90                  95
Ala Ser Pro Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
            100                 105                 110
Cys Pro Pro Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
        115                 120                 125
Pro Arg Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
145                 150                 155                 160
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                165                 170                 175
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            180                 185                 190
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        195                 200                 205
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln
    210                 215                 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225                 230                 235                 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                245                 250
<210>71
<211>913
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>71
Ala Leu Ala Ser Glu Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro
 1            5                     10                   15
Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro His Glu Pro Arg Leu Glu Ala Leu
        20                      25                  30
Ala Pro Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr
    35                      40                  45
His Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Leu
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Leu Glu Val Ala
65                  70                  75                  80
Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Pro His Glu Pro Arg Gly
                85                  90                  95
Leu Pro Arg Val Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Thr
            100                 105                 110
Arg Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu
        115                 120                 125
Thr His Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Val Ala Leu His Ile Ser Thr
    130                 135                 140
His Arg Pro His Glu Pro Arg Ala Leu Ala Val Ala Leu Leu Glu Gly
145                150                 155                 160
Leu Asn Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Tyr Arg
               165                  170                 175
Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Val Ala
            180                 185                 190
Leu Thr His Arg Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser
        195                 200                 205
Glu Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Asn Thr His Arg
    210                 215                 220
Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Leu Ala
225                 230                 235                 240
Ser Asn His Ile Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn
                245                 250                 255
Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Leu
            260                 265                 270
Tyr Ser Val Ala Leu Gly Leu Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Cys
        275                 280                 285
Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Thr His Arg His Ile Ser Thr His
    290                 295                 300
Arg Cys Tyr Ser Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Leu Ala
305                 310                 315                 320
Pro Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg
                325                 330                 335
Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro His Glu Leu Glu Pro His Glu Pro Arg
            340                 345                 350
Pro Arg Leu Tyr Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr His Arg
        355                 360                 365
Leu Glu Met Glu Thr Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His
    370                 375                 380
Arg Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Val Ala
385                 390                 395                 400
Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser Glu Arg
                405                 410                 415
His Ile Ser Gly Leu Ala Ser Pro Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Leu
            420                 425                 430
Tyr Ser Pro His Glu Ala Ser Asn Thr Arg Pro Thr Tyr Arg Val Ala
        435                 440                 445
Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu His
    450                 455                 460
Ile Ser Ala Ser Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Leu Tyr
465                 470                 475                 480
Ser Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Asn Thr Tyr Arg
                485                 490                 495
Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Val
            500                 505                 510
Ala Leu Val Ala Leu Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu Glu Thr His Arg
        515                 520                 525
Val Ala Leu Leu Glu His Ile Ser Gly Leu Asn Ala Ser Pro Thr Arg
    530                  535                540
Pro Leu Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly Leu Thr Tyr
545                 550                 555                 560
Arg Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Arg
                565                 570                     575
Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala
            580                 585                     590
Pro Arg Ile Leu Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Thr Hi s Arg Ile Leu Glu
        595                 600                      605
Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly
    610                 615                     620
Leu Asn Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Pro Arg Gly Leu Asn Val Ala
625                 630                     635             640
Leu Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg
                645                     650             655
Ala Arg Gly Ala Ser Pro Gly Leu Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser
            660                     665             670
Ala Ser Asn Gly Leu Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Leu Glu Thr His
        675                 680                 685
Arg Cys Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro
    690                 695                 700
His Glu Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu
705                 710                 715                 720
Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Ser Glu Arg
                725                 730                 735
Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Gly Leu Ala Ser Asn
            740                 745                 750
Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Thr His Arg Pro
        755                 760                 765
Arg Pro Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ala Ser
    770                 775                 780
Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu Leu Glu Thr
785                 790                 795                 800
Tyr Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu
                805                 810                 815
Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr Arg Pro Gly
            820                 825                 830
Leu Asn Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Val Ala Leu Pro His
        835                 840                 845
Glu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Met Glu Thr
    850                 855                 860
His Ile Ser Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu His Ile Ser Ala Ser Asn
865                 870                 875                 880
His Ile Ser Thr Tyr Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ser
                885                 890                 895
Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu
            900                 905                 910
Tyr

Claims (97)

1.一种结合分子，其包含：
(i)至少一个选自以下的CDR序列：
CDR L1：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：9)，
CDR L2：KVSNRFS(SEQ ID NO：10)，
CDR L3：FQGSHVPLT(SEQ ID NO：11)，
CDR H1：SYWIH(SEQ ID NO：12)，
CDR H2：ENDPSNGRTNYNEKFKN(SEQ ID NO：13)，和
CDR H3：GPNYFYSMDY(SEQ ID NO：14)
以及(ii)来自人受体免疫球蛋白序列的可变框架区序列，
其中所述结合分子特异结合人Cripto抗原。
2.权利要求1的结合分子，其包含CDR H3序列GPNYFYSMDY(SEQ IDNO：14)。
3.权利要求1或2的结合分子，其包含CDR H2序列ENDPSNGRTNYNEKFKN(SEQ ID NO：13)。
4.权利要求1-3之一的结合分子，其包含CDR H1序列SYWIH(SEQ IDNO：12)。
5.权利要求1-4之一的结合分子，其包含CDR L3序列FQGSHVPLT(SEQ ID NO：11)。
6.权利要求1-5之一的结合分子，其包含CDR L2序列KVSNRFS(SEQID NO：10)。
7.权利要求1-6之一的结合分子，其包含CDR L1序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：9)。
8.权利要求1-7之一的结合分子，其中所述可变框架区序列中的至少一个框架残基被相应小鼠B3F6可变区序列中的相应氨基酸残基取代。
9.一种结合分子，该分子包含：
(a)轻链可变区，其含有SEQ ID NO：39的CDR 1-3和来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区；以及
(b)重链可变区，其含有SEQ ID NO：40的CDR 1-3和来自人受体免疫球蛋白重链的可变框架区，
其中所述结合分子特异结合人CRIPTO抗原。
10.权利要求9的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白重链的可变框架区与SEQ ID NO：40的框架和CDR区至少约50％相同。
11.权利要求9或10的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白重链的可变框架区是来源于人亚型1序列、人亚型1共有序列，或人种系序列。
12.权利要求9-11之一的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白重链的可变框架区包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列。
13.权利要求9-12之一的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区与SEQ ID NO：39的框架和CDR区至少约60％相同。
14.权利要求9-13之一的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区是来源于人κ2亚型序列、人κ2亚型共有序列，或人种系序列。
15.权利要求9-14之一的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列。
16.权利要求9-15之一的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白重链之可变框架区的至少一个框架残基被SEQ ID NO：40所示小鼠氨基酸序列中的相应氨基酸残基取代，其中该至少一个氨基酸残基是
a)规范残基、
b)界面堆积残基、
c)靠近结合位点的不常见或罕见残基、
d)具有与CDR中一些原子距离在3_单位以内的侧链原子的残基。
17.权利要求16的结合分子，其中所述的至少一个框架残基选自H1、H48、H67、H71、H73、H81、H82b、H93和H112(Kabat编号体系)。
18.权利要求16或17的结合分子，其中所述的至少一个框架残基包括H48、H67、H71、H73、H93和H112。
19.权利要求16-18之一的结合分子，其中所述的至少一个框架残基是H71和H112。
20.权利要求16-19之一的结合分子，其中所述的至少一个框架残基包括H1、H48、H71、H81、H82b和H112。
21.权利要求16-20之一的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列之可变框架区的至少一个框架残基被SEQ ID NO：39所示小鼠序列中的相应氨基酸残基取代，其中该至少一个氨基酸残基是
a)规范残基、
b)界面堆积残基、
c)靠近结合位点的不常见或罕见残基、
d)具有与CDR中一些原子距离在3_单位以内的侧链原子的残基。
22.权利要求21的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区是L2或L100(Kabat编号体系)。
23.权利要求21或22的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区是L2。
24.权利要求21-23之一的结合分子，其中所述来自人受体免疫球蛋白轻链序列的可变框架区包括L2和L100。
25.一种结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有VL序列的CDR和框架氨基酸序列并任选含有信号序列，所述VL序列选自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：50、以及位于SEQ IDNO：52中的氨基酸残基1-112；以及
(b)重链，该重链含有VH序列的CDR和框架氨基酸序列并任选含有信号序列，所述VH序列选自SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、以及位于SEQ ID NO：55中的氨基酸残基1-121；
其中该结合分子特异结合人Cripto抗原。
26.权利要求25的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有SEQ ID NO：52中氨基酸1-112所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列；以及
(b)重链，该重链含有SEQ ID NO：55中氨基酸1-121所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列。
27.权利要求25的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有SEQ ID NO：47所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列；以及
(b)重链，该重链含有SEQ ID NO：48所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列。
28.权利要求25的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有SEQ ID NO：47所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列；以及
(b)重链，该重链含有SEQ ID NO：49所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列。
29.权利要求25的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有SEQ ID NO：47所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列；以及
(b)重链，该重链含有SEQ ID NO：51所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列。
30.权利要求25的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有SEQ ID NO：50所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列；以及
(b)重链，该重链含有SEQ ID NO：48所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列。
31.权利要求25的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有SEQ ID NO：50所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列；以及
(b)重链，该重链含有SEQ ID NO：49所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列。
32.权利要求25的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有SEQ ID NO：50所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列；以及
(b)重链，该重链含有SEQ ID NO：51所示的框架和CDR氨基酸序列，并任选含有信号序列。
33.权利要求9-32之一的结合分子，其中所述结合分子的重链包含与VH、VL或CH1区借助合成连接肽而遗传融合的CH3区。
34.权利要求9-33之一的结合分子，其中所述结合分子的重链缺少全部或部分CH2区。
35.权利要求9-34之一的结合分子，该结合分子包含来源于选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的抗体亚型的恒定区。
36.权利要求9-35之一的结合分子，其中该结合分子包含来源于选自γ1绞链、γ2绞链、γ3绞链和γ4绞链的绞链区的氨基酸序列。
37.权利要求9-36之一的结合分子，其中该结合分子包含嵌合绞链区。
38.权利要求9-37之一的结合分子，其中所述结合分子包含至少部分IgG1绞链区，至少部分IgG3绞链区。
39.权利要求9-38之一的结合分子，其中所述结合分子包含重链恒定区，所述恒定区在位点239或242(Kabat编号体系)含有半胱氨酸残基。
40.权利要求9-39之一的结合分子，其中所述结合分子包含重链恒定区，所述恒定区与野生型Fc区相比，含有至少一个氨基酸修饰。
41.权利要求40的结合分子，其中所述修饰包含发生在EU位点297-299中任一位点的氨基酸取代，从而使得变体在哺乳动物细胞内表达时基本上是非糖基化的。
42.权利要求40或41的结合位点，其中所述结合分子与具有野生型Fc区的结合分子相比，效应物功能下降。
43.权利要求42的结合分子，其中所述结合分子的抗原依赖性细胞毒性降低。
44.权利要求42或43的结合分子，其中该结合分子的半衰期延长。
45.权利要求40-45之一的结合分子，其中所述修饰的Fc区有至少一个工程化的半胱氨酸残基。
46.权利要求45的结合分子，其中所述工程化的半胱氨酸残基位于Fc区的CH3区。
47.权利要求1-46之一的结合分子，该分子与效应物部分偶联。
48.权利要求47的结合分子，其中所述效应物部分选自细胞毒素、前药、生物毒素和放射性同位素。
49.权利要求47的结合分子，其中所述效应物部分借助酰胺键来偶联。
50.权利要求48的结合分子，其中所述效应物部分是美登木素生物碱。
51.权利要求25的结合分子，其轻链包含SEQ ID NO：53所示的框架和CDR氨基酸序列，重链包含SEQ ID NO：56所示的框架和CDR氨基酸序列。
52.权利要求25的结合分子，其轻链包含SEQ ID NO：53所示的框架和CDR氨基酸序列，重链包含如SEQ ID NO：57所示的框架和CDR氨基酸序列。
53.权利要求52的结合分子，其包含γ1亚型重链恒定区。
54.权利要求52的结合分子，其含SEQ ID NO：71所示重链恒定区序列。
55.人源化抗Cripto单克隆抗体，所述抗体由ATCC保藏号为PTA-7284的细胞系产生。
56.权利要求25的结合分子，其轻链具有如SEQ ID NO：53所示的序列，重链具有如SEQ ID NO：58所示的序列。
57.权利要求25的结合分子，其轻链具有如SEQ ID NO：54所示的序列，重链具有如SEQ ID NO：56所示的序列。
58.权利要求25的结合分子，其轻链具有如SEQ ID NO：54所示的序列，重链具有如SEQ ID NO：57所示的序列。
59.权利要求25的结合分子，其轻链具有如SEQ ID NO：54所示的序列，重链具有如SEQ ID NO：58所示的序列。
60.权利要求25的结合分子，其轻链具有如SEQ ID NO：52所示的序列，重链具有如SEQ ID NO：55所示的序列。
61.CH2区删除的结合分子，其包含：
(a)轻链，该轻链含有选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ IDNO：54的轻链可变区(VL)序列；
(b)重链，该重链含有选自SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：57和SEQ ID NO：5的重链可变区(VH)序列8；
其中所述结合分子能够特异结合人CRIPTO抗原。
62.权利要求57所述结构域删除的结合分子，其轻链序列如SEQ IDNO：53所示，重链序列如SEQ ID NO：60所示。
63.权利要求57所述结构域删除的结合分子，其轻链序列如SEQ IDNO：53所示，重链序列如SEQ ID NO：61所示。
64.权利要求57所述结构域删除的结合分子，其轻链序列如SEQ IDNO：53所示，重链序列如SEQ ID NO：62所示。
65.权利要求57所述结构域删除的结合分子，其轻链序列如SEQ IDNO：54所示，重链序列如SEQ ID NO：60所示。
66.权利要求57所述结构域删除的结合分子，其轻链序列如SEQ IDNO：54所示，重链序列如SEQ ID NO：61所示。
67.权利要求57的人源化B3F6结合分子，其轻链序列如SEQ ID NO：54所示，重链序列如SEQ ID NO：62所示。
68.权利要求57的人源化B3F6结合分子，其中所述轻链的序列如SEQID NO：52所示，重链的序列如SEQ ID NO：59所示。
69.权利要求9-68之一的结合分子，其中所述结合分子被改变成在该结合分子的至少一个CDR中包含至少一个保守氨基酸取代。
70.权利要求9-69之一的结合分子，该分子是双特异性的。
71.权利要求9-69之一的结合分子，该分子是四价的。
72.权利要求9-69之一的结合分子，该分子是全长抗体。
72.权利要求9-69之一的结合分子，该分子是抗体片段。
73.一种组合物，该组合物包含具有至少两个结合位点和至少两个多肽链的多肽二聚体，其中所述至少两个结合位点中的至少一个包含人源化B3F6可变区，其中所述至少两个多肽链包含至少一个重链部分并包含合成的连接肽，其中约70％以上的多肽二聚体含有通过至少一个链间二硫键相连的多肽链，所述连接肽在Kabat编号体系所示位点243包含脯氨酸残基。
74.权利要求73的组合物，其中90％以上的多肽二聚体是通过至少一个链间二硫键连在一起的。
75.权利要求73或74的组合物，其中所述合成的连接肽还在Kabat编号体系所示位点239或242包含半胱氨酸残基。
76.权利要求73-75之一的组合物，其中至少一个多肽链包含与VL、VH或CH1区借助连接肽相连的CH3区。
77.权利要求73-76之一的组合物，其中所述合成的连接肽还在Kabat编号体系所示位点244包含丙氨酸、并在该体系所示位点245包含脯氨酸。
78.人源化的抗Cripto抗体，该抗体包含SEQ ID NO：53所示的轻链氨基酸序列，和SEQ ID NO：57所示的重链氨基酸序列，其中所述抗体与美登木素生物碱偶联。
79.组合物，包含权利要求1-78之一所述的结合分子和可药用载体。
80.权利要求78所述抗体的变体，其中该变体包含至少一个保守氨基酸取代，并且该变体保留了特异结合人Cripto的能力。
81.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求9-55之一所述结合分子的重链或轻链的核苷酸序列。
82.一种核酸分子，其在高度严格条件下与权利要求81所述核酸分子的互补链杂交。
83.权利要求82的核酸分子，其位于载体中。
84.宿主细胞，包含权利要求83所述的载体。
85.制备结合分子的方法，包括将权利要求9-55之一的宿主细胞在能产生该结合分子的条件下进行培养，并从宿主细胞或培养物中分离所述结合分子。
86.用权利要求1-80之一的结合分子治疗受试者的方法，所述方法包括将所述结合分子给予受试者从而进行治疗，所述受试者是能受益于该项治疗的受试者。
87.治疗恶性肿瘤的方法，包括将编码权利要求1-80之一所述结合分子的核酸分子给予恶性肿瘤患者，给药条件使得所述结合分子被表达，从而患者的恶性肿瘤得以治疗。
88.权利要求86或87的方法，其中所述受试者患有癌症。
89.权利要求86或87的方法，该方法还包括给予其它的试剂。
90.权利要求89的方法，其中所述其它试剂是化疗剂。
91.权利要求89的方法，其中所述其它试剂选自那他珠单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、因福利美、利妥昔单抗、替伊莫单抗、爱必妥、盐酸左旋咪唑、托西莫单抗、阿仑单抗、IMC-C225、甲磺酸伊马替尼、氟维司群、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、他莫昔芬、α干扰素、地尼白介素、奥利莫森、盐酸厄洛替尼、保特佐米、沙利度胺和内皮抑制素。
92.一种抑制Cripto在患者细胞内表达产生的后果的方法，该方法包括将有效剂量的权利要求78的结合分子给予患者。
93.权利要求92的方法，其中所述结合分子的有效剂量是至少约5mg/kg。
94.权利要求92的方法，其中所述结合分子的有效剂量是至少约10mg/kg。
95.权利要求92的方法，其中所述结合分子是通过腹膜内、口服、鼻内、皮下、肌内、局部或静脉内给药的。
96.权利要求92的方法，其中所述患者在选自下组的器官中患有癌症：脑、***、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。
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