JP4932076B2

JP4932076B2 - 走査型レーザ顕微鏡

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Publication number: JP4932076B2
Application number: JP2000330710A
Authority: JP
Inventors: 祐仁荒井
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2020-10-30
Also published as: JP2002131645A; US6717723B2; US6781751B2; US20040125440A1; US20020097487A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物試料の観察などに用いられる走査型レーザ顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
走査型レーザ顕微鏡は、生きた細胞や組織の試料を傷付けることなく、光学的にスライスして２次元断層像を複数得るとともに、これら複数の２次元断層像から３次元画像を得るものとして知られている。
【０００３】
また、このような特徴を生かして、生理学や薬学、細胞生物学などの分野では、細胞に対する刺激、例えば電気信号による刺激や熱、薬品などの化学的な刺激に対する細胞内の化学的、物理的反応、変化の様子を、また、形態学や発生学では、細胞の構造、形状や経時的に変形、移動する様子を詳細に観察、記録するためのものとしても広く使用されている。
【０００４】
ところで、生物試料を観察する走査型レーザ顕微鏡は、試料に導入した蛍光試薬あるいは蛍光蛋白をレーザ光で励起し、この励起により発生した蛍光量を測定することにより画像を生成するようにしている。この場合、蛍光物質から発生する蛍光量は、励起光の照射にともなって減少する、いわゆる退色現象が生じることが知られており、このため、従来では、不必要な励起光を遮断して極力退色を防止する方法が考えられている。
【０００５】
例えば、上述した２次元あるいは３次元画像の経時変化を観測するような場合、画像の取得から次の画像の取得までのインターバル時間内に、レーザ光が不要に試料に照射されないように、機械的に光路中にシャッタを挿入したり、光学フィルタや音響フィルタを用いてレーザ光を減衰させたり、あるいは電気的にレーザ光源の発振を停止させるなどの方法が取られている。
【０００６】
このような考えに基づいたものとして、例えば、特開平９−１８９８６４号公報に開示されるように、１フレーム分の画像中に観察したい領域を設定し、実際にレーザ光を走査する場合に、設定領域内では透光状態「１」、領域外では遮光状態「０」とするように走査ピクセル単位でレーザ光の照射を制御することで、観察したい領域以外での試料の退色を防止するようにしたものや、特開２０００−３５４００号公報に開示されるように、レーザ光により２次元面内を走査する間に、各位置においてレーザ光の強度調整および波長の選択を予め設定された手順で実行することにより、２次元面内の所望の部分にのみ所望の波長、強度のレーザ光を照射できるようにしたものが知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、最近、蛍光の退色現象を積極的に利用した研究が進められている。この研究では、試料の特定の領域をレーザ光の照射により退色させ、その後、この退色領域の蛍光の復帰過程での蛍光物質の移動や拡散度などを観測領域やレーザ光の照射条件などを変えながら測定するもので、具体的には、試料の特定部位を任意の形状で退色させた直後から、その部位またはその周囲、あるいはその両方の領域について所望の波長、強度のレーザ光を照射した観測を行うようにしている。
【０００８】
ところが、特開平９−１８９８６４号公報および特開２０００−３５４００号公報に開示されたものは、予め設定された領域や各位置について、決められた条件に基づいてレーザ光の照射を制御するようにしたもので、静的な観察がメインターゲットになっている。このため、上述したように、試料の特定の領域をレーザ光の照射により退色させるとともに、この退色領域の蛍光の復帰過程を観測領域やレーザ光の照射条件などを変えながら測定するようなダイナミックな経時測定には、対応できないという問題があった。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、ダイナミックな経時測定に対応できる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の一態様による走査型レーザ顕微鏡は、試料面にレーザ光を走査するとともに、前記試料面からの光を受光するような走査型レーザ顕微鏡において、前記試料面に走査されるレーザ光を変調する光変調手段と、前記試料面からの光の受光により取得される走査画像の１画素ごとに前記光変調手段を制御する制御手段と、を具備し、前記制御手段は、前記走査画像に対応する各画素ごとにレーザ光の変調情報が設定されたレーザ照射領域パターン画像としての制御パターンを複数記憶する記憶手段を有し、この記憶手段に記憶された前記制御パターンの中から任意の制御パターンを読み出し、各画素ごとの変調情報に基づいて前記光変調手段を制御するとともに、任意のタイミングで前記記憶手段に記憶された別の制御パターンを読み出し、該読み出した別の制御パターンに変更する制御を行うことを特徴とする。
【００１３】
この結果、本発明によれば、走査を中断することなく、時間とともに異なるレーザ照射領域パターン画像に対応する走査画像を得ることができる。
【００１４】
また、少ない容量の記憶手段でも、多数のレーザ照射領域パターン画像を適用させることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１６】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。
【００１７】
この走査型レーザ顕微鏡は、レーザ装置１、レーザ走査ユニット２、顕微鏡本体３、制御ユニット４、データ処理ユニット５、表示ユニット６およびマウスやキーボードなどからなる入力ユニット７より構成されている。
【００１８】
レーザ装置１は、波長の異なる複数（図示例では３個）のレーザ発振器１１ａ、１１ｂ、１１ｃを有し、これらレーザ発振器１１ａ、１１ｂ、１１ｃの前方には、機械的にレーザ光路を遮断するレーザシャッタ１２ａ、１２ｂ、１２ｃが配置されるとともに、レーザ発振器１１ａ、１１ｂ、１１ｃの各レーザ光路を結合して１つのレーザ光路に導くダイクロイックミラー１３ａ、１３ｂ、１３ｃが配置され、これらダイクロイックミラー１３ａ、１３ｂ、１３ｃにより導かれたレーザ光路に、レーザ光の波長や強度を変調する光変調手段として、音響光学可変フィルタ（以下、ＡＯＴＦと称する。）１４が配置されている。ここで、レーザシャッタ１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、ＡＯＴＦ１４では、その特性上レーザ光を完全に遮断することが困難であり、ＡＯＴＦ１４に入力されるレーザ光の０．１％程度が常に出力されてしまうことを回避するために設けられている。
【００１９】
レーザ走査ユニット２は、ＡＯＴＦ１４より変調されるレーザ光が光ファイバ８を介してコリメータレンズ２１に入力される。このコリメータレンズ２１でコリメートされたレーザ光の光路には、レーザシャッタ２２を介してダイクロイックミラー２３が配置されている。このダイクロイックミラー２３は、レーザ光を反射するとともに、後述する試料３３からの蛍光あるいは反射光を透過するものである。ダイクロイックミラー２３の反射光路には、走査機構２４および投影レンズ２５が配置されている。走査機構２４は、レーザ光を試料３３上で２次元に走査させるもので、この２次元走査されたレーザ光は、投影レンズ２５を介して顕微鏡本体３に入射される。また、ダイクロイックミラー２３の透過光路には、ピンホール２６、ダイクロイックミラー２７が配置されている。ピンホール２６は、試料３３と光学的に共役な位置に配置されている。ダイクロイックミラー２７は、試料３３からの蛍光あるいは反射光の信号光を波長域ごとに光路分割するものである。そして、ダイクロイックミラー２７で分割された各光路上には、波長フィルタ２６ａ、２６ｂを各別に介して光電変換器２７ａ、２７ｂが配置されている。波長フィルタ２６ａ、２６ｂは、ダイクロイックミラー２７を介して入力される信号光の波長を精度よく選択するものである。光電変換器２７ａ、２７ｂは、各波長フィルタ２６ａ、２６ｂで選択された所定波長域の信号光を電気信号に変換するものである。
【００２０】
このように構成されたレーザ走査ユニット２は、顕微鏡本体３の鏡筒部に機械的、電気的に結合されている。
【００２１】
顕微鏡本体３は、レーザ走査ユニット２のダイクロイックミラー２３の反射光路上に沿って結像レンズ３１、対物レンズ３２が配置され、走査機構２４で２次元走査されたレーザ光が結像レンズ３１、対物レンズ３２を介して試料３３に照射される。試料３３は、サンプルステージ３４に載置されていて、レーザ光の照射により内部に導入された例えば蛍光色素や蛍光タンパクが励起され、その濃度分布などに相関を持った強度の蛍光あるいは反射光を発生する。そして、この蛍光あるいは反射光は、再度対物レンズ３２、結像レンズ３１を介してレーザ走査ユニット２に送られ、投影レンズ２５、走査機構２４を介してダイクロイックミラー２３に入射されるようになっている。
【００２２】
制御ユニット４は、インターフェース部４１、スキャナ駆動回路４２、高周波ドライバ回路４３、制御回路４４、電装部制御回路４５および同期信号発生回路４６により構成されている。インターフェース部４１は、データ処理ユニット５とのデータのやり取りを行うものである。スキャナ駆動回路４２は、レーザ走査ユニット２の走査機構２４を駆動するものである。高周波ドライバ回路４３は、レーザ装置１のＡＯＴＦ１４を駆動するもので、制御回路４４からの変調信号によりＡＯＴＦ１４によるレーザ光の強度変調を行うようにしている。電装部制御回路４５は、レーザシャッタ１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、２２の制御や光電変換器２７ａ、２７ｂの検出感度を設定するものである。同期信号発生回路４６は、走査画像の水平、垂直および１画素ごとの同期信号を発生するものである。
【００２３】
また、高周波ドライバ回路４３を制御する制御回路４４は、図２に示すようにパターン記憶メモリ４４ａ、メモリ制御回路４４ｂ、Ｄ／Ａコンバータ４４ｃ、およびバッファアンプ４４ｄから構成されている。パターン記憶メモリ４４ａは、レーザ光照射領域のパターン画像のデータを１画素ごとのレーザ光の照射強度の情報とともに保存している。メモリ制御回路４４ｂは、同期信号発生回路４６から供給される同期信号とインターフェース部４１を介してデータ処理ユニット５から与えられる制御パラメータによりパターン記憶メモリ４４ａを制御するものである。そして、Ｄ／Ａコンバータ４４ｃは、パターン記憶メモリ４４ａから読み出されるデジタルデータをアナログ信号に変換し、バッファアンプ４４ｄは、Ｄ／Ａコンバータ４４ｃからの出力をレーザ光の強度変調信号として、高周波ドライバ回路４３に出力するようにしている。
【００２４】
図１に戻って、データ処理ユニット５は、パーソナルコンピュータからなるもので、制御ユニット４のインターフェース部４１を介して各種制御パラメータや制御信号を供給する。
【００２５】
表示ユニット６は、データ処理ユニット５に接続され、試料３３の蛍光画像あるいは反射光画像などを表示するものである。
【００２６】
次に、このように構成された実施の形態の動作を説明する。
【００２７】
レーザ装置１のレーザ発振器１１ａ、１１ｂ、１１ｃから発生されたレーザ光は、ＡＯＴＦ１４により波長や強度が調整され、光ファイバ８を介してレーザ走査ユニット２に供給される。
【００２８】
光ファイバ８を出射したレーザ光は、コリメータレンズ２１でコリメートされ、ダイクロイックミラー２３で反射され、走査機構２４に導かれる。そして、走査機構２４により２次元走査されたレーザ光は、投影レンズ２５より、顕微鏡本体３内の結像レンズ３１、対物レンズ３２を介して試料３３に照射される。
【００２９】
このレーザ光の照射により、試料３３より蛍光あるいは反射光が発生し、この蛍光あるいは反射光は、再度対物レンズ３２、結像レンズ３１を介してレーザ走査ユニット２に送られ、投影レンズ２５、走査機構２４を介してダイクロイックミラー２３に導かれ、このダイクロイックミラー２３を透過される。そして、ピンホール２６により試料３３の焦点面のみの情報が選択的に通過され、ダイクロイックミラー２７で波長域ごとに光路分割されたのち、波長フィルタ２６ａ、２６ｂを各別に介して光電変換器２７ａ、２７ｂに導かれ、光の強度に応じた電気信号に変換される。また、これら光電変換器２７ａ、２７ｂからの電気信号の時間変化は、走査機構２４での走査に同期してＡ／Ｄ変換された後、制御ユニット４に取り込まれ、さらにインターフェース部４１を介してデータ処理ユニット５に送られ、試料３３の蛍光画像または反射光画像として表示ユニット６に表示される。
【００３０】
この場合、表示ユニット６に表示される画像は、図３に示すようにレーザ光が２次元走査された試料３３上の領域内の蛍光強度あるいは反射光強度の分布を表わす走査画像となる。
【００３１】
次に、このようにして表示ユニット６上に得られた走査画像に基づいて、レーザ光を照射する任意の領域を設定するとともに、このレーザ光の照射領域を時間とともに変化させる場合を説明する。
【００３２】
この場合、図３に示す表示ユニット６上に表示された走査画像を見ながら、この画像上で、データ処理ユニット５の入力ユニット７のマウスなどを使って、レーザ照射領域Ａを指定する。そして、データ処理ユニット５において、指定されたレーザ照射領域Ａに基づいて、制御パターンとして図４（ａ）に示すようなレーザ照射領域パターン画像１００を作成する。このレーザ照射領域パターン画像１００は、図３に示す表示ユニット６上の走査画像と同じ画素数を有するもので、１画素ごとにレーザ光の照射強度などの変調情報が設定できるようになっている。ここでは、レーザ照射領域Ａで囲まれた部分の各画素のレーザ光の照射強度は、「強」で、それ以外の領域の各画素については、レーザ光遮断に設定されている。
【００３３】
そして、このようなレーザ照射領域パターン画像１００は、画素ごとのレーザ光の変調情報とともに、図４（ｂ）に示すパターン画像データ１０１として、制御回路４４に転送され、パターン記憶メモリ４４ａに記憶される。
【００３４】
同様にして、次に、レーザ照射領域Ｂを指定する。そして、データ処理ユニット５において、指定されたレーザ照射領域Ｂに基づいて図４（ａ）に示すようなレーザ照射領域パターン画像２００を作成する。このレーザ照射領域パターン画像２００は、レーザ照射領域Ｂで囲まれた部分の各画素のレーザ光の照射強度は、「弱」で、それ以外の領域の各画素については、レーザ光遮断に設定されている。
【００３５】
そして、このレーザ照射領域パターン画像２００についても、画素ごとのレーザ光の変調情報とともに、図４（ｂ）に示すパターン画像データ２０１として、制御回路４４に転送され、パターン記憶メモリ４４ａに記憶される。
【００３６】
このようにして、複数枚（図示例では２枚）のレーザ照射領域パターン画像１００、２００のそれぞれのパターン画像データ１０１、２０１がパターン記憶メモリ４４ａに記憶される。
【００３７】
次に、このようなレーザ照射領域パターン画像１００、２００を使用して試料３３の走査画像を取得する方法を説明する。
【００３８】
まず、走査開始前に、最初に使用するパターン画像データ１０１が記憶されるパターン記憶メモリ４４ａの領域をメモリ制御回路４４ｂに設定する。
【００３９】
この状態で、走査を開始すると、メモリ制御回路４４ｂにより、同期信号発生回路４６からの同期信号に同期してパターン記憶メモリ４４ａのパターン画像データ１０１が１画素ずつ読み出され、Ｄ／Ａコンバータ４４ｃに出力される。すると、この画素単位のパターン画像データ１０１は、Ｄ／Ａコンバータ４４ｃによりアナログ信号に変換され、バッファアンプ４４ｄを介してレーザ光の強度変調信号として、高周波ドライバ回路４３に出力され、ＡＯＴＦ１４によるレーザ光の強度変調が行われる。この場合、パターン画像データ１０１は、レーザ照射領域パターン画像１００に相当することから、図４（ａ）に示すようにレーザ照射領域Ａで囲まれた部分の各画素のレーザ光についてのみ、照射強度は「強」となり、それ以外の領域の各画素については、レーザ光が遮断される。
【００４０】
ここで、高周波ドライバ回路４３によるＡＯＴＦ１４への駆動信号と、ＡＯＴＦ１４からのレーザ光の出力との間には有限の遅延時間が存在する。そこで、実際は、メモリ制御回路４４ｂは、同期信号の入力からパターン記憶メモリ４４ａでのパターン画像データ１０１の読み出し開始までに適当な遅延時間を設定することが望ましい。
【００４１】
このようにして、最初のレーザ照射領域パターン画像１００での所望の時間走査が行われた後、次に、パターン記憶メモリ４４ａに対して、次のパターン画像データ２０１が記憶される領域をメモリ制御回路４４ｂに設定する。すると、今度は、メモリ制御回路４４ｂにより、同期信号発生回路４６の同期信号に同期してパターン記憶メモリ４４ａのパターン画像データ２０１が１画素ずつ読み出され、Ｄ／Ａコンバータ４４ｃ、バッファアンプ４４ｄを介してレーザ光の強度変調信号として、高周波ドライバ回路４３に出力され、ＡＯＴＦ１４によるレーザ光の強度変調が行われる。この場合、パターン画像データ２０１は、レーザ照射領域パターン画像２００に相当することから、図４（ａ）に示すようにレーザ照射領域Ｂで囲まれた部分の各画素のレーザ光についてのみ、照射強度は「弱」となり、それ以外の領域の各画素については、レーザ光が遮断される。
【００４２】
この場合、レーザ照射領域パターン画像１００、２００の共通のレーザ照射点Ｘでの蛍光強度は、図５に示すように変化する。まず、期間ｔ１は、試料３３の初期状態の蛍光強度を示している。そして、期間ｔ２において、レーザ照射点Ｘ周辺に対し、レーザ照射領域パターン画像１００に基づいて強いレーザ光を照射すると、試料３３内の蛍光物質が退色し、蛍光強度が急激に低下する。その後、任意のタイミングでレーザ照射領域パターンをレーザ照射領域パターン画像２００に変更制御し、期間ｔ３で、蛍光物質が退色したレーザ照射点Ｘ周辺に、レーザ照射領域パターン画像２００に基づいて弱いレーザ光を照射すると、退色させた領域の周辺を含めた範囲で、蛍光強度が回復する過程を観測できる。
【００４３】
従って、このようにすれば、走査を中断することなく、時間とともに異なるレーザ照射領域パターン画像１００、２００に対応する走査画像を得ることができるので、試料３３の特定部位を強いレーザ光により退色させ、その後、退色した蛍光物質の回復度合いを弱いレーザ光を照射しながら測定するようなダイナミックな経時測定を実現することができる。
【００４４】
なお、上述では、２枚のレーザ照射領域パターン画像１００、２００の場合を述べたが、これ以上の枚数のレーザ照射領域パターン画像を使用する場合にも適用することができる。
【００４５】
（第２の実施の形態）
第１の実施の形態では、レーザ光の照射強度の設定は、走査画像の１画素ごとにできるようにした。しかし、走査画像の画素数を、例えば５１２画素＊５１２画素に設定し、Ｄ／Ａコンバータ４４ｃに８ビットの分解能のものを使用した場合、１つのパターン画像データを記憶するのに要するメモリ容量は、２５６ｋバイトになる。このため、レーザ照射領域パターン画像が数枚から数十枚にもなり、これらを変更しながら走査画像を取得しようとすると、これらレーザ照射領域パターン画像に対応するパターン画像データを記憶するためのパターン記憶メモリ４４ａでの総容量は、数メガバイトから数十メガバイトにもなり、実用的でなくなる。
【００４６】
そこで、この第２の実施の形態では、図６に示すように走査画像５１の画素数を、５１２画素＊５１２画素とし、パターン画像データの１画素を２＊２画素ごとに設定することで、パターン記憶メモリ４４ａでの容量を１／４に低減している。
【００４７】
このようにすれば、走査画像の画素数に対してパターン画像データの画素数を少なく設定できるので、総容量の少ないパターン記憶メモリ４４ａでも、多数のレーザ照射領域パターン画像を適用させることができる。
【００４８】
なお、本発明は上記実施例にのみ限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜実施することができる。例えば、レーザ装置１は、複数のレーザ発振器１１ａ、１１ｂ、１１ｃに対して共通のＡＯＴＦ１４を設けるようにしたが、この他にＵＶレーザを発生するレーザ発振器を設けるとともに、ＵＶレーザ用ＡＯＴＦを設け、このＵＶレーザ用ＡＯＴＦを独立して制御することで、試料３３に対するケージドイオン解除→イオン濃度測定などを行うこともできる。
【００４９】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、例えば、試料の特定部位を任意の形状で退色させ、その直後から蛍光の退色領域の復帰過程を測定するようなダイナミックな経時測定に対応できる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態に用いられる制御回路の概略構成を示す図。
【図３】第１の実施の形態の表示ユニットに表示された走査画像を示す図。
【図４】第１の実施の形態に用いられる制御パターンを説明するための図。
【図５】第１の実施の形態による蛍光強度の変化状況を説明するための図。
【図６】本発明の第２の実施の形態を説明するための図。
【符号の説明】
１…レーザ装置
２…レーザ走査ユニット
３…顕微鏡本体
４…制御ユニット
５…データ処理ユニット
６…表示ユニット
７…入力ユニット
８…光ファイバ
１１ａ．１１ｂ、１１ｃ…レーザ発振器
１２ａ．１２ｂ、１２ｃ…レーザシャッタ
１３ａ．１３ｂ、１３ｃ…ダイクロイックミラー
１４…ＡＯＴＦ
２１…コリメータレンズ
２２…レーザシャッタ
２３…ダイクロイックミラー
２３１…投影レンズ
２４…走査機構
２５…投影レンズ
２６…ピンホール
２７…ダイクロイックミラー
２６ａ．２６ｂ…波長フィルタ
２７ａ．２７ｂ…光電変換器
３１…結像レンズ
３２…対物レンズ
３３…試料
３４…サンプリングステージ
４１…インターフェース部
４２…スキャナ駆動回路
４３…高周波ドライバ回路
４４…制御回路
４４ａ…パターン記憶メモリ
４４ｂ…メモリ制御回路
４４ｃ…Ａコンバータ
４４ｄ…バッファアンプ
４５…電装部制御回路
４６…同期信号発生回路
１００．２００…レーザ照射領域パターン画像
１０１．２０１…パターン画像データ
５１…走査画像

Claims

試料面にレーザ光を走査するとともに、前記試料面からの光を受光するような走査型レーザ顕微鏡において、
前記試料面に走査されるレーザ光を変調する光変調手段と、
前記試料面からの光の受光により取得される走査画像の１画素ごとに前記光変調手段を制御する制御手段と、を具備し、
前記制御手段は、前記走査画像に対応する各画素ごとにレーザ光の変調情報が設定されたレーザ照射領域パターン画像としての制御パターンを複数記憶する記憶手段を有し、
この記憶手段に記憶された前記制御パターンの中から任意の制御パターンを読み出し、各画素ごとの変調情報に基づいて前記光変調手段を制御するとともに、任意のタイミングで前記記憶手段に記憶された別の制御パターンを読み出し、該読み出した別の制御パターンに変更する制御を行うことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
前記記憶手段に複数記憶された前記制御パターンは、前記走査画像に対応する画素数で各画素ごとにレーザの変調情報が設定されていることを特徴とする請求項1記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記記憶手段は、前記走査画像の画素数と等しい画素数の制御パターンを記憶することを特徴とする請求項１又は２記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記記憶手段は、前記走査画像の画素数より少ない画素数の制御パターンを記憶することを特徴とする請求項１又は２記載の走査型レーザ顕微鏡。
前記記憶手段に複数記憶された互いに異なるレーザ照射領域パターン画像にそれぞれ対応する複数の前記制御パターンは、レーザ強度、又はレーザ照射領域が異なることを特徴とする請求項１乃至請求項４のうち何れか一つに記載の走査型レーザ顕微鏡